CN113881759A - Egfr基因突变检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请实施例属于基因工程及分子生物学领域，涉及一种EGFR基因突变检测试剂盒，包括用于检测EGFR基因突变位点所需的EGFR特异性引物、EGFR基因突变位点探针，内控基因引物和内控基因探针，EGFR特异性引物及EGFR基因突变位点探针分别对EGFR基因突变位点类型进行检测，内控基因引物，用于扩增待测血浆样本中的管家基因以得到第二扩增产物，内控基因探针，用于在第二扩增产物生成过程中进行水解反应，释放第二荧光信号。本申请还涉及一种EGFR基因突变检测方法。本申请提供的技术方案能够现对待测血浆样本中EGFR基因突变位点的快速检测，可以减少非特异扩增，提高检测结果的特异性，还可以提高样本检测的效率和准确性。
Description
技术领域
本申请涉及基因工程及分子生物学领域技术领域，更具体地，涉及一种EGFR基因突变检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
肺癌是中国及全球范围内发病率和死亡率最高的癌症之一，并且其发病率和死亡率呈不断上升的趋势，其中最为常见的是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，约占肺癌总数的80％～85％。表皮生长因子受体(Epidermal growth factorreceptor，EGFR)基因是非小细胞肺癌中最常见的驱动基因，突变率约50％。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR Tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs)是针对EGFR靶点的小分子抑制剂。多项临床试验已证实，EGFR突变基因的晚期NSCLC患者能从EGFR-TKIs治疗中显著获益。携带不同EGFR基因突变患者对于EGFR-TKIs治疗的反应效率不尽相同，大量研究表明，EGFR基因突变主要存在18-21外显子上，TKI治疗最有效的敏感突变为19号外显子的缺失突变和21号外显子的L858R点突变，研究报道，19号外显子的缺失突变约占EGFR突变的5％，L858R点突变占EGFR突变的40％～45％，因此，临床医生需要依据EGFR基因不同突变类型在用药方案的选择上区别对待。尽管EGFR-TKIs为进展期非小细胞肺癌的治疗带来了里程碑的意义，但是携带EGFR激活突变的患者经EGFR-TKIs治疗一年后，绝大多数患者会出现耐药现象，其中T790M突变为最常见的耐药机制，约占所有耐药机制的60％，所以，临床医生需要实时监测EGFR基因突变状态，及时调整用药方案，以期达到最优的临床疗效。
目前，常用的EGFR基因突变检测方法包括：荧光PCR法、测序法、荧光原位杂交法和流式荧光杂交法等。但是，已有方法存在两大主要问题包括：
(1)无法做到“有或无”式的扩增结果，总会有非特异性反应的发生，因此在结果判读时需要用到ΔCt(即检测靶点Ct-内控Ct)，而ΔCt的引入不仅增加了操作步骤，还会引起混乱，因为ΔCt的设定值无法准确定位基因突变位置。
(2)目前已有的方法检测EGFR基因突变的灵敏度较低，其中测序法的灵敏度约20％，且操作复杂，检测时间较长。荧光PCR法的灵敏度相对较高，可达到1％，对于肿瘤组织样本可满足检测要求，但是由于血浆中的循环游离DNA(circulating free DNA，cfDNA)含量少，且很多患者的ctDNA(Circulating tumor DNA，循环肿瘤DNA)含量只占全部cfDNA含量的0.01％～1％，因此对于取样方便且无创的血浆样本，使用常规的基因突变检测方法难以满足需要。
此外，若血液中的基因突变在检测限以下，或者肿瘤DNA并没有释放到血液中去，则可能出现假阴性结果。
综上，提高灵敏度对于以血液作为检测样本的试剂很有必要，因此，需要开发一种灵敏度高、特异性强、操作简单的基因突变检测方法。
发明内容
本申请实施例所要解决的技术问题是相关技术中EGFR基因突变检测灵敏度低、特异性差以及检测效率低的问题。
为了解决上述技术问题，本申请实施例提供一种EGFR基因突变检测试剂盒，采用了如下所述的技术方案：
用于检测EGFR基因突变位点所需的EGFR特异性引物、EGFR基因突变位点探针；内控基因引物和内控基因探针；
所述EGFR特异性引物，用于扩增待测血浆样本中的目标区域以得到第一扩增产物；
所述EGFR基因突变位点探针，用于在所述第一扩增产物生成过程中进行水解反应，释放第一荧光信号；
所述EGFR特异性引物及EGFR基因突变位点探针分别对所述EGFR基因突变位点类型进行检测；
所述内控基因引物，用于扩增所述待测血浆样本中的管家基因以得到第二扩增产物；
所述内控基因探针，用于在所述第二扩增产物生成过程中进行水解反应，释放第二荧光信号。
进一步的，所述EGFR特异性引物包括：
EGFR基因19Del位点引物，用于与所述目标区域的19Del突变位点相结合；
EGFR基因T790M位点引物，用于与所述目标区域的T790M突变位点相结合；
EGFR基因L858R位点引物，用于与所述目标区域的L858R突变位点相结合。
进一步的，所述EGFR基因19Del位点引物包括第一上游引物、第一下游引物和第一封闭引物；其中，第一上游引物对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6，第一下游引物对应的核苷酸序列包括SEQID NO:7，第一封闭引物对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:18；
所述EGFR基因T790M位点引物包括第二上游引物、第二下游引物和第二封闭引物；其中，第二上游引物对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:8，第二下游引物对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:9，第二封闭引物对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:19；
所述EGFR基因L858R位点引物包括第三上游引物、第三下游引物和第三封闭引物；其中，第三上游引物对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:10，第三下游引物对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:11，第三封闭引物对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:20。
进一步的，所述SEQ ID NO:18、所述SEQ ID NO:19和所述SEQ ID NO:20对应的核苷酸序列的3’端分别标记有ZNA修饰。
进一步的，所述EGFR基因突变位点探针包括：
EGFR基因19Del位点探针、EGFR基因T790M位点探针以及EGFR基因L858R位点探针。
进一步的，所述EGFR基因19Del位点探针对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:14；所述EGFR基因T790M位点探针对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:15；所述EGFR基因L858R位点探针对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:16；其中，所述SEQ ID NO:14、所述SEQ ID NO:15和所述SEQ ID NO:16分别对应的核苷酸序列的5’端标记有FAM，3’端标记有Eclipse以及3’端的ZNA修饰。
进一步的，所述内控基因引物包括内控上游引物和内控下游引物，其中，所述内控上游引物对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:12，所述内控下游引物对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:13；
所述内控基因探针对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:17，其中，所述SEQ ID NO:17对应的核苷酸序列的5’端标记有CY5、3’端标记有Eclipse以及3’端的ZNA修饰。
进一步的，所述检测试剂盒还包括引物探针混合液、缓冲液、聚合酶反应液、对照样本和纯化水；
所述引物探针混合液为所述EGFR特异性引物、所述EGFR基因突变位点探针、所述内控基因引物和所述内控基因探针配制得到；
所述引物探针混合液、所述缓冲液、所述聚合酶反应液与所述纯化水混合配制得到PCR反应液；
所述对照样本包括阴性对照和阳性对照。
进一步的，述检测试剂盒还包括防污染组分尿嘧啶DNA糖基化酶。
为了解决上述技术问题，本申请实施例还提供一种EGFR基因突变检测方法，使用如上所述的检测试剂盒进行检测，采用了如下所述的技术方案：
采集样本EGFR基因突变检测静脉血液样本，处理所述静脉血液样本得到待测血浆样本；
利用所述检测试剂盒中的EGFR特异性引物对所述待测血浆样本的目标区域进行扩增，得到第一扩增产物，并在所述第一扩增产物生成过程中，所述EGFR基因突变位点探针进行水解反应，释放第一荧光信号；
利用所述检测试剂盒中的内控基因引物对所述待测血浆样本中的管家基因进行扩增，得到第二扩增产物，并在所述第二扩增产物生成过程中，所述内控基因探针进行水解反应，释放第二荧光信号；
根据所述第二荧光信号得到内控结果；
当所述内控结果满足预设条件，则根据所述第一荧光信号得到所述待测血浆样本的EGFR基因突变检测结果。
进一步的，所述利用所述检测试剂盒中的EGFR特异性引物对所述待测血浆样本的目标区域进行扩增，得到第一扩增产物的步骤包括：
所述EGFR基因19Del位点引物与所述待测血浆样本中的EGFR基因19Del位点互补配对区域相结合，生成19Del扩增产物；
所述EGFR基因T790M位点引物与所述待测血浆样本中的EGFR基因T790M位点互补配对区域相结合，生成T790M扩增产物；
所述EGFR基因L858R位点引物与所述待测血浆样本中的EGFR基因L858R位点互补配对区域相结合，生成L858R扩增产物。
进一步的，所述在所述第一扩增产物生成过程中，所述EGFR基因突变位点探针进行水解反应，释放第一荧光信号的步骤包括：
所述EGFR基因19Del位点引物扩增到所述EGFR基因19Del位点探针的位置时，所述EGFR基因19Del位点探针被所述检测试剂盒中的聚合酶水解，释放19Del类型荧光信号；
所述EGFR基因T790M位点引物扩增到所述EGFR基因T790M位点探针的位置时，所述EGFR基因T790M位点探针被所述检测试剂盒中的聚合酶水解，释放T790M类型荧光信号；
所述EGFR基因L858R位点引物扩增到所述EGFR基因L858R位点探针的位置时，所述EGFR基因L858R位点探针被所述检测试剂盒中的聚合酶水解，释放L858R类型荧光信号。
进一步的，所述利用所述检测试剂盒中的内控基因引物对所述待测血浆样本中的管家基因进行扩增，得到第二扩增产物的步骤之前还包括：
设置阳性对照和阴性对照，利用所述检测试剂盒中的阳性对照样本和阴性对照样本分别与所述待测血浆样本进行反应，获得检测结果；
根据所述检测结果确定所述检测试剂盒的检测有效性。
进一步的，所述根据所述第二荧光信号得到内控结果的步骤包括：
检测所述第二荧光信号得到所述第二扩增产物的内控扩增曲线；
根据所述内控扩增曲线确定所述第二扩增产物的内控Ct值。
进一步的，所述当所述内控结果满足预设条件，则根据所述第一荧光信号得到所述待测血浆样本的EGFR基因突变结果的步骤包括：
当所述内控Ct值满足预设阈值时，根据所述第一荧光信号得到所述待测血浆样本中所述目标区域对应的扩增曲线；
根据所述扩增曲线得到所述目标区域对应的目标Ct值；
基于所述目标Ct值确定所述待测血浆样本的所述EGFR基因突变结果。
与现有技术相比，本申请实施例主要有以下有益效果：
1、本申请实施例提供的EGFR基因突变检测试剂盒及其检测方法，通过采用EGFR特异性引物和EGFR基因突变位点探针可以实现对待测血浆样本中EGFR基因突变位点的快速检测；同时，通过EGFR特异性引物扩增待测血浆样本中的目标区域，并释放第一荧光信号，可以减少非特异扩增，提高检测结果的特异性；此外，通过内控基因引物和内控基因探针对待测血浆样本进行检测得到内控结果，根据内控结果判定是否对待测血浆样本的检测结果进行判断，可以提高样本检测的效率和准确性。
2、本申请对EGFR基因突变检测的灵敏度可达0.1％；采用ARMS-PCR技术，减少了非特异扩增，从而提高了检测结果的特异性，同时，本申请在引探设计过程中加入了封闭野生型扩增的一段核苷酸序列，从而提高了检测结果的准确性。
3、本申请在反应体系中添加了防污染组分尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶)提高了检测结果的准确性。
4、本申请中，使不同位点间的非特异性扩增的可能性降到最低，因此本发明提供的检测试剂盒的结果可直接通过Ct值进行判读。
5、本申请检测的样本为血浆样本，可以有效节省有限的组织标本，且血液标本无创并可重复采样，多项回顾性和前瞻性研究表明，血液循环游离或肿瘤DNA(cf/ctDNA)检测的阳性结果可作为EGFR-TKIs用药的确认性依据。
附图说明
为了更清楚地说明本申请中的方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一个简单介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是根据本申请的EGFR基因突变检测方法的一个实施例的流程图；
图2是本申请实施例检测EGFR基因19 Del位点PCR反应管阳性对照的PCR结果示意图；
图3是本申请实施例检测EGFR基因T790M位点PCR反应管阳性对照的PCR结果示意图；
图4是本申请实施例检测EGFR基因L858R位点PCR反应管阳性对照的PCR结果示意图；
图5是本申请实施例检测EGFR基因19 Del位点PCR反应管阴性对照的PCR结果示意图；
图6是本申请实施例检测EGFR基因T790M位点PCR反应管阴性对照的PCR结果示意图；
图7是本申请实施例检测EGFR基因L858R位点PCR反应管阴性对照的PCR结果示意图；
图8是本申请实施例检测EGFR基因19 Del位点灵敏度PCR结果示意图；
图9是本申请实施例检测EGFR基因T790M位点灵敏度PCR结果示意图；
图10是本申请实施例检测EGFR基因L858R位点灵敏度PCR结果示意图。
具体实施方式
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文中在申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请；本申请的说明书和权利要求书及上述附图说明中的术语“包括”和“具有”以及它们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。本申请的说明书和权利要求书或上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别不同对象，而不是用于描述特定顺序。
在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。此外，本文所描述的实施例所用实验方法如无特殊说明，均为普通方法，本文所描述的实施例所用试剂如无特殊说明，均可由商业渠道获得。
本申请实施例提供一种EGFR基因突变检测试剂盒，该检测试剂盒包括用于检测EGFR基因突变位点所需的EGFR特异性引物、EGFR基因突变位点探针；内控基因引物和内控基因探针，其中，EGFR特异性引物用于扩增待测血浆样本中的目标区域以得到第一扩增产物，EGFR基因突变位点探针，用于在所述第一扩增产物生成过程中进行水解反应，释放第一荧光信号，EGFR特异性引物及EGFR基因突变位点探针分别对EGFR基因突变位点类型进行检测；内控基因引物，用于扩增待测血浆样本中的管家基因以得到第二扩增产物，内控基因探针，用于与在所述第二扩增产物生成过程中进行水解反应，释放第二荧光信号。
在本实施例中，待测血浆样本为人的血浆样本，目标区域有3个，分别位于EGFR基因的19号外显子(Exon19)、20号外显子(Exon20)以及21号外显子(Exon21)，3个目标区域对应的EGFR特异性引物分别为EGFR基因19Del位点引物、EGFR基因T790M位点引物和EGFR基因L858R位点引物。
需要说明的是，检测试剂盒是基于实时荧光PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)技术、ARMS(Amplification Refractory Mutation System，扩增阻碍突变系统)-PCR技术，实现血浆DNA样本中EGFR基因目标区域对应的3个突变位点的检测。
引物是含有15-30个碱基的合成DNA寡核苷酸，能够与待测血浆样本中DNA模板链的目标区域互补序列结合，实现目标区域的特异性扩增。具体地，EGFR基因19Del位点引物，用于与目标区域的19Del突变位点相结合，可以达到检测19Del突变(19号外显子缺失突变)的目的；EGFR基因T790M位点引物，用于与目标区域的T790M突变位点相结合，可以达到检测T790M突变(20号外显子T790M点突变)的目的；EGFR基因L858R位点引物，用于与目标区域的L858R突变位点相结合，可以达到检测L858R突变(21号外显子L858R点突变)的目的。
在本实施例中，检测EGFR基因19Del突变的EGFR基因19Del位点引物包括第一上游引物、第一下游引物和第一封闭引物，第一上游引物为EGFR基因19号外显子的缺失突变的上游引物，其核苷酸序列包括如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示，第一下游引物为EGFR基因19号外显子的缺失突变的下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，第一封闭引物为EGFR基因19号外显子的缺失突变的封闭野生型引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示。
检测EGFR基因T790M突变的EGFR基因T790M位点引物包括第二上游引物、第二下游引物和第二封闭引物，其中，第二上游引物为EGFR基因20号外显子T790M点突变的上游引物，其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，第二下游引物为EGFR基因20号外显子T790M点突变的下游引物，其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，第二封闭引物为EGFR基因20号外显子的T790M点突变的封闭野生型引物，其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示。
检测EGFR基因L858R突变的EGFR基因L858R位点引物包括第三上游引物、第三下游引物和第三封闭引物，其中，第三上游引物为EGFR基因21号外显子L858R点突变的上游引物，其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，第三下游引物为EGFR基因21号外显子L858R点突变的下游引物，其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，第三封闭引物为EGFR基因21号外显子的L858R点突变的封闭野生型引物，其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。
在本实施例中，SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20对应的核苷酸序列的3’端分别标记有ZNA修饰。
在本实施例中，EGFR基因突变位点探针包括EGFR基因19Del位点探针、EGFR基因T790M位点探针和EGFR基因L858R位点探针。探针为一线性的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，荧光监测系统检测不到荧光信号，PCR扩增过程中，探针被切断，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可检测到荧光信号。
在本实施例中，EGFR基因19Del位点探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，EGFR基因T790M位点探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示，EGFR基因L858R位点探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。
本实施例中，EGFR基因19Del位点探针、EGFR基因T790M位点探针和EGFR基因L858R位点探针分别对应的核苷酸序列，5’端都有FAM(羧基荧光素)荧光报告基团，3’端标记有Eclipse以及3’端的ZNA修饰。
需要说明的是，探针的位置尽可能地靠近对应而定上游引物，在PCR反应过程中，利用高温使待测血浆样本中的双链DNA模板分离，形成单链DNA模板，降低温度进行退火，引物与目标区域的单链DNA模板结合，同时，探针也会与目标区域的单链DNA模板结合，最后通过聚合酶的作用，由引物开始沿着DNA链合成互补链，从而扩增目标区域，扩增过程中，扩增产物不断延伸，延伸到探针所在的位置时，聚合酶将与单链DNA模板结合的探针分解，释放出对应的荧光信号。
本实施例通过采用EGFR特异性引物、EGFR基因突变位点探针技术，可以实现血浆样本EGFR基因3个位点基因突变的快速检测。
在本实施例中，内控基因引物和内控基因探针是根据人的管家基因保守片段设计并合成的，用于样本和实验过程的监控。
内控基因引物用于扩增待测血浆样本中的管家基因以得到第二扩增产物，内控基因引物包括内控上游引物和内控下游引物，内控上游引物为检测内控基因的上游引物，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示，内控下游引物为检测内控基因的下游引物，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。内控基因探针，用于与第二扩增产物进行连接反应，释放第二荧光信号，内控基因探针对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，SEQ ID NO:17核苷酸序列5’端分别标记有CY5荧光报告基团，3’端分别标记有Eclipse以及3’端的ZNA修饰。
本申请实施例使用ZNA修饰的引物和探针，可以提高检测结果的准确性和灵敏度。
在本实施例的一种具体实现方式中，检测EGFR基因19号外显子缺失突变的6条上游引物SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6在反应体系中的终浓度为0.4μmol/L，检测EGFR基因19号外显子缺失突变的下游引物SEQID NO:7在反应体系中的终浓度为0.4μmol/L，EGFR基因19号外显子缺失突变的探针SEQ IDNO：14在反应体系中的终浓度为0.2μmol/L，EGFR基因19号外显子缺失突变的野生型封闭引物在反应体系中的终浓度为0.04μmol/L；
检测EGFR基因T790M位点的上游引物SEQ ID NO:8在反应体系中的终浓度为0.4μmol/L，检测EGFR基因T790M位点下游引物SEQ ID NO:9在反应体系中的终浓度为0.4μmol/L，EGFR基因T790M位点探针SEQ ID NO:15在反应体系中的终浓度为0.2μmol/L，EGFR基因T790M位点的野生型封闭引物SEQ ID NO:19在反应体系中的终浓度为0.16μmol/L；
检测EGFR基因L858R位点的上游引物SEQ ID NO:10在反应体系中的终浓度为0.4μmol/L，检测EGFR基因L858R位点下游引物SEQ ID NO:11在反应体系中的终浓度为0.4μmol/L，EGFR基因L858R位点探针SEQ ID NO:16在反应体系中的终浓度为0.2μmol/L，EGFR基因L858R位点的野生型封闭引物SEQ ID NO:20在反应体系中的终浓度为0.008μmol/L；
内控上游引物SEQ ID NO:12在反应体系中的终浓度为0.3μmol/L，内控下游引物SEQ ID NO:13在反应体系中的终浓度为0.3μmol/L，内控基因探针SEQ ID NO:17在反应体系中的终浓度为0.1μmol/L。
EGFR特异性引物、EGFR基因突变位点探针、内控基因引物和内控基因探针对应的引物探针核苷酸序列表如表1所示。
表1引物探针核苷酸序列表
| 引物探针序列号 | 核苷酸序列(5’-3’) |
| SEQ ID NO：1 | 5’-GTCGCTATCAAATCCGA-3’ |
| SEQ ID NO：2 | 5’-CCCGTCGCTATCAAGCGG-3’ |
| SEQ ID NO：3 | 5’-CCGTCGCTATCAAGGACTG-3’ |
| SEQ ID NO：4 | 5’-TCGTCGCTATCAAGGCGT-3’ |
| SEQ ID NO：5 | 5’-TCGCTATCAAGGAATGCC-3’ |
| SEQ ID NO：6 | 5’-CGCTATCAAGGTTCCGAA-3’ |
| SEQ ID NO：7 | 5’-CATTTAGGATGTGGAGATG-3’ |
| SEQ ID NO：8 | 5’-CTCCACCGTGCARCTCATCTT-3’ |
| SEQ ID NO：9 | 5’-AGTTGAGCAGGTACTGGGAGC-3’ |
| SEQ ID NO：10 | 5’-GGCAGCCAGGAACGTACTG-3’ |
| SEQ ID NO：11 | 5’-CACCCAGCAGTTTGTCCC-3’ |
| SEQ ID NO：12 | 5’-TGACCCCTTCATTGACCTCAAC-3’ |
| SEQ ID NO：13 | 5’-CCATCAGCCAGGTGGCTCCTC-3’ |
| SEQ ID NO：14 | 5’-FAM-CCCACCTTTTCTCATGTCT-Eclipse-ZNA-3’ |
| SEQ ID NO：15 | 5’-FAM-AGGAGGCAGCCGAAGGGCATGA-Eclipse-ZNA-3’ |
| SEQ ID NO：16 | 5’-FAM-AACACCGCAGCATGTCAA-Eclipse-ZNA-3’ |
| SEQ ID NO：17 | 5’-CY5-CTACATGGTGAGCCCCAAA-Eclipse-ZNA-3’ |
| SEQ ID NO：18 | 5’-AAGCAACATCTCCGAAAGCCAAC-ZNA-3’ |
| SEQ ID NO：19 | 5’-CGAAGGGCATGAGCTGCG-ZNA-3’ |
| SEQ ID NO：20 | 5’-TGGGCTGGCCAAACTGC-ZNA-3’ |
需要说明的是，上述PCR引物(包括EGFR特异性引物和内控基因引物)和标记有不同类型荧光的探针可分别用于对EGFR基因19 Del、T790M、L858R这3个位点突变类型进行检测，根据野生反应管和突变反应管结果呈现的荧光信号有无，判断待测血浆样本中EGFR基因3个位点型别；上述PCR引物和探针根据人的EGFR基因19 Del、T790M、L858R 3个位点所在区段和内控基因DNA序列设计并合成，可以检测EGFR基因19 Del、T790M、L858R 3个位点的型别。
在本实施例中，上述检测试剂盒还包括引物探针混合液、缓冲液、聚合酶反应液、对照样本和纯化水，引物探针混合液为EGFR特异性引物、EGFR基因突变位点探针、内控基因引物和内控基因探针配制得到；缓冲液即为PCR buffer，主要成分包括(NH4)2SO4、Tris-HCl、MgCl2、Triton、Tween-20、BSA、甜菜碱，用于提供聚合酶行使功能的化学环境。
聚合酶反应液具体为热启动Taq酶反应液，主要成分包括dNTP、热启动Taq酶、UDG、热启动Taq酶稀释液。应当理解，热启动Taq酶是必须经过高温才能激活的酶，在初始循环的变性之前没有活性，不会产生非特异性扩增，大大提高了PCR扩增的特异性。
对照样本包括阳性对照和阴性对照，阳性对照为EGFR基因19 Del、T790M和L858R位点突变阳性细胞核酸的混合溶液，阴性对照样本为纯化水。对照样本的作用在于判定检测试剂盒检测的有效性，有效性的标准为：每次检测均设置阴性对照组和阳性对照组，当检测结果的阳性对照组为阳性，且阴性对照组均为阴性时，表明实验结果有效。
在本实施例中，将EGFR特异性引物、EGFR基因突变位点探针、内控基因引物和内控基因探针混合得到引物探针混合液，并将引物探针混合液与缓冲液、聚合酶反应液组成PCR反应液。引物探针混合液包括检测EGFR基因19Del位点突变型的引物探针和内控基因的19Del位点引物探针混合液、检测EGFR基因T790M位点野生型的引物探针和内控基因的T790M位点引物探针混合液以及检测EGFR基因L858R位点野生型的引物探针和内控基因的L858R位点引物探针混合液，19Del位点引物探针混合液的主要成分包括EGFR基因19Del位点引物、EGFR基因19Del位点探针、内控基因引物以及内控基因探针；T790M位点引物探针混合液的主要成分包括EGFR基因T790M位点引物、EGFR基因T790M位点探针、内控基因引物以及内控基因探针；L858R位点引物探针混合液的主要成分包括EGFR基因L858R位点引物、EGFR基因L858R位点探针、内控基因引物以及内控基因探针。
检测EGFR基因19号外显子缺失突变时，E EGFR基因19Del位点探针、EGFR基因19Del位点的上下游引物和19号外显子缺失突变的野生型封闭引物组成19 Del PCR引物反应液，分别与待测血浆样本所扩增的目标区域上19号外显子缺失突变所在的片段结合，释放出FAM荧光信号；检测EGFR基因T790M位点突变时，EGFR基因T790M位点探针、EGFR基因T790M位点的上下游引物和T790M位点野生型封闭引物组成T790M PCR引物反应液，分别与所扩增的目标区域上T790M位点所在的片段结合，释放FAM荧光信号；检测EGFR基因L858R位点突变时，EGFR基因L858R位点探针、EGFR基因L858R位点的上下游引物和L858R野生型封闭引物组成L858R PCR引物反应液，分别与所扩增的目标区域上L858R位点所在的片段结合，释放FAM荧光信号。EGFR基因19 Del、T790M和L858R 3个位点突变类型检测过程都通过内控基因引物和内控基因探针进行监控。
在本实施例中，上述检测试剂盒还包括防污染组分尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶)，其作用机理是选择性水解断裂含有dU的双链或者单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的DNA链，在碱性介质以及高温下会进一步水解断裂，从而被消除，该UDG酶的加入提高了检测结果的准确性。
本申请采用的PCR检测原理如下：基于实时荧光PCR技术，采用扩增阻碍突变系统，实现血浆DNA样本中EGFR基因中3个突变位点的检测。上述检测试剂盒针对EGFR基因3个突变位点设计特异的突变检测引物，PCR扩增时，由于该引物3’末端的碱基与突变型模板完全配对，引物延伸并扩增出突变模板；而与野生型模板由于不能完全配对，引物的延伸被阻断，野生型模板扩增被抑制，从而实现EGFR基因3个突变位点基因的检测。EGFR基因3个突变位点，其片段扩增长度均小于200bp，3个突变位点基因探针为FAM荧光标记，内控基因(人类管家基因)探针为CY5荧光标记，通过内控基因可以对待测血浆样本的采集、核酸提取、PCR检测全过程实行监控，避免检测结果的假阴性。
基于上述的EGFR基因突变检测试剂盒，本申请实施例还提供一种EGFR基因突变检测方法，参见图1所示，具体实施步骤包括：
步骤S10：采集EGFR基因突变检测静脉血液样本，处理EGFR基因突变检测静脉血液样本得到待测血浆样本。
具体地，抽取不少于5mL的静脉血注入普通EDTA(Ethylene Diamine TetraaceticAcid，乙二胺四乙酸)抗凝采血管或专用游离核酸样本保存管(如：STRECK公司的Cell-FreeDNA BCT)中。建议在血液离体2小时内分离血浆，一般不宜超过4小时。血浆体积不少于2mL。血浆分离时，首先采用2000×g离心10min，取上清；再8000×g离心10min，取上清，并对血浆样本进行核酸提取。
本实施例检测的样本为血浆样本，克服了依赖肿瘤石蜡组织样本进行检测的缺陷，可以有效节省有限的组织标本，且血液标本无创并可重复采样。
步骤S20：利用检测试剂盒中的EGFR特异性引物对待测血浆样本的目标区域进行扩增，得到第一扩增产物，并在第一扩增产物生成过程中，EGFR基因突变位点探针进行水解反应，释放第一荧光信号。
在进行PCR反应之前，制备PCR反应体系，PCR反应体系配制前准备：取出检测试剂盒中的EGFR特异性引物和EGFR基因突变位点探针、PCR buffer、热启动Taq酶反应液、纯化水等，室温融化，涡旋震荡混匀后离心10秒。配制前准备完成后，配制PCR反应体系，PCR反应体系的构成包括19Del PCR反应液、T790M PCR反应以及L858R PCR反应液。
配制PCR反应体系的过程为：将EGFR特异性引物、EGFR基因突变位点探针、内控基因引物和内控基因探针、PCR buffer、热启动Taq酶反应液、纯化水混合，加入处理后的待测血浆样本DNA10μL，制备得到EGFR基因19Del PCR反应液、T790M PCR反应液和L858R PCR反应液，具体的构成参见表2、表3和表4。
表2 19Del PCR反应液
| 组分 | 体积 |
| 19Del位点引物探针混合液 | 5.1μL |
| 血浆样本DNA | 10μL |
| PCR buffer | 8.97μL |
| 热启动Taq酶反应液 | 8μL |
| 纯化水 | 补足至50μL |
表3 T790M PCR反应液
| 组分 | 体积 |
| T790M位点引物探针混合液 | 2.9μL |
| 血浆样本DNA | 10μL |
| PCR buffer | 8.97μL |
| 热启动Taq酶反应液 | 8μL |
| 纯化水 | 补足至50μL |
表4 L858R PCR反应液
| 组分 | 体积 |
| L858R位点引物探针混合液 | 2.52μL |
| 血浆样本DNA | 10μL |
| PCR buffer | 8.97μL |
| 热启动Taq酶反应液 | 8μL |
| 纯化水 | 补足至50μL |
取出待测血浆样本所提取的核酸和检测试剂盒对照样本中的阳性对照以及阴性对照各10μL，加入配制的PCR反应体系的八连管(PCR反应管)中，使每管PCR反应液的总体积为50μL；盖紧八联管管盖，充分混匀，高速离心10秒。
将PCR反应管放入仪器样品槽内，并记录放置顺序。选择FAM通道检测EGFR基因19Del、T790M和L858R位点突变型；选择CY5通道检测内标通道；选择参比荧光(PassiveReference)为None(ABI7500需)；设置循环条件如表5所示，PCR反应体系体积设置为50μL；设置完成后，保存文件，运行程序。
表5
在PCR反应第一个循环变形前有一个升温过程(50℃升到95℃)，升温完成之后，利用高温(95℃)使待测血浆样本中的双链DNA模板分离，以单链DNA模板形式存在，降低温度，使得引物可以结合与单链DNA模板上，并在热启动Taq酶的作用下沿着DNA链合成互补链，完成目标区域的扩增。
具体地，EGFR基因19Del位点引物与待测血浆样本中的EGFR基因19Del位点互补配对区域相结合，生成19Del扩增产物；EGFR基因T790M位点引物与待测血浆样本中的EGFR基因T790M位点互补配对区域相结合，生成T790M扩增产物；EGFR基因L858R位点引物与待测血浆样本中的EGFR基因L858R位点互补配对区域相结合，生成L858R扩增产物。
扩增产物生成原理为：EGFR基因19Del位点、T790M位点和L858R位点对应的引物与待测血浆样本目标区域的单链DNA模板结合，并在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与DNA模板链互补的新链，生成目标区域对应的扩增产物。
在Taq DNA聚合酶的作用下，由引物开始扩增目标区域生成对应扩增产物的过程中，引物合成序列延伸至EGFR基因突变位点探针所在位置时，Taq DNA聚合酶将与待测血浆样本目标区域的单链DNA模板结合的EGFR基因突变位点探针分解，释放出对应的第一荧光信号，通过检测PCR反应体系中的荧光强度，可以达到检测扩增产物扩增量的目的。
具体地，EGFR基因19Del位点引物扩增到EGFR基因19Del位点探针的位置时，EGFR基因19Del位点探针被检测试剂盒中的聚合酶水解，释放19Del类型荧光信号；EGFR基因T790M位点引物扩增到EGFR基因T790M位点探针的位置时，EGFR基因T790M位点探针被检测试剂盒中的聚合酶水解，释放T790M类型荧光信号；EGFR基因L858R位点引物扩增到EGFR基因L858R位点探针的位置时，EGFR基因L858R位点探针被检测试剂盒中的聚合酶水解，释放L858R类型荧光信号。
步骤S30，利用检测试剂盒中的内控基因引物对待测血浆样本中的管家基因进行扩增，得到第二扩增产物，并在第二扩增产物生成过程中，内控基因探针进行水解反应，释放第二荧光信号。
通过内控基因引物与内控基因探针，对PCR反应过程进行监控。在CY5检测通道，利用内控基因引物对待测血浆样本中的管家基因进行扩增，得到第二扩增产物，并在第二扩增产物生成过程中，内控基因探针进行水解反应，释放第二荧光信号。
第二扩增产物生成原理为：内控基因引物与待测血浆样本管家基因目的片段的单链DNA模板结合，并在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与DNA模板链互补的新链，即为目的片段的第二扩增产物。
在Taq DNA聚合酶的作用下，由内控基因引物开始扩增目的片段生成对应第二扩增产物的过程中，内控基因引物合成序列延伸至内控基因探针所在位置时，Taq DNA聚合酶将与待测血浆样本管家基因目的片段的单链DNA模板结合的内控基因探针分解，释放出对应的第二荧光信号，通过检测PCR反应体系中的荧光强度，可以达到检测扩增产物扩增量的目的。
步骤S40，根据第二荧光信号得到内控结果。
具体地，检测第二荧光信号得到第二扩增产物的内控扩增曲线，根据内控扩增曲线确定第二扩增产物的内控Ct值。
需要说明的是，Ct值中C代表Cycle(循环)，t代表threshold(域值)，Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。
PCR反应结束后，自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，建议Start值可以在3～15、End值可设在5～20，在Log图谱窗口各反应体系Threshold的Value值设置为阳控最高荧光值的1/20(各通道分别设置)，使阈值线位于扩增曲线指数期，EGFR阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击Ranalyse自动获得各通道的Ct值，根据各通道Ct值进行结果判断。
内控结果判定：待测血浆样本反应管CY5检测通道均有明显对数扩增曲线，且Ct≤32；满足此条件则继续进行突变结果(FAM通道)判断。若某反应管不满足此条件，则对应反应管检测结果无效，建议重新检测该反应管；若各反应管均不满足此条件，则所有反应管检测结果均无效，建议重新提取样本核酸或增加核酸的加入量进行检测。
步骤S50，当内控结果满足预设条件，则根据第一荧光信号得到待测血浆样本的EGFR基因突变结果。
具体地，当所内控Ct值满足预设阈值时，根据第一荧光信号得到待测血浆样本中目标区域对应的扩增曲线；根据扩增曲线得到目标区域对应的目标Ct值；基于目标Ct值确定待测血浆样本的EGFR基因突变结果。
EGFR基因突变结果判断：若某反应管FAM通道均无扩增曲线，无Ct值，或有扩增曲线但Ct值>40，则该样本对应反应管的突变结果为阴性或低于本试剂盒的检测下限；若某反应管FAM通道有明显对数扩增曲线，且Ct值≤40，则该样本对应反应管的突变结果为阳性。
需要说明的是，同一次实验中，EGFR阳性对照和阴性对照在3个反应管中需同时满足质量控制要求，否则，本次实验无效，需重新进行。
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例一
本实施例提供一种EGFR基因突变检测的检测试剂盒的组成成分、包装及数量(24反应/盒)，如表6所示。
表6检测试剂盒的组成成分、包装及数量
本实施例的采用ARMS-PCR技术，减少了非特异扩增，从而提高了检测结果的特异性，灵敏度高。
实施例二
本实施例提供一种检测试剂盒的样本灵敏度检测实验，具体步骤如下：
选取检测结果EGFR野生型模拟血浆样本20例作为检测样本，编号为A1～A20；选取检测结果EGFR 19 Del位点突变型模拟血浆样本72例作为检测样本，编号为B1～B72，这72例模拟血浆样本包含19 Del的18种突变型别，分别由1ng/μL突变比例为0.1％、1％、3％和40％各18例组成；选取检测结果EGFR T790M位点突变型模拟血浆样本12例作为检测样本，分别由1ng/μL突变比例为0.1％、1％、3％和40％至少各3例组成，编号为C1～C12；选取检测结果EGFR L858R位点突变型模拟血浆样本12例作为检测样本，分别由1ng/μL突变比例为0.1％、1％、3％和40％至少各3例组成，编号为D1～D12；使用本公司核酸提取或纯化试剂盒提取血浆样本核酸，样本处理及核酸提取均按说明书进行操作。各1ng/μL 4种突变比例的模拟血浆DNA上样检测，阴性对照为纯化水，加样至配制的PCR反应体系的八连管中，使每管PCR反应液总体积为50μL；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒。
将PCR反应管放入仪器样品槽内，并记录放置顺序。选择FAM通道检测EGFR基因19Del、T790M和L858R位点突变型；选择CY5通道检测内标通道；选择参比荧光(PassiveReference)为None(ABI7500需)；设置循环条件如表5所示，反应体系体积设置为50μL；设置完成后，保存文件，运行程序。
采用PCR系统对本实施例的样本检测范围进行测定，实际测得的结果如表7所示。
表7样本检测范围实验结果
由此可知，本申请试剂盒的检测限为1ng/μL 0.1％的突变，通过对EGFR19 Del、T790M和L858R位点不同型别的1ng/μL突变比例分别为0.1％、1％、3％和40％的血浆DNA进行检测，灵敏度检测良好，代表性扩增曲线见图8、图9和图10，阳性对照扩增曲线如图2、图3和图4所示，阴性对照扩增曲线如图5、图6和图7所示。因此，本申请的样本检测限为1ng/μL0.1％的突变。
本申请中试剂盒的结果可直接通过Ct值进行判读，可以提高检测效率，简化检测过程。
实施例三
本实施例提供一种检测试剂盒的准确性检测方法，具体步骤如下：
检测试剂盒检测含EGFR基因突变型人血浆提取的DNA制备的阳性参考品P1-P3、EGFR突变阳性细胞系DNA、质粒DNA，分别与人阴性血浆按3％突变比例混合后提取并稀释至1.5ng/uL制成的P4-P23，阴性对照为纯化水。分别取10μL样本加至配制的PCR反应体系的八联管中，使每管PCR反应液总体积为50μL；盖紧八联管管盖，充分混匀，高速离心10秒。
将PCR反应管放入仪器样品槽内，并记录放置顺序。选择FAM通道检测EGFR基因19Del、T790M和L858R位点突变型；选择CY5通道检测内标通道；选择参比荧光(PassiveReference)为None(ABI7500需)；设置循环条件如表5所示，反应体系体积设置为50μL；设置完成后，保存文件，运行程序。
使用PCR系统对本申请的检测试剂盒的准确性进行检测，得到结果如表8所示。
表8准确性检测结果
根据上表所述结果，各质控品准确性的检测结果阳性率为100％，表明本申请检测试剂盒的准确性检测符合要求。
实施例四
本实施例提供一种临床应用实验，具体过程如下：
抽取30例人血浆样本，使用本公司核酸提取或纯化试剂盒(备案号：粤穗械备20170665号)提取血浆样本核酸，样本处理及核酸提取均按说明书进行操作。同时，该血浆样本通过数字PCR检测验证。
取每个样本的血浆DNA 10μL及试剂盒中对照样本各10μL，加样至配制的PCR反应体系的八联管中，使每管PCR反应液的总体积为50μL；盖紧管盖，充分混匀，高速离心10秒。
将PCR反应管放入仪器样品槽内，并记录放置顺序。选择FAM通道检测EGFR基因19Del、T790M和L858R位点突变型；选择CY5通道检测内标通道；选择参比荧光(PassiveReference)为None(ABI7500需)；设置循环条件如表5所示，反应体系体积设置为50μL；设置完成后，保存文件，运行程序。
使用本申请检测试剂盒对30例人血浆样本进行检测，得到结果如表9所示。
表9 30例人血浆样本检测结果
检测结果为：30例样本中EGFR基因野生型19例，EGFR基因19 Del位点突变6例，EGFR基因L858 R位点突变3例，EGFR基因T790 M位点突变2例，所检结果与数字PCR检测结果一致性为100％。
显然，以上所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例，附图中给出了本申请的较佳实施例，但并不限制本申请的专利范围。本申请可以以许多不同的形式来实现，相反地，提供这些实施例的目的是使对本申请的公开内容的理解更加透彻全面。尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来而言，其依然可以对前述各具体实施方式所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等效替换。凡是利用本申请说明书及附图内容所做的等效结构，直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理在本申请专利保护范围之内。
Claims (15)
1.一种EGFR基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括：
用于检测EGFR基因突变位点所需的EGFR特异性引物、EGFR基因突变位点探针；内控基因引物和内控基因探针；
所述EGFR特异性引物，用于扩增待测血浆样本中的目标区域以得到第一扩增产物；
所述EGFR基因突变位点探针，用于在所述第一扩增产物生成过程中进行水解反应，释放第一荧光信号；
所述EGFR特异性引物及所述EGFR基因突变位点探针分别对所述EGFR基因突变位点类型进行检测；
所述内控基因引物，用于扩增所述待测血浆样本中的管家基因以得到第二扩增产物；
所述内控基因探针，用于在所述第二扩增产物生成过程中进行水解反应，释放第二荧光信号。
2.根据权利要求1所述的EGFR基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述EGFR特异性引物包括：
EGFR基因19Del位点引物，用于与所述目标区域的19Del突变位点相结合；
EGFR基因T790M位点引物，用于与所述目标区域的T790M突变位点相结合；
EGFR基因L858R位点引物，用于与所述目标区域的L858R突变位点相结合。
3.根据权利要求2所述的EGFR基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述EGFR基因19Del位点引物包括第一上游引物、第一下游引物和第一封闭引物；其中，第一上游引物对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6，第一下游引物对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:7，第一封闭引物对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:18；
所述EGFR基因T790M位点引物包括第二上游引物、第二下游引物和第二封闭引物；其中，第二上游引物对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:8，第二下游引物对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:9，第二封闭引物对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:19；及
所述EGFR基因L858R位点引物包括第三上游引物、第三下游引物和第三封闭引物；其中，第三上游引物对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:10，第三下游引物对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:11，第三封闭引物对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:20。
4.根据权利要求3所述的EGFR基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述SEQ ID NO:18、所述SEQ ID NO:19和所述SEQ ID NO:20对应的核苷酸序列的3’端分别标记有ZNA修饰。
5.根据权利要求1所述的EGFR基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述EGFR基因突变位点探针包括：
EGFR基因19Del位点探针、EGFR基因T790M位点探针以及EGFR基因L858R位点探针。
6.根据权利要求5所述的EGFR基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述EGFR基因19Del位点探针对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:14；所述EGFR基因T790M位点探针对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:15；所述EGFR基因L858R位点探针对应的核苷酸序列包括SEQ IDNO:16；其中，所述SEQ ID NO:14、所述SEQ ID NO:15和所述SEQ ID NO:16分别对应的核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有Eclipse以及3’端的ZNA修饰。
7.根据权利要求1所述的EGFR基因突变检测试剂盒，其特征在于，
所述内控基因引物包括内控上游引物和内控下游引物，其中，所述内控上游引物对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:12，所述内控下游引物对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:13；
所述内控基因探针对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO:17，其中，所述SEQ ID NO:17对应的核苷酸序列的5’端标记有CY5、3’端标记有Eclipse以及3’端的ZNA修饰。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的EGFR基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括引物探针混合液、缓冲液、聚合酶反应液、对照样本和纯化水；
所述引物探针混合液为所述EGFR特异性引物、所述EGFR基因突变位点探针、所述内控基因引物和所述内控基因探针配制得到；
所述引物探针混合液、所述缓冲液、所述聚合酶反应液与所述纯化水混合配制得到PCR反应液；
所述对照样本包括阴性对照和阳性对照。
9.根据权利要求8所述的EGFR基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括防污染组分尿嘧啶DNA糖基化酶。
10.一种EGFR基因突变检测方法，使用如权利要求1至9任一项所述的检测试剂盒进行检测，其特征在于，包括如下步骤：
采集EGFR基因突变检测静脉血液样本，处理所述静脉血液样本得到待测血浆样本；
利用所述检测试剂盒中的EGFR特异性引物对所述待测血浆样本的目标区域进行扩增，得到第一扩增产物，并在所述第一扩增产物生成过程中，所述EGFR基因突变位点探针进行水解反应，释放第一荧光信号；
利用所述检测试剂盒中的内控基因引物对所述待测血浆样本中的管家基因进行扩增，得到第二扩增产物，并在所述第二扩增产物生成过程中，所述内控基因探针进行水解反应，释放第二荧光信号；
根据所述第二荧光信号得到内控结果；
当所述内控结果满足预设条件，则根据所述第一荧光信号得到所述待测血浆样本的EGFR基因突变结果。
11.根据权利要求10所述的EGFR基因突变检测方法，其特征在于，所述利用所述检测试剂盒中的EGFR特异性引物对所述待测血浆样本的目标区域进行扩增，得到第一扩增产物的步骤包括：
所述EGFR基因19Del位点引物与所述待测血浆样本中的EGFR基因19Del位点互补配对区域相结合，生成19Del扩增产物；
所述EGFR基因T790M位点引物与所述待测血浆样本中的EGFR基因T790M位点互补配对区域相结合，生成T790M扩增产物；
所述EGFR基因L858R位点引物与所述待测血浆样本中的EGFR基因L858R位点互补配对区域相结合，生成L858R扩增产物。
12.根据权利要求11所述的EGFR基因突变检测方法，其特征在于，所述在所述第一扩增产物生成过程中，所述EGFR基因突变位点探针进行水解反应，释放第一荧光信号的步骤包括：
所述EGFR基因19Del位点引物扩增到所述EGFR基因19Del位点探针的位置时，所述EGFR基因19Del位点探针被所述检测试剂盒中的聚合酶水解，释放19Del类型荧光信号；
所述EGFR基因T790M位点引物扩增到所述EGFR基因T790M位点探针的位置时，所述EGFR基因T790M位点探针被所述检测试剂盒中的聚合酶水解，释放T790M类型荧光信号；
所述EGFR基因L858R位点引物扩增到所述EGFR基因L858R位点探针的位置时，所述EGFR基因L858R位点探针被所述检测试剂盒中的聚合酶水解，释放L858R类型荧光信号。
13.根据权利要求10所述的EGFR基因突变检测方法，其特征在于，在所述利用所述检测试剂盒中的内控基因引物对所述待测血浆样本中的管家基因进行扩增，得到第二扩增产物的步骤之前还包括：
设置阳性对照和阴性对照，利用所述检测试剂盒中的阳性对照样本和阴性对照样本分别与所述待测血浆样本进行反应，获得检测结果；
根据所述检测结果确定所述检测试剂盒的检测有效性。
14.根据权利要求10所述的EGFR基因突变检测方法，其特征在于，所述根据所述第二荧光信号得到内控结果的步骤包括：
检测所述第二荧光信号得到所述第二扩增产物的内控扩增曲线；
根据所述内控扩增曲线确定所述第二扩增产物的内控Ct值。
15.根据权利要求10所述的EGFR基因突变检测方法，其特征在于，所述当所述内控结果满足预设条件，则根据所述第一荧光信号得到所述待测血浆样本的EGFR基因突变结果的步骤包括：
当所述内控Ct值满足预设阈值时，根据所述第一荧光信号得到所述待测血浆样本中所述目标区域对应的扩增曲线；
根据所述扩增曲线得到所述目标区域对应的目标Ct值；
基于所述目标Ct值确定所述待测血浆样本的所述EGFR基因突变结果。
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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