CN114047235B - 一种神经元特异性烯醇化酶光电化学传感器的制备方法 - Google Patents

一种神经元特异性烯醇化酶光电化学传感器的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种神经元特异性烯醇化酶光电化学传感器的制备方法。本发明以Cs2AgBiBr6作为基底材料来获取光电流，这种不含铅元素的无机卤化物钙钛矿量子点具有优异的光电转化效率，能够有效提高传感器检测的稳定性。实现了对神经元特异性烯醇化酶的灵敏检测。其检测限为0.035 pg/mL。

Description

一种神经元特异性烯醇化酶光电化学传感器的制备方法
技术领域
本发明涉及一种神经元特异性烯醇化酶光电化学传感器的制备方法。具体是采用Cs2AgBiBr6作为基底光敏材料，Cs2AgBiBr6作为一种不含铅元素的无机卤化物钙钛矿材料，表现出优异的光电性能，制备了一种检测神经元特异性烯醇化酶的光电化学传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。
背景技术
肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不完全明确。肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，非小细胞型肺癌包括鳞状细胞癌（鳞癌）、腺癌、大细胞癌，与小细胞癌相比其癌细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚。小细胞肺癌确诊一般会在中晚期，且确诊后往往很难治愈。神经元特异性烯醇化酶(NSE)是参与糖酵解途径的烯醇化酶中的一种，存在于神经组织和神经内分泌组织中。NSE在脑组织细胞的活性最高，外周神经和神经分泌组织的活性水平居中，最低值见于非神经组织、血清和脊髓液。它被发现在与神经内分泌组织起源有关的肿瘤中，特别是小细胞肺癌中有过量的NSE表达，导致血清中NSE明显升高。因此，检测NES对小细胞肺癌的检测有积极意义。目前已有的NSE的检测方法有很多，如酶联免疫分析、电化学分析、电化学发光分析等。酶联免疫分析操作繁琐；电化学分析和电化学发光分析检测时间长。本发明设计了一种新型的光电化学传感器，其分析速度快，操作简单，稳定性好，本发明设计的新型光电化学传感器对NSE的检测限达到0.035 pg/mL。Cs2AgBiBr6，一种不含铅元素的无机卤化物钙钛矿，不污染环境且无毒，在可见光照射下表现出优异的光电活性，它作为传感器的基底材料提高了传感器的稳定性，使得该传感器的检测灵敏度大大提高。
光电化学传感器是基于物质的光电转换特性来确定待测物浓度的一类检测装置。光电化学检测方法具有设备简单、灵敏度高、易于微型化的特点，已经发展成为一种极具应用潜力的分析方法，在食品、环境、医药等领域具有广阔的应用前景。Cs2AgBiBr6，一种不含铅元素的无机卤化物钙钛矿材料，在光电化学传感器方面的应用未见报道。本发明基于Cs2AgBiBr6材料成功构建了在可见光下检测神经元特异性烯醇化酶的光电化学传感器，实现了对神经元特异性烯醇化酶的选择性检测。本发明制备的光电化学传感器，具有低成本、高灵敏、特异性好、快速检测、易于制备等优点，实现了在可见光区域对神经元特异性烯醇化酶的快速、高灵敏检测，有效克服了目前神经元特异性烯醇化酶检测方法的不足。
发明内容
本发明目的之一是利用Cs2AgBiBr6材料作为光敏材料。该光敏材料作为一种不含铅的无极卤化物钙钛矿材料，在可见光下表现出极大的光电转换效率。
本发明目的之二是以Cs2AgBiBr6作为基底，制备一种灵敏度高、稳定性好、检测速度快的光电化学传感器，实现了在可见光条件下对神经元特异性烯醇化酶灵敏检测的目的。
本发明的技术方案如下：
1、一种神经元特异性烯醇化酶光电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）Cs2AgBiBr6纳米材料的制备
取0.1 ~ 0.5 g溴化铯，0.1 ~ 0.6 g溴化铋和0.1 ~ 0.3 g溴化银混合溶解于5 ~30 mL质量分数为48 %的溴化氢溶液中，该溶液在60 ~ 150 °C下反应1 ~ 5 h，得到橙色沉淀，反应结束后，冷却至室温后静置1 ~ 5 h，之后，用超纯水和无水乙醇洗涤数次，在25 ~65 °C下真空干燥10 ~14 h，制得Cs2AgBiBr6纳米材料；
（2）光电化学传感器的制备
1）将导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗，通氮气在70 ℃烘箱中烘干；
2）取25µL、5 ~ 10 mg/mL的Cs2AgBiBr6水溶液滴加到ITO导电玻璃的导电面，室温下自然晾干；
3）将修饰的电极浸泡在浓度为1 ~ 5 mmol/L的巯基乙酸水溶液中，浸泡5 ~ 15min，在电极上修饰羧基；
4）在修饰电极表面滴加体积比为1:1的1 ~ 5 mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙级)碳二亚胺盐酸盐和5 ~ 10 mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺的混合液6 μL；超纯水冲洗电极表面，室温下自然晾至湿润薄膜状态；
5）滴加6 µL、5 ~ 20 μg/mL的神经元特异性烯醇化酶抗体，超纯水清洗，室温下自然晾至湿润薄膜状态；
6）滴加3 µL、用pH为7.4的PBS缓冲溶液配置的质量分数为1% ~ 3%的牛血清白蛋白溶液于修饰电极表面，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
7）滴加6 µL、浓度为0.1 pg/mL ~ 100 ng/mL神经元特异性烯醇化酶抗原，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中自然晾干，制得一种检测神经元特异性烯醇化酶抗原的光电化学传感器。
2. 如权利要求1所述制备方法制备得到的光电化学传感器的检测方法，其特征在于，步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，银/氯化银电极为参比电极，铂电极为辅助电极，制备的ITO修饰的传感器为工作电极，在15 mL、pH 5.5 ~ 8.5的PBS，0.1 ~0.5 mol/L的抗坏血酸缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对神经元特异性烯醇化酶进行检测，设置电压为-0.1 ~ 0.1V，运行时间240 s，光源波长为400 ~ 450 nm；
（3）电极放置好之后，每隔20 s开灯持续照射20 s，记录光电流，绘制工作曲线；
（4）将待测的神经元特异性烯醇化酶抗原样品溶液代替神经元特异性烯醇化酶抗原标准溶液进行检测。
本传感器对神经元烯醇化酶的检测线性范围为0.1 pg/mL ~ 100 ng/mL，检测限达0.035 pg/mL。
材料合成所需要的化学试剂均为当地试剂店购得，没有经过再处理。
（1）本发明成功合成具有优异光电性能的Cs2AgBiBr6纳米材料，这种无机卤化物钙钛矿材料不含铅元素，不会污染环境且具有优异的光电活性。
（2）本发明制备的光电化学传感器，用于神经元烯醇化酶的检测，响应时间短，线性范围宽，检测限低，稳定性和重现性好，可实现简单、快捷、高灵敏和特异性的检测。本发明对神经元烯醇化酶的检测线性范围为0.1 pg/mL ~ 100 ng/mL，检测限达0.035 pg/mL。
具体实施方案
实施例1 光电化学传感器的制备
（1）Cs2AgBiBr6纳米材料的制备
取0.1 g溴化铯，0.1 g溴化铋和0.1 g溴化银混合溶解于5 mL质量分数为48 %的溴化氢溶液中，该溶液在60 °C下反应1 h，得到橙色沉淀，反应结束后，冷却至室温后静置1h，之后，用超纯水和无水乙醇洗涤数次，在25 °C下真空干燥10 h，制得Cs2AgBiBr6纳米材料；
（2）光电化学传感器的制备
1）将导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗，通氮气在70 ℃烘箱中烘干；
2）取25µL、5 mg/mL的Cs2AgBiBr6水溶液滴加到ITO导电玻璃的导电面，室温下自然晾干；
3）将修饰的电极浸泡在浓度为1 mmol/L的巯基乙酸水溶液中，浸泡5 min，在电极上修饰羧基；
4）在修饰电极表面滴加体积比为1:1的1 mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙级)碳二亚胺盐酸盐和5 mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺的混合液6 μL；超纯水冲洗电极表面，室温下自然晾至湿润薄膜状态；
5）滴加6 µL、5 μg/mL的神经元特异性烯醇化酶抗体，超纯水清洗，室温下自然晾至湿润薄膜状态；
6）滴加3 µL、用pH为7.4的PBS缓冲溶液配置的质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液于修饰电极表面，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
7）滴加6 µL、浓度为0.1 pg/mL ~ 100 ng/mL神经元特异性烯醇化酶抗原，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中自然晾干，制得一种检测神经元特异性烯醇化酶抗原的光电化学传感器。
实施例2 光电化学传感器的制备
（1）Cs2AgBiBr6纳米材料的制备
取0.2 g溴化铯，0.3 g溴化铋和0.2 g溴化银混合溶解于10 mL质量分数为48 %的溴化氢溶液中，该溶液在100 °C下反应2 h，得到橙色沉淀，反应结束后，冷却至室温后静置3 h，之后，用超纯水和无水乙醇洗涤数次，在35 °C下真空干燥14 h，制得Cs2AgBiBr6纳米材料；
（2）光电化学传感器的制备
1）将导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗，通氮气在70 ℃烘箱中烘干；
2）取25µL、6 mg/mL的Cs2AgBiBr6水溶液滴加到ITO导电玻璃的导电面，室温下自然晾干；
3）将修饰的电极浸泡在浓度为3 mmol/L的巯基乙酸水溶液中，浸泡8 min，在电极上修饰羧基；
4）在修饰电极表面滴加体积比为1:1的2 mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙级)碳二亚胺盐酸盐和6 mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺的混合液6 μL；超纯水冲洗电极表面，室温下自然晾至湿润薄膜状态；
5）滴加6 µL、10 μg/mL的神经元特异性烯醇化酶抗体，超纯水清洗，室温下自然晾至湿润薄膜状态；
6）滴加3 µL、用pH为7.4的PBS缓冲溶液配置的质量分数为2%的牛血清白蛋白溶液于修饰电极表面，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
7）滴加6 µL、浓度为0.1 pg/mL ~ 100 ng/mL神经元特异性烯醇化酶抗原，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中自然晾干，制得一种检测神经元特异性烯醇化酶抗原的光电化学传感器。。
实施例3 光电化学传感器的制备
（1）Cs2AgBiBr6纳米材料的制备
取0.5 g溴化铯，0.6 g溴化铋和0.3 g溴化银混合溶解于10 mL质量分数为48 %的溴化氢溶液中，该溶液在150 °C下反应5 h，得到橙色沉淀，反应结束后，冷却至室温后静置5 h，之后，用超纯水和无水乙醇洗涤数次，在65 °C下真空干燥14 h，制得Cs2AgBiBr6纳米材料；
（2）光电化学传感器的制备
1）将导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗，通氮气在70 ℃烘箱中烘干；
2）取25µL、10 mg/mL的Cs2AgBiBr6水溶液滴加到ITO导电玻璃的导电面，室温下自然晾干；
3）将修饰的电极浸泡在浓度为5 mmol/L的巯基乙酸水溶液中，浸泡15 min，在电极上修饰羧基；
4）在修饰电极表面滴加体积比为1:1的5 mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙级)碳二亚胺盐酸盐和10 mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺的混合液6 μL；超纯水冲洗电极表面，室温下自然晾至湿润薄膜状态；
5）滴加6 µL、20 μg/mL的神经元特异性烯醇化酶抗体，超纯水清洗，室温下自然晾至湿润薄膜状态；
6）滴加3 µL、用pH为7.4的PBS缓冲溶液配置的质量分数为3%的牛血清白蛋白溶液于修饰电极表面，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
7）滴加6 µL、浓度为0.1 pg/mL ~ 100 ng/mL神经元特异性烯醇化酶抗原，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中自然晾干，制得一种检测神经元特异性烯醇化酶抗原的光电化学传感器。
实施例4 神经元特异性烯醇化酶的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，银/氯化银电极为参比电极，铂电极为辅助电极，制备的ITO修饰的传感器为工作电极，在15 mL、pH 5.5的PBS，0.1 mol/L的抗坏血酸缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对神经元特异性烯醇化酶进行检测，设置电压为-0.1 V，运行时间240 s，光源波长为400 nm；
（3）电极放置好之后，每隔20 s开灯持续照射20 s，记录光电流，绘制工作曲线；
（4）将待测的神经元特异性烯醇化酶抗原样品溶液代替神经元特异性烯醇化酶抗原标准溶液进行检测。
实施例5神经元特异性烯醇化酶的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，银/氯化银电极为参比电极，铂电极为辅助电极，制备的ITO修饰的传感器为工作电极，在15 mL、pH 7.5的PBS，0.3 mol/L的抗坏血酸缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对神经元特异性烯醇化酶进行检测，设置电压为0 V，运行时间240 s，光源波长为420 nm；
（3）电极放置好之后，每隔20 s开灯持续照射20 s，记录光电流，绘制工作曲线；
（4）将待测的神经元特异性烯醇化酶抗原样品溶液代替神经元特异性烯醇化酶抗原标准溶液进行检测
实施例6神经元特异性烯醇化酶的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，银/氯化银电极为参比电极，铂电极为辅助电极，制备的ITO修饰的传感器为工作电极，在15 mL、pH 8.5的PBS，0.5 mol/L的抗坏血酸缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对神经元特异性烯醇化酶进行检测，设置电压为0.1 V，运行时间240 s，光源波长为430 nm；
（3）电极放置好之后，每隔20 s开灯持续照射20 s，记录光电流，绘制工作曲线；
（4）将待测的神经元特异性烯醇化酶抗原样品溶液代替神经元特异性烯醇化酶抗原标准溶液进行检测。

Claims (2)

1.基于Cs2AgBiBr6构建的神经元特异性烯醇化酶光电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）Cs2AgBiBr6纳米材料的制备
取0.1 ~ 0.5 g溴化铯，0.1 ~ 0.6 g溴化铋和0.1 ~ 0.3 g溴化银混合溶解于5 ~ 30mL质量分数为48 %的溴化氢溶液中，该溶液在60 ~ 150 °C下反应1 ~ 5 h，得到橙色沉淀，反应结束后，冷却至室温后静置1 ~ 5 h，之后，用超纯水和无水乙醇洗涤数次，在25 ~ 65°C下真空干燥10 ~14 h，制得Cs2AgBiBr6纳米材料；
（2）光电化学传感器的制备
1）将导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗，通氮气在70 ℃烘箱中烘干；
2）取25µL、5 ~ 10 mg/mL的Cs2AgBiBr6水溶液滴加到ITO导电玻璃的导电面，室温下自然晾干；
3）将修饰的电极浸泡在浓度为1 ~ 5 mmol/L的巯基乙酸水溶液中，浸泡5 ~ 15 min，在电极上修饰羧基；
4）在修饰电极表面滴加体积比为1:1的1 ~ 5 mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙级)碳二亚胺盐酸盐和5 ~ 10 mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺的混合液6 μL；超纯水冲洗电极表面，室温下自然晾至湿润薄膜状态；
5）滴加6 µL、5 ~ 20 μg/mL的神经元特异性烯醇化酶抗体，超纯水清洗，室温下自然晾至湿润薄膜状态；
6）滴加3 µL、用pH为7.4的PBS缓冲溶液配置的质量分数为1% ~ 3%的牛血清白蛋白溶液于修饰电极表面，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
7）滴加6 µL、浓度为0.1 pg/mL ~ 100 ng/mL神经元特异性烯醇化酶抗原，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中自然晾干，制得一种检测神经元特异性烯醇化酶抗原的光电化学传感器。
2.如权利要求1所述制备方法制备得到的光电化学传感器的检测方法，其特征在于，步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，银/氯化银电极为参比电极，铂电极为辅助电极，制备的ITO修饰的传感器为工作电极，在15 mL、pH 5.5 ~ 8.5的PBS，0.1 ~ 0.5mol/L的抗坏血酸缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对神经元特异性烯醇化酶进行检测，设置电压为-0.1 ~ 0.1 V，运行时间240 s，光源波长为400 ~ 450 nm；
（3）电极放置好之后，每隔20 s开灯持续照射20 s，记录光电流，绘制工作曲线；
（4）将待测的神经元特异性烯醇化酶抗原样品溶液代替神经元特异性烯醇化酶抗原标准溶液进行检测。
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