CN107505466A - 一种检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于新型纳米材料、免疫分析和生物传感技术领域，本发明涉及一种检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的制备方法及应用。本发明首次将介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球引入电化学免疫传感器的构建中，用于标记乙型肝炎表面检测抗体并放大电流信号。本发明的电化学免疫传感器实现了乙型肝炎表面抗原的精确定量检测，具有操作简单，响应迅速，灵敏度高，检测限低的优点，可用于临床分析，为乙型肝炎病毒感染的早期诊断提供重要的依据。

Description

一种检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的制备方法 及应用
技术领域
本发明属于新型纳米材料、免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的制备方法及应用，具体涉及一种基于介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球的电化学免疫传感器的构建方法，以及由该方法构建的电化学免疫传感器在检测乙型肝炎表面抗原中的应用。
背景技术
乙型肝炎病毒感染是全球最严重的健康问题之一，乙型肝炎病毒携带者正在面临由这种持续性感染引发并发症的风险，例如引发慢性肝炎、肝硬化和肝癌。乙型肝炎病毒感染的潜伏期约为半年，因此，乙型肝炎病毒感染的早期诊断对降低其并发症发病率具有重要意义。乙型肝炎表面抗原是一种重要的乙型肝炎病毒标志物，它能够在潜伏期内乙型肝炎病毒携带者的血液中被检测出来，血液中乙型肝炎表面抗原的浓度为乙型肝炎病毒感染的早期诊断提供了重要依据。因此，发展高灵敏的乙型肝炎表面抗原的定量检测方法对乙型肝炎病毒感染的早期诊断尤为重要。
电化学免疫传感器是基于抗原和抗体特异性结合的一种分析方法，具有检测迅速、检出限低、灵敏度高、操作简单和制备成本低的优点。近年来，电化学免疫传感器备受关注，被广泛应用于病毒标志物或肿瘤标志物的检测中。本发明利用层层自组装技术，以金纳米棒为基底，以介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球作为乙型肝炎表面检测抗体的标记物，制备了一种检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器，实现了对乙型肝炎表面抗原的精确定量检测，具有检测范围广、检测下限低、灵敏度高、操作简单、检测速度快等优点，并且具有良好的重现性、稳定性和选择性，为乙型肝炎病毒感染的早期诊断提供了可靠的检测手段。
发明内容
本发明提供了一种检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器，所述电化学免疫传感器包括：工作电极、对电极和参比电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰金纳米棒、乙型肝炎表面捕获抗体、牛血清蛋白、乙型肝炎表面抗原、介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球标记的乙型肝炎表面检测抗体。所述对电极为铂丝电极，所述参比电极为饱和甘汞电极。
本发明的目的之一是提供一种检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的制备方法。
本发明的目的之二是将所制备的一种检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器用于乙型肝炎表面抗原的检测。
本发明的技术方案，包括以下步骤。
（1）制备金纳米棒分散液；
（2）制备介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球标记的乙型肝炎表面检测抗体分散液；
（3）制备检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的工作电极；
（4）制作检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的工作曲线。
其中，步骤（1）的制备金纳米棒分散液，包括以下步骤：
①制备金晶种分散液
取2.5 mL、0.2 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵溶液和1.5 mL、1.0 mmol/L的氯金酸溶液置于50 mL圆底烧瓶中，在35.0 ℃水浴中强磁力搅拌30.0 min后，快速加入0.6 mL、0.01mol/L的新配置的硼氢化钠溶液，停止磁力搅拌，在35.0 ℃水浴中静置3.0 h，得到金晶种分散液；
②制备金纳米棒分散液
取50.0 mL、0.2 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵溶液，5.0 mL、15.0 mmol/L的氯金酸溶液，2.5 mL、4.0 mmol/L的硝酸银溶液和45.0 mL超纯水置于500 mL三口烧瓶中，摇匀后，置于35.0 ℃水浴中，缓慢加入1.25 mL、0.08 mol/L的抗坏血酸溶液，待混合液稳定后，将200.0 ~ 500.0 µL的金晶种分散液逐滴加入，在35.0 ℃水浴中静置24.0 h后，离心，用超纯水洗涤，将所得到的沉淀重新分散于20.0 mL 超纯水中，得到金纳米棒分散液。
步骤（2）的制备介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球标记的乙型肝炎表面检测抗体分散液，包括以下步骤：
①制备介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球
取2.5 mL、20.0 mmol/L的氯金酸溶液，2.5 mL、20.0 mmol/L的四氯钯酸钠溶液，4.0mL、20.0 mmol/L的氯铂酸溶液和0.1 g的Pluronic F127置于50 mL圆底烧瓶中，超声分散后，置于油浴中，在磁力搅拌下迅速加入1.5 ~ 4.5 mL、0.4 mol/L的抗坏血酸溶液，油浴升温至80.0 ℃，持续磁力搅拌1.0 h后，停止油浴，自然冷却至室温，离心，用超纯水洗涤，将所得到的固体置于30.0 ℃真空干燥箱内干燥24.0 h，得到介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球；
②制备介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球标记的乙型肝炎表面检测抗体分散液
取3.0 ~ 9.0 mg介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球分散到1.0 mL、pH=7.0的磷酸盐缓冲液中，加入1.0 ~ 2.0 mL、10.0 ~ 20.0 µg/mL的乙型肝炎表面检测抗体分散液，置于4.0 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化8.0 ~ 12.0 h后，在1000 rpm转速下离心0.5 ~ 1.5min，得到下层沉淀，加入1.0 mL、pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，将下层沉淀重新分散于1.0 mL、pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中，分散均匀，得到介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球标记的乙型肝炎表面检测抗体分散液，在4.0 ℃下保存。
步骤（3）的制备检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的工作电极，包括以下步骤：
①将直径为3.0 ~ 5.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
②取6.0 µL、0.5 ~ 4.0 mg/mL的金纳米棒分散液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
③继续将6.0 µL、5.0 ~ 15.0 µg/mL的乙型肝炎表面捕获抗体滴加到电极表面，4.0℃冰箱中干燥；
④继续将3.0 µL、1.0 ~ 2.0 wt%的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0 ℃冰箱中晾干；
⑤滴加6.0 µL、0.00002 ~ 200 ng/mL的一系列不同浓度的乙型肝炎表面抗原溶液，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0 ℃冰箱中晾干；
⑥将6.0 µL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球标记的乙型肝炎表面检测抗体分散液滴涂于电极表面，静置于4.0 ℃冰箱中30.0 ~ 40.0 min，用pH=7.0的磷酸盐缓冲液冲洗，置于4.0 ℃冰箱中晾干，制得一种检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的工作电极。
步骤（4）的制作检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的工作曲线，包括以下步骤：
①使用电化学工作站，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝电极为对电极，与所制备的工作电极组成三电极系统，在10.0 mL包含5.0 mmol/L过氧化氢溶液、2.0 mmol/L邻苯二胺溶液的pH 5.5 ~ 8.5磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
②利用差分脉冲伏安法分别检测不同乙型肝炎表面抗原浓度下的电流峰值，扫描范围为0.1 ~ 0.5 V，脉冲振幅为50 mV，脉冲宽度为50 ms，脉冲周期为500 ms；
③记录不同浓度下的乙型肝炎表面抗原所对应的电流峰值，绘制检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器工作曲线；
④利用工作曲线法，得到待测样品中乙型肝炎表面抗原的浓度。
本发明所用的原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。
本发明的有益成果
（1）本发明利用金纳米棒作为基底能够有效增加电极表面的电子传递效率，并且，金纳米棒具有良好的生物相容性和稳定性，使其表面能够稳定结合大量的具有活性的乙型肝炎表面捕获抗体，从而增加免疫传感器的稳定性，对于提高免疫传感器的灵敏度具有重要作用；
（2）本发明首次将介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球作为乙型肝炎表面检测抗体的标记物用于免疫传感器的构建。所述的标记物不仅能够提供大量的催化活性位点，而且能加速电子的转移速率，从而有效放大电信号，提高免疫传感器的灵敏度，降低免疫传感器的检测下限；
（3）本发明的电化学免疫传感器对乙型肝炎病毒表面抗原实现了精确定量检测的目的，其线性检测范围是0.00002 ng/mL ~ 200 ng/mL，最低检测下限为6.7 fg/mL；
（4）本发明的方法构建的电化学免疫传感器，操作简单、检测迅速，可用于实际样品的快速检测。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。
实施例1 制备金纳米棒分散液
①制备金晶种分散液
取2.5 mL、0.2 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵溶液和1.5 mL、1.0 mmol/L的氯金酸溶液置于50 mL圆底烧瓶中，在35.0 ℃水浴中强磁力搅拌30.0 min后，快速加入0.6 mL、0.01mol/L的新配置的硼氢化钠溶液，停止磁力搅拌，在35.0 ℃水浴中静置3.0 h，得到金晶种分散液；
②制备金纳米棒分散液
取50.0 mL、0.2 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵溶液，5.0 mL、15.0 mmol/L的氯金酸溶液，2.5 mL、4.0 mmol/L的硝酸银溶液和45.0 mL超纯水置于500 mL三口烧瓶中，摇匀后，置于35.0 ℃水浴中，缓慢加入1.25 mL、0.08 mol/L的抗坏血酸溶液，待混合液稳定后，将200.0 µL的金晶种分散液逐滴加入，在35.0 ℃水浴中静置24.0 h后，离心，用超纯水洗涤，将所得到的沉淀重新分散于20.0 mL超纯水中，得到金纳米棒分散液。
实施例2 制备金纳米棒分散液
①制备金晶种分散液
取2.5 mL、0.2 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵溶液和1.5 mL、1.0 mmol/L的氯金酸溶液置于50 mL圆底烧瓶中，在35.0 ℃水浴中强磁力搅拌30.0 min后，快速加入0.6 mL、0.01mol/L的新配置的硼氢化钠溶液，停止磁力搅拌，在35.0 ℃水浴中静置3.0 h，得到金晶种分散液；
②制备金纳米棒分散液
取50.0 mL、0.2 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵溶液，5.0 mL、15.0 mmol/L的氯金酸溶液，2.5 mL、4.0 mmol/L的硝酸银溶液和45.0 mL超纯水置于500 mL三口烧瓶中，摇匀后，置于35.0 ℃水浴中，缓慢加入1.25 mL、0.08 mol/L的抗坏血酸溶液，待混合液稳定后，将300.0 µL的金晶种分散液逐滴加入，在35.0 ℃水浴中静置24.0 h后，离心，用超纯水洗涤，将所得到的沉淀重新分散于20.0 mL超纯水中，得到金纳米棒分散液。
实施例3 制备金纳米棒分散液
①制备金晶种分散液
取2.5 mL、0.2 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵溶液和1.5 mL、1.0 mmol/L的氯金酸溶液置于50 mL圆底烧瓶中，在35.0 ℃水浴中强磁力搅拌30.0 min后，快速加入0.6 mL、0.01mol/L的新配置的硼氢化钠溶液，停止磁力搅拌，在35.0 ℃水浴中静置3.0 h，得到金晶种分散液；
②制备金纳米棒分散液
取50.0 mL、0.2 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵溶液，5.0 mL、15.0 mmol/L的氯金酸溶液，2.5 mL、4.0 mmol/L的硝酸银溶液和45.0 mL超纯水置于500 mL三口烧瓶中，摇匀后，置于35.0 ℃水浴中，缓慢加入1.25 mL、0.08 mol/L的抗坏血酸溶液，待混合液稳定后，将500.0 µL的金晶种分散液逐滴加入，在35.0 ℃水浴中静置24.0 h后，离心，用超纯水洗涤，将所得到的沉淀重新分散于20.0 mL超纯水中，得到金纳米棒分散液。
实施例4 制备介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球标记的乙型肝炎表面检测抗体分散液
①制备介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球
取2.5 mL、20.0 mmol/L的氯金酸溶液，2.5 mL、20.0 mmol/L的四氯钯酸钠溶液，4.0mL、20.0 mmol/L的氯铂酸溶液和0.1 g的Pluronic F127置于50 mL圆底烧瓶中，超声分散后，置于油浴中，在磁力搅拌下迅速加入1.5 mL、0.4 mol/L的抗坏血酸溶液，油浴升温至80.0 ℃，持续磁力搅拌1.0 h后，停止油浴，自然冷却至室温，离心，用超纯水洗涤，将所得到的固体置于30.0 ℃真空干燥箱内干燥24.0 h，得到介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球；
②制备介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球标记的乙型肝炎表面检测抗体分散液
取3.0 mg介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球分散到1.0 mL、pH=7.0的磷酸盐缓冲液中，加入1.0 mL、10.0 µg/mL的乙型肝炎表面检测抗体分散液，置于4.0 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化8.0 h后，在1000 rpm转速下离心0.5 min，得到下层沉淀，加入1.0 mL、pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，将下层沉淀重新分散于1.0 mL、pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中，分散均匀，得到介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球标记的乙型肝炎表面检测抗体分散液，在4.0 ℃下保存。
实施例5 制备介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球标记的乙型肝炎表面检测抗体分散液
①制备介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球
取2.5 mL、20.0 mmol/L的氯金酸溶液，2.5 mL、20.0 mmol/L的四氯钯酸钠溶液，4.0mL、20.0 mmol/L的氯铂酸溶液和0.1 g的Pluronic F127置于50 mL圆底烧瓶中，超声分散后，置于油浴中，在磁力搅拌下迅速加入3.0 mL、0.4 mol/L的抗坏血酸溶液，油浴升温至80.0 ℃，持续磁力搅拌1.0 h后，停止油浴，自然冷却至室温，离心，用超纯水洗涤，将所得到的固体置于30.0 ℃真空干燥箱内干燥24.0 h，得到介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球；
②制备介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球标记的乙型肝炎表面检测抗体分散液
取6.0 mg介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球分散到1.0 mL、pH=7.0的磷酸盐缓冲液中，加入1.5 mL、15 µg/mL的乙型肝炎表面检测抗体分散液，置于4.0 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化10.0 h后，在1000 rpm转速下离心1.0 min，得到下层沉淀，加入1.0 mL、pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，将下层沉淀重新分散于1.0 mL、pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中，分散均匀，得到介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球标记的乙型肝炎表面检测抗体分散液，在4.0 ℃下保存。
实施例6 制备介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球标记的乙型肝炎表面检测抗体分散液
①制备介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球
取2.5 mL、20.0 mmol/L的氯金酸溶液，2.5 mL、20.0 mmol/L的四氯钯酸钠溶液，4.0mL、20.0 mmol/L的氯铂酸溶液和0.1 g的Pluronic F127置于50 mL圆底烧瓶中，超声分散后，置于油浴中，在磁力搅拌下迅速加入4.5 mL、0.4 mol/L的抗坏血酸溶液，油浴升温至80.0 ℃，持续磁力搅拌1.0 h后，停止油浴，自然冷却至室温，离心，用超纯水洗涤，将所得到的固体置于30.0 ℃真空干燥箱内干燥24.0 h，得到介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球；
②制备介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球标记的乙型肝炎表面检测抗体分散液
取9.0 mg介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球分散到1.0 mL、pH=7.0的磷酸盐缓冲液中，加入2.0 mL、20.0 µg/mL的乙型肝炎表面检测抗体分散液，置于4.0 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12.0 h后，在1000 rpm转速下离心1.5 min，得到下层沉淀，加入1.0 mL、pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，将下层沉淀重新分散于1.0 mL、pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中，分散均匀，得到介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球标记的乙型肝炎表面检测抗体分散液，在4.0 ℃下保存。
实施例7 制备检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的工作电极
①将直径为3.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
②取6.0 µL、0.5 mg/mL的金纳米棒分散液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
③继续将6.0 µL、5.0 µg/mL的乙型肝炎表面捕获抗体滴加到电极表面，4.0 ℃冰箱中干燥；
④继续将3.0 µL、1.0 wt%的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0 ℃冰箱中晾干；
⑤滴加6.0 µL、0.00002 ng/mL的乙型肝炎表面抗原溶液，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0 ℃冰箱中晾干；
⑥将6.0 µL、1.0 mg/mL的介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球标记的乙型肝炎表面检测抗体分散液滴涂于电极表面，静置于4.0 ℃冰箱中30.0 min，用pH=7.0的磷酸盐缓冲液冲洗，置于4.0 ℃冰箱中晾干，制得一种检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的工作电极。
实施例8 制备检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的工作电极
①将直径为4.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
②取6.0 µL、2.0 mg/mL的金纳米棒分散液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
③继续将6.0 µL、10.0 µg/mL的乙型肝炎表面捕获抗体滴加到电极表面，4.0 ℃冰箱中干燥；
④继续将3.0 µL、1.5 wt%的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0 ℃冰箱中晾干；
⑤滴加6.0 µL、100 ng/mL的乙型肝炎表面抗原溶液，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0 ℃冰箱中晾干；
⑥将6.0 µL、2.0 mg/mL的介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球标记的乙型肝炎表面检测抗体分散液滴涂于电极表面，静置于4.0 ℃冰箱中35.0 min，用pH=7.0的磷酸盐缓冲液冲洗，置于4.0 ℃冰箱中晾干，制得一种检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的工作电极。
实施例9 制备检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的工作电极
①将直径为5.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
②取6.0 µL、4.0 mg/mL的金纳米棒分散液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
③继续将6.0 µL、15.0 µg/mL的乙型肝炎表面捕获抗体滴加到电极表面，4.0 ℃冰箱中干燥；
④继续将3.0 µL、2.0 wt%的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0 ℃冰箱中晾干；
⑤滴加6.0 µL、200 ng/mL的乙型肝炎表面抗原溶液，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0 ℃冰箱中晾干；
⑥将6.0 µL、3.0 mg/mL的介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球标记的乙型肝炎表面检测抗体分散液滴涂于电极表面，静置于4.0 ℃冰箱中40.0 min，用pH=7.0的磷酸盐缓冲液冲洗，置于4.0 ℃冰箱中晾干，制得一种检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的工作电极。
实施例10 制作检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的工作曲线
①使用电化学工作站，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝电极为对电极，与所制备的工作电极组成三电极系统，在10.0 mL包含5.0 mmol/L过氧化氢溶液、2.0 mmol/L邻苯二胺溶液的pH=5.5的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
②利用差分脉冲伏安法分别检测不同乙型肝炎表面抗原浓度下的电流峰值，扫描范围为0.1 ~ 0.5 V，脉冲振幅为50 mV，脉冲宽度为50 ms，脉冲周期为500 ms；
③记录不同浓度下的乙型肝炎表面抗原所对应的电流峰值，绘制检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的工作曲线；
④利用工作曲线法，得到待测样品中乙型肝炎表面抗原的浓度。
实施例11 制作检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的工作曲线
①使用电化学工作站，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝电极为对电极，与所制备的工作电极组成三电极系统，在10.0 mL包含5.0 mmol/L过氧化氢溶液、2.0 mmol/L邻苯二胺溶液的pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
②利用差分脉冲伏安法分别检测不同乙型肝炎表面抗原浓度下的电流峰值，扫描范围为0.1 ~ 0.5 V，脉冲振幅为50 mV，脉冲宽度为50 ms，脉冲周期为500 ms；
③记录不同浓度下的乙型肝炎表面抗原所对应的电流峰值，绘制检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的工作曲线；
④利用工作曲线法，得到待测样品中乙型肝炎表面抗原的浓度。
实施例12 制作检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的工作曲线
①使用电化学工作站，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝电极为对电极，与所制备的工作电极组成三电极系统，在10.0 mL包含5.0 mmol/L过氧化氢溶液、2.0 mmol/L邻苯二胺溶液的pH=8.5的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
②利用差分脉冲伏安法分别检测不同乙型肝炎表面抗原浓度下的电流峰值，扫描范围为0.1 ~ 0.5 V，脉冲振幅为50 mV，脉冲宽度为50 ms，脉冲周期为500 ms；
③记录不同浓度下的乙型肝炎表面抗原所对应的电流峰值，绘制检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的工作曲线；
④利用工作曲线法，得到待测样品中乙型肝炎表面抗原的浓度。

Claims (5)

1.一种检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的制备方法及应用
一种检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的制备方法，所述方法包括：
（1）制备金纳米棒分散液；
（2）制备介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球标记的乙型肝炎表面检测抗体分散液；
（3）制备检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的工作电极；
（4）制作检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的工作曲线。
2.如权利要求1所述一种检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）的制备金纳米棒分散液包括：
①制备金晶种分散液
取2.5 mL、0.2 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵溶液和1.5 mL、1.0 mmol/L的氯金酸溶液置于50 mL圆底烧瓶中，在35.0 ℃水浴中强磁力搅拌30.0 min后，快速加入0.6 mL、0.01mol/L的新配置的硼氢化钠溶液，停止磁力搅拌，在35.0 ℃水浴中静置3.0 h，得到金晶种分散液；
②制备金纳米棒分散液
取50.0 mL、0.2 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵溶液，5.0 mL、15.0 mmol/L的氯金酸溶液，2.5 mL、4.0 mmol/L的硝酸银溶液和45.0 mL超纯水置于500 mL三口烧瓶中，摇匀后，置于35.0 ℃水浴中，缓慢加入1.25 mL、0.08 mol/L的抗坏血酸溶液，待混合液稳定后，将200.0 ~ 500.0 μL的金晶种分散液逐滴加入，在35.0 ℃水浴中静置24.0 h后，离心，用超纯水洗涤，将所得到的沉淀重新分散于20.0 mL超纯水中，得到金纳米棒分散液。
3.如权利要求1所述一种检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）的制备介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球标记的乙型肝炎表面检测抗体分散液包括：
①制备介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球
取2.5 mL、20.0 mmol/L的氯金酸溶液，2.5 mL、20.0 mmol/L的四氯钯酸钠溶液，4.0mL、20.0 mmol/L的氯铂酸溶液和0.1 g的Pluronic F127置于50 mL圆底烧瓶中，超声分散后，置于油浴中，在磁力搅拌下迅速加入1.5 ~4.5 mL、0.4 mol/L的抗坏血酸溶液，油浴升温至80.0 ℃，持续磁力搅拌1.0 h后，停止油浴，自然冷却至室温，离心，用超纯水洗涤，将所得到的固体置于30.0 ℃真空干燥箱内干燥24.0 h，得到介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球；
②制备介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球标记的乙型肝炎表面检测抗体分散液
取3.0 ~ 9.0 mg介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球分散到1.0 mL、pH=7.0的磷酸盐缓冲液中，加入1.0 ~ 2.0 mL、10.0 ~ 20.0 μg/mL的乙型肝炎表面检测抗体分散液，置于4.0 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化8.0 ~ 12.0 h后，在1000 rpm转速下离心0.5 ~ 1.5min，得到下层沉淀，加入1.0 mL、pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，将下层沉淀重新分散于1.0 mL、pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中，分散均匀，得到介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球标记的乙型肝炎表面检测抗体分散液，在4.0 ℃下保存。
4.如权利要求1所述一种检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）的制备检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的工作电极包括：
①将直径为3.0 ~ 5.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
②取6.0 µL、0.5 ~ 4.0 mg/mL的金纳米棒分散液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
③继续将6.0 µL、5.0 ~ 15.0 µg/mL的乙型肝炎表面捕获抗体滴加到电极表面，4.0℃冰箱中干燥；
④继续将3.0 µL、1.0 ~ 2.0 wt%的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0 ℃冰箱中晾干；
⑤滴加6.0 µL、0.00002 ~ 200 ng/mL的一系列不同浓度的乙型肝炎表面抗原溶液，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0 ℃冰箱中晾干；
⑥将6.0 µL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的介孔核壳型金@钯@铂三元合金纳米微球标记的乙型肝炎表面检测抗体分散液滴涂于电极表面，静置于4.0 ℃冰箱中30.0 ~ 40.0 min，用pH=7.0的磷酸盐缓冲液冲洗，置于4.0 ℃冰箱中晾干，制得一种检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的工作电极。
5.如权利要求1所述的制备方法制备的一种检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器，其特征在于，所述步骤（4）的制作检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的工作曲线包括：
①使用电化学工作站，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝电极为对电极，与所制备的工作电极组成三电极系统，在10.0 mL包含5.0 mmol/L过氧化氢溶液、2.0 mmol/L邻苯二胺溶液的pH 5.5 ~ 8.5磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
②利用差分脉冲伏安法分别检测不同乙型肝炎表面抗原浓度下的电流峰值，扫描范围为0.1 ~ 0.5 V，脉冲振幅为50 mV，脉冲宽度为50 ms，脉冲周期为500 ms；
③记录不同浓度下的乙型肝炎表面抗原所对应的电流峰值，绘制检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的工作曲线；
④利用工作曲线法，得到待测样品中乙型肝炎表面抗原的浓度。
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