CN108709996A - 一种金钯复合纳米酶免疫传感器的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于新型纳米复合材料、免疫分析和生物传感技术领域,本发明涉及一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器的制备方法及应用,基于负载金纳米粒子的多孔钯复合材料构建的电化学免疫传感器,用于定量检测癌胚抗原含量,具有特异性强,灵敏度高,检测限低的优点,对癌症的早期诊断具有重要的科学意义和应用价值。
Description
技术领域
本发明属于新型纳米复合材料、免疫分析和生物传感技术领域,提供了一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器的制备方法,应用于癌胚抗原的检测。
背景技术
癌症是全球最严重的健康问题之一,癌胚抗原是高度糖基化的蛋白质,由大肠癌组织产生,作为抗原可引起患者的免疫反应,癌胚抗原在许多恶性肿瘤的存在下含量会升高,如胃癌、结肠直肠癌、乳腺癌、肝癌等。癌胚抗原浓度的精确检测对癌症的早期诊断具有重要意义。因此,发展高灵敏的癌胚抗原的定量检测方法尤为迫切。
近年来,随着临床诊断技术的飞速发展,性能优越的电化学免疫传感器脱颖而出,并被广泛应用于病毒标志物或肿瘤标志物的检测中。无标记型电化学免疫传感器是基于抗原和抗体特异性结合的一种分析方法,具有检测迅速、检出限低、灵敏度高、操作简单和制备成本低的优点,对痕量级病毒和肿瘤标志物的检测具有重要价值。
基底材料和催化剂材料作为电化学免疫传感器的重要组分,对提高免疫传感器的灵敏度具有重要作用。近年来,纳米材料及其复合材料被广泛应用于免疫传感器的构建当中。本发明利用层层自组装技术,以负载金纳米粒子的多孔钯同时作为基底材料和催化剂材料,构建的无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器,具有检测范围广、检测下限低、操作简单、检测速度快等优点,对癌症的早期诊断具有重要的应用价值。
发明内容
本发明提供了一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器的制备方法及应用,实现了对癌胚抗原的超灵敏检测。
本发明的目的之一是提供一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器的制备方法。
本发明的目的之二是将所制备的一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器用于癌胚抗原的检测。
本发明的技术方案,包括以下步骤:
1. 一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器的制备方法,步骤如下:
(1)将直径为3.0 ~ 5.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面,在无水乙醇中超声清洗干净;
(2)将6.0 µL、0.5 ~ 2.0 mg/mL的Au@Pd纳米粒子分散液滴加到电极表面,超纯水冲洗,室温下晾干;
(3)将6.0 µL、5 ~ 15 µg/mL的癌胚抗原捕获抗体滴加到电极表面,pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面,4.0 ℃冰箱中干燥;
(4)继续将3.0 µL、1~ 2 mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面,用以封闭电极表面上非特异性活性位点,pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面,4.0 ℃冰箱中晾干;
(5)继续滴加6.0 µL、0.01 pg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原溶液,用pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗,4.0 ℃冰箱中干燥,制得一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器。
2. 一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器的制备方法,所述相关材料的制备,步骤如下:
(1)金纳米粒子溶液的制备
在室温下,将1.0 ~ 2.0 mL、1.0 wt%的氯金酸溶液加入到99.0 mL超纯水中,依次加入7.7 ~ 15.4 mg谷胱甘肽,3.0 ~ 6.0 mL甲醇,0.5 ~ 1.0 mL乙酸,搅拌5 min,快速加入1.5~ 3.0 mL现配制的20 mg/mL的硼氢化钠溶液,继续搅拌2 h,得到金纳米粒子的水分散系;
(2)多孔钯的制备
在室温下,将20 ~ 40 mL、0.5 g/mL的四氯钯酸钾溶液加入到10 ~ 20 mL、2 g/L的罗丹明B碱溶液中,磁力搅拌5 min后,逐滴滴加2 ~ 4 mL、10 wt%的抗坏血酸溶液,继续搅拌30 min,得到多孔钯的水分散系;
(3)Au@Pd纳米粒子的制备
取1.0 ~ 1.5 mL、12 wt%的多孔钯纳米粒子置于20 mL烧杯中,加入1.0 ~ 1.5 mL、12wt%的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液,持续搅拌30 min,超声20 min后,离心,用超纯水洗涤,继续加入1.0 ~ 1.5 mL、1.0 mol/mL的金纳米粒子后,搅拌均匀,超声20 min后,离心,用超纯水洗涤,将所得到的溶液离心洗涤,得到Au@Pd纳米粒子分散液。
3. 一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器的制备,用于癌胚抗原的检测,步骤如下:
(1)使用电化学工作站,在三电极体系下进行测试,以饱和甘汞电极为参比电极,以铂丝电极为对电极,以所制备的免疫传感器为工作电极,在10 mL包含5.0 mmol/L过氧化氢溶液的pH 5.29 ~ 8.04磷酸盐缓冲溶液中进行测试;
(2)用时间-电流法对分析物进行检测,输入电压为-0.4 V,取样间隔0.1 s,运行时间400 s;
(3)当背景电流趋于稳定后,每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.0磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5 mol/L的过氧化氢溶液,记录电流变化;
(3)记录不同浓度下的癌胚抗原所对应的电流峰值;
(4)利用工作曲线法,得到待测样品中癌胚抗原的浓度。
本发明的有益成果
(1)本发明利用金纳米粒子能够有效增加电极表面的电子传递效率,并且,由于金纳米粒子具有良好的生物相容性,能够稳定结合大量的具有活性的捕获抗体,从而增加免疫传感器的稳定性,对于提高免疫传感器的灵敏度具有重要作用,有辣根过氧化物酶活性的金纳米粒子和多孔钯纳米粒子,催化性能和导电性能极佳的多孔钯和金纳米粒子结合后,有效增强了导电性,通过这种协同作用和优势互补作用,增大免疫传感器的灵敏度;
(2)一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器对癌胚抗原的检测,其对癌胚抗原检测范围是0.01 pg/mL ~ 100 ng/mL,最低检测下限为0.1 fg/mL;表明一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器可以达到精确定量检测癌胚抗原的目的。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明,但不限于此。
实施例1 一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器的制备方法
(1)将直径为3.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面,在无水乙醇中超声清洗干净;
(2)将6.0 µL、0.5 mg/mL的Au@Pd纳米粒子分散液滴加到电极表面,超纯水冲洗,室温下晾干;
(3)将6.0 µL、5.0 µg/mL的癌胚抗原捕获抗体滴加到电极表面,pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面,4.0 ℃冰箱中干燥;
(4)继续将3.0 µL、1.0 mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面,用以封闭电极表面上非特异性活性位点,pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面,4.0 ℃冰箱中晾干;
(5)继续滴加6.0 µL、0.01 pg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原溶液,用pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗,4.0 ℃冰箱中干燥,制得一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器。
实施例2 一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器的制备方法
(1)将直径为4.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面,在无水乙醇中超声清洗干净;
(2)将6.0 µL、1.0 mg/mL的Au@Pd纳米粒子分散液滴加到电极表面,超纯水冲洗,室温下晾干;
(3)将6.0 µL、10.0 µg/mL的癌胚抗原捕获抗体滴加到电极表面,pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面,4.0 ℃冰箱中干燥;
(4)继续将3.0 µL、1.5 mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面,用以封闭电极表面上非特异性活性位点,pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面,4.0 ℃冰箱中晾干;
(5)继续滴加6.0 µL、0.01 pg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原溶液,用pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗,4.0 ℃冰箱中干燥,制得一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器。
实施例3 一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器的制备方法
(1)将直径为5.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面,在无水乙醇中超声清洗干净;
(2)将6.0 µL、2.0 mg/mL的Au@Pd纳米粒子分散液滴加到电极表面,超纯水冲洗,室温下晾干;
(3)将6.0 µL、15.0 µg/mL的癌胚抗原捕获抗体滴加到电极表面,pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面,4.0 ℃冰箱中干燥;
(4)继续将3.0 µL、2.0 mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面,用以封闭电极表面上非特异性活性位点,pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面,4.0 ℃冰箱中晾干;
(5)继续滴加6.0 µL、0.01 pg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原溶液,用pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗,4.0 ℃冰箱中干燥,制得一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器。
实施例4 所述金纳米粒子分散液的制备
在室温下,将1.0 mL、1.0 wt%的氯金酸溶液加入到99.0 mL超纯水中,依次加入7.7 mg谷胱甘肽,3.0 mL甲醇,0.5 mL乙酸,搅拌5 min,快速加入1.5 mL现配制的20 mg/mL的硼氢化钠溶液,继续搅拌2 h,得到金纳米粒子的水分散系。
实施例5 所述金纳米粒子分散液的制备
在室温下,将1.5 mL、1.0 wt%的氯金酸溶液加入到99.0 mL超纯水中,依次加入11.5mg谷胱甘肽,4.5 mL甲醇,0.75 mL乙酸,搅拌5 min,快速加入2.25 mL现配制的20 mg/mL的硼氢化钠溶液,继续搅拌2 h,得到金纳米粒子的水分散系。
实施例6 所述金纳米粒子分散液的制备
在室温下,将2.0 mL、1.0 wt%的氯金酸溶液加入到99.0 mL超纯水中,依次加入15.4mg谷胱甘肽,6.0 mL甲醇,1.0 mL乙酸,搅拌5 min,快速加入3.0 mL现配制的20 mg/mL的硼氢化钠溶液,继续搅拌2 h,得到金纳米粒子的水分散系。
实施例7 所述Au@Pd纳米粒子的制备
① 多孔钯的制备
在室温下,将20 mL、0.5 g/mL的四氯钯酸钾溶液加入到10 mL、2 g/L的罗丹明B碱溶液中,磁力搅拌5 min后,逐滴滴加2 mL、10 wt%的抗坏血酸溶液,继续搅拌30 min,得到多孔钯的水分散系;
② Au@Pd纳米粒子的制备
取1.0 mL、12 wt%的多孔钯纳米粒子置于20 mL烧杯中,加入1.0 mL、12 wt%的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液,持续搅拌30 min,超声20 min后,离心,用超纯水洗涤,继续加入1.0 mL、1.0 mol/mL的金纳米粒子后,搅拌均匀,超声20 min后,离心,用超纯水洗涤,将所得到的溶液离心洗涤,得到Au@Pd纳米粒子分散液。
实施例8 所述Au@Pd纳米粒子的制备
① 多孔钯的制备
在室温下,将30 mL、0.5 g/mL的四氯钯酸钾溶液加入到15 mL、2 g/L的罗丹明B碱溶液中,磁力搅拌5 min后,逐滴滴加3 mL、10 wt%的抗坏血酸溶液,继续搅拌30 min,得到多孔钯的水分散系;
② Au@Pd纳米粒子的制备
取1.25 mL、12 wt%的多孔钯纳米粒子置于20 mL烧杯中,加入1.25 mL、12 wt%的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液,持续搅拌30 min,超声20 min后,离心,用超纯水洗涤,继续加入1.25 mL、1.0 mol/mL的金纳米粒子后,搅拌均匀,超声20 min后,离心,用超纯水洗涤,将所得到的溶液离心洗涤,得到Au@Pd纳米粒子分散液。
实施例9 所述Au@Pd纳米粒子的制备
① 多孔钯的制备
在室温下,将40 mL、0.5 g/mL的四氯钯酸钾溶液加入到20 mL、2 g/L的罗丹明B碱溶液中,磁力搅拌5 min后,逐滴滴加4 mL、10 wt%的抗坏血酸溶液,继续搅拌30 min,得到多孔钯的水分散系;
② Au@Pd纳米粒子的制备
取1.5 mL、12 wt%的多孔钯纳米粒子置于20 mL烧杯中,加入1.5 mL、12 wt%的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液,持续搅拌30 min,超声20 min后,离心,用超纯水洗涤,继续加入1.5 mL、1.0 mol/mL的金纳米粒子后,搅拌均匀,超声20 min后,离心,用超纯水洗涤,将所得到的溶液离心洗涤,得到Au@Pd纳米粒子分散液。
实施例10 所述的无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器对癌胚抗原的检测
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为辅助电极,所制备的传感器为工作电极,在10 mL、50 mmol/L的pH 5.29 ~ 8.04磷酸盐缓冲溶液中进行测试;
(2)用时间-电流法对分析物进行检测,输入电压为-0.4 V,取样间隔0.1 s,运行时间400 s;
(3)当背景电流趋于稳定后,每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.0磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5 mol/L的过氧化氢溶液,记录电流变化;
(3)记录不同浓度下的癌胚抗原所对应的电流峰值;
(4)利用工作曲线法,得到所述免疫传感器对癌胚抗原的线性检测范围是0.01 pg/mL~ 100 ng/mL,检测限为0.1 fg/mL。
糖类抗原125的检测:
绘制工作曲线步骤同实施例10,按照绘制工作曲线的方法对糖类抗原125进行样品分析,测得其线性范围为0.1 pg/mL ~ 100 ng/mL,检测限为1 fg/mL。
Claims (5)
1.一种金钯复合纳米酶免疫传感器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)Au@Pd纳米粒子的制备:将单独制备的金纳米粒子和钯纳米粒子结合;
(2)构建无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器,测定癌胚抗原含量,绘制工作曲线。
2.根据权利要求1所述的一种检测癌胚抗原的无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器及其制备方法,其特征在于:步骤(1)所述的Au@Pd纳米粒子的制备具体如下:
① 金纳米粒子溶液的制备
在室温下,将1.0 ~ 2.0 mL、1.0 wt%的氯金酸溶液加入到99.0 mL超纯水中,依次加入7.7 ~ 15.4 mg谷胱甘肽,3.0 ~ 6.0 mL甲醇,0.5 ~ 1.0 mL乙酸,搅拌5 min,快速加入1.5~ 3.0 mL现配制的20 mg/mL的硼氢化钠溶液,继续搅拌2 h,得到金纳米粒子的水分散系;
② 多孔钯的制备
在室温下,将20 ~ 40 mL、0.5 g/mL的四氯钯酸钾溶液加入到10 ~ 20 mL、2 g/L的罗丹明B碱溶液中,磁力搅拌5 min后,逐滴滴加2 ~ 4 mL、10 wt%的抗坏血酸溶液,继续搅拌30 min,得到多孔钯的水分散系;
③ Au@Pd纳米粒子的制备
取1.0 ~ 1.5 mL、12 wt%的多孔钯纳米粒子置于20 mL烧杯中,加入1.0 ~ 1.5 mL、12wt%的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液,持续搅拌20 ~ 40 min,超声15 ~ 20 min后,离心,用超纯水洗涤,继续加入1.0 ~ 1.5 mL、1.0 mol/mL的金纳米粒子后,搅拌均匀,超声15 ~ 20min后,离心,用超纯水洗涤,将所得到的溶液离心洗涤,得到Au@Pd纳米粒子分散液。
3.根据权利要求1所述的一种检测癌胚抗原的无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器及其制备方法,其特征在于:步骤(2)所述的构建无标记型电化学免疫传感器,具体如下:
(1)将直径为3.0 ~ 5.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面,在无水乙醇中超声清洗干净;
(2)将6.0 µL、0.5 ~ 2.0 mg/mL的Au@Pd纳米粒子分散液滴加到电极表面,超纯水冲洗,室温下晾干;
(3)将6.0 µL、5 ~ 15 µg/mL的癌胚抗原捕获抗体滴加到电极表面,pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面,4.0 ℃冰箱中干燥;
(4)继续将3.0 µL、1~ 2 mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面,用以封闭电极表面上非特异性活性位点,pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面,4.0 ℃冰箱中晾干;
(5)继续滴加6.0 µL、0.01 pg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原溶液,用pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗,4.0 ℃冰箱中干燥,制得一种无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器。
4.根据权利要求1所述的一种检测癌胚抗原的无标记型金钯复合纳米酶免疫传感器及其制备方法,其特征在于:步骤(2)所述的测定癌胚抗原,绘制工作曲线,具体如下:
① 采用10 mL、50 mmol/L的pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液配制不同浓度的癌胚抗原溶液,将3 ~ 10 µL不同浓度的癌胚抗原溶液分别滴涂至所得的不同电极表面,反应0.5 ~ 2h,晾干后连接至电化学工作站中,分别将电极浸于pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中测定其氧化还原电流变化,当背景电流趋于稳定后,每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.0磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5 mol/L的过氧化氢溶液,记录电流变化;
② 根据所得电流差值与癌胚抗原浓度呈线性关系,绘制工作曲线;
③ 利用工作曲线法,得到待测样品中癌胚抗原的浓度。
5.如权利要求1所述的一种金钯复合纳米酶免疫传感器的制备方法制备的传感器,用于癌胚抗原的测定,其特征在于,所述肿瘤标志物选自下列之一:癌胚抗原、糖类抗原125。
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- 2018-05-17 CN CN201810472436.9A patent/CN108709996B/zh not_active Expired - Fee Related
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