CN109425598A - 一种毛细自驱动微流控芯片及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种毛细自驱动微流控芯片及其制备方法与应用。本发明提供的微流控检测芯片包括样品垫、结合物垫、可产生毛细驱动力的基底、检测区、质控区和吸水材料，各部分按照所述顺序搭接组合而成。在所述基底上设置有具有向上突起的纤维状纳米结构阵列，可产生毛细驱动力并固化捕获探针。本发明设计加工具有毛细驱动力的纳米纤维阵列的透明材料作为载体，在检测中将检测探针呈现为完全可视的表面以利于检测结果的定量分析，而且具有毛细驱动力的纳米纤维阵列还具有比表面积大的优点，更利于捕获配体的大量固化并提高后续检测分析的灵敏度和选择性。

Description

一种毛细自驱动微流控芯片及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种毛细自驱动微流控芯片及其制备方法与应用。
背景技术
免疫层析试纸条是上世纪80年代发展起来的一种简便易用的快速检测技术，该技术将胶体金、胶体硒、着色乳胶微球等标记抗体或抗原后作为检测探针储存于玻纤膜内。当液态检测样本在毛细作用驱动下依次通过样品垫、储存有检测探针的玻纤膜、固化有待检分子对应配体的硝酸纤维素膜、吸水垫时在硝酸纤维素膜上捕获并呈色相应的靶分子。经过多年的发展，该技术制备简单、成本极低、操作简便，在生物医学检测领域得到了广泛的应用。但是，免疫层析试纸条是基于硝酸纤维素膜的检测方案，只能在不透明的硝酸纤维素膜表面呈色，膜内所捕获的检测探针无法呈色，使得免疫层析试纸条损失了大部分检测信号，因而检测灵敏度较低，且无法对待检分子进行更为精确的定量分析。
为解决上述问题，瑞典的阿米克股份公司开发了基于毛细微柱阵列的微流控芯片技术并申请了相关的专利(国内专利号：ZL03813252.4)。该技术将硝酸纤维素膜改为具有直径为数十个微米的毛细微柱阵列的透明热塑聚合物作为载体，经过表面修饰改性后固化捕获探针来替代传统的硝酸纤维素膜，从而得到既可实现液态样本毛细驱动的载体，又可在检测中将检测探针呈现为完全可视的表面以利于检测结果的定量。然而，在现有的微加工技术条件下，热塑性聚合物材料微柱阵列的直径尚不可能达到更小，因此可供免疫反应用的比表面积与硝酸纤维素膜还存在有较大差距。而且热塑性材料本身天然疏水，需要较多表面改性工艺步骤来调节微流控通道的亲水性和表面功能化以完成毛细驱动和捕获探针(待检分子对应配体)的包被。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种微流控检测芯片。
本发明提供的微流控检测芯片由样品垫、结合物垫、可产生毛细驱动力的基底和吸水材料按照所述顺序依次搭接固定在载体上而成；
所述基底是以透光性材料为衬底制备而成；
所述基底上设置有检测区和质控区；所述检测区在所述结合物垫一侧，所述质控区在所述吸水材料一侧；所述检测区和所述质控区上均设置具有向上突起的纤维状纳米结构阵列。
上述芯片中，
所述纤维状纳米结构的直径为50-300nm；
所述纤维状纳米结构之间的距离为5-500nm；
所述透光性材料可为玻璃衬底、石英衬底、载玻片或盖玻片；
所述检测区和所述质控区表面覆有具有向上突起的纤维状纳米结构阵列的聚合物层；
所述样品垫可为玻纤膜；
所述结合物垫可为固化有荧光标记探针的玻纤膜；所述荧光标记探针为能与待检物质相互作用的配体；
所述检测区上连接有所述能与待检物质相互作用的配体，所述质控区上连接有不能与待检物质相互作用、但能与所述待检物质相互作用的配体结合的物质；
所述基底的检测区上能与待检物质相互作用的配体可以与待检物质结合，待检物质又与所述荧光标记探针上的能与待检物质相互作用的配体结合，通过双抗体夹心法将荧光标记探针固定在检测区上，通过检测荧光标记探针上的荧光强度检测待检物质的含量；
所述基底的质控区上的不能与待检物质相互作用、但能与待检物质相互作用的配体结合的物质可以与荧光标记探针上的能与待检物质相互作用的配体结合，不需要通过待检物质就可以将荧光标记探针固定在质控区，通过检测荧光标记探针上的荧光强度对微流控芯片进行质控；
所述吸水材料可为滤纸、玻纤膜或高分子吸水材料；
所述能与待检物质相互作用的配体可为抗体或抗原。
上述芯片中，所述待检物质可为蓖麻毒素；
所述抗体可为抗蓖麻毒素多克隆抗体；
所述不能与待检物质相互作用、但能与待检物质相互作用的配体结合的物质可为羊抗兔多克隆抗体；
所述抗蓖麻毒素多克隆抗体和所述羊抗兔多克隆抗体均通过酰胺键固定在所述表面覆有具有向上突起的纤维状纳米结构阵列的聚合物层上；
所述聚合物材料可为光刻胶或聚酰亚胺；
所述聚合物层的厚度可为2-10μm；
所述载体可为塑料壳体。
本发明的另一个目的是提供一种制备上述微流控芯片的方法。
本发明提供的制备上述微流控芯片的方法包括所述可产生毛细驱动力的基底的制备方法；
所述可产生毛细驱动力的基底的制备方法如下：
1)以透光性材料为衬底旋涂聚合物，形成有聚合物层的衬底；将所述有聚合物层的衬底进行烘烤，得到烘烤后的聚合物层；
2)对所述烘烤后的聚合物层进行光刻，去除在检测区和质控区外分布的聚合物层，得到图形化的检测区和质控区；
3)采用等离子体对图形化的检测区和质控区进行轰击，形成具有纤维状纳米结构阵列的基底；
4)将所述具有纤维状纳米结构阵列的基底依次经过氨基化和戊二醛表面功能化处理，得到表面修饰后的基底；
5)将所述能与待检物质相互作用的配体和不能与待检物质相互作用、但能与所述待检物质相互作用的配体结合的物质分别点样于所述表面修饰后的基底的检测区与质控区，得到固化有配体的基底。
上述方法中，
所述步骤1)中，采用甩胶机旋涂聚合物，所述旋涂的条件为：转速为3000rpm，时间为30s；所述烘烤的条件为：温度为120度，时间为20分钟；所述聚合物层的厚度为5μm；
所述步骤2)中，所述光刻的方法具体如下：采用EVG光刻机进行曝光；所述曝光条件为：紫外光波长为365nm，曝光剂量为6mJ/s，时间为80s；所述曝光后置于CD26显影液中进行显影，所述显影的时间为38s；所述显影后还包括用等离子体去胶机进行扫底膜处理和烘烤的步骤；所述扫底膜处理的条件为：时间为7min，氧气压强为0.48Pa，入射功率为5W，反射功率为0W，温度为70℃；所述烘烤的条件为：温度为140℃，时间为40min；
所述步骤3)中，等离子体可以为任何能够对所述聚合物层进行轰击的等离子体；具体可为氩等离子体、氧等离子体、氮等离子体等，或几种等离子体的两两组合或先后组合；所述轰击的条件为：等离子体气源的流量为50-400sccm，腔体压力为0.2-5Pa，射频功率为150-350W，处理时间为2-120min；
经等离子体轰击之后，在聚合物层所在的位置形成纤维状纳米结构阵列。该纤维状纳米结构之间的距离大小为几十纳米至几个微米，部分纳米纤维呈弯曲或倾斜，底部或顶部可以两两相互靠近，形成簇状或丛状结构，从而在纤维状纳米结构之间形成大量纳米孔隙，加之纳米纤维的材料具有亲水性，进而纤维状纳米结构阵列具有毛细驱动力。
所述步骤3)和步骤4)之间还包括将所述具有纤维状纳米结构阵列的基底进行清洗和吹干的步骤；所述清洗的方法如下：将所述具有纤维状纳米结构阵列的基底放入H2O2:H2SO4(比例为1:2)的溶液中清洗1小时，然后置于去离子水中超声5分钟；
所述步骤4)中，所述氨基化和戊二醛表面功能化处理的方法如下：将具有纤维状纳米结构阵列的基底在3-氨基丙基-三甲氧基硅氧烷溶液中浸泡20分钟，得到氨基化基底；将所述氨基化基底在戊二醛溶液中浸泡2小时，得到表面修饰后的基底；
所述3-氨基丙基-三甲氧基硅氧烷溶液为将3-氨基丙基-三甲氧基硅氧烷(APTES)与丙酮溶液混匀得到的溶液，所述APTES在3-氨基丙基-三甲氧基硅氧烷溶液中的体积分数为2％；所述戊二醛溶液是将戊二醛与PBS溶液(pH7.4)混匀得到的溶液，所述戊二醛在所述戊二醛溶液中的体积分数为5％；所述浸泡后还包括清洗和吹干的步骤。
所述步骤5)中，所述抗蓖麻毒素多克隆抗体和所述羊抗兔多克隆抗体均以1mg/mL的浓度稀释于含有体积分数为20％的甘油的PBS溶液(pH7.4)中通过非接触式点样仪分别点样于具有纤维状纳米结构阵列的基底的检测区与质控区，每个区域内点样量可为1-10nL。
所述步骤5)后还包括用含有牛血清白蛋白的PBS溶液封闭所述固化有配体的基底的步骤。所述封闭的条件为37℃温育1小时；所述牛血清白蛋白的质量分数为1％。所述封闭前后还包括清洗和吹干的步骤。
上述方法中，采用常规的微电子光刻工艺对所述烘烤后的聚合物层进行曝光、显影，去除在检测区和质控区外分布的聚合物层，形成聚合物层在检测区和质控区的图形化。当所述聚合物的材料为光刻胶或光敏聚合物材料时，可以直接采用光刻、显影的方法形成图形化的聚合物层。当所述聚合物的材料为非光敏材料时，可先对聚合物层覆盖掩模层(如光刻胶)，而后在掩模层的掩盖下，对聚合物层进行刻蚀，并去除掩模层，从而形成图形化的聚合物层。
上述方法中，所述固化有荧光标记探针的玻纤膜的具体制备方法如下：对能与待检物质相互作用的配体进行荧光标记，得到荧光标记探针，将所述荧光标记探针与缓冲液混匀，得到荧光标记探针溶液；将玻纤膜浸入所述荧光标记探针溶液中，干燥过夜，得到固化有荧光标记探针的玻纤膜；
所述荧光标记探针的具体制备方法如下：用50mM pH9.0的碳酸盐缓冲液配制浓度为10mg/mL的蓖麻毒素抗体溶液；用50mM pH9.0的碳酸盐缓冲液配制浓度为0.1mg/mL的FITC溶液，得到FITC溶液；将所述蓖麻毒素抗体溶液与所述FITC溶液按照体积比为1:10的比例混匀，4℃缓慢搅拌反应24h，6000rpm离心20min，反复多次，收集每次离出液，测定荧光值F485/535，直至离出液无荧光值，得到荧光标记探针；
所述荧光标记所使用的试剂可为异硫氰酸荧光素；
所述缓冲液是将BSA、PEG20000、Na3N、蔗糖、海藻糖、Tween-20和PBS溶液混匀得到的溶液；所述BSA在所述缓冲液中的质量分数为1％，所述PEG20000在所述缓冲液中的质量分数为0.2％，所述Na3N在所述缓冲液中的质量分数为0.02％，所述蔗糖在所述缓冲液中的质量分数为10％，所述海藻糖在所述缓冲液中的质量分数为2.5％，所述Tween-20在所述缓冲液中的质量分数为0.1％；
上述方法中，所述样品垫的长度可为3-10mm，宽度可为3-10mm；结合物垫的长度可为1-3mm，宽度可为3-10mm；所述结合物垫与所述吸水材料在所述基底上形成的微通道长度可为5-30mm，宽度可为1-3mm；所述微通道内的检测区和质控区可为方形，长度根据点样量的不同，可为1-3mm，宽度可为1-3mm；吸水材料长度可为3-30mm，宽度可为3-10mm。
本发明还有一个目的是提供一种检测待检样品中是否含有目的物质的方法。
本发明提供的检测待检样品中是否含有目的物质的方法包括如下步骤：将不含有目的物质的样品加入上述芯片的样品垫上，待不含有目的物质的样品完全被所述芯片上的所述吸水材料吸收完毕后，将所述芯片置于荧光检测仪上检测荧光强度，取平均值加两倍标准差的值记作Cut-off值；按照同样的方法，对待检样品进行检测，得到待检样品的荧光强度；如果待检样品的荧光强度高于或等于Cut-off值，则待检样品判定为含有目的物质的样品，如果待检样品的荧光强度低于Cut-off值，则待检样品判定为不含有目的物质的样品。
本发明最后一个目的是提供一种定量检测待测样品中目的物质的方法。
本发明提供的定量检测待测样品中目的物质的方法包括如下步骤：将不同浓度的目的物质的标准品加入上述芯片的样品垫上，待目的物质完全被所述芯片上的所述吸水材料吸收完毕后，将所述芯片置于荧光检测仪上检测荧光强度，以目的物质浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标制作标准曲线，得到标准曲线公式；按照同样的方法，对待检样品进行检测，得到待检样品的荧光强度；将所述待检样品的荧光强度带入所述标准曲线公式，得到待检样品中目的物质的含量。
上述定量检测方法中，所述荧光强度是指检测区RGB扩展值与质控区RGB扩展值的比值。
上述芯片在制备定性或定量检测样品中的目的物质的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述方法和应用中，所述目的物质为蓖麻毒素。
本发明提供的微流控检测芯片包括样品垫、结合物垫、可产生毛细驱动力的基底(纳米森林基片)、检测区、质控区和吸水材料，各部分按照所述顺序搭接组合而成。在所述基底结构上设置有具有向上突起的纤维状纳米结构阵列，可产生毛细驱动力并固化捕获探针。样品液体经过样品垫后，大的颗粒物质被过滤，剩余的液体样品在结合物垫内复溶并游离垫内固化的荧光标记探针，同时，荧光标记探针与液体样品中的靶分子结合。纳米森林基片与吸水材料组合后可引导样品液体自动定向流入吸水材料方向并存储废液。检测区与质控区经氨基化、戊二醛等表面功能化处理后分别固化有特异捕获待检靶分子的配体和针对荧光探针的配体，在检测分析中用于指示结果、质控检测过程以及结果的定量。
与阿米克股份公司发明的微柱阵列热塑材料载体不同的是，本发明设计加工具有毛细驱动力的纳米纤维阵列的透明材料作为载体，经过表面修饰改性后固化捕获探针来替代传统的硝酸纤维素膜，同样得到可实现液态样本毛细驱动的载体，也可在检测中将检测探针呈现为完全可视的表面以利于检测结果的定量分析。更为重要的是，具有毛细驱动力的纳米纤维阵列还具有比表面积远大于阿米克股份公司所发明的微柱阵列载体的优点，更利于捕获配体的大量固化并提高后续检测分析的灵敏度和选择性。
附图说明
图1为毛细自驱动微流控检测芯片的示意图。
图2为蓖麻毒素标准品标准曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的蓖麻(Ricinus communis)种子购自北京秀禾种子有限公司，产品目录号为蓖麻1号。
下述实施例中的平衡液为0.01M，pH7.2的PBS缓冲液。
下述实施例中的琼脂糖亲和层析柱购自Amersham公司，产品目录号为17-5080-01。
下述实施例中的新西兰纯种大耳白兔购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。
下述实施例中的羊抗兔多克隆抗体购自美国Aldrich-Sigma公司，产品目录号为SAB3700883。
下述实施例中抗蓖麻毒素多克隆抗体的制备方法如下：
(一)制备脱毒的蓖麻毒素
粗提：将蓖麻种子去壳后称取100g，浸泡于PBS(0.01M，pH7.2)中24h，至种子肿胀；去壳洗净，将洗净的种子置于500mL PBS(0.01M，pH7.2)缓冲液中，于匀浆机中匀浆，并于4℃条件下浸提过夜24h(放置24h)，得到浸提液；次日，将浸提液用脱脂纱布滤去残渣后，在4℃下以12000rpm离心20min，取上清液，0.45μm滤膜过滤，上清液调pH7.2；向上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液(pH7.4)至饱和度为90％，4℃磁力搅拌1h，静止过夜24h，得到混合液；次日将混合液在4℃条件下以12000rpm离心20min，取沉淀为白色；将沉淀用PB(10mM，pH7.4)50mL溶解后，于4℃条件下对PB透析48h(每8h换一次液)，透析后经1200g、4℃离心20min，取上清，即为蓖麻毒素粗提液。
亲和层析纯化：亲和层析介质为氨苯基-β-D-半乳糖苷琼脂糖亲和介质(购自sigma公司，产品目录号为A-0414)。取5mL亲和介质真空脱气后，缓慢装入层析柱，注意避免产生气泡和断层，以至少10倍柱床体积的PBS进行清洗平衡。将蓖麻毒素粗提液经0.45μm的滤膜过滤后，用平衡液10倍体积稀释，以1mL/min流速加入层析柱内，使蓖麻毒素和凝集素充分吸附在柱上。待蓖麻毒素和凝集素吸附充分后，以平衡液洗脱杂蛋白，流速控制在1mL/min左右，杂蛋白洗脱完全后，改用含有0.1M半乳糖的PBS缓冲液进一步洗脱目的蛋白，收集洗脱峰，12％变性、非变性SDS电泳分析。
凝胶过滤层析：凝胶过滤柱为SephacrylTMS-100G75凝胶预装柱(购自Amersham公司)。将亲和层析浓缩后的样品经0.22μm的滤膜过滤后上样，上样体积为5mL，浓度2mg/mL；以PBS为洗脱液进行洗脱，流速为0.5mL/min，紫外测定后合并第二吸收峰各组分，12％变性、非变性SDS电泳分析为蓖麻毒素蛋白(氨基酸序列如序列1所示)；将得到的蓖麻毒素蛋白透析、浓缩后-20℃保存。
脱毒：用PBS(0.1M，pH7.4)稀释凝胶过滤后的蓖麻毒素蛋白。至(0.2-0.3)mg/ml，放置PBS缓冲液(0.1M，pH8.1)中，35℃透析7天，然后再放入PBS(0.01M，pH7.4)中透析48h，12000rpm离心10min，取上清液，即为脱毒的蓖麻毒素溶液，分装，-20℃保存。
(二)动物免疫
以脱毒的蓖麻毒素蛋白作为免疫原，取200μg与等体积的弗氏完全佐剂充分混匀，免疫新西兰纯种大耳白兔。两周后用0.5mg脱毒的蓖麻毒素蛋白和等体积弗氏不完全佐剂加强免疫1次；隔三周后再用1mg脱毒的蓖麻毒素蛋白和等体积弗氏不完全佐剂加强免疫1次；此后每周耳缘静脉采血，间接ELISA测定效价。加强免疫后的第7天血清的效价最高，为106，取此血清进行多抗纯化。
(三)抗体纯化
用琼脂糖亲和层析柱进行多抗纯化。具体步骤如下：
将亲和柱以平衡缓冲液(1L平衡缓冲液为含有300mmol NaCl的1000ml 20mM PB缓冲液，pH7.8)平衡，待柱平衡后，将步骤(二)得到的血清经0.45μm滤膜滤过后以1mL/min流速上柱，用平衡缓冲液以1mL/min流速洗脱杂蛋白，监测，待杂蛋白洗脱彻底后换洗脱液(0.1M柠檬酸缓冲液，pH4.0)将抗体洗下。收集洗下的抗体，收集试管事先加适量的1mol/L，pH9.0的Tris-HCl，使pH恢复至7.4左右，以免失去活性。纯化好的抗体以PBS(5mM，pH7.4)工作液4℃透析24h，每8h换一次液，再10000r/min离心30min，收集上清液，即得到纯化后的蓖麻毒素抗体溶液，-70℃保存备用。间接ELISA测定纯化后的蓖麻毒素抗体效价为106，12％SDS变性电泳分析纯度达95％以上。
实施例1、毛细自驱动微流控芯片的制备
一、固化有荧光标记探针的玻纤膜的制备
1、用50mM pH9.0的碳酸盐缓冲液将纯化的蓖麻毒素抗体透析过夜，调整其浓度为10mg/mL，得到蓖麻毒素抗体溶液。
2、用50mM pH9.0的碳酸盐缓冲液配制浓度为0.1mg/mL的FITC(异硫氰酸荧光素)溶液，得到FITC溶液。
3、将蓖麻毒素抗体溶液与FITC溶液按照体积比为1:10的比例混匀，4℃缓慢搅拌反应24h，反应后液体置于超滤离心管中，6000rpm离心20min，反复多次，收集每次离出液，测定荧光值F485/535，直至离出液无荧光值，得到荧光标记探针。
4、将荧光标记探针与含有质量分数为1％的BSA，质量分数为0.2％的PEG20000，质量分数为0.02％的Na3N，质量分数为10％的蔗糖，质量分数为2.5％的海藻糖，体积分数为0.1％的Tween-20的PBS溶液(pH 7.4)混匀，得到荧光标记探针溶液，荧光标记探针在荧光标记探针溶液中的浓度为1mg/mL。
5、将玻纤膜(美国PALL，61635)浸入荧光标记探针溶液中，36℃干燥过夜后，得到固化有荧光标记探针的玻纤膜，干燥条件下常温保存备用。
二、可产生毛细驱动力的基底的制备
本发明的微流控芯片的基底为可产生毛细驱动力的基底，该基底上设置有大面积具有向上突起的纤维状纳米结构阵列，可产生毛细驱动力，经过氨基化、戊二醛等表面功能化处理后分别固化有特异捕获待检靶分子的配体和针对荧光探针的配体。具体制备方法如下：
1、以玻璃为衬底，在衬底上采用甩胶机旋涂聚合物，形成有聚合物层的衬底。所用聚合物材料为聚酰亚胺，旋涂时的转速为3000rpm，旋涂时间为30s。在旋涂后进行烘烤工艺，将形成有聚合物层的衬底放置于热板上进行烘烤，烘烤温度为120度，烘烤时间为20分钟，得到厚度为5μm的聚合物层。
2、采用常规的微电子光刻工艺对已经烘烤后的聚合物层进行光刻，去除在检测区和质控区外分布的聚合物层，形成聚合物层在检测区和质控区的图形化。具体步骤如下：采用EVG光刻机对聚合物层进行曝光，曝光时采用的紫外光波长为365nm，曝光剂量为6mJ/s，时间为80s，曝光后将圆片置于CD26显影液中进行显影，时间为38s，之后将图形化的圆片放于型号为branson的等离子体去胶机中进行7min扫底膜处理，其中，氧气压强为0.48Pa，入射功率为5W，反射功率为0W，温度为70℃，之后，再将圆片放置在140℃的烘箱中后烘40min。
3、采用等离子体直接对聚合物层进行轰击，以形成纤维状纳米结构阵列，得到具有纤维状纳米结构阵列的基底。具体步骤如下：采用半导体工艺中的等离子体清洗设备进行等离子体轰击，在等离子体轰击中，等离子体为氧等离子体，等离子体气源的流量为50-400sccm，腔体压力为0.2-5Pa，射频功率为150-350W，处理时间为2-120min。经等离子体轰击之后，在聚合物层所在的位置形成纤维状纳米结构阵列。该纤维状纳米结构之间的距离大小为几十纳米至几个微米，部分纳米纤维呈弯曲或倾斜，底部或顶部可以两两相互靠近，形成簇状或丛状结构。
4、将步骤3制备的具有纤维状纳米结构阵列的基底放入H2O2:H2SO4(比例为1:2)的溶液中清洗1小时，然后置于去离子水中超声5分钟彻底清洗芯片。然后将清洗好的芯片浸入3-氨基丙基-三甲氧基硅氧烷(APTES)溶液(为含有体积分数为2％的APTES的丙酮溶液)中浸泡20分钟，再分别用丙酮、乙醇和去离子水清洗后氮气吹干，得到氨基化的芯片。最后将氨基化的芯片浸入戊二醛溶液中(为含有体积分数为5％的戊二醛的PBS溶液，pH值为7.4)中浸泡2小时，再分别用PBS溶液(pH7.4)、去离子水清洗后氮气吹干，得到表面修饰后的芯片。
5、将抗蓖麻毒素多克隆抗体和羊抗兔多克隆抗体以1mg/mL的浓度稀释于含有体积分数为20％的甘油的PBS溶液(pH7.4)中通过非接触式点样仪分别点样于表面修饰后的芯片的检测区与质控区，每个区域内点样量为5nL，并置于潮湿培养皿中4℃温育过夜，得到固化有配体的芯片。
6、取出固化有配体的芯片用含有体积分数为1％的Tween-20的PBS溶液彻底清洗后氮气吹干，再置于含有质量分数为1％的牛血清白蛋白的PBS溶液中37℃温育1小时封闭芯片，最后将芯片用含有体积分数为1％的Tween-20的PBS溶液彻底清洗后氮气吹干，得到偶联有抗蓖麻毒素多克隆抗体和羊抗兔多克隆抗体的纳米纤维阵列基底，即可产生毛细驱动力的基底，备用。
三、芯片组装
如图1所示，将样品垫(玻纤膜)、结合物垫(步骤一制备的固化有荧光标记探针的玻纤膜)、可产生毛细驱动力的基底(步骤二制备的偶联有抗蓖麻毒素多克隆抗体和羊抗兔多克隆抗体的纳米纤维阵列基底)和吸水材料(玻纤膜)按照玻纤膜、固化有荧光标记探针的玻纤膜、可产生毛细驱动力的基底和吸水材料的顺序依次搭接粘贴于塑料壳体上形成微流控检测芯片。其中，基底上的抗蓖麻毒素多克隆抗体偶联在固化有荧光标记探针的玻纤膜方向，基底的上羊抗兔多克隆抗体偶联在吸水材料方向。
结合物垫和吸水材料之间形成的微通道长度为8mm，宽度为1mm；微通道内检测区和质控区均为方形，长度均为3mm，宽度均为1mm。样品垫(玻纤膜)的大小为3×2mm。结合物垫剪切成如附图所示类梯形形状，上底为2mm，下底为3mm，上底中间突出部分与微通道同宽为1mm左右，正好插入到微通道中。吸水材料的大小为3×5mm。
四、微流控芯片在定量和定性检测蓖麻毒素中的应用
在定性检测时，取阴性参考样品10份100μl加入到微流控芯片的样品垫，待阴性参考样品完全被吸水材料吸收后置于荧光检测仪检测相应区域，获得FITC荧光图像的RGB扩展值，取均值加两倍标准差作为判定结果的截止值(Cut-off值)。在检测未知样品中凡高于此值的判定为阳性，低于此值的判定为阴性。
在定量检测时，取稀释不同浓度的蓖麻毒素标准品加入到微流控芯片的样品垫，待标准品完全被吸水材料吸收后置于荧光检测仪检测相应区域，获得FITC荧光图像的RGB扩展值，并以检测区RGB扩展值与质控区RGB扩展值的比值为纵坐标，蓖麻毒素标准品的浓度为横坐标建立标准曲线。蓖麻毒素的检测结果见表1。建立的标准曲线如图2所示。将未知浓度含蓖麻毒素样品的信号强度代入标准曲线即可对未知样品中蓖麻毒素的含量进行定量分析。
表1为微流控芯片检测蓖麻毒素结果
序列表
<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院微生物流行病学研究所
<120>一种毛细自驱动微流控芯片及其制备方法与应用
<160>1
<210>1
<211>576
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
Met Lys Pro Gly Gly Asn Thr Ile Val Ile Trp Met Tyr Ala Val Ala
1 5 10 15
Thr Trp Leu Cys Phe Gly Ser Thr Ser Gly Trp Ser Phe Thr Leu Glu
20 25 30
Asp Asn Asn Ile Phe Pro Lys Gln Tyr Pro Ile Ile Asn Phe Thr Thr
35 40 45
Ala Gly Ala Thr Val Gln Ser Tyr Thr Asn Phe Ile Arg Ala Val Arg
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Thr Gly Ala Asp Val Arg His Glu Ile Pro Val Leu
65 70 75 80
Pro Asn Arg Val Gly Leu Pro Ile Asn Gln Arg Phe Ile Leu Val Glu
85 90 95
Leu Ser Asn His Ala Glu Leu Ser Val Thr Leu Ala Leu Asp Val Thr
100 105 110
Asn Ala Tyr Val Val Gly Tyr Arg Ala Gly Asn Ser Ala Tyr Phe Phe
115 120 125
His Pro Asp Asn Gln Glu Asp Ala Glu Ala Ile Thr His Leu Phe Thr
130 135 140
Asp Val Gln Asn Arg Tyr Thr Phe Ala Phe Gly Gly Asn Tyr Asp Arg
145 150 155 160
Leu Glu Gln Leu Ala Gly Asn Leu Arg Glu Asn Ile Glu Leu Gly Asn
165 170 175
Gly Pro Leu Glu Glu Ala Ile Ser Ala Leu Tyr Tyr Tyr Ser Thr Gly
180 185 190
Gly Thr Gln Leu Pro Thr Leu Ala Arg Ser Phe Ile Ile Cys Ile Gln
195 200 205
Met Ile Ser Glu Ala Ala Arg Phe Gln Tyr Ile Glu Gly Glu Met Arg
210 215 220
Thr Arg Ile Arg Tyr Asn Arg Arg Ser Ala Pro Asp Pro Ser Val Ile
225 230 235 240
Thr Leu Glu Asn Ser Trp Gly Arg Leu Ser Thr Ala Ile Gln Glu Ser
245 250 255
Asn Gln Gly Ala Phe Ala Ser Pro Ile Gln Leu Gln Arg Arg Asn Gly
260 265 270
Ser Lys Phe Ser Val Tyr Asp Val Ser Ile Leu Ile Pro Ile Ile Ala
275 280 285
Leu Met Val Tyr Arg Cys Ala Pro Pro Pro Ser Ser Gln Phe Ser Leu
290 295 300
Leu Ile Arg Pro Val Val Pro Asn Phe Asn Ala Asp Val Cys Met Asp
305 310 315 320
Pro Glu Pro Ile Val Arg Ile Val Gly Arg Asn Gly Leu Cys Val Asp
325 330 335
Val Arg Asp Gly Arg Phe His Asn Gly Asn Ala Ile Gln Leu Trp Pro
340 345 350
Cys Lys Ser Asn Thr Asp Ala Asn Gln Leu Trp Thr Leu Lys Arg Asp
355 360 365
Asn Thr Ile Arg Ser Asn Gly Lys Cys Leu Thr Thr Tyr Gly Tyr Ser
370 375 380
Pro Gly Val Tyr Val Met Ile Tyr Asp Cys Asn Thr Ala Ala Thr Asp
385 390 395 400
Ala Thr Arg Trp Gln Ile Trp Asp Asn Gly Thr Ile Ile Asn Pro Arg
405 410 415
Ser Ser Leu Val Leu Ala Ala Thr Ser Gly Asn Ser Gly Thr Thr Leu
420 425 430
Thr Val Gln Thr Asn Ile Tyr Ala Val Ser Gln Gly Trp Leu Pro Thr
435 440 445
Asn Asn Thr Gln Pro Phe Val Thr Thr Ile Val Gly Leu Tyr Gly Leu
450 455 460
Cys Leu Gln Ala Asn Ser Gly Gln Val Trp Ile Glu Asp Cys Ser Ser
465 470 475 480
Glu Lys Ala Glu Gln Gln Trp Ala Leu Tyr Ala Asp Gly Ser Ile Arg
485 490 495
Pro Gln Gln Asn Arg Asp Asn Cys Leu Thr Ser Asp Ser Asn Ile Arg
500 505 510
Glu Thr Val Val Lys Ile Leu Ser Cys Gly Pro Ala Ser Ser Gly Gln
515 520 525
Arg Trp Met Phe Lys Asn Asp Gly Thr Ile Leu Asn Leu Tyr Ser Gly
530 535 540
Leu Val Leu Asp Val Arg Ala Ser Asp Pro Ser Leu Lys Gln Ile Ile
545 550 555 560
Leu Tyr Pro Leu His Gly Asp Pro Asn Gln Ile Trp Leu Pro Leu Phe
565 570 575

Claims (10)

1.一种微流控检测芯片，该微流控检测芯片由样品垫、结合物垫、可产生毛细驱动力的基底和吸水材料按照所述顺序依次搭接固定在载体上而成；
所述基底是以透光性材料为衬底制备而成；
所述基底上设置有检测区和质控区；所述检测区在所述结合物垫一侧，所述质控区在所述吸水材料一侧；所述检测区和所述质控区上均设置具有向上突起的纤维状纳米结构阵列。
2.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于：
所述纤维状纳米结构的直径为50-300nm；
所述纤维状纳米结构之间的距离为5-500nm；
所述透光性材料可为玻璃衬底、石英衬底、载玻片或盖玻片；
所述检测区和所述质控区表面覆有具有向上突起的纤维状纳米结构阵列的聚合物层；
所述样品垫为玻纤膜；
所述结合物垫为固化有荧光标记探针的玻纤膜；所述荧光标记探针为能与待检物质相互作用的配体；
所述检测区上连接有所述能与待检物质相互作用的配体，所述质控区上连接有不能与待检物质相互作用、但能与所述待检物质相互作用的配体结合的物质；
所述吸水材料为滤纸、玻纤膜或高分子吸水材料；
所述能与待检物质相互作用的配体为抗体或抗原。
3.根据权利要求1或2所述的芯片，其特征在于：
所述待检物质为蓖麻毒素；
所述抗体为抗蓖麻毒素多克隆抗体；
所述聚合物材料为光刻胶或聚酰亚胺；
所述聚合物层的厚度为2-10μm。
4.一种制备权利要求1-3中任一所述的芯片的方法，包括所述可产生毛细驱动力的基底的制备方法；
所述可产生毛细驱动力的基底的制备方法如下：
1)以透光性材料为衬底旋涂聚合物，形成有聚合物层的衬底；将所述有聚合物层的衬底进行烘烤，得到烘烤后的聚合物层；
2)对所述烘烤后的聚合物层进行光刻，去除在检测区和质控区外分布的聚合物层，得到图形化的检测区和质控区；
3)采用等离子体对所述图形化的检测区和质控区进行轰击，形成具有纤维状纳米结构阵列的基底；
4)将所述具有纤维状纳米结构阵列的基底依次经过氨基化和戊二醛表面功能化处理，得到表面修饰后的基底；
5)将能与待检物质相互作用的配体和不能与待检物质相互作用、但能与所述待检物质相互作用的配体结合的物质分别点样于所述表面修饰后的基底的检测区与质控区，得到固化有配体的基底。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
所述步骤1)中，采用甩胶机旋涂聚合物，所述旋涂的条件为：转速为3000rpm，时间为30s；所述烘烤的条件为：温度为120度，时间为20分钟；
所述步骤2)中，所述光刻的方法如下：采用EVG光刻机进行曝光；所述曝光条件为：紫外光波长为365nm，曝光剂量为6mJ/s，时间为80s；所述曝光后置于CD26显影液中进行显影，所述显影的时间为38s；所述显影后还包括用等离子体去胶机进行扫底膜处理和烘烤的步骤；所述扫底膜处理的条件为：时间为7min，氧气压强为0.48Pa，入射功率为5W，反射功率为0W，温度为70℃；所述烘烤的条件为：温度为140℃，时间为40min；
所述步骤3)中，所述等离子体可以为任何能够对所述聚合物层进行轰击的等离子体；所述轰击的条件为：等离子体气源的流量为50-400sccm，腔体压力为0.2-5Pa，射频功率为150-350W，处理时间为2-120min；
所述步骤4)中，所述氨基化和戊二醛表面功能化处理的方法如下：将具有纤维状纳米结构阵列的基底在3-氨基丙基-三甲氧基硅氧烷溶液中浸泡20分钟，得到氨基化基底；将所述氨基化基底在戊二醛溶液中浸泡2小时，得到表面修饰后的基底；
所述步骤5)后还包括用含有牛血清白蛋白的PBS溶液封闭所述固化有配体的基底的步骤。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：
所述方法还包括所述固化有荧光标记探针的玻纤膜的制备方法；
所述固化有荧光标记探针的玻纤膜的制备方法如下：对能与待检物质相互作用的配体进行荧光标记，得到荧光标记探针，将所述荧光标记探针与缓冲液混匀，得到荧光标记探针溶液；将玻纤膜浸入所述荧光标记探针溶液中，干燥过夜，得到固化有荧光标记探针的玻纤膜。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述荧光标记所使用的试剂为异硫氰酸荧光素；
所述缓冲液是将BSA、PEG20000、Na3N、蔗糖、海藻糖、Tween-20和PBS溶液混匀得到的溶液；所述BSA在所述缓冲液中的质量分数为1％，所述PEG20000在所述缓冲液中的质量分数为0.2％，所述Na3N在所述缓冲液中的质量分数为0.02％，所述蔗糖在所述缓冲液中的质量分数为10％，所述海藻糖在所述缓冲液中的质量分数为2.5％，所述Tween-20在所述缓冲液中的质量分数为0.1％。
8.一种检测待检样品中是否含有目的物质的方法，包括如下步骤：将不含有目的物质的样品加入权利要求1-3中任一所述的芯片的样品垫上，待不含有目的物质的样品完全被所述芯片上的所述吸水材料吸收完毕后，将所述芯片置于荧光检测仪上检测荧光强度，取平均值加两倍标准差的值记作Cut-off值；按照同样的方法，对待检样品进行检测，得到待检样品的荧光强度；如果待检样品的荧光强度高于或等于Cut-off值，则待检样品判定为含有目的物质的样品，如果待检样品的荧光强度低于Cut-off值，则待检样品判定为不含有目的物质的样品。
9.一种定量检测待测样品中目的物质的方法，包括如下步骤：将不同浓度的目的物质的标准品加入权利要求1-3中任一所述的芯片的样品垫上，待目的物质完全被所述芯片上的所述吸水材料吸收完毕后，将所述芯片置于荧光检测仪上检测荧光强度，以目的物质浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标制作标准曲线，得到标准曲线公式；按照同样的方法，对待检样品进行检测，得到待检样品的荧光强度；将所述待检样品的荧光强度带入所述标准曲线公式，得到待检样品中目的物质的含量。
10.权利要求1-3中任一所述的芯片在制备定性或定量检测样品中的目的物质的产品中的应用。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110292959A (zh) * 2019-06-21 2019-10-01 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种微流控芯片及其制备方法与应用
CN111141814A (zh) * 2020-01-04 2020-05-12 山东大学齐鲁医院(青岛) 一种基于蛋白质图谱的肾部内分泌检测装置
CN113009143A (zh) * 2020-06-17 2021-06-22 山东大学 一种用于抗体检测的双层微流控芯片及其制备方法
CN114231401A (zh) * 2022-02-21 2022-03-25 北京芯迈微生物技术有限公司 一种核酸检测试剂盒及检测方法
CN118022867A (zh) * 2024-02-26 2024-05-14 深圳大学 具有局部亲水区的数字微流控芯片制备及点样方法

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101750481A (zh) * 2008-12-12 2010-06-23 清华大学 集成光栅微悬臂梁生化传感器及其芯片制作方法
CN101957368A (zh) * 2009-07-02 2011-01-26 阿米克股份公司 毛细管驱动的检验装置及其制备
CN102706843A (zh) * 2012-05-31 2012-10-03 东南大学 一种具有光谱增强功能的透明生物基片的制备方法
CN103389266A (zh) * 2013-08-07 2013-11-13 苏州扬清芯片科技有限公司 一种内置光学透镜的生物芯片
US20140170680A1 (en) * 2012-12-17 2014-06-19 Leukodx Ltd. Systems, compositions and methods for detecting a biological condition
CN104280365A (zh) * 2014-07-10 2015-01-14 深圳威芯华创科技有限公司 双重检测生物传感芯片及其制备方法和dna检测方法
CN104849254A (zh) * 2014-02-18 2015-08-19 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种基于表面增强拉曼散射的微流控检测芯片
CN105051214A (zh) * 2013-03-15 2015-11-11 吉纳普赛斯股份有限公司 用于生物分析的系统和方法
CN105203749A (zh) * 2015-09-22 2015-12-30 深圳市第二人民医院 一种可评估溶栓前脑出血风险的血清标记物及其应用
CN105556289A (zh) * 2013-10-02 2016-05-04 古河电气工业株式会社 靶标物质的检测方法
CN106092982A (zh) * 2016-06-02 2016-11-09 济南大学 癌细胞及细胞表面多糖检测荧光/比色双模式纸芯片的制备
CN106967416A (zh) * 2017-04-07 2017-07-21 合肥学院 用于ddt检测的二氧化钛纳米粒子荧光探针的制备方法

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101750481A (zh) * 2008-12-12 2010-06-23 清华大学 集成光栅微悬臂梁生化传感器及其芯片制作方法
CN101957368A (zh) * 2009-07-02 2011-01-26 阿米克股份公司 毛细管驱动的检验装置及其制备
CN102706843A (zh) * 2012-05-31 2012-10-03 东南大学 一种具有光谱增强功能的透明生物基片的制备方法
US20140170680A1 (en) * 2012-12-17 2014-06-19 Leukodx Ltd. Systems, compositions and methods for detecting a biological condition
CN105051214A (zh) * 2013-03-15 2015-11-11 吉纳普赛斯股份有限公司 用于生物分析的系统和方法
CN103389266A (zh) * 2013-08-07 2013-11-13 苏州扬清芯片科技有限公司 一种内置光学透镜的生物芯片
CN105556289A (zh) * 2013-10-02 2016-05-04 古河电气工业株式会社 靶标物质的检测方法
CN104849254A (zh) * 2014-02-18 2015-08-19 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种基于表面增强拉曼散射的微流控检测芯片
CN104280365A (zh) * 2014-07-10 2015-01-14 深圳威芯华创科技有限公司 双重检测生物传感芯片及其制备方法和dna检测方法
CN105203749A (zh) * 2015-09-22 2015-12-30 深圳市第二人民医院 一种可评估溶栓前脑出血风险的血清标记物及其应用
CN106092982A (zh) * 2016-06-02 2016-11-09 济南大学 癌细胞及细胞表面多糖检测荧光/比色双模式纸芯片的制备
CN106967416A (zh) * 2017-04-07 2017-07-21 合肥学院 用于ddt检测的二氧化钛纳米粒子荧光探针的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAIYANG MAO等: "《Microfluidic Surface-Enhanced Raman Scattering Sensors Based on Nanopillar Forests Realized by an Oxygen-Plasma-Stripping-of-Photoresist Technique》", 《SMALL》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110292959A (zh) * 2019-06-21 2019-10-01 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种微流控芯片及其制备方法与应用
CN110292959B (zh) * 2019-06-21 2022-05-13 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种微流控芯片及其制备方法与应用
CN111141814A (zh) * 2020-01-04 2020-05-12 山东大学齐鲁医院(青岛) 一种基于蛋白质图谱的肾部内分泌检测装置
CN113009143A (zh) * 2020-06-17 2021-06-22 山东大学 一种用于抗体检测的双层微流控芯片及其制备方法
CN114231401A (zh) * 2022-02-21 2022-03-25 北京芯迈微生物技术有限公司 一种核酸检测试剂盒及检测方法
CN114231401B (zh) * 2022-02-21 2022-05-03 北京芯迈微生物技术有限公司 一种核酸检测试剂盒及检测方法
CN118022867A (zh) * 2024-02-26 2024-05-14 深圳大学 具有局部亲水区的数字微流控芯片制备及点样方法

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