CN102507689B - 一种检测凝血酶的电化学发光传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种检测凝血酶的电化学发光传感器的制备方法及应用 Download PDF

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CN102507689B CN201110317670.2A CN201110317670A CN102507689B CN 102507689 B CN102507689 B CN 102507689B CN 201110317670 A CN201110317670 A CN 201110317670A CN 102507689 B CN102507689 B CN 102507689B
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陈怀成
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Abstract

本发明涉及一种检测凝血酶的电化学发光传感器的制备方法及应用，将带有活性基团的联吡啶钌修饰到金纳米粒子表面形成电化学发光纳米粒子探针，对电化学发光起放大作用，在工作电极表面上修饰上部分DNA单链，组成电化学发光传感器。将目标分析物凝血酶与部分DNA双链作用，再与DNA聚合酶和Nb.BbvCI切口酶、部分DNA单链作用，得DNA杂交液，将其加到传感器中，使得电极表面电化学发光纳米粒子探针增加，导致电化学发光信号增强，以此现象实现对凝血酶的测定。本发明的传感器具有很高的选择性和检测灵敏度。

Description

一种检测凝血酶的电化学发光传感器的制备方法及应用
技术领域
    本发明属于分析化学与电化学发光传感器领域，具体为一种检测凝血酶的电化学发光传感器的制备方法及应用。另外，本发明还涉及采用所述的电化学发光传感器检测凝血酶的方法。
背景技术
    凝血酶（Thombin）作为一种重要的蛋白酶，在血液凝固、炎症和创伤愈合等生理及病理过程中发挥着重要作用。由于恶性肿瘤患者常有不同程度的出血倾向，肿瘤组织对周围组织侵袭、肿瘤细胞转移以及肿瘤组织和肿瘤患者血液本身的变化，均可改变患者的凝血机制。衡量凝血机制的重要指标之一就是检测凝血酶的浓度，这为揭示肿瘤的发生机制，以及作为临床早期诊断、疗效及预后判断具有重大意义。
    目前测定凝血酶的传统方法主要有荧光法和发色底物法，其灵敏度不高，不满足实际检测要求。适体是利用指数富集配基的系统进化（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, SELEX）技术筛选出来的。能够与目标蛋白等进行高亲合性、高特异性的结合，其特异性可与抗原抗体相媲美。同时适体稳定、便宜、易合成、可再生，因而近年来成为蛋白分析的有力工具之一。目前利用适体的识别进行凝血酶检测方法主要为二茂铁淬灭钌联吡啶电化学发光等方法[Yan Li, Honglan Qi, Yage Peng, Qiang Gao, Chengxiao Zhang. Electrochem.Commun., 2008, 10, 1322-1325; Hongying Zhu, Jonathan D. Suter, Ian M. White, Xudong Fan. Sensors 2006, 6(8), 785-795; Anna Pasternak, Frank J. Hernandez, Lars M. Rasmussen, Birte Vester, Jesper Wengel. Nucl. Acids Res. 2011, 39(3), 1155-1164]。这些方法各有其优点，能不同程度的满足对凝血酶的检测要求，但方法的灵敏度不高。所以必须发展一种灵敏度高，简单的新型检测方法。
发明内容
    鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测凝血酶的电化学发光传感器的制备方法及应用，以及提供一种采用所述的电化学发光传感器检测凝血酶的方法。
本发明的目的是这样实现的：                                              
一种检测凝血酶的电化学发光传感器的制备方法，包括如下步骤：
（1）将金电极浸入0.5×10-7～1.5×10-7 M的DNA1中，37℃固定4 h后，在金电极表面形成自组装膜，用PBS溶液冲洗，再用0.5×10-3～1.5×10-3 M 的巯基己醇封板，用PBS溶液冲洗金电极；
（2）取DNA杂交液于小样品管中，37℃浸泡金电极进行杂交，之后用PBS冲洗金电极；
（3）取发光探针溶液于小样品管中，将金电极插入其中在37℃浸泡进行再杂交，然后用PBS 缓冲液冲洗金电极，从而制得电化学发光生物传感器；
其中：所述的DNA杂交液按如下方法制备而成：在小样品管中加入DNA1，然后再加入DNA2，37℃下杂交后，向其中加入凝血酶，室温下反应后再加入DNA3，37℃下反应后加入Tris-HCl缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶Phi 29，37℃反应；然后加入Tris-HCl缓冲液、DNA 剪切酶Nb.BbvCI，37℃条件下反应，即得；
所述的发光探针溶液按如下方法制备而成：在小样品管中加入依次加入pH为8.2的Tris-HCl、TCEP、DNA4、巯基乙胺，室温放置20-60min后加入金纳米粒子，室温下反应10-14 h后加入pH为9.0的硼酸缓冲液，取活化的联吡啶钌，室温下震荡反应过夜，将溶液于4 ℃，10000 r/min下离心，弃去上清液，加入Tris-HCl缓冲液洗涤后定容，即得；
所述的DNA1的部分序列为5`-CCAACCACACCAACCCAC-3`；
所述的DNA2的部分序列为3`-GGTTGGTGTGGTTGGGTGCTC-5`；
所述的DNA3的部分序列为：
3`-ATTGTGGTTGGGTGCGACTCCAACTAGCTGAAGT-5`；
所述的DNA4的部分序列为3`-SH-CAGACTCCAACT-5`。
优选地，上述的电化学发光传感器的制备方法，其中所述的金纳米粒子按如下方法制备而成：在圆底烧瓶中加入100 mL、0.01%的HAuCl4，搅拌加热至沸腾，然后快速加入1.8 mL、1%的Na3C6H5O7，再加热、搅拌10分钟，冷却至室温，即得。
优选地，上所述的电化学发光传感器的制备方法，其中所述的活化的联吡啶钌按如下方法制备而成：
（1）在100 mL圆底烧瓶中分别加入0.3992 g RuCl3·xH2O和0.6324 g 2,2-联吡啶，再加40 mL乙二醇加热回流6 h后，冷却至室温，用20 mL丙酮和40 mL乙醚萃取、抽滤，用无水乙醇冲洗三次，得到氯化二联吡啶钌；
（2）取0.16 g 氯化二联吡啶钌，以及0.16 g NaHCO3，0.12 g 4,4’-二羧基-2,2’-联吡啶，加到10 mL甲醇溶液中(V甲醇/水=4:1)，将混合液转移到50 mL三口烧瓶中加热回流4 h，然后冰浴下保存7 h，用HCl混合物调节pH至4.4，抽滤混合物后，再用甲醇冲洗三次，然后取2.0 g NaPF6溶于14 mL水中，加入到上述滤液中，反应生成沉淀，过滤并干燥沉淀，得到二联吡啶-4,4’-二羧基-2,2’-联吡啶合钌(II)六氟磷酸盐；
（3）在10 mL小烧杯中加入1.0 mL含0.1532 g上述产物的DMF 溶液，再加入1.5 mL含0.23 g EDC和0.119 g NHS 的DMF溶液，搅拌反应 5 h后即得到活后的联吡啶钌。
优选地，上述的电化学发光传感器的制备方法，其中所述的金电极按如下方法预处理：金电极经α-A12O3抛光粉抛光后，用二次蒸馏水冲洗干净，并在超声波水浴中超声5 min，用高纯氮气吹干；采用三电极系统检测，工作电极为金电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极，在K3[Fe(CN)6]溶液中，设置电压为0～0.8 V，对金电极进行循环伏安扫描，测完后，用二次水冲洗电极，吹干电极表面，备用。
一种利用上述方法制备的电化学发光传感器检测凝血酶含量的方法，使用不同浓度的凝血酶会得到不同浓度的杂交液，当加入10 μL一定浓度的凝血酶时，获得杂交液，经此杂交液反应制得的电化学传感器再经电化学发光检测，准确移取1 mL 0.1 M TPA（用pH为7.4的PBS溶液配制）到检测池中，以具备电化学发光生物传感器功能的金电极作为工作电极，以电化学发光信号S（S为施加电压后30 s内的电化学发光积分值）为分析信号，进行凝血酶的测定，参数设置为：高压800 v，放大级数为3。
由于上述方法制备的电化学发光传感器可以检测凝血酶，因此，本发明提供了上述的电化学发光传感器在检测凝血酶含量中的应用。
与现有技术相比，本发明涉及的电化学发光传感器具有如下优点和显著地进步：金纳米粒子提供相对大的比表面积用于负载电化学发光试剂，酶切循环使信号进一步放大，使得本发明设计的电化学发光适体传感器具有高灵敏度。另外，根据实验发光强度（图8）可以看出，当本发明的传感器用于检测溶菌酶、牛血清白蛋白和免疫球蛋白G时，其发光强度远远低于检测凝血酶的发光强度，这说明该传感器具有很高的选择性检来测凝血酶。因此，本发明涉及的电化学发光传感器在构建检测蛋白质的研究方法中体现出良好的发展前景。
附图说明
    图1为本发明的实验原理图。
    图2为不同修饰阶段的电极的电化学阻抗。
    图3为电化学发光适体传感器的电化学行为。
    图4为凝血酶与其适体结合时间。
    图5为检测体系的pH。
    图6为不同浓度凝血酶的电化学发光信号。
   图7为电化学发光强度与凝血酶浓度的标准曲线图，插图为凝血酶浓度为3.0×10-14~6.0×10-12 M与电化学发光信号线性关系的放大图。
图8 相同浓度凝血酶、溶菌酶、牛血清白蛋白和免疫球蛋白G的检测结果比较。
具体实施方式
以下是本发明涉及的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
    本发明涉及的一种检测凝血酶的电化学发光传感器，将带有活性基团的联吡啶钌修饰到金纳米粒子表面形成电化学发光纳米粒子探针，对电化学发光起放大作用，在工作电极表面上修饰上部分DNA单链，组成电化学发光传感器。将目标分析物凝血酶与部分DNA双链作用，再与DNA聚合酶和Nb.BbvCI切口酶、部分DNA单链作用，得DNA杂交液，将其加到传感器中，使得电极表面电化学发光纳米粒子探针增加，导致电化学发光信号增强。以此现象实现对凝血酶的测定。
    本发明是通过以下措施来实现的：一种检测凝血酶的电化学发光传感器的制备方法，包括以下步骤：
    (1) 利用现有方法，制备出合适粒径的金纳米粒子；
    (2) 利用巯基与金的作用，将一端巯基，另一端羧基的烷烃修饰在金纳米粒子表面；
    (3) 利用羧基和氨基作用，将氨基化的联吡啶钌连接在烷烃修饰的金纳米粒子上制备电化学发光探针；
    (4) 利用靶标与适体的特异性识别作用、Nb.BbvCI切口酶切割作用和DNA聚合酶聚合作用，制备DNA 的杂交液；
    (5) 利用杂交技术，构建电化学发光传感器。
    所述金纳米粒子电化学发光纳米粒子探针和传感器的制备包括以下步骤：
    (1) 工作电极表面经1 μm、0.3 μm、0.05 μm的α-A12O3抛光粉抛光后，用二次蒸馏水冲洗干净，并在超声波水浴中超声5 分钟，用二次水彻底冲洗后，吹干；
    (2) 将工作电极浸入100 μL（1.0×10-7 M）的部分DNA单链溶液中，37℃杂交反应4 h，用PBS溶液清洗电极，再用巯基己醇（MCH, 200 μL，10-3 M）浸泡30分钟，用PBS溶液清洗电极；
    (3) 取50 μL已制备好的杂交液于2 mL小样品管中，浸泡工作电极1 h（37℃）进行杂交，之后用PBS清洗电极；
    (4) 取100 μL已制备好的电化学发光探针溶液于2 mL小样品管中，37 ℃下将工作电极浸入进行杂交1 h，然后用PBS 清洗电极。
    (5)  DNA 杂交液的制备采用以下步骤：在2 mL的小样品管中加入DNA1 (10 μL，10-7 M)，然后再加入DNA2 (10 μL，10-7 M)，37℃下杂交60 min，形成部分DNA双链。向其中加入10 μL不同浓度的凝血酶。室温下反应40 min。再加入部分DNA3 单链(10 μL，10-7 M)，37℃下反应1 h。加入7.5 μL的Tris-HCl缓冲液，6 μL的10﹡buffer2，6 μL的dNTPs, 然后加入0.5 μL DNA聚合酶Phi 29，37℃反应1 h。加入2.5 μL Tris-HCl缓冲液，7 μL的10﹡buffer2，再加入0.5 μL DNA 剪切酶Nb.BbvCI，37℃条件下反应1 h。上述杂交液于4℃下保存备用。
    具体实验原理如图1所示。
    不同修饰阶段的电极的电化学阻抗如图2所示。
    电化学发光适体传感器的电化学行为如图3所示。
    本发明中的电化学发光检测条件，具体特征如下：
    (1) 凝血酶与其适体结合时间。优选的，实验结果如图4所示。从图4可以看出，电化学发光强度在10～40 min内随着结合时间增长而增加，在40 min达到最大值，而在40～60 min内随着结合时间增加，发光强度反而略有下降。这可能是在较长的时间条件下，凝血酶及凝血酶-适体结合物吸附或包埋住部分DNA 洗脱液，造成最终信号强度略减。优选的，最佳结合时间为40-50 min。
    (2) 检测体系的pH。优选的，实验结果如图5所示。当pH为7.0-8.0时，电化学发光强度较大。所以，优选的，实验用pH为7.0-8.0。
实施例：基于酶切循环信号放大技术标记电化学发光传感器检测凝血酶
    1. 实验部分
    1.1 仪器与试剂
    MPI-E型电致化学发光分析系统(西安瑞迈分析仪器有限公司)；THZ-82A气浴恒温振荡器（全坛市医疗仪器厂）；CHI660B电化学工作站（上海辰华仪器公司）；Anke-TGL-16C飞翁牌高速离心机（上海市安亭科学仪器厂）；PHS-3D型酸度计（上海雷磁仪器厂）；实验采用三电极系统：金电极及修饰金电极为工作电极，Ag/AgC1（饱和KCl）电极为参比电极，铂丝电极为对电极。
    巯基己醇（HS-(CH2)6-OH）购自Aldrich 公司；NaH2PO4·2H2O购自天津市广成化学试剂有限公司；Na2HPO4·12H2O购自天津市红岩化学试剂厂；TCEP，三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）购自国药集团化学试剂有限公司；氯金酸（HAuCl4），柠檬酸三钠（Na3C6H5O7）均购于天津市博迪化工有限公司；铁氰化钾（K3[Fe(CN)6]）购自天津市博迪化工有限公司；亚铁氰化钾（K4[Fe(CN)6]·3H2O）购自天津市广成化学试剂有限公司；氧化铝粉末（α-A12O3），购自CH Instruments, Inc；三丙胺（TPA）购自上海阿拉丁试剂公司；DNA聚合酶（phi 29.），DNA限制性内切酶（Nb.BbvCI）购自北京百灵威科技有限公司；凝血酶购于Haematologic Technologies, Inc.（美国）；水合氯化钌，2,2-联吡啶，4,4’-二羧基-2,2’-联吡啶，六氟磷酸钠均购自上海阿拉丁试剂公司；1-（3-二甲氨基醛）-3-乙基二亚胺盐酸盐（EDC）购自天津市巴斯夫化工有限公司；N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）购自天津市巴斯夫化工有限公司。
    所用人工合成DNA序列（北京赛百盛生物工程有限公司购得）如下。
    部分DNA1：（凝血酶适体互补链），5`-CCA ACC ACA CCA ACC CAC-3`；
    部分DNA2：（凝血酶适体），3`-GGT TGG TGT GGT TGG GTG CTC-5`；
    部分DNA1与部分DNA2形成部分DNA双链。
    部分DNA3单链：3`-AT T GTG GTT GGG TGCGAC TCC AAC TAG CTG AAGT-5`；（粗体部分与DNA1杂交），
    部分DNA4单链：（3`-SH，与金电极连接），3`-SH-CAG ACT CCA ACT-5`；
    1.2实验步骤
    1.2.1金纳米粒子的制备
    制备、储存金胶溶液所用的玻璃容器（容量瓶，棕色广口瓶，圆底烧瓶等）用王水（盐酸硝酸比例为1:3）泡洗30分钟，然后用二次水冲洗干净，烘干备用。在250 mL圆底烧瓶中加入100 mL，0.01%的HAuCl4，搅拌加热至沸腾，然后快速加入1.8 mL，1%的Na3C6H5O7，再加热、搅拌10分钟，冷却至室温。转移到棕色瓶中于阴凉处保存。
    1.2.2联吡啶钌的合成与活化
（1）在100 mL圆底烧瓶中分别加入0.3992 g RuCl3·xH2O和0.6324 g 2,2-联吡啶，再加40 mL乙二醇加热回流6 h后，冷却至室温，用20 mL丙酮和40 mL乙醚萃取、抽滤，用无水乙醇冲洗三次，得到氯化二联吡啶钌。
（2）取上述方法制得的0.16 g Ru(bpy)2Cl2，以及0.16 g NaHCO3，0.12 g 4,4’-二羧基-2,2’-联吡啶，加到10 mL甲醇溶液中(V甲醇/水=4:1)。将混合液转移到50 mL三口烧瓶中加热回流4 h，然后冰浴下保存7 h，用HCl混合物调节pH至4.4，抽滤混合物后，再用甲醇冲洗三次。然后取2.0 g NaPF6溶于14 mL水中，加入到上述滤液中，反应生成沉淀。过滤并干燥沉淀，得到二联吡啶-4,4’-二羧基-2,2’-联吡啶合钌(II)六氟磷酸盐(Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)。
（3）在10 mL小烧杯中加入1.0 mL含0.1532 g上述产物的DMF 溶液，再加入1.5 mL含0.23 g EDC和0.119 g NHS 的DMF溶液，搅拌反应 5 h后即得到活后的联吡啶钌-Ru(bpy)2(dcbpy)NHS。
    1.2.3电化学发光探针的制备
    取2 mL的样品管，依次加入1.5 μL，500 mM的Tris-HCl(pH为8.2)，6 μL，10 mM的TCEP，7.2 μL，10-4 M的DNA4，7.2 μL，10-4 M的巯基乙胺，室温放置30 min后加入1 mL Au NPs，室温下反应12 h。再加入120 μL，0.1 M 的硼酸缓冲液（pH为9.0），取8 μL上一步活化的联吡啶钌，室温下震荡反应过夜。将溶液于4 ℃，10000 r/min下离心30 min，弃去上清液，加入800 μL Tris-HCl缓冲液(500 mM，pH为8.2)洗3次。使用Tris-HCl缓冲液定容至1 mL，4 ℃储存备用。
   1.2.4 DNA 杂交液的制备
    在2 mL的小样品管中加入DNA1 (10 μL，10-7 M)，然后再加入DNA2 (10 μL，10-7 M)，37℃下杂交60 min。向其中加入10 μL不同浓度的凝血酶。室温下反应40 min。再加入DNA3 (10 μL，10-7 M)，37℃下反应1 h。加入7.5 μL的Tris-HCl缓冲液，6 μL的10﹡buffer2（buffer2为商品化DNA限制性内切酶（Nb.BbvCI）附带溶液），6 μL的dNTPs, 然后加入0.5 μL DNA聚合酶Phi 29，37℃反应1 h。加入2.5 μL Tris-HCl缓冲液，7 μL的10﹡buffer2，再加入0.5 μL DNA 剪切酶Nb.BbvCI，37℃条件下反应1 h。上述杂交液于4℃下保存备用。
    1.2.5电化学生物传感器的构建
    1. 金电极的预处理。金电极经α-A12O3抛光粉抛光后，用二次蒸馏水冲洗干净，并在超声波水浴中超声5 min，用高纯氮气吹干。采用三电极系统检测，工作电极为金电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极，在K3[Fe(CN)6]溶液中，设置电压为0～0.8 V，对金电极进行循环伏安（CV）扫描。测完后，用二次水冲洗电极，吹干电极表面，备用。
    2. 电化学发光传感器的制备。将金电极浸入100 μL（1.0×10-7 M）的DNA1中，固定4 h（37℃）后，在Au电极表面形成自组装膜，用0.1 MPBS（pH 7.4，Na2HPO4- NaH2PO4）溶液冲洗二次，再用MCH（200 μL，10-3 M）封板半小时，用PBS溶液冲洗电极二次。取50 μL已制备好的杂交液于2 mL小样品管中，浸泡金电极1 h（37℃）进行杂交，之后用PBS冲洗电极二次。取100 μL已制备好的探针溶液于2 mL小样品管中，将金电极浸入1 h（37 ℃）进行再杂交，然后用PBS 缓冲液冲洗电极二次。从而制得电化学发光生物传感器。
    1.2.6电化学发光法检测凝血酶
    使用不同浓度的凝血酶会得到不同浓度的杂交液，当加入10 μL一定浓度的凝血酶时，获得杂交液，经此杂交液反应制得的电化学传感器再经电化学发光检测。准确移取1 mL 0.1 M TPA（用pH为7.4的PBS溶液配制）到检测池中，以具备电化学发光生物传感器功能的金电极作为工作电极，以电化学发光信号S（S 为施加电压后30 s 内的电化学发光积分值）为分析信号，进行凝血酶的测定。参数设置为：高压800 v，放大级数为3。
    1.3结果与讨论
    本发明在优选的最佳的实验条件下，研究了不同浓度凝血酶与发光强度之间的关系，得到了检测凝血酶的标准曲线，线性范围及线性方程。
 在最佳的实验条件下，当凝血酶的浓度在3.0×10-14～6.0×10-10 M之间时，随着凝血酶浓度的变化，电化学发光强度有明显变化。经计算得到检测凝血酶的非线性方程为ΔIECL = - 0.0138 C2  + 17.6762 C + 83.5496 (ΔIECL 是体系的相对化学发光强度；C是凝血酶的浓度，10-13 M；n=12，R2=0.9919) 溶菌酶的浓度在3.0×10-14～6.0×10-12 M范围内与发光强度呈一定的线性关系，其线性回归方程是ΔIECL = 22.8575 C + 10.8689（ΔIECL是体系的相对化学发光强度; C是凝血酶的浓度，10-13 M；n=9），线性相关系数R= 0.9991，检测限是1.8×10-14 M（3σ），实验数据证明该方案比大多数现有腺苷适体传感器更灵敏。该方法的精密度通过对浓度为3.0×10-12 M的凝血酶进行11次平行测定而计算得出，相对标准偏差为3.1%。表明本法有较好的重现性。
    选择性是衡量传感器性能的重要指标。为检验该传感器的选择性，选择牛血清白蛋白和溶菌酶作为检测适体传感器对检测凝血酶的对比物。将修饰好的传感器检测浓度为3.0×10-12 M溶菌酶、牛血清白蛋白和免疫球蛋白G，并将发光强度与检测凝血酶的发光强度比较。发光强度如图8所示，可以看出，检测溶菌酶、牛血清白蛋白和免疫球蛋白G的发光强度远远低于检测凝血酶的发光强度，说明该传感器具有很高的选择性来测凝血酶。
    本发明是基于酶切循环信号放大技术标记电化学发光机制研制了一种高灵敏检测凝血酶的新型生物传感器。研制的传感器具有如下优势：金纳米提供相对大的比表面积用于负载电化学发光试剂；酶切循环使信号进一步放大，设计的电化学发光适体传感器具有高灵敏度。因此，所设计的电化学发光传感器在构建检测蛋白质的研究方法中体现出良好的发展前景。 
序列表
SEQUENCE LISTING
 
<110> 青岛科技大学
<120> 一种检测凝血酶的电化学发光传感器的制备方法及应用
<160> 4
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccaaccacac caacccac                     18     
 
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctcgtgggtt ggtgtggttg g                 21
 
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgaagtcgat caacctcagc gtgggttggt gtta   34
 
<210> 4
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcaacctcag ac                           12

Claims (3)

1.一种检测凝血酶的电化学发光传感器的制备方法，包括如下步骤：
（1）将金电极浸入0.5×10-7～1.5×10-7 M的DNA1中，37℃固定4 h后，在金电极表面形成自组装膜，用PBS溶液冲洗，再用0.5×10-3～1.5×10-3 M 的巯基己醇封板，用PBS溶液冲洗金电极；
（2）取DNA杂交液于小样品管中，37℃浸泡金电极进行杂交，之后用PBS冲洗金电极；
（3）取发光探针溶液于小样品管中，将金电极插入其中在37℃下浸泡进行再杂交，然后用PBS 缓冲液冲洗金电极，从而制得电化学发光生物传感器；
其中：所述的DNA杂交液按如下方法制备而成：在小样品管中加入DNA1，然后再加入DNA2，37℃下杂交后，向其中加入凝血酶，室温下反应后再加入DNA3，37℃下反应后加入Tris-HCl缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶Phi 29，37℃反应；然后加入Tris-HCl缓冲液、DNA 剪切酶Nb.BbvCI，37℃条件下反应，即得；
所述的发光探针溶液按如下方法制备而成：在小样品管中加入依次加入pH为8.2的Tris-HCl、TCEP、DNA4、巯基乙胺，室温放置20-60min后加入金纳米粒子，室温下反应10-14 h后加入pH为9.0的硼酸缓冲液，取活化的联吡啶钌，室温下震荡反应过夜，将溶液于4 ℃，10000 r/min下离心，弃去上清液，加入Tris-HCl缓冲液洗涤后定容，即得；
所述的DNA1的部分序列为5`-CCAACCACACCAACCCAC-3`；
所述的DNA2的部分序列为3`-GGTTGGTGTGGTTGGGTGCTC-5`；
所述的DNA3的部分序列为3`-ATTGTGGTTGGGTGCGACTCCAACTAGCTGAAGT-5`；
所述的DNA4的部分序列为3`-SH-CAGACTCCAACT-5`。
2.根据权利要求1所述的电化学发光传感器的制备方法，其特征在于：所述的活化的联吡啶钌按如下方法制备而成：
（1）在100 mL圆底烧瓶中分别加入0.3992 g RuCl3·xH2O和0.6324 g 2,2-联吡啶，再加40 mL乙二醇加热回流6 h后，冷却至室温，用20 mL丙酮和40 mL乙醚萃取、抽滤，用无水乙醇冲洗三次，得到氯化二联吡啶钌；
（2）取0.16 g 氯化二联吡啶钌，以及0.16 g NaHCO3，0.12 g 4,4’-二羧基-2,2’-联吡啶，加到10 mL甲醇溶液中，其中V甲醇/水=4:1，将混合液转移到50 mL三口烧瓶中加热回流4 h，然后冰浴下保存7 h，用HCl混合物调节pH至4.4，抽滤混合物后，再用甲醇冲洗三次，然后取2.0 g NaPF6溶于14 mL水中，加入到上述滤液中，反应生成沉淀，过滤并干燥沉淀，得到二联吡啶-4,4’-二羧基-2,2’-联吡啶合钌(II)六氟磷酸盐；
（3）在10 mL小烧杯中加入1.0 mL含0.1532 g上述产物的DMF 溶液，再加入1.5 mL含0.23 g EDC和0.119 g NHS 的DMF溶液，搅拌反应 5 h后即得到活后的联吡啶钌。
3.根据权利要求1所述的电化学发光传感器的制备方法，其特征在于：所述的金电极按如下方法预处理：金电极经α-A12O3抛光粉抛光后，用二次蒸馏水冲洗干净，并在超声波水浴中超声5 min，用高纯氮气吹干；采用三电极系统检测，工作电极为金电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极，在K3[Fe(CN)6]溶液中，设置电压为0～0.8 V，对金电极进行循环伏安扫描，测完后，用二次水冲洗电极，吹干电极表面，备用。
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