CN104280365B - 双重检测生物传感芯片及其制备方法和dna检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种双重检测生物传感芯片，包括衬底，以及设置于衬底上三电极体系，三电极体系包括生物传感电极、辅助电极和参比电极，所述生物传感电极为纳米金电极，纳米金电极包括设置于衬底上的透明导电基底，该透明导电基底表面上设有若干规则排布的纳米金颗粒。本发明的双重检测生物传感芯片，将三电极体系中的工作电极采用纳米金电极，纳米金颗粒的电极结构能进行局域表面等离子的光学生物检测；而透明导电基底本身也是N型半导体，实现电化学生物检测的同时，其透明特性也不会影响光学检测的进行。
Description
技术领域
本发明属于生物电子电化学和光学传感技术领域，具体涉及一种联合电极表面电化学信号和局域表面等离子体共振的双重检测生物传感芯片及其制备方法和检测方法。
背景技术
局域表面等离子体共振(LSPR,Localised Surface Plasmon Resonance)是金属纳米颗粒或者不连续的金属纳米结构被入射光激发后，其内部自由电子的协同震荡产生局域表面等离子体共振，金属纳米结构表面的局域电磁场被极大增强，展现强烈的表面等离子体共振吸收。生物传感芯片利用纳米颗粒表面修饰特定捕获探针，检测物质与捕获探针的杂交/亲和结合会改变传感器的检测平面上纳米颗粒本身的震动频率，从而使得传感器对入射光产生的吸收峰发生改变，变化的大小程度与检测物质的浓度呈正相关。
在电化学检测中，比如有酶催化体系主要用于安培型或伏安型电化学传感器，利用循环伏安法进行核酸或蛋白分析，操作简便、直观，灵敏度高，常用于蛋白或核酸定量或定性分析。在酶催化放大电化学传感器中，常以标记的辣根过氧化物酶(HRP)催化相关底物反应电信号，在电极表面放大检测信号。差分脉冲伏安法具有灵敏度高、分辨能力强、选择性强等特点，在分析领域得到广泛的应用。在定量检测方面，常常比分子或院子吸收光谱、大部分色谱方法灵敏。
但目前，为满足不同靶物质定量或定性检测要求，需要同时进行光学生物检测和电化学生物检测等多种检测才能确定待测物的准确信息；而实施中则需分别制备上述特定检测的电化学或光学传感芯片，每一种传感芯片只能实现单一种类检测，导致检测过程需要分次重复，耗时、成本高；需要分别制备对应的单一传感芯片，过程繁琐。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种高灵敏度、制备简单、成本低的联合电极表面电化学信号和局域表面等离子体共振的双重检测生物传感芯片，以及其制备方法和检测方法。
为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
一种双重检测生物传感芯片，包括衬底，以及设置于所述衬底上三电极体系，所述三电极体系包括生物传感电极、辅助电极和参比电极，所述生物传感电极为纳米金电极，所述纳米金电极包括设置于所述衬底上的透明导电基底，该透明导电基底表面上设有若干规则排布的纳米金颗粒。
本发明的双重检测生物传感芯片，将三电极体系中的工作电极采用纳米金电极，纳米金颗粒的电极结构能进行局域表面等离子的光学生物检测；并且纳米金电极包括透明导电基体，而透明导电基体本身是选用N型半导体；同时能满足实现电化学生物检测和光学生物检测，并且同时结合LSPR与电化学的检测结果，可以减少样品检测中的假阳性结果，整体检测结果更加精确。
本发明进一步还提出一种双重检测生物传感芯片的制备方法，包括如下步骤：
制备纳米金电极；
以所述纳米金电极作为工作电极，与辅助电极和参比电极组装成三电极体系。
采用本发明上述制备方法，采用在透明导电基底上形成纳米金颗粒制成纳米金电极，再将纳米金电极用于三电极模板中的工作电极，即可同时实现光学和电化学的检测。
本发明还提出一种基于双重检测生物传感芯片的DNA检测方法，包括如下步骤：
获取待测DNA；
将待测DNA添加至双重检测生物传感芯片的工作电极上；
检测加样后的双重检测生物芯片在400nm～800nm光波长内的吸收光谱，以及用差分脉冲伏安法测定双重检测生物芯片的电流峰谱。
本发明的基于双重检测生物传感芯片的DNA检测方法，相比现有的单一检测的方式，可以同时进行光学和电化学生物检测，耗时短，且能避免分次检测的结果偏差，更加提高了检测的精确性和灵敏度；并且同时结合LSPR与电化学的检测结果，可以减少样品检测中的假阳性。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1为本发明实施例双重检测生物传感芯片的结构示意图；
图2为本发明实施例纳米金电极制备过程中压印板与透明导电基底压合示意图；
图3为图2中压印后抗蚀层表面生成纳米级尺寸凹槽的结构示意图；
图4为图3中抗蚀层表面沉积保护层后的结构示意图；
图5为图4中抗蚀层被等离子蚀刻后的结构示意图；
图6为图5中保护层和透明导电基底裸露表面生成Au膜后的结构示意图；
图7为图6中去除残留抗蚀层后获得的纳米金电极结构示意图；
图8为本发明实施例双重检测生物传感芯片进行双重检测的示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实例提供了一种联合电极表面电化学信号和局域表面等离子体共振的双重检测生物传感芯片，参见图1，其包括衬底1，该衬底1的表面上设置有纳米金电极2、以及辅助电极3和参比电极4组成的三电极体系；
其中纳米金电极2包括一设于衬底1上的透明导电基底21，该透明导电基底21表面上设有纳米金颗粒；纳米金颗粒尺寸大小为纳米级，本发明中优选采用20～80nm。且进一步地，在本发明中纳米金颗粒的数量可以有若干，整体规则、有序、均匀分布排列，可以提高LSPR传感器对界面变化检测的灵感度。
在本发明中，上述衬底1在实施中采用玻璃即可，基于其功能和电极衬底的效果用石英、亚克力等透明度和强度较好的材料进行也可以，实施中也可以采用PCB。
并且为了使本发明中的三电极体系相比现有的标准三电极能够具备微量检测的功能，其中参比电极4用标准Ag/AgCl电极；辅助电极3用铂黑电极、也可以使用在研究介质中保持惰性的金属材料如Ni、W、Pb等，保证辅助电极3上的电流密度，使其在测量过程中基本上不被极化。
鉴于传统的传统的三电极体积庞大，化学试剂消耗较大，制备工艺繁琐，仅适于大量检测，因此在本发明中上述三电极体系采用丝网印刷方法进行制作，采用丝网印刷电极制备三电极，本身丝网印刷技术具有如下特点：1、适用于各种材质，如Si、PVC、PC、PET、PU等材料均可使用；2、可以在基底表面印刷各种图案,设计十分灵活；3、印刷过程易实现自动化；4、重现性好；5、成本低廉；因此，丝网印刷技术能够大批量生产重现性好的生物传感器，而且制备的三电极体系可以用于非常微量的标样检测。
本发明采用将现有电化学生物检测芯片中的工作电极用能够进行局域表面等离子共振光学生物检测的纳米金电极2进行；其中纳米金电极2中的采用透明导电基底21；实施中该透明导电基底优选为ITO即氧化铟锡，本身是一种N型半导体材料，具有良好的导电性、透明性和黏附性等独特性能，在本发明中将其进行加工形成厚度为纳米级的玻璃膜的形式固设于衬底1上，然后在透明导电基底21表面上蚀刻形成纳米金颗粒结构，能进行局域表面等离子的光学生物检测，而且由于ITO本身又是导体，本发明中将其作为工作电极的基底，那么便可以用于电化学生物检测，其材质和导电的整体性能可以最优地满足本发明中进行电化学检测中的导电性能，以及作为光学检测中基底的条件。当然，该透明导电基底21除了上述ITO薄膜或者薄片之外，还可以采用同等性质的AZO(铝掺杂的氧化锌)、FTO(SnO2：F)、PET-ITO等透明导电薄膜及玻璃进行替换，皆可。为了使得ITO基底能够较好地接入检测，纳米金电极2还包括与ITO基底连接的导电接口22，更加便于电连接后进行检测。
当然，进一步地，本发明的双重检测生物传感芯片，其纳米金电极2上固定有靶向设计DNA探针，通过该DNA探针与待测的DNA特异性结合引起检测中光谱或者电信号的差异，从而得出待测DNA的定量和定性结果。
本发明进一步提出上述双重检测生物传感芯片的制备方法，包括如下步骤：
S10，制备纳米金电极；
S20，组装双重检测生物传感芯片；
S30，在纳米金电极上固定DNA探针；
其中在本发明上述步骤中，步骤S10为制备纳米金电极，其具体实施中可以采用如下步骤进行，具体可以参见图2-7所示的示意图:
S11，获取一ITO玻璃211，并将其表面进行清洗、干燥后备用；
S12，在ITO玻璃211表面涂布一抗蚀层212；
S13，在抗蚀层212的表面上生成纳米级尺寸的凹槽214；
S14，在抗蚀层212的非凹槽表面沉积一保护层215；
S15，将沉积有保护层215的ITO玻璃211进行等离子蚀刻，除去位于凹槽214部位的抗蚀层212，并使位于该凹槽214部位的ITO玻璃211表面裸露；
S16，在步骤S15所制备的ITO玻璃211的裸露表面生成纳米级厚度的Au膜216；
S17，再用氧气等离子体处理，除去残余的抗蚀层212，即得到ITO-纳米金电极。
其中上述步骤S13中，抗蚀层212表面纳米级尺寸凹槽214的形成在本发明中采用纳米压印技术进行，其具体实施中可以选用一压印板213，该压印板213的压印面上具有若干规则排布的尺寸为纳米级的凸模型213a，将压印板213的压印面与抗蚀层212压合，那么便能在抗蚀层212表面上形成与上述纳米级的凸模型213a适配的凹槽214。当然，本发明纳米压印实施中，鉴于检测的需要，凸模型213a和凹槽214的形状可以根据检测的需求进行设计，当然一般为了检测光谱的谱带更加优良，形状优选规则几何形状。
在完成上述纳米金电极后，这一纳米金电极其表面的纳米金可以直接用于局域表面等离子光学生物检测，进一步为了满足能够同时进行电化学检测的功能，进一步采用步骤S20组装双重检测生物传感芯片，在步骤S20中采用将S10所制备的纳米金电极安装在三电极模板上。
在组装完成双重检测生物芯片之后，为了能使其正常工作并进行检测，需要在步骤S10完成的纳米金电极上固定DNA探针；其中DNA探针可以通过现有常规技术固定在金电极表面，但是在本发明中为了使探针的特异性，采用本发明如下定向锚定技术进行DNA探针的固定，包括：
S31，电极活化：将所得的纳米金电极分别用HNO3溶液、丙酮和纯水清洗，干燥；
S32，形成羟基单分子层：室温下，将纳米金电极用巯基乙酸溶液浸泡处理后，清洗干燥，则纳米金电极上形成羟基单分子层；
S33，将具有羟基单分子层的纳米金电极于含有偶联剂和单链的DNA探针的MES(pH优选6.5)溶液中浸泡处理；
S34，清洗、干燥，低温保存备用。
其中，步骤S31中因为纳米金电极的表面极易发生钝化，导致表面纳米金颗粒的的结合力以及活性下降，因此本发明在使用时先将纳米金电极用硝酸溶液进行清洗，将其表面的钝化膜、有机物、无机物等去除，进行极化，使其电极达到能产生较好的电势。
步骤S32和步骤S33中采用巯基乙酸对纳米金电极进行处理，并在偶联剂偶联剂(EDAC，或者EDAC与NHS混合)作用下，使金电极表面形成自由-OH基团，自由-OH基团与探针DNA 5'-端磷酸基团通过共价键结合，将DNA探针的5'-端定向锚定在金电极表面，避免了DNA探针非特异性吸附。
并进一步在上述步骤S33中的DNA探针包括捕获探针和二茂铁标记的特异DNA杂交指示信号探针，捕获探针设计本身与待测样品中靶DNA的杂交，使待测样品中靶DNA序列能结合在DNA探针上，那么便实现检测；而在捕获探针之外，本发明DNA探针还包括用于杂交检测的信号探针，该信号探针与双链DNA中靶DNA序列的另一互补链为互补设计，检测时捕获探针和二茂铁标记的特异DNA杂交指示信号探针分别与双链DNA中的靶序列、以及靶序列互补序列互补识别，形成类似于脱氧核糖核苷酸单链“三文治”包夹结构，信号探针上标记有标记物根据标记物释放的信号，根据反应中信号变化便可实现检测样品的目的。上述实施方式中DNA探针为根据已知的特异性基因进行设计，如果检测中待测DNA样品能与这一DNA探针进行结合，那么便可以认定待测的DNA即为该DNA探针所属的靶序列类型；如果检测中无法结合，那么说明待测DNA的类型与DNA探针所述的靶序列类型不匹配，那么可以更换DNA探针，重复检测过程，直至能得出待测DNA的类型为止。
并且，本发明采用上述二茂铁分子标记的信号探针进行电化学生物检测，因为二茂铁本身是一类具有夹心型结构的富电子化合物，在适当的电势条件下，二茂铁分子向电极表面转移电子的效率有其余电极表面距离远近的影响，当距离靠近时，二茂铁分子中的Fe(II)氧化为Fe(III)的电子转移效率高，可获得较高的氧化还原峰电流；当距离拉开时，其电子转移效率降低，相应的峰电流减弱。因此，充分利用二茂铁分子电子转移效率对距离的依赖性和分子识别元件与目标物结合前后的构象变化，可实现对不同目标物的检测。二茂铁在邻近杂交效应的研究中，对目标DNA检测的线性范围可达1fM。因此采用二茂铁作为信号探针的电信号检测指示剂，使本发明中检测的结果，还能大大提高检测灵敏度和准确度。
当然，需要指出的是，本发明上述制备的ITO-纳米金电极其本身的纳米金材质，容易被氧化和钝化，因此在上述制备中进行清洗后干燥时，需要在氮气提供的保护气氛氛围下进行干燥，避免其被氧化等。当然出于相同的目的，氮气也可以采用同样具有保护作用惰性等气体替换皆可。并且在本发明中，上述步骤S30进行DNA探针固定在S20组装成三电极之后进行；如果组装直接进行使用，那么DNA探针固定步骤也可在步骤S20组装之前进行。
采用本发明上述制备方法，采用在ITO玻璃基材上形成纳米金颗粒制成纳米金电极，再将纳米金电极用于三电极模板中的工作电极，即可同时实现光学和电化学的检测。并且纳米金电极采用纳米压印技术，在ITO玻璃基材上形成具有规则、有序、均匀排列或者分布的的纳米金颗粒结构，提高LSPR传感器对界面变化检测的灵感度。
同时，进一步为了保证测量的准确，本发明采用定向锚定将DNA探针固定在纳米金电极表面，避免了DNA探针非特异性吸附，进一步提升了测量的准确性。
基于本发明上述双重检测生物芯片，本发明提出一种基于该双重检测生物芯片的DNA检测方法，参考如下步骤进行：
S100，获取待测DNA样品；
S200，将待测DNA样品添加至工作电极上，静置后冲洗干燥；
S300，双重检测，参见图8所示：
用紫外分光光度计对双重检测生物芯片在400nm～800nm光波长内测量吸收光谱；
用差分脉冲伏安法测定双重检测生物芯片的电流峰谱。
在上述检测过程中属于样品测试，在实施过程中可以再相同的条件下以相同的双重检测生物芯片不添加样品作为对照组进行对比参考，或者将上述步骤S200之前，未添加待测DNA样品时的双重检测生物芯片进行吸收光谱和电流峰谱检测，将检测的吸收光谱和电流峰谱作为未加样的对照。
为了使本发明上述方法更加清楚并易于理解，以下通过实施例进行举例说明：
实施例1
S11，选用厚度为1mm、直径为1cm的ITO圆形玻璃基材，分别用氨水、乙醇和蒸馏水超声清洗3分钟，用氮气吹干；
在这一步骤中，采用将ITO玻璃基材为了电极组装及电极制备方便，选择为圆形；当然也可以根据所需用其他的规则或者不规则的形状替换均可，并不仅仅限定于圆形形状。
S12，在步骤S11清洗后的ITO圆形玻璃基材上涂布单层压印抗蚀剂如树脂等，在ITO圆形玻璃基材上形成一树脂层；
S13，获取一压印板，该压印板的压印面具有纳米级的凸模型；将该压印板的压印面朝向树脂层与ITO圆形玻璃基材压合之后，再取掉压印板，则在抗蚀层的表面上形成与凸模型适配的凹槽；
凹槽的形状，在本发明中为了保证检测中光谱的精确性，该凹槽的形状优选为规则形状，其尺寸大小为纳米级；这些凹槽的数量为若干个，整体在抗蚀层表面上均匀、有序、规则的排列，可以提高LSPR传感测量中对界面变化检测的灵感度。
S14，将压印有上述纳米级凹槽的ITO圆形玻璃基材斜置45度，在树脂层表面沉积一层20nm的金属铬(Cr)层；并且由于抗蚀层表面存在上述纳米级凹槽，那么金属铬(Cr)层沉积于树脂层非凹槽的表面部位，凹槽部中则不会沉积上金属铬(Cr)层；该金属铬(Cr)层作为保护层，防止步骤S15中的等离子蚀刻导致树脂层整体被蚀刻，而不能形成特定的纳米金颗粒结构。
S15，将沉积有金属铬(Cr)层的ITO圆形玻璃基材置于洗胶机中，使用氧气等离子体进行冲洗、刻蚀；那么在冲洗、蚀刻的处理中，非凹槽表面具有金属铬(Cr)层保护，则这一部分的抗蚀层不会被蚀刻去除，而由于凹槽内表面没有上述金属铬(Cr)层的沉积，那么位于凹槽部分的树脂层会被蚀刻去除，使ITO圆形玻璃基材相对于凹槽部位的裸露；
S16，在步骤S15所形成的ITO圆形玻璃基材的表面裸露部位上进行电子束蒸镀，将20nm Au颗粒均匀蒸镀，使ITO圆形玻璃基材的表面裸露部位生成一层Au膜；
S17，当然由于采用蒸镀的方式进行，那么在残留的抗蚀层表面上也会生成Au膜；那么再用氧气等离子体处理，除去残余的树脂层整体除去，那么便能在ITO圆形玻璃基材表面形成均匀、有序、规则排列的纳米金颗粒；即为本发明纳米金电极。
进一步采用本发明上述双重检测生物传感芯片进行检测，需要先固定探针后再添加待测DNA样品进行检测，步骤示例如下：
S31，电极活化：将所制得的纳米金电极分别用HNO3(1：1)溶液、丙酮和纯水超声清洗2分钟后，氮气吹干；
S32，室温下，将ITO-纳米金电极在40mmol/L的巯基乙酸溶液中浸泡6小时，用超纯水冲洗电极2分钟，氮气吹干，使ITO-纳米金电极上形成羟基单分子层；
S33，步骤S32所得电极浸泡在40mmol/L MES(包含1mg/ml EDAC和1mg/ml单链DNA探针)pH＝6.5的DNA固定缓冲液中，25℃处理24小时；
其中在这一步骤中单链DNA探针采用根据人HIV病毒基因组设计捕获探针和信号探针：
捕获探针TCATTGATGGTCTCTTTTAACA-SH(5'-3')；
信号探针[Fc]C[Fc]G[Fc]C[Fc]GCTTA[Fc]C[Fc]G[Fc]C[Fc]G(EO)3TTTGCATGGCTGCTTGATGTC(5'-3')；
S34，将步骤S33获得的电极用40mmol/L MES pH＝6.5清洗3遍，去除游离未固定的单链DNA探针分子，氮气吹干，低温保存备用；
本发明上述纳米金电极固定好DNA探针之后，初步仅能实现纳米金颗粒的局域表面等离子共振的光学检测，为了使其还能在电化学检测中实现其功能，那么将纳米金电极作为工作电极安装于三电极模板上，辅助电极选择铂，参比电极为Ag/AgCl电极，共同组成三电极体系，组装成本发明双重检测生物传感芯片。
采用上述组装成双重检测生物传感芯片进行检测的步骤参考下述步骤进行：
S100，取1μl待测DNA样品(这一实施例1中含有本发明所筛选的把金银序列HIVtarget-sequence)；
在这一步骤中DNA待测溶液作为样品，可以采用现有的试剂盒从待测的细菌、组织细胞等提取。
S200，采用本发明中的双重检测生物传感芯片进行检测时，分两组进行；
实验组：取上述步骤S100中的待测DNA样品，滴加至双重检测生物传感芯片的工作电极上，室温静置1小时；使用washing buffer冲洗电极后，并用氮气流干燥；
对照组：在双重检测生物传感芯片的工作电极上滴加不含上述目标HIV target-sequence的溶液(在这里可以是缓冲液、或者是其他DNA溶液)；
S300，参见图8所示，进行LSPR和CV双重传感芯片双重检测；分别使用紫外分光光度计对实验组和对照组的工作电极在400nm～800nm光波长内测量其吸收光谱；观察此时光谱与空白对照(不含有HIV target-sequence)的LSPR的光谱吸收峰的变化；
并且使用差分脉冲伏安法测定实验组和对照组的电流峰。
采用上述实施例1的检测方式，在LSPR的光谱吸收峰的结果对比中，实验组的吸收峰相机对照组的吸收峰发生了向右移动，则表明DNA与LSPR传感器表面固定的探针发生互补配对结合，即表明所检测样品中含有该检测探针所对应的靶序列。
而在对照组测量中LSPR的光谱吸收峰若吸收峰未出现移动，则表明DNA与LSPR传感器表面固定的探针没有特异性结合，即表明所检测样品中没有含有该DNA探针所对应的靶序列；当然在测量过程过中也偶尔出现实验组的吸收峰相比对照组向左移动，则是因为被固定的DNA探针在检测或者洗脱的过程中脱落，因此导致峰谱向左移动，那么需要重新按照上述S31～S34进行探针固定，然后进行检测。当然，在本发明检测过程中，为了避免单次检测中的偶发情形对检测的结果产生偏差，因此上述检测过程中可以测试的实验组可以做2～3个重复，那么良好的重复性结果更加有助于检测结果的准确分析。
同时在电化学检测结果中，实验组在0.2～0.4V之间可以检测到一个明显的氧化还原峰，而对照组相比无该氧化还原峰。因为在实验组中捕获探针、目标DNA、信号探针三者相互结合使得信号探针上的二茂铁分子能贴近电极表面，此时使用电化学工作站用差分脉冲伏安法对工作电极进行检测时，由于二茂铁分子的电化学性质，该电极在0.2～0.4V之间可以检测到一个明显的氧化还原峰。而若存在的目标DNA不能与捕获探针和信号探针，则二茂铁分子无法被固定在电极产生电化学反应，工作站也无法检测到氧化还原峰。
整体上采用本发明同时结合LSPR与电化学的检测结果，可以减少样品检测中的假阳性，对检测中质量控制起到了非常重要的作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种双重检测生物传感芯片，包括衬底，以及设置于所述衬底上三电极体系，所述三电极体系包括生物传感电极、辅助电极和参比电极，其特征在于，所述生物传感电极为纳米金电极，所述纳米金电极包括设置于所述衬底上的透明导电基底，该透明导电基底表面上设有若干规则排布的纳米金颗粒；所述纳米金电极按照如下方法制备获得：
获取透明导电基底；
在所述透明导电基底表面形成抗蚀层；
获取压印板，该压印板的压印面具有纳米级尺寸的凸模型；
将所述压印板与设有抗蚀层的透明导电基底压合，使抗蚀层表面形成与凸模型适配的凹槽；
在所述抗蚀层的非凹槽表面形成保护层；
将具有所述保护层和抗蚀层的透明导电基底进行等离子刻蚀处理，使位于凹槽部分的抗蚀层被刻蚀去除以及位于凹槽部的透明导电基底表面裸露；
在所述位于凹槽部的透明导电基底的裸露表面上生成Au膜；
除去所述透明导电基底残留的抗蚀层。
2.如权利要求1所述的双重检测生物传感芯片，其特征在于，所述纳米金电极上固定有DNA探针。
3.如权利要求2所述的双重检测生物传感芯片，其特征在于，所述DNA探针包括与待测靶DNA链互补的DNA捕获探针、以及与靶DNA链的互补链互补并标记有二茂铁的信号探针。
4.如权利要求1至3任一项所述的双重检测生物传感芯片，其特征在于，所述纳米金颗粒的尺寸为20～80nm。
5.一种权利要求1至4任一项所述的双重检测生物传感芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
制备纳米金电极；
以所述纳米金电极作为工作电极，与辅助电极和参比电极组装成三电极体系；
所述制备纳米金电极包括如下步骤：
获取透明导电基底；
在所述透明导电基底表面形成抗蚀层；
获取压印板，该压印板的压印面具有纳米级尺寸的凸模型；
将所述压印板与设有抗蚀层的透明导电基底压合，使抗蚀层表面形成与凸模型适配的凹槽；
在所述抗蚀层的非凹槽表面形成保护层；
将具有所述保护层和抗蚀层的透明导电基底进行等离子刻蚀处理，使位于凹槽部分的抗蚀层被刻蚀去除以及位于凹槽部的透明导电基底表面裸露；
在所述位于凹槽部的透明导电基底的裸露表面上生成Au膜；
除去所述透明导电基底残留的抗蚀层。
6.如权利要求5所述的双重检测生物传感芯片的制备方法，其特征在于，在所述位于凹槽部的透明导电基底的裸露表面上生成Au膜步骤中，采用电子束蒸镀方式生成所述Au膜。
7.如权利要求5至6任一项所述的双重检测生物传感芯片的制备方法，其特征在于，
在以所述纳米金电极作为工作电极，与辅助电极和参比电极组装成三电极体系步骤之后，还包括在所述纳米金电极上固定DNA探针步骤；
或
在制备所述纳米金电极步骤之后，组装成三电极体系的步骤之前还包括在所述纳米金电极上固定DNA探针步骤。
8.如权利要求7所述的双重检测生物传感芯片的制备方法，其特征在于，在所述纳米金电极上固定DNA探针包括：
将所述纳米金电极进行活化处理；
将活化处理后的所述纳米金电极用巯基乙酸溶液浸泡处理；
将巯基乙酸处理后的所述纳米金电极置于含有偶联剂和DNA探针的MES溶液浸泡处理，使DNA探针与所述纳米金电极结合。
9.如权利要求8所述的双重检测生物传感芯片的制备方法，其特征在于，所述偶联剂为EDAC或EDAC与NHS两种组合。
10.一种基于权利要求1至4任一项所述的双重检测生物传感芯片的DNA检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
获取待测DNA；
将待测DNA添加至双重检测生物传感芯片的工作电极上；
检测加样后的双重检测生物芯片在400nm～800nm光波长内的吸收光谱，以及用差分脉冲伏安法测定双重检测生物芯片的电流峰谱。
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Legal Events
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Inventor after: Li Kezheng Inventor after: Wu Yuliang Inventor before: Li Kezheng Inventor before: Wu Yuliang Inventor before: Yu Hongyu |
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Effective date of registration: 20160505 Address after: Zhenjiang City, Jiangsu Province, 212000 Jingkou District Road No. 118 building 211 room two Applicant after: Zhenjiang WeThink Biological Technology Co., Ltd. Address before: 518000, room 5, 601 west shore village, Shenzhen, Guangdong, Baoan District Applicant before: Li Kezheng |
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Effective date of registration: 20161011 Address after: 518000, room 2, 1507, COFCO business park, two road, Baoan District, Xin'an, Shenzhen, Guangdong Applicant after: Shenzhen Dingxin Fusion Technology Co. Ltd. Address before: Zhenjiang City, Jiangsu Province, 212000 Jingkou District Road No. 118 building 211 room two Applicant before: Zhenjiang WeThink Biological Technology Co., Ltd. |
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Address after: 518000, Guangdong, Longhua New District, Longhua street, Heping East Road, Hong Kong Science and Technology Park, dragon science and technology incubator center, 2 floor, G District, room 208 and 210, Patentee after: Shenzhen Dingxin Fusion Technology Co. Ltd. Address before: 518000, room 2, 1507, COFCO business park, two road, Baoan District, Xin'an, Shenzhen, Guangdong Patentee before: Shenzhen Dingxin Fusion Technology Co. Ltd. |
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| CP02 | Change in the address of a patent holder | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20201228 Address after: 224000 industrial concentration zone, Longgang Town, Yandu District, Yancheng City, Jiangsu Province (f) Patentee after: Phoenix Science and Technology Development Co.,Ltd. Address before: 518000 rooms 208 and 210, Zone G, 2nd floor, science and Technology Incubation Center, gangzhilong science and Technology Park, Heping East Road, Longhua street, Longhua New District, Shenzhen City, Guangdong Province Patentee before: SHENZHEN DINGXIN RONGHE TECHNOLOGY Co.,Ltd. |
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