CN108342459A - 一种基于金纳米颗粒的定量pcr检测方法 - Google Patents

一种基于金纳米颗粒的定量pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种扩增引物的设计方法，设计发夹结构的扩增引物，扩增产物两端带有单链DNA片段。本发明提供两种金纳米颗粒探针，该探针修饰的DNA序列与待测DNA的PCR产物两端的单链DNA片段互补。本发明提供一种基于金纳米颗粒的定量PCR检测方法，包括以下步骤：(1)选取待测DNA序列，设计一对特殊结构的扩增引物；所述一对特殊结构的扩增引物设计成发夹结构；(2)在含有待测DNA模板、一对特殊结构的扩增引物、Taq DNA聚合酶和dNTP的体系中进行PCR反应，得到PCR产物；(3)制备DNA修饰的金纳米颗粒探针；(4)将探针加入到PCR产物中，与PCR产物杂交；(5)测定金纳米颗粒的吸光度或动态光散射信号的变化。该方法操作简单，能够快速检测PCR产物，灵敏度高。

Description

一种基于金纳米颗粒的定量PCR检测方法
技术领域
本发明涉及一种聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)检测方法，属于生物检测技术领域，特别涉及一种基于金纳米颗粒的定量PCR检测方法。
背景技术
PCR是一种体外酶促扩增DNA片段的技术，是检测少量目标DNA分子最常用的方法。但是，采用凝胶电泳对PCR产物进行后处理的过程费力又耗时。
实时荧光PCR(Real-time PCR)在传统PCR技术上作出了重大改进，可以在放大的同时定量检测目标DNA分子。然而，实时荧光定量PCR仪比较昂贵和复杂，在不发达国家的偏远地区的应用会受到限制。考虑到这一点，开发新型的、能够准确定量目标DNA的PCR方法仍然很有必要。
随着纳米技术的不断发展，纳米材料逐渐被应用到生命科学领域，为其研究和发展提供了新的技术和手段。金纳米颗粒(gold nanoparticles，AuNPs)作为纳米材料的一个重要组成部分，由于其特殊的物理化学性质和生物相容性，目前已被广泛应用于分子识别、细胞成像、临床诊断和环境监测等。研究表明，AuNPs可以作为一种理想的PCR添加剂，它能够提高PCR反应的产率，并且减少非特异性的放大产物。同时，AuNPs具有较高的摩尔消光系数，与颗粒大小、聚集程度以及颗粒之间距离相关的光学性质等特点。随着AuNPs分散/聚集状态的改变，其吸光度和粒径大小也随之变化。因此，AuNPs可以作为一种理想的比色或动态光散射信号探针显示PCR扩增产物的量。
目前，PCR技术与AuNPs探针的结合主要有两种方式，一种是采用不对称PCR技术产生单链DNA产物，然后与AuNPs探针上修饰的DNA杂交；但在进行不对称PCR时，上下游引物的浓度配比很难优化，其成功率往往不太理想；另一种是制备两种修饰不同引物的AuNPs探针，再进行PCR反应，但由于AuNPs表面修饰的DNA会存在空间位阻，阻碍PCR反应的进行而降低其扩增效率。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明目的是提供一种扩增引物的设计方法，所述扩增引物设计成发夹结构，扩增得到的产物两端带有单链DNA片段。
本发明另一目的是提供两种金纳米颗粒探针，两种探针修饰的DNA序列与待测DNA的PCR产物两端的单链DNA片段互补，可与PCR产物进行杂交。
本发明再一目的是提供一种基于金纳米颗粒的定量PCR检测方法，该方法操作简单，能够快速检测PCR产物，灵敏度高。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种扩增引物的设计方法，设计发夹结构的扩增引物，并且环部引入分子间臂；其扩增得到的产物两端带有单链DNA片段。
进一步地，所述分子间臂选自C3间臂、C6间臂、C12间臂、三聚乙二醇间臂(Spacer9)或六聚乙二醇间臂(Spacer 18)。
进一步地，所述引物的茎部序列为：
上游引物：5’-GGG AGA GAA GAA CT分子间臂AG TTC TTC TCT CCC；
下游引物：5’-GAG GAA GGA AAG CT分子间臂AG CTT TCC TTC CTC。
本发明提供两种金纳米颗粒探针，所述两种金纳米颗粒探针修饰的DNA序列与待测DNA的PCR产物两端的单链DNA片段互补。
进一步地，所述两种金纳米颗粒探针包括Probe 1和Probe 2；Probe 1和Probe 2修饰的DNA序列分别与待测DNA的PCR产物两端的单链DNA片段互补；
所述Probe 1和Probe 2修饰的DNA序列分别为：
Probe 1：5’-TTC TTC TCT CCC-thiol-3’；
Probe 2：5’-CTT TCC TTC CTC-thiol-3’。
本发明提供如上所述的两种金纳米颗粒探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)金纳米颗粒的制备：
将新鲜配制的柠檬酸钠溶液迅速加到煮沸的氯金酸HAuCl4溶液中，柠檬酸钠溶液与氯金酸HAuCl4溶液加入的摩尔比为40：1；反应液由淡黄色变为黑色，再变成紫色，最后变为酒红色，继续加热回流并搅拌10min；让反应液冷却至室温并保持搅拌，然后用0.45μm尼龙滤膜过滤，保存在4℃冰箱中备用；
(2)金纳米颗粒表面修饰DNA：
巯基修饰的DNA先用磷酸三(2-氯乙基)酯TCEP处理，接着按200：1的摩尔比加入到步骤(1)制备的金纳米颗粒中，在室温下孵育16h；在接下来的44h内分多次加入NaCl进行盐老化，NaCl的最终浓度为0.1M；将反应液以13800rpm的转速离心30min，重复3次，得到的油状沉淀物溶解在10mM PBS缓冲液中，保存在4℃冰箱中备用。
本发明提供一种基于金纳米颗粒的定量PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)选取待测DNA序列，设计一对特殊结构的扩增引物；所述一对特殊结构的扩增引物设计成发夹结构；
(2)在含有待测DNA模板、一对特殊结构的扩增引物、Taq DNA聚合酶和dNTP的体系中进行PCR反应，得到PCR产物；
(3)制备DNA修饰的金纳米颗粒探针；
(4)将金纳米颗粒探针加入到PCR产物中，与PCR产物杂交，使金纳米颗粒发生聚集；
(5)测定金纳米颗粒吸光度或动态光散射信号(粒径大小)的变化，实现对目标DNA序列的高灵敏定量分析。
进一步地，步骤(1)中，所述一对特殊结构的扩增引物设计成发夹结构，并且环部引入分子间臂；所述分子间臂选自C3间臂、C6间臂、C12间臂、三聚乙二醇间臂(Spacer 9)或六聚乙二醇间臂(Spacer 18)。
进一步地，步骤(2)中，所得到的PCR产物为两端带有单链DNA片段的PCR产物。
进一步地，步骤(3)中，所述两种金纳米颗粒探针包括Probe 1和Probe 2；Probe 1和Probe 2修饰的DNA序列分别与待测DNA的PCR产物两端的单链DNA片段互补。
进一步地，步骤(5)中，所述测定金纳米颗粒吸光度或动态光散射信号的变化采用分光光度法或动态光散射法进行定量分析。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过设计发夹结构的上下游引物，环部引入分子间臂(如C3间臂、C6间臂、C12间臂、三聚乙二醇间臂(Spacer 9)或六聚乙二醇间臂(Spacer 18)等)；在PCR过程中发夹结构打开，聚合反应在分子间臂处终止，得到的PCR产物两端带有单链DNA片段；
(2)本发明提供的两种DNA修饰的金纳米颗粒探针(Probe 1和Probe 2)分别与PCR产物两端的单链DNA杂交，导致金纳米颗粒发生聚集，伴随着金纳米颗粒吸光度及其动态光散射信号(粒径大小)的变化，从而能够高效、快速检测PCR产物；
(3)两种金纳米颗粒探针(Probe 1和Probe 2)修饰的DNA序列可以任意设计，只需要保证PCR产物两端的单链DNA片段分别与其互补；换言之，我们可以根据PCR产物两端的单链DNA片段去设计Probe 1和Probe 2修饰的DNA序列；
(4)通过固定引物茎部的序列，改变引物与模板DNA互补的片段，采用两种通用的金纳米颗粒探针(Probe 1和Probe 2)可以实现不同目标DNA序列的分析检测，具有很好的通用性；
(5)此方法无需通过不对称PCR或将PCR双链DNA产物进行变性，获得单链DNA与金纳米颗粒探针进行杂交，是一种操作简单、快速、高灵敏度的PCR检测方法。
附图说明
图1为本发明一种基于金纳米颗粒的定量PCR检测方法原理图；
图2为本发明实施例1中采用比色分析不同样品的紫外可见吸收光谱图；
图3a为本发明实施例1中采用动态光散射分析不含目标DNA的样本的粒径大小分布图；
图3b为本发明实施例1中采用动态光散射分析含目标DNA的样本的粒径大小分布图；
图4为本发明实施例1中采用比色分析不同浓度目标DNA反应体系的紫外可见吸收光谱图；
图5为本发明实施例2中采用比色分析不同浓度目标DNA反应体系的紫外可见吸收光谱图。
具体实施方式
现结合附图与具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明提供的一种基于金纳米颗粒的定量PCR检测方法，无需通过不对称PCR或将PCR双链DNA产物进行变性，获得单链DNA。只需设计特殊的引物结构，通过常规的PCR反应，得到的PCR产物两端带有单链DNA，可以与金纳米颗粒探针上修饰的DNA杂交，产生明显的颜色和粒径大小变化。因此本方法具有操作简单、快速、灵敏度高等优点。
本发明的技术方案主要包括以下内容：
(1)DNA修饰的金纳米颗粒探针的制备；
(2)在PCR仪上按程序进行待测DNA扩增；
(3)将DNA修饰的金纳米颗粒与PCR扩增产物按优化比例混合均匀：
加入适量的DNA修饰金纳米颗粒探针(Probe 1和Probe 2)到PCR产物中，在室温下孵育30min，通过DNA杂交反应使金纳米颗粒发生聚集；
(4)测定相应的紫外可见吸收光谱图或粒径大小分布结果。
本发明涉及的一种基于金纳米颗粒的定量PCR检测方法，原理图如图1所示，具体步骤如下：
(1)选取待测DNA序列，设计一对特殊结构的扩增引物，设计成发夹结构，并且环部引入分子间臂(如C3间臂、C6间臂、C12间臂、三聚乙二醇间臂(Spacer 9)和六聚乙二醇间臂(Spacer 18)等)。利用上述分子间臂一方面可以使引物形成稳定的发夹结构，另一方面这些分子间臂会阻止聚合反应的继续进行。
(2)在含有模板待测DNA、一对特殊结构的扩增引物、Taq DNA聚合酶和dNTP的体系中进行PCR反应，在PCR过程中发夹结构打开，引物发生聚合反应延伸到分子间臂处会终止，得到两端带有单链DNA片段的PCR产物。
(3)分别制备两种DNA修饰的金纳米颗粒探针(Probe 1和Probe 2)，金纳米颗粒探针Probe 1和Probe 2分别带有不同序列，目的在于防止金纳米颗粒探针只与PCR产物的一端结合，无法形成交联的金纳米颗粒聚集体，导致金纳米颗粒的吸光度及其动态光散射信号(粒径大小)无明显变化。
通过固定引物茎部的序列，改变引物与模板DNA互补的片段，采用两种通用的金纳米颗粒探针(Probe 1和Probe 2)可以实现不同目标DNA序列的分析检测，具有很好的通用性。
两种金纳米颗粒探针(Probe 1和Probe 2)修饰的DNA序列可以任意设计，只需要保证PCR产物两端的单链DNA片段分别与其互补。换言之，我们可以根据PCR产物两端的单链DNA片段去设计Probe 1和Probe 2修饰的DNA序列。
(4)将两种探针加入到PCR产物中，分别与PCR产物的两段单链DNA杂交，使金纳米颗粒发生聚集。
(5)通过测定金纳米颗粒吸光度或动态光散射信号(粒径大小)的变化，采用分光光度法或动态光散射法进行定量分析，实现对目标DNA序列的高灵敏定量分析。
下面通过具体实施例以及附图对本发明作进一步阐释，但是本发明的技术方案不以具体实施例为限。
实施例1
1、基于特殊结构引物的聚合酶链式反应：
设计发夹结构的扩增引物，并且环部引入六聚乙二醇间臂(Spacer 18)，上下游引物的序列分别为：
上游引物：5’-GGG AGA GAA GAACT spacer18AG TTC TTC TCT CCC GAC AGG CCCGAA GGA ATA GA-3’
下游引物：5’-GAG GAAGGAAAG CT spacer18AG CTT TCC TTC CTC CTC TCT CTCCAC CTT CTT CT-3’；
在含有模板DNA(序列为5’-GAC AGG CCC GAA GGA ATA GAA GAA GAA GGT GGAGAG AGAG-3’)、一对扩增引物、Taq DNA聚合酶和dNTP的体系中进行PCR反应，得到两端带有单链DNA片段的PCR产物。
PCR反应液的总体积为50μL，包括5μL的10×PCR缓冲液，1μL 10mM的dNTP，3μL25mM的MgCl2，0.5μL 5U/μL的Taq DNA聚合酶，10μM/L的上下游引物各2μL，2μL不同浓度(0-1.6nM)的模板DNA以及34.5μL的双蒸水。
94℃预变性3min，再进行35个循环的如下过程：94℃变性15s，55℃退火20s，72℃延伸30s，最后在72℃下反应3min，完成对模板分子的PCR扩增过程。
2、制备两种DNA修饰的金纳米颗粒探针(Probe 1和Probe 2)：
DNA修饰的AuNPs制备：
AuNPs的制备是根据经典的柠檬酸钠还原法，并做了适当的调整。将2mL新鲜配制的38.8mM柠檬酸钠溶液迅速加到20mL煮沸的1mM氯金酸HAuCl4溶液中，反应液由淡黄色变为黑色，再变成紫色，最后变为酒红色，继续加热回流并搅拌10min。最后，让反应液冷却至室温并保持搅拌，然后用0.45μm的尼龙滤膜过滤，保存在4℃冰箱中备用。
AuNPs表面修饰DNA：
巯基修饰的DNA先用磷酸三(2-氯乙基)酯TCEP处理，接着按200：1的摩尔比加入到预先制备的AuNPs溶液中，在室温下孵育16h。然后在接下来的44h内分多次加入NaCl进行盐老化，NaCl的最终浓度为0.1M。最后，将反应液以13800rpm的转速离心30min以除去游离的DNA(重复3次)，得到的油状沉淀物溶解在10mM PBS缓冲液(pH＝7.4，NaCl＝0.1M)中，保存在4℃冰箱中备用。
探针序列分别为：
Probe 1：5’-TTC TTC TCT CCC-thiol-3’；
Probe 2：5’-CTT TCC TTC CTC-thiol-3’。
3、杂交：
将两种探针(Probe 1和Probe 2)加入到PCR产物中，分别与PCR产物的两段单链DNA杂交，在室温下孵育30min，使金纳米颗粒发生聚集。
4、比色或动态光散射分析：
通过测定金纳米颗粒吸光度或其动态光散射信号(粒径大小)的变化，实现对目标DNA序列的高灵敏定量分析。
结果如图2、图3a和图3b所示。由图2可见，当加入目标DNA后，金纳米颗粒的紫外吸收峰发生红移，其在520nm处的吸光度明显降低。由图3a可见，当没有目标DNA时，DLS测得的金纳米颗粒水合粒径为36.6nm，表明金纳米颗粒保持分散状态。由图3b可见，而当目标DNA存在时，金纳米颗粒的水合粒径增加到364.2nm，表明PCR产物诱导金纳米颗粒发生聚集。
由图4可见，随着目标DNA浓度的增加，金纳米颗粒在522nm处的吸光度也逐渐下降。
实施例2
1、基于特殊结构引物的聚合酶链式反应：
设计发夹结构的扩增引物，并且环部引入三聚乙二醇间臂(Spacer 9)，上下游引物的序列分别为：
上游引物：5’-GGG AGA GAA GAA CT spacer9AG TTC TTC TCT CCC CTT CTC TTTGAT GTC ACG CA-3’
下游引物：5’-GAG GAA GGA AAG CT spacer9AG CTT TCC TTC CTC GAT GCC ACAGGATTC CATA-3’
在含有模板DNA(序列为5’-CTT CTC TTT GAT GTC ACG CAT ATG GAATCC TGT GGCATC-3’、一对扩增引物、Taq DNA聚合酶和dNTP的体系中进行PCR反应，得到两端带有单链DNA片段的PCR产物。
PCR反应液的总体积为50μL，包括5μL的10×PCR缓冲液，1μL 10mM的dNTP，3μL25mM的MgCl2，0.5μL 5U/μL的Taq DNA聚合酶，10μM/L的上下游引物各2μL，2μL不同浓度(16fM-1.6nM)的模板DNA以及34.5μL的双蒸水。
94℃预变性3min，再进行35个循环的如下过程：94℃变性15s，55℃退火20s，72℃延伸30s，最后在72℃下反应3min，完成对模板分子的PCR扩增过程。
2、制备两种DNA修饰的金纳米颗粒探针(Probe 1和Probe 2)：
DNA修饰的AuNPs制备：
AuNPs的制备是根据经典的柠檬酸钠还原法，并做了适当的调整。将2mL新鲜配制的38.8mM柠檬酸钠溶液迅速加到20mL煮沸的1mM氯金酸HAuCl4溶液中，反应液由淡黄色变为黑色，再变成紫色，最后变为酒红色，继续加热回流并搅拌10min。最后，让反应液冷却至室温并保持搅拌，然后用0.45μm的尼龙滤膜过滤，保存在4℃冰箱中备用。
AuNPs表面修饰DNA：巯基修饰的DNA先用磷酸三(2-氯乙基)酯TCEP处理，接着按200：1的摩尔比加入到预先制备的AuNPs溶液中，在室温下孵育16h。然后在接下来的44h内分多次加入NaCl进行盐老化，NaCl的最终浓度为0.1M。最后，将反应液以13800rpm的转速离心30min以除去游离的DNA(重复3次)，得到的油状沉淀物溶解在10mM PBS缓冲液(pH＝7.4，NaCl＝0.1M)中，保存在4℃冰箱中备用。
探针序列分别为：
Probe 1：5’-TTC TTC TCT CCC-thiol-3’；
Probe 2：5’-CTT TCC TTC CTC-thiol-3’。
3、杂交：
将两种探针(Probe 1和Probe 2)加入到PCR产物中，分别与PCR产物的两段单链DNA杂交，在室温下孵育30min，使金纳米颗粒发生聚集。
4、比色或动态光散射分析：
通过测定金纳米颗粒吸光度或其动态光散射信号(粒径大小)的变化，实现对目标DNA序列的高灵敏定量分析。
结果如图5所示，随着目标DNA浓度的增加，金纳米颗粒在522nm处的吸光度也逐渐下降。
本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变型不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变型属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变动。

Claims (10)

1.一种扩增引物的设计方法，其特征在于：设计发夹结构的扩增引物，并且环部引入分子间臂；所述分子间臂选自C3间臂、C6间臂、C12间臂、三聚乙二醇间臂或六聚乙二醇间臂。
2.根据权利要求1所述的扩增引物的设计方法，其特征在于：设计所得的扩增引物扩增得到的产物两端带有单链DNA片段；
所述引物的茎部序列为：
上游引物：5’-GGG AGA GAA GAA CT分子间臂AG TTC TTC TCT CCC；
下游引物：5’-GAG GAA GGA AAG CT分子间臂AG CTT TCC TTC CTC。
3.两种金纳米颗粒探针，其特征在于：所述两种金纳米颗粒探针修饰的DNA序列分别与待测DNA的PCR产物两端的单链DNA片段互补。
4.根据权利要求3所述的两种金纳米颗粒探针，其特征在于：所述两种金纳米颗粒探针包括Probe 1和Probe 2；Probe 1和Probe 2修饰的DNA序列分别与待测DNA的PCR产物两端的单链DNA片段互补；
所述Probe 1和Probe 2修饰的DNA序列分别为：
Probe 1：5’-TTC TTC TCT CCC-thiol-3’；
Probe 2：5’-CTT TCC TTC CTC-thiol-3’。
5.权利要求3所述的两种金纳米颗粒探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)金纳米颗粒的制备：
将柠檬酸钠溶液迅速加到氯金酸HAuCl4溶液中，柠檬酸钠溶液与氯金酸HAuCl4溶液加入的摩尔比为40：1；反应完全后，继续加热回流并搅拌10min；让反应液冷却至室温并保持搅拌，过滤，保存在4℃冰箱中备用；
(2)金纳米颗粒表面修饰DNA：
巯基修饰的DNA先用磷酸三(2-氯乙基)酯TCEP处理，接着按200：1的摩尔比加入到步骤(1)中制备的金纳米颗粒中，在室温下孵育16h；在接下来的44h内分多次加入NaCl，NaCl的最终浓度为0.1M；将反应液以13800rpm的转速离心30min，重复3次，得到的沉淀物溶解在10mM PBS缓冲液中，保存在4℃冰箱中备用。
6.一种基于金纳米颗粒的定量PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)选取待测DNA序列，设计一对特殊结构的扩增引物；所述一对特殊结构的扩增引物设计成发夹结构；
(2)在含有待测DNA模板、一对特殊结构的扩增引物、Taq DNA聚合酶和dNTP的体系中进行PCR反应，得到PCR产物；
(3)制备DNA修饰的金纳米颗粒探针；
(4)将金纳米颗粒探针加入到PCR产物中，与PCR产物杂交；
(5)测定金纳米颗粒的吸光度或动态光散射信号的变化。
7.根据权利要求6所述的PCR检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述一对特殊结构的扩增引物设计成发夹结构，并且环部引入分子间臂；所述分子间臂选自C3间臂、C6间臂、C12间臂、三聚乙二醇间臂或六聚乙二醇间臂。
8.根据权利要求6所述的PCR检测方法，其特征在于：步骤(2)中，所得到的PCR产物为两端带有单链DNA片段的PCR产物。
9.根据权利要求6所述的PCR检测方法，其特征在于：步骤(3)中，所述金纳米颗粒探针包括Probe 1和Probe 2；Probe 1和Probe 2修饰的DNA序列分别与待测DNA的PCR产物两端的单链DNA片段互补。
10.根据权利要求6所述的PCR检测方法，其特征在于：步骤(5)中，所述测定金纳米颗粒吸光度或动态光散射信号的变化采用分光光度法或动态光散射法。
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