CN106501240B - 具有双信号源的电致化学发光传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了具有双信号源的电致化学发光的生物传感器及其制备方法和应用，属于生物传感器领域。该生物传感器包括电极和附着于电极的表面的发光复合物，发光复合物包括两种电致化学发光物质，两种电致化学发光物质分别以O₂和H₂O₂作为共反应试剂，且两种电致化学发光物质所发出的电致化学发光信号互不干扰。这种生物传感器的灵敏度和精确度高，能够有效避免由仪器、环境因素、以及一些人为操作因素导致的假阳性或假阴性信号对检测的干扰，使检测结果的可靠性高。这种生物传感器可应用于检测生物酶的抑制剂或激活剂，检测结果可靠。

Description

具有双信号源的电致化学发光传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及电致化学发光传感器领域，具体而言，涉及具有双信号源的电致化学发光传感器及其制备方法和应用。

背景技术

电致化学发光生物分析是近年来才发展起来的一种新型的分析方法，是将化学发光、电化学、生物分析、微电子技术及传感技术相结合的最新产物，主要用于临床、农业、环境监测等领域。

电致化学发光(Electrogenerated Chemiluminescence,ECL)，是某些具有电致化学发光活性的物质处在一定的电位时，与溶液中的氧化还原物质作用生成的不稳定激发态迁移回基态时所导致的化学发光。

目前，现有的电致化学发光传感器大多是由一种发光物质(比如量子点)作为信号源，这种电致化学发光传感器的信号源单一，信号不稳定，极容易受电致化学发光仪器或者一些环境因素的影响，出现一些假阳性或者假阴性信号，给这类使用电致化学发光传感器的检测分析带来诸多不便。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种具有双信号源的电致化学发光的生物传感器，这种生物传感器的灵敏度和精确度高，能够有效避免由仪器、环境因素、以及一些人为操作因素导致的假阳性或假阴性信号对检测的干扰，使检测结果的可靠性高。

本发明的第二目的在于提供一种上述的具有双信号源的电致化学发光的生物传感器的制备方法，这种制备方法的工艺简单，反应条件温和，可操作性强。

本发明的第三目的在于提供一种具有双信号源的电致化学发光的生物传感器在检测生物酶的抑制剂或激活剂中的应用，这种基于生物酶的生物传感器的灵敏度高，能够对样品中的生物酶的抑制剂或激活剂进行超微量检测，且检测结果可信度高。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种具有双信号源的电致化学发光的生物传感器，生物传感器包括电极和附着于电极的表面的发光复合物，发光复合物包括两种电致化学发光物质，两种电致化学发光物质分别以O₂和H₂O₂作为共反应试剂，且两种电致化学发光物质所发出的电致化学发光信号互不干扰。

一种具有双信号源的电致化学发光的生物传感器的制备方法，其包括：

步骤a：制备包含两种电致化学发光物质的发光复合物，所述两种电致化学发光物质分别以O₂和H₂O₂作为共反应试剂，且所述两种电致化学发光物质所发出的电致化学发光信号互不干扰；

步骤b：利用电极表面修饰技术，将所述发光复合物修饰到电极的表面。

一种具有双信号源的电致化学发光的生物传感器在检测生物酶的抑制剂或激活剂中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

这种生物传感器，在一个循环电位扫描下，会发出两种电致化学发光信号，并利用O₂和H₂O₂分别作为这两种电致化学发光物质的共反应试剂。这两种电致化学发光物质的发光电位没有重叠，同时，采用的两种电致化学发光物质之间没有能量转移，使得这种生物传感器的灵敏度和精确度显著提高，不仅能够避免能量转移的复杂性，而且能够有效避免由仪器、环境因素、以及一些人为操作因素导致的假阳性或假阴性信号对检测的干扰，使检测结果的可靠性高。

这种生物传感器的制备方法，通过在电极表面修饰发光复合物，使得电极上同时具有两种电致化学发光物质，使这种电极能够同时产生两种电致化学发光信号，这种制备方法的工艺简单，反应条件温和，可操作性强。

利用这种生物传感器能够对样品中生物酶的抑制剂或激活剂进行检测分析，定性或者定量分析均可以，且这种基于生物酶的生物传感器的灵敏度高，其最低检测限为1.25×10^-13mol/L，即这种生物传感器能够对样品中的生物酶的抑制剂或激活剂进行超微量检测，可广泛应用于生物、农业或环境分析等领域。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例7中的生物传感器的制备过程以及相应的响应原理图；

图2为实施例7中的生物传感器在饱和空气下pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中对不同浓度的乙基对氧磷响应的ECL谱图；

图3为用实施例7中的生物传感器检测乙基对氧磷的工作曲线；

图4为验证实施例7中的生物传感器的稳定性的ECL谱图；

图5为裸电极(a线)、修饰有PFO-GO-CdTe QDs的电极(b线)、以及修饰有AChE-ChOx的生物传感器(c线)的循环伏安图谱，电位：-0.2-0.6V，扫速：100mV/s；

图6为不同材料的透射电子显微镜图，其中，A图为PFO dots的TEM图；B图为GO-CdTe QDs的TEM图；C图为GO-CdTe QDs的放大图；D图为PFO-GO-CdTe QDs的TEM图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本实施方式提供一种具有双信号源的ECL生物传感器，生物传感器包括电极和附着于电极的表面的发光复合物，发光复合物包括两种ECL物质，两种ECL物质分别以O₂和H₂O₂作为共反应试剂，且两种ECL物质所发出的ECL信号互不干扰。

在本发明中，"两种ECL物质所发出的ECL信号互不干扰”指这两种ECL物质的发光电位没有重叠，相互之间没有影响。

这种生物传感器，在一个循环电位扫描下，会发出两种ECL信号，并利用O₂和H₂O₂分别作为这两种ECL物质的共反应试剂，当O₂和H₂O₂分别为某个化学反应或生物反应的反应物和生成物时，即可实现这两种ECL信号的呈相反变化的趋势。

O₂和H₂O₂为共反应试剂，能够促进ECL物质中发光基团的发光效率，使其ECL信号显著增强，即当该生物传感器的表面有O₂时，以O₂为共反应试剂的ECL物质的ECL信号便会显著增强，O₂的浓度越大，该ECL信号越强；同理，当该生物传感器的表面有H₂O₂时，以H₂O₂为共反应试剂的ECL物质的ECL信号便会显著增强，H₂O₂的浓度越大，该ECL信号越强。

这两种ECL物质的发光电位没有重叠，同时，采用的两种ECL物质之间没有能量转移，使得这种生物传感器的灵敏度和精确度显著提高，不仅能够避免能量转移的复杂性，而且能够有效避免由仪器、环境因素、以及一些人为操作因素导致的假阳性或假阴性信号对检测的干扰，使检测结果的可靠性高。

进一步地，在被发明较佳的实施例中，发光复合物还包括导电载体，两种ECL物质固载于导电载体。

本发明中的“固载”指某种物质通过物理或化学方法使之与固体载体相结合,而形成一种特殊的复合物。

加入导电载体，使电极与这两种电致发光物质之间的电子转移速率增强，同时，导电载体作为的载体，有助于将这两种电致发光物质修饰到电极上。在本发明中，电极优选为玻碳电极、金电极或者其他能满足实际需求的电极。

进一步优选地，导电载体为石墨稀。石墨稀具有片层结构，其比表面积大、导电性能好，且容易对其结构进行修饰，使两种电致发光物质能够固载于石墨稀，即两种电致发光物质与石墨稀形成复合物。

在本发明较佳的实施例中，生物传感器还包括生物酶，生物酶附着于发光复合物的表面，生物酶在酶促反应中的反应物包括O₂，且生物酶在酶促反应中的生成物包括H₂O₂。

O₂和H₂O₂分别为很多生物酶参与的酶促反应的反应物和生成物，在电极的发光复合物表面修饰生物酶，能够实现在电极表面原位产生O₂和H₂O₂，并使O₂和H₂O₂的含量始终处于负相关的变化趋势，进而实现两种ECL信号也呈现相反的变化趋势，使得仅通过两种ECL信号的比值便可对生物酶的活性进行检测、评估，同时也可对这种生物酶的抑制剂或激活剂进行检测分析。

进一步的，在本发明较佳的实施例中，两种ECL物质分别为阳极发光物质和阴极发光物质，阳极发光物质以H₂O₂为共反应试剂，阴极发光物质以O₂为共反应试剂。

当给予该生物传感器施加扫描电压，例如采用ECL检测仪对生物传感器施加-2～2V的扫描电压，这两种ECL物质中的一种会在扫描电压为-2～0V的过程中出现ECL信号，即该ECL物质为阴极发光物质；而另一种ECL物质则会在扫描电压为0～2V的过程中出现ECL信号，即该ECL物质为阳极发光物质。在同一个生物传感器中选择这两种ECL物质的好处在于，这两种ECL发光物质的发光电位没有重叠，相互之间没有交叉干扰，从而降低检测结果的误差。

优选地，阳极发光物质为聚芴衍生物或鲁米诺，阴极发光物质为量子点。

鲁米诺和聚芴衍生物，都是一种ECL物质。酶促反应产生的H₂O₂可作为鲁米诺或聚芴衍生物的共反应试剂，能够增强鲁米诺或聚芴衍生物的ECL信号。

量子点具有宽的激发谱和窄的发射谱，且具有很好的光稳定性，是一种理想的ECL物质。参与酶促反应的O₂可作为量子点的共反应试剂，能够增强量子点的ECL信号。量子点可以为CdS、CdTe、CdSe等。

更为优选地，聚芴衍生物为聚(9,9-正二辛基芴基-2,7-二基)(PFO)颗粒，阴极发光物质为CdTe量子点。这两种ECL物质组合使用，所得到的生物传感器的抗干扰性和灵敏度更好。

O₂能使CdTe量子点(CdTe QDs)的ECL信号增强的原理是：

CdTe QDs得电子被还原为CdTe QDs^·-(式1)；O₂得电子生成OOH^-和OH^-(式2)；随后，CdTe QDs^·-和OOH^-进一步反应生成激发态的CdTe QDs^*(式3)；最后，激发态的CdTe QDs^*回到基态，产生ECL信号(式4)，具体如下所示：

CdTe QDs+e^-→CdTe QDs^·- (1)

O₂+H₂O+2e^-→OOH^-+OH^- (2)

2CdTe QDs^·-+OOH^-+H₂O→3OH^-+2CdTe QDs* (3)

CdTe QDs*→CdTe QDs+hv (4)

H₂O₂能使PFO的ECL信号增强的原理是：

PFO可以被氧化成PFO^·+(式1)；H₂O₂水解为HO₂ ^-和H⁺(式2)；随后，HO₂ ^-失去电子生成O₂ ^·-(式3和式4),O₂ ^·-会进一步与PFO^·+反应生成激发态的PFO^*(式5)。最后，PFO^*回到基态，产生ECL信号(式6)，具体如下所示：

PFO-e→PFO^·+ (1)

H₂O₂→HO₂ ^-+H⁺ (2)

HO₂ ^--e→HO₂ ^· (3)

HO₂ ^·→O₂ ^·-+H⁺ (4)

PFO^·++O₂ ^·-→PFO*+O₂ (5)

PFO*→PFO+hv (6)

进一步的，在本发明较佳的实施例中，生物酶为乙酰胆碱酯酶-胆碱氧化酶复合酶(AChE-ChOx)。

基于乙酰胆碱酯酶(AChE)系统的酶促反应为：底物硫代乙酰胆碱(ATCl)在AChE的作用下水解为乙酸和硫代胆碱(RSH)；RSH在胆碱氧化酶(ChOx)的催化作用下，进一步与O₂反应生成二硫代二胆碱(RSSR)和H₂O₂。

用AChE-ChOx为生物酶，可通过酶促反应在电极表面原位产生O₂和H₂O₂，从而引起两种ECL物质的ECL信号的变化，通过检测ECL信号既可返推出AChE-ChOx的活性。因此，可用该生物传感器来检测AChE的抑制剂或激活剂。

以AChE-ChOx作为生物酶的生物传感器为例，这类具有双信号源的ECL的生物传感器的工作原理为(如图1所示)：

该生物传感器以CdTe QDs为阴极发光物质，以溶液中溶解的O₂作为CdTe QDs的共反应试剂；以PFO颗粒(PFO dots)为阳极发光物质，以酶促反应产生的H₂O₂为PFO dots的共反应试剂。在底物ATCl存在下，随着AChE和胆碱氧化酶ChOx引起的酶促反应的发生，溶液中溶解的O₂被消耗，阴极发光物质CdTe QDs的ECL信号被猝灭；同时，通过酶促反应原位生成的H₂O₂将使阳极发光物质PFO dots的ECL信号增强。

当溶液中存在AChE的抑制剂时，比如有机磷(OPs)，由于OPs具有抑制AChE的活性的特性，从而阻碍了溶液中溶解的O₂的消耗和H₂O₂的产生，进一步导致阴极发光物质的ECL信号增加，而阳极发光物质的ECL信号相应地下降。反之，当溶液中存在AChE的激活剂时，由于O₂的消耗量增多和H₂O₂的产生量增大，进一步导致阴极发光物质的ECL信号降低，而阳极发光物质的ECL信号增大。根据这两种ECL信号的比值便可实现对溶液中含有的抑制剂或激活剂的浓度进行测定。

本实施方式还提供一种具有双信号源的电致化学发光的生物传感器的制备方法，如图1所示，其包括：

步骤a：制备包含两种电致化学发光物质的发光复合物，所述两种电致化学发光物质分别以O₂和H₂O₂作为共反应试剂，且所述两种电致化学发光物质所发出的电致化学发光信号互不干扰。

在本发明较佳的实施例中，步骤a为：先将两种电致化学发光物质固载于导电载体，形成发光复合物；

在本发明较佳的实施例中，上述导电载体为石墨稀，进一步优选的，所述两种电致化学发光物质分别为量子点和聚芴衍生物；

在本发明较佳的实施例中，步骤a中，两种电致化学发光物质固载于导电载体的方法包括：(1)制备表面具有氨基的石墨稀-量子点复合物的步骤；优选地，石墨稀-量子点复合物为石墨稀-碲化镉量子点复合物(GO-CdTe QDs)。

在本发明较佳的实施例中，制备GO-CdTe QDs的步骤包括：将CdCl₂与石墨稀混合搅拌，随后再与亚碲酸钠、硼氢化钠和半胱氨酸混合，并于140-160℃下加热回流9-11h，得到表面具有氨基的GO-CdTe QDs。

(2)制备羧基功能化的聚芴衍生物颗粒的步骤；优选地，聚芴衍生物颗粒为PFOdots；

在本发明较佳的实施例中，制备羧基功能化的PFO dots的步骤包括：将PFO与聚(苯乙烯-马来酸酐)(PSMA)溶解于四氢呋喃中，并在超声波的作用下乳化8-12min，过滤后得到羧基功能化的PFO dots。

(3)以及使石墨稀-量子点复合物与聚芴衍生物颗粒发生酰化反应得到发光复合物的步骤。

在本发明较佳的实施例中，制备发光复合物(PFO-GO-CdTe QDs)的方法为：将上述制备的羧基功能化的PFO dots用交联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化处理0.8-1.2h后，加入表面具有氨基的GO-CdTe QDs，搅拌反应后经离心、洗涤，即可得到PFO-GO-CdTe QDs。

步骤b：利用电极表面修饰技术，将发光复合物修饰到电极的表面；

在本发明较佳的实施例中，在步骤b之后还包括步骤c，步骤c为：在表面附着发光复合物的电极的表面修饰生物酶。

优选地，所述生物酶在酶促反应中的反应物包括所述O₂，且所述生物酶在酶促反应中的生成物包括所述H₂O₂。进一步优选地，该生物酶为AChE-ChOx。

在本发明较佳的实施例中，制备AChE-ChOx的方法为：将AChE、ChOx以及戊二醛混合，在4℃冰浴条件下搅拌混合反应后，即可得到AChE-ChOx。

这种生物传感器的制备方法，通过在电极表面修饰发光复合物，使得电极上同时具有两种ECL物质，使这种电极能够同时产生两种ECL信号，这种制备方法的工艺简单，反应条件温和，可操作性强。

本实施方式还提供一种具有双信号源的电致化学发光的生物传感器在检测生物酶的抑制剂或激活剂中的应用。

在本发明较佳的实施例中，用该生物传感器进行检测的方法为：将该生物传感器于待测样品溶液进行孵育，再将孵育后的生物传感器置于含有生物酶的底物的检测液中，随后采用ECL检测仪采集该生物传感器的两种ECL信号，得到检测数据。

在本发明较佳的实施例中，该生物传感器在检测生物酶的抑制剂或激活剂的分析方法包括以下步骤：

(1)将生物传感器用含有抑制剂或激活剂的不同浓度的标准溶液孵育后，再将孵育后的生物传感器置于含有生物酶的底物的检测液中，并采集生物传感器的两种电致化学发光信号；

(2)将采集到的两种电致化学发光信号的强度比值的对数与标准溶液的浓度的对数进行线性拟合，得到工作曲线；

(3)用生物传感器检测待测样品中的抑制剂或激活剂，通过工作曲线计算得到抑制剂或激活剂的浓度。

优选地，抑制剂为有机磷农药。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：

实施例1

本实施例提供一种具有双信号源的电致化学发光的生物传感器，该生物传感器包括电极和附着于电极的表面的发光复合物，发光复合物包括两种电致化学发光物质，两种电致化学发光物质分别以O₂和H₂O₂作为共反应试剂，且两种电致化学发光物质所发出的电致化学发光信号互不干扰。

这种生物传感器的制备方法为：

S1：制备包含两种电致化学发光物质的发光复合物；

S2：利用电极表面修饰技术，将发光复合物修饰到电极的表面。

实施例2

本实施例提供一种具有双信号源的电致化学发光的生物传感器，该生物传感器包括电极和附着于电极的表面的发光复合物，发光复合物包括两种电致化学发光物质和导电载体，两种电致化学发光物质固载于导电载体，两种电致化学发光物质分别以O₂和H₂O₂作为共反应试剂，且两种电致化学发光物质所发出的电致化学发光信号互不干扰。

这种生物传感器的制备方法为：

S1：将两种电致化学发光物质固载于导电载体，制备发光复合物S2：利用电极表面修饰技术，将发光复合物修饰到电极的表面。

实施例3

本实施例提供一种具有双信号源的电致化学发光的生物传感器，该生物传感器包括电极和附着于电极的表面的发光复合物，发光复合物包括两种电致化学发光物质和石墨稀，两种电致化学发光物质固载于导电载体，两种电致化学发光物质分别以O₂和H₂O₂作为共反应试剂，且两种电致化学发光物质所发出的电致化学发光信号互不干扰。

这种生物传感器的制备方法为：

S1：将两种电致化学发光物质固载于石墨稀上来制备发光复合物；

S2：利用电极表面修饰技术，将发光复合物修饰到电极的表面。

实施例4

本实施例提供一种具有双信号源的电致化学发光的生物传感器，生物传感器包括电极、附着于电极的表面的发光复合物、以及附着于发光复合物的表面的生物酶，发光复合物包括两种电致化学发光物质和石墨稀，两种电致化学发光物质固载于石墨稀上，两种电致化学发光物质分别以O₂和H₂O₂作为共反应试剂，且两种电致化学发光物质所发出的电致化学发光信号互不干扰，生物酶在酶促反应中的反应物包括O₂，且生物酶在酶促反应中的生成物包括H₂O₂。

这种生物传感器的制备方法为：

S1：制备包含石墨稀和两种电致化学发光物质的发光复合物；

S2：利用电极表面修饰技术，将发光复合物修饰到电极的表面；

S3:将生物酶孵育到表面附着发光复合物的电极上。

实施例5

本实施例提供一种具有双信号源的电致化学发光的生物传感器，基本与实施例4一致，不同之处在于：

两种电致化学发光物质分别为阳极发光物质和阴极发光物质，其中，阳极发光物质以H₂O₂为共反应试剂，阴极发光物质以O₂为共反应试剂。阳极发光物质为鲁米诺，阴极发光物质为CdTe量子点。

这种生物传感器的制备方法为：

S1：制备包含石墨稀、鲁米诺以及CdTe量子点的发光复合物；

S2：利用电极表面修饰技术，将发光复合物修饰到电极的表面；

S3:将生物酶孵育到表面附着发光复合物的电极上。

实施例6

本实施例提供一种具有双信号源的电致化学发光的生物传感器，基本与实施例5一致，不同之处在于：阳极发光物质为聚芴衍生物，阴极发光物质为CdTe量子点。

这种生物传感器的制备方法为：

S1：制备包含石墨稀、聚芴衍生物以及CdTe量子点的发光复合物；

具体包括：

(1)制备表面具有氨基的GO-CdTe QDs的步骤：将CdCl₂与石墨稀混合搅拌，随后再与亚碲酸钠、硼氢化钠和半胱氨酸混合，并于140-160℃下加热回流9-11h，得到表面具有氨基的GO-CdTe QDs。

(2)制备羧基功能化的PFO dots的步骤：将PFO与聚(苯乙烯-马来酸酐)(PSMA)溶解于四氢呋喃中，并在超声波的作用下乳化8-12min，过滤后得到羧基功能化的PFO dots。

(3)制备发光复合物(PFO-GO-CdTe QDs)的步骤：将上述制备的羧基功能化的PFOdots用交联剂EDC和NHS活化处理1h后，加入表面具有氨基的GO-CdTe QDs，搅拌反应后经离心、洗涤，即可得到PFO-GO-CdTe QDs。

S2：利用电极表面修饰技术，将发光复合物修饰到电极的表面；

S3:将生物酶孵育到表面附着发光复合物的电极上。

实施例7

本实施例提供一种具有双信号源的电致化学发光的生物传感器，基本与实施例6一致，不同之处在于：生物酶为乙酰胆碱酯酶-胆碱氧化酶复合酶。

这种生物传感器的制备方法与实施例6一致，不同之处在于：

S3:将乙酰胆碱酯酶-胆碱氧化酶复合酶孵育到表面附着发光复合物的电极上。其中，制备AChE-ChOx的方法为：将AChE、ChOx以及戊二醛混合，在4℃冰浴条件下搅拌混合反应后，即可得到AChE-ChOx。

实施例8

本实施例提供一种具有双信号源的电致化学发光的生物传感器的应用，该生物传感器的制备方法与实施例7一致。

用该生物传感器来检测残留有机磷农药的分析方法，包括以下步骤：

将生物传感器于含有有机磷的不同浓度的标准溶液中孵育，再将孵育后的生物传感器置于含硫代乙酰胆碱的检测液中，并采集该生物传感器的两种ECL信号；

随后，将采集到两种ECL信号的强度比值的对数与标准溶液的浓度的对数进行线性拟合，得到工作曲线；

最后，用生物传感器检测待测样品中的抑制剂或激活剂，通过工作曲线计算得到抑制剂或激活剂的浓度。

实验例1

用实施例7中的生物传感器来对卷心菜、小白菜和生菜中的有机磷农药残留进行检测：

一、样品制备：

将卷心菜、小白菜、生菜用超纯水洗涤并研碎，取10g的样品被研磨成蔬菜汁并加入到9mL磷酸缓冲溶液(0.1mol/L，pH 7.4)和1mL的丙酮的混合溶液中。然后，将获得的悬浮液超声10分钟后离心(8000转/分钟，15分钟)。离心后得到的上清液直接用于检测，不用再进行额外或进一步的处理。

二、检测方法：

将生物传感器置于样品溶液中孵育15min。随后，将孵育后的生物传感器在3mL包含有0.090mmol/L的氯代乙酰胆碱的磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH 7.4)中进行检测。

检测设备为MPI-E型电致化学发光分析仪(西安瑞迈分析仪器有限公司，西安，中国)，检测时光电倍增管高压(PMT)为800V，扫描电压为-2～2V。

三、工作曲线的构建：

用乙基对氧磷标准品配制以下浓度的标准样品：(a)0mol/L,(b)5×10^-13mol/L,(c)10^-12mol/L(d)5×10^-12mol/L,(e)1×10^-11mol/L,(f)5×10^-11mol/L,(g)1×10^-10mol/L,(h)5×10^-9mol/L,(i)1×10^-9mol/L和(j)5×10^-8mol/L。将生物传感器用上述不同浓度的标准样品进行孵育，采集其ECL信号，其中阳极ECL信号出现在扫描电压为1.96V时，阴极ECL信号出现在扫描电压为-1.67V时，ECL谱图如图2所示。

以阳极ECL信号(I_PFO)与阴极ECL信号(I_CdTe)强度之比(I_PFO/I_CdTe)的对数为纵坐标，以乙基对氧磷的浓度的对数为横坐标，进行线性拟合，得到如图2所示的工作曲线，其线性相关方程为lg(I_PFO/I_CdTe)＝-6.49115+0.50511lg c，相关系数为0.995。

此外，可得出该生物传感器对有机磷农药的检测限为1.25×10^-13mol/L，信噪比S/N＝3。

四、实际样品检测：

发明人用标准添加法将不同浓度的乙基对氧磷添加到空气饱和的蔬菜样品溶液中进行回收实验，检测蔬菜样品中的有机磷农药的回收率，回收实验的结果如表1所示。

表1乙基对氧磷在不同蔬菜样品中的回收测试结果

注：^a表示三次的平均值±SD,n＝3

由表1可知，本发明提供的这种生物传感器对卷心菜、小白菜和生菜的回收率变化范围分别是94.0％～104％、95.7％～102％和98.0％～105％。由此可知，该生物传感器可以很好的应用到分析实际生活样品。

实验例2

验证该生物传感器的稳定性：

将实施例7中的生物传感器在浓度为5.0×10^-11mol/L的乙基对氧磷溶液中孵育，随后将孵育后的生物传感器在空气饱和的pH 7.4磷酸缓冲溶液中扫描10圈来检测该生物传感器的操作稳定性。

结果如图4所示，生物传感器的ECL信号在扫描10圈后趋于稳定，其中PFO dots和GO-CdTe QDs的ECL信号的相对标准偏差分别是2.26％和2.85％，表明该比率型ECL生物传感器具有很好的操作稳定性。

实验例3

该生物传感器的性能表征：

一.循环伏安法(CV)表征

将实施例7中的生物传感器的逐步组装过程在含有5mmol/L铁氰化钾的0.1mol/L的磷酸缓冲溶液(pH 7.4)中进行循环伏安法(CV)表征。

表征结果如图5所示，其中曲线a为裸电极的CV图；曲线b为PFO-GO-CdTe修饰的电极的CV图；曲线c为修饰有AChE-ChOx的生物传感器的CV图。

由图5可以看出，与裸电极相比(曲线a)，PFO-GO-CdTe纳米复合物修饰电极的氧化还原峰电流增加(曲线b)，这主要是由于PFO-GO-CdTe纳米复合物加速了电化学探针铁氰化钾和电极之间的电子转移速度。当AChE-ChOx修饰到电极上(曲线c)，由于酶的不导电性，氧化还原电流降低。上述结果证明了该生物传感器的逐步构建过程是成功的。

二、透射电子显微镜(TEM)

用透射电子显微镜来表征在制备该生物反应器中的材料，其结果呈现在如图6所示。

图6A为，从图中可以看出PFO纳米颗粒呈圆球状，直径范围为60～160nm。

图6B为GO-CdTe QDs的TEM图，从图中可以看出GO-CdTe QDs被成功制备并均匀分散在石墨烯表面。

图6C为GO-CdTe QDs的放大图，图中CdTe QDs的平均直径为3.5nm。而且，几乎没有单独的石墨烯纳米片或单独的CdTe QDs出现。

图6D为PFO-GO-CdTe QDs的TEM图，图6D中的插图为PFO-GO-CdTe QDs的放大图，从图中可以看出PFO-GO-CdTe QDs已成功制备。

综上所述，本发明提供的这种生物传感器，在一个循环电位扫描下，会发出两种电致化学发光信号，并利用O₂和H₂O₂分别作为这两种电致化学发光物质的共反应试剂以实现这两种电致化学发光信号呈相反变化的趋势。这两种电致化学发光物质的发光电位没有重叠，同时，采用的两种电致化学发光物质之间没有能量转移，使得这种生物传感器的灵敏度和精确度显著提高，能避免能量转移的复杂性，而且也能够有效避免由仪器、环境因素、以及一些人为操作因素导致的假阳性或假阴性信号对检测的干扰，使检测结果的可靠性高，其制备方法简单易行，可用于检测多种生物酶的抑制剂或激活剂。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (13)

1.一种具有双信号源的电致化学发光的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器包括电极和附着于所述电极表面的发光复合物、以及附着于所述发光复合物表面的生物酶，所述发光复合物包括两种电致化学发光物质和导电载体，所述两种电致化学发光物质固载于所述导电载体上、且分别以O₂和H₂O₂作为共反应试剂，所述两种电致化学发光物质所发出的电致化学发光信号互不干扰；所述生物酶在酶促反应中的反应物包括所述O₂，且所述生物酶在酶促反应中的生成物包括所述H₂O₂。

2.根据权利要求1所述的具有双信号源的电致化学发光的生物传感器，其特征在于，所述导电载体为石墨稀。

3.根据权利要求1所述的具有双信号源的电致化学发光的生物传感器，其特征在于，所述两种电致化学发光物质分别为阳极发光物质和阴极发光物质，所述阳极发光物质以H₂O₂为共反应试剂，所述阴极发光物质以O₂为共反应试剂。

4.根据权利要求3所述的具有双信号源的电致化学发光的生物传感器，其特征在于，所述阳极发光物质为聚芴衍生物或鲁米诺，所述阴极发光物质为量子点。

5.根据权利要求4所述的具有双信号源的电致化学发光的生物传感器，其特征在于，所述聚芴衍生物为聚(9,9-正二辛基芴基-2,7-二基)颗粒，所述阴极发光物质为CdTe量子点。

6.根据权利要求3所述的具有双信号源的电致化学发光的生物传感器，其特征在于，所述生物酶为乙酰胆碱酯酶-胆碱氧化酶复合酶。

7.一种具有双信号源的电致化学发光的生物传感器的制备方法，其特征在于，其包括：

步骤a：制备包含两种电致化学发光物质的发光复合物，所述两种电致化学发光物质分别以O₂和H₂O₂作为共反应试剂，且所述两种电致化学发光物质所发出的电致化学发光信号互不干扰；

步骤b：利用电极表面修饰技术，将所述发光复合物修饰到电极的表面；

步骤c：在表面附着所述发光复合物的所述电极的表面修饰生物酶；所述生物酶在酶促反应中的反应物包括所述O₂，且所述生物酶在酶促反应中的生成物包括所述H₂O₂。

8.根据权利要求7所述的具有双信号源的电致化学发光的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤a为：先将所述两种电致化学发光物质固载于导电载体，形成所述发光复合物。

9.根据权利要求8所述的具有双信号源的电致化学发光的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述导电载体为石墨稀，所述步骤a中，所述两种电致化学发光物质固载于所述导电载体的方法包括：制备表面具有氨基的石墨稀-量子点复合物的步骤；制备羧基功能化的聚芴衍生物颗粒的步骤；以及使所述石墨稀-量子点复合物与所述聚芴衍生物颗粒发生酰化反应得到所述发光复合物的步骤。

10.根据权利要求9所述的具有双信号源的电致化学发光的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述石墨稀-量子点复合物为石墨稀-CdTe量子点复合物，所述聚芴衍生物颗粒为聚(9,9-正二辛基芴基-2,7-二基)颗粒。

11.一种如权利要求1～6中任一项所述的具有双信号源的电致化学发光的生物传感器在检测生物酶的抑制剂或激活剂中的应用。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将所述生物传感器用含有所述抑制剂或激活剂的不同浓度的标准溶液孵育后，再将孵育后的所述生物传感器置于含有所述生物酶的底物的检测液中，并采集所述生物传感器的两种电致化学发光信号；

(2)将采集到的两种所述电致化学发光信号的强度比值的对数与所述标准溶液的浓度的对数进行线性拟合，得到工作曲线；

(3)用所述生物传感器检测待测样品中的抑制剂或激活剂，通过所述工作曲线计算得到所述抑制剂或激活剂的浓度。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为有机磷农药。