CN111560377A - 一种多价核酸及其在制备malat1检测试剂盒中的用途 - Google Patents

一种多价核酸及其在制备malat1检测试剂盒中的用途 Download PDF

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张婷
曾珍
朱云柯
刘成武
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Abstract

本发明公开了一种多价核酸，属于分子检测领域。本发明的多价核酸由MALAT1适配体和1～4条核酸单链通过部分序列碱基互补配对构成；适配体和不同核酸单链的摩尔比为1：1；前述适配体与核酸单链的1个或2个末端共价连接荧光基团或荧光淬灭基团；荧光基团和淬灭基团总数分别大于0且相同，所有荧光基团和淬灭基团因碱基互补配对而成对地靠近，荧光基团一一被荧光淬灭基团抑制荧光信号。本发明的多价核酸可作为探针，在室温下检测长链非编码RNA MALAT1，应用前景广阔。

Description

一种多价核酸及其在制备MALAT1检测试剂盒中的用途
技术领域
本发明属于分子检测领域。
背景技术
癌症又称恶性肿瘤，是威胁世界健康的一个关键因素，是世界范围内由疾病引起死亡的一个主要原因。最为常见的癌症类型为：肺癌、肝癌、结肠直肠癌、胃癌和乳腺癌。迁移，侵袭和转移是恶性肿瘤的特征之一，其中癌症转移是癌症复发和与肿瘤相关的死亡的主要原因。
目前对于大多数转移机制的研究都集中在蛋白质编码基因上，尽管大量的编码基因会转录但未翻译。这些转录但未被翻译的RNA称为长的非编码RNA(lncRNA)。lncRNA是一类位于细胞核或细胞质内结构类似mRNA、长度大于200个核苷酸的不具有可读框的转录本。这些lncRNA通过参与很多细胞的增殖、生长和凋亡的代谢过程从而调控癌症的转移。长非编码RNA(lncRNA)是长链非编码RNA在各种疾病中的作用已得到广泛重视。其中MALAT1是一种典型的多功能非编码RNA，可促进诱导上皮-间质转化的肿瘤转移，上调肺癌的转移水平。
肺癌转移相关基因转录本(MALAT)1，也称为MALAT1，是一种高度保守的lncRNA,是肺癌转移发展的预测标记。在肺癌组织中，MALAT1会积极调节一系列转移相关基因的表达，促进癌症转移。特别的，MALAT1被鉴定为非小细胞肺癌(NSCLC)转移的预后指标，影响NSCLC细胞的生长和集落，特别是在肺腺癌的早期阶段。因此，MALAT1可以被作为肺癌诊断相关核酸生物传感器的目标检测物。
长链非编码RNA(lncRNA)的序列长，检测方法很多。
芯片技术、实时荧光定量RT-PCR、荧光原位杂交法等方法均可用于lnRNA的检测。lncRNA定量分析最常用方法是RT-PCR,核质分离RT-PCR用于lnRNA的定位分析。但是这些实验步骤繁琐,操作复杂，不便于推广。
分子信标是一种荧光标记的寡核苷酸链，一般有三部分组成：①环状区：由15～30个可以与靶分子特异结合的核苷酸组成；②茎干区：一般由5～8个可发生可逆性解离的碱基对组成；③荧光基团和淬灭基团：分子信标的两个末端分别标记荧光基团和淬灭基团。没有靶分子的时候，分子信标的荧光和淬灭基团靠得很近，荧光被淬灭。与靶分子结合后，分子信标的空间构型发生改变，导致荧光恢复。但该方法需要对样品和分子信标加热，使原有的双链打开，再降温，才能实现分子信标与靶分子的结合，这使得其检测场景受到一定的限制。另外，分子信标的灵敏度一般在nM级(例如：李晨，新型荧光探针检测平台的构建及其在miRNA-21和UDG检测中的应用，湖南大学，2015)，对某些微量样本的检测可靠性不高。
发明内容
本发明要解决的问题是：提供一种特异性高，且适用于室温下检测MALAT1的多价核酸。
本发明的多价核酸由特异性识别MALAT1的核酸适配体(Aptamer)(简称“MALAT1适配体”)与其他核酸单链通过部分碱基互补配对构成，互补配对的链末端具有荧光基团和荧光淬灭基团，当检测环境中存在MALAT1时，MALAT1会与前述其他核酸单链竞争性结合MALAT1适配体，造成前述多价核酸的碱基对打开，荧光基团和荧光淬灭基团分离，发出荧光，达到检测MALAT1的目的。
本发明的技术方案如下：
一种多价核酸，它由MALAT1适配体和1～4条核酸单链通过部分序列碱基互补配对构成；适配体和不同核酸单链的摩尔比为1：1；
前述适配体与核酸单链的1个或2个末端共价连接荧光基团或荧光淬灭基团；
荧光基团和淬灭基团总数分别大于0且相同，所有荧光基团和淬灭基团因碱基互补配对而成对地靠近，荧光基团一一被荧光淬灭基团抑制荧光信号。
如前述的多价核酸，所述MALAT1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
如前述的多价核酸，每分子多价核酸中，所述核酸单链数量为1，其序列如SEQ IDNO.2或3所示；
优选的，所述核酸单链的序列如SEQ ID NO.3所示，荧光基团和荧光淬灭基团总数各为2。
如前述的多价核酸，每分子多价核酸中，所述核酸单链的数量为2，其序列分别如SEQ ID NO.4和5所示；荧光基团和荧光淬灭基团总数各为3。
如前述的多价核酸，每分子多价核酸中，所述核酸单链的数量为3，其序列分别如SEQ ID NO.6～8所示；荧光基团和荧光淬灭基团总数各为4。
如前述的多价核酸，每分子多价核酸中，所述核酸单链的数量为4，其序列分别如SEQ ID NO.9～12所示；荧光基团和荧光淬灭基团总数各为5。
前述的多价核酸的制备方法，包括：将所述MALAT1适配体和核酸单链按相同物质的量混合，并加入缓冲液和水，得到混合体系，于65～100摄氏度下孵育2～10min，再于室温下孵育20～60min；
所述缓冲液中含有缓冲盐，使得混合体系的pH为7.0～8.5；缓冲液中还有镁离子、钾离子，镁离子浓度为1～200mM，钾离子浓度为300～800mM。
如前述的方法，得到混合体系后，于90摄氏度孵育5min，再于室温孵育30min；
和/或，混合体系中的pH值为7.9；
和/或，混合体系中镁离子浓度为10mM；
和或，混合体系中钾离子浓度为66mM。
前述的多价核酸在制备MALAT1检测试剂盒中的用途。
前述的多价核酸在制备肺癌诊断试剂盒中的用途。
一种检测MALAT1的试剂盒，它包括前述的多价核酸。
本发明具有如下有益效果：
1)本发明的多价核酸能在室温下检测MALAT1。
2)本发明的多价核酸检测MALAT1的灵敏度很高，最低能检测到浓度为7.445pM的MALAT1，能提高对微量甚至痕量样本的检测可靠性。
3)本发明的多价核酸检测MALAT1的特异性高，最高可分辨单碱基差别的目的核酸片段。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：采用本发明提供的多价核酸检测MALAT1的原理示意图。
图2：多价核酸检测MALAT1产生的信噪比测试结果图。
图3：多价核酸检测MALAT1产生荧光与MALAT1浓度的标准曲线。
图4：采用3V多价核酸检测病人肺癌组织和癌旁组织中MALAT1的结果。
图5：采用4V多价核酸检测病人肺癌组织和癌旁组织中MALAT1的结果。
图6：MALAT1选择特异性图。
具体实施方式
实施例1制备多价核酸溶液
按照表1合成所需序列。其中1V-T、2V-T、3V-T、4V-T和5V-T为MALAT1适配体，5条适配体的核苷酸序列一致，仅两端荧光、淬灭基团可能不同。
表1构成多价核酸的单链脱氧核酸序列
Figure BDA0002494404410000041
Figure BDA0002494404410000051
注：F，荧光基团；Q，淬灭基团。
再按照如下方法制备多价核酸：
①1V多价核酸溶液的制备
将3.5μL浓度为1μM的1V-T脱氧核酸溶液,3.5μL浓度为1μM的1V-1脱氧核酸溶液，加入到14μL缓冲液中，加入10.5μL超纯水，得混合体系，混合体系的pH值为7.9，置于PCR管中，保持总体积31.5μL。在90℃下孵育5min，室温下孵育30min，形成1V多价核酸溶液。
②2V多价核酸溶液的制备
依次使用2V-T代替浓度①中的1V-T,2V-1代替①中的1V-1，重复步骤①的操作，制备2V多价核酸溶液。
③3V多价核酸溶液的制备
将3.5μL浓度为1μM的3V-T脱氧核酸溶液,3.5μL浓度为1μM的3V-1脱氧核酸溶液，3.5μL浓度为1μM的3V-2脱氧核酸溶液，加入到14μL缓冲液(phi29buffer:330mM Tris-HCl，100mM MgCl2，660mM KCl，pH＝7.9)中，加入7μL超纯水，置于PCR管中，保持总体积31.5μL。在90℃下孵育5min，室温下孵育30min，形成3V多价核酸溶液。
④4V多价核酸溶液的制备
将3.5μL浓度为1μM的4V-T脱氧核酸溶液,3.5μL浓度为1μM的4V-1脱氧核酸溶液，3.5μL浓度为1μM的4V-2脱氧核酸溶液，3.5μL浓度为1μM的4V-3脱氧核酸溶液，加入到14μL缓冲液(phi29 buffer:330mM Tris-HCl，100mM MgCl2，660mM KCl，pH＝7.9)中，加入3.5μL超纯水，置于PCR管中，保持总体积31.5μL。在90℃下孵育5min，室温下孵育30min，形成4V多价核酸溶液。
⑤5V多价核酸溶液的制备
将3.5μL浓度为1μM的5V-T脱氧核酸溶液,3.5μL浓度为1μM的5V-1脱氧核酸溶液，3.5μL浓度为1μM的5V-2脱氧核酸溶液，3.5μL浓度为1μM的5V-3脱氧核酸溶液，3.5μL浓度为1μM的5V-4脱氧核酸溶液，加入到14μL缓冲液(phi29 buffer:330mM Tris-HCl，100mMMgCl2，660mM KCl，pH＝7.9)中，置于PCR管中，保持总体积31.5μL。在90℃下孵育5min，室温下孵育30min，形成5V多价核酸溶液。
实施例1制备得到的多价核酸，等同于本发明的荧光传感器。
实施例2信噪比检测
本实施例中，比较多价核酸荧光传感器产生的信噪比结果,步骤如下：
①取实施例1①中制备的1V多价核酸溶液，向其中加入3.5μL浓度为1μM的MALAT1核酸溶液，在室温静置，避光2.5h进行反应，然后测定反应混合液的荧光强度，记录该1V多价核酸溶液体系中MALAT1核酸溶液对应的荧光强度，记为信号值。用3.5μL的超纯水代替1μM的MALAT1核酸溶液，在室温静置，避光2.5h进行反应，然后测定反应混合液的荧光强度，记录该1V多价核酸溶液体系中超纯水对应的荧光强度，记为背景值。重复3次，计算该多价核酸体系得到的信噪比。
分别取实施例1②，③，④，⑤中制备的2V，3V，4V，5V多价核酸溶液代替实施例1①制备的的1V多价核酸溶液，重复本实施例步骤①的操作，得到1V-5V多价核酸体系得到的信噪比，如图2所示。
结论：本发明的多价核酸溶液3V体系检测信噪比最高，达到6.48，能够满足日常检测需求。
实施例3标准曲线
本实施例中，绘制标准溶液曲线，步骤如下：
①取实施例1制备的1V多价核酸溶液一份(31.5μL)，向其中加入3.5μL浓度为0mol的MALAT1溶液，在室温静置，避光2.5h进行反应，然后测定反应混合液的荧光强度，记录1V多价核酸溶液体系中该MALAT1浓度下的荧光强度
②依次使用MALAT1浓度分别为10-8、7.5×10-9、5×10-9、2.5×10-9、10-9、5×10-10、10-10、10-11、10-12、10-13mol/L的MALAT1溶液代替步骤①中的使用的MALAT1溶液,重复步骤①的操作,测定荧光吸收值，以MALAT1溶液浓度为横坐标，以该MALAT1溶液浓度下的荧光强度为纵坐标绘制标准曲线。拟合出的标准曲线的回归方程为y＝-0.8819x+7.9314，LOD(最低检测限)＝1.364nM其中，y代表荧光强度，x代表MALAT1浓度。
③依次使用实施例1制备的2V，3V,4V,5V多价核酸溶液代替①中的1V体系，重复步骤①，②，拟合出2V多价核酸体系的标准曲线的回归方程为y＝-0.7423x+6.7765，LOD＝1.04nM，3V多价核酸体系的标准曲线的回归方程为y＝-0.2634x+2.9655，LOD＝13.121pM，4V多价核酸体系的标准曲线的回归方程为y＝-0.2203x+2.6469，LOD＝7.445pM，5V多价核酸体系的标准曲线的回归方程为y＝-0.4263x+4.3366，LOD＝0.2527nM。其中，y代表荧光强度，x代表MALAT1浓度。标准曲线如图3所示。
本实施例除了获得标准曲线以外，还表明：本发明的多价核酸作为探针检测MALAT1时，灵敏度极高，最低检测限为7.445pM。
实施例4使用3V多价核酸进行临床检测
本实施例中，采用3V多价核酸检测来自12肺癌病人癌症组织和癌旁组织中MALAT1的浓度，并分析其显著性差异，步骤如下：
(1)取12个的肺癌病人癌症组织和癌旁组织的，依次记作1#～12#，癌症组织记为C，癌旁组织记为A，提取1#～12#组织的总RNA。
(2)组织样品总RNA的MALAT1检测
①取实施例1中制备的3V多价核酸溶液两份(31.5μL)，依次向其中加入3.5μL的1#A和1#C样品溶液，在室温静置，避光2.5h进行反应，然后测定反应混合液的荧光强度。
②依次使用2#～12#肺癌病人的癌症组织和癌旁组织代替步骤①中的1#样品溶液，重复步骤①的操作，得到2#～12#肺癌病人样品的荧光强度值并记录；
③将1#～12#肺癌病人的癌症和癌旁组织总RNA溶液的荧光强度值，分别代入标准曲线的回归方程中，计算出各病人癌症组织和癌旁组织中MALAT1的浓度，结果如图4所示，其中有十个病人的癌症组织和癌旁组织中MALAT1的含量具有显著性差异。
实施例5使用4V多价核酸进行临床检测
本实施例中，采用4V多价核酸检测来自12肺癌病人癌症组织和癌旁组织中MALAT1的浓度，并分析其显著性差异，步骤如下：
(1)取12个的肺癌病人癌症组织和癌旁组织的，依次记作1#～12#，癌症组织记为C，癌旁组织记为A，提取1#～12#组织的总RNA。
(2)组织样品总RNA的MALAT1检测
①取实施例1中制备的4V多价核酸溶液两份(31.5μL)，依次向其中加入3.5μL的1#A和1#C样品溶液，在室温静置，避光2.5h进行反应，然后测定反应混合液的荧光强度。
②依次使用2#～12#肺癌病人的癌症组织和癌旁组织代替步骤①中的1#样品溶液，重复步骤①的操作，得到2#～12#肺癌病人样品的荧光强度值并记录；
③将1#～12#肺癌病人的癌症和癌旁组织总RNA溶液的荧光强度值，分别代入标准曲线的回归方程中，计算出各病人癌症组织和癌旁组织中MALAT1的浓度，结果如图5所示，其中有十个病人的癌症组织和癌旁组织中MALAT1的含量具有显著性差异。
实施例6选择特异性
核酸检测中，经常会因为靶序列和探针间存在不完全匹配而影响检测特异性。
本实施例中，检测MALAT1选择特异性，步骤如下：
(1)用超纯水分别配制浓度为1μM的MALAT1、MALAT1-a MALAT1-b、MALAT1-c、MALAT1-d、MALAT1-e、MALAT1-f、MALAT1-g核酸溶液，其中MALAT1-a MALAT1-b、MALAT1-c、MALAT1-d、MALAT1-e、MALAT1-f、MALAT1-g是在MALAT1基础上发生1～3碱基突变的序列。
序列如下(小写字母为突变碱基)：
表2检测靶标的序列
Figure BDA0002494404410000081
(2)取实施例1中制备的1V，2V，3V，4V，5V多价核酸溶液各一份(31.5μL)，依次向其中加入溶液3.5 μL浓度为1μM的MALAT1溶液，在室温静置，避光2.5h进行反应，在激发波长480nm,发射波长510nm-600nm处测定荧光强度。
依次使用MALAT1-a、MALAT1-b、MALAT1-c、MALAT1-d、MALAT1-e、MALAT1-f、MALAT1-g代替(2)中的MALAT1,重复(2)的操作，测定荧光强度值并记录。绘制选择性图，如图6示。
结果显示，本发明的多价核酸与MALAT1相差2碱基以上的序列产生的荧光信号与空白对照(水)相当，不会形成假阳性；5V多价核酸甚至可区分MALAT1和与之相差1碱基的序列。
结论：本发明的多价核酸具有十分高的特异性。
实施例7反应时间对检测结果的影响
①取实施例1中制备的3V多价核酸溶液一份，向其中加入3.5μL浓度为1μM的MALAT1核糖核酸溶液，在室温放置2.5h进行置换反应，然后测定反应混合液的荧光强度，记录该浓度MALAT1核糖核酸溶液对应的荧光强度为1230±21a.u；
②取实施例1中制备的3V多价核酸溶液一份，向其中加入3.5μL浓度为1μM的MALAT1核糖核酸溶液，在室温放置2h进行置换反应，然后测定反应混合液的荧光强度，记录该浓度MALAT1核糖核酸溶液对应的荧光强度为760±23；
③取实施例1中制备的3V多价核酸溶液一份，向其中加入3.5μL超纯水，在室温放置2.5h进行置换反应，然后测定反应混合液的荧光强度，记录该浓度MALAT1核糖核酸溶液对应的荧光强度为478±11a.u；
结论：对比①，②，③的荧光强度发现，室温放置2.5h的检测效果优于放置2h的效果。
综上，本发明的多价核酸能在室温下检测MALAT1，且检测灵敏度、特异性高。将其用于制备检测试剂盒，应用前景广阔。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学华西医院
<120> 一种多价核酸及其在制备MALAT1检测试剂盒中的用途
<130> GYKH1094-2020P019901CC20JS022
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgtttctttt cct 13
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cttaggtctg tctagatgaa acat 24
<210> 13
<211> 36
<212> RNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 13
cuuaggucug ucuagaaucc uaaaggcaaa ugacuc 36
<210> 14
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cuuaggugug ucuagaaucc uaaaggcaaa ugacuc 36
<210> 15
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cuuaggucug ucuagaaucc uaaaggcaua ugacuc 36
<210> 16
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cuuaggucug ucuagaaugc uaaaggcaaa ugacuc 36
<210> 17
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cuuaggugug ucuagaaucc uaaaggcaua ugacuc 36
<210> 18
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cuuaggugug ucuagaaugc uaaaggcaaa ugacuc 36
<210> 19
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cuuaggucug ucuagaaugc uaaaggcaua ugacuc 36
<210> 20
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cuuaggugug ucuagaaugc uaaaggcaua ugacuc 36

Claims (11)

1.一种多价核酸，其特征在于：它由MALAT1适配体和1～4条核酸单链通过部分序列碱基互补配对构成；适配体和不同核酸单链的摩尔比为1：1；
前述适配体与核酸单链的1个或2个末端共价连接荧光基团或荧光淬灭基团；
荧光基团和淬灭基团总数分别大于0且相同，所有荧光基团和淬灭基团因碱基互补配对而成对地靠近，荧光基团一一被荧光淬灭基团抑制荧光信号。
2.如权利要求1所述的多价核酸，其特征在于：所述MALAT1的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
3.如权利要求2所述的多价核酸，其特征在于：每分子多价核酸中，所述核酸单链数量为1，其序列如SEQ ID NO.2或3所示；
优选的，所述核酸单链的序列如SEQ ID NO.3所示，荧光基团和荧光淬灭基团总数各为2。
4.如权利要求2所述的多价核酸，其特征在于：每分子多价核酸中，所述核酸单链的数量为2，其序列分别如SEQ ID NO.4和5所示；荧光基团和荧光淬灭基团总数各为3。
5.如权利要求2所述的多价核酸，其特征在于：每分子多价核酸中，所述核酸单链的数量为3，其序列分别如SEQ ID NO.6～8所示；荧光基团和荧光淬灭基团总数各为4。
6.如权利要求2所述的多价核酸，其特征在于：每分子多价核酸中，所述核酸单链的数量为4，其序列分别如SEQ ID NO.9～12所示；荧光基团和荧光淬灭基团总数各为5。
7.权利要求1～6所述的多价核酸的制备方法，其特征在于：包括：将所述MALAT1适配体和核酸单链按相同物质的量混合，并加入缓冲液和水，得到混合体系，于65～100摄氏度下孵育2～10min，再于室温下孵育20～60min；
所述缓冲液中含有缓冲盐，使得混合体系的pH为7.0～8.5；缓冲液中还有镁离子、钾离子，镁离子浓度为1～200mM，钾离子浓度为300～800mM。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：
得到混合体系后，于90摄氏度孵育5min，再于室温孵育30min；
和/或，混合体系中的pH值为7.9；
和/或，混合体系中镁离子浓度为10mM；
和或，混合体系中钾离子浓度为66mM。
9.权利要求1～6所述的多价核酸在制备MALAT1检测试剂盒中的用途。
10.权利要求1～6所述的多价核酸在制备肺癌诊断试剂盒中的用途。
11.一种检测MALAT1的试剂盒，其特征在于：它包括权利要求1～6所述的多价核酸。
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