CN112858420A - 一种基于硒化钒/金纳米粒子构建的夹心型电化学传感器的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于新型功能材料与生物传感技术领域，涉及一种基于硒化钒/金纳米粒子(VSe2/Au NPs)的纳米复合材料的电化学传感器的制备，用于灵敏检测降钙素原(PCT)。本发明电化学传感器的制备方法为：分别制备作为基底的VSe2/Au NPs纳米复合材料和作为标记物的磷化钼/碳纳米管复合材料(MoP/CNTs)，基于此构建夹心型传感器。VSe2具有较低的电荷转移阻力，将金纳米粒子负载到VSe2上，能够提高材料的电催化性能。将CNTs嵌入到MoP中，大大提高了材料对H2O2的催化性能。根据此方法构建的电化学免疫传感器用于测定实际血清样本的PCT浓度，表现出优异的稳定性和选择性，为检测PCT提供了一种新的检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种电化学免疫传感器的制备与应用，具体说是一种以硒化钒/金纳米粒子(VSe2/Au NPs)为传感平台，以磷化钼/碳纳米管复合材料(MoP/CNTs)为标记物的夹心型免疫传感器，本发明属于新型功能材料、生物传感技术领域。
背景技术
脓毒症是一种发病率高、死亡率高的疾病，它可以由身体任何部位的细菌、病毒或真菌免疫反应引起；降钙素原(PCT)在评估脓毒症的严重程度和进展中起着至关重要的作用，健康人的血清PCT浓度低于0.1 ng/mL，而脓毒症患者的血清PCT浓度则显著高于2 ng/mL；目前，PCT被认为是一种可靠的分子生物标记物，用于检测、早期筛查和诊断脓毒症。
电化学生物传感器利用化学传感的方法，提供半定量或定量的分析信息，具有检测速度快、灵敏度高、选择性好、成本低、设备轻便等优点，在临床检测和监测治疗中具有十分广阔的发展前景。
VSe2是一种有前途的过渡金属硒化物，具有独特的电子结构，在相邻的V4+离子之间存在强电子耦合；这一特性使VSe2具有更强的金属特性，具有优异的催化活性和较低的电荷转移电阻；VSe2和Au NPs复合使大量的Ab1-PCT负载在电极表面，促进了电子转移；VSe2/Au NPs的应用为固定抗体提供了良好的活性位点，进一步有效地放大了检测抗体的电流信号；钼是一种重要的元素，钼基化合物，如MoP、MoS2、MoN、MoO2和Mo2C，因其优异的电催化性能而引起了人们的极大兴趣；我们开发了一种简单的方法来合成MoOx(OH)y/CNTs中间体，然后转化为MoP/CNTs杂化物，其中小尺寸、高度分散和结晶良好的MoP纳米粒子均匀地涂覆在CNTs侧壁上；MoP/CNTs杂化材料在表现出优异的电催化活性；除了提高导电性外，CNTs的加入还显著降低了纳米粒子的团聚和烧结，因为金属离子和CNTs之间有很强的相互作用。
发明内容
本发明的目的之一是制备一种以VSe2/Au NPs粒子为传感平台，以MoP/CNTs为标记物的夹心型免疫传感器。
本发明的目的之二是将该传感器用于PCT的高灵敏、特异性检测。
本发明的技术方案如下：
1.一种基于硒化钒/金纳米粒子构建的夹心型电化学传感器的制备方法如下：
(1)将玻碳电极用抛光粉打磨，再使用去离子水清洗，将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，并在-0.2~0.6 V电位下进行扫描，使峰电位的差值小于110 mV；
(2)将8 μL，1 ~ 3 mg/mL VSe2/Au NPs纳米复合物溶液滴加在电极上，室温下干燥；
(3)将8 μL，1 ~ 2 μg/mL PCT抗体滴加在电极上，室温下干燥之后，用PBS清洗，除去多余抗体，室温下干燥；
(4)将3 μL，质量分数为1 ~ 2% BSA溶液滴加于电极上，用以封闭非特异性结合位点，干燥之后使用PBS洗去多余BSA，室温下干燥；
(5)将8 μL，0.01 pg/mL ~ 50 ng/mL一系列不同浓度的PCT抗原标准溶液滴加于电极上，室温下干燥之后，用PBS清洗，除去多余抗原，室温下干燥；
(6)将8 μL，3 ~ 5 mg/mL MoP/CNTs标记的二抗滴加于电极上，室温下干燥之后，用PBS清洗，除去多余二抗，室温下干燥，制得一种基于硒化钒/金纳米粒子构建的夹心型电化学传感器。
2.一种基于硒化钒/金纳米粒子构建的夹心型电化学传感器的制备方法及应用，其所述的VSe2/Au NPs材料的制备步骤如下：
(1) VSe2的合成
将3.00mmol SeO2 (0.3329g)、0.75mmol V2O5 (0.1364g)和14.63 mmol C2H2O4·2H2O (1.8444g)放入高压反应釜 (50mL)中，加入30 mL去离子水；高压釜置于烘箱中并在200 ℃下保持24 h；在水热反应后，用热水和乙醇中各洗涤2-3次，洗涤后，将产物再真空干燥箱中干燥24 h；
(2) Au-COOH的合成
将20 mL含有0.2 g HAuCl4和75 mg硫代苹果酸的溶液置于脱氧甲醇(85 mL)中；然后在剧烈磁力搅拌下缓慢滴加25 mL，0.2 mol / L NaBH4水溶液(0.1891 g)； 通过离心收集深褐色沉淀物，用水/乙醇(体积比1/4)反复洗涤以除去杂质并干燥；
(3)APTES-VSe2的合成
将介孔VSe2纳米颗粒(0.1 g)和APTES(0.1 mL)溶于25 mL乙醇超声处理(30 min)以获得对称分散体并在70 ℃下保持回流1.5 h；将得到的产物离心，用乙醇和超纯水洗涤并干燥；
(4) VSe2/Au NPs的合成
将Au-COOH(10~20 mg)和APTES-VSe2(30~60 mg)分散在超纯水中并超声处理并再搅拌3 h；将产物离心，用超纯水洗涤并再真空干燥箱中干燥24 h，收集产物VSe2 /Au NPs。
3.一种基于硒化钒/金纳米粒子构建的夹心型电化学传感器的制备方法及应用，其所述的MoP/CNTs-Ab2材料的制备步骤如下：
(1)轻度氧化碳纳米管(MWCNTs)的合成
多壁碳纳米管(MWCNTs)首先在500 ℃下煅烧1 h并用稀盐酸(10％)洗涤来纯化；将纯化的MWCNTs(1g)放入250mL圆底烧杯中，加入23 mL浓硫酸，并将混合物在室温下搅拌过夜；接下来，将烧瓶在40 ℃的油浴中加热，并向悬浮液中加入200 mg NaNO3并使其溶解5min；之后缓慢加入1g KMnO4，并保持反应温度低于45 ℃；将溶液搅拌30 min；然后，向烧瓶中加入3 mL水，5 min后再加入3 mL水，再过5 min后，加入40 mL水；15 min后，从油浴中取出烧瓶，加入140 mL水和10 mL 30％H2O2以终止反应；将该悬浮液在室温下搅拌5 min；然后将其反复离心并用5％ HCl溶液洗涤两次，然后用大量水洗涤；将最终的沉淀物分散在10mL水中并在冷冻干燥机中干燥；最后，收集1 g的干燥产物；
(2)MoOx (OH)y/CNTs的合成
取MWCNTs (20 mg)分散于40 mL无水乙醇中，将0.2M MoCl5和NH4HCO3 (2 mmol)依次加入CNTs悬浮液中，合成的混合物经400 rpm磁搅拌5h后，离心冻干收集固体产物；
(3)MoP/CNT杂化物的合成
称取70~210 mg MoOx(OH)y/CNTs前体置于石英舟中，称取500~1500 mg NaH2PO2·2H2O置于另一只石英舟中并放置在石英管上游区域，两石英舟距离10 cm；用高纯N2冲洗后，将管式炉从室温加热到700 ℃维持1 h，得到MoP/CNTs杂化物；
(4)MoP/CNTs-Ab2的合成
称取6 mg MoP/CNTs杂化物，加入1 mL 2 mmol/L NHS， 1 mL 10 mmol/L EDC (用pH=7.38的PBS溶液配制)，1 mL PCT-Ab2 (10 μg/mL)， 1 mLPBS (pH=7.38)，-4 ℃恒温振荡10 h；在-4℃离心，向得到的沉淀物中加入1mLPBS溶液得到MoP/ CNTs-Ab2。
4.PCT的检测步骤如下：
(1)使用电化学工作站的三电极体系进行测试，所有的电化学测量都采用传统的三电极系统：一个饱和甘汞电极作为参考电极，一个铂电极作为对电极，所制备的电化学免疫传感器为工作电极；通过DPV法(范围和方向：-0.8 ~ 0.7 V，电位增量：0.004 V，幅值：0.05 V，脉宽：0.04 s，采样宽度：0.01 s，脉冲周期：0.1 s)在PBS (pH=7.38)中进行电化学测量；
(2)在10 mL、pH 6.0 ~ 8.5的PBS缓冲溶液中，通过电化学方法，检测对不同浓度的PCT标准溶液产生的电化学信号，绘制工作曲线；
(3)将待测PCT样品溶液代替PCT标准溶液进行测定。
本发明的有益成果：
(1)本发明采用VSe2 /Au NPs作为基底材料，其具有优异的电化学活性和较低的电荷转移电阻，同时能够更大限度的结合抗体，具有较高且稳定的电化学信号，提高了检测PCT的灵敏度；
(2)采用MoP/CNTs作为标记物，经活化后直接与二抗进行孵化，表现出了优异的电催化性能；
(3)本发明采用VSe2 /Au NPs及MoP/CNTs复合材料构建的超灵敏电化学免疫传感器，基于此构建的传感器可应用于PCT的临床检测，具有操作简单，检测快速，信号线性范围宽(0.01 pg/mL ~ 50 ng/mL)和检出限低(4.17 fg/mL)的优点；
具体实施方式：
实施例1 一种基于硒化钒/金纳米粒子构建的夹心型电化学传感器的制备方法及应用，其所述的VSe2/Au NPs材料的制备步骤如下：
(1) VSe2的合成
将3.00 mmol SeO2(0.3329 g)、0.75 mmol V2O5(0.1364 g)和14.63 mmolC2H2O4·2H2O(1.8444 g)放入高压反应釜(50 mL)中，加入30 mL去离子水；高压釜置于烘箱中并在200 ℃下保持24 h；在水热反应后，用热水和乙醇中各洗涤2-3次，洗涤后，将产物再真空干燥箱中干燥24 h；
(2) Au-COOH的合成
将20 mL含有0.2 g HAuCl4和75 mg硫代苹果酸的溶液置于脱氧甲醇(85 mL)中；然后在剧烈磁力搅拌下缓慢滴加25 mL，0.2mol / L NaBH4水溶液(0.1891g)；通过离心收集深褐色沉淀物，用水/乙醇(体积比1/4)反复洗涤以除去杂质并干燥；
(3) APTES- VSe2的合成
将介孔VSe2纳米颗粒(0.1 g)和APTES(0.1 mL)溶于25 mL乙醇超声处理(30 min)以获得对称分散体并在70 ℃下保持回流1.5 h；将得到的产物离心，用乙醇和超纯水洗涤并干燥；
(4) VSe2 /Au NPs的合成
将Au-COOH(10 mg)和APTES- VSe2(30 mg)分散在超纯水中并超声处理并再搅拌3h；将产物离心，用超纯水洗涤并再真空干燥箱中干燥24 h，收集产物VSe2 /Au NPs。
实施例2 一种基于硒化钒/金纳米粒子构建的夹心型电化学传感器的制备方法及应用，其所述的VSe2/Au NPs材料的制备步骤如下：
(1) VSe2的合成
将3.00mmol SeO2(0.3329 g)、0.75mmol V2O5(0.1364 g)和14.63mmol C2H2O4·2H2O(1.8444 g)放入高压反应釜(50 mL)中，加入30 mL去离子水；高压釜置于烘箱中并在200 ℃下保持24 h；在水热反应后，用热水和乙醇中各洗涤2-3次，洗涤后，将产物再真空干燥箱中干燥24 h；
(2) Au-COOH的合成
将20mL含有0.2 g HAuCl4和75 mg硫代苹果酸的溶液置于脱氧甲醇(85 mL)中；然后在剧烈磁力搅拌下缓慢滴加25 mL，0.2mol / L NaBH4水溶液(0.1891 g)；通过离心收集深褐色沉淀物，用水/乙醇(体积比1/4)反复洗涤以除去杂质并干燥；
(3)APTES- VSe2的合成
将介孔VSe2纳米颗粒(0.1g)和APTES(0.1mL)溶于25 mL乙醇超声处理(30 min)以获得对称分散体并在70℃下保持回流1.5 h；将得到的产物离心，用乙醇和超纯水洗涤并干燥；
(4) VSe2/Au NPs的合成
将Au-COOH(15 mg)和APTES- VSe2(45 mg)分散在超纯水中并超声处理并再搅拌3h；将产物离心，用超纯水洗涤并再真空干燥箱中干燥24 h，收集产物VSe2 /Au NPs。
实施例3 一种基于硒化钒/金纳米粒子构建的夹心型电化学传感器的制备方法及应用，其所述的VSe2/Au NPs材料的制备步骤如下：
(1) VSe2的合成
将3.00 mmol SeO2(0.3329 g)、0.75 mmol V2O5(0.1364 g)和14.63 mmolC2H2O4·2H2O(1.8444 g)放入高压反应釜(50 mL)中，加入30 mL去离子水；高压釜置于烘箱中并在200 ℃下保持24 h；在水热反应后，用热水和乙醇中各洗涤2-3次，洗涤后，将产物再真空干燥箱中干燥24 h；
(2) Au-COOH的合成
将20 mL含有0.2 g HAuCl4和75 mg硫代苹果酸的溶液置于脱氧甲醇(85 mL)中；然后在剧烈磁力搅拌下缓慢滴加25 mL，0.2 mol / L NaBH4水溶液(0.1891 g)； 通过离心收集深褐色沉淀物，用水/乙醇(体积比1/4)反复洗涤以除去杂质并干燥；
(3) APTES- VSe2的合成
将介孔VSe2纳米颗粒(0.1 g)和APTES(0.1 mL)溶于25 mL乙醇超声处理(30 min)以获得对称分散体并在70 ℃下保持回流1.5 h；将得到的产物离心，用乙醇和超纯水洗涤并干燥；
(4) VSe2 /Au NPs的合成
将Au-COOH(20 mg)和APTES-VSe2(60 mg)分散在超纯水中并超声处理并再搅拌3h；将产物离心，用超纯水洗涤并再真空干燥箱中干燥24 h，收集产物VSe2 /Au NPs。
实施例4 一种基于硒化钒/金纳米粒子构建的夹心型电化学传感器的制备方法及应用，其所述的MoP/CNTs-Ab2材料的制备步骤如下：
(1) 轻度氧化碳纳米管(MWCNTs)的合成
多壁碳纳米管(MWCNTs)首先在500 ℃下煅烧1 h并用稀盐酸(10％)洗涤来纯化；将纯化的MWCNTs(1g)放入250 mL圆底烧杯中，加入23 mL浓硫酸，并将混合物在室温下搅拌过夜；接下来，将烧瓶在40 ℃的油浴中加热，并向悬浮液中加入200 mg NaNO3并使其溶解5min；之后缓慢加入1g KMnO4，并保持反应温度低于45 ℃；将溶液搅拌30 min；然后，向烧瓶中加入3 mL水，5 min后再加入3 mL水；再过5 min后，加入40 mL水，15 min后，从油浴中取出烧瓶，加入140 mL水和10 mL 30％H2O2以终止反应；将该悬浮液在室温下搅拌5 min；然后将其反复离心并用5％HCl溶液洗涤两次，然后用大量水洗涤；将最终的沉淀物分散在10mL水中并在冷冻干燥机中干燥，最后，收集1g的干燥产物；
(2) MoOx (OH)y/CNTs的合成
取MWCNTs (20 mg)分散于40 mL无水乙醇中；将0.2M MoCl5和NH4HCO3 (2 mmol)依次加入CNTs悬浮液中；合成的混合物经400 rpm磁搅拌5 h后，离心冻干收集固体产物；
(3) MoP/CNTs杂化物的合成
称取70 mg MoOx(OH)y/CNTs前体置于石英舟中，称取500 mg NaH2PO2·2H2O置于另一只石英舟中并放置在石英管上游区域，两石英舟距离10 cm；用高纯N2冲洗后，将管式炉从室温加热到700 ℃维持1 h，得到MoP/CNTs杂化物；
(4) MoP/CNTs-Ab2的合成
称取6 mg MoP/CNTs杂化物，加入1 mL 2 mmol/L NHS， 1 mL 10 mmol/L EDC (用pH=7.38的PBS溶液配制)，1 mL PCT-Ab2 (10 μg/mL)，1 mLPBS (pH=7.38)， -4 ℃恒温振荡10 h；在-4 ℃离心，向得到的沉淀物中加入1mLPBS溶液得到MoP/ CNTs-Ab2。
实施例5 一种基于硒化钒/金纳米粒子构建的夹心型电化学传感器的制备方法及应用，其所述的MoP/CNTs-Ab2材料的制备步骤如下：
(1) 轻度氧化碳纳米管(MWCNTs)的合成
多壁碳纳米管(MWCNTs)首先在500 ℃下煅烧1 h并用稀盐酸(10％)洗涤来纯化；将纯化的MWCNTs(1g)放入250 mL圆底烧杯中，加入23 mL浓硫酸，并将混合物在室温下搅拌过夜；接下来，将烧瓶在40 ℃的油浴中加热，并向悬浮液中加入200 mg NaNO3并使其溶解5min；之后缓慢加入1g KMnO4，并保持反应温度低于45 ℃；将溶液搅拌30 min；然后，向烧瓶中加入3 mL水，5 min后再加入3 mL水；再过5 min后，加入40 mL水，15 min后，从油浴中取出烧瓶，加入140 mL水和10 mL 30％H2O2以终止反应；将该悬浮液在室温下搅拌5 min；然后将其反复离心并用5％HCl溶液洗涤两次，然后用大量水洗涤；将最终的沉淀物分散在10mL水中并在冷冻干燥机中干燥，最后，收集1 g的干燥产物；
(2) MoOx (OH)y/CNTs的合成
取MoCNTs (20 mg)分散于40 mL无水乙醇中；将0.2M MoCl5和NH4HCO3 (2 mmol)依次加入CNTs悬浮液中；合成的混合物经400 rpm磁搅拌5 h后，离心冻干收集固体产物；
(3) MoP/CNTs杂化物的合成
称取140 mg MoOx(OH)y/CNTs前体置于石英舟中，称取1000 mg NaH2PO2·2H2O置于另一只石英舟中并放置在石英管上游区域，两石英舟距离10 cm；用高纯N2冲洗后，将管式炉从室温加热到700 ℃维持1 h，得到MoP/CNTs杂化物；
(4) MoP/CNTs-Ab2的合成
称取6 mg MoP/CNTs杂化物，加入1 mL 2 mmol/L NHS， 1 mL 10 mmol/L EDC (用pH=7.38的PBS溶液配制)，1 mL PCT-Ab2 (10 μg/mL)，1 mLPBS (pH=7.38)， -4 ℃恒温振荡10 h；在-4 ℃离心，向得到的沉淀物中加入1mLPBS溶液得到MoP/ CNTs-Ab2。
实施例6 一种基于硒化钒/金纳米粒子构建的夹心型电化学传感器的制备方法及应用，其所述的MoP/CNTs-Ab2材料的制备步骤如下：
(1) 轻度氧化碳纳米管(MWCNTs)的合成
多壁碳纳米管(MWCNTs)首先在500 ℃下煅烧1 h并用稀盐酸(10％)洗涤来纯化；将纯化的MWCNTs(1g)放入250mL圆底烧杯中，加入23 mL浓硫酸，并将混合物在室温下搅拌过夜；接下来，将烧瓶在40 ℃的油浴中加热，并向悬浮液中加入200 mg NaNO3并使其溶解5min；之后缓慢加入1g KMnO4，并保持反应温度低于45 ℃；将溶液搅拌30 min；然后，向烧瓶中加入3 mL水，5 min后再加入3 mL水，再过5 min后，加入40 mL水；15 min后，从油浴中取出烧瓶，加入140 mL水和10 mL 30％H2O2以终止反应；将该悬浮液在室温下搅拌5 min；然后将其反复离心并用5％HCl溶液洗涤两次，然后用大量水洗涤；将最终的沉淀物分散在10mL水中并在冷冻干燥机中干燥，最后，收集1g的干燥产物；
(2) MoOx (OH)y/CNTs的合成
取MWCNTs (20 mg)分散于40 mL无水乙醇中；将0.2M MoCl5和NH4HCO3 (2 mmol)依次加入CNTs悬浮液中；合成的混合物经400 rpm磁搅拌5 h后，离心冻干收集固体产物；
(3) MoP/CNTs杂化物的合成
称取210 mg MoOx(OH)y/CNTs前体置于石英舟中，称取1500 mg NaH2PO2·2H2O置于另一只石英舟中并放置在石英管上游区域，两石英舟距离10 cm；用高纯N2冲洗后，将管式炉从室温加热到700 ℃维持1 h，得到MoP/CNTs杂化物；
(4) MoP/CNTs-Ab2的合成
称取6 mg MoP/CNTs杂化物，加入1 mL 2 mmol/L NHS， 1 mL 10 mmol/L EDC (用pH=7.38的PBS溶液配制)，1 mL PCT-Ab2 (10 μg/mL)，1 mLPBS (pH=7.38)， -4 ℃恒温振荡10 h；在-4 ℃离心，向得到的沉淀物中加入1mLPBS溶液得到MoP/ CNTs-Ab2。
实施例7 一种基于硒化钒/金纳米粒子构建的夹心型电化学传感器的制备方法包括以下步骤：
(1)将玻碳电极用抛光粉打磨，再使用去离子水清洗，将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，并在-0.2~0.6 V电位下进行扫描，使峰电位的差值小于110 mV；
(2)将8 μL，2 mg/mL VSe2/Au NPs纳米复合物溶液滴加在电极上，室温下干燥；
(3)将8 μL，1 μg/mL PCT抗体滴加在电极上，室温下干燥之后，用PBS清洗，除去多余抗体，室温下干燥；
(4)将3 μL，质量分数为1 % BSA溶液滴加于电极上，用以封闭非特异性结合位点，干燥之后使用PBS洗去多余BSA，室温下干燥；
(5)将8 μL，0.01 pg/mL ~ 50 ng/mL一系列不同浓度的PCT抗原标准溶液滴加于电极上，室温下干燥之后，用PBS清洗，除去多余抗原，室温下干燥；
(6)将8 μL，5 mg/mL MoP/CNTs标记的二抗滴加于电极上，室温下干燥之后，用PBS清洗，除去多余二抗，室温下干燥；
实施例8 一种基于硒化钒/金纳米粒子构建的夹心型电化学传感器的制备方法包括以下步骤：
(1)将玻碳电极用抛光粉打磨，再使用去离子水清洗，将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，并在-0.2~0.6 V电位下进行扫描，使峰电位的差值小于110 mV；
(2)将8 μL 1 mg/mL VSe2/Au NPs纳米复合物溶液滴加在电极上，室温下干燥；
(3)将8 μL 1.5 μg/mL PCT抗体滴加在电极上，室温下干燥之后，用PBS清洗，除去多余抗体，室温下干燥；
(4)将3 μL，质量分数为1.5% BSA溶液滴加于电极上，用以封闭非特异性结合位点，干燥之后使用PBS洗去多余BSA，室温下干燥；
(5)将8 μL，0.01 pg/mL ~ 50 ng/mL一系列不同浓度的PCT抗原标准溶液滴加于电极上，室温下干燥之后，用PBS清洗，除去多余抗原，室温下干燥；
(6)将8 μL，3 mg/mL MoP/CNTs标记的二抗滴加于电极上，室温下干燥之后，用PBS清洗，除去多余二抗，室温下干燥；
实施例9 一种基于硒化钒/金纳米粒子构建的夹心型电化学传感器的制备方法包括以下步骤：
(1)将玻碳电极用抛光粉打磨，再使用去离子水清洗，将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，并在-0.2~0.6 V电位下进行扫描，使峰电位的差值小于110 mV；
(2)将8 μL，3 mg/mL VSe2/Au NPs纳米复合物溶液滴加在电极上，室温下干燥；
(3)将8 μL， 2 μg/mL PCT抗体滴加在电极上，室温下干燥之后，用PBS清洗，除去多余抗体，室温下干燥；
(4)将3 μL，质量分数为 2% BSA溶液滴加于电极上，用以封闭非特异性结合位点，干燥之后使用PBS洗去多余BSA，室温下干燥；
(5)将8 μL，0.01pg/mL ~ 50 ng/mL一系列不同浓度的PCT抗原标准溶液滴加于电极上，室温下干燥之后，用PBS清洗，除去多余抗原，室温下干燥；
(6)将8 μL，4 mg/mL MoP/CNTs标记的二抗滴加于电极上，室温下干燥之后，用PBS清洗，除去多余二抗，室温下干燥；
实施例10 PCT的检测步骤如下：
(1)使用电化学工作站的三电极体系进行测试，所有的电化学测量都采用传统的三电极系统：一个饱和甘汞电极作为参考电极，一个铂电极作为对电极，所制备的电化学免疫传感器为工作电极；通过DPV法(范围和方向：-0.8 ~ 0.7 V，电位增量：0.004 V，幅值：0.05 V，脉宽：0.04 s，采样宽度：0.01 s，脉冲周期：0.1 s)在PBS (pH=7.38)中进行电化学测量；
(2)在10 mL、pH 6.0 ~ 8.5的PBS缓冲溶液中，通过电化学方法，检测对不同浓度的PCT标准溶液产生的电化学信号，绘制工作曲线；
(3)将待测PCT样品溶液代替PCT标准溶液进行测定；
(4)PCT检测的线性范围是0.01 pg/mL ~ 50 ng/mL，检测限是4.17 fg/mL。
Claims (4)
1.一种基于硒化钒/金纳米粒子构建的夹心型电化学传感器的制备方法包括以下步骤：
(1)将玻碳电极用抛光粉打磨，再使用去离子水清洗，将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，并在-0.2~0.6 V电位下进行扫描，使峰电位的差值小于110 mV；
(2)将8 μL，1 ~ 3 mg/mL 硒化钒/金纳米粒子(VSe2/Au NPs)溶液滴加在电极上，室温下干燥；
(3)将8 μL，1 ~ 2 μg/mL 降钙素原(PCT)抗体滴加在电极上，室温下干燥之后，用PBS清洗，除去多余抗体，室温下干燥；
(4)将3 μL，质量分数为1 ~ 2% BSA溶液滴加于电极上，用以封闭非特异性结合位点，干燥之后使用PBS洗去多余BSA，室温下干燥；
(5)将8 μL，0. 01 pg/mL ~ 50 ng/mL一系列不同浓度的PCT抗原标准溶液滴加于电极上，室温下干燥之后，用PBS清洗，除去多余抗原，室温下干燥；
(6)将8 μL，3 ~ 5 mg/mL MoP/CNTs标记的二抗滴加于电极上，室温下干燥之后，用PBS清洗，除去多余二抗，室温下干燥。
2.如权利1所述的一种基于硒化钒/金纳米粒子构建的夹心型电化学传感器的制备方法及应用，其所述的硒化钒/金纳米粒子的制备步骤如下：
(1) VSe2的合成
将3.00 mmol SeO2(0.3329g)、0.75 mmol V2O5(0.1364g)和14.63 mmol C2H2O4·2H2O(1.8444g)放入高压反应釜(50mL)中，加入30mL去离子水；高压釜置于烘箱中并在200 ℃下保持24 h；在水热反应后，用热水和乙醇中各洗涤2-3次，洗涤后，将产物再真空干燥箱中干燥24 h；
(2) Au-COOH的合成
将20 mL含有0.2 g HAuCl4和75 mg硫代苹果酸的溶液置于脱氧甲醇(85mL)中；然后在剧烈磁力搅拌下缓慢滴加25 mL，0.2mol/L NaBH4(0.1891g)水溶液；通过离心收集深褐色沉淀物，用水/乙醇(体积比1/4)反复洗涤以除去杂质并干燥；
(3) APTES-VSe2的合成
将介孔VSe2纳米颗粒(0.1g）和APTES(0.1mL)溶于25mL乙醇超声处理(30 min)以获得对称分散体并在70 ℃下保持回流1.5 h；将得到的产物离心，用乙醇和超纯水洗涤并干燥；
(4) VSe2-Au NPs的合成
将Au-COOH (10~20 mg) 和APTES-VSe2 (30~60 mg) 分散在超纯水中并超声处理并再搅拌3 h；将产物离心，用超纯水洗涤并再真空干燥箱中干燥24 h，收集产物VSe2 -Au NPs。
3.如权利1所述的一种基于硒化钒/金纳米粒子构建的夹心型电化学传感器的制备方法及应用，其所述的磷化钼/碳纳米管复合材料的制备步骤如下：
(1) 轻度氧化碳纳米管(MWCNTs)的合成
多壁碳纳米管(MWCNT)首先在500 ℃下煅烧1 h并用稀盐酸(10％)洗涤来纯化，将纯化的MWCNT(1g)放入250 mL圆底烧杯中，加入23 mL浓硫酸，并将混合物在室温下搅拌过夜；接下来，将烧瓶在40 ℃的油浴中加热，并向悬浮液中加入200 mg NaNO3并使其溶解；之后缓慢加入1g KMnO4，并保持反应温度低于45 ℃，将溶液搅拌30 min；然后，向烧瓶中加入3 mL水，5 min后再加入3 mL水；再过5 min后，加入40 mL水；15 min后，从油浴中取出烧瓶，加入140 mL水和10 mL 30％ H2O2以终止反应；将该悬浮液在室温下搅拌5 min；然后将其反复离心并用5％HCl溶液洗涤两次，然后用大量水洗涤；将最终的沉淀物分散在10 mL水中并在冷冻干燥机中干燥，最后，收集1 g的干燥产物；
(2) MoOx (OH)y/CNT的合成
取MWCNT (20 mg) 分散于40 mL无水乙醇中；将MoCl5 (0.2 M)和NH4HCO3 (2 mmol)依次加入CNT悬浮液中；合成的混合物经400 rpm磁搅拌5 h后，离心冻干收集固体产物；
(3) MoP/CNT杂化物的合成
称取70 ~210 mg MoOx(OH)y/CNT前体置于石英舟中，称取500 ~1500 mg NaH2PO2·2H2O置于另一只石英舟中并放置在石英管上游区域，两石英舟距离10 cm；用高纯N2冲洗后，将管式炉从室温加热到700℃维持1 h，得到MoP/CNT杂化物；
(4) MoP/CNT-Ab2的合成
称取6 mg MoP/CNT杂化物，加入1 mL 2 mmol/L NHS, 1 mL 10 mmol/L EDC (用pH=7.38的PBS溶液配制)，1 mL PCT-Ab2 (10 μg/mL),1 mLPBS (pH=7.38), -4 ℃恒温振荡10h；在-4 ℃离心，向得到的沉淀物中加入1mLPBS溶液得到MoP/CNT-Ab2。
4.如权利1所述的一种基于硒化钒/金纳米粒子构建的夹心型电化学传感器的制备方法及应用，其特征为用于PCT的检测，检测步骤如下：
(1)使用电化学工作站的三电极体系进行测试，所有的电化学测量都采用传统的三电极系统：一个饱和甘汞电极作为参考电极，一个铂电极作为对电极，所制备的电化学免疫传感器为工作电极；通过DPV法(范围和方向：-0.8 ~ 0.7 V，电位增量:0.004 V，幅值:0.05V，脉宽:0.04 s，采样宽度:0.01 s，脉冲周期:0.1 s)在pH为7.38的PBS缓冲液中进行电化学测量；
(2)在10 mL、pH 6.0 ~ 8.5的PBS缓冲溶液中，通过电化学方法，检测对不同浓度的PCT标准溶液产生的电化学信号，绘制工作曲线；
(3)将待测PCT样品溶液代替PCT标准溶液进行测定。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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- 2021-03-30 CN CN202110341582.XA patent/CN112858420A/zh active Pending
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