CN105506138B - Ret融合基因arms荧光定量pcr分型检测试剂盒 - Google Patents

Ret融合基因arms荧光定量pcr分型检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了RET融合基因ARMS荧光定量PCR分型检测试剂盒，涉及7种常见KIF5B‑RET融合基因变体和1种RET融合基因型ARMS‑qPCR检测的引物及探针、检测试剂盒，RET融合基因突变包括KR1(K15：R12)、KR2(K16：R12)、KR3(K23：R12)、KR4(K24：R8)、KR5(K22：R12)、KR6(K24：R11)、KR7(K15：R11)以及最新发现的NR8(N6：R12)八种融合变体，本发明检测不仅快速、高效、灵敏，而且其结果的判读非常明确、直观，结果可靠、特异，利用本发明所述引物及探针、试剂盒可以有效的检出8种RET融合基因突变。

Description

RET融合基因ARMS荧光定量PCR分型检测试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学基因检测领域，涉及RET融合基因ARMS荧光定量PCR分型检测试剂盒，具体涉及7种最常见KIF5B-RET融合基因变体和1种最新发现的RET融合基因型ARMS-qPCR检测的试剂盒，适用于肺腺癌中RET融合基因突变的检测。
背景技术
肺癌是全世界范围死亡率最高的肿瘤，其死亡率亦居肿瘤之首，主要包括小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)两类，其中NSCLC包括鳞癌、腺癌、腺鳞癌、大细胞癌、类癌等。在我国，肺癌病死率已居肿瘤死亡率首位，其中NSCLC发病率占所有肺癌发病率的80％，每年新发肺癌病例约为150万。NSCLC的治疗包括手术、化疗、放疗、分子靶向治疗及生物免疫治疗等多种方法。进入21世纪后，随着基础、临床研究的发展与检测技术的进步，肺癌的治疗经历了依靠病理分型到分子分型的转变，使其更加精准化和个体化。根据分子标志筛选特定的疾病人群，应用阻断此标志的化合物来抑制肿瘤生长已成为治疗肺癌的新思路。肺癌靶向治疗涉及肿瘤细胞生长的多个重要环节，目前研究较为成熟且应用于临床的主要有两个作用点，一个是血管内皮生长因子受体(VEGFR)，另一个为表皮生长因子受体(EGFR)；此外，还有最新发现的KIF5B-RET融合基因。总的来说，人们对肺癌的理解已经进入分子水平，临床诊治实践也已走入分子时代；基于分子靶点的肺癌分型由单基因检测向多基因或全基因组分析转变，针对特定靶点的个体化治疗是未来的治疗方向。
2012年2月12日，日美三个研究小组(日本癌症研究会和自治医科大学小组、日本国立癌症研究中心小组、美国的研究所及名古屋市立大学小组)在美国《自然·医学》(Nature Medicine)杂志(网络版)同时发文，宣布已发现会引发肺腺癌的异常基因。该异常基因名为“KIF5B-RET融合基因”，是由两个基因在某种原因下融合形成的。KIF5B-PET融合基因是一种新的致癌驱动突变，存在于一部分非小细胞肺癌中，多为不吸烟或少吸烟的腺癌患者，其存在与其他已知的基因改变如EGFR、K-Ras、ALK等相互排斥，KIF5B-RET融合基因成为非小细胞肺癌个体化治疗的一个分子靶点。虽然KIF5B-RET融合基因在肺癌中的发生率很低，但由于肺癌在全世界高发，如能结合临床病理学特点，对EGFR突变、EML4-ALK基因均阴性的腺癌患者进一步检测KIF5B-RET融合基因，阳性患者进行针对RET的靶向治疗，相信会使众多肺癌患者获益。目前为止检测到的KIF5B-RET阳性患者病理类型均为肺腺癌，但由于相关研究很少，是否在其他类型肺癌中存在该融合基因尚不明确，有待进一步研究。KIF5B-RET阳性患者的临床特点与EGFR、EML4-ALK阳性患者具有相似性，多为不吸烟或少吸烟的腺癌患者。目前为止，由于相关研究尚少，该融合基因与性别、肿瘤分化程度、预后等的关系尚不明确。
RET原癌基因发现于1985年，因其具有转化培养中小鼠NTH/3T3细胞的能力而被确认为原癌基因。RET原癌基因位于10号常染色体长臂(10q11.2)，全长60kb，包含21个外显子，编码1100个氨基酸的酪氨酸激酶受体超家族RET蛋白，其包括富含半胱氨酸的胞外区、跨膜区和胞内区即酪氨酸激酶(tyrosine kinase，TK)的部分，与其他染色体易位或10号染色体发生倒置可使RET活化。KIF5B基因位于10号常染色体短臂(10p11.22)，KIF5B蛋白属于Kinesin驱动蛋白家族，可以沿着细胞微管运动，与多种细胞器以及胞内载体运动有关，具有一个为人熟知的蜷曲螺旋结构，可以使RET蛋白聚合从而导致自体活化，自发诱导下游磷酸化信号转导。KIF5B和RET分别位于10p11.22和10q11.21，相距10.6Mb，通过臂间倒位后相融合，形成KIF5B-RET融合基因。据相关研究报道，KIF5B和RET双螺旋DNA的融合断点并非完全一致，目前已发现KIF5B-RET至少存在以下7种变体：KR1(KIF5B外显子15/RET外显子12融合，K15：R12)、KR2(KIF5B外显子16/RET外显子12融合，K16：R12)、KR3(KIF5B外显子23/RET外显子12融合，K23：R12)、KR4(KIF5B外显子24/RET外显子8融合，K24：R8)、KR5(KIF5B外显子22/RET外显子12融合，K22：R12)、KR6(KIF5B外显子24/RET外显子11融合，K24：R11)、KR7(KIF5B外显子15/RET外显子11融合，K15：R11)。KIF5B-RET融合蛋白由卷曲螺旋域和蛋白激酶域组成，卷曲螺旋域诱导融合激酶二聚体化，从而使蛋白酪氨酸激酶域自身磷酸化而激活。
国际上尚无标准的、快速简便的检测KIF5B-RET的方法，使其临床应用推广受到限制。未来的挑战是寻找最佳的KIF5B-RET融合基因检测方法，能简单、方便、快速和经济地鉴定出KIF5B-RET融合基因的靶向人群，真正实现以KIF5B-RET融合基因为靶点的个体化治疗。
目前，检测鉴定融合基因KIF5B-RET的方法主要有：测序法、免疫组化(IHC)、荧光原位杂交(FISH)法、反式逆转录PCR(RT-PCR)方法、cDNA末端快速扩增技术
测序法包括直接测序、二代测序技术、高通量测序技术，测序法的结果虽然具有客观性和特异性，但其操作过程复杂，且要涉及到PCR扩增后的操作，因此易被污染，造成结果的不理想；并且检测费用高、周期长，测序结果的判读也较复杂、费时。
免疫组化(IHC)是一种较简便实用的检查手段，该法可在不损伤细胞结构特征的条件下，通过检测肿瘤特异性抗原的表达与正常组织鉴别。但KIF5B-RET基因在NSCLC中的表达较低。而且KIF5B-RET变异体较多，难以进一步检测。与外科手术切除标本相比，肺组织活检标本中KIF5B-RET基因的检测敏感性低，结果具有局限性，另外IHC方法总是存在一定的主观性，对弱阳性结果的判断需要进一步用FISH等技术来验证，且IHC不能鉴定KIF5B-RET融合患者具体属于那种变体。
荧光原位杂交(FISH)法是通过不同颜色的荧光信号来检测基因重排的RET，用2种不同标记的探针检测RET基因断裂点的相对两端，正常的RET显示出黄色信号，而发生重排的RET显示出分离的红色和绿色信号，只要RET发生基因重排均可检出。FISH的优点是可以从病理切片或细胞涂片上检测少数细胞的融合变异，假阳性率低。然而这种检测方法使样品组织的形态受到破坏，所观察到的信号同样不能区分不同的KIF5B-RET的变异体，其结果还会受到一些因素的影响，如标本的固定、考片温度、蛋白质消化不当等都会造成信号减弱或无信号，且价格昂贵造成其不适合成为KIF5B-RET融合基因的普及筛查。
反式逆转录PCR(RT-PCR)方法检测是一种快速的、敏感的诊断KIF5B-RET融合基因的方法，但该法需要高纯度的mRNA，而临床上多数患者的组织标本都用福尔马林固定、蜡块包埋，难以提取出高质量RNA。而且由于KIF5B-RET的变异体较多，要检测所有已知融合基因的转录产物，需要多组引物才能完成，假阳性率高。RT-PCR技术对实验室也有较高要求，难以使KIF5B-RET检测成为常规项目。
扩增阻碍突变系统(Amplification Refractory Mutation System,ARMS)也称为等位基因特异性扩增法(Allele-specific amplification,ASA)或等位基因特性PCR(allele-specific PCR,ASPCR)，于1989年建立，是PCR技术应用的发展，用于对已知突变基因进行检测。ARMS的基本原理是PCR扩增时引物是否能延伸主要取决于引物3′端的1～2个碱基是否与模板配对，如果不配对则引物不能延伸，故只要能设计适当的引物，就可以区别正常和突变的DNA序列。该法首先设计两个5′端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3′端引物进行两个平行PCR，只有与突变DNA完全互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于引物的3′端则导致PCR不能延伸，则称为ARMS。即在PCR扩增时，引物的延伸是从其3'未端开始的，而这种延伸的进行要求引物3'端的碱基与模板需完全配对，只有这样引物才能延伸，扩增才得以进行下去而得到预期的扩增产物，若引物3'端与模板不能配对，则引物的延伸即阻断，不能得到相对应的扩增产物。ARMS借鉴多重PCR原理，可在同一系统中同时检测两种或多种等位基因突变位点。利用该系统进行基因突变检测时不仅能检出突变的纯合子，而且能检出杂合子个体，在这种情况下，同一个体的DNA模板利用突变引物和正常引物均能引发扩增反应，利用多对突变引物和正常引物进行多重3'特异PCR，可使DNA分子上的多位点突变的鉴定准确，快速，简便。
实时荧光定量PCR技术(real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，它是一种在PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时，探针结合在DNA任一一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。
RT-ARMS-qPCR(real time-amplification refractory mutation system-quantitative PCR)技术基于实时PCR平台，结合ARMS突变富集和qPCR特异性荧光检测两种技术对微量突变进行检测。利用ARMS引物对突变靶序列进行特异性PCR扩增，Taqman探针对扩增产物进行特异性位点检测，在实时PCR基础上鉴定特定突变，基本原理是：针对多个突变类型序列，分别设计多条引物，多个融合基因特异上游引物和一个通用下游引物(突变型上游引物F，通用下游引物R)，结合实时荧光定量PCR技术，在PCR扩增时同时加入一个特异性的荧光探针，实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，直接达到一个反应管内同时检测并区分多个融合突变型基因的目的。
针对RET融合基因突变，如何进行行之有效的检测，是本领域技术人员面临的技术难题。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种能快速、准确、高敏感度的检测7种最常见KIF5B-RET融合基因变体和1种最新发现的RET融合基因型的ARMS-qPCR检测引物及探针、检测试剂盒。
本发明中的试剂盒结合能特异检测含已知突变位点的ARMS系统及荧光定量PCR技术，建立RT-ARMS-qPCR方法检测RET融合基因，包括KR1(KIF5B外显子15/RET外显子12融合，K15：R12)、KR2(KIF5B外显子16/RET外显子12融合，K16：R12)、KR3(KIF5B外显子23/RET外显子12融合，K23：R12)、KR4(KIF5B外显子24/RET外显子8融合，K24：R8)、KR5(KIF5B外显子22/RET外显子12融合，K22：R12)、KR6(KIF5B外显子24/RET外显子11融合，K24：R11)、KR7(KIF5B外显子15/RET外显子11融合，K15：R11)以及最新发现的NR8(NCOA4外显子6/RET外显子12融合，N6：R12)八种融合变体，建立检测7种最常见KIF5B-RET融合基因变体和1种最新发现的RET融合基因型的RT-ARMS-qPCR体系。
具体涉及以下技术方案：
首先，本发明提供一种用于检测RET融合基因突变的核苷酸序列组合，其包含：
(1)用于检测RET融合基因KR1、KR2、KR3、KR5、NR8的引物和探针：
正向引物序列为：
KR1-Forward Primer：5’-GGGAAATAATGATGTAAAGGAGGATC-3’(SEQ ID NO:1)、
KR2-Forward Primer：5’-TCGTATCTCTCAAGAGGATCCAAA-3’(SEQ ID NO:2)、
KR3-Forward Primer：5’-GCACAAACAGGAGGATCCAAA-3’(SEQ ID NO:3)、
KR5-Forward Primer：5’-CAAGAGTTAAAAAGGAGGATCCAAA-3’(SEQ ID NO:4)、
NR8-Forward Primer：5’-CCAGAGCAGGAGGATCCAAA-3’(SEQ ID NO:5)
共用反向引物序列为：
KR1-Reverse Primer:5’-AGGCCGTTGCCTTGACC-3’(SEQ ID NO:6)、
荧光探针序列为:
KR1-Taqman-Probe:5’-FAM-TAGGAGAAGGCGAATTT-MGB-3’(SEQ ID NO:7)；
荧光探针的5′端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团；
(2)用于检测RET融合基因KR4、KR6的引物和探针：
共用正向引物序列为：
KR4-Forward Primer：5’-CGCATAAAGGAAGCAGTCAGG-3’(SEQ ID NO:8)、
反向引物序列为：
KR4-Reverse Primer:5’-CCTCCTCGGCCACATCAAT-3’(SEQ ID NO:9)、
KR6-Reverse Primer:5’-CGCATAAAGGAAGCAGTCAGG-3’(SEQ ID NO:10)、
荧光探针序列为：
KR4-Taqman-Probe:5’-FAM-AAGAATATGGCCAGAAGAG-MGB-3’(SEQ ID NO:11)；
(3)用于检测RET融合基因KR7的引物和探针：
正向引物序列为：
KR7-Forward Primer：5’-CTTCAGAAACTTAAGGAAATGACCAA-3’(SEQ ID NO:12)、
反向引物序列为：
KR7-Reverse Primer:5’-CTTGTGGGCAAACTTTACATCATTA-3’(SEQ ID NO:13)、
荧光探针序列为:
KR7-Taqman-Probe:5’-FAM-ATGGCATCTTTACTAAAAG-MGB-3’(SEQ ID NO:14)。
RET融合基因ARMS荧光定量PCR检测试剂盒的原理为：分别针对7种最常见KIF5B-RET融合基因变体和1种最新发现的RET融合基因型序列特异设计TaqMan探针及引物；利用ARMS引物对突变靶序列进行特异性PCR扩增，Taqman探针对扩增产物进行特异性位点检测，在实时PCR基础上鉴定特定突变，基本原理是：针对多个突变类型，设计多条引物，多个融合基因特异上游引物和一个通用下游引物(突变型上游引物F，通用下游引物R)，结合实时荧光定量PCR技术，在PCR扩增时同时加入一个特异性的荧光探针，实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，直接达到一个反应管内同时检测并区分多个融合突变型基因的目的。
虽然ARMS-qPCR引物的设计，通常尽量在一个反应管内同时检测并区分多个融合突变型基因，但发明人在试验过程中发现，由于针对不同突变位置的因素，尤其是根据本发明目的需要检测7种最常见KIF5B-RET融合基因变体和1种最新发现的RET融合基因型这8中基因型时，设计共用反向引物或共用正向引物难度较大(基因型位点的位置等因素)，此外，多组引物在一个反应管内同时检测时，不仅存在相互干扰，而且假阳性率较高。因此，对于RT-ARMS-qPCR引物的设计，发明人通过多次调整和试验，将RET融合基因突变的8种突变型分成3组，每一组内正反向引物及探针均能够有效的实现扩增，不存在干扰，且特异性和扩增效率极高，本发明引物的设计除考虑引物的常规设计因素外，另外着重兼顾了扩增的特异性以及qPCR的扩增效率，通过多条设计引物的筛选，最终获得本发明所述序列组合。
此外，对于荧光定量PCR检测探针的设计，为了进一步增加荧光定量PCR扩增的特异性，本发明采用的TaqMan-MGB探针，与传统的TaqMan-TAMRA探针相比较，MGB探针具有提高TM值，使探针的长度缩短，并且提高配对与非配对模板间的TM值差异；提高信噪比，使实验结果更精确，分辨率更高；更简化实验，MGB探针实验优化步骤简单，杂交的稳定性大大提高，重复性大大提高等优势。
同时发明人对于荧光报告基团也进行了选择性优化，现有的荧光报告基团包括6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，FAM)、六氯-6-甲基荧光素(Hexachloro-6-methylfluorescein，HEX)、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素(tetrachloro-6-carboxyfluorescein，TET)、羧基-X-罗丹明(Carboxy-x-rhodamine，ROX)、6-羧基四甲基罗丹明(6-carboxytetramethylrhodamine，TAMRA)、磺酰罗丹明(Sulforhodamine 101，TexasRed)、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯(6-Carboxy-4’,5’-dichloro-2’,7’-dimethoxyfluorescein，JOE)、花菁3(cyanine3，Cy3)、花菁3.5(cyanine3.5，Cy3.5)、花菁5(cyanine5，Cy5)和花菁5.5(cyanine5.5，Cy5.5)等多种，发明人通过对探针5′端报告基团的选择，发现5′端标记FAM荧光报告基团与MGB型探针，其淬灭过程中荧光共振能量转移更好，产生背景干扰极少，荧光定量PCR过程中，基于能量转移迅速有效，淬灭基团和荧光基团分离较好，荧光曲线效果更优。。
本发明提供的两端都标有荧光发光基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5′端报告基团发出的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3′端淬灭基团淬灭，所以体系中没有荧光信号的变化。而一旦它与模板特异性的结合，其结合位点在两条引物之间，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶在链延伸过程中遇到与模板相结合的探针，其5′-3′外切酶活性就会将探针切断，荧光报告基团远离荧光淬灭基团，这样就破坏了两荧光基团之间的FRET，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。PCR每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模板DNA的拷贝数的多少。因此本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做样本具体含量的定量检测。
其次，本发明还涉及上述核苷酸序列组合在制备检测RET融合基因突变的试剂中的应用。
进一步的，本发明还涉及一种快速、准确检测RET融合基因的荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包含上述核苷酸序列组合。
优选的，该试剂盒包括荧光定量反应液预混液(PCR Master Mix)、荧光定量反应液A、荧光定量反应液B、荧光定量反应液C；阳性对照样品A、阳性对照样品B、阳性对照样品C。
荧光定量反应液A：检测的是RET融合基因KR1(KIF5B外显子15/RET外显子12融合)、KR2(KIF5B外显子16/RET外显子12融合)、KR3(KIF5B外显子23/RET外显子12融合)、KR5(KIF5B外显子22/RET外显子12融合)、NR8(NCOA4外显子6/RET外显子12融合)
反应体系包括：
(1)检测RET融合基因KR1、KR2、KR3、KR5、NR8的引物和探针：
正向引物序列为：
KR1-Forward Primer：5’-GGGAAATAATGATGTAAAGGAGGATC-3’(SEQ ID NO:1)、
KR2-Forward Primer：5’-TCGTATCTCTCAAGAGGATCCAAA-3’(SEQ ID NO:2)、
KR3-Forward Primer：5’-GCACAAACAGGAGGATCCAAA-3’(SEQ ID NO:3)、
KR5-Forward Primer：5’-CAAGAGTTAAAAAGGAGGATCCAAA-3’(SEQ ID NO:4)、
NR8-Forward Primer：5’-CCAGAGCAGGAGGATCCAAA-3’(SEQ ID NO:5)、
共用反向引物序列为：
KR1-Reverse Primer:5’-AGGCCGTTGCCTTGACC-3’(SEQ ID NO:6)、
荧光探针序列为:
KR1-Taqman-Probe:5’-FAM-TAGGAGAAGGCGAATTT-MGB-3’(SEQ ID NO:7)
(2)阳性对照样品A：包含所检测RET融合基因KR1、KR2、KR3、KR5、NR8基因组片断DNA质粒；
荧光定量反应液B：检测的是RET融合基因KR4(KIF5B外显子24/RET外显子8融合)、KR6(KIF5B外显子24/RET外显子11融合),
反应体系包括：
(1)检测RET融合基因KR4、KR6的引物和探针：
共用正向引物序列为：
KR4-Forward Primer：5’-CGCATAAAGGAAGCAGTCAGG-3’(SEQ ID NO:8)、
反向引物序列为：
KR4-Reverse Primer:5’-CCTCCTCGGCCACATCAAT-3’(SEQ ID NO:9)、
KR6-Reverse Primer:5’-CGCATAAAGGAAGCAGTCAGG-3’(SEQ ID NO:10)、
荧光探针序列为:
KR4-Taqman-Probe:5’-FAM-AAGAATATGGCCAGAAGAG-MGB-3’(SEQ ID NO:11)；
(2)阳性对照样品B：包含所检测RET融合基因KR4、KR6基因组片断DNA质粒
荧光定量反应液C：检测的是RET融合基因KR7(KIF5B外显子15/RET外显子11融合)反应体系包括：
(1)检测RET融合基因KR7的引物和探针：
正向引物序列为：
KR7-Forward Primer：5’-CTTCAGAAACTTAAGGAAATGACCAA-3’(SEQ ID NO:12)、
反向引物序列为：
KR7-Reverse Primer:5’-CTTGTGGGCAAACTTTACATCATTA-3’(SEQ ID NO:13)、
荧光探针序列为:
KR7-Taqman-Probe:5’-FAM-ATGGCATCTTTACTAAAAG-MGB-3’(SEQ ID NO:14)；(2)阳性对照样品C：包含所检测RET融合基因KR7基因组片断DNA质粒。
此外，本发明还提供一种RET融合基因突变的检测方法，包括：
从样品组织中提取基因组DNA；
利用上述引物及探针、或上述试剂盒进行荧光定量PCR反应；
根据荧光定量PCR扩增曲线检测是否发生RET融合基因突变；
所检测的RET融合基因突变类型包括KR1(K15：R12)、KR2(K16：R12)、KR3(K23：R12)、KR4(K24：R8)、KR5(K22：R12)、KR6(K24：R11)、KR7(K15：R11)以及最新发现的NR8(N6：R12)八种融合变体。
优选的，样品组织为临床组织蜡块。
优选的，检测过程中PCR反应条件：95℃预变性30秒；按95℃15秒，62℃20秒，扩增反应20个循环；再按95℃15秒，60℃34秒，扩增反应40个循环。
本发明取得了以下有益效果：
与现有检测方法比较，本技术采用荧光定量PCR技术检测KIF5B-RET融合基因具有以下优势：
1.检测灵敏度高，特异性好：本发明采用ARMS-qPCR技术分别针对7种最常见KIF5B-RET融合基因变体和1种最新发现的RET融合基因型设计了特异性引物和荧光探针，提高检测敏感性和特异性，假阳性低；
2.检测效率高：本发明试剂盒可检测8种RET融合基因变异体，一个反应管内可同时检测多个融合变体类型，如本发明反应液荧光定量反应液A可同时检测RET融合基因KR1、KR2、KR3、KR5、NR8；
3.线性关系好，可定量检测，由于荧光信号的强弱与模板扩增产物的对数呈线性关系，通过荧光信号的检测对样品初始模板浓度进行定量，误差小；
4.操作简单，自动化程度高，ARMS-qPCR技术对PCR产物的扩增和检测在闭管的情况下一步完成，不需要开盖，交叉污染和污染环境机会少，因此也就降低了结果偏差的几率；
5.结果判读明确、直观，可对结果进行定量分析。荧光定量PCR法结果的判读：在域值线以上有扩增曲线的标本均为阳性标本，结果判读非常简单、直观；
6.安全：整个体系中不包含有毒有害物质，对操作员和环境都无危害；
7.没有后处理，不用杂交、电泳、拍照。
附图说明
图1RET融合基因KR1的ARMS-qPCR图
图2RET融合基因KR1的测序结果图
图3RET融合基因KR2的ARMS-qPCR图
图4RET融合基因KR2的测序结果图
图5RET融合基因KR3的ARMS-qPCR图
图6RET融合基因KR3的测序结果图
图7RET融合基因KR4的ARMS-qPCR图
图8RET融合基因KR4的测序结果图
图9RET融合基因KR5的ARMS-qPCR图
图10RET融合基因KR5的测序结果图
图11RET融合基因KR6的ARMS-qPCR图
图12RET融合基因KR6的测序结果图
图13RET融合基因KR7的ARMS-qPCR图
图14RET融合基因KR7的测序结果图
图15RET融合基因NR8的ARMS-qPCR图
图16RET融合基因NR8的测序结果图
具体实施方式
样本说明：下面实施例中所用阳性样本收集自中山大学附属肿瘤医院病理科临床病理诊断为相应RET基因融合的蜡块组织(共212例)，正常组织样本12例，从蜡块中提取基因组DNA供以下的实验应用。
实施例1：RET融合基因KR1(KIF5B外显子15/RET外显子12融合)的检测
采用发明RET融合基因ARMS荧光定量PCR分型检测试剂盒中的荧光定量反应液A进行检测；然后优化反应体系进行ARMS-qPCR的检测：反应体系为25μL，荧光定量反应液A(引物、探针混合液，浓度为5uM)1μL，样品模板DNA 2μL(100-300ng/μL)，2*Taqman universalPCR Master Mix(购自美国应用生物公司)15μL,ddH2O 7μL。
PCR反应条件：95℃预变性30秒；按95℃15秒，62℃20秒，扩增反应20个循环；再按95℃15秒，60℃34秒，扩增反应40个循环。
同时在荧光定量试验中，需要检测样品的同时，还需要设置样品参考品，以确定试验的有效性，如图1所示，为RET融合基因KR1阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线；另外，将上述实施例1中的样品进行测序验证，发现在本实施例中由上述荧光定量检测试验检测出RET融合基因KR1，如图2所示，通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因融合，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。采用荧光定量反应B液、C液未检出，正常组织样本未检出。以此发现采用本发明的RET融合基因荧光定量PCR检测试剂盒能够准确地确定RET融合基因突变情况。
实施例2：RET融合基因KR2(KIF5B外显子16/RET外显子12融合)的检测
采用发明RET融合基因ARMS荧光定量PCR分型检测试剂盒中的荧光定量反应液A进行检测；然后优化反应体系进行ARMS-qPCR的检测：反应体系为25μL，荧光定量反应液A(引物、探针混合液，浓度为5uM)1μL，样品模板DNA 2μL(100-300ng/μL)，2*Taqman universalPCR Master Mix(购自美国应用生物公司)15μL,ddH2O 7μL。
PCR反应条件：95℃预变性30秒；按95℃15秒，62℃20秒，扩增反应20个循环；再按95℃15秒，60℃34秒，扩增反应40个循环。
同时在荧光定量试验中，需要检测样品的同时，还需要设置样品参考品，以确定试验的有效性，如图3所示，为RET融合基因KR2阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线；另外，将上述实施例2中的样品进行测序验证，发现在本实施例中由上述荧光定量检测试验检测出RET融合基因KR2，如图4所示，通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因融合，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。采用荧光定量反应B液、C液未检出，正常组织样本未检出。以此发现采用本发明的RET融合基因荧光定量PCR检测试剂盒能够准确地确定RET融合基因突变情况。
实施例3：RET融合基因KR3(KIF5B外显子23/RET外显子12融合)的检测
采用发明RET融合基因ARMS荧光定量PCR分型检测试剂盒中的荧光定量反应液A进行检测；然后优化反应体系进行ARMS-qPCR的检测：反应体系为25μL，荧光定量反应液A(引物、探针混合液，浓度为5uM)1μL，样品模板DNA 2μL(100-300ng/μL)，2*Taqman universalPCR Master Mix(购自美国应用生物公司)15μL,ddH2O 7μL。
PCR反应条件：95℃预变性30秒；按95℃15秒，62℃20秒，扩增反应20个循环；再按95℃15秒，60℃34秒，扩增反应40个循环。
同时在荧光定量试验中，需要检测样品的同时，还需要设置样品参考品，以确定试验的有效性，如图5所示，为RET融合基因KR3阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线；另外，将上述实施例3中的样品进行测序验证，发现在本实施例中由上述荧光定量检测试验检测出RET融合基因KR3，如图6所示，通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因融合，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。采用荧光定量反应B液、C液未检出，正常组织样本未检出。
实施例4：RET融合基因KR4(KIF5B外显子24/RET外显子8融合)的检测
采用发明RET融合基因ARMS荧光定量PCR分型检测试剂盒中的荧光定量反应液B进行检测；然后优化反应体系进行ARMS-qPCR的检测：反应体系为25μL，荧光定量反应液B(引物、探针混合液，浓度为5uM)1μL，样品模板DNA 2μL(100-300ng/μL)，2*Taqman universalPCR Master Mix(购自美国应用生物公司)15μL,ddH2O 7μL。
PCR反应条件：95℃预变性30秒；按95℃15秒，62℃20秒，扩增反应20个循环；再按95℃15秒，60℃34秒，扩增反应40个循环。
同时在荧光定量试验中，需要检测样品的同时，还需要设置样品参考品，以确定试验的有效性，如图7所示，为RET融合基因KR4阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线；另外，将上述实施例4中的样品进行测序验证，发现在本实施例中由上述荧光定量检测试验检测出RET融合基因KR4，如图8所示，通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因融合，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。采用荧光定量反应A液、C液未检出，正常组织样本未检出。
实施例5：RET融合基因KR5(KIF5B外显子22/RET外显子12融合)的检测
采用发明RET融合基因ARMS荧光定量PCR分型检测试剂盒中的荧光定量反应液A进行检测；然后优化反应体系进行ARMS-qPCR的检测：反应体系为25μL，荧光定量反应液A(引物、探针混合液，浓度为5uM)1μL，样品模板DNA 2μL(100-300ng/μL)，2*Taqman universalPCR Master Mix(购自美国应用生物公司)15μL,ddH2O 7μL。
PCR反应条件：95℃预变性30秒；按95℃15秒，62℃20秒，扩增反应20个循环；再按95℃15秒，60℃34秒，扩增反应40个循环。
同时在荧光定量试验中，需要检测样品的同时，还需要设置样品参考品，以确定试验的有效性，如图9所示，为RET融合基因KR5阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线；另外，将上述实施例5中的样品进行测序验证，发现在本实施例中由上述荧光定量检测试验检测出RET融合基因KR5，如图10所示，通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因融合，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。采用荧光定量反应B液、C液未检出，正常组织样本未检出。以此发现采用本发明的RET融合基因荧光定量PCR检测试剂盒能够准确地确定RET融合基因突变情况。
实施例6：RET融合基因KR6(KIF5B外显子24/RET外显子11融合)的检测
采用发明RET融合基因ARMS荧光定量PCR分型检测试剂盒中的荧光定量反应液B进行检测；然后优化反应体系进行ARMS-qPCR的检测：反应体系为25μL，荧光定量反应液B(引物、探针混合液，浓度为5uM)1μL，样品模板DNA 2μL(100-300ng/μL)，2*Taqman universalPCR Master Mix(购自美国应用生物公司)15μL,ddH2O 7μL。
PCR反应条件：95℃预变性30秒；按95℃15秒，62℃20秒，扩增反应20个循环；再按95℃15秒，60℃34秒，扩增反应40个循环。
同时在荧光定量试验中，需要检测样品的同时，还需要设置样品参考品，以确定试验的有效性，如图11所示，为RET融合基因KR6阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线；另外，将上述实施例6中的样品进行测序验证，发现在本实施例中由上述荧光定量检测试验检测出RET融合基因KR6，如图12所示，通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因融合，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。采用荧光定量反应A液、C液未检出，正常组织样本未检出。
实施例7：RET融合基因KR7(KIF5B外显子15/RET外显子11融合)的检测
采用发明RET融合基因ARMS荧光定量PCR分型检测试剂盒中的荧光定量反应液C进行检测；然后优化反应体系进行ARMS-qPCR的检测：反应体系为25μL，荧光定量反应液C(引物、探针混合液，浓度为5uM)1μL，样品模板DNA 2μL(100-300ng/μL)，2*Taqman universalPCR Master Mix(购自美国应用生物公司)15μL,ddH2O 7μL。
PCR反应条件：95℃预变性30秒；按95℃15秒，62℃20秒，扩增反应20个循环；再按95℃15秒，60℃34秒，扩增反应40个循环。
同时在荧光定量试验中，需要检测样品的同时，还需要设置样品参考品，以确定试验的有效性，如图13所示，为RET融合基因KR7阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线；另外，将上述实施例7中的样品进行测序验证，发现在本实施例中由上述荧光定量检测试验检测出RET融合基因KR7，如图14所示，通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因融合，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。采用荧光定量反应A液、B液未检出，正常组织样本未检出。以此发现采用本发明的RET融合基因荧光定量PCR检测试剂盒能够准确地确定RET融合基因突变情况。
实施例8：RET融合基因NR8(NCOA4外显子6/RET外显子12融合)的检测
采用发明RET融合基因ARMS荧光定量PCR分型检测试剂盒中的荧光定量反应液A进行检测；然后优化反应体系进行ARMS-qPCR的检测：反应体系为25μL，荧光定量反应液A(引物、探针混合液，浓度为5uM)1μL，样品模板DNA 2μL(100-300ng/μL)，2*Taqman universalPCR Master Mix(购自美国应用生物公司)15μL,ddH2O 7μL。
PCR反应条件：95℃预变性30秒；按95℃15秒，62℃20秒，扩增反应20个循环；再按95℃15秒，60℃34秒，扩增反应40个循环。
同时在荧光定量试验中，需要检测样品的同时，还需要设置样品参考品，以确定试验的有效性，如图15所示，为RET融合基因NR8阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线；另外，将上述实施例8中的样品进行测序验证，发现在本实施例中由上述荧光定量检测试验检测出RET融合基因NR8，如图16所示，通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因融合，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。采用荧光定量反应B液、C液未检出，正常组织样本未检出。
由上可知：ARMS-qPCR法不仅是快速、高效、灵敏的检测方法，而且其结果的判读非常明确、直观，结果亦是可靠、特异的，阳性样本检出率100％，利用本发明所述引物及探针、试剂盒可以有效的检出8种RET融合基因突变。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (2)

1.一种快速、准确检测RET融合基因的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测RET融合基因突变的核苷酸序列组合，其包含：
(1)用于检测RET融合基因KR1、KR2、KR3、KR5、NR8的引物和探针：正向引物序列为SEQID NO:1至SEQ ID NO:5； 共用反向引物序列为SEQ ID NO:6；荧光探针序列为SEQ ID NO:7， 荧光探针的5′端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团；
(2)用于检测RET融合基因KR4、KR6的引物和探针：共用正向引物序列为SEQ ID NO:8；反向引物序列为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；荧光探针序列为SEQ ID NO:11，荧光探针的5′端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团；
(3)用于检测RET融合基因KR7的引物和探针：正向引物序列为SEQ ID NO:12；反向引物序列为SEQ ID NO:13；荧光探针序列为SEQ ID NO:14，荧光探针的5′端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团；
该试剂盒还包括荧光定量反应液预混液、阳性对照样品。
2.一种检测RET融合基因的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：荧光定量反应液预混液、荧光定量反应液A、荧光定量反应液B、荧光定量反应液C；阳性对照样品A、阳性对照样品B、阳性对照样品C；
荧光定量反应液A包括：检测RET融合基因KR1、KR2、KR3、KR5、NR8的引物和探针：正向引物序列为SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:5； 共用反向引物序列为SEQ ID NO:6；荧光探针序列为SEQ ID NO:7， 荧光探针的5′端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团；
阳性对照样品A包含：所检测RET融合基因KR1、KR2、KR3、KR5、NR8基因组片断DNA质粒；
荧光定量反应液B包括：共用正向引物序列为SEQ ID NO:8；反向引物序列为SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:10；荧光探针序列为SEQ ID NO:11，荧光探针的5′端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团；
阳性对照样品B包含：所检测RET融合基因KR4、KR6基因组片断DNA质粒；
荧光定量反应液C包括：正向引物序列为SEQ ID NO:12；反向引物序列为SEQ ID NO:13；荧光探针序列为SEQ ID NO:14，荧光探针的5′端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团；
阳性对照样品C包含：所检测RET融合基因KR7基因组片断DNA质粒。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107385088A (zh) * 2017-09-04 2017-11-24 厦门飞朔生物技术有限公司 一种用于检测人类ret基因融合的多重荧光pcr检测试剂盒
CN108676848B (zh) * 2018-05-31 2022-04-22 上海科医联创医学检验所有限公司 用于检测融合基因的混合基因、标准质粒、试剂盒及其制备方法
CN110820051B (zh) * 2018-12-28 2023-04-28 广州表观生物科技有限公司 一种高灵敏度融合基因检测方法及其应用
CN114350754A (zh) * 2020-10-13 2022-04-15 重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司 一种快速检测ret基因重排探针、fish试剂盒及方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104031978A (zh) * 2013-03-06 2014-09-10 北京宏微特斯生物科技有限公司 一种基于arms荧光定量pcr检测基因突变的试剂盒和方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104031978A (zh) * 2013-03-06 2014-09-10 北京宏微特斯生物科技有限公司 一种基于arms荧光定量pcr检测基因突变的试剂盒和方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Emergence of RET rearrangement co-existing with activated EGFR mutation in EGFR-mutated NSCLC patients who had progressed on first-or second-generation EGFR TK1;Samuel J. Klempner et al;《LUNG CANCER》;20150930;第89卷(第3期);349-351页
RET fusion genes in Korean non-small cell lung cancer.;SS Yoo et.al;《Journal of Korean medical science》;20131031;第28卷(第10期);1555-1558页
RET，ROS1 and ALK fusions in lung cancer.;Kengo Takeuchi et al;《Nature Medicine》;20120212;第18卷(第3期);摘要、第379页左栏第1-2段，第380页图2、补充材料中的Table 1、补充材料第2页第6-35行

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