CN113945615A - 一种基于金修饰的磷酸铈作为高效共反应加速器的夹心型ecl传感器的制备及应用 - Google Patents

一种基于金修饰的磷酸铈作为高效共反应加速器的夹心型ecl传感器的制备及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基于金修饰的磷酸铈作为共反应加速器放大NHCDs‑H2O2体系的ECL传感器的制备及应用，本发明属于生物传感领域与新型功能材料的新颖性结合。Au修饰的磷酸铈与氮掺杂碳点结合作为电致化学发光传感平台，构建夹心型电致化学发光免疫传感器，用于黄曲霉毒素B1的超灵敏检测。CePO4纳米材料好的形态特征、合适的酸性度和低毒性等使其具有很大的应用潜力。CePO4@Au可以促进H2O2分解产生O2 •−，产生更强的发光信号；CePO4固定在玻碳电极表面时，能显著提高其电子转移速率。Au修饰的磷酸铈可以增加抗原抗体的结合数量，增强ECL信号，实现对生物分子的灵敏准确检测。

Description

一种基于金修饰的磷酸铈作为高效共反应加速器的夹心型 ECL传感器的制备及应用
技术领域
本发明涉及一种基于电致化学发光免疫传感器的制备与应用，具体说是一种以CePO4@Au作为高效共反应加速器放大NHCDs-H2O2体系的夹心型ECL传感器，本发明属于新型功能材料、生物传感技术领域。
背景技术
黄曲霉毒素B1 (AFB1) 是污染性最强的真菌毒素之一，且存在致突变性、致畸性和致癌性，并且以特殊的方式污染了大量的食品和农产品；黄曲霉毒素普遍存在于各种粮食作物中，主要包括谷物、坚果和其他农产品中；人类可能通过食用受黄曲霉毒素污染的食物进而影响人们的身体健康，增加发病率和死亡率。
电致化学发光 (ECL) 是将电化学手段与化学发光技术相结合的一种研究方法，近几年在免疫分析等方面受到的广泛地关注；ECL传感器具有高灵敏性、高选择性、高专一性和检出限低等优点，可快速准确的检测待测物的含量。
CePO4纳米材料优异的形态特征、高的热稳定性、合适的酸性强度和低毒性等使得在多个领域中具有很大的应用潜力；CePO4@Au作为共反应促进剂有两个主要的优点：一方面，CePO4@Au可以促进H2O2分解产生O2 •−，Ce3+和Ce4+的反复转化具有很高的催化活性和电活性，可促进O2 •−的产生，产生的O2 •−与NHCDs•反应产生更强的发光信号；另一方面，将固定在玻碳电极(GCE) 表面时，能显著提高GCE的有效表面积和电子转移速率；通过Au修饰CePO4不仅提高了材料的电导率和加速电子转移，而且还可以增加抗原抗体的结合数量，从而增大发光信号，提高检测的灵敏度和准确性。
碳量子点是一类新兴的碳纳米材料，具有非常好的发光性能，由于显示出较低的细胞毒性、较高的稳定性和良好的生物相容性等突出优点，有望在生物传感或成像中得到广泛的应用；目前在电致化学发光传感器中经常应用的量子点有碲化镉量子点、碳量子点、硫化锌量子点、二硫化钼量子点等；本发明中使用低激发电位、高稳定性和良好的生物相容性的新型氮掺杂的碳量子点，过氧化氢 (H2O2) 作为共反应活性物质，碳量子点在溶液中能产生极强的ECL发射；其机理主要是CePO4@Au可以促进H2O2分解产生O2 •−，Ce3+和Ce4+的反复转化具有很高的催化活性和电活性，可促进O2 •−的产生，产生的O2 •−与NHCDs•反应产生更强的发光信号。
发明内容
本发明的目的之一是制备一种基于CePO4@Au作为高效共反应加速器放大NHCDs-H2O2体系的夹心型ECL免疫传感器。
本发明的目的之二是将该传感器用于AFB1的高灵敏、特异性准确检测。
本发明的技术方案如下：
1.一种基于金修饰的磷酸铈作为高效共反应加速器放大NHCDs-H2O2体系的夹心型ECL传感器的制备如下：
(1)用抛光粉将玻碳电极打磨，再使用去离子水清洗，将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，并在-0.2 ~ 0.6 V电位下进行扫描，使峰电位的差值小于110 mV；
(2)将8 μL，1 ~ 3 mg/mL CePO4@Au纳米复合物溶液滴加在电极上，4 ℃下干燥；
(3)将8 μL，1 ~ 2 μg/mL AFB1抗体滴加在电极上，在4 ℃冰箱下干燥之后，用PBS清洗，以除去多余抗体，4 ℃下干燥；
(4)将3 μL，质量分数为1 ~ 2 % BSA溶液滴加于电极上，用以封闭非特异性结合位点，干燥之后使用PBS洗去多余BSA，4 ℃下干燥；
(5)将8 μL，0.0001 ~ 100 ng/mL一系列不同浓度的AFB1抗原标准溶液滴加于电极上，4 ℃下干燥之后，用PBS清洗，除去多余抗原，4 ℃下干燥；
(6)将8 μL，3 ~ 5 mg/mL Fe3O4@Pt@NHCDs-Ab2标记的二抗滴加于电极上，室温下干燥之后，用PBS清洗，除去多余二抗，4 ℃下干燥，制得一种CePO4@Au作为高效共反应加速器放大NHCDs-H2O2体系的夹心型ECL免疫传感器。
2.一种基于金修饰的磷酸铈作为高效共反应加速器放大NHCDs-H2O2体系的夹心型ECL传感器，其所述的CePO4@Au材料的制备步骤如下：
(1)CePO4的制备
首先，将1.5-6 mmol Ce(NO3)3•6H2O和1.5-6 mmol (NH4)2HPO4分别溶于5-20 mL去离子水中，在强烈搅拌下，将(NH4)2HPO4溶液缓慢滴加到Ce(NO3)3•6H2O溶液中形成白色沉淀；然后，在混合物中滴加适量的25 wt.%氨水调节pH至10.45左右，白色沉淀溶解形成透明无色的溶液，将得到的溶液倒入内衬聚四氟乙烯的100 mL不锈钢高压釜中150 ℃下反应12h，自然冷却至室温；收集得到的产品，用蒸馏水和无水乙醇洗涤数次，60 ℃下干燥12 h；
(2)CePO4@Au的制备
将25-100 mg制备的CePO4和1.5-6 mL 2 %的HAuCl4分散加入10-40 mL去离子水，搅拌5 min后加入3.5-14 mg聚乙烯吡咯烷酮（PVP）放入溶液中再进行5 min的搅拌，以此来防止金纳米粒子的团聚；然后，将2.5-10 mL 5 mol/L柠檬酸钠溶液和1滴硼氢化钠溶液并继续搅拌12 h，生成物用去离子水和乙醇冲洗沉淀，直到上清液无色，并在50 ℃下干燥一夜。
3.一种基于金修饰的磷酸铈作为高效共反应加速器放大NHCDs-H2O2体系的夹心型ECL传感器，其所述的Fe3O4@Pt@NHCDs-Ab2材料的制备步骤如下：
(1)NHCDs的制备
在连续搅拌下将1.05-4.2 g柠檬酸溶于5-20 mL DMF中，随后滴加0.5-2 mL水合肼后转移到高压反应釜进行溶剂热反应；180 ℃下进行12 h热处理后自然冷却到室温；得到的溶液离心（12000 rpm, 10 min）去除大颗粒残留物，用离子水对溶液进行透析（1000da），然后60 ℃真空干燥，最后将获得的黑色粉末储存在4 ℃密闭容器中；
(2)Fe3O4的制备
将0.675-2.7 g FeCl3·6H2O溶解在15-60 mL乙二醇中搅拌30 min以形成透明溶液，然后，将1.8-7.2 g CH3COONa和0.5-2.0 g聚乙二醇加入溶液中剧烈搅拌30 min，将混合的反应物转移到 100 mL 内衬聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中加热至180 °C并保持16 h；通过离心收集黑色产物并用乙醇洗涤数次，然后在60 °C下干燥过夜；Fe3O4 纳米球是从上述干燥样品中获得的，在 300 °C下在N2流 (1.67 cm3g-1s-1) 中处理4 h；
(3)Fe3O4@Pt的制备
通常，1.5-6 mL 1 % H2PtCl6·(H2O)6、0.1-0.4 g PVP (30000) 和1-4 g Fe3O4纳米球混合在乙二醇溶液中；然后，由油浴控制的溶液温度逐渐升高至160 °C并保持20 min，将混合物冷却至室温后，再剧烈搅拌6 h，按照与上述Fe3O4纳米球载体相同的程序，分别清洗、干燥和煅烧制备的Fe3O4@Pt纳米球样品；
(4)Fe3O4@Pt@NHCDs的制备
将3-12 mg Fe3O4@Pt与1-4 mg NHCDs溶解在去离子水中，用震荡机震荡24 h后进行离心、洗涤、干燥，得到目标产物；
(5)Fe3O4@Pt@NHCDs-Ab2
称取6 mg Fe3O4@Pt@NHCDs复合物，加入1 mL黄曲霉毒素B1 (10 μg/mL)，1 mLPBS(pH=7.38)，在-4 ℃恒温振荡12 h后离心处理，向得到的沉淀物中加入1mLPBS溶液得到Fe3O4@Pt@NHCDs-Ab2。
4.AFB1的检验，步骤如下：
(1)使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电致化学发光免疫传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为600 V，循环伏安扫描电位范围为0 ~ 0.7V，扫描速率为0.15 V/s；
(2)在含20 ~ 80 mM H2O2和10 mL pH为6.47 ~ 9.18的磷酸盐缓冲溶液中(PBS，1/15 mol/L的KH2PO4和1/15 mol/L的Na2HPO4)，通过电化学发光方法，检测对不同浓度的AFB1标准溶液产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；
(3)将待测AFB1样品溶液代替AFB1标准溶液进行测定。
本发明的有益成果
(1)本发明采用CePO4纳米材料优异的形态特征、高的热稳定性、合适的酸性强度和低毒性等使得在多个领域中具有很大的应用潜力，能够承载更多的NHCDs；CePO4中的Ce3+和Ce4+的反复转化具有很高的催化活性和电活性，可促进O2 •−的产生，产生的O2 •−与NHCDs•反应产生更强的发光信号，通过Au修饰CePO4不仅提高了材料的电导率和加速电子转移，而且还可以增加抗原抗体的结合数量，增强ECL信号，提高了检测AFB1的灵敏度；
(2)采用低激发电位、高稳定性和良好的生物相容性的氮掺杂碳量子点作为发光体，使用过氧化氢 (H2O2) 作为共反应活性物质，碳量子点在溶液中能产生极强的ECL发射，从而提高了检测AFB1的准确性与特异性。
(3)本发明采用Fe3O4@Pt@NHCDs构建的超灵敏夹心型电致化学发光免疫传感器，基于此构建的传感器可应用于AFB1的临床检测，具有操作简单，检测快速，信号线性范围宽(0.0001 ~ 100 ng/mL) 和检出限低 (0.08 pg/mL) 的优点。
具体实施方式
实施例1一种基于金修饰的磷酸铈作为高效共反应加速器放大NHCDs-H2O2体系的夹心型ECL传感器，其所述的CePO4@Au材料的制备步骤如下：
(1)CePO4的制备
首先，将1.5 mmol Ce(NO3)3•6H2O和1.5 mmol (NH4)2HPO4分别溶于5 mL去离子水中，在强烈搅拌下，将(NH4)2HPO4溶液缓慢滴加到Ce(NO3)3•6H2O溶液中形成白色沉淀；然后，在混合物中滴加适量的25 wt.%氨水调节pH至10.45左右，白色沉淀溶解形成透明无色的溶液，将得到的溶液倒入内衬聚四氟乙烯的100 mL不锈钢高压釜中150 ℃下反应12 h，自然冷却至室温；收集得到的产品，用蒸馏水和无水乙醇洗涤数次，60 ℃下干燥12 h；
(2)CePO4@Au的制备
将25 mg制备的CePO4和1.5 mL 2 %的HAuCl4分散加入10 mL去离子水，搅拌5 min后加入3.5 mg聚乙烯吡咯烷酮（PVP）放入溶液中再进行5 min的搅拌，以此来防止金纳米粒子的团聚；然后，将2.5 mL 5 mol/L柠檬酸钠溶液和1滴硼氢化钠溶液并继续搅拌12 h，生成物用去离子水和乙醇冲洗沉淀，直到上清液无色，并在50 ℃下干燥一夜。
实施例2一种基于金修饰的磷酸铈作为高效共反应加速器放大NHCDs-H2O2体系的夹心型ECL传感器，其所述的CePO4@Au材料的制备步骤如下：
(1)CePO4的制备
首先，将3 mmol Ce(NO3)3•6H2O和3 mmol (NH4)2HPO4分别溶于10 mL去离子水中，在强烈搅拌下，将(NH4)2HPO4溶液缓慢滴加到Ce(NO3)3•6H2O溶液中形成白色沉淀；然后，在混合物中滴加适量的25 wt.%氨水调节pH至10.45左右，白色沉淀溶解形成透明无色的溶液，将得到的溶液倒入内衬聚四氟乙烯的100 mL不锈钢高压釜中150 ℃下反应12 h，自然冷却至室温；收集得到的产品，用蒸馏水和无水乙醇洗涤数次，60 ℃下干燥12 h；
(2)CePO4@Au的制备
将50 mg制备的CePO4和3 mL 2 %的HAuCl4分散加入20 mL去离子水，搅拌5 min后加入7 mg聚乙烯吡咯烷酮（PVP）放入溶液中再进行5 min的搅拌，以此来防止金纳米粒子的团聚；然后，将5 mL 5 mol/L柠檬酸钠溶液和1滴硼氢化钠溶液并继续搅拌12 h，生成物用去离子水和乙醇冲洗沉淀，直到上清液无色，并在50 ℃下干燥一夜。
实施例3一种基于金修饰的磷酸铈作为高效共反应加速器放大NHCDs-H2O2体系的夹心型ECL传感器，其所述的CePO4@Au材料的制备步骤如下：
(1)CePO4的制备
首先，将6 mmol Ce(NO3)3•6H2O和6 mmol (NH4)2HPO4分别溶于20 mL去离子水中，在强烈搅拌下，将(NH4)2HPO4溶液缓慢滴加到Ce(NO3)3•6H2O溶液中形成白色沉淀；然后，在混合物中滴加适量的25 wt.%氨水调节pH至10.45左右，白色沉淀溶解形成透明无色的溶液，将得到的溶液倒入内衬聚四氟乙烯的100 mL不锈钢高压釜中150 ℃下反应12 h，自然冷却至室温；收集得到的产品，用蒸馏水和无水乙醇洗涤数次，60 ℃下干燥12 h；
(2)CePO4@Au的制备
将100 mg制备的CePO4和6 mL 2 %的HAuCl4分散加入40 mL去离子水，搅拌5 min后加入14 mg聚乙烯吡咯烷酮（PVP）放入溶液中再进行5 min的搅拌，以此来防止金纳米粒子的团聚；然后，将10 mL 5 mol/L柠檬酸钠溶液和1滴硼氢化钠溶液并继续搅拌12 h，生成物用去离子水和乙醇冲洗沉淀，直到上清液无色，并在50 ℃下干燥一夜。
实施例4一种基于金修饰的磷酸铈作为高效共反应加速器放大NHCDs-H2O2体系的夹心型ECL传感器，其所述的Fe3O4@Pt@NHCDs-Ab2材料的制备步骤如下：
(1)NHCDs的制备
在连续搅拌下将1.05 g柠檬酸溶于5mL DMF中，随后滴加0.5 mL水合肼后转移到高压反应釜进行溶剂热反应；180 ℃下进行12 h热处理后自然冷却到室温；得到的溶液离心（12000 rpm, 10 min）去除大颗粒残留物，用离子水对溶液进行透析（1000da），然后60℃真空干燥，最后将获得的黑色粉末储存在4 ℃密闭容器中；
(2)Fe3O4的制备
将0.675 g FeCl3·6H2O溶解在15 mL乙二醇中搅拌30 min以形成透明溶液，然后，将1.8 g CH3COONa和0.5 g聚乙二醇加入溶液中剧烈搅拌30 min，将混合的反应物转移到100 mL 内衬聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中加热至180 °C并保持16 h；通过离心收集黑色产物并用乙醇洗涤数次，然后在60 °C下干燥过夜；Fe3O4 纳米球是从上述干燥样品中获得的，在 300 °C下在N2流 (1.67 cm3g-1s-1) 中处理4 h；
(3)Fe3O4@Pt的制备
通常，1.5 mL 1 % H2PtCl6·(H2O)6、0.1 g PVP (30000) 和1 g Fe3O4纳米球混合在乙二醇溶液中；然后，由油浴控制的溶液温度逐渐升高至160 °C并保持20 min，将混合物冷却至室温后，再剧烈搅拌6 h，按照与上述Fe3O4纳米球载体相同的程序，分别清洗、干燥和煅烧制备的Fe3O4@Pt纳米球样品；
(4)Fe3O4@Pt@NHCDs的制备
将3 mg Fe3O4@Pt与1 mg NHCDs溶解在去离子水中，用震荡机震荡24 h后进行离心、洗涤、干燥，得到目标产物；
(5)Fe3O4@Pt@NHCDs-Ab2
称取6 mg Fe3O4@Pt@NHCDs复合物，加入1 mL黄曲霉毒素B1 (10 μg/mL)，1 mLPBS(pH=7.38)，在-4 ℃恒温振荡12 h后离心处理，向得到的沉淀物中加入1mLPBS溶液得到Fe3O4@Pt@NHCDs-Ab2。
实施例5一种基于金修饰的磷酸铈作为高效共反应加速器放大NHCDs-H2O2体系的夹心型ECL传感器，其所述的Fe3O4@Pt@NHCDs-Ab2材料的制备步骤如下：
(1)NHCDs的制备
在连续搅拌下将2.1 g柠檬酸溶于10 mL DMF中，随后滴加1.0 mL水合肼后转移到高压反应釜进行溶剂热反应；180 ℃下进行12 h热处理后自然冷却到室温；得到的溶液离心（12000 rpm, 10 min）去除大颗粒残留物，用离子水对溶液进行透析（1000da），然后60℃真空干燥，最后将获得的黑色粉末储存在4 ℃密闭容器中；
(2)Fe3O4的制备
将1.35 g FeCl3·6H2O溶解在30 mL乙二醇中搅拌30 min以形成透明溶液，然后，将3.6 g CH3COONa和1.0 g聚乙二醇加入溶液中剧烈搅拌30 min，将混合的反应物转移到100 mL 内衬聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中加热至180 °C并保持16 h；通过离心收集黑色产物并用乙醇洗涤数次，然后在60 °C下干燥过夜；Fe3O4 纳米球是从上述干燥样品中获得的，在 300 °C下在N2流 (1.67 cm3g-1s-1) 中处理4 h；
(3)Fe3O4@Pt的制备
通常，3 mL 1 % H2PtCl6·(H2O)6、0.2 g PVP (30000) 和2 g Fe3O4纳米球混合在乙二醇溶液中；然后，由油浴控制的溶液温度逐渐升高至160 °C并保持20 min，将混合物冷却至室温后，再剧烈搅拌6 h，按照与上述Fe3O4纳米球载体相同的程序，分别清洗、干燥和煅烧制备的Fe3O4@Pt纳米球样品；
(4)Fe3O4@Pt@NHCDs的制备
将6 mg Fe3O4@Pt与2 mg NHCDs溶解在去离子水中，用震荡机震荡24 h后进行离心、洗涤、干燥，得到目标产物；
(5)Fe3O4@Pt@NHCDs-Ab2
称取6 mg Fe3O4@Pt@NHCDs复合物，加入1 mL黄曲霉毒素B1 (10 μg/mL)，1 mLPBS(pH=7.38)，在-4 ℃恒温振荡12 h后离心处理，向得到的沉淀物中加入1mLPBS溶液得到Fe3O4@Pt@NHCDs-Ab2。
实施例6一种基于金修饰的磷酸铈作为高效共反应加速器放大NHCDs-H2O2体系的夹心型ECL传感器，其所述的Fe3O4@Pt@NHCDs-Ab2材料的制备步骤如下：
(1)NHCDs的制备
在连续搅拌下将4.2 g柠檬酸溶于20 mL DMF中，随后滴加2.0 mL水合肼后转移到高压反应釜进行溶剂热反应；180 ℃下进行12 h热处理后自然冷却到室温；得到的溶液离心（12000 rpm, 10 min）去除大颗粒残留物，用离子水对溶液进行透析（1000da），然后60℃真空干燥，最后将获得的黑色粉末储存在4 ℃密闭容器中；
(2)Fe3O4的制备
将2.7 g FeCl3·6H2O溶解在60 mL乙二醇中搅拌30 min以形成透明溶液，然后，将7.2 g CH3COONa和2.0 g聚乙二醇加入溶液中剧烈搅拌30 min，将混合的反应物转移到100 mL 内衬聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中加热至180 °C并保持16 h；通过离心收集黑色产物并用乙醇洗涤数次，然后在60 °C下干燥过夜；Fe3O4 纳米球是从上述干燥样品中获得的，在 300 °C下在N2流 (1.67 cm3g-1s-1) 中处理4 h；
(3)Fe3O4@Pt的制备
通常，6 mL 1 % H2PtCl6·(H2O)6、0.4 g PVP (30000) 和4 g Fe3O4纳米球混合在乙二醇溶液中；然后，由油浴控制的溶液温度逐渐升高至160 °C并保持20 min，将混合物冷却至室温后，再剧烈搅拌6 h，按照与上述Fe3O4纳米球载体相同的程序，分别清洗、干燥和煅烧制备的Fe3O4@Pt纳米球样品；
(4)Fe3O4@Pt@NHCDs的制备
将12 mg Fe3O4@Pt与4 mg NHCDs溶解在去离子水中，用震荡机震荡24 h后进行离心、洗涤、干燥，得到目标产物；
(5)Fe3O4@Pt@NHCDs-Ab2
称取6 mg Fe3O4@Pt@NHCDs复合物，加入1 mL黄曲霉毒素B1 (10 μg/mL)，1 mLPBS(pH=7.38)，在-4 ℃恒温振荡12 h后离心处理，向得到的沉淀物中加入1mLPBS溶液得到Fe3O4@Pt@NHCDs-Ab2。
实施例7一种基于金修饰的磷酸铈作为高效共反应加速器放大NHCDs-H2O2体系的夹心型ECL传感器包括以下步骤：
(1)将玻碳电极用抛光粉打磨，再使用去离子水清洗，将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，并在-0.2 ~ 0.6 V电位下进行扫描，使峰电位的差值小于110 mV；
(2)将8 μL，2 mg/mL CePO4@Au纳米复合物溶液滴加在电极上，4 ℃下干燥；
(3)将8 μL，1 μg/mL AFB1抗体滴加在电极上，在4 ℃冰箱下干燥之后，用PBS清洗，以除去多余抗体，4 ℃下干燥；
(4)将3 μL，质量分数为1% BSA溶液滴加于电极上，用以封闭非特异性结合位点，干燥之后使用PBS洗去多余BSA，4 ℃下干燥；
(5)将8 μL，0.0001 ~ 100 ng/mL一系列不同浓度的AFB1抗原标准溶液滴加于电极上，4 ℃下干燥之后，用PBS清洗，除去多余抗原，4 ℃下干燥；
(6)将8 μL，3 mg/mL Fe3O4@Pt@NHCDs-Ab2标记的二抗滴加于电极上，室温下干燥之后，用PBS清洗，除去多余二抗，4 ℃下干燥，制得一种金修饰的CePO4材料夹心型电致化学发光免疫传感器。
实施例8一种基于金修饰的磷酸铈作为高效共反应加速器放大NHCDs-H2O2体系的夹心型ECL传感器包括以下步骤：
(1)将玻碳电极用抛光粉打磨，再使用去离子水清洗，将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，并在-0.2 ~ 0.6 V电位下进行扫描，使峰电位的差值小于110 mV；
(2)将8 μL，1 mg/mL CePO4@Au纳米复合物溶液滴加在电极上，4 ℃下干燥；
(3)将8 μL，1.5 μg/mL AFB1抗体滴加在电极上，在4 ℃冰箱下干燥之后，用PBS清洗，以除去多余抗体，4 ℃下干燥；
(4)将3 μL，质量分数为1.5% BSA溶液滴加于电极上，用以封闭非特异性结合位点，干燥之后使用PBS洗去多余BSA，4 ℃下干燥；
(5)0.0001 ~ 100 ng/mL一系列不同浓度的AFB1抗原标准溶液滴加于电极上，4℃下干燥之后，用PBS清洗，除去多余抗原，4 ℃下干燥；
(6)将8 μL，4 mg/mL Fe3O4@Pt@NHCDs-Ab2标记的二抗滴加于电极上，室温下干燥之后，用PBS清洗，除去多余二抗，4 ℃下干燥，制得金修饰的CePO4材料夹心型电致化学发光免疫传感器。
实施例9一种基于金修饰的磷酸铈作为高效共反应加速器放大NHCDs-H2O2体系的夹心型ECL传感器包括以下步骤：
(1)将玻碳电极用抛光粉打磨，再使用去离子水清洗，将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，并在-0.2 ~ 0.6 V电位下进行扫描，使峰电位的差值小于110 mV；
(2)将8 μL，3 mg/mL CePO4@Au纳米复合物溶液滴加在电极上，4 ℃下干燥；
(3)将8 μL，2 μg/mL AFB1抗体滴加在电极上，在4 ℃冰箱下干燥之后，用PBS清洗，以除去多余抗体，4 ℃下干燥；
(4)将3 μL，质量分数为2% BSA溶液滴加于电极上，用以封闭非特异性结合位点，干燥之后使用PBS洗去多余BSA，4 ℃下干燥；
(5)0.0001 ~ 100 ng/mL一系列不同浓度的AFB1抗原标准溶液滴加于电极上，4℃下干燥之后，用PBS清洗，除去多余抗原，4 ℃下干燥；
(6)将8 μL，5 mg/mL Fe3O4@Pt@NHCDs-Ab2标记的二抗滴加于电极上，室温下干燥之后，用PBS清洗，除去多余二抗，4 ℃下干燥，制得一种金修饰的CePO4材料夹心型电致化学发光免疫传感器。
实施例10 AFB1的检验，步骤如下：
(1)使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电致化学发光免疫传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为600 V，循环伏安扫描电位范围为0 ~0.7V，扫描速率为0.15 V/s；
(2)在含20 ~ 80 mM H2O2和10 mL pH为6.47 ~ 9.18的磷酸盐缓冲溶液中(PBS，1/15 mol/L的KH2PO4和1/15 mol/L的Na2HPO4)，通过电化学发光方法，检测对不同浓度的AFB1标准溶液产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；
(3)将待测AFB1样品溶液代替AFB1标准溶液进行测定；
(4)AFB1检测的线性范围是0.0001 ~ 100 ng/mL，检测限是0.08 pg/mL。

Claims (4)

1.一种基于金修饰的磷酸铈作为高效共反应加速器放大NHCDs-H2O2体系的夹心型ECL传感器包括以下步骤：
（1）用抛光粉将玻碳电极打磨，再使用去离子水清洗，将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，并在-0.2 ~ 0.6 V电位下进行扫描，使峰电位的差值小于110 mV；
（2）将8 μL，1 ~ 3 mg/mL磷酸铈@金 (CePO4@Au) 纳米复合物溶液滴加在电极上，4 ℃下干燥；
（3）将8 μL，1 ~ 2 μg/mL黄曲霉毒素B1 (AFB1) 抗体滴加在电极上，在4 ℃冰箱下干燥之后，用PBS清洗，以除去多余抗体，4 ℃下干燥；
（4）将3 μL，质量分数为1 ~ 2 % BSA溶液滴加于电极上，用以封闭非特异性结合位点，干燥之后使用PBS洗去多余BSA，4 ℃下干燥；
（5）将8 μL，0.0001 ~ 100 ng/mL一系列不同浓度的AFB1抗原标准溶液滴加于电极上，4 ℃下干燥之后，用PBS清洗，除去多余抗原，4 ℃下干燥；
（6）将8 μL，3 ~ 5 mg/mL Fe3O4@Pt@NHCDs-Ab2标记的二抗滴加于电极上，室温下干燥之后，用PBS清洗，除去多余二抗，4 ℃下干燥。
2.如权利1所述的一种基于金修饰的磷酸铈作为高效共反应加速器放大NHCDs-H2O2体系的夹心型ECL传感器，其所述的CePO4@Au材料的制备步骤如下：
（1）CePO4的制备
首先，将1.5-6 mmol Ce(NO3)3•6H2O和1.5-6 mmol (NH4)2HPO4分别溶于5-20 mL去离子水中，在强烈搅拌下，将(NH4)2HPO4溶液缓慢滴加到Ce(NO3)3•6H2O溶液中形成白色沉淀；然后，在混合物中滴加适量的25 wt.%氨水调节pH至10.45左右，白色沉淀溶解形成透明无色的溶液，将得到的溶液倒入内衬聚四氟乙烯的100 mL不锈钢高压釜中150 ℃下反应12 h，自然冷却至室温；收集得到的产品，用蒸馏水和无水乙醇洗涤数次，60 ℃下干燥12 h；
（2）CePO4@Au的制备
将25-100 mg制备的CePO4和1.5-6 mL 2 %的HAuCl4分散加入10-40 mL去离子水，搅拌5min后加入3.5-14 mg聚乙烯吡咯烷酮（PVP）放入溶液中再进行5 min的搅拌，以此来防止金纳米粒子的团聚；然后，将2.5-10 mL 5 mol/L柠檬酸钠溶液和1滴硼氢化钠溶液并继续搅拌12 h，生成物用去离子水和乙醇冲洗沉淀，直到上清液无色，并在50 ℃下干燥一夜。
3.如权利1所述的一种基于金修饰的磷酸铈作为高效共反应加速器放大NHCDs-H2O2体系的夹心型ECL传感器，其所述的Fe3O4@Pt@NHCDs-Ab2材料的制备步骤如下：
（1）NHCDs的制备
在连续搅拌下将1.05-4.2 g柠檬酸溶于5-20 mL DMF中，随后滴加0.5-2 mL水合肼后转移到高压反应釜进行溶剂热反应；180 ℃下进行12 h热处理后自然冷却到室温；得到的溶液离心（12000 rpm, 10 min）去除大颗粒残留物，用离子水对溶液进行透析（1000da），然后60 ℃真空干燥，最后将获得的黑色粉末储存在4 ℃密闭容器中；
（2）Fe3O4的制备
将0.675-2.7 g FeCl3·6H2O溶解在15-60 mL乙二醇中搅拌30 min以形成透明溶液，然后，将1.8-7.2 g CH3COONa和0.5-2.0 g聚乙二醇加入溶液中剧烈搅拌30 min，将混合的反应物转移到 100 mL 内衬聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中加热至180 °C并保持16 h；通过离心收集黑色产物并用乙醇洗涤数次，然后在60 °C下干燥过夜；Fe3O4 纳米球是从上述干燥样品中获得的，在 300 °C下在N2流 (1.67 cm3g-1s-1) 中处理4 h；
（3）Fe3O4@Pt的制备
通常，1.5-6 mL 1 % H2PtCl6·(H2O)6、0.1-0.4 g PVP (30000) 和1-4 g Fe3O4纳米球混合在乙二醇溶液中；然后，由油浴控制的溶液温度逐渐升高至160 °C并保持20 min，将混合物冷却至室温后，再剧烈搅拌6 h，按照与上述Fe3O4纳米球载体相同的程序，分别清洗、干燥和煅烧制备的Fe3O4@Pt纳米球样品；
（4）Fe3O4@Pt@NHCDs的制备
将3-12 mg Fe3O4@Pt与1-4 mg NHCDs溶解在去离子水中，用震荡机震荡24 h后进行离心、洗涤、干燥，得到目标产物；
（5）Fe3O4@Pt@NHCDs-Ab2
称取6 mg Fe3O4@Pt@NHCDs复合物，加入1 mL黄曲霉毒素B1 (10 μg/mL)，1 mLPBS (pH=7.38)，在-4 ℃恒温振荡12 h后离心处理，向得到的沉淀物中加入1mLPBS溶液得到Fe3O4@Pt@NHCDs-Ab2。
4.如权利1所述的一种基于金修饰的磷酸铈作为高效共反应加速器放大NHCDs-H2O2体系的夹心型ECL传感器，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电致化学发光免疫传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为600 V，循环伏安扫描电位范围为0 ~ 0.7 V，扫描速率为0.15 V/s；
（2）在含20 ~ 80 mM H2O2和10 mL pH为6.47 ~ 9.18的磷酸盐缓冲溶液中 (PBS，1/15mol/L的KH2PO4和1/15 mol/L的Na2HPO4)，通过电化学发光方法，检测对不同浓度的AFB1标准溶液产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；
（3）将待测AFB1样品溶液代替AFB1标准溶液进行测定。
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