CN107385088A - 一种用于检测人类ret基因融合的多重荧光pcr检测试剂盒 - Google Patents
一种用于检测人类ret基因融合的多重荧光pcr检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于检测人类RET基因融合的多重荧光PCR检测试剂盒，包括一正向引物组、一反向引物组、一检测探针组、一内标正向引物、一内标反向引物和一内标检测探针；检测探针组中的检测探针的5’端均修饰有第一荧光报告基团，3’端均修饰有第一荧光猝灭基团；内标检测探针的5’端修饰有与第一荧光报告基团不同的第二荧光报告基团，3’端均修饰有第二荧光猝灭基团。本发明以人类RET基因融合为检测对象，通过特异引物的优化组合以及荧光探针，从而实现准确、简单、快速地同时检测RET基因融合，而且检测融合的能力高达1％。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测人类RET基因融合的多重荧光PCR检测试剂盒。
背景技术
RET原癌基因1985年Takahashi等首先在转化小鼠的NIH3T3细胞中发现了RET原癌基因。它位于10ql1.2，含有21个外显子，全长60kb，与其他染色体易位或10号染色体发生倒置可使RET活化。RET原癌基因编码一种跨膜的酪氨酸激酶受体RET蛋白，调节细胞的生长、分化。
RET基因的致癌作用RET基因的致瘤作用最初发现于甲状腺乳头状癌，不同形式的染色体异位和插入导致PTC/RET融合基因的形成，被认为是乳头状甲状腺癌的驱动突变。除基因重排外，RET基因突变与甲状腺髓样癌(MTC)相关。一项II期临床试验结果表明，多靶点激酶抑制剂凡德他尼(Vandetanib)治疗局部晚期或转移性家族遗传性MTC，疾病控制率为73％，且不良反应可控；另一项关于MTC的III期临床试验(ZETA)结果显示，截止至2009年7月31日，凡德他尼组较安慰剂组无进展生存期(PFS)明显延长，疾病进展风险降低54％。因此，凡德他尼被美国食品药品管理局(FDA)批准用于不宜手术切除或转移性MTC的治疗。此外文献报道在胰腺癌、黑色素瘤中发现RET激活。
KIF5B-RET融合基因KIF5B和RET分别位于lOpl1.22和10ql1.21，相距10.6Mb，通过臂间倒位后相融合，形成KIF5B-RET融合基因。KIF5B和RET双螺旋DNA的融合断点并非完全一致，目前已发现KIF5B-RET至少存在7种变体。KIF5B-RET融合蛋白由卷曲螺旋域和蛋白激酶域组成，卷曲螺旋域诱导融合激酶二聚体化，从而使蛋白酪氨酸激酶域自身磷酸化而激活。
RET抑制剂的抗肿瘤作用凡德他尼是VEGFR-2、EGFR和RET信号通路的抑制剂。在表达KIF5B--RET而无野生型或其他RET融合基因的人肺癌细胞中，RET激酶活化环上的Tyr905在无血清刺激的情况下磷酸化，提示与KIF5B的融合使RET激酶异常活化。这种磷酸化作用可被凡德他尼所抑制。由KIF5B-RET诱导的NIH3T3纤维母细胞的生长可被凡德他尼所抑制，而由K-Ras突变导致的细胞生长则不能被其所抑制。此外，还在该融合基因阳性的肺腺癌标本中检测到KIFSB-RET蛋白在Tyrg05的磷酸化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测人类RET基因融合的多重荧光PCR检测试剂盒。
本发明的技术方案如下：
一种用于检测人类RET基因融合的多重荧光PCR检测试剂盒，包括一正向引物组、一反向引物组、一检测探针组、一内标正向引物、一内标反向引物和一内标检测探针；检测探针组中的检测探针的5’端均修饰有第一荧光报告基团，3’端均修饰有第一荧光猝灭基团；内标检测探针的5’端修饰有与第一荧光报告基团不同的第二荧光报告基团，3’端均修饰有第二荧光猝灭基团；其中
正向引物组由RET-11-F、RET-12-F和RET-1231-F组成，依次包括如SEQ ID NO 01至03所示的序列；
反向引物组由RET-11-R、RET-12-R、RET-11-R1、RET-12-R1、RET-1255-R、RET-1232-R、RET-1231-R、RET-1253-R、RET-1234-R、RET-1241-R、RET-1262-R、RET-1491-R、RET-1481-R、RET-1511-R、RET-1271-R、RET-1503-R、RET-1509-R和RET-1513-R组成，依次包括如SEQ ID NO 04至21所示的序列；
检测探针组由RET-12-P、RET-1231-P和RET-11-P组成，分别包括如SEQ ID NO 22至24所示的序列；
该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的组成如下：
正向引物组中的至少一正向引物
反向引物组中的至少一反向引物
检测探针组中的一检测探针
内标正向引物
内标反向引物
内标检测探针
1×PCR缓冲液
MgCl2
dNTPs
Taq酶
模板
H2O；
该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的反应条件均为：95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒，64℃退火20秒，72℃延伸15秒，15个循环；95℃变性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸10秒，30个循环；后30个循环在退火时检测荧光信号。
在本发明的一个优选实施方案中，所述内标正向引物为βactin-F，包括如SEQ IDNO 25所示的序列；所述内标反向引物为βactin-R，包括如SEQ ID NO 26所示的序列；所述内标检测探针为βactin-P，包括如SEQ ID NO 27所示的序列。
在本发明的一个优选实施方案中，所述第一荧光报告基团为FAM，所述第一荧光猝灭基团为BHQ1，所述第二荧光报告基团为HEX、ROX或VIC，第二荧光猝灭基团为BHQ1。
上述引物及探针具体序列如下表所示：
本发明的有益效果：本发明以人类RET基因融合为检测对象，通过特异引物的优化组合以及荧光探针，从而实现准确、简单、快速地同时检测RET基因融合，而且检测融合的能力高达1％。
附图说明
图1为本发明实施例1中检测RET基因融合阴性的样品检测曲线图。
图2为本发明实施例1中检测RET基因融合阳性的样品检测曲线图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
一种用于检测人类RET基因融合的多重荧光PCR检测试剂盒，包括一正向引物组、一反向引物组、一检测探针组、一内标正向引物、一内标反向引物和一内标检测探针；检测探针组中的检测探针的5’端均修饰有第一荧光报告基团，3’端均修饰有第一荧光猝灭基团；内标检测探针的5’端修饰有与第一荧光报告基团不同的第二荧光报告基团，3’端均修饰有第二荧光猝灭基团，所述第一荧光报告基团为FAM，所述第一荧光猝灭基团为BHQ1，所述第二荧光报告基团为HEX、ROX或VIC，第二荧光猝灭基团为BHQ1；其中
正向引物组由RET-11-F、RET-12-F和RET-1231-F组成，依次包括如SEQ ID NO 01至03所示的序列；
反向引物组由RET-11-R、RET-12-R、RET-11-R1、RET-12-R1、RET-1255-R、RET-1232-R、RET-1231-R、RET-1253-R、RET-1234-R、RET-1241-R、RET-1262-R、RET-1491-R、RET-1481-R、RET-1511-R、RET-1271-R、RET-1503-R、RET-1509-R和RET-1513-R组成，依次包括如SEQ ID NO 04至21所示的序列；
检测探针组由RET-12-P、RET-1231-P和RET-11-P组成，分别包括如SEQ ID NO 22至24所示的序列；
所述内标正向引物为βactin-F，包括如SEQ ID NO 25所示的序列；
所述内标反向引物为βactin-R，包括如SEQ ID NO 26所示的序列；
所述内标检测探针为βactin-P，包括如SEQ ID NO 27所示的序列。
该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的组成如下：
正向引物组中的至少一正向引物
反向引物组中的至少一反向引物
检测探针组中的一检测探针
内标正向引物
内标反向引物
内标检测探针
1×PCR缓冲液
MgCl2
dNTPs
Taq酶
模板
H2O；
该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的反应条件均为：95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒，64℃退火20秒，72℃延伸15秒，15个循环；95℃变性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸10秒，30个循环；后30个循环在退火时检测荧光信号。
上述引物及探针具体序列如下表所示：
实施例1
本发明以人类RET基因融合为检测对象，通过特异引物的优化组合以及荧光探针，从而实现准确、简单、快速地同时检测RET基因融合，而且检测融合的能力高达1％。
野生型细胞系H460的RNA逆转录cDNA为野生型模板，以RET融合基因KIF5B-RET质粒为阳性对照模板，建立多重荧光PCR检测RET基因KIF5B-RET突变的反应体系。此方法主要包括以下步骤：
(1)根据Cosmic数据公布的RET基因和KIF5B基因的野生型cDNA基因序列和融合突变基因序列，设计高特异性引物和检测探针。待检测的突变为肺癌患者RET基因5种常见突变，具体相见下表：
(2)多重荧光PCR扩增反应体系配制并上机检测。
(3)检测荧光信号，以达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为结果判断的标准。
步骤(1)中根据Cosmic数据公布的RET基因和KIF5B的野生型基因序列和融合突变基因序列，设计引物和检测探针，具体序列详见实施例1的表。
步骤(2)的多重荧光PCR扩增反应体系之一为：
| 序号 | 物料 | 物料浓度 | 用量(μL) |
| 1 | 1×PCR缓冲液 | 1× | 10 |
| 2 | MgCl2 | 25mM | 10 |
| 3 | dNTPs | 10mM | 5 |
| 4 | RET-1231-F | 50μM | 0.8 |
| 5 | RET-1231-R | 50mM | 0.8 |
| 6 | RET-1231-P | 50mM | 0.8 |
| 7 | βactin-F | 50mM | 0.5 |
| 8 | βactin-R | 50mM | 0.5 |
| 9 | βactin-P-HEX(VIC) | 50mM | 0.5 |
| 10 | Taq酶 | 5U | 0.5 |
| 11 | H2O | 纯化水 | 17.1 |
| 12 | DNA模板 | 2ng/ul | 5 |
| 13 | 总体积 | 50 |
以上试剂组分：1×PCR缓冲液，MgCl2，Taq酶，dNTP均购自中国大连宝生物公司。
所述荧光PCR的反应条件是95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒，64℃退火20秒，72℃延伸15秒，15个循环；95℃变性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸10秒，30个循环；后30个循环在退火时检测FAM和HEX或ROX荧光信号。
步骤(3)检测FAM和HEX荧光信号的Ct值，是采用Mx3000P荧光PCR扩增仪或Mx3005P荧光PCR扩增仪或ABI 7500荧光PCR扩增仪。，一次可检测96份样品(包括阴阳性对照)。根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果：检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，以HEX信号达到设定阈值(Ct＞18)时表明上样DNA量在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判断的标准，Ct值为0或30：阴性；Ct小于30：阳性。检测RET基因融合阴性的样品的结果如图1所示，检测RET基因融合阳性的样品的结果如图2所示。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 厦门飞朔生物技术有限公司
<120> 一种用于检测人类RET基因融合的多重荧光PCR检测试剂盒
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
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<212> DNA
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<400> 27
cggctacagc ttcaccaac 19
Claims (3)
1.一种用于检测人类RET基因融合的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：包括一正向引物组、一反向引物组、一检测探针组、一内标正向引物、一内标反向引物和一内标检测探针；检测探针组中的检测探针的5’端均修饰有第一荧光报告基团，3’端均修饰有第一荧光猝灭基团；内标检测探针的5’端修饰有与第一荧光报告基团不同的第二荧光报告基团，3’端均修饰有第二荧光猝灭基团；其中
正向引物组由RET-11-F、RET-12-F和RET-1231-F组成，依次包括如SEQ ID NO 01至03所示的序列；
反向引物组由RET-11-R、RET-12-R、RET-11-R1、RET-12-R1、RET-1255-R、RET-1232-R、RET-1231-R、RET-1253-R、RET-1234-R、RET-1241-R、RET-1262-R、RET-1491-R、RET-1481-R、RET-1511-R、RET-1271-R、RET-1503-R、RET-1509-R和RET-1513-R组成，依次包括如SEQ IDNO 04至21所示的序列；
检测探针组由RET-12-P、RET-1231-P和RET-11-P组成，分别包括如SEQ ID NO 22至24所示的序列；
该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的组成如下：
正向引物组中的至少一正向引物
反向引物组中的至少一反向引物
检测探针组中的一检测探针
内标正向引物
内标反向引物
内标检测探针
1×PCR缓冲液
MgCl2
dNTPs
Taq酶
模板
H2O；
该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的反应条件均为：95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒，64℃退火20秒，72℃延伸15秒，15个循环；95℃变性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸10秒，30个循环；后30个循环在退火时检测荧光信号。
2.如权利要求1所述的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述内标正向引物为βactin-F，包括如SEQ ID NO 25所示的序列；所述内标反向引物为βactin-R，包括如SEQ IDNO 26所示的序列；所述内标检测探针为βactin-P，包括如SEQ ID NO 27所示的序列。
3.如权利要求1所述的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述第一荧光报告基团为FAM，所述第一荧光猝灭基团为BHQ1，所述第二荧光报告基团为HEX、ROX或VIC，第二荧光猝灭基团为BHQ1。
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2017
- 2017-09-04 CN CN201710788320.1A patent/CN107385088A/zh active Pending
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