CN110777208B - 一种用于检测braf基因k601e突变的引物、探针及试剂盒 - Google Patents
一种用于检测braf基因k601e突变的引物、探针及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及分子生物技术领域，公开了一种用于检测BRAF基因K601E突变的引物、探针及试剂盒。本发明独特之处在于通过在BRAF基因K601E突变检测引物的3’末端连续设计了2个错配碱基，大大提高了该突变位点检测的特异性，减少了周围临近突变位点对检测的干扰，获得了很好的检测效果。本发明还公开了一种利用上述引物和探针检测BRAF基因K601E突变的检测试剂盒，能够快速、灵敏、准确地检测BRAF基因K601E突变。本发明具有特异性好、灵敏度高、操作简便、成本低廉、结果准确、判读方便等优点，具有良好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，具体地涉及一种用于检测BRAF基因K601E突变的引物、探针及试剂盒。
背景技术
BRAF基因突变常见于一些恶性肿瘤，例如黑色素瘤、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤和大肠癌等。在甲状腺癌中，BRAF基因突变的频率也很高，其中尤以BRAF基因V600E的突变频率最高，因为该突变常常与临床不良预后相关，因此BRAF基因V600E突变是临床检测的重要靶点。
但是，BRAF基因上除了发生V600E突变外，还会发生K601E突变，V600E突变主要和甲状腺乳头状癌（PTC）相关，但K601E突变则是甲状腺滤泡型腺瘤或滤泡型甲状腺乳头状癌（FVPTC）中的特有突变。临床数据证实，和BRAF基因V600E突变不同的是，BRAF基因K601E突变往往是患者预后较好的指标之一。因此，作为一个临床良性预后的分子诊断标识，需要将K601E突变位点与BRAF基因上的其他突变位点，尤其是V600E突变位点区分开来，但目前临床上针对BRAF基因突变的检测，主要还是集中在BRAF基因V600E突变，对于BRAF基因K601E突变的检测方法和检测产品则并不多见。
本发明主要基于扩增阻滞突变系统PCR（ARMS-PCR）的原理对检测体系进行设计和优化。通过检索NCBI数据库，发现BRAF基因K601E突变位点前后25bp的序列中包含5处连续的相同碱基排列，分别为AAAAA、TTT、AAA、GGG、CCC，突变位点处的序列为AAAT。根据PrimerPremier 5.0等设计软件的基本规则，在进行引物探针设计时，要避免同一碱基的重复过多，特别是避免出现连续4个或更多相同碱基，而且在引物的3’端避免为A，避免出现3个及以上连续相同的碱基。同时，在BRAF基因K601E位点附近由于还存在较多其他类型的突变，例如V600E、V600K、V600R等，这些临近位点的突变对BRAF基因K601E突变的检出也造成了很大的干扰。由于存在以上引物探针设计条件的限制，且实验中针对该区域设计的多轮引物探针测试结果显示，根据常规原理设计的引物探针组合特异性差，非特异性扩增明显，无法有效区分BRAF基因野生型和K601E突变型。该位点的引物探针设计需要寻找新的技术方案来解决现有的技术问题。
为此，本发明将引物3’末端设定为K601E突变位点的互补碱基，随后连续引入了2个错配碱基，由于PCR过程中引物延伸是由3’端开始的，3’端的碱基对引物延伸至关重要，在加入2个错配碱基之后，只有突变型模板可以依靠3’末端的碱基对互补实现稳定的扩增，而野生型模板由于3’端连续3个碱基完全不配对，无法进行有效扩增，从而有效区分了BRAF基因野生型和K601E突变型，同时该方法也可降低检测结果中假阳性的发生率。但具体引入哪两个错配碱基，才能达到最优的检测效果，需要经过对检测反应体系和反应条件的不断优化和调整，最终获得了本发明所述的最优的组合方案和PCR反应条件，使BRAF基因K601E突变能被稳定检出，且检出的突变频率的下限稳定在0.5%，优于普通ARMS-PCR的检测方法，满足了临床检测的需求。
在探针选择方面，本发明采用了特异性好、灵敏度高的Taqman MGB探针，探针3’端有NFQ-MGB非荧光淬灭基团修饰，该基团本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度,同时该修饰可以将探针的Tm值提高10℃左右，增加了探针的特异性。同时该条探针为突变体系检测和质控体系检测的通用探针，在保证检测特异性和灵敏度的基础上，降低了检测成本。
最后需要说明的是，利用本发明方法，无需计算ΔCT值，只需通过检测特异性扩增产物的“有”或“无”，即突变检测扩增曲线的“有”或“无”，即可对最终检测结果进行判读，非常简单和直观。
总而言之，本发明公开了一种操作简便、成本低廉、结果准确和判读方便的用于检测BRAF基因K601E突变的引物、探针及试剂盒。本试剂盒以DNA为检测对象，检测样本中是否存在BRAF基因K601E突变，能在60分钟内获得准确的检测结果，且能达到0.5%的突变频率检测下限，具有特异性好、灵敏度高、操作简便、成本低廉、结果准确、判读方便等优点，具有良好的临床应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简便、成本低廉、结果准确、判读方便的检测BRAF基因K601E突变的引物、探针及试剂盒，满足临床上对于BRAF基因K601E突变的检测需求。
本发明提供了一种检测BRAF基因K601E突变的引物和探针，其特征在于检测引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，其中引物序列SEQ ID NO.1的3’末端为突变位点互补碱基C,之后是连续2个错配碱基AC，引入2个错配碱基是为了提升突变检测引物的特异性，探针为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，且所述探针的5’端修饰有FAM荧光基团，3’端修饰有NFQ-MGB非荧光淬灭基团，该基团本身不产生荧光，一方面可以大大降低本底信号的强度，另一方面，当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号，随着PCR的进行，Taq酶在DNA链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5’→3’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离荧光淬灭基团，产生荧光信号。同时该特异性探针上的MGB修饰基团，可以将该探针的Tm值提高10℃左右，增加探针的特异性。
进一步的，还包括质控引物，质控引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示。
其中，核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的引物与核苷酸序列为SEQ IDNO.3的探针一起组成突变检测反应体系，核苷酸序列为SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO.5的引物与核苷酸序列为SEQ ID NO.3的探针组成质控检测反应体系。
上述引物及探针可以应用于制备检测BRAF基因K601E突变的试剂盒。
所述一种检测BRAF基因K601E突变的试剂盒，其特征在于，包含以下试剂：
1）PCR反应液及50×ROX：PCR反应液包含DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、dATP、dTTP、dCTP、dGTP，50×ROX为含ROX荧光的参比染料；
2）突变检测引物探针预混液: 核苷酸序列如SEQ ID NO.：1、2、3所示的引物和探针的混合液，其中每条引物的浓度为10 μM，探针的浓度为10 μM。两条突变检测引物和探针的母液以2：2：1的体积比例混合；
3）质控检测引物探针预混液: 核苷酸序列如SEQ ID NO.：3、4、5所示的探针和引物的混合液，其中每条引物的浓度为10 μM，探针的浓度为10 μM。两条质控检测引物和探针的母液以2：2：1的体积比例混合；
4）阳性对照品：含有BRAF 基因K601E突变的基因组DNA与 BRAF基因野生型的基因组DNA的混合液，其中，BRAF基因K601E突变频率为5%，样本浓度为10ng/μL；
5）阴性对照品：含有BRAF基因野生型的基因组DNA溶液，其中，BRAF基因K601E突变频率为0%，样本浓度为10ng/μL。
上述检测BRAF基因K601E突变的试剂盒在检测BRAF基因K601E突变基因中的应用，包含以下步骤：
1） 样本DNA提取：
根据样本性质，使用相应的DNA提取试剂盒进行样本DNA提取，使用无核酸酶水将提取的DNA稀释至10ng/μL 。
2） 配制PCR反应体系：
PCR反应液 10μL，50×ROX 0.4μL，引物探针预混液 1μL，样本DNA模板 2μL，无核酸酶水6.6μL，总体系20μL。
3） 设置PCR扩增条件：
37℃2min；95℃5min；95℃10s，65℃30s，45个循环；在65℃30s阶段采集FAM通道荧光。
4） 进行实时荧光PCR扩增反应，根据荧光PCR仪的扩增结果按照质控标准对样本是否发生BRAF 基因K601E突变进行判断。
质控标准包括：
a) 阳性对照品：质控检测体系和突变检测体系均有正常平滑扩增曲线，如图1所示；
b) 阴性对照品：质控检测体系有正常平滑扩增曲线，突变检测体系没有扩增曲线，如图2所示；
c) 样本质控：质控检测体系有正常平滑扩增曲线。
符合上述条件的即为质控合格。
样本检测结果的判读：
a) 在质控合格的前提下，如样本突变检测体系检测到正常平滑扩增曲线，则样本为BRAF基因K601E突变阳性；
b) 在质控合格的前提下，如样本突变检测体系未检测到扩增曲线，则样本为BRAF基因K601E突变阴性。
本发明的有益效果在于：（1）通过在3’端连续引入2个错配碱基，进行了特殊的引物设计，有效提升了检测的特异性，减少了BRAF基因K601E突变位点周围可能存在的其他突变情况对检测结果的干扰，避免了假阳性的出现；（2）突变频率的检测下限可以达到0.5%，优于普通ARMS-PCR方法1%的检测下限，具有更高的灵敏度；（3）突变检测体系和质控检测体系共用了一条Taqman探针，提升了质控的准确性，降低了检测成本；（4）本发明试剂盒，基于实时荧光PCR体系，实现了对BRAF基因K601E突变的快速检测，灵敏度高，特异性强，检测时间短，只需60分钟就可完成检测；（5）检测结果判读方便，根据扩增信号的“有”或“无”即可判定结果，无需计算ΔCT值，大大降低了结果判读的难度；（6）样本适用范围广，样本可以是全血、新鲜病理组织、石蜡包埋组织或冰冻病理切片。
附图说明
图1为用试剂盒检测BRAF基因K601E阳性对照品的效果图。
图2为用试剂盒检测BRAF基因野生型的效果图。
图3为本发明引物和探针组合与其他引物和探针组合在检测BRAF基因K601E突变阳性对照品时的效果图。
图4为用试剂盒检测不同突变频率的BRAF基因K601E标准品的效果图。
图5为1例用试剂盒检测BRAF基因 K601E突变阳性的临床样本的效果图。
图6为1例BRAF基因K601E突变阳性的临床样本的一代测序结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
实施例1
本发明涉及一种用于检测BRAF基因K601E突变的引物和探针，其设计流程如下：
1） 根据NCBI数据库BRAF基因K601E突变序列信息，发现BRAF基因K601E突变位点前后25bp的序列中包含5处连续的相同碱基排列，分别为AAAAA、TTT、AAA、GGG、CCC，突变位点处的序列为AAAT。如果按照常规引物和探针设计的思路，难以获得有效的引物和探针组合用于区分BRAF基因K601E的突变型和野生型。因此考虑通过在突变位点正向引物的3’端连续引入2个错配碱基，经过多轮测试验证和优化，最终找到可以有效区分BRAF基因K601E突变型和野生型的引物和探针组合，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3所示（具体见表1）。探针的5’端修饰有FAM荧光基团，3’端修饰有NFQ-MGB非荧光淬灭基团，可以降低本底信号，提高检测的特异性。
2） 选择BRAF基因K601E突变位点附近的保守区域作为质控区域，分别设计上下游引物，质控引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示（具体见表1），同时选择核苷酸序列为SEQ ID NO.3的检测探针作为质控探针。
表1 检测BRAF基因K601E突变的引物和探针的核苷酸序列
实施例2
本发明涉及一种用于检测BRAF基因K601E突变的试剂盒，主要包括：
1） PCR反应液及50×ROX：购于南京诺唯赞生物科技有限公司，货号Q113-02。2×AceQ®U+ Probe Master Mix为2×PCR反应液，包含DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、dATP、dTTP、dCTP、dGTP等组分，-20℃保存，50×ROX Reference Dye为50×ROX，包含ROX荧光的参比染料，-20℃避光保存；
2） 突变检测引物探针预混液:核苷酸序列如SEQ ID NO.：1、2、3所示的引物和探针的混合液，其中每条引物的浓度为10 μM，探针的浓度为10 μM。两条突变检测引物和探针的母液以2：2：1的体积比例混合，-20℃避光保存；
3） 质控检测引物探针预混液: 核苷酸序列如SEQ ID NO.：3、4、5所示的探针和引物的混合液，其中每条引物的浓度为10 μM，探针的浓度为10 μM。两条质控检测引物和探针的母液以2：2：1的体积比例混合，-20℃避光保存；
4） 阳性对照品：含有BRAF 基因K601E突变的基因组DNA与 BRAF野生型的基因组DNA的混合液，其中，BRAF基因K601E突变频率为5%，样本浓度为10ng/μL，-20℃保存；
5） 阴性对照品：含有BRAF基因野生型的基因组DNA溶液，其中，BRAF基因K601E突变频率为0%，样本浓度为10ng/μL，-20℃保存；
实施例3
一种检测BRAF基因K601E突变的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
1） 样本DNA提取：
根据样本性质，使用相应的DNA提取试剂盒进行样本DNA提取，使用无核酸酶水将提取的DNA稀释至10ng/μL 备用，提取后的DNA应立即使用或放置4℃，若暂时不用需放置在-20℃保存。
2）配制突变检测PCR反应体系：
从-20℃冰箱里取出试剂盒各组分，室温融化，放冰盒上备用。按检测样本数配制PCR反应液（另+1份阴性对照+1份阳性对照+1份空白对照），其中一个PCR反应体系包括：
| 试剂 | 体积 |
| PCR反应液 | 10μL |
| 50×ROX Dye | 0.4μL |
| 突变检测引物探针预混液 | 1μL |
| gDNA(10ng/μL) | 2μL |
| 无核酸酶水 | 6.6μL |
3）配制质控检测PCR反应体系
从-20℃冰箱取出试剂盒各组分，室温融化，放冰盒上备用。按检测样本数配制PCR反应液（另+1份阴性对照+1份阳性对照），其中一个PCR反应体系包括：
| 试剂 | 体积 |
| PCR反应液 | 10μL |
| 50×ROX Dye | 0.4μL |
| 质控检测引物探针预混液 | 1μL |
| gDNA(10ng/μL) | 2μL |
| 无核酸酶水 | 6.6μL |
4）设置PCR扩增条件：
按照下列反应程序在美国Illumina公司的7500荧光定量PCR仪上进行设置：
反应结束后，65℃时采集FAM通道荧光。
5）根据荧光PCR扩增结果按照质控标准对样本是否发生BRAF 基因K601E突变进行判断：
质控标准包括：
a)阳性对照品：质控检测体系和突变检测体系均有正常平滑扩增曲线，如图1所示；
b) 阴性对照品：质控检测体系有正常平滑扩增曲线，突变检测体系没有扩增曲线，如图2所示；
c) 样本质控：质控检测体系有正常平滑扩增曲线。
符合上述条件的即为质控合格。
样本检测结果的判读：
a) 在质控合格的前提下，如样本突变检测体系检测到正常平滑扩增曲线，则样本为BRAF基因K601E突变阳性；
b) 在质控合格的前提下，如样本突变检测体系未检测到扩增曲线，则样本为BRAF基因K601E突变阴性。
实施例4
比较了采用常规设计方法所获得引物与采用本发明方法所获得多种引物和探针组合，在检测BRAF基因K601E突变时的检测效果，以测试除本发明所述最优的引物和探针组合之外是否还有更优的选择。引物具体的核苷酸序列如表2所示，探针仍为核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针。
表2 检测BRAF基因K601E突变的引物核苷酸序列
| 序号 | 名称 | 序列(5’- 3’) |
| SEQ ID NO.1 | BRAF K601E-F | 5’-GGGACCCACTCCATCGAGAACC-3’ |
| SEQ ID NO.6 | BRAF K601E突变引物F1 | 5’-GGGACCCACTCCATCGAGTCTC-3’ |
| SEQ ID NO.7 | BRAF K601E突变引物F2 | 5’-GGGACCCACTCCATCGAGTTAC-3’ |
| SEQ ID NO.8 | BRAF K601E突变引物F3 | 5’-GGGACCCACTCCATCGAGAAAC-3’ |
| SEQ ID NO.9 | BRAF K601E突变引物F4 | 5’-GGGACCCACTCCATCGAGAGAC-3’ |
| SEQ ID NO.10 | BRAF K601E突变引物F5 | 5’-GGGACCCACTCCATCGAGATAC-3’ |
根据实施例3所述方法进行引物和探针的组合测试试验，分别检测阴性对照品，检测结果如图3所示。图中编号为1-6的扩增曲线分别对应核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10的引物的PCR扩增曲线图。图3中3-6号的扩增曲线显示，在第26个循环之前就出现了扩增信号，表明相应引物的扩增特异性较差，产生了非特异性扩增，图3中2号扩增曲线显示，在第34个循环左右也出现了扩增信号，产生了非特异性扩增，只有图中1号曲线平稳，始终没有扩增信号出现，也就意味着无非特异性扩增产生，因此本发明的引物序列SEQ ID NO.1和探针序列SEQ ID NO.3的组合与其他利用常规方法所设计的引物和探针组合相比具有最佳的检测效果。
实施例5
对不同突变频率的标准品（经测序确认的突变型质粒与野生型质粒混合，突变频率分别为0.1%、0.5%、1%、5%）使用本发明所述的试剂盒进行验证，检测方法根据实施例3所述步骤进行，每个突变频率的标准品分别做5次重复，标准品质控检测扩增曲线为正常平滑扩增曲线，符合样本质控检测标准，最终结果如图4和表3所示。图4为用试剂盒检测不同突变频率的BRAF基因K601E标准品的检测扩增曲线。结果显示，突变频率分别为0.5%、1%、5%的BRAF基因K601E标准品，在5次重复检测的过程中均能被稳定检出，变异系数CV值小于5%，而突变频率为0.1%的标准品，在5次重复检测过程中，有3次被检出，2次未被检出，检测结果不稳定。因此，本发明试剂盒的稳定检出下限为0.5%的突变频率，已经优于普通ARMS-PCR方法1%的检测下限，表现出更高的检测灵敏度，能检出临床上较低的突变频率。
表3 用试剂盒检测不同突变频率的BRAF基因K601E标准品的检测结果
实施例6
分别对12例临床患者使用本发明所述试剂盒进行检测，并将检测结果与一代测序的检测结果进行对比分析，结果如表4所示，表明本发明所述试剂盒的检测结果与一代测序的检测结果完全吻合。图5为使用本发明试剂盒检测出的1例BRAF基因 K601E突变阳性临床样本的实验结果，图6为上述阳性临床样本用一代测序进行验证的结果图，箭头标识处显示该患者的测序结果为BRAF基因 K601E杂合型突变（一代测序产物全长为350bp，BRAF基因K601E位点位于该测序反应中的第191号位置），与本发明试剂盒的检测结果一致。
表4 12例临床样本试剂盒检测结果与一代测序检测结果的对比
| 临床样本编号 | 试剂盒检测结果 | 一代测序检测结果 |
| 临床样本1 | 阴性 | 阴性 |
| 临床样本2 | 阴性 | 阴性 |
| 临床样本3 | 阴性 | 阴性 |
| 临床样本4 | 阴性 | 阴性 |
| 临床样本5 | 阴性 | 阴性 |
| 临床样本6 | 阴性 | 阴性 |
| 临床样本7 | 阴性 | 阴性 |
| 临床样本8 | 阳性 | 杂合 |
| 临床样本9 | 阴性 | 阴性 |
| 临床样本10 | 阴性 | 阴性 |
| 临床样本11 | 阴性 | 阴性 |
| 临床样本12 | 阴性 | 阴性 |
最后说明的是，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制。上文中已经用具体实施方案描述了本发明的基本原理和主要特征，在本发明的基础上，可以对之进行一些修改或替换，但这些修改或者替换并不使相应技术方案的本质脱离本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 上海润安医学科技有限公司
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gggacccact ccatcgagaa cc 22
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
cctttactta ctacacctca gatatatttc ttcatga 37
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
cacagtaaaa ataggtgat 19
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ctgttttcct ttacttacta cacctcagat 30
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
caactgttca aactgatggg 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
gggacccact ccatcgagtc tc 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gggacccact ccatcgagtt ac 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gggacccact ccatcgagaa ac 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
gggacccact ccatcgagag ac 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
gggacccact ccatcgagat ac 22
Claims (5)
1.一种用于检测BRAF基因K601E突变的引物和探针，其特征在于，检测引物为SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，质控引物为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，探针为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，且所述探针的5’端修饰有FAM荧光基团，3’端修饰有NFQ-MGB非荧光淬灭基团。
2.一种用于检测BRAF基因K601E突变的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物和探针。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，含有阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为含有BRAF 基因K601E突变的基因组DNA与BRAF基因野生型的基因组DNA的混合液，所述阴性对照品为含有BRAF基因野生型的基因组DNA溶液。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应液及50×ROX。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，使用方法包括以下步骤：
（1）样本DNA提取；
（2）配制PCR反应体系；
（3）设置PCR扩增条件；
（4）进行实时荧光PCR扩增反应，根据荧光PCR仪的扩增结果按照质控标准对样本是否发生BRAF 基因K601E突变进行判断。
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