CN105510420B - 一种基于磁珠分离和dna标记金纳米粒子探针检测atp含量的方法 - Google Patents

一种基于磁珠分离和dna标记金纳米粒子探针检测atp含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于电化学传感器领域，具体涉及一种基于磁珠分离和DNA标记金纳米粒子探针检测ATP含量的方法。首先，将羧基化磁珠MB与氨基修饰的ATP适体DNA1结合生成MB‑DNA1复合物，随后使得修饰有SH的CV适体DNA2、ATP适体互补链DNA3与纳米金结合，并加入CV生成探针CV/DNA2/DNA3/AuNPs，然后，MB‑DNA1复合物与探针反应，通过DNA1与DNA3结互补作用，生成探针修饰的磁珠。接着向探针修饰的磁珠溶液中加入含ATP的样品溶液，之后进行磁分离，取上清液。随后，将上清液滴在金纳米粒子修饰的电极上。将所得到的电极作为工作电极同参比电极、指示电极插入电解质溶液中，进行电化学测定。根据电化学信号强弱，实现ATP含量的测定。

Description

一种基于磁珠分离和DNA标记金纳米粒子探针检测ATP含量的 方法
技术领域
本发明属于电化学传感器领域，具体涉及一种基于磁珠分离和DNA标记金纳米粒子探针检测ATP含量的方法。
背景技术
ATP(三磷酸腺苷)是人体细胞内储能、供能的重要物质。ATP是体内重要的能量来源，是生物体和生命现象的结构基础和功能基础。在物质代谢、机体防御、血液凝固、肌肉收缩、细胞信息传递、个体生长发育、组织修复等方面发挥着不可替代的作用。当人体遇到强烈刺激，如病菌侵犯、濒临死亡等严重情况时，ATP会快速转化为二磷酸腺苷，同时释放出巨大的能量，使机体各系统、各器官迅速获得强大动力。所以，快速测定ATP的含量，是当前生命分析化学研究的热点问题[Yao W,Wang L,Wang H,et al.An aptamer-basedelectrochemiluminescent biosensor for ATP detection[J].Biosensors&Bioelectronics,2009,24(11):3269–3274]。文献报道测定ATP的方法有生物发光法[Branchini B R,Southworth T L,Fontaine D M,et al.An enhanced chimeric fireflyluciferase-inspired enzyme for ATP detection and bioluminescence reporter andimaging applications[J].Analytical Biochemistry,2015:148–153]、电化学法[Bao T,Shu H,Wei W,et al.A sensitive electrochemical aptasensor for ATP detectionbased on exonuclease III-assisted signal amplification strategy[J].AnalyticaChimica Acta,2015,862:64–69]、荧光法[Wang K,Jian L,Yang X,et al.A label-freeaptasensor for highly sensitive detection of ATP and thrombin based on metal-enhanced PicoGreen fluorescence[J].Biosensors&Bioelectronics,2015,63c:172–177]、酶联吸附分析法[赵秋伶，刘玲玲，杨丽娜.基于核酸适体检测ATP的酶联分析新方法[J].高等学校化学学报，2014，06:1161-1165]、共振散射光谱法[欧阳辉祥，刘庆业，梁爱惠，蒋治良.非标记纳米银探针催化共振散射光谱检测痕量ATP[J].化学学报，2011，20:2493-2498]等。近年来，基于分子适体的生化分析新方法的研究成为了热点之一[ShukoorM I,Altman M O,Han D,et al.Aptamer-nanoparticle assembly for logic-baseddetection[J].Acs Appl Mater Interfaces,2012,4(6):3007-3011.]，然而，将核酸适体技术与结晶紫(CV)适体电化学手段结合对ATP进行检测，至今尚未见文献报道。为了进一步提高对ATP检测的灵敏度和选择性，采用CV适体电化学信号放大技术，构建了一种高灵敏检测ATP的电化学新方法，并用于运动前后小鼠心肌ATP含量的测定。在本发明中，利用ATP适体修饰磁珠为分离载体，以电化学试剂结晶紫适体、CV、ATP适体互补序列修饰的胶体金CV/DNA2/DNA3/AuNPs为探针，建立了测定ATP电化学新方法，该方法对ATP的测定表现出了高的灵敏度和良好的选择性。并利用该方法对运动前后小鼠心肌ATP含量进行了测定。
发明内容
本发明旨在发明一种方法简单、成本低、灵敏度高、选择性好的测定ATP的方法。
实现发明目的技术方案是：
首先，将羧基化磁珠(MB)与氨基修饰的ATP适体DNA1结合生成MB-DNA1复合物，随后使得修饰有SH的CV适体DNA2、ATP适体互补链DNA3与纳米金结合，并加入CV生成探针CV/DNA2/DNA3/AuNPs，然后，MB-DNA1复合物与探针反应，通过DNA1与DNA3结互补作用，生成探针修饰的磁珠。接着向探针修饰的磁珠溶液中加入含ATP的样品溶液，之后进行磁分离，取上清液。随后，将上清液滴在金纳米粒子修饰的电极上。将所得到的电极作为工作电极同参比电极、指示电极插入电解质溶液中，进行电化学测定。由于在电极表面 的探针CV/DNA2/DNA3/AuNPs数量取决于ATP的浓度，因此CV的电化学信号随ATP浓度的增大而增强。根据电化学信号强弱，实现ATP含量的测定。
测定步骤为：
(1)金纳米粒子的制备
制备金纳米粒子所用的玻璃容器容量瓶、棕色广口瓶、圆底烧瓶等用王水(浓盐酸和浓硝酸体积比为1:3)浸泡30分钟，然后用二次水冲洗干净，烘干备用。在250mL圆底烧瓶中加入100mL，0.01％的HAuCl4，搅拌加热至沸腾，然后快速加入500μL，1％的Na3C6H5O7，再加热10分钟，搅拌15分钟，冷却至室温。转移在棕色瓶中保存。
(2)探针CV/DNA2/DNA3/AuNPs的制备
在2mL的离心管中加入10μL 1.0×10-5M的DNA3、30μL 1.0×10-5M的DNA2和10μLpH 5.2的醋酸缓冲溶液以及10μL 10mM的TCEP反应1h。随后向其中加入制备好的1mL的AuNPs溶液，放入摇床轻摇反应16h。使巯基DNA与AuNPs通过Au-S键连接起来，生成DNA2/DNA3/AuNPs。再向其中加入过量的CV溶液，37℃条件下恒温反应65min，生成探针CV/DNA2/DNA3/AuNPs。
(3)MB-DNA1的制备
取10μL羧基化磁珠至1mL的小离心管管中，并用100μL pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液清洗两遍，并分散于Tris-HCl缓冲溶液中得磁珠悬浮液。将40mM EDC和10mM NHS加到处理好的磁珠悬浮液中，将该混合物在室温下轻摇1h。然后，将50μL，5.0×10-6M的DNA1加到上述所得溶液中。在4℃条件下，振动反应12h。反应完成后，将所得产物经过磁性分离，并将得到的DNA1修饰磁珠产物MB-DNA1分散在1mL pH 7.4的Tris-HCl缓冲溶液中。
(4)ATP的检测
在1.5mL样品管中加入制备好的100μL探针CV/DNA2/DNA3/AuNPs溶液以及100μLMB-DNA1溶液，反应1h。然后用pH 7.4的磷酸缓冲溶液洗三次，并将其分散在1mL pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液中。然后将含有不同浓度的ATP溶液加入，在37℃条件下反应一定时间，经过磁性分离，取磁性分离清液10μL均匀滴涂在工作电极上，室温下静置1小时，然后进行电化学测定。在室温下将三电极体系放在含有10mM K3[Fe(CN)6]和0.5M KCl溶液中进行表征。利用差分脉冲伏安法在含0.1M KCl的pH 8.0的磷酸缓冲溶液中以100mV/s的扫速扫描，电位扫描范围为-0.7～0.1V。
(5)所使用的仪器与试剂
CHI660B电化学工作站(上海辰华仪器公司)；Anke-TGL-16C飞翁牌高速离心机(上海市安亭科学仪器厂)；Z-82A气浴恒温振荡器(全坛市医疗仪器厂)；PHS-3D型酸度计(上海雷磁仪器厂)；实验采用三电极系统：金电极及修饰金电极为工作电极，Ag/AgC1(饱和KCl)电极为参比电极，铂丝电极为对电极。
浓度为25mg/mL的羧基化磁性纳米颗粒(粒径为100nm)溶液购于阿拉丁试剂有限公司；TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)等购自上海化学试剂有限公司；EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)购自Sigma公司；氯金酸(HAuCl4)，柠檬酸三钠(Na3C6H5O7)均购于天津市博迪化工有限公司；Tris-HCl缓冲溶液包含100mM Tris,0.1％(v/v)Tween 20和1M NaCl。
DNA由赛百盛公司合成，序列如下：
DNA1：5'-NH2-(CH2)6-ACC TGG GGG AGT ATT GCG GAG GAA GGT-3'(ATP适体)。
DNA2：5’-SH-(CH2)6-TTT TTC CCC CTT TCC CCC TTT CCC CCT TTC CCC C-3’(CV适体)。
DNA3：5'-SH-(CH2)6-TCC TTC CTC CGC AAT GTC CCC CCA AAC-3’(ATP适体互补链)。
醋酸缓冲溶液组成：醋酸-醋酸钠溶液。
磷酸盐缓冲液组成：磷酸氢二钠–磷酸二氢钠溶液。
附图说明
图1测定ATP原理示意图。
图2MB-DNA1用量(A)，探针用量(B)和ATP与适体结合时间(C)对信号强度的影响。
图3ATP浓度与信号关系图。
图4方法测定ATP的选择性。
发明的优点与效果
在最佳实验条件下，研究了不同浓度ATP与信号强度之间的关系，得到了检测ATP的标准曲线，线性范围及线性方程。当ATP的浓度在1.0×10-8～1.0×10-6M之间时，体系的信号强度随着ATP浓度的增大而增大(图3)。得到ATP的线性回归方程为Δip＝0.6536C+15.584(Δip为体系的信号强度；C为ATP的浓度，10-8M；n＝7，R＝0.999)。该方法检测限为3.0×10-9M(3σ)。对浓度1.0×10-7M的ATP进行7次平行重复测定的RSD为3.7％，表明本法有较好的重现性。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明，但不构成对发明的进一步限制。
实施例1 MB-DNA1用量对电化学信号的影响
MB-DNA1作为载体，用于固定探针。首先固定探针溶液用量，考察了MB-DNA1溶液用量变化时，检测信号的变化。实验结果显示，检测信号随着MB-DNA1溶液用量的增加而增强；用量大于75μL，信号变化趋势变缓(图2(A))。因此，实验选取75μL为MB-DNA1溶液的最佳用量。
实施例2探针用量对电化学信号的影响
当固定MB-DNA1溶液用量为75μL时，考察了探针用量对信号强度的影响，随着探针用量的增加，检测信号逐渐增强，当探针用量为90μL时，信号最大(图2(B))。因此，实验选取90μL作为探针的最佳用量。
实施例3 ATP与适体结合时间对电化学信号的影响
实验考查了ATP与适体结合时间对信号强度的影响，信号强度随着结合时间的增长而快速增强，在40min时信号强度达到最大，之后趋于平稳，由此可见40min足够用于ATP与适体结合(图2(C))。因此，实验选取40min作为最佳结合时间。
实施例4方法的选择性
选择性的好坏是决定方法是否可行的必要因素。考察了所建立的方法检测ATP的选择性。利用该方法在同一实验条件下检测的ATP及其一定浓度相关活性小分子物质。当ATP浓度为7.0×10-7M，GTP、UTP和CTP浓度为7.0×10-5M时，检测结果如图4所示。浓度为7.0×10-7M的ATP产生强的电化学信号，而GTP、UTP和CTP的所产生的信号比ATP弱许多(图4)。由此证明，在该检测体系中，GTP、UTP和CTP这些活性小分子物质不会对ATP的检测产生影响，方法的选择性很好，可以用于实际样品的检测。
实施例5方法检测运动小鼠心肌ATP含量
进一步将该方法应用于实际样品中ATP含量的检测中。根据发明的方法对小鼠心肌ATP含量进行了测定，并采用标准加入法对方法进行了评价，样品测定回收率为93.5–98.7％，测定结果见表1，本发明的方法在ATP检测中具有精密度高的特点。同时做了运动前后小鼠心肌ATP含量检测。结果表明，运动前小鼠心肌的ATP含量为3.33±0.56μM/g，运动后小鼠心肌ATP含量为1.06±0.29μM/g。实验结果显示，运动后小鼠心肌ATP含量降低。
表1.小鼠心肌ATP含量测定结果
an＝7
。

Claims (3)

1.一种基于磁珠分离和DNA标记金纳米粒子探针检测ATP含量的方法，包括以下步骤：
(1)金纳米粒子的制备
制备金纳米粒子所用的玻璃容器容量瓶、棕色广口瓶、圆底烧瓶用王水浸泡30分钟，然后用二次水冲洗干净，烘干备用；在250mL圆底烧瓶中加入100mL，0.01％的HAuCl4，搅拌加热至沸腾，然后快速加入500μL，1％的Na3C6H5O7，再加热10分钟，搅拌15分钟，冷却至室温，转移在棕色瓶中保存；
(2)探针CV/DNA2/DNA3/AuNPs的制备
在2mL的离心管中加入10μL 1.0×10-5M的DNA3、30μL 1.0×10-5M的DNA2和10μL pH5.2的醋酸缓冲溶液以及10μL 10mM的TCEP反应1h；随后向其中加入制备好的1mL的AuNPs溶液，放入摇床轻摇反应16h；使巯基DNA与AuNPs通过Au-S键连接起来，生成DNA2/DNA3/AuNPs；再向其中加入过量的CV溶液，37℃条件下恒温反应65min，生成探针CV/DNA2/DNA3/AuNPs；
(3)MB-DNA1的制备
取10μL羧基化磁珠至1mL的小离心管管中，并用100μL pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液清洗两遍，并分散于Tris-HCl缓冲溶液中得磁珠悬浮液；将40mM EDC和10mM NHS加到处理好的磁珠悬浮液中，在室温下轻摇1h；然后，将50μL，5.0×10-6M的DNA1加到上述所得溶液中；在4℃条件下，振动反应12h；反应完成后，将所得产物经过磁性分离，并将得到的DNA1修饰磁珠产物MB-DNA1分散在1mL pH 7.4的Tris-HCl缓冲溶液中；
(4)ATP的检测
在1.5mL样品管中加入制备好的100μL探针CV/DNA2/DNA3/AuNPs溶液以及100μL MB-DNA1溶液，反应1h；然后用pH 7.4的磷酸缓冲溶液洗三次，并将其分散在1mL pH 7.4的Tris-HCl缓冲溶液中；然后将含有不同浓度的ATP溶液加入，在37℃条件下反应一定时间，经过磁性分离，取磁性分离清液10μL均匀滴涂在工作电极上，室温下静置1小时，然后进行电化学测定；在室温下将三电极体系放在含有10mM K3[Fe(CN)6]和0.5M KCl溶液中进行表征；利用差分脉冲伏安法在含0.1M KCl的pH 8.0的磷酸缓冲溶液中以100mV/s的扫速扫描，电位扫描范围为-0.7～0.1V；
所述的DNA1的部分序列为：5'-NH2-(CH2)6-ACC TGG GGG AGT ATT GCG GAG GAA GGT-3'；
所述的DNA2的部分序列为：5’-SH-(CH2)6-TTT TTC CCC CTT TCC CCC TTT CCC CCTTTC CCC C-3’；
所述的DNA3的部分序列为：5'-SH-(CH2)6-TCC TTC CTC CGC AAT GTC CCC CCA AAC-3’。
2.根据权利要求1所述的一种基于磁珠分离和DNA标记金纳米粒子探针检测ATP含量的方法，其特征在于所述的电化学工作站为上海辰华仪器公司的CHI660B电化学工作站；高速离心机为上海市安亭科学仪器厂的Anke-TGL-16C飞翁牌高速离心机；恒温振荡器为全坛市医疗仪器厂的Z-82A气浴恒温振荡器；酸度计为上海雷磁仪器厂的PHS-3D型酸度计；实验采用三电极系统：金电极及修饰金电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极。
3.根据权利要求1所述的一种基于磁珠分离和DNA标记金纳米粒子探针检测ATP含量的方法，其特征在于所述羧基化磁珠的浓度为25mg/mL、粒径为100nm的溶液购于阿拉丁试剂有限公司；三(2-羧乙基)膦盐酸盐TCEP、三羟甲基氨基甲烷Tris购自上海化学试剂有限公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC、N-羟基琥珀酰亚胺NHS购自Sigma公司；氯金酸HAuCl4，柠檬酸三钠Na3C6H5O7均购于天津市博迪化工有限公司；Tris-HCl缓冲溶液包含100mM Tris，体积分数为0.1％Tween 20和1M NaCl。
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