CN112899152A - 核酸快速扩增和检测的微流控芯片、检测方法及系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核酸快速扩增和检测的微流控芯片、检测方法及系统。所述系统包括：一种核酸快速扩增和检测的微流控芯片，推力施加机构，以及反复抽吸机构，用以将反应液在变性区域和退火延伸区域间进行往复运动。所述方法包括：采用推力施加机构将待检测样本及反应液置于加样孔内，采用反复抽吸机构将待检测样本及反应液在变性区域和退火延伸区域之间进行往复运动，进行变性和退火延伸；以及，将扩增反应液输入杂交反应腔室，之后进行荧光检测。本发明的快速核酸扩增和杂交检测方法不仅可以大大加快反应速度，而且减少了微流控芯片设计的复杂度和液体操控自动化的复杂度，避免了多重检测中探针设计的难度和复杂度。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速核酸扩增和检测的方法及系统，尤其涉及一种特异性编码引物、核酸捕获探针微阵列，以及一种核酸检测利用微流控偏激，以及基于该微流控芯片实现的核酸快速扩增及微阵列芯片杂交和荧光检测的方法和装置，属于核酸扩增检测技术领域。
背景技术
核酸是由许多核苷酸单体聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一，包括脱氧核糖核酸DNA和核糖核酸RNA两大类，广泛存在于所有动植物、微生物及生物体内。核酸与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序不同。核酸是基本的遗传物质，所有生物包括动植物，细菌病毒等都要靠核酸来遗传，每一个种属都有它自己特定的核酸顺序。通过检测核酸的顺序，就可以来确定到底是哪一种类型的生物，比如有一种感染，就通过进行核酸的测序能够肯定是什么样的小生物造成的，并且能够使用药物来控制消除它。在肿瘤的治疗中，也可以根据肿瘤的核酸性质遗传物质来确定用什么药，用什么药物的敏感从而选择更加好的药物。
常用的核酸分析方法包括测序、扩增检测和杂交检测等，这些分析方法一般都包括核酸的扩增和检测等步骤。
核酸扩增检测是通过酶的作用将待检核酸序列进行扩增，然后检出的方法，包括以聚合酶链式反应(PCR)为代表的热循环扩增方法，以及RPA和LAMP为代表的恒温扩增方法。PCR是利用DNA在体95℃高温时变性会变成单链，低温(经常是60℃左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72℃左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。荧光定量PCR是在反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时监测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化。杂交检测是将PCR产物与固定在玻璃基片或者膜上的捕获探针特异性杂交，然后通过荧光检测或者显色反应检测目标产物的方法。
核酸的扩增检测通常需要在专业的分子实验室进行，对实验室环境和专业操作人员都有严苛的要求。因此PCR实验室想要渗透到多有生物相关行业内部难度相当大。比如近期爆发的新型冠状病毒肺炎和近期爆发非洲猪瘟，对在现场进行核酸分析提出了新的需求。近年来研发的现场快速检验(POCT)核酸检测系统，采用“样本进、结果出”的核酸分析检测模式大大简化操作流程，使得现场部署和非分子检验专业人员操作成为可能。采用微流控芯片将PCR扩增及杂交检测等核酸分析的过程在微流控芯片自动完成，已成为一种经济实惠且快速的分子诊断技术。
因此，如何将快速核酸扩增检测与基于特异性捕获探针杂交及荧光检测技术的核酸快速检测设备相结合，寻求一种快速、低成本和自动化操作的核酸扩增检测的方法及其系统，已然成为业界研究人员长期以来一直努力的方向。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上现状，提供一种快速核酸扩增检测与基于特异性捕获探针杂交及荧光检测技术的核酸快速检测装置及方法，以克服现有技术中的不足。
本发明的另一主要目的在于提供一种核酸快速扩增和检测的微流控芯片。
本发明的另一主要目的在于提供一种基于该微流控芯片的往复式快速核酸扩增检测装置。
本发明的另一主要目的在于提供一种核酸检测用特异性编码引物以及相应的核酸捕获探针微阵列。
具体的，本发明的另一主要目的在于还提供一种将待检测序列转换为一段编码序列而与核酸微阵列杂交检测的方法及系统。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种核酸检测用特异性编码引物组，其包括至少一组引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，并且所述正向引物、反向引物中的任一者为特异性编码的引物序列，而另一者为荧光基团标记的引物序列，所述特异性编码的引物序列包括编码区、间隔区、阻断区和特异性引物区。
在一些实施例中，所述特异性引物区为特异性引物序列，至少用于识别待检测位点；其中，所述待检测位点包括单碱基多态位点；3’端完全匹配的引物能够被DNA聚合酶延伸，而3’端有错配的引物不能被DNA聚合酶延伸，且能够将识别位点编码为编码序列。
进一步地，所述特异性编码的引物序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
进一步地，所述荧光基团标记的引物序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明实施例还提供了一种核酸捕获探针微阵列，其包括呈阵列排布的多个第三探针和第四探针，所述第三探针和第四探针为编码序列的互补序列捕获探针，并且，所述第三探针的序列如SEQ ID NO.6所示，所述第四探针的序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步地，所述核酸捕获探针微阵列还包括作为阴性参照的第一探针和作为阳性参照的第二探针，所述第一探针的序列如SEQ ID NO.4所示，所述第二探针的序列如SEQ IDNO.5所示。
本发明实施例还提供了一种核酸快速扩增和检测的微流控芯片，其包括盖片层和基片层，所述盖片层和基片层之间闭合形成相连通的微流道和杂交反应腔室，所述杂交反应腔室内固定设置前述的核酸捕获探针微阵列，并且，所述微流控芯片包括呈第一温度的变性区域和呈第二温度的退火延伸区域，或者，所述微流控芯片包括呈第一温度的变性区域、呈第二温度的退火区域及呈第三温度的延伸区域，所述微流道贯穿连通于变性区域、退火延伸区域或变性区域与延伸区域中。
进一步地，所述变性区域与退火延伸区域或退火区域之间还设置有至少一个隔热区域。
进一步地，所述微流控芯片还包括依次层叠设置的导热层、铜层和加热膜层，所述微流道设置于导热层上方。
本发明实施例还提供了一种核酸快速扩增和检测的系统，其包括：
前述的核酸快速扩增和检测的微流控芯片；
推力施加机构，其至少用于将反应液输入加样孔并进入微流控芯片的微流道内；
以及，反复抽吸机构，其至少用以将反应液在变性区域和退火延伸区域，或者，在变性区域、变性区域与延伸区域之间进行往复运动实现温度循环，从而进行变性和退火延伸。
相应的，本发明实施例还提供了一种核酸快速扩增和检测的方法，所述方法主要基于前述核酸快速扩增和检测的系统而实施，并且所述方法包括：
采用推力施加机构将待检测样本及反应液置于加样孔内，所述反应液包含前述的核酸检测用特异性编码引物组；
采用反复抽吸机构将待检测样本及反应液在变性区域和退火延伸区域，或者，在变性区域、变性区域与延伸区域之间进行往复运动实现温度循环，从而进行变性和退火延伸；
以及，将所获扩增反应液输入杂交反应腔室，并与其中的核酸捕获探针微阵列进行杂交反应，之后进行荧光检测。
进一步地，所述方法包括：采用反复抽吸机构将待检测样本及反应液在变性区域和退火延伸区域，或者，在变性区域、变性区域与延伸区域之间进行往复运动20～45次。
本发明提出了一种快速核酸扩增检测与基于特异性捕获探针杂交及荧光检测技术的核酸快速检测装置，与现有技术相比，本发明的优点包括：
1)本发明提供了一种快速核酸扩增和杂交检测方法和装置，其核心是推动核酸扩增反应液在两个或者三个不同的固定的温度区域之间往复运动，然后将扩增反应液推到杂交区，与特异性捕获探针杂交后进行荧光检测。其特点是在注射泵等装置的驱动下，通过与反应液互不相溶的液体，如矿物油或者空气推动反应液在两个固定的温度区域之间往复运动，实现温度循环；本发明提出的往复式PCR通过固定微流控芯片不同区域的温度，将加热和致冷的部分缩减为反应液自身，不仅可以大大加快反应速度，而且可以大幅度降低能耗，使得设备的小型化和现场部署成为可能；
2)本发明通过设计分子杂交方法实现在杂交温度和杂交液严格度都较为宽松的条件下进行杂交检测，从而可以将PCR反应液直接推入杂交腔作为杂交反应液，减少了微流控芯片设计的复杂度和液体操控自动化的复杂度；同时不同的待检测目标序列也可以在60℃左右的同一温度条件下杂交，避免了多重检测中探针设计的难度和复杂度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1a和图1b分别是本发明一典型实施方案中微流控芯片、加热和温控装置的俯视图和侧面图；
图2是本发明一典型实施方案中往复式PCR和微阵列杂交流程示意图；
图3是本发明一典型实施方案中特异性编码引物、扩增和杂交检测方法示意图；
图4是本发明一典型实施方案中使用的微流控芯片的实物照片；
图5a是本发明一典型实施方案中核酸捕获探针微阵列的排布示意图；
图5b是本发明一典型实施方案中的检测结果荧光图片。
具体实施方式
鉴于现有技术的不足和缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，提供了一种快速核酸扩增和杂交检测方法和装置，其核心是推动核酸扩增反应液在两个或者三个不同的固定的温度区域之间往复运动，然后将扩增反应液推到杂交区，与特异性捕获探针杂交后进行荧光检测，其特点是在注射泵等装置的驱动下，通过与反应液互不相溶的液体，如矿物油，或者空气推动反应液在两个固定的温度区域之间往复运动，实现温度循环。与常规的用PCR管在PCR仪内进行的温度循环相比，只有PCR反应液自身需要经过加热和致冷的温度变化过程，而不是像常规PCR仪的加热模块、PCR管和PCR反应液都需要经过加热和致冷的温度变化过程。普通的Taq DNA聚合酶合成速度为16碱基/秒，而优化过的Taq DNA聚合酶合成速度可以达到为60-70碱基/秒甚至更快，因此对于200碱基的扩增子，需要的延伸时间仅为12秒甚至3秒，而通常PCR仪设置的延伸时间为30秒或者更长，而从95℃降温到60℃还通常还需要约20秒，主要的时间消耗在将反应体系加热到同样的温度，而本发明提出的往复式PCR通过固定微流控芯片不同区域的温度，将加热和致冷的部分缩减为反应液自身，不仅可以大大加快反应速度，而且可以大幅度降低能耗，使得设备的小型化和现场部署成为可能。
本发明的另外一个特点是通过设计分子杂交方法实现在杂交温度和杂交液严格度都较为宽松的条件下进行杂交检测，从而可以将PCR反应液直接推入杂交腔作为杂交反应液，减少了微流控芯片设计的复杂度和液体操控自动化的复杂度；同时不同的待检测目标序列也可以在同一温度条件下杂交，避免了多重检测重探针设计的难度和复杂度。例如，在对单碱基多态(single base polymorphism,SNP)的不同单个碱基进行杂交检测时，在经过优化的杂交液体系中可区分的温度范围往往也在1-5℃范围以内，如果直接进行杂交检测，不仅对杂交反应液和杂交温度控制要求严苛，而且使得多重反应设计困难。
如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
下文将对本发明的技术方案作更为详尽的解释说明。但是，应当理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
本发明实施例的一个方面提供了一种核酸检测用特异性编码引物组，其包括至少一组引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，并且所述正向引物、反向引物中的任一者为特异性编码的引物序列，而另一者为荧光基团标记的引物序列，所述特异性编码的引物序列包括编码区、间隔区、阻断区和特异性引物区。
在一些优选实施例中，所述编码区的序列设计为具有相近长度和相近的优化杂交温度、而序列差异较大的编码序列，可以在宽松的杂交条件(杂交液严格度、杂交温度等)下杂交并具有较好的差异。
在一些优选实施例中，所述间隔区包括设计含5～20碱基的无关序列，至少用于优化扩增和增加杂交效率。
进一步地，所述间隔区可以选择为5～20个T。
在一些优选实施例中，所述阻断区用间臂修饰，至少用于阻断DNA聚合酶合成，保证扩增产物的编码区和间隔区为单链，无需进行变性或者采用不对称PCR等方式也能保证杂交效率。
进一步地，所述阻断区可以包括如Spacer 3、Spacer 9、Spacer 18等中的至少任一者，但不限于此。
在一些优选实施例中，所述特异性引物区为特异性引物序列，至少可以用于识别待检测位点；其中，所述待检测位点可以为单碱基多态位点(SNPs)，利用DNA聚合酶的保真性，3’端完全匹配的引物可以被DNA聚合酶延伸，而3’端有错配的引物不能被DNA聚合酶延伸或者延伸效率较低；利用DNA聚合酶的保真性可以将识别位点编码为编码序列。
进一步地，所述特异性引物序列3’端的第二位、第三位、第四位或第五位具有至少一个错配位点，亦即，还可以在特异性引物序列3’端的第二位、第三位、第四位或第五位引入一个或者多个错配位点以进一步降低DNA聚合酶识别的错误率以增加检测的特异性。
进一步地，所述荧光基团标记的引物序列包括通用引物和5’端荧光标记基团；其中，所述荧光标记基团可以为但不限于FAM、Cy3、Cy5、TAMRA、HEX等中的至少任一者。
在一些优选实施例中，所述核酸检测用特异性编码引物组包括特异性编码的正向引物和荧光基团标记的反向引物；或者，荧光基团标记的正向引物和特异性编码的反向引物。
亦即，在一些优选实施例中，本发明所用一组引物包括特异性编码的正向引物和荧光基团标记的反向引物，正向引物序列包括了编码区、间隔区、阻断区和特异性引物区。
在另一些优选实施例中，本发明所用一组引物也可以为荧光基团标记的正向引物和特异性编码的反向引物。
在一些优选实施例中，本发明也可以使用多组引物进行多重PCR扩增。
在一些优选实施例中，所述特异性编码的引物序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
其中，具体的，Rs671的A基因型特异性引物序列(rs671-F-A)如SEQ ID NO.1所示，具体序列为GCTGTACCCGATCGCAAGGTGGTC-TTTTT-(Spacer9)-TA CGGGC TGCAG GCATACACTA。
其中，具体的，Rs671的G基因型特异性引物序列(rs671-F-G)如SEQ ID NO.2所示，具体序列为CAAGCGTGCTAACAAGCGTGATCA-TTTTT-(Spacer9)-TA CGGGC TGCAG GCATACACTG。
进一步地，所述荧光基团标记的引物序列(rs671-R)如SEQ ID NO.3所示，具体序列为FAM-CGGCAGG TCCTG AACCT CTGGC。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种核酸捕获探针微阵列，其包括呈阵列排布的多个第三探针和第四探针，所述第三探针和第四探针为编码序列的互补序列捕获探针，并且，所述第三探针的序列如SEQ ID NO.6所示，所述第四探针的序列如SEQ ID NO.7所示。
在一些实施例中，所述核酸捕获探针微阵列还包括作为阴性参照的第一探针和作为阳性参照的第二探针，所述第一探针的序列如SEQ ID NO.4所示，所述第二探针的序列如SEQ ID NO.5所示。
在一些实施例中，氨基修饰的捕获探针的序列如下所示，其中NC为阴性参照，PC为阳性参照，cX3,cX4为编码序列的互补序列捕获探针，微阵列捕获探针的排布如图5a所示。
其中，所述第一探针，亦即cX1(NC)的序列如SEQ ID NO.4所示，具体序列为5-TGCGAC CTCAGCATCGACCTCAGCTTTTTTTTTT-NH2。
其中，所述第二探针，亦即cX2(PC)的序列如SEQ ID NO.5所示，具体序列为5-CAGCAC CTGACCATCGATCGCAGCTTTTTTTTTT-NH2。
其中，所述第三探针，亦即cX3的序列如SEQ ID NO.6所示，具体序列为5-GACCACCTTGCGATCGGGTACAGCTTTTTTTTTT-NH2。
其中，所述第四探针，亦即cX4的序列如SEQ ID NO.7所示，具体序列为5-TGATCACGCTTGTTAGCACGCTTGTTTTTTTTTT-NH2。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种核酸快速扩增和检测的微流控芯片，其包括盖片层和基片层，所述盖片层和基片层之间闭合形成相连通的微流道和杂交反应腔室，所述杂交反应腔室内固定设置前述的核酸捕获探针微阵列，并且，所述微流控芯片包括呈第一温度的变性区域和呈第二温度的退火延伸区域，或者，所述微流控芯片包括呈第一温度的变性区域、呈第二温度的退火区域及呈第三温度的延伸区域，所述微流道贯穿连通于变性区域、退火延伸区域或变性区域与延伸区域中。
在一些优选实施例中，所述微流道包括蛇形沟道。
在一些优选实施例中，所述变性区域与退火延伸区域或退火区域之间还设置有至少一个隔热区域。
进一步地，所述隔热区域具有隔热沟道，其设置于微流道背面。
在一些优选实施例中，所述杂交反应腔室的温度呈第四温度，所述第四温度为50～70℃。
进一步地，所述第一温度为90～98℃。
进一步地，所述第二温度为55～70℃。
进一步地，所述第三温度为70～75℃。
在一些优选实施例中，所述微流控芯片还包括废液收集腔室，至少用以对扩增产物和废液进行收集。
进一步地，所述微流道的深度为0.05～1mm,宽度为0.1～2mm。
进一步地，所述隔热沟道的深度为0.5～4.5mm,宽度为1～5mm。
进一步地，所述基片层的厚度为1～5mm，材质包括聚碳酸酯、聚烯烃共聚物等材料。
进一步地，所述盖片层的厚度为0.05～0.5mm，材质包括聚碳酸酯、聚烯烃共聚物等材料。
在一些优选实施例中，所述微流控芯片还包括依次层叠设置的导热层、铜层和加热膜层，所述微流道设置于导热层上方。
进一步地，所述铜层内设置有温度传感器，至少用于测量温度，并反馈给温控电路实现精确温控。
更进一步地，所述温度传感器包括热电偶或者热敏电阻等，但不限于此。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种核酸快速扩增和检测的系统，其包括：
前述的核酸快速扩增和检测的微流控芯片；
推力施加机构，其至少用于将反应液输入加样孔并进入微流控芯片的微流道内；
以及，反复抽吸机构，其至少用以将反应液在变性区域和退火延伸区域，或者，在变性区域、变性区域与延伸区域之间进行往复运动实现温度循环，从而进行变性和退火延伸。
进一步地，所述推力施加机构可以包括注射泵，但不限于此。
进一步地，所述系统还包括温度控制单元，至少用以调控微流控芯片各区域的工作温度。
进一步地，所述系统还包括检测单元，至少用以采集产生的荧光，并进行分析检测。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种核酸快速扩增和检测的方法，具体是一种将待检测序列转换为一段编码序列而与核酸微阵列杂交检测的方法，所述方法主要基于前述的核酸快速扩增和检测的系统而实施，并且所述方法包括：
采用推力施加机构将待检测样本及反应液置于加样孔内，所述反应液包含前述的核酸检测用特异性编码引物组；
采用反复抽吸机构将待检测样本及反应液在变性区域和退火延伸区域，或者，在变性区域、变性区域与延伸区域之间进行往复运动实现温度循环，从而进行变性和退火延伸；
以及，将所获扩增反应液输入杂交反应腔室，并与其中的核酸捕获探针微阵列进行杂交反应，之后进行荧光检测。
在一些优选实施例中，所述方法包括：采用反复抽吸机构将待检测样本及反应液在变性区域和退火延伸区域，或者，在变性区域、变性区域与延伸区域之间进行往复运动20～45次。
在一些优选实施例中，所述方法包括：在注射泵的驱动下，通过与反应液互不相溶的液体，或者空气推动反应液在变性区域和退火延伸区域，或者，在变性区域、变性区域与延伸区域之间进行往复运动。
进一步地，所述与反应液互不相溶的液体可以包括矿物油，但不限于此。
进一步地，每个循环中退火延伸的时间在20秒以内，优选为5～20秒。
进一步地，所述变性的时间1～5分钟，优选为2～4分钟，尤其优选为1～5秒，循环扩增总时间为15分钟以内，优选为10分钟以内，尤其优选为10秒以内。
进一步地，所述杂交反应的时间为2～60分钟，优选为5分钟以内。
进一步地，所述方法还包括：将杂交反应所获反应液推进至废液收集腔室。
进一步地，所述方法还包括：对核酸捕获探针微阵列进行荧光成像，读出信号，并进行分析和检测。
综上所述，本发明提供了一种快速核酸扩增和杂交检测方法和装置，其核心是推动核酸扩增反应液在两个或者三个不同的固定的温度区域之间往复运动20～45次，然后将扩增反应液推到杂交区，与特异性捕获探针杂交后进行荧光检测。其特点是在注射泵等装置的驱动下，通过与反应液互不相溶的液体，如矿物油或者空气推动反应液在两个固定的温度区域(90～98℃变性，55～70℃退火延伸)或三个固定的温度区域(90～98℃变性，55～70℃退火，70～75℃延伸)之间往复运动，实现温度循环。与常规的用PCR管在PCR仪内进行的温度循环相比，只有PCR反应液自身需要经过加热和致冷的温度变化过程，而不是像常规PCR仪的加热模块、PCR管和PCR反应液都需要经过加热和致冷的温度变化过程。普通的TaqDNA聚合酶合成速度为16碱基/秒，而优化过的Taq DNA聚合酶合成速度可以达到为60-70碱基/秒甚至更快，因此对于200碱基的扩增子，需要的延伸时间仅为12秒甚至3秒，而通常PCR仪设置的延伸时间为30秒或者更长，而从95℃降温到60℃还通常还需要约20秒，主要的时间消耗在将反应体系加热到同样的温度，而本发明提出的往复式PCR通过固定微流控芯片不同区域的温度，将加热和致冷的部分缩减为反应液自身，不仅可以大大加快反应速度，而且可以大幅度降低能耗，使得设备的小型化和现场部署成为可能。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1a和图1b所示，为本发明一具体实施例中提供的一种微流控芯片、加热和温控装置的俯视图和侧面图。所述微流控芯片可以由一块通过微纳制造方法形成的沟道和腔室结构的玻璃、塑料(如PC、COC)等或者硅橡胶(如PDMS等)等材料形成。
进一步地，所述微流控芯片可以包括两个固定的温度区域(90～98℃变性，55～70℃退火延伸)或三个固定的温度区域(90～98℃变性，55～70℃退火，70～75℃延伸)完成核酸扩增。
进一步地，所述微流控芯片还可以包括一个或多个隔热区，隔热区设计在两个或者三个温区之间和微流道的背面。
进一步地，所述微流控芯片还包括一个温度设置在50～70℃的杂交腔，固定了核酸捕获探针微阵列的玻璃或塑料片可以用双面胶或者UV胶黏附在微流控芯片杂交反应腔区域构成杂交反应腔的一个表面。
进一步地，所述微流控芯片还包括一个废液收集腔，可以将扩增产物和其他废液收集，防止扩增产物对环境的污染。
进一步地，所述微流体芯片的加热和温控装置结构图如图1b，从上到下分别是微流控芯片、导热层、铜片和加热膜，在铜片内埋有热电偶或者热敏电阻，用于测量温度，反馈给温控电路实现精确温控。
请参阅图2所示，为本发明一具体实施例中往复式PCR和微阵列杂交流程示意图，具体包括以下步骤：
设计蛇形沟道以实现在较小的面积获得一定量的反应体积，将5～20微升体积的反应液加样进入沟道；
将反应液驻留在90～98℃温区1～5分钟，预变性；
通过与反应液互不相溶的液体，如矿物油，或者空气推动反应液，在加样孔施加推力将反应液55～70℃退火延伸5～20秒；
将反应液抽吸90～98℃温区变性1～5秒；
重复以上两步，将反应液在两个温区之间推进和抽吸往复运动20～45个循环；
将反应液推进至杂交腔杂交2～60分钟；
将反应液推进至废液腔；
对捕获探针微阵列进行荧光成像，读出信号。
请参阅图3所示，为本发明一具体实施例中特异性编码引物、扩增和杂交检测方法示意图。所用一组引物包括特异性编码的正向引物和荧光基团标记的反向引物；正向引物序列包括了编码区、间隔区、阻断区和特异性引物区。
其中，所述编码区序列设计为具有相近长度和相近的优化杂交温度、而序列差异较大的编码序列，可以在宽松的杂交条件(杂交液严格度、杂交温度等)下杂交并具有较好的差异。
其中，所述间隔区设计为5～20碱基的无关序列，用于优化扩增和增加杂交效率；间隔区可以选择5～20个T。
其中，所述阻断区用间臂修饰，如Spacer 3、Spacer 9、Spacer 18等，可以阻断DNA聚合酶合成，保证扩增产物的编码区和间隔区为单链，无需进行变性或者采用不对称PCR等方式也能保证杂交效率。
其中，特异性引物区为序列特异性引物，可以识别待检测位点；待检测位点可以为单碱基多态位点(SNPs),利用DNA聚合酶的保真性，3’端完全匹配的引物可以被DNA聚合酶延伸，而3’端有错配的引物不能被DNA聚合酶延伸或者延伸效率较低；利用DNA聚合酶的保真性可以将识别位点编码为编码序列。
进一步地，还可以在序列特异性引物3’端的第二位、第三位、第四位或第五位引入一个或者多个错配位点以进一步降低DNA聚合酶识别的错误率以增加检测的特异性。
进一步地，反向引物包括通用引物和5’端荧光标记基团。、
进一步地，荧光标记基团可以为但不限于FAM、Cy3、Cy5、TAMRA、HEX等，但不限于此。
进一步地，所用一组引物也可以为荧光基团标记的正向引物和特异性编码的反向引物。
进一步地，也可以使用多组引物进行多重PCR扩增。
实施例1微流控芯片
用双面热模压或注塑工艺制造微流控芯片基片层，如图4所示，其一面包含微流道和杂交腔，而另一面包含隔热沟。基片层的材质为聚碳酸酯PC，基片层厚度为2mm。微流道深度为0.2mm,宽度为1mm,在变性区域和退火延伸区域微流道的长度各约为6mm，可以容纳的最大反应体系体积约为12微升。另一面隔热沟深度为1.5mm,宽度为3mm，位于变性区域和退火延伸区域之间。微流控芯片的盖片层为0.2mm厚的聚碳酸酯PC膜。基片层和盖片层热键合后形成闭合的微流道。
实施例2核酸捕获探针微阵列
将洗净的玻璃片放入等离子清洗设备，处理30秒后取出。在室温条件下放入2％(v/v)3-氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液修饰30min，95％乙醇溶液清洗后，放入戊二酸反应液1小时(戊二醛反应液配制:50％戊二酸500μL，PBS 9.5mL，硼氢化钠20mg,pH＝7.4)，用去离子水清洗后吹干。保存在4℃用于点样捕获探针。
氨基修饰的捕获探针用碳酸缓冲液(pH＝9.5)稀释至50μM,用点样仪点样至3-氨丙基三乙氧基硅烷和戊二醛修饰的玻璃片表面，37℃湿盒中孵育4小时，用去离子水清洗后吹干。
氨基修饰的捕获探针的序列如下表，其中NC为阴性参照，PC为阳性参照，cX3,cX4为编码序列的互补序列捕获探针。核酸捕获探针微阵列中探针的排布如图5a所示。
点样了捕获探针的玻璃片切割为8mm x 8mm的小片，用UV胶与实施例1中的微流控芯片的杂交区黏合，形成封闭的杂交腔。
实施例3核酸样品采集
用咽拭子样品采集卡(FTA Buccal Collection Kit,P/N：WB120239,GEHealthcare)采集患者口腔细胞，具体方法：(a)患者采样前30分钟不能进食；(b)在采集卡上填写患者信息；(c)用清水漱口后，首先将采样棒放在舌下下等处，蘸取唾唾液后，然后将采样棒一面在口腔内左侧擦拭30秒，将采样棒的另一面在口腔内右侧擦拭30秒；(d)将海绵头的平坦表面按入采集卡样品区域使样品充分吸收；再将海绵头翻转，放在采集卡样品区域重复按压；(e)将采集卡室温放置1小时，至完全干燥。
实施例4单碱基多态检测案例
设计实验检测rs671单碱基多态。编码编码乙醛脱氢酶的ALDH2基因的rs671位点存在碱基多态，其基因型为野生型纯合子GG型、突变杂合子AG型和突变纯合子AA型。野生型纯合子酶具有正常乙醛催化活性；杂合子酶催化活性显著下降；突变型纯合子完全失去乙醛催化活性。设计一对特异性编码引物，包括编码区、间隔区、阻断区和等位基因特异性引物区，用于检测rs671单碱基多态。Rs671的A和G两个基因型特异性引物分别编码为X3和X4。
PCR反应使用Takara公司的Premix Taq试剂盒R004A。引物序列如下表。
反应体系如下表：
模板为实施例3中的采集卡打孔2mm的圆片上洗脱。阳性对照序列加入反应体系。将10μL反应液加入微流控芯片，变性1分钟后，进行40个循环的往复式PCR，变性4秒，退火延伸12秒，然后杂交5分钟后检测，检测结果荧光图片如图5b所示。该样品检测结果为突变杂合子AG型，与测序结果一致。
综上所述，藉由上述技术方案，本发明的快速核酸扩增和杂交检测方法不仅可以大大加快反应速度，而且减少了微流控芯片设计的复杂度和液体操控自动化的复杂度，避免了多重检测中探针设计的难度和复杂度。
本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。
在本发明案中标题及章节的使用不意味着限制本发明；每一章节可应用于本发明的任何方面、实施例或特征。
在本发明案通篇中，在将组合物描述为具有、包含或包括特定组份之处或者在将过程描述为具有、包含或包括特定过程步骤之处，预期本发明教示的组合物也基本上由所叙述组份组成或由所叙述组份组成，且本发明教示的过程也基本上由所叙述过程步骤组成或由所叙述过程步骤组组成。
应理解，各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要，只要本发明教示保持可操作即可。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。
此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。
尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。
序列表
<110> 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所
<120> 核酸快速扩增和检测的微流控芯片、检测方法及系统
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
gctgtacccg atcgcaaggt ggtctttttt acgggctgca ggcatacact a 51
<210> 2
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
caagcgtgct aacaagcgtg atcatttttt acgggctgca ggcatacact g 51
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
cggcaggtcc tgaacctctg gc 22
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
tgcgacctca gcatcgacct cagctttttt tttt 34
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 5
cagcacctga ccatcgatcg cagctttttt tttt 34
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 6
gaccaccttg cgatcgggta cagctttttt tttt 34
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 7
tgatcacgct tgttagcacg cttgtttttt tttt 34
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 8
tttttgctgc gatcgatggt caggtgctg 29
Claims (10)
1.一种核酸检测用特异性编码引物组，其特征在于包括至少一组引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，并且所述正向引物、反向引物中的任一者为特异性编码的引物序列，而另一者为荧光基团标记的引物序列，所述特异性编码的引物序列包括编码区、间隔区、阻断区和特异性引物区。
2.根据权利要求1所述的核酸检测用特异性编码引物组，其特征在于：所述编码区的序列设计为具有相近长度和相近的优化杂交温度、而序列差异较大的编码序列；和/或，所述间隔区包括含5～20碱基的无关序列，至少用于优化扩增和增加杂交效率，优选为5～20个T；和/或，所述阻断区用间臂修饰，至少用于阻断DNA聚合酶合成，保证扩增产物的编码区和间隔区为单链，优选的，所述阻断区包括Spacer 3、Spacer 9、Spacer 18中的至少任一者；
和/或，所述特异性引物区为特异性引物序列，至少用于识别待检测位点；其中，所述待检测位点包括单碱基多态位点；3’端完全匹配的引物能够被DNA聚合酶延伸，而3’端有错配的引物不能被DNA聚合酶延伸，且能够将识别位点编码为编码序列；
优选的，所述特异性引物序列3’端的第二位、第三位、第四位或第五位具有至少一个错配位点，至少用于降低DNA聚合酶识别的错误率以增加检测的特异性；
和/或，所述荧光基团标记的引物序列包括通用引物和5’端荧光标记基团；优选的，所述荧光标记基团包括FAM、Cy3、Cy5、TAMRA、HEX中的至少任一者；
和/或，所述核酸检测用特异性编码引物组包括特异性编码的正向引物和荧光基团标记的反向引物；或者，荧光基团标记的正向引物和特异性编码的反向引物；
和/或，所述特异性编码的引物序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；
和/或，所述荧光基团标记的引物序列如SEQ ID NO.3所示。
3.一种核酸捕获探针微阵列，其特征在于包括呈阵列排布的多个第三探针和第四探针，所述第三探针和第四探针为编码序列的互补序列捕获探针，并且，所述第三探针的序列如SEQ ID NO.6所示，所述第四探针的序列如SEQ ID NO.7所示；优选的，所述核酸捕获探针微阵列还包括作为阴性参照的第一探针和作为阳性参照的第二探针，所述第一探针的序列如SEQ ID NO.4所示，所述第二探针的序列如SEQ ID NO.5所示。
4.一种核酸快速扩增和检测的微流控芯片，其包括盖片层和基片层，其特征在于：所述盖片层和基片层之间闭合形成相连通的微流道和杂交反应腔室，所述杂交反应腔室内固定设置权利要求3所述的核酸捕获探针微阵列，并且，所述微流控芯片包括呈第一温度的变性区域和呈第二温度的退火延伸区域，或者，所述微流控芯片包括呈第一温度的变性区域、呈第二温度的退火区域及呈第三温度的延伸区域，所述微流道贯穿连通于变性区域、退火延伸区域或变性区域与延伸区域中。
5.根据权利要求4所述的微流控芯片，其特征在于：所述变性区域与退火延伸区域或退火区域之间还设置有至少一个隔热区域；优选的，所述隔热区域具有隔热沟道，其设置于微流道背面；
和/或，所述杂交反应腔室的温度呈第四温度，所述第四温度为50～70℃；和/或，所述第一温度为90～98℃；和/或，所述第二温度为55～70℃；和/或，所述第三温度为70～75℃；和/或，所述微流道包括蛇形沟道；
和/或，所述微流控芯片还包括废液收集腔室，至少用以对扩增产物和废液进行收集；
和/或，所述微流道的深度为0.05～1mm,宽度为0.1～2mm；
和/或，所述隔热沟道的深度为0.5～4.5mm,宽度为1～5mm；
和/或，所述基片层的厚度为1～5mm，材质包括聚碳酸酯和/或聚烯烃共聚物；
和/或，所述盖片层的厚度为0.05～0.5mm，材质包括聚碳酸酯和/或聚烯烃共聚物。
6.根据权利要求4所述的微流控芯片，其特征在于还包括依次层叠设置的导热层、铜层和加热膜层，所述微流道设置于导热层上方；优选的，所述铜层内设置有温度传感器，至少用于测量温度，并反馈给温控电路实现精确温控，优选的，所述温度传感器包括热电偶或者热敏电阻。
7.一种核酸快速扩增和检测的系统，其特征在于包括：
权利要求4-6中任一项所述的核酸快速扩增和检测的微流控芯片；
推力施加机构，其至少用于将反应液输入加样孔并进入微流控芯片的微流道内；
以及，反复抽吸机构，其至少用以将反应液在变性区域和退火延伸区域，或者，在变性区域、变性区域与延伸区域之间进行往复运动实现温度循环，从而进行变性和退火延伸。
8.根据权利要求7所述的核酸快速扩增和检测的系统，其特征在于：所述推力施加机构包括注射泵；和/或，所述系统还包括温度控制单元，至少用以调控微流控芯片各区域的工作温度；和/或，所述系统还包括检测单元，至少用以采集产生的荧光，并进行分析检测。
9.一种核酸快速扩增和检测的方法，其特征在于所述方法主要基于权利要求7-8中任一项所述的核酸快速扩增和检测的系统而实施，并且所述方法包括：
采用推力施加机构将待检测样本及反应液置于加样孔内，所述反应液包含权利要求1-2中任一项所述的核酸检测用特异性编码引物组；
采用反复抽吸机构将待检测样本及反应液在变性区域和退火延伸区域，或者，在变性区域、变性区域与延伸区域之间进行往复运动实现温度循环，从而进行变性和退火延伸；
以及，将所获扩增反应液输入杂交反应腔室，并与其中的核酸捕获探针微阵列进行杂交反应，之后进行荧光检测。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于包括：采用反复抽吸机构将待检测样本及反应液在变性区域和退火延伸区域，或者，在变性区域、变性区域与延伸区域之间进行往复运动20～45次；
和/或，所述方法包括：在注射泵的驱动下，通过与反应液互不相溶的液体，或者空气推动反应液在变性区域和退火延伸区域，或者，在变性区域、变性区域与延伸区域之间进行往复运动；优选的，所述与反应液互不相溶的液体包括矿物油；
和/或，每个循环中退火延伸的时间在20秒以内，优选为5～20秒；
和/或，所述变性的时间1～5分钟，优选为2～4分钟，尤其优选为1～5秒，循环扩增总时间为15分钟以内，优选为10分钟以内，尤其优选为10秒以内；
和/或，所述杂交反应的时间为2～60分钟，优选为5分钟以内；
和/或，所述方法还包括：将杂交反应所获反应液推进至废液收集腔室；
和/或，所述方法还包括：对核酸捕获探针微阵列进行荧光成像，读出信号，并进行分析和检测。
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