CN110229872A

CN110229872A - 一种基于G-四链体探针结构解旋的可视化识别microRNA的检测方法

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Publication number: CN110229872A
Application number: CN201910514343.2A
Authority: CN
Inventors: 程靓; 兰玲; 刘利
Original assignee: Institute of Chemistry CAS
Current assignee: Institute of Chemistry CAS
Priority date: 2019-06-14
Filing date: 2019-06-14
Publication date: 2019-09-13
Anticipated expiration: 2039-06-14
Also published as: CN110229872B

Abstract

本发明公开了一种基于G‑四链体探针结构解旋的可视化识别microRNA的检测方法。本发明将G‑四链体与血红素结合后的催化特性和G‑四链体的结构变化进行结合构建的信号衰减方法能够区分单碱基错配和多碱基错配的miRNA，同时能够区分不同miRNA家族成员。在信号衰减的基础上灵敏度仍能达到4.5nmol/L。本发明所使用探针设计简单，不涉及复杂反应过程。本发明对于miRNA的检测有重要意义。

Description

一种基于G-四链体探针结构解旋的可视化识别microRNA的检测方法

技术领域

本发明涉及涉及核酸检测领域，具体涉及一种基于G-四链体探针结构解旋的可视化识别microRNA的检测方法。

背景技术

microRNA(以下简称miRNA)是一类广泛存在于真核生物中长度约22～23个核苷酸非编码、单链小RNA。在不同细胞或组织类型中miRNA表达水平不同，广泛参与不同的生理活动，其主要通过完全降解或翻译抑制靶基因可以调控细胞增生、分化和凋亡。miRNA作为抑癌基因或原癌基因通过调节凋亡蛋白、激酶和其他肿瘤诱导因子等的表达来参与肿瘤的发生发展，因此异常的miRNA表达被认为是肿瘤或疾病的特征。

目前miRNA已经作为肿瘤分子标志物被用来研究肿瘤诊断和治疗的靶点，那么关于miRNA的高灵敏检测则为肿瘤早期诊断的重要依据。由于miRNA本身具有长度短，丰度低，易降解并且同源miRNAs相似度高的特点，现在大多数研究致力于信号放大或目标转换的方法来弥补miRNA的缺陷，其中包括聚合酶链式反应(PCR)，滚环扩增反应(RCA)，纳米粒子聚集和荧光能量转移等方法，但这些方法反应过程复杂，制作费用高昂，不能全面满足应用需求。为丰富现在已有的miRNA高灵敏检测方法，同时为以后能选择有效合适的检测方法提供更多可能性，需要开发一种设计简单，操作方便不依赖昂贵仪器，且高特异性识别miRNA的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于G-四链体探针结构解旋的可视化识别microRNA的检测方法。

第一方面，本发明保护一种检测microRNA的方法，包括如下步骤：合成探针；所述探针由结合区段和信号区段组成；所述结合区段为与目标microRNA的全长序列反向互补的DNA片段；所述信号区段为可形成G-四链体结构的DNA片段；

如果所述探针与待测样本进行DNA/RNA杂化反应后可以招募DNA聚合酶对探针的G-四链体结构进行解旋复制使其转变为双链结构，则待测样本中含有目标microRNA；反之，待测样本中不含有目标microRNA。

进一步地，所述方法包括如下步骤：

(1)合成上述探针；

(2)取步骤(1)所述探针，经过退火使所述探针的信号区段形成G-四链体结构；

(3)将步骤(2)的探针与待测样本进行DNA/RNA杂化反应；

(4)完成步骤(3)后，向反应体系中加入DNA聚合酶进行解旋扩增反应；

(5)完成步骤(4)后，向反应体系中加入血红素进行反应；血红素可与未解旋的G-四链体结构结合形成具有催化功能的复合物；

(6)完成步骤(5)后，向反应体系中加入ABTS和H₂O₂进行催化反应后检测420nm处吸收值；

所述方法设置空白对照；所述空白对照采用水替代待测样本；将待测样本在420nm处吸收值记为A，将空白对照在420nm处吸收值记为A₀；A₀-A的数值越大，待测样本中目标miRNA的含量越多。

同时，还可通过观察空白对照的反应体系颜色和待测样本的反应体系颜色来判断目标miRNA的存在情况；空白对照的反应体系颜色为绿色，待测样本的反应体系颜色与空白对照相比颜色越浅，待测样本中目标miRNA的含量越多。

以上任一所述探针的信号区段的长度小于30bp。所述信号区段形成G-四链体结构时，四联体层数应小于等于3(即信号区段中连续的碱基G个数应为2或3)。

当选用的DNA聚合酶的复制方向是3′→5′时，所述探针自5’端至3’端依次为信号区段和结合区段；当选用的DNA聚合酶的复制方向是5′→3′时，所述探针自5’端至3’端依次为结合区段和信号区段。

在本发明的实施例中，所述信号区段具体可如序列表的序列1自5’端第1至19位所示。

所述方法中，所述DNA聚合酶具体可为Klenow Fragment聚合酶。

当所述DNA聚合酶为Klenow Fragment聚合酶时，所述探针自5’端至3’端依次为信号区段和结合区段。

所述步骤(3)中，所述探针在DNA/RNA杂化反应体系中的浓度为0.5-1μmol/L(最优选为1μmol/L)；

和/或，所述DNA/RNA杂化反应温度为20℃-37℃(最优选为37℃)；

和/或，所述DNA/RNA杂化反应时间为60-120min(最优选为80min)；

所述步骤(4)中，所述DNA聚合酶在解旋扩增反应体系中的浓度为0.1-0.3unit/μL(最优选为0.2unit/μL)；

和/或，所述解旋扩增反应时间为40-60min(最优选为50min)；

所述步骤(5)中，所述血红素在反应体系中的浓度为2-4μmol/L(最优选为2μmol/L)；

和/或，所述反应时间为1-2h(最优选为1h)；

和/或，所述反应温度为20℃-37℃(最优选为25℃)。

进一步地，所述步骤(2)中，所述退火具体条件可为：95℃加热5min，然后置于冰上退火降温。

所述步骤(3)中，所述杂化反应的反应体系具体可为：探针8μL，10×KF reactionbuffer 2 8μL，dNTPs 4μL，Tris-HCl buffer 44μL，待测样本8μL。

所述步骤(4)中，完成解旋扩增反应后，80℃条件下孵育10min灭活DNA聚合酶。

所述步骤(5)中，血红素可采用DMSO溶解后加至反应体系中。

所述步骤(5)中，具体可向反应体系中加入4μL含有血红素的DMSO溶液和286μL缓冲溶液A(10mL Tris-HCL，10mM KCl，150mM NaCl，0.03％Triton X-100，pH＝7.4)。

所述步骤(6)中，所述ABTS在反应体系中的浓度为1mmol/L；所述H₂O₂在反应体系中的浓度为0.5mmol/L。

在本发明的实施例中，所述目标microRNA具体可为miRNA21；当目标microRNA为miRNA21时，所述探针具体可如序列表的序列1所示。

第二方面，本发明保护以上任一所述的探针在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为检测microRNA。

第三方面，本发明保护一种检测microRNA的试剂盒，含有以上任一所述的探针。

所述试剂盒还含有记载以上任一所述方法的说明书。

以上任一所述待测样本可为RNA样本，更具体可为总RNA或microRNA样本。

本发明将G-四链体与血红素结合后的催化特性和G-四链体的结构变化进行结合构建的信号衰减方法能够区分单碱基错配和多碱基错配的miRNA，同时能够区分不同miRNA家族成员。在信号衰减的基础上灵敏度仍能达到4.5nmol/L。本发明所使用探针设计简单，不涉及复杂反应过程。

本发明对于miRNA的检测有重要意义。

附图说明

图1为技术原理图。

图2为灵敏度评价结果。

图3为特异性评价性结果。

图4为癌细胞系(MCF-7)中miR21的检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

10×KF reaction buffer 2：NEW ENGLAND BioLabs(NEB)，货号#B7002S。

DNA聚合酶KF：NEW ENGLAND BioLabs(NEB)，货号#M0212L。

血红素：MACKLIN，货号#M28818033。

ABTS：Solarbio，货号No.A9590。

实施例1、探针的设计及检测方法建立

本发明设计的G-四链体探针包含结合区段和信号区段，结合区段为可特异识别目标miRNA并与之结合的DNA片段(结合区段与目标miRNA全长序列反向互补)，信号区段为输出信号的可形成G-四链体结构的DNA片段。

本发明的检测原理见图1。在无目标miRNA分子存在时，探针中的G-四链体结构可与血红素hemin结合形成DNAzyme，DNAzyme可催化H₂O₂氧化ABTS[2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐]反应，使溶液颜色由无色变为明显的绿色，在吸收光谱中特征吸收峰为420nm；在有一定浓度的目标miRNA存在时，探针通过杂交识别miRNA并将其作为引物招募诱导Klenow Fragment聚合酶(KF，源自大肠杆菌中DNA polymerase I的片段)进而对G-四链体结构进行解旋破坏，将G-四链体结构通过扩增反应转变为双链结构，此时信号探针不能与hemin形成DNAzyme参与催化H₂O₂氧化显色剂ABTS，溶液将显示浅绿或无色，同时在420nm处吸收值降低。通过吸收光谱测定420nm处吸收值，将样本与空白对照组的吸收差值(A₀-A)作为评估参数，差值越大说明miRNA含量越高。基于以上信号衰减原理通过样本比色和吸收检测即可实现对miRNA的可视化识别检测。

具体检测方法如下：

1、取设计合成的探针，95℃加热5min，然后在冰上退火降温。

2、配置反应体系，20℃-37℃条件下进行杂化反应，反应时间为60-120min。

反应体系：探针8μL，10×KF reaction buffer 2 8μL，dNTPs 4μL，Tris-HClbuffer 44μL，待测样本8μL。

所述探针在反应体系中的浓度为0.5-1μmol/L。

dNTPs在反应体系中的浓度为0.5mmol/L。

Tris-HCl buffer在反应体系中的浓度为10mmol/L。

本步骤的目的是使探针和目标miRNA充分杂化。

3、完成步骤2后，向反应体系中加入8μL DNA聚合酶KF，37℃条件下孵育40-60min，然后80℃条件下孵育10min灭活KF。

DNA聚合酶KF在反应体系中的浓度为0.1-0.3unit/μL。

本步骤的目的是使DNA聚合酶KF对已经与目标miRNA杂化形成的探针复合物进行解旋扩增反应，探针由G-四链体结构转变为双链结构。

4、完成步骤3后，在反应体系中加入4μL含有血红素的DMSO溶液和286μL缓冲溶液A(10mL Tris-HCL，10mM KCl，150mM NaCl，0.03％Triton X-100，pH＝7.4)，20-37℃反应1-2h。

血红素浓度在反应体系中的浓度为2-4μmol/L。

本步骤的目的是使血红素与G-四链体结构形成具有催化功能的DNAzyme。

5、完成步骤4后，在反应体系中加入10μL ABTS水溶液和20μL H₂O₂水溶液，20-37℃反应15-30min，然后进行吸收光谱检测420nm处吸收值。

ABTS在反应体系中的浓度为1mmol/L；

H₂O₂在反应体系中的浓度为0.5mmol/L。

设置用水替代待测样本的空白对照。

如果实验组比空白对照组颜色浅，则所述待测样本中含有目标miRNA；反之，则所述待测样本中含少量的或不含目标miRNA；通过吸收光谱检测测定实验组与空白对照组在420nm处的吸收差值确定待测样本中具体目标miRNA的含量。

实施例2、以miRNA21作为目标分子的G-四链体探针设计

以miRNA21作为目标分子设计G-四链体探针MG41，如表1所示。

表1 G-四链体探针与miR21的序列

探针MG41中，自5’端第1至19位为信号区段，第20-41位为结合区段。

实施例3、灵敏度

1、将实施例1制备的MG41探针95℃加热5min，然后置于冰上退火降温。

2、配置如下反应体系，37℃杂化反应80min。

反应体系：探针8μl，10×KF reaction buffer 2 8μl，dNTPs 4μl，Tris-HClbuffer44μl，miRNA21 8μl。

所述探针在反应体系中的浓度为1μmol/L。

所述miRNA21在反应体系中的浓度设置不同梯度(0-1μmol/L)。

dNTPs在反应体系中的浓度为0.5mmol/L。

Tris-HCl buffer在反应体系中的浓度为10mmol/L。

3、完成步骤2后，向反应体系中加入8μl DNA聚合酶KF，37℃条件下孵育50min，然后80℃条件下孵育10min灭活KF。

DNA聚合酶KF在反应体系中的浓度为0.2unit/μL。

4、完成步骤3后，在反应体系中加入4μl含有血红素的DMSO溶液和286μl缓冲溶液A(10mL Tris-HCL，10mM KCl，150mM NaCl，0.03％Triton X-100，pH＝7.4)，25℃反应1h。在反应体系中，血红素浓度为2μmol/L。

5、完成步骤4后，在反应体系中加入10μl ABTS水溶液和20μl H₂O₂水溶液，25℃反应20min，然后进行吸收光谱检测420nm处吸收值，并进行数据处理(A₀代表不含miR21的空白样品吸收值，A代表不同浓度miR21的吸收值)。

ABTS在反应体系中的浓度为1mmol/L；

H₂O₂在反应体系中的浓度为0.5mmol/L。

设置用水替代待测样本的空白对照。

结果如图2所示。结果表明，miR21浓度在0.1-1μmol/L范围内呈良好的线性关系，并且根据3σ/slope原理计算得到最低检测限为4.5nmol/L。

实施例4、特异性

1、以miR21为模板设计一系列碱基错配的序列，并从其他不同miRNA家族中挑选几种不同的miRNA做特异性评价，使用的miRNA见表2。

表2评价MG41探针的特异性相关的序列

2、采用实施例3中的方法进行检测。设置每个miRNA单独检测的样本和将所有miRNA混合(混合样本具体是miR21、miR15a、miR122、miR155、miR17和miR4a按照等浓度进行混合)检测的样本。其中miR21和所有对照序列在体系中的浓度为0.5μmol/L，其他成分浓度不变。

检测结果如图3所示。图3A为碱基错配识别结果，结果显示目标miR21的A₀-A值明显高于碱基错配的差值强度，而且三碱基突变和含3′端碱基突变的序列几乎没有信号，说明该方法能达到特定位置的单碱基错配识别的效果；图3B为其他miRNA的识别结果，结果显示该探针对目标分子miR21的识别程度普遍高于其他家族的miRNA，并且几种miRNAs混合之后仍能达到与纯的miR21几乎一致的检测效果，进一步说明该方法的高度选择识别能力。

实施例5、对癌细胞系MCF-7中miR21进行检测

1、提取癌细胞系MCF-7(ATCC细胞库)和正常细胞MCF-10A(ATCC细胞库)的总RNA。

2、采用实施例3中的方法进行检测。其中总RNA在体系中加入量为5μg，其他成分浓度不变。

结果如图4所示。结果显示，癌细胞MCF-7的miR21含量明显高于正常细胞MCF-10A，说明该方法可以检测实际样本是否含有miR21。

序列表

<110> 中国科学院化学研究所

<120> 一种基于G-四链体探针结构解旋的可视化识别microRNA的检测方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgagggtggg tagggtgggt caacatcagt cagataagct a 41

Claims

1.一种检测microRNA的方法，包括如下步骤：合成探针；所述探针由结合区段和信号区段组成；所述结合区段为与目标microRNA的全长序列反向互补的DNA片段；所述信号区段为可形成G-四链体结构的DNA片段；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述方法包括如下步骤：

(1)合成权利要求1中所述的探针；

(3)将步骤(2)的探针与待测样本进行DNA/RNA杂化反应；

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

4.如权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于：所述探针的信号区段的长度小于30bp；所述信号区段形成G-四链体结构时，四联体层数小于等于3。

5.如权利要求1至4任一所述的方法，其特征在于：所述信号区段如序列表的序列1自5’端第1至19位所示。

6.如权利要求1至5任一所述的方法，其特征在于：所述DNA聚合酶为Klenow Fragment聚合酶。

7.如权利要求2至6任一所述的方法，其特征在于：

所述步骤(3)中，所述探针在DNA/RNA杂化反应体系中的浓度为0.5-1μmol/L；

和/或，所述杂化反应温度为20℃-37℃；

和/或，所述杂化反应时间为60-120min；

所述步骤(4)中，所述DNA聚合酶在解旋扩增反应体系中的浓度为0.1-0.3unit/μL；

和/或，所述解旋扩增反应时间为40-60min；

所述步骤(5)中，所述血红素在反应体系中的浓度为2-4μmol/L；

和/或，所述反应时间为1-2h；

和/或，所述反应温度为20℃-37℃。

8.权利要求1至7中任一所述的探针在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为检测目标microRNA。

9.一种检测microRNA的试剂盒，含有权利要求1至7中任一所述的探针。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有记载权利要求1至7任一所述方法的说明书。