CN104007152B - 基于铂纳米粒子催化电化学循环信号放大技术测定dna的电化学传感器和测定dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基于铂纳米粒子催化电化学循环信号放大技术测定DNA的电化学传感器的制备方法及其应用，将发卡DNA1自组装在铂纳米粒子修饰金电极表面，当有目标物DNA2存在时，由于目标物DNA2与组装在金电极表面表面上的发卡DNA1部分互补配对，打开DNA1的发卡结构；然后另外一条发卡DNA3链通过竞争配对杂交取代目标链DNA2，目标链DNA2被释放下来，释放的目标链则继续打开新的发卡结构，如此的循环作用实现了目标链DNA2的循环使用，结合制备的纳米粒子电化学探针实现信号的放大，再利用制备好的电化学传感器催化PAP与PQI之间的循环，实现了电化学信号的进一步放大，利用环伏安法或DPV测定电流信号强度，根据测得电流信号强度，实现对目标链DNA2测定。本发明的传感器具有高的检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于分析化学和电化学传感器领域，涉及基于铂纳米粒子催化电化学循环信号放大技术测定DNA的电化学传感器和测定DNA的方法。
背景技术
DNA是生物体内的遗传分子。DNA的检测通常与各种疾病的诊断相关，因此DNA检测具有重要的研究意义。目前由于DNA检测技术的不断进步，人们对其他生物分子如蛋白质、小分子物质的检测也可以转化为对DNA的检测。DNA检测的方法很多，比如增强纳曼散射技术(Wei,X.,Su,S.,Guo,Y.,Jiang,X.,Zhong,Y.,Su,Y.,Fan,C.,Lee,S.T.andHe,Y.(2013)AMolecularBeacon‐BasedSignal‐OffSurface‐EnhancedRamanScatteringStrategyforHighlySensitive,Reproducible,andMultiplexedDNADetection.Small,9,2652-2652)，荧光技术(Su,S.,Wei,X.,Zhong,Y.,Guo,Y.,Su,Y.,Huang,Q.,Lee,S.-T.,Fan,C.andHe,Y.(2012)SiliconNanowire-BasedMolecularBeaconsforHigh-SensitivityandSequence-SpecificDNAMultiplexedAnalysis.ACSNano,6,2582-2590)，化学发光检测(Hun,X.,Liu,F.,Mei,Z.H.(2013)Signalamplifiedstrategybasedontarget-inducedstrandreleasecouplingcleavageofnickingendonucleasefortheultrasensitivedetectionofochratoxinA.BiosensorsandBioelectronics,39:145-151)、电化学检测(T.H.M.,Peng,H.,Soeller,C.Travas-SejdicJ.(2010)ACdTenanoparticle-modifiedhairpinprobefordirectandsensitiveelectrochemicaldetectionofDNA)等。这些方法各有其有点，能不同程度的满足对DNA检测的要求，但方法或者灵敏度不高，或者这些方法复杂。与文献报道的铂纳米粒子催化方法相比，本发明具有合成铂纳米粒子简单，测定灵敏度高的优点。
发明内容
基于铂纳米粒子催化电化学循环信号放大技术测定DNA的电化学传感器和测定DNA的方法。发明设计两条发卡DNA，即DNA1和DNA3。将发卡DNA1自组装在铂纳米粒子修饰金电极表面，当有目标物DNA2(Target)存在时，由于目标物DNA2与组装在金电极表面上的发卡DNA1部分互补配对，打开DNA1的发卡结构。然后另外一条发卡DNA3链通过竞争配对杂交取代目标链DNA2，目标链DNA2被释放下来，释放的目标链则继续打开新的发卡结构，如此的循环作用实现了目标链DNA2的循环使用，结合制备的纳米粒子电化学探针实现了信号的放大。另外，由于要检测的目标物DNA2浓度一般都极低，所以本发明还提出了利用制备好的电化学传感器催化PAP与PQI之间的循环，实现了电化学信号的进一步放大用于DNA的测定，从而实现了对目标链DNA2的高灵敏度测定。
本发明是通过以下措施来实现的：基于铂纳米粒子催化电化学循环信号放大技术测定DNA的电化学传感器和测定DNA的方法，其特征包括以下步骤：
(1)制备金纳米粒子；
(2)二茂铁修饰的金纳米粒子(Fc-AuNPs)制备；
(3)制备DNA修饰Fc-AuNPs探针；
(4)制备铂纳米粒子；
(5)制备电化学传感器；
(6)利用制备的传感器对DNA进行测定，构建测定DNA的方法；
(7)利用所建立的方法，对样品进行检测。
优选的，本发明所述的金纳米粒子制备包括以下步骤：把容量瓶、棕色广口瓶、圆底烧瓶等玻璃仪器用王水泡30min，用二次水冲洗烘干后备用。在100mL圆底烧瓶中加入50mL1mM的HAuCl4，并在搅拌下加热至沸腾，然后快速加入5mL的38.8mM的柠檬酸钠(Na3C6H5O7)，此时溶液由无色变为酒红色。再加热10min，搅拌15min，冷却至室温，转移至棕色瓶中，并放于4℃温度下储存备用。
优选的，本发明所述的二茂铁修饰的金纳米粒子(Fc-AuNPs)制备包括以下步骤：把容量瓶、棕色广口瓶、圆底烧瓶等制备和储备金属纳米粒子的所用的玻璃仪器用王水(HCl：HNO3＝1:3)浸泡30min，然后用二次水冲洗烘干备用。首先，将1mgFc加入到2mL0.10mol/LNHS和0.10mol/LEDC的0.20mol/LPBS(pH7.40)溶液中，将此混合溶液在室温下剧烈搅拌反应2h。然后向混合溶液中加入2mL金纳米粒子溶液，室温下反应24h后离心(13000r/min，30min)，沉淀用PBS洗涤三次，以除去未反应的Fc，最后将沉淀用水溶解分散，即得二茂铁修饰的金纳米粒子(Fc-AuNPs)，在4℃下避光储存备用
优选的，本发明所述的DNA修饰Fc-AuNPs探针制备包括以下步骤：取2mL的样品管，依次加入1.5μL500mM的Tris-HCl，6μL10mM的TCEP，7.2μL100μM的DNA4,7.2μL100μM的巯基已胺，室温放置30min后加入1mL制得的Fc-AuNPs，室温下反应12h。然后在10000r/min下离心30min，弃去上清液，加入800μLTris-HCl缓冲液洗3次，并用Tris-HCl缓冲溶液定容至1mL，即得DNA修饰Fc-AuNPs探针(即电化学探针)，4℃储存备用。
优选的，本发明所述的铂纳米粒子制备包括以下步骤：把合成要用到的玻璃仪器如容量瓶、棕色广口瓶、圆底烧瓶等用王水(HCl：HNO3＝1:3)浸泡洗净，用二次水冲洗烘干后备用。在100mL圆底烧瓶中加入50mL1mM的HPtCl6，并在搅拌下加热至沸腾，然后快速加入5mL的38.8mM的柠檬酸钠(Na3C6H5O7)，此时溶液由黄色变为棕色。再加热10min，搅拌30min，冷却至室温，即得铂纳米粒子(PtNPs)，转移至棕色瓶中，并放于4℃温度下储存备用。
优选的，本发明所述的电化学传感器的制备包括以下步骤：(1)制备铂纳米粒子修饰金电极：取金电极经0.2μm，0.03μm和0.05μm的α-A12O3抛光粉抛光后，用二次蒸馏水冲洗干净，然后在超声波水浴中超声5min，用高纯氮气吹干。取5～20μL制备的PtNPs滴涂在金电极表面，置于避光处自然晾干，用二次水冲洗电极，得铂纳米粒子修饰的金电极(PtNPs/GE)；(2)DNA的预处理:进行发卡DNA的预处理。取一定量的0.1～10μM的巯基DNA1或DNA3于2mL离心管中，置于95℃恒温水浴槽中加热5min，取出后立即置于冰水中冷却1min即得到发卡DNA1或DNA3；(3)制备电化学传感器：取5～30μL经过预处理的发卡DNA1滴涂在PtNPs/GE表面，4℃下使其自组装反应24h。接着取10μL100μM的巯基已醇封闭，得电化学传感器。
优选的，一种对DNA2检测方法，其特征是：取5～20μL目标物DNA2滴加到电化学传感器的电极表面，37℃下孵育30min。取5～20μL发卡DNA3滴加到电极表面。37℃下孵育4h，孵育完成后用PBS冲洗两次。最后，取5～50μL制备的电化学探针滴加到电极表面，37℃下继续孵育1h。将电极插入0.5mL50mM的硼氢化钠，1.75mL20mM的PNP和3.25mLPBS混合液中，采用三电极系统检测，工作电极为金电极或修饰金电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极，利用循环伏安法或DPV测定电流信号强度，根据测得电流信号强度的变化，计算目标链DNA2的浓度。
根据电流信号强度对DNA2进行定量，根据标准溶液浓度和信号关系作图得标准曲线。
具体实验原理如图1所示。
不同电极测定目标物DNA2时的电流信号强度比较如图2所示。
目标物DNA2的标准曲线如图3所示。
分析性能如下：
本发明研究了不同浓度目标物DNA2与电流信号强度之间的关系，得到了检测目标物DNA2的标准曲线，线性范围及线性方程。
当目标物DNA2的浓度在0.2fM-700fM之间时，随着目标物DNA2浓度的变化，电流信号强度有明显变化。经计算得到检测目标物DNA2的非线性方程为y＝-0.003x2+3.783x+21.90(y是体系的电流信号强度；x是目标物DNA2的浓度，单位fM；n＝12，n表示同一浓度测定次数R＝0.9987)。目标物DNA2的浓度在0.2fM～10.0fM范围内与电流信号强度呈一定的线性关系，其线性回归方程是y＝7.401x+1.001，线性相关系数R＝0.9990，检测限是0.1fM(3σ)。该测定方法的精密度通过对浓度为10fM的目标物DNA2进行11次平行测定而计算得出，相对标准偏差分别为3.8％，表明本发明的测定方法有较好的重现性。
另外，金电极不经过铂纳米粒子修饰，利用裸金电极直接固定发卡DNA1，其他步骤相同按本发明的方法制备电化学传感器，然后利用其对目标物DNA2进行检测，测定的检测限为150fM。表明本发明提出的基于铂纳米粒子催化电化学循环信号放大技术测定DNA的电化学传感器和测定DNA的方法具有高的灵敏度。所制备的铂纳米粒子修饰电极信号强度
(1.520μA)是金电极不经过铂纳米粒子修饰电极信号强度(0.0727μA)的23倍(空白信号为0.0662μA)(图2)，增强效果较文献报道6.66倍的效果要好(Insituamplifiedelectronicsignalfordeterminationoflow-abundanceproteinscouplingwithnanocatalyst-basedredoxcycling.JuanTang,JunZhou,QunfangLi,DianpingTang,GuonanChenandHuanghaoYangChem.Commun.,2013,49,1530--1532)。
附图说明
图1.基于铂纳米粒子催化电化学循环信号放大技术测定DNA的电化学传感器和测定DNA的原理图。
图2.不同电极测定目标物DNA2时的电流信号强度比较图。(A)裸金电极对目标物DNA2的响应；(B)铂纳米粒子修饰电极对不含目标物DNA2的响应；(C)铂纳米粒子修饰电极对含目标物DNA2的响应。
图3.目标物DNA2的标准曲线，横坐标x是目标物DNA2浓度，单位是fM，纵坐标y是体系的电流信号强度。
具体实施方式
下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。
实例：基于铂纳米粒子催化电化学循环信号放大技术测定DNA的电化学传感器和测定DNA的方法。
1.实验部分
1.1仪器与试剂
1.1.1仪器设备
CHI660B电化学工作站，上海辰华仪器公司；Anke-TGL-16C飞翁牌高速离心机，上海市安亭科学仪器厂；HS-3D型酸度计，上海雷磁仪器厂；实验用三电极系统：金电极及修饰金电极为工作电极，Ag/AgCl(饱和KCl)电极为参比电极，铂丝电极为对电极。
1.1.2试剂
三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)，氯金酸(HAuCl4)，氯铂酸(H2PtCl6)，柠檬酸三钠(Na3C6H5O7)，氧化铝粉末(α-A12O3)均购自上海阿拉丁试剂公司；巯基已醇(HS-(CH2)6-OH)，巯基已胺HS-(CH2)6-NH2，三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，对硝基苯酚(PNP)，二茂铁甲酸(Fc)，硼氢化钠(NaBH4)，均购自国药集团化学试剂有限公司；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)购于Sigma。
PBS缓冲溶液是0.20M，pH＝7.4，其的配制方法是称取0.2gKH2PO4、8.0gNaCl、2.9gNa2HPO4·12H2O及0.2gKCl溶解于1L水中。
Tris-HCl缓冲溶液配置，称1.576gTris用1000mL蒸馏水溶解，用6M的NaOH调pH到8.2，即得。
所用人工合成DNA序列(北京赛百盛生物工程有限公司购得)如下：
优选的DNA4部分序列为：5`-TTTTTTATTCGATCCGGTGCTCTTATGCCC-HS-3`
优选的DNA2部分序列为：5’-CAATAACTACCGGGCATTACTGGCCTT-3’；
优选的DNA1部分序列为：5’-SH-AAAGCCAGTAATGCCCGGTAGTTATTCCATCGTGTACAATAACTACCGGGCATAAGAGCACCCTTGTAC-3’
优选的DNA3部分序列为：5’-TAGTTATTGTACACGATGGAATAACTACCGGGCATCCATCGTGTAC-3’；。
1.2金纳米粒子的制备
把容量瓶、棕色广口瓶、圆底烧瓶等玻璃仪器用王水泡30min，用二次水冲洗烘干后备用。在100mL圆底烧瓶中加入50mL，1mM的HAuCl4，并在搅拌下加热至沸腾，然后快速加入5mL的38.8mM的柠檬酸钠(Na3C6H5O7)，此时溶液由无色变为酒红色。再加热10min，搅拌15min，冷却至室温，转移至棕色瓶中，并放于4℃温度下储存备用。
1.3二茂铁修饰的金纳米粒子(Fc-AuNPs)的制备
把容量瓶、棕色广口瓶、圆底烧瓶等制备和储备金属纳米粒子的所用的玻璃仪器用王水(HCl：HNO3＝1:3)浸泡30min，然后用二次水冲洗烘干备用。首先，将1mgFc加入到2mL含0.10mol/LNHS和0.10mol/LEDC的PBS溶液中，将此混合溶液在室温下剧烈搅拌反应2h。然后向混合溶液中加入200mL金纳米粒子溶液，室温下反应24h后离心(13000r/min，30min)，沉淀用PBS洗涤三次，以除去未反应的Fc，最后将沉淀用水溶解分散，即得二茂铁修饰的金纳米粒子(Fc-AuNPs)，在4℃下避光储存备用。
1.4DNA修饰Fc-AuNPs探针的制备
取2mL的样品管，依次加入1.5μL500mM的Tris-HCl，6μL10mM的TCEP，7.2μL100μM的DNA4,7.2μL100μM的巯基已胺，室温放置30min后加入1mL制得的Fc-AuNPs，室温下反应12h。然后在10000r/min下离心30min，弃去上清液，加入800μLTris-HCl缓冲液洗3次，并用Tris-HCl缓冲溶液定容至1mL，即得DNA修饰Fc-AuNPs探针(即电化学探针)，4℃储存备用。
1.5铂纳米粒子的制备
把合成要用到的玻璃仪器如容量瓶、棕色广口瓶、圆底烧瓶等用王水(HCl：HNO3＝1:3)浸泡洗净，用二次水冲洗烘干后备用。在100mL圆底烧瓶中加入50mL，1mM的HPtCl6，并在搅拌下加热至沸腾，然后快速加入5mL的38.8mM的柠檬酸钠(Na3C6H5O7)，此时溶液由黄色变为棕色。再加热10min，搅拌30min，冷却至室温，即得铂纳米粒子(PtNPs)，转移至棕色瓶中，并放于4℃温度下储存备用。
1.6电化学传感器的制备
1.6.1铂纳米粒子修饰金电极的制备
取金电极经0.2μm，0.03μm和0.05μm的α-A12O3抛光粉抛光后，用二次蒸馏水冲洗干净，然后在超声波水浴中超声5min，用高纯氮气吹干。取10μL制备的PtNPs滴涂在金电极表面，置于避光处自然晾干，用二次水冲洗电极，得铂纳米粒子修饰的金电极(PtNPs/GE)。
1.6.2DNA的预处理
进行发卡DNA的预处理。取一定量的10-6M的巯基DNA1或DNA3于2mL离心管中，置于95℃恒温水浴槽中加热5min，取出后立即置于冰水中冷却1min即得到发卡DNA或DNA3。
1.6.3电化学传感器的制备
取10μL经过预处理的发卡DNA1滴涂在PtNPs/GE表面，4℃下使其自组装反应24h。接着取10μL，100μM的巯基已醇封闭，得电化学传感器
1.7DNA检测
取10μL目标物DNA2滴加到电化学传感器的电极表面，37℃下孵育30min。取10μL发卡DNA3滴加到电极表面。37℃下孵育4h，孵育完成后用PBS冲洗两次。最后，取10μL制备的电化学探针滴加到电极表面，37℃下继续孵育1h。将电极插入0.5mL50mM的硼氢化钠，1.75mL20mM的PNP和3.25mLPBS混合液中，采用三电极系统检测，工作电极为金电极或修饰金电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极，通过循环伏安法或DPV测得电流的变化，根据标准溶液浓度和信号关系作图得标准曲线。
1.8样品分析
将含目标物DNA2的样品溶液按步骤1.7方法进行实验，根据电流信号强度和步骤1.7所得标准曲线可以获取目标物DNA2含量。
根据发明的方法对目标物DNA2含量进行了测定，并采用标准加入法对方法进行了评价，样品测定回收率为98.9–104.3％，测定结果见表1，本发明的方法在目标物DNA2检测中具有精密度高的特点。
表1样品分析测定结果
| 编号 | 含量a,b | 标准样品加入量 | 测得量 | 回收率(％) |
| 1 | 0.8 | 1.0 | 1.8 | 100 |
| 2 | 2.3 | 2.0 | 4.4 | 104.3 |
| 3 | 5.6 | 5.0 | 10.7 | 101.8 |
| 4 | 10.2 | 10.0 | 20.1 | 99.0 |
| 5 | 20.7 | 20.0 | 40.5 | 99.0 |
| 6 | 55.6 | 50.0 | 105.0 | 98.9 |
a7次测量结果
b单位：fM
Claims (3)
1.基于铂纳米粒子催化电化学循环信号放大技术测定DNA的电化学传感器的制备方法和测定DNA的方法，其特征包括以下步骤：
(1)铂纳米粒子制备包括以下步骤：把合成要用到的玻璃仪器容量瓶、棕色广口瓶、圆底烧瓶用王水浸泡洗净，用二次水冲洗烘干后备用；在100mL圆底烧瓶中加入50mL，0.1～50mM的HPtCl6，并在搅拌下加热至沸腾，然后快速加入5mL的38.8mM的柠檬酸钠Na3C6H5O7，此时溶液由黄色变为棕色；再加热10min，搅拌30min，冷却至室温，即得铂纳米粒子PtNPs，转移至棕色瓶中，并放于4℃温度下储存备用；
(2)制备铂纳米粒子修饰金电极：取金电极经0.2μm，0.03μm和0.05μm的α-A12O3抛光粉抛光后，用二次蒸馏水冲洗干净，然后在超声波水浴中超声5min，用高纯氮气吹干；取5～20μL制备的PtNPs滴涂在金电极表面，置于避光处自然晾干，用二次水冲洗电极，得铂纳米粒子修饰的金电极PtNPs/GE；
(3)金纳米粒子制备包括以下步骤：把容量瓶、棕色广口瓶、圆底烧瓶玻璃仪器用王水泡30min，用二次水冲洗烘干后备用；在100mL圆底烧瓶中加入50mL1mM的HAuCl4，并在搅拌下加热至沸腾，然后快速加入5mL的38.8mM的柠檬酸钠Na3C6H5O7，此时溶液由无色变为酒红色；再加热10min，搅拌15min，冷却至室温，转移至棕色瓶中，并放于4℃温度下储存备用；
(4)二茂铁修饰的金纳米粒子Fc-AuNPs制备包括以下步骤：把容量瓶、棕色广口瓶、圆底烧瓶制备和储备金属纳米粒子的所用的玻璃仪器用王水浸泡30min，然后用二次水冲洗烘干备用；首先，将1mgFc加入到含2mL0.10mol/LNHS和0.10mol/LEDC的0.20mol/LPBSpH7.40的溶液中，将此混合溶液在室温下剧烈搅拌反应2h；然后向混合溶液中加入2mL金纳米粒子溶液，室温下反应24h后，在13000rpm/min条件下离心30min，沉淀用PBS洗涤三次，以除去未反应的Fc，最后将沉淀用水溶解分散，即得二茂铁修饰的金纳米粒子Fc-AuNPs；
(5)电化学探针制备包括以下步骤：取2mL的样品管，依次加入1.5μL500mM的Tris-HCl，6μL10mM的TCEP，7.2μL100μM的DNA4,7.2μL100μM的巯基已胺，室温放置30min后加入1mL制得的Fc-AuNPs，室温下反应12h；然后在10000r/min下离心30min，弃去上清液，加入800μLTris-HCl缓冲液洗3次，并用Tris-HCl缓冲溶液定容至1mL，即得DNA修饰Fc-AuNPs探针探针，即电化学探针，4℃储存备用；
(6)DNA的预处理：取一定量的0.1～10μM的巯基DNA1或DNA3于2mL离心管中，置于95℃恒温水浴槽中加热5min，取出后立即置于冰水中冷却1min即得到发卡DNA1或DNA3；
(7)制备电化学传感器：取5～30μL经过预处理的发卡DNA1滴涂在PtNPs/GE表面，4℃下使其自组装反应24h；接着取10μL100μM的巯基已醇封闭，得电化学传感器；
(8)测定DNA的方法：取5～20μL目标物DNA2滴加到电化学传感器的电极表面，37℃下孵育30min；取5～20μL发卡DNA3滴加到电极表面；37℃下孵育4h，孵育完成后用PBS冲洗两次；最后，取5～50μL制备的电化学探针滴加到电极表面，37℃下继续孵育1h；将电极插入0.5mL50mM的硼氢化钠，1.75mL20mM的PNP和3.25mLPBS混合液中，采用三电极系统检测，工作电极为金电极或修饰金电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极，利用循环伏安法或DPV测定电流信号强度，根据标准溶液浓度和信号关系作图得标准曲线；
所述的DNA1的部分序列为：5’-SH-AAAGCCAGTAATGCCCGGTAGTTATTCCATCGTGTACAATAACTACCGGGCATAAGAGCACCCTTGTAC-3’；
所述的DNA2的部分序列为：5’-CAATAACTACCGGGCATTACTGGCCTT-3’；
所述的DNA3的部分序列为：5’-TAGTTATTGTACACGATGGAATAACTACCGGGCATCCATCGTGTAC-3’；
所述的DNA4的部分序列为：5`-TTTTTTATTCGATCCGGTGCTCTTATGCCC-HS-3`。
2.根据权利要求1所述的基于铂纳米粒子催化电化学循环信号放大技术测定DNA的电化学传感器的制备方法和测定DNA的方法，其特征在于所述PBS缓冲溶液是0.20M，pH＝7.4，其配制方法是称取0.2gKH2PO4、8.0gNaCl、2.9gNa2HPO4·12H2O及0.2gKCl溶解于1L水中，即得。
3.根据权利要求1所述的基于铂纳米粒子催化电化学循环信号放大技术测定DNA的电化学传感器的制备方法和测定DNA的方法，其特征在于所述Tris-HCl缓冲溶液配置，称1.576gTris用1000mL蒸馏水溶解，用6M的NaOH调pH到8.2，即得。
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