CN114231401B - 一种核酸检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种核酸检测试剂盒及检测方法，试剂盒以微流控芯片作为载体，包括进样区、微通道和废液区，微通道内设置有多条T线和C线，不同的T线上包被有含有不同目的片段的核酸单链，C线上包被有内参单链，将待测样本中的核酸扩增后变性成核酸单链，核酸单链与核酸染料混合后在冰浴条件下与包被在T线上的对应的核酸单链结合形成被核酸染料染色的核酸双链，从而产生荧光，实现对多重目的片段的检测，该方法操作简单、便捷高效。

Description

一种核酸检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于生物技术及医学检测技术领域，尤其涉及一种核酸检测试剂盒及检测方法。

背景技术

核酸检测在多种领域得到广泛应用，包括刑事侦查、病原微生物检测、疾病诊断等。一般情况下，环境样本或者生理样本中靶标核酸含量非常少，为使结果更为准确，常常将微量的目的片段进行扩增，然后将扩增产物进行恒压电泳，电泳结束后取出凝胶置于紫外成像仪中观察，并拍照记录试验结果，根据标准参照物比对目的片段的大小，从而得出阴性或阳性的实验结果。这种分析方法主要集中在传统实验室中，对操作人员的专业性要求较高，而且操作繁琐耗时，不太适用于快速的现场检测。

为此基于微流控芯片的核酸检测方法应运而生，现阶段，基于微流控芯片的核酸检测方法主要依靠聚合酶链式反应（PCR）或环介导等温扩增技术（LAMP），但这些技术往往只能针对一种目的片段进行检测，对于多基因片段的混合样本中出现多种目的片段时，无法特异性区分，需要进行多次检测，在多重基因检测领域存在较大的局限性。

发明内容

本发明为了克服核酸检测过程复杂、检测效率低的问题，提供一种核酸检测试剂盒及检测方法，可以在较短时间内精准、量化地检测多重核酸目的片段、快速高效、简便安全。

为实现上述目的，本发明提出了一种核酸检测试剂盒，以微流控芯片作为载体，所述微流控芯片包括微通道和分别与微通道两端连通的加样区和废液区，废液区与外界大气连通，废液区内设置有能够沿微通道长度方向移动的吸水性材料，吸水性材料向微通道方向移动后可以与微通道的出口端接触，所述微通道包括设置有多条检测线（T线）的检测区和设置有质控线（C线）的质控区，T线包括沿液体流动方向依次设置的T1、T2……Tn（n≥2），不同的T线上分别包被有与不同目的片段配对的核酸单链，C线上包被有内参单链，加样区与T线之间固定有核酸染料和能够与C线上内参单链配对结合的内参单链（以下简称配对内参）。

需要说明的是，所述核酸染料及配对内参可以固定在同一位置，也可以固定在不同位置，在一个实施方案中，核酸染料及配对内参均设置在加样区的加样孔内。

当液体样本从加样孔进入微通道后，核酸染料及配对内参溶解随同核酸变性产物流至T线处。

当然，核酸染料与配对内参也可以不设置在上述微流控芯片上，在进行核酸检测时，现将待测样本与核酸染料和配对内参混合后再加入微流控芯片内，不影响检测结果；本实施方案中，将核酸染料与配对内参集成在微流控芯片上，可以减少检测步骤，提高检测效率。

为避免与待测样本中的目的片段发生交叉，所述内参单链采用非人源的核酸产物，保证了结果的特异性。

所述核酸染料指仅能够与核酸双链发生非特异性结合而不与核酸单链发生结合的染料，在其中一个实施方案中，所述核酸染料选用SYBR Green I，SYBR Green I在液体中呈游离状态时几乎无荧光显示，但与核酸双链结构发生非特异性结合时发出的荧光强度可增强1000倍，且设计简单（不需要信号探针的预先结合）、成本低。

所述吸水性材料可选用吸水棉等常规的吸水材料，其嵌入废液区设置的条形通孔内，所述条形通孔的一端贴近微通道的出口端。

本发明还包括一种利用上述试剂盒检测核酸的检测方法，包括以下步骤：

（a）核酸扩增：采用PAP法、RAP或PCR等可实现扩增目的片段的方法扩增得到含有目的片段的核酸双链产物；

（b）核酸变性：使核酸双链产物中的核酸双链变性成核酸单链，从而得到核酸变性产物；

（c）目的核酸检测：核酸变性产物从加样区的加样孔进入微流控芯片后流经微流控芯片上的核酸染料及配对内参，使核酸染料与配对内参溶解一同流经微通道内设置的T线和C线，核酸变性产物与T线、C线充分反应后，将远离微通道的吸水性材料移动至与微通道出口端接触，多余的未被T线和C线结合的液体被吸收，反应终止。

（d）结果分析：利用荧光仪对T线、C线信号值进行定性或定量检测。

待检测样本中可能存在非目的片段的核酸，为进一步减少非目的片段核酸的干扰，上述检测方法中还包括以下步骤：核酸检测反应终止后，向加样孔内加入缓冲液以冲刷掉微通道内残留的被核酸染料染色的非目的片段核酸，待吸水性材料完全吸收缓冲液后，再进行结果分析，提高了检测结果的准确性。

核酸双链变性成核酸单链的具体操作方式有多种，其中一个实施方案中，采用将核酸双链产物直接加热至80-100℃的方式，使核酸双链变性成核酸单链；则步骤（c）中，需要对核酸变性产物进行降温才能与T线发生反应，降温的方式也有多种，例如风冷、水冷、自然冷却等方式，其中的一个实施方案中，直接将微流控芯片置于冰浴环境中。

核酸双链变性成核酸单链还有其他方式，例如在核酸双链中加入DNA解旋酶，得到核酸单链，然后高温加热使DNA解旋酶失活得到核酸变性产物，避免核酸变性产物与T线反应时DNA解旋酶影响核酸双链的生成；同样的，需要对高温加热后的核酸变性产物进行降温。

不同的T线上分别包被有与不同目的片段配对的核酸单链，若核酸变性产物中存在对应的核酸单链，核酸变性产物降低至55℃-70℃（退火温度）时，核酸变性产物中的核酸单链就会与T线上包被的核酸单链进行配对结合变成核酸双链结构，而核酸染料会立即与T线形成的核酸双链结构进行结合，产生荧光，反之，则无荧光产生。荧光信号值越高，表明目的片段的浓度越高，从而实现对多重核酸扩增产物的量化检测。

同时，配对内参会与C线上的内参单链结合形成内参双链结构，进而被核酸染料染色，产生荧光，验证了反应过程的有效性。

通过上述技术方案得到的一种核酸检测试剂盒及检测方法，其有益效果是：

1、整个过程只采用一种非特异性核酸染料即可实现对多种目的片段的检测，通过设置多条分别包被有与不同目的片段配对的核酸单链的T线，然后将待检测的目的片段由核酸双链变性为核酸单链后与T线上的核酸单链反应重新生成可被核酸染料染色的核酸双链，可一次性同时特异性检测多种目的片段，检测效率高，且操作简单；

2、检测过程不需要信号探针的预先结合，降低了检测的设置和运行成本，同时降低了对检测人员专业化的需求，简便安全；

3、在质控线上设置内参，可验证整个反应过程的有效性，内参采用的是非人源的核酸产物，与待检测样本无交叉，保证了结果的特异性和准确性；

4、所述载体采用微流控芯片，无需借助外力驱动即可实现液体流动，通过设置能够沿微通道长度方向移动的吸水性材料，反应时间可控，使核酸染料能够充分与核酸双链结合，提高了显色程度，且能吸收多余的液体，减少非目的片段核酸双链的影响，操作简单，安全卫生；

5、利用缓冲液的冲刷进一步减少了非目的片段核酸双链染色的影响，提高了检测结构的准确性；

6、将核酸染料和配对内参均集成在微流控芯片上，加入核酸变性产物后，核酸染料和配对内参溶解随核酸变性产物流动至检测区，进一步简化了整个检测步骤。

附图说明

图1是模板核酸拷贝数与信号值的线性关系图（横坐标为模板核酸拷贝数，纵坐标为荧光信号值）。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

本发明的目的是提供一种能够进行多重目的片段检测的核酸检测试剂盒，设置多条包被有不同目的片段核酸单链的T线，在将待测样本中的核酸扩增后变性成核酸单链，核酸单链与微流控芯片上设置的核酸染料混合后降温使核酸单链与包被在T线上的对应的核酸单链结合形成被核酸染料染色的核酸双链，从而产生荧光，实现对多重核酸目的片段的快速检测，该方法操作简单、便捷高效。

为使本发明的目的、技术方案及效果更加明确、清楚，以下结合实施例及附图对本发明进一步详细说明。

实施例1：以检测待测样本中的HIV核心片段（207位至331位残基），HCV核心区基因片段（C70-140）,TP核心片段(Fla B1)及HBsAg核心片段（C蛋白）为例。

1、材料和仪器

1.1微流控芯片

芯片卡的构成：包括由盖片和基片围合成的加样区、微通道和废液区，微通道包括检测区和质控区，加样孔上端固定有核酸染料SYBR Green I和配对内参拟南芥核酸单链，检测区沿液体流动方向依次设置T1（包被有HIV核心片段核酸单链），T2（包被有HCV核心区基因片段的核酸单链）, T3（包被有TP核心片段的核酸单链）和T4（包被有HBsAg核心片段的核酸单链），C线包被拟南芥核酸单链。

1.2 荧光免疫分析仪（F10pro）

1.3 含有HIV核心片段，HCV核心区基因片段,TP核心片段及HBsAg核心片段的待测样本20份（不同的待测样本中含有的目的片段的浓度不同）；

不含有HIV核心片段，HCV核心区基因片段,TP核心片段及HBsAg核心片段的待测样本20份；

拷贝数依次为1000copies/μL、500copies/μL、100copies/μL和50copies/μL的模板核酸样本；

0.01M PBS缓冲液。

2、检测方法

将微流控芯片置于冰浴的条件下，通过PAP方法得到待检测样本的扩增双链产物，加热至95°高温使之变性，将变性后的核酸产物滴加到微流控芯片加样孔内，沿着微流控通道流动，流动过程中将核酸染料和配对内参溶解，此时核酸温度降低至55℃-70℃，核酸变性产物依次流经检测区和质控区，发生荧光反应后利用缓冲液冲洗掉多余的样本然后利用荧光免疫分析仪进行分析检测。

PAP（焦磷酸化激活性聚合反应）是一种使用3'末端阻断性引物，利用DNA聚合酶催化焦磷酸化反应串联耦合聚合反应的一种核酸扩增方法。

3.准确性试验

将得到的20份含有HIV核心片段，HCV核心区基因片段,TP核心片段及HBsAg核心片段的待检测样本按照上述检测方法进行检测，得到的结果如表1所示：

表1 含有目的片段的不同样本对应的信号值

上述结果显示，测定20份含有目的片段的样本进行检测，均显示阳性，符合实验预期，试剂盒准确性较好，且C线也均为阳性，说明实验过程准确可靠。

4、特异性试验

将20份不含HIV核心片段，HCV核心区基因片段,TP 核心片段及HBsAg核心片段的待检测样本按照上述实验方法进行检测，得到的结果如表2所示：

表2 不含有目的片段的样本对应的信号值

上述结果显示，测定20份不含有目的片段的样本进行检测，均显示阴性，表明试剂盒特异性较好，且C线均为阳性，说明实验过程准确可靠。

5、灵敏度试验

将不同浓度的含HIV核心片段，HCV核心区基因片段,TP 核心片段及HBsAg核心片段的模板核酸样本滴加到微流控芯片上进行检测，得到结果如表3所示：

表3 不同拷贝数模板核酸样本对应的信号值

结果显示：在模板核酸样本拷贝数大于100 copies/μL时，性能稳定，而在核酸样本拷贝数为50 copies/μL时，性能开始不稳定（个别样本可能出现假阴性），故该方法的灵敏度为模板核酸样本拷贝数大于100 copies/μL时（见图1），且图1中显示测定核酸扩增产物时线性梯度较好，可对核酸产物进行量化检测。

上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种核酸检测试剂盒，以微流控芯片作为载体，其特征在于，所述微流控芯片包括微通道和分别与微通道两端连通的加样区和废液区，废液区与外界大气连通，废液区内设置有能够沿微通道长度方向移动的吸水性材料，吸水性材料向微通道方向移动后能够与微通道的出口端接触，所述微通道包括设置有不少于两条T线的检测区和设置有C线的质控区，每条T线上分别包被有与不同目的片段配对的核酸单链， C线上包被有内参单链，加样区与T线之间固定有核酸染料和配对内参。

2.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述内参单链采用非人源的核酸产物。

3.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述核酸染料为SYBR GreenI。

4.一种非诊断目的的核酸检测方法，其特征在于，应用权利要求1-3中任一试剂盒，包括以下步骤：

（a）核酸扩增：核酸扩增得到含有多种目的片段的核酸双链产物；

（b）核酸变性：使核酸双链产物中的核酸双链变性成核酸单链，从而得到核酸变性产物；

（c）目的核酸检测：核酸变性产物从加样区的加样孔进入微流控芯片后流经微流控芯片上的核酸染料及配对内参，核酸变性产物与T线、C线充分反应后，将远离微通道的吸水性材料移动至与微通道出口端接触，多余的未被T线和C线结合的液体被吸收，反应终止；

（d）结果分析：利用荧光仪对T线和C线信号值进行定性或定量检测。

5.根据权利要求4所述的非诊断目的的核酸检测方法，步骤（b）中，将核酸双链产物加热至80-100℃高温，使核酸双链变性成核酸单链。

6.根据权利要求4所述的非诊断目的的核酸检测方法，步骤（b）中，向核酸双链产物中加入DNA解旋酶，然后高温加热使DNA解旋酶失活。

7.根据权利要求5或6所述的非诊断目的的核酸检测方法，步骤（c）中对核酸变性产物进行降温。

8.根据权利要求7所述的非诊断目的的核酸检测方法，步骤（c）中将微流控芯片置于冰浴环境下使核酸变性产物降温。

9.根据权利要求4所述的非诊断目的的核酸检测方法，还包括以下步骤：核酸检测反应终止后，向加样孔内加入缓冲液，待吸水性材料完全吸收缓冲液后，再进行结果分析。

10.根据权利要求4所述的非诊断目的的核酸检测方法，步骤（a）中采用PAP或PCR法中的一种进行核酸扩增。

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