CN110055312A

CN110055312A - 用于检测egfr基因c797s和t790m顺反式突变的引物、探针及试剂盒

Info

Publication number: CN110055312A
Application number: CN201910307605.8A
Authority: CN
Inventors: 陈钊; 莫敏俐; 刘玉忠; 李东霞; 刘阳; 张艳
Original assignee: JIAXING YAKANGBO MEDICAL SCIENCE INSPECTION INSTITUTE Co Ltd
Current assignee: JIAXING YAKANGBO MEDICAL SCIENCE INSPECTION INSTITUTE Co Ltd
Priority date: 2019-04-09
Filing date: 2019-04-09
Publication date: 2019-07-26
Anticipated expiration: 2039-04-09
Also published as: CN110055312B

Abstract

本发明公开了一种用于检测EGFR基因C797S和T790M顺反式突变的引物、探针及试剂盒。本发明所述的引物、探针组合及试剂盒能够实现基于实时荧光PCR技术平台的EGFR基因C797S和T790M顺式双突变的准确检测，具有检测速度快、易于判读结果、检测试剂成本低、检测灵敏度高、特异性强的优点，同时适用于检测组织样本DNA和血浆游离DNA。

Description

用于检测EGFR基因C797S和T790M顺反式突变的引物、探针及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的说，涉及一种用于EGFR基因C797S和T790M顺反式突变检测的引物、探针组合及试剂盒。

背景技术

癌症发病率近年来呈逐年上升趋势，我国每年新增癌症患者达350万人以上。肺癌是世界范围内最常见的癌症之一。在我国，肺癌已成为癌症第一位死因，5年生存率约15％。随着肿瘤分子生物学的发展，靶向药物治疗已在临床得到广泛应用，选择合适的患者进行靶向治疗是其成功的关键。

EGFR(表皮生长因子受体，Epidermal Growth Factor Receptor)是目前肺癌靶向治疗的重要靶点。EGFR基因位于人第7号染色体短臂(7p12)，编码跨细胞膜糖蛋白，胞内区具有酪氨酸激酶(Tyrosine Kinase，TK)活性，负责将胞外信号传递至胞内。异常的EGFR活化能够促进肿瘤细胞的增殖、迁移、分化、血管新生，并且能够抑制肿瘤细胞的凋亡。EGFR基因突变主要发生在胞内TK区域的18～21外显子。研究表明：EGFR基因18、19、21外显子发生突变的肺癌患者服用第一代酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine Kinase Inhibitors，TKIs)类药物(例如易瑞沙、特罗凯、凯美纳等)的疗效较好，第一代TKIs药物的耐药常与EGFR基因发生的20外显子T790M突变有关。最新上市的第三代TKI(例如泰瑞莎)针对携带T790M突变的肺癌患者仍有效，但在治疗一段时间后可能产生耐药，其中重要耐药机制之一是EGFR基因出现20外显子C797S突变。

当EGFR基因C797S和T790M突变共存，且这两个突变位于相同等位基因上，被称为顺式(in cis)构型；当两者共存但位于不同等位基因上，被称为反式(in trans)构型。最新研究发现，EGFR基因C797S和T790M两种突变共存的不同构型与癌症患者对TKIs药物的耐药性和疗效预测相关。当EGFR基因C797S和T790M为反式突变时，患者接受第一代和第三代EGFR-TKI靶向药物的联合治疗是有效的；当EGFR基因C797S和T790M为顺式突变时，患者对目前所有EGFR-TKI靶向药物均产生耐药。

由此可见，在肺癌患者接受EGFR-TKI靶向药物治疗过程中，应针对携带EGFR基因T790M突变的患者，在用药过程中继续检测C797S的突变状态，尤其是当C797S为阳性时，需要进一步鉴定C797S和T790M发生的是顺式还是反式双突变，从而指导医生制定合理的治疗方案，避免延误患者的最佳治疗时机。

针对晚期肺癌患者，当无法通过活检取组织样本检测时，可通过采集全血、分离血浆中游离DNA来实现基因突变的检测。由于活检组织量很少，血浆游离DNA浓度也很低，其中所含的基因突变比例也可能很低，因此不论针对组织样本还是血浆样本，均要求基因突变检测试剂具有高灵敏度和高特异性。

目前针对EGFR基因C797S和T790M顺反式突变检测方法包括高通量测序(NGS)、数字PCR(dPCR)。NGS方法检测灵敏度可达0.2％，但其检测步骤繁杂、试剂费用昂贵、结果判读依赖于生物信息学分析计算，检测周期长；数字PCR方法检测灵敏度可达0.1％，但其检测步骤较多、试剂费用较实时荧光PCR昂贵很多、结果判读也依赖于专用软件、对阴性/阳性区间的划分主要依赖于针对图形的主观判断。NGS和数字PCR仪器、试剂均很昂贵，因此对操作人员也有很高要求。

鉴于此，目前亟需能够快速、简便、高灵敏度、高特异性、试剂费用低、结果易于判读的检测EGFR基因C797S和T790M顺反式突变的试剂盒。特提出本发明。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于实时荧光PCR技术平台的、用于检测EGFR基因T790M(c.2369C＞T)和C797S(c.2390G＞C、c.2389T＞A、c.2388_2389CT＞AA)顺式双突变的引物、探针和试剂盒。本发明的引物和探针包括如下序列：

顺式双突变正向引物(Cis-F1)：GGACATAGTCCAGGAGCG(SEQ ID No：1)

顺式双突变正向引物(Cis-F2)：GACATAGTCCAGGAGGAT(SEQ ID No：2)

顺式双突变正向引物(Cis-F3)：GACATAGTCCAGGAGGATT(SEQ ID No：3)

顺式双突变反向引物(Cis-R)：CACCGTGCARCTCATCTT(SEQ ID No：4)

顺式双突变探针(Cis-PB)：CAGCTCATGCCCTTCGGCTG(SEQ ID No：5)

本发明另一方面提供一种用于在不依赖于T790M突变状态情况下，检测EGFR基因C797S突变状态的引物、探针和试剂盒。本发明的引物和探针包括如下序列：

C797S突变正向引物(C797S-F1)：GCTCATGCCCTTCGGCAC(SEQ ID No：6)

C797S突变正向引物(C797S-F2)：AGCTCATGCCCTTCGGTA(SEQ ID No：7)

C797S突变正向引物(C797S-F3)：AGCTCATGCCCTTCGTAA(SEQ ID No：8)

C797S突变反向引物(C797S-R)：ACCAGTTGAGCAGGTACT(SEQ ID No：9)

C797S突变探针(C797S-PB)：AGCCAATATTGTCTTTGTGTTCCCGGACA(SEQ ID No：10)

本发明另一方面提供一种用于区分EGFR基因C797S和T790M顺式/反式(简称顺反式)双突变的试剂盒。所述试剂盒包括SEQ ID No.1-SEQ ID No.4所示的引物和SEQ IDNo.5所示的探针，还包括SEQ ID No.6-SEQ ID No.9所示的引物和SEQ ID No.10所示的探针。

根据所采用的实时荧光PCR方法，本发明的试剂盒还可以包括用于检测内控基因的引物和探针。

本发明另一方面提供一种用于区分EGFR基因C797S和T790M顺反式突变的方法，其包括以下步骤：

(1)针对EGFR基因C797S和T790M顺反式突变位点，设计特异性引物和探针；

(2)针对携带EGFR基因T790M突变的患者，提取检测样本中DNA，检测样本包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织、全血、血浆、胸腔积液等；

(3)建立实时荧光PCR扩增反应体系；

(4)根据荧光PCR仪显示的Ct值，计算ACt值，根据Cutoff判断检测结果：当C797S突变反应体系检测结果为阳性，且顺式双突变反应体系也为阳性时，检测结果为C797S和T790M存在顺式双突变；当C797S突变反应体系检测结果为阳性，但顺式双突变反应体系为阴性时，则检测结果为C797S和T790M为反式双突变。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明采用了特异性引物和探针技术，不但可以特异性检测EGFR基因C797S突变，还可以特异性检测EGFR基因C797S和T790M的顺式突变，进而区分出C797S和T790M是顺式还是反式双突变。

(2)本发明中检测C797S突变的试剂可同时检测对应的三种碱基类型(c.2390G＞C、c.2389T＞A、c.2388_2389CT＞AA)，避免漏检导致假阴性。

(3)因仅涉及实时荧光PCR反应体系的配制、加样和上机，本发明中的试剂盒的操作步骤非常简单，检测速度快、周期短，提出DNA后可在90分钟内获得结果；判读过程简单，无需其他专业数据分析处理软件，也无需通过图形进行阴性/阳性区间的人为主观判断，非常易于判读结果；检测试剂费用相对于NGS、数字PCR等需要使用昂贵的检测仪器配套专用试剂而言要低很多。

(4)检测灵敏度高，可达0.1％；检测特异性强，针对100ng/μl野生型无假阳性结果。

(5)同时适用于检测多种类型组织样本DNA和血浆游离DNA。

(6)采用实时荧光PCR技术，PCR反应结束后无需开盖，有效避免了核酸气溶胶污染的风险。

(7)相对于NGS、数字PCR方法，本发明中的实时荧光PCR方法和试剂盒检测周期更短、检测试剂成本更低。

附图说明

图1为试剂A检测EGFR基因C797S和T790M发生顺式双突变样本的荧光PCR图。同时选择试剂A的FAM和HEX通道，其中顺式双突变检测在FAM通道(阳性)、内控检测在HEX通道(阳性)。

图2为试剂B检测EGFR基因C797S和T790M发生顺式双突变样本的荧光PCR图。同时选择试剂B的FAM和HEX通道，其中C797S突变检测在FAM通道(阳性)、内控检测在HEX通道(阳性)。

图3为试剂A检测EGFR基因C797S和T790M发生反式双突变样本的荧光PCR图。同时选择试剂A的FAM和HEX通道，其中顺式双突变检测在FAM通道(阴性)、内控检测在HEX通道(阳性)。

图4为试剂B检测EGFR基因C797S和T790M发生反式双突变样本的荧光PCR图。同时选择试剂B的FAM和HEX通道，其中C797S突变检测在FAM通道(阳性)、内控检测在HEX通道(阳性)。

具体实施方式

一.原理

本发明的特异性引物和探针同DNA模板结合后，Taq DNA聚合酶以脱氧核苷酸(dNTP)为底物，对内控基因(Internal Control，IC)、EGFR基因C797S突变型进行体外扩增。检测采用荧光PCR技术，通过特异性探针水解释放荧光，监测PCR反应的进行，通过ΔCt值判定EGFR基因C797S突变状态、并区分C797S和T790M顺反式突变。

根据EGFR基因20外显子上T790M(c.2369C＞T)、C797S(c.2390G＞C、c.2389T＞A、c.2388_2389CT＞AA)所在的碱基位置，首先，设计特异性引物和探针对C797S和T790M处于顺式构型情况下进行检测，仅在两者同时存在于同一个等位基因上时才能被检出。其次，设计引物和探针对C797S突变(不依赖于T790M突变状态，即不论T790M是否发生突变)进行检测。

在本发明中，通过针对引物和探针的设计、筛选和优化，获得了特定的引物和探针的序列，得到了最优的引物和探针组合，分别用于检测EGFR基因C797S和T790M顺式双突变、C797S突变。其中C797S突变对应三种碱基变化(c.2390G＞C、c.2389T＞A、c.2388_2389CT＞AA)。

本发明的试剂盒在EGFR基因C797S突变检测体系中同时设置了内控基因(Internal Control，IC)检测体系。多个反应体系在同一PCR管中同时进行反应。内控基因检测的是EGFR基因保守区。将识别内控基因模板的探针修饰为HEX/VIC荧光基团，将识别C797S突变模板的探针修饰为FAM荧光基团，从而与内控检测通道区分开。通过检测内控基因扩增情况，可分析待检DNA是否能被正常扩增，从而排除漏加试剂或样本、样本含有PCR抑制剂等造成PCR检测失败的情况。

二.实验材料和设备

1.针对突变位点设计合成特异性引物和探针

针对EGFR基因C797S、C797S和T790M顺式突变位点分别设计特异性引物和探针。通过特异性引物和探针优化实现高灵敏度、高特异性和快速检测。当不使用下述引物和探针的最优组合时，无法达到同时具有高灵敏度和高特异性的检测试剂性能结果。本发明所述的引物和探针如下：

(1)用于检测EGFR基因C797S和T790M顺式双突的引物和探针：

顺式双突变正向引物(Cis-F1)：GGACATAGTCCAGGAGCG(SEQ ID No：1)

顺式双突变正向引物(Cis-F2)：GACATAGTCCAGGAGGAT(SEQ ID No：2)

顺式双突变正向引物(Cis-F3)：GACATAGTCCAGGAGGATT(SEQ ID No：3)

顺式双突变反向引物(Cis-R)：CACCGTGCARCTCATCTT(SEQ ID No：4)

顺式双突变探针(Cis-PB)：CAGCTCATGCCCTTCGGCTG(SEQ ID No：5)

(2)不依赖于T790M突变状态、用于检测EGFR基因C797S突变的引物和探针：

C797S突变正向引物(C797S-F1)：GCTCATGCCCTTCGGCAC(SEQ ID No：6)

C797S突变正向引物(C797S-F2)：AGCTCATGCCCTTCGGTA(SEQ ID No：7)

C797S突变正向引物(C797S-F3)：AGCTCATGCCCTTCGTAA(SEQ ID No：8)

C797S突变反向引物(C797S-R)：ACCAGTTGAGCAGGTACT(SEQ ID No：9)

C797S突变探针(C797S-PB)：AGCCAATATTGTCTTTGTGTTCCCGGACA(SEQ ID No：10)

(3)用于检测内控基因的引物和探针：

IC正向引物(IC-F)：GGCATGAACATGACCCTGAAT(SEQ ID No：11)

IC反向引物(IC-R)：TGCTGTGAGGGACAGATCA(SEQ ID No：12)

IC探针(IC-PB)：CGGATGCAGAGCTTCTTCCCATG(SEQ ID No：13)

2.检测样本处理与DNA的提取

携带EGFR基因T790M突变的患者，其检测样本可以是新鲜病理组织、石蜡包埋组织、全血、血浆和胸腔积液。以下仅以石蜡包埋组织样本为例进行说明。

由于DNA样品质量会影响检测结果，因此应确定DNA样品来源的石蜡包埋组织样本中含有癌组织细胞，并且不少于整个样本的25％；将DNA稀释至5-10ng/μl。

3.适用仪器：荧光定量PCR仪，具有FAM、VIC/HEX荧光通道。

4.试剂盒的组成：见表1。

表1：试剂盒组成

其中试剂A用于检测EGFR基因C797S和T790M顺式双突变(FAM通道)和内控基因(HEX/VIC通道)，包含SEQ ID No.1-SEQ ID No.5、SEQ ID No.11-SEQ ID No.13的引物和探针。在试剂A荧光PCR反应终体系中，各引物的终浓度为900nM、各探针的终浓度为600nM、氯化镁终浓度为3.5mM、dNTP终浓度为300μM、Taq DNA聚合酶的终浓度为1.25U/反应，反应体积为25μL。

其中试剂B用于检测EGFR基因C797S突变(FAM通道)和内控基因(HEX/VIC通道)，包含SEQ ID No.6-SEQ ID No.10、SEQ ID No.11-SEQ ID No.13的引物和探针。在试剂B荧光PCR反应终体系中，各引物的终浓度为800nM、各探针的终浓度为800nM、氯化镁终浓度为3.5mM、dNTP终浓度为300μM、Taq DNA聚合酶的终浓度为1.25U/反应，反应体积为25μL。

其中所述内控基因的具体序列可以由本领域技术人员根据实验情况容易地确定。

三.检测方法

以下仅以石蜡包埋组织样本为例进行说明。

1.使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Qiagen公司生产)试剂盒，按照使用说明书进行石蜡包埋组织样本DNA提取。将DNA稀释至5-10ng/μl。

2.取试剂盒中的检测试剂以及阳性质控品(PC)。待检测试剂及阳性质控品PC融化后短暂离心，置于冰上。

3.按19.5∶0.5的体积比例混合试剂A和Taq DNA聚合酶，按19.5∶0.5的体积比例混合试剂B和Taq DNA聚合酶。按20μl/孔分装两种检测试剂与酶的混合液至八连管中。向装有两种检测试剂的八连管中分别加入5μl待检DNA样品、阴性质控品(NC，溶解DNA的缓冲液，由使用者自备)及阳性质控品PC，吹打混匀，盖紧管盖后短暂离心。注意：每种模板需同时加入两种检测试剂孔中进行后续检测。

4.荧光PCR仪检测通道设定需同时选择FAM、HEX/VIC通道(参比染料设置为“无”)。反应程序见表2。

表2荧光PCR反应程序

四.检测结果判定

1.Ct值确定：仪器自动设定荧光PCR仪的基线和阈值线，必要时手工调整，确保阈值线处于扩增曲线指数期。从软件中读取各样本在各检测孔的Ct值。

2.定性分析：

(1)实验质量评判：若NC中各通道检测均无扩增(不呈典型的S型曲线。注：典型的S型曲线依次表现为指数期、直线期及平台期)或无Ct值、PC中各通道检测均有扩增(呈典型的S型曲线)且Ct值≤35，则可继续分析；否则认为实验无效，需重复实验。

(2)待检DNA样品中内控基因(IC)检测情况评判：若内控基因检测(HEX/VIC通道)有扩增且20≤Ct值≤35，则可继续分析；若其Ct值较小，则认为DNA样品浓度过高；若其Ct值较大或无扩增，则认为DNA样品浓度过低、发生降解，或其中可能含有PCR抑制剂。

(3)待检DNA样品中EGFR基因C797S和T790M顺反式突变判定：

计算试剂A、试剂B中突变通道(FAM)Ct值与同一孔中内控通道(HEX/VIC)Ct值的差值(ΔCt)，ΔCt＝突变通道Ct-同孔内控Ct。当突变检测无扩增、或Ct值≥38、或ΔCt≥9，则判定为阴性或低于检测限；当突变检测Ct值＜38且ΔCt＜9，则判定为阳性。

a.若试剂A和试剂B中突变检测均为阴性，则判定为样品中无C797S突变或低于试剂检测限。

b.若试剂B中C797S检测为阳性，且试剂A中C797S和T790M顺式双突变检测也为阳性，则判为C797S和T790M存在顺式双突变。

c.若试剂B中C797S检测为阳性，但试剂A中C797S和T790M顺式双突变检测为阴性时，则检测结果为C797S和T790M不存在顺式双突变，即该样本中C797S和T790M为反式双突变。

下面结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照本领域技术人员熟知的常规条件，或者按照制造厂商建议的条件。

实施例

实施例1检测EGFR基因C797S突变的分析灵敏度(最低检测限)

(1)检测限参考品的制备

a)通过本领域内常规使用的基因克隆技术，根据突变型基因的序列设计并构建对应的突变型质粒，见表3。通过Sanger测序法验证所构建的含EGFR突变型基因序列的质粒(以下简称“突变质粒”)的序列符合设计要求。

表3突变质粒信息

b)选择人肺癌细胞系A549(其中EGFR基因为野生型)进行体外培养，收集细胞后使用细胞基因组DNA提取试剂盒，提取A549细胞系DNA，并使用微量分光光度计对DNA进行浓度测定，根据测定浓度将DNA用TE(Tris-HCl EDTA pH 8.0)稀释至4ng/μl。

c)将每种突变型对应的突变质粒用TE稀释至不同浓度，分别与上述A549细胞基因组DNA(4ng/μl)等体积混合，即可得到2ng/μl基因组DNA且含有不同突变比例的突变参考品。

d)使用NGS(二代测序)试剂盒测定上述参考品中的突变比例，并与野生型DNA混合，即可制备得到不同突变比例(5％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％)的检测限参考品。

e)使用超声仪(Covaris M220型)及使用说明书中的参数配置可将基因组DNA超声打断成150±50bp长度的片段化DNA，与血浆游离DNA(cfDNA)的长度几乎一致，可作为cfDNA参考品使用。

(2)最低检测限的测定

分别针对含有不同突变比例(5％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％)的各突变型的检测限参考品，采用上述方法连续检测20次，将检出率至少95％的最低突变比例确定为检测试剂的最低检测限。

结果表明，不论使用基因组DNA还是cfDNA参考品，根据上述方法配制出的试剂A均可检出C797S和T790M顺式双突变型参考品，最低检测限可达0.1％，且不识别T790M或C797S单一突变型参考品；试剂B均可检出C797S和T790M顺式双突变型参考品、以及C797S单一突变型参考品，最低检测限可达0.1％，且不识别T790M单一突变型参考品。

实施例2检测试剂的分析特异性

(1)野生型参考品的制备

a)选择人肺癌细胞系A549(其中EGFR基因为野生型)进行体外培养，收集细胞后使用细胞基因组DNA提取试剂盒，提取A549细胞系DNA，并使用微量分光光度计对DNA进行浓度测定，根据测定浓度将DNA用TE(Tris-HCl EDTA pH 8.0)分别稀释至2、5、20、50、100ng/μl。

b)使用超声仪(Covaris M220型)及使用说明书中的参数配置可将基因组DNA超声打断成150±50bp长度的片段化DNA，与血浆游离DNA(cfDNA)的长度几乎一致，可作为cfDNA参考品使用。

(2)强阳性参考品的制备

参照实施例1中的方法，配制表3所示的突变型的阳性参考品，使用NGS(二代测序)试剂盒测定阳性参考品中的突变比例，并与野生型DNA混合，即可制备得到较高突变比例(70～90％)的强阳性参考品。

(3)分析特异性的测定

分别针对2、5、20、50、100ng/μl野生型基因组DNA参考品或cfDNA参考品、针对含有较高突变比例(70～90％)的各突变型的强阳性DNA参考品或cfDNA参考品，采用上述方法连续检测5次。

结果表明，不论使用基因组DNA还是cfDNA参考品，根据上述方法配制出的试剂A和试剂B检测野生型DNA时均为阴性，无假阳性结果产生；试剂A均可检出C797S和T790M顺式双突变型参考品，且不识别T790M或C797S单一突变型参考品；试剂B均可检出C797S和T790M顺式双突变型参考品、以及C797S单一突变型参考品，且不识别T790M单一突变型参考品，结果表明试剂A和试剂B不存在交叉反应，具有高度特异性。

实施例3检测用引物和探针序列改变后，影响分析灵敏度和/或分析特异性，使最低检测限无法达到0.1％，且/或存在交叉识别。试剂A存在交叉识别指的是该试剂将野生型DNA误检为阳性，或将仅含T790M或C797S单一突变DNA误检为阳性；试剂B存在交叉识别指的是该试剂将野生型DNA误检为阳性，或将T790M单一突变DNA误检为阳性。

因此本发明所述的引物和探针序列均为最优组合，可确保在检测EGFR基因C797S，以及C797S和T790M顺式双突变时具有高灵敏度和高特异性。

实施例4检测100例携带EGFR基因T790M突变的晚期非小细胞肺癌患者癌组织或血浆样本中EGFR基因C797S和T790M顺反式突变并与NGS结果对比

(1)收集100例携带EGFR基因T790M突变的晚期非小细胞肺癌患者的癌组织石蜡包埋组织样本(60例)或全血样本(40例)。其中，采集全血盛装在可保护游离DNA稳定性的专用抗凝采血管(Streck公司生产)中，在4～30℃可稳定保存7天。

(2)每例样本取2片石蜡切片(5μm厚)，使用石蜡包埋组织DNA提取试剂盒提取组织样本DNA，并使用微量分光光度计检测DNA浓度，将其稀释至2ng/μl待用。DNA样本在-20℃或以下冷冻条件下保存时限不超过3个月。

(3)使用全血样本分离血浆：将全血采血管2000g在室温下离心10分钟；将上清小心取出(避免吸到中间絮状白细胞层)，进行第二次离心，4℃下15000g离心10分钟；分离上清得到不含细胞成分(cell free)的血浆样本，放置于-70℃冻存直至DNA提取，或直接进行DNA提取。

(4)使用血浆游离DNA提取试剂盒(Qigan公司生产)从4ml血浆中提取游离DNA(cfDNA)。提取DNA之后应立即用原液检测，无需稀释。DNA样本在-20℃或以下冷冻条件下保存时限不超过3个月。

(5)针对提取出的组织DNA和游离DNA，各取5μl用作模板，按照上述方法进行EGFR基因C797S和T790M顺反式突变的荧光PCR检测，并与NGS检测结果对比。当NGS结果显示C797S和T790M突变均存在且共存于同一条read(read指的是通过高通量测序得到的序列)上时，表明两者为顺式双突变，如两者分别存在于不同reads上时，表明两者为反式双突变。

结果表明，通过本发明所述的荧光PCR试剂盒检出C797S突变15例(组织5例、血浆10例)，其中C797S和T790M顺式双突变6例(组织2例、血浆4例)、反式双突变9例(组织3例、血浆6例)。荧光PCR检测结果与NGS检测结果完全一致，但检测步骤和结果判定过程相对于NGS方法更为简单方便、检测时间更短。此结果表明通过本发明所述引物、探针和试剂盒可以准确的检测出组织样本和血浆样本中EGFR基因C797S和T790M顺反式突变，且检测操作简单、时间短、结果易于判定。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于检测EGFR基因C797S和T790M顺式双突变的引物、探针组合，其特征在于，所述引物如SEQ ID No.1-SEQ ID No.4所示，所述探针如SEQ ID No.5所示。

2.一种用于检测EGFR基因C797S和T790M顺式双突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括SEQ ID No.1-SEQ ID No.4所示的引物和SEQ ID No.5所示的探针。

3.一种用于检测EGFR基因C797S突变的引物、探针组合，其特征在于，所述引物如SEQID No.6-SEQ ID No.9所示，所述探针如SEQ ID No.10所示。

4.一种用于区分EGFR基因C797S和T790M顺反式双突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括SEQ ID No.1-SEQ ID No.4所示的引物和SEQ ID No.5所示的探针，还包括SEQ IDNo.6-SEQ ID No.9所示的引物和SEQ ID No.10所示的探针。

5.如权利要求2或4所述的试剂盒，其特征在于，其还包括用于检测内控基因的引物和探针。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其中用于检测内控基因的引物如SEQ ID No.11-SEQ IDNo.12所示，用于检测内控基因的探针如SEQ ID No.13所示。

7.一种用于区分EGFR基因C797S和T790M顺反式突变的方法，其包括以下步骤：

(3)建立实时荧光PCR扩增反应体系；

(4)根据荧光PCR仪显示的Ct值，计算ΔCt值，根据Cutoff判断检测结果：当C797S突变反应体系检测结果为阳性，且顺式双突变反应体系也为阳性时，检测结果为C797S和T790M存在顺式双突变；当C797S突变反应体系检测结果为阳性，但顺式双突变反应体系为阴性时，则检测结果为C797S和T790M为反式双突变。