CN105567850A - 用于定量检测rprm基因dna甲基化试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于定量检测RPRM基因DNA甲基化试剂盒及方法，所述的试剂盒包含：重亚硫酸盐转化反应液，玻璃纤维膜离心柱，结合缓冲液，漂洗缓冲液、脱硫缓冲液，洗脱缓冲液，2×SYBR？GREEN？I预混反应液，引物RPRM-F与RPRM-R，甲基化阳性对照质粒SM及非甲基化阳性对照质粒SU。在2小时内完成对DNA的重亚硫酸盐转化，经纯化后，通过特异的引物对转化后的？RPRM基因DNA区域进行PCR扩增，然后进行甲基化敏感的熔解曲线分析（MS-MCA），从而检测是否有RPRM基因的甲基化及甲基化的程度。该方法以血浆为检测样本，操作程序大为简化、灵敏度高、特异性好、检测结果稳定，有重要的应用前景。

Description

用于定量检测RPRM基因DNA甲基化试剂盒及方法
技术领域
本发明的属于生物技术领域，具体涉及用于定量检测RPRM基因DNA甲基化试剂盒及方法。
背景技术
DNA甲基化作为最基本的表观遗传学调控机制，是肿瘤中最常见的基因分子改变之一，尤其表现在肿瘤抑制基因与错配修复基因上，能导致基因编码区的突变和使基因失活而有利于肿瘤的发展，是癌症发生的重要指标之一。人类不同类型的癌症基因甲基化模式图谱的建立是相关领域研究的一项重要内容。目前已在肺癌、胃癌、头部和颈部癌症、膀胱癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、和胆囊癌等中发现基因的异常甲基化。
RPRM基因的全称：reprimo,TP53dependentG2arrestmediatorcandidate，是一种p53肿瘤抑制因子诱导表达的基因，位于染色体2q23位点上，该位点等位基因失衡已被证明与肺癌、乳腺癌和结肠癌等相关联。在许多癌症和肿瘤细胞株的检测中，都发现了RPRM基因的异常甲基化，包括胃癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、大肠癌、食道癌、胆囊癌、淋巴瘤、白血病、乳腺癌患者。特别是在早期胃癌的血浆样品检测中，只有RPRM有高甲基化频率（>70％），而正常的对照血浆无明显的经常性甲基化，说明发现于癌症的RPRM甲基化，很少发生在非恶性的组织中。因此，RPRM甲基化作为胃癌早期血清学活检的生物标志物是有潜力的。另一方面，胃癌患者RPRM甲基化检测并与胃黏膜萎缩标记和幽门螺杆菌检测相结合有可能建立起胃癌早期检测的指标。此外，由于RPRM甲基化是胃癌患者的重要指标之一，有可能用于胃癌的预后检测中。目前RPRM甲基化检测已在美国被批准进入临床试验阶段。因此，RPRM基因甲基化，作为癌症诊治中重要的血清分子标志物，可以作为诊断和治疗中的一项重要参考依据。
基因甲基化主要发生于CpG位点的C（即胞嘧啶）上，在重亚硫酸盐的作用下，胞嘧啶将转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变，再进一步通过DNA测序分析等方法，区别胞密啶及尿密啶。因此，通过重亚硫酸盐转化可以区别胞嘧啶的甲基化或者非甲基化。本发明，改进了重亚硫酸盐转化的方法，并通过建立甲基化修饰及非修饰内参质粒，配合实时PCR的方法及阈值截取，将重亚硫酸盐转化PCR方法加以优化，进行DNA甲基化敏感的熔解曲线分析，达到对DNA甲基化进行定量检测的目的。该方法不仅可用于定量检测RPRM基因DNA甲基化，也可用于定量检测其他基因DNA甲基化，且免除了DNA测序的步骤，而且对甲基化的程度可以加以定量分析，操作较为简便，成本较低，非常适合于未来大量样本的高通量分析。
发明内容
本发明的目的在于提供用于定量检测RPRM基因DNA甲基化试剂盒及方法，该方法不仅可用于定量检测RPRM基因DNA甲基化，也可用于定量检测其他基因DNA甲基化，且免除了DNA测序的步骤，而且对甲基化的程度可以加以定量分析，操作较为简便，成本较低，非常适合于未来大量样本的高通量分析。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
用于定量检测RPRM基因DNA甲基化试剂盒，包含：DNA转化试剂组分（重亚硫酸盐转化反应液），DNA纯化试剂组分（玻璃纤维膜离心柱，结合缓冲液，漂洗缓冲液、脱硫缓冲液，洗脱缓冲液），甲基化检测试剂组分（2×SYBRGREENI预混反应液，引物RPRM-F与RPRM-R，甲基化阳性对照质粒SM及非甲基化阳性对照质粒SU）。
用于定量检测RPRM基因DNA甲基化的方法，所述方法包括如下：
（1）在0.2毫升的PCR管中，加入含有1纳克至1微克DNA的20微升DNA水溶液，然后加入80微升重亚硫酸盐转化反应液，进行DNA转化反应；将上述转化反应后100微升的DNA溶液，进行如下纯化处理。
（2）将上述转化反应后100微升溶液，与500微升结合缓冲液进行混合，通过玻璃纤维膜离心柱收集转化后的DNA，并用漂洗缓冲液进行清洗；离心弃去漂洗缓冲液，加入脱硫缓冲液进行脱硫处理，用漂洗缓冲液再清洗两次；离心弃去漂洗缓冲液，然后用30微升洗脱缓冲液收集玻璃纤维膜离心柱上经处理后的DNA。
（3）取上述纯化后的DNA溶液1微升转移到0.1毫升的PCR管中，在含1×SYBRGREENI预混反应液，0.25微摩尔/升RPRM-F、RPRM-R引物的反应液中进行实时聚合酶链式反应扩增；条件如下：扩增阶段：95℃、30秒；[95℃、5秒，56℃、15秒，72℃、30秒]40个循环；熔解曲线阶段：95℃、15秒，然后从72℃-88℃每升高0.1℃读取一次荧光值，将得到的结果进行熔解曲线法分析，以确定样本中RPRM基因启动子特异DNA序列甲基化的程度。
步骤（3）中的熔解曲线法分析使用两种标准质粒作为参照：甲基化的RPRM基因序列经重亚硫酸盐转化后的M-seq，序列为SEQIDNO.2，而非甲基化序列转化后U-seq，序列为SEQIDNO.3，然后分别将这两种序列克隆至载体上作为阳性对照标准样品SM和SU，进行上述（3）所描述的实时PCR扩增及熔解曲线分析。
具体为：
用于定量检测RPRM基因DNA甲基化试剂盒，包含：DNA转化试剂组分（重亚硫酸盐转化反应液），DNA纯化试剂组分（玻璃纤维膜离心柱，结合缓冲液，漂洗缓冲液、脱硫缓冲液，洗脱缓冲液），甲基化检测试剂组分（2×SYBRGREENI预混反应液，引物RPRM-F与RPRM-R，甲基化阳性对照质粒SM及非甲基化阳性对照质粒SU）。
所述DNA转化试剂组分中，重亚硫酸盐转化反应液含5摩尔/升NaHSO3，12.5wt.%乙二醇二甲醚（DME），pH5.0。
所述DNA纯化试剂组分中，结合缓冲液含6摩尔/升盐酸胍；漂洗缓冲液含10毫摩尔/升Tris-Cl，pH6.8，体积分数80%乙醇；脱硫缓冲液含200毫摩尔/升NaOH，100毫摩尔/升NaCl，体积分数30%乙醇，体积分数5%甘油；洗脱缓冲液含10毫摩尔/升Tris-Cl，1毫摩尔/升EDTA，pH8.0。
所述的引物RPRM-F为：5’-GTTTTAGAAGAGTTTAGTTGTTG-3’；RPRM-R为5’-CTACTATTAACCAAAAACAAAC-3’。
所述的2×SYBRGREENI预混反应液含有2毫摩尔/升MgCl2、100毫摩尔/升Tris-Cl，1个酶活力单位/微升TaqDNA聚合酶，5毫摩尔/升dNTPs，2×SYBRGREENI染料和2×ROXI校准染料。其中2×SYBRGREENI染料、2×ROXI校准染料购买自北京博凌科为生物科技有限公司。
用于定量检测RPRM基因DNA甲基化的方法，包括如下：
（1）DNA重亚硫酸盐转化反应：
在0.2毫升的PCR管中，加入含有1纳克至1微克DNA的20微升DNA水溶液，然后与80微升转化反应液混匀；将PCR管置于热循环仪中进行如下反应：95℃3分钟预变性；[95℃30秒，70℃10分钟]12个循环。
（2）DNA纯化处理：
将上述转化反应后100微升溶液，与500微升结合缓冲液进行混合，然后全部转移至玻璃纤维膜离心柱中，12000转/秒转速离心1分钟；弃去流出液，加入500微升漂洗缓冲液，12000转/秒转速离心1分钟；弃去流出液，加入250微升脱硫缓冲液，室温放置10分钟，12000转/秒转速离心1分钟；弃去流出液，加入500微升漂洗缓冲液，12000转/秒转速离心1分钟，然后再重复此步骤一次；12000转/秒转速离心2分钟彻底甩去残留的漂洗缓冲液，然后将离心柱转移至新的1.5毫升Eppendorf管中；加30微升洗脱缓冲液，室温放置2分钟，然后12000转/秒转速离心1分钟收集纯化后的DNA。
（3）PCR反应及MS-MCA（Methylation-sensitiveMeltCurveAnalysis）分析：
在0.1毫升的荧光定量PCR管中，加入8微升超纯水，10微升2×SYBRGREENI预混反应液，浓度为10微摩尔/升RPRM-F和RPRM-R引物各0.5微升，最后加入1微升上述纯化的DNA，混匀。然后将PCR管置于荧光定量PCR仪中进行如下反应：扩增阶段：95℃30秒预变性；[95℃5秒，56℃15秒，72℃30秒]共40个循环；熔解曲线阶段：95℃15秒预变性，然后从72℃-88℃每升高0.1℃读取一次荧光值，将得到的结果进行熔解曲线法分析，以确定样本中RPRM基因启动子特异DNA序列甲基化的程度。
（4）阳性对照：
在上述（3）的分析中，需要在另外的荧光定量PCR管中使用两种标准质粒SM和SU作为参照。人基因组RPRM靶基因序列（SEQIDNo.1,Ref-seq），完全甲基化的基因组DNA经重亚硫酸盐转化后相应的序列（SEQIDNo.2,M-seq），以及非甲基化的基因组转化后相应的序列（SEQIDNo.3,U-seq）如下：
SEQIDNo.1,Ref-seq：
gctttagaagagcctagctgctgcgcgcgtcggagaggctcctgggaaactcccacggcccagggactttcgaaagcagagcgaggagccctcgcacgcgctagtctgcgagtgagcgctcagcccggcacctgttcctccagcgccgccgccttcccacccctcggacccgcgccgctcgcggcgcccgcccgttcctgcgatgaatccggccctaggcaaccagacggacgtggcgggcctgttcctggccaacagcag
SEQIDNo.2,M-seq，SM：
gttttagaagagtttagttgttgcgcgcgtcggagaggtttttgggaaatttttacggtttagggattttcgaaagtagagcgaggagttttcgtacgcgttagtttgcgagtgagcgtttagttcggtatttgtttttttagcgtcgtcgtttttttatttttcggattcgcgtcgttcgcggcgttcgttcgtttttgcgatgaattcggttttaggtaattagacggacgtggcgggtttgtttttggttaatagtag
SEQIDNo.3,U-seq，SU：
gttttagaagagtttagttgttgtgtgtgttggagaggtttttgggaaatttttatggtttagggatttttgaaagtagagtgaggagtttttgtatgtgttagtttgtgagtgagtgtttagtttggtatttgtttttttagtgttgttgtttttttattttttggatttgtgttgtttgtggtgtttgtttgtttttgtgatgaatttggttttaggtaattagatggatgtggtgggtttgtttttggttaatagtag
将上述M-seq和U-seq两种序列分别克隆至pGEM?-TEasy载体（Promega，USA）上作为阳性对照标准样品SM和SU，与样品进行上述（3）所描述的实时PCR扩增及熔解曲线分析。引物RPRM-F与RPRM-R可对SM和SU进行无差异的扩增，但在熔解曲线阶段将区分为完全甲基化和非甲基化的标准峰型。
本发明的优点在于：通过构建阳性对照标准质粒，配合实时PCR的方法及熔解曲线分析，将重亚硫酸盐转化PCR方法加以优化，同时通过甲基化敏感的熔解曲线分析，达到对DNA甲基化进行定量检测的目的。该方法不仅可用于定量检测RPRM基因DNA甲基化，也可用于定量检测其他基因DNA甲基化，且免除了DNA测序的步骤，而且对甲基化的程度可以加以定量分析，操作较为简便，成本较低，非常适合于未来大量样本的高通量分析。
附图说明
图1SM的转化态峰型示例。其中，SM质粒经重亚硫酸盐的转化以及MS-MCA所得到的峰型如图中带符号标记曲线所示（SX）。左右两个实线曲线分别为SU和SM阳性对照质粒产生的峰型。
图2以SM作为标准DNA样品，依次稀释为1×10-1纳摩尔/升，1×10-2纳摩尔/升，1×10-3纳摩尔/升，1×10-4纳摩尔/升，1×10-5纳摩尔/升浓度，经qPCR扩增，以Ct值为纵坐标，浓度的对数值为横坐标生成标准曲线。
图3不同重亚硫酸盐对SMDNA的转化及降解情况。A，用混合亚硫酸盐，NaHSO3，以及Na2S2O5对SM进行转化，反应2小时及6小时的转化率；B，用混合亚硫酸盐，NaHSO3，以及Na2S2O5对SM进行转化，反应6小时后的DNA降解率。
图4高温加热条件对SMDNA转化影响。A，不同的高温加热条件对DNA转化率的影响；B，不同的高温加热条件对DNA降解率的影响。其中，反应条件分别为：a，[95℃5分钟，60℃30分钟]6循环；b，95℃3分钟，[95℃30秒，60℃10分钟]18循环；c，[95℃10秒，60℃10分钟]18循环；d，95℃3分钟，60℃3小时。
图5转化反应温度对SMDNA转化影响。A，不同的转化温度对DNA转化率的影响；B，不同的转化温度对DNA降解率的影响。其中，反应条件分别为：e，95℃3分钟，[95℃30秒，60℃10分钟]18循环；f，95℃3分钟，[95℃30秒，70℃10分钟]18循环；g，95℃3分钟，[95℃30秒，80℃10分钟]18循环；h，95℃3分钟，[95℃30秒，90℃10分钟]18循环。
图6变性剂对SMDNA转化影响。A，不同的变性剂对DNA转化率的影响；B，不同的变性剂对DNA降解率的影响。
图7变性剂对AGS细胞系基因组DNA转化影响。A，反应2小时内不同的变性剂对AGSDNA转化的促进作用；B，反应2小时内不同的变性剂对最终获得的靶序列拷贝数的影响。
图8变性剂对PBMC基因组DNA转化影响。A，反应2小时内不同的变性剂对PBMCDNA转化的促进作用；B，反应2小时内不同的变性剂对最终获得的靶序列拷贝数的影响。
图9优化配方，Qiagen试剂盒及传统转化方法对于SMDNA转化的比较。A，加入DME的重亚硫酸盐溶液，Qiagen试剂盒及传统转化方法对SMDNA的转化率；B，加入DME的重亚硫酸盐溶液，Qiagen试剂盒及传统转化方法对SMDNA的降解率。
图10优化配方，Qiagen试剂盒及传统转化方法对于BGC-823DNA转化的比较。A，加入DME的重亚硫酸盐溶液，Qiagen试剂盒及传统转化方法对BGC-823DNA的转化情况；B，加入DME的重亚硫酸盐溶液，Qiagen试剂盒及传统转化方法转化1微克BGC-823DNA获得的靶序列拷贝数。
图11优化配方，Qiagen试剂盒及传统转化方法对于PBMCDNA转化的比较。A，加入DME的重亚硫酸盐溶液，Qiagen试剂盒及传统转化方法对PBMCDNA的转化情况；B，加入DME的重亚硫酸盐溶液，Qiagen试剂盒及传统转化方法转化1微克PBMCDNA获得的靶序列拷贝数。
图1220例PBMC样本RPRM基因熔解曲线峰型。
图13混合样本的甲基化扩增产物与初始甲基化DNA含量关系的标准曲线。
图14正常人及胃癌患者血浆DNA样本RPRM甲基化分析示例。A，5例正常人血浆DNA样本RPRM甲基化检测结果；B，5例胃癌患者血浆DNA样本RPRM甲基化检测结果。
具体实施方式
用于定量检测RPRM基因DNA甲基化试剂盒，包含玻璃纤维膜离心柱，转化反应液（5摩尔/升NaHSO3、12.5wt.%DME，pH5.0），结合缓冲液（6摩尔/升盐酸胍），漂洗缓冲液（10毫摩尔/升Tris-ClpH6.8，80%乙醇）脱硫缓冲液（200毫摩尔/升NaOH、100毫摩尔/升NaCl、30%乙醇、5%甘油），洗脱缓冲液（10毫摩尔/升Tris-Cl、1毫摩尔/升EDTA，pH8.0），2×SYBRGREENI预混反应液，引物RPRM-F（10微摩尔/升，序列为GTTTTAGAAGAGTTTAGTTGTTG）与RPRM-R（10微摩尔/升，序列为CTACTATTAACCAAAAACAAAC），甲基化阳性对照质粒SM及非甲基化阳性对照质粒SU。
用于定量检测RPRM基因DNA甲基化的方法，所述方法包括如下：
（1）在0.2毫升的PCR管中，加入含有1纳克至1微克DNA的20微升DNA水溶液，然后加入80微升含5摩尔/升NaHSO3、12.5%DME，pH5.0的转化反应液，混匀，使转化反应液终浓度达到4摩尔/升NaHSO3、10%DME，pH5.0的条件；反应条件为：95℃3分钟；接着，95℃30秒，70℃10分钟，共12个循环；将上述转化反应后100微升的DNA溶液，进行如下纯化处理。
（2）将上述转化反应后100微升溶液，与500微升结合缓冲液进行混合，然后全部转移至玻璃纤维膜离心柱中，12000转/秒转速离心1分钟；弃去流出液，加入500微升漂洗缓冲液，12000转/秒转速离心1分钟；弃去流出液，加入250微升脱硫缓冲液，室温放置10分钟，12000转/秒转速离心1分钟；弃去流出液，加入500微升漂洗缓冲液，12000转/秒转速离心1分钟，然后再重复此步骤一次；12000转/秒转速离心2分钟彻底甩去残留的漂洗缓冲液，然后将离心柱转移至新的1.5毫升Eppendorf管中；加30微升洗脱缓冲液，室温放置2分钟，然后12000转/秒转速离心1分钟收集纯化后的DNA。
（3）取上述纯化后的DNA溶液1微升转移到0.1毫升的PCR管中，加入10微升2×SYBRGREENI预混反应液（2毫摩尔/升MgCl2、100毫摩尔/升Tris-Cl，1个酶活力单位/微升TaqDNA聚合酶，5毫摩尔/升dNTPs，2×SYBRGREENI染料和2×ROXI校准染料），10微摩尔/升引物RPRM-F、RPRM-R各0.5微升，补足超纯水至20微升，然后在PCR仪器上进行实时聚合酶链式反应扩增；条件如下：扩增阶段：95℃、30秒；[95℃、5秒，56℃、15秒，72℃、30秒]40个循环；熔解曲线阶段：95℃、15秒，然后从72℃-88℃每升高0.1℃读取一次荧光值，将得到的结果进行熔解曲线法分析，以确定样本中RPRM基因启动子特异DNA序列甲基化的程度。
所述的引物RPRM-F为：5’-GTTTTAGAAGAGTTTAGTTGTTG-3’；RPRM-R为5’-CTACTATTAACCAAAAACAAAC-3’。
步骤（3）中的熔解曲线法分析使用两种标准质粒作为参照：甲基化的RPRM基因序列经重亚硫酸盐转化后的M-seq，序列为SEQIDNO.2，而非甲基化序列转化后U-seq，序列为SEQIDNO.3，然后分别将这两种序列克隆至载体上作为阳性对照标准样品SM和SU，进行上述（3）所描述的实时PCR扩增及熔解曲线分析。
所述的结合缓冲液为6摩尔/升盐酸胍；所述漂洗缓冲液为10毫摩尔/升Tris-ClpH6.8、80%乙醇；所述脱硫缓冲液为200毫摩尔/升NaOH、100毫摩尔/升NaCl、30%乙醇、5%甘油；洗脱缓冲液含10毫摩尔/升Tris-Cl、1毫摩尔/升EDTA，pH8.0。
实施例1
1．转化反应液配方：5摩尔/升NaHSO3、12.5%DME，pH5.0。
．转化反应条件：95℃3min，[95℃30秒，70℃10分钟]12循环。
．DNA模板
标准品SM除了可以作为MS-MCA时甲基化峰型的阳性对照外，还可作为进行重亚硫酸盐转化的DNA模板。SM的靶序列中具有30个胞嘧啶位点，经过重亚硫酸盐的处理这些胞嘧啶将逐渐转化成尿嘧啶。随着转化的进行，SM的峰型将逐渐向SU的峰型进行过渡；当转化率达100%时，其MS-MCA的峰型将完全与SU的峰型重合。SM和SU的峰型，以及处于转化态的SM的峰型（SX）如图1所示。因此可以通过MS-MCA对SM经重亚硫酸盐转化后的产物状态进行检测，从而挑选出转化率最优的配方及转化条件。
．C-T转化率计算
SM和SU的熔解温度分别由10次独立的qPCR扩增及MS-MCA确定，分别为Tm(SM)=84.21±0.09℃和Tm(SU)=79.12±0.10℃。当以SM为模板进行转化时，假设转化产物的平均熔解温度为Tm(X)，则转化率P=×100%。
5．模板降解率计算
因为重亚硫酸盐的转化将不可避免的造成DNA的断裂及降解，因此DNA的降解情况也是衡量重亚硫酸盐溶液配方及转化条件优劣的重要指标。以SM作为标准DNA样品，依次稀释为1×10-1纳摩尔/升、1×10-2纳摩尔/升、1×10-3纳摩尔/升、1×10-4纳摩尔/升、1×10-5纳摩尔/升浓度，经qPCR扩增，以CycleThreshold(Ct)值为纵坐标，浓度的对数值为横坐标生成标准曲线（图2）。当以SM为模板进行转化时，经过qPCR分别得到转化前后的Ct值，通过标准曲线可分别求得转化前以及转化后靶序列的拷贝数C1和C2，则降解率D=×100%。
．改进的条件
1)加入变性剂DME促进转化；
2)减小反应体系至100微升；
3)反应时间缩短至2小时。
7．与其它方法的对比优势：
实施例2不同重亚硫酸盐的比较
比较不同的重亚硫酸盐，包括NaHSO3，Na2S2O5，以及NaHSO3与Na2S2O5不同比例的混合亚硫酸盐之间的转化效率。
实验设计：对照组(0.1纳克SM，0.5毫摩尔/升对苯二酚，pH5.0，100微升)；
混合亚硫酸盐(0.1纳克SM，0.052克混合亚硫酸盐、0.5毫摩尔/升对苯二酚，pH5.0，100微升)；
NaHSO3(0.1纳克SM，4摩尔/升NaHSO3、0.5毫摩尔/升对苯二酚，pH5.0，100微升)；
Na2S2O5(0.1纳克SM，2摩尔/升Na2S2O5、0.5毫摩尔/升对苯二酚，pH5.0，100微升)；
上述转化反应条件均为：[95℃5分钟，58℃30分钟]4个循环或者12个循环。
不同重亚硫酸盐对SM的转化及降解情况见图3A及3B。其中，纯NaHSO3在相同条件下对DNA的转化效率较高，对DNA造成的降解程度稍低。
实施例3不同温度反应条件对转化效率的影响
重亚硫酸盐对胞嘧啶的催化反应条件主要包括催化反应温度（一般为55~60℃）及以不同时间间隔对溶液进行高温加热（以维持DNA的单链状态）两个方面。
1）高温加热条件的影响
实验设计：0.1纳克SM，4摩尔/升NaHSO3，pH5.0，100微升。
取4组上述溶液分别进行如下反应(~3小时)：
a.[95℃5分钟，60℃30分钟]6循环；
b.95℃3分钟，[95℃30秒，60℃10分钟]18循环；
c.[95℃10秒，60℃10分钟]18循环；
d.95℃3分钟，60℃3小时。
结果（图4）显示高温加热时间越长，转化率相对提高，但同时DNA的降解程度也越高。
2）转化反应温度的影响
实验设计：0.1纳克SM，4摩尔/升NaHSO3，pH5.0，100微升。
取4组上述溶液分别进行如下反应(~3小时)：
e.95℃3分钟，[95℃30秒，60℃10分钟]18循环；
f.95℃3分钟，[95℃30秒，70℃10分钟]18循环；
g.95℃3分钟，[95℃30秒，80℃10分钟]18循环；
h.95℃3分钟，[95℃30秒，90℃10分钟]18循环；
结果（图5）显示转化反应温度越高，转化率相对提高，但降解率也相对增加。
实施例4、变性剂DME和盐酸胍对反应的影响
模板除SM外，还通过胃癌AGS细胞系，胃癌BGC-823细胞系和正常人外周血单核细胞（PeripheralBloodMononuclearCell,PBMC）的基因组DNA为模板验证不同方法的有效性。由于基因组DNA只有经重亚硫酸盐转化后序列才能被引物所识别，因此其经qPCR扩增后获得的CT值是模板的降解率与转化率的综合反映，转化率越高，降解率越低，则最终靶序列的拷贝数则越高。
1)实验设计（以SM为模板）：
对照组(0.1纳克SM，100微升)；
无变性剂组(0.1纳克SM，4摩尔/升NaHSO3，pH5.0，100微升)；
盐酸胍组(0.1纳克SM，4摩尔/升NaHSO3，150、300或600毫摩尔/升盐酸胍，pH5.0，100微升)；
DME组(0.1纳克SM，4摩尔/升NaHSO3，5%、10%或20%DME，pH5.0，100微升)；
反应条件为：95℃3分钟，[95℃30秒，70℃10分钟]18循环；
结果（图6）显示盐酸胍在较宽浓度范围无论对DNA的转化率或是降解率方面均无明显作用。而DME能相对提高转化率，虽然降解率也相对增加。
2)实验设计（以AGS细胞系基因组DNA为模板）；
无变性剂组(1微克AGSDNA，4摩尔/升NaHSO3，pH5.0，100微升)；
盐酸胍组(1微克AGSDNA，4摩尔/升NaHSO3，300毫摩尔/升盐酸胍，pH5.0，100微升)；DME组(1微克AGSDNA，4摩尔/升NaHSO3，10%DME，pH5.0，100微升)；
反应条件为：95℃3分钟，[95℃30秒，70℃10分钟]12循环；
结果（图7）显示在反应时间约2小时内盐酸胍无论对DNA的转化率或是降解率方面均无明显作用。而DME能明显的促进转化的进行。
3)实验设计（正常人PBMC细胞基因组DNA为模板）：
无变性剂组(1微克PBMCDNA，4摩尔/升NaHSO3pH5.0，100微升)；
盐酸胍组(1微克PBMCDNA，300毫摩尔/升盐酸胍，pH5.0，100微升)；
DME组(1微克PBMCDNA，4摩尔/升NaHSO3，10%DME，pH5.0，100微升)；
反应条件为：95℃3分钟，[95℃30秒，70℃10分钟]12循环；
结果（图8）显示在反应时间约2小时内各组反应均能转化PBMCDNA，可能是由于重亚硫酸盐对于非甲基化的DNA样本转化能力较强。
实施例5、与商业化试剂盒及传统方法的比较
本实验室优化的配方及条件（以下简称“优化组”）与EpiTect?PlusBisulfiteConversionKit(Qiagen，Germany)（以下简称“Qiagen”）商业化试剂盒，以及传统重亚硫酸盐转化方法（以下简称“传统方法”）进行比较，测试各种转化方法对SM、BGC-823及PBMC基因组DNA的转化效率。
1)实验设计（以SM为模板）：
a.对照组(0.1纳克SM，100微升)；
b.优化组(0.1纳克SM，4摩尔/升NaHSO3，10%DME，pH5.0，100微升)；
c.Qiagen(0.1纳克SM，BisulfiteMix及DNAProtectBuffer共140微升0.1纳克)；
d.传统方法(0.1纳克SM，2.6摩尔/升NaHSO3，0.5毫摩尔/升对苯二酚，100微升0.1纳克)；
其中，a组不进行反应，b组反应条件为：95℃3分钟，[95℃30秒，70℃10分钟]12循环（~2小时）；c组反应条件根据试剂盒说明书：95℃5分钟，60℃25分钟，95℃5分钟，60℃85分钟，95℃5分钟，60℃175分钟(~5小时)；d组DNA首先在0.3摩尔/升NaOH，37℃下变性10分钟，然后加入传统配方重亚硫酸盐溶液至100微升体系，50℃下反应16小时。
结果（图9）显示优化的重亚硫酸盐反应液在2小时反应时间内对SMDNA的转化率高于Qiagen试剂盒在5小时反应的转化率，也高于传统方法16小时的转化率。并且加入Trolox的配方对DNA造成的降解率与Qiagen试剂盒或传统方法的降解情况相近。
2)实验设计（以BGC-823细胞系基因组DNA为模板）
a.优化组(1微克BGC-823DNA，4摩尔/升NaHSO3，10%DME，pH5.0，100微升)；
b.Qiagen(1微克BGC-823DNA，BisulfiteMix及DNAProtectBuffer共140微升)；
c.传统方法(1微克BGC-823DNA，2.6摩尔/升NaHSO3，0.5毫摩尔/升对苯二酚，100微升)；
其中，a组反应条件为：95℃3分钟，[95℃30秒，70℃10分钟]12循环（~2小时）；b组反应条件根据试剂盒说明书：95℃5分钟，60℃25分钟，95℃5分钟，60℃85分钟，95℃5分钟，60℃175分钟(~5小时)；c组DNA首先在0.3摩尔/升NaOH，37℃下变性10分钟，然后加入传统配方重亚硫酸盐溶液至100微升体系，50℃下反应16小时。
结果（图10）显示优化的重亚硫酸盐反应液在2小时反应时间内对BGC-823细胞系基因组DNA的转化结果与Qiagen试剂盒在5小时和传统方法在16小时反应的转化结果相当，表明此配方能在较短时间内完成对甲基化DNA样本的转化。并且通过此方法转化1微克BGC-823DNA获得的靶序列拷贝数高于Qiagen试剂盒。
3)实验设计（PBMC基因组DNA为模板）
a.优化组(1微克PBMCDNA，4摩尔/升NaHSO3，10%DME，pH5.0，100微升)；
b.Qiagen(1微克PBMCDNA，BisulfiteMix及DNAProtectBuffer共140微升)；
c.传统方法(1微克PBMCDNA，2.6摩尔/升NaHSO3，0.5毫摩尔/升对苯二酚，100微升)；
其中，a组反应条件为：95℃3分钟，[95℃30秒，70℃10分钟]12循环（~2小时）；b组反应条件根据试剂盒说明书：95℃5分钟，60℃25分钟，95℃5分钟，60℃85分钟，95℃5分钟，60℃175分钟(~5小时)；c组DNA首先在0.3摩尔/升NaOH，37℃下变性10分钟，然后加入传统配方重亚硫酸盐溶液至100微升体系，50℃下反应16小时。结果（图11）显示优化的重亚硫酸盐反应液在2小时反应时间内对正常人PBMC基因组DNA的转化结果与Qiagen试剂盒在5小时反应和传统方法在16小时的转化结果相当，表明此配方能在较短时间内完成对非甲基化DNA样本的转化。并且通过此方法转化1微克PBMCDNA获得的靶序列拷贝数高于Qiagen试剂盒。
实施例6对血浆游离核酸中RPRM基因DNA甲基化的分析
（一）重亚硫酸盐转化
1.取血清或血浆1毫升，通过酚氯仿抽提方法或商业化试剂盒对DNA进行提取。
2.在0.2毫升的PCR管中，加入20微升提取的DNA溶液，然后加入80微升重亚硫酸盐转化反应液，混匀。
3.将PCR管置于热循环仪中进行如下反应：95℃3分钟预变性；[95℃30秒，70℃10分钟]12个循环。
4.将上述转化反应后100微升溶液，与500微升结合缓冲液进行混合，然后将溶液全部转移至玻璃纤维膜离心柱中，12000转/秒转速离心1分钟。
5.弃去流出液，加入500微升漂洗缓冲液，12000转/秒转速离心1分钟。
6.弃去流出液，加入250微升脱硫缓冲液，室温放置10分钟，然后12000转/秒转速离心1分钟，弃去流出液。
7.加入500微升漂洗缓冲液，12000转/秒转速离心1分钟，弃去流出液。
8.重复上述步骤1次。
9.12000转/秒转速离心2分钟，彻底甩去残留的漂洗缓冲液，然后将离心柱转移至新的1.5毫升EP管中
10.往膜中央滴加30微升洗脱缓冲液，室温放置2分钟，然后12000转/秒转速离心1分钟收集纯化后的DNA。
（二）实时荧光定量PCR扩增及甲基化敏感性的熔解曲线分析（MS-MCA）
1．实时荧光定量PCR扩增
在0.1毫升的荧光定量PCR管中，加入8微升超纯水，10微升2×SYBRGREENI预混反应液，10微摩尔/升RPRM-F和RPRM-R引物各0.5微升，最后加入1微升上述纯化的DNA，混匀。除待测DNA样本外，还需要使用两种标准质粒SM和SU作为阳性对照，在另外的PCR管中按相同的方法进行配制。然后将PCR管置于荧光定量PCR仪中进行如下反应：扩增阶段：95℃30秒预变性；[95℃5秒，56℃15秒，72℃30秒]共40个循环；熔解曲线阶段：95℃15秒预变性，然后从72℃-88℃每升高0.1℃读取一次荧光值，将得到的结果按下述方法进行熔解曲线法分析，以确定血浆样本中RPRM基因启动子特异DNA序列甲基化的程度。
．非甲基化及甲基化峰型区间的确定
我们已经通过重亚硫酸盐测序证实正常人的PBMC中RPRM基因极少发生甲基化，并且其熔解曲线峰型与几乎阳性对照质粒的峰型一致，因此PBMCDNA样本可代表非甲基化的DNA样本。对20例PBMCDNA样本进行分析可发现其非甲基化峰型均介于77℃到81℃温度之间（图12）。有些样本的峰型与SU对照接近但不完全吻合，这可能是因为不同个体之间低甲基化或单核苷酸多态性，或是扩增产物含量高低，都可能会导致熔解曲线轻微的漂移。因此，我们将77-81℃区间作为非甲基化区间，而81-86℃则作为甲基化区间。依此原则，对于单一的DNA样本类型，当其熔解曲线峰型完全被包含于非甲基化区间时，则确定该样本为非甲基化样本；当其峰型部分或完全超出非甲基化区间时，则确定该样本存在一定程度的甲基化。
混合样本中甲基化与非甲基化DNA的相对定量分析
对于单一的DNA样本类型，如PBMC基因组DNA（一致非甲基化状态），细胞系基因组DNA（程度均一的甲基化状态）等，其熔解曲线只有一个峰型，因此很容易判断样本是否具有甲基化。对于混合的DNA样本类型，如手术切除的肿瘤组织样本（混杂正常类型细胞及肿瘤细胞），肿瘤病人血浆DNA样本（混杂正常血液细胞及肿瘤细胞来源的DNA），其熔解曲线可能出现两个甚至更多的峰型。大多数情况下多个峰型的信号都较为明显，可以判断样本为甲基化与非甲基化的混合样本。然而，在某些情况下，甲基化峰型的信号不显著。在这种情形下，需要有一种指标来对这些样本进行判别。
DNA的荧光信号与PCR扩增产物的丰度成正比，随着温度的升高，DNA双链解旋，荧光信号下降。但甲基化与非甲基化样本的扩增产物荧光信号的下降速率不同。荧光强度代表着在一定温度下仍然维持双链状态的DNA总量。所以如果我们将非甲基化扩增产物的荧光信号确定在77℃到81℃，通过对荧光信号的积分就可对非甲基化扩增产物进行相对的定量。同样，甲基化DNA的产物可以通过从81℃到86℃的温度进行量化计算。
为了计算混合样品中非甲基化和甲基化DNA各自含量，首先将SM和SU以不同比例混合，扩增产生多组熔解曲线，然后对各组非甲基化与甲基化扩增产物的比例分别进行计算，从而绘制甲基化扩增产物与初始甲基化DNA含量关系的标准曲线，如图13所示。通过标准曲线，可以计算混合DNA样品中甲基化DNA的含量。从中也可以发现，相同的引物对于甲基化DNA模板有一定的偏好性。这可能是这种方法的另一个优点，即使在DNA池中甲基化DNA极低的水平（甲基化DNA/总DNA=1/1000）时，其甲基化DNA扩增信号也能被检测到。
血浆DNA样品甲基化阈值的确定
正常人血浆DNA中甲基化的DNA含量大致在0.21%到0.35%左右。我们将阈值设定为0.64%。当血浆样品中甲基化的DNA含量高于此阈值时，该样本将被视为甲基化的样本。图14A和14B分别为具有代表性的5例正常人血浆DNA样本（RPRM非甲基化）和5例胃癌患者血浆DNA样本（RPRM甲基化）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCELISTING
<110>福建师范大学
<120>用于定量检测RPRM基因DNA甲基化试剂盒及方法
<130>5
<160>5
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>261
<212>DNA
<213>Ref-seq
<400>1
gctttagaagagcctagctgctgcgcgcgtcggagaggctcctgggaaactcccacggcc60
cagggactttcgaaagcagagcgaggagccctcgcacgcgctagtctgcgagtgagcgct120
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gcggcgcccgcccgttcctgcgatgaatccggccctaggcaaccagacggacgtggcggg240
cctgttcctggccaacagcag261
<210>2
<211>261
<212>DNA
<213>M-seq
<400>2
gttttagaagagtttagttgttgcgcgcgtcggagaggtttttgggaaatttttacggtt60
tagggattttcgaaagtagagcgaggagttttcgtacgcgttagtttgcgagtgagcgtt120
tagttcggtatttgtttttttagcgtcgtcgtttttttatttttcggattcgcgtcgttc180
gcggcgttcgttcgtttttgcgatgaattcggttttaggtaattagacggacgtggcggg240
tttgtttttggttaatagtag261
<210>3
<211>261
<212>DNA
<213>U-seq
<400>3
gttttagaagagtttagttgttgtgtgtgttggagaggtttttgggaaatttttatggtt60
tagggatttttgaaagtagagtgaggagtttttgtatgtgttagtttgtgagtgagtgtt120
tagtttggtatttgtttttttagtgttgttgtttttttattttttggatttgtgttgttt180
gtggtgtttgtttgtttttgtgatgaatttggttttaggtaattagatggatgtggtggg240
tttgtttttggttaatagtag261
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
gttttagaagagtttagttgttg23
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
ctactattaaccaaaaacaaac22

Claims (6)

1.用于定量检测RPRM基因DNA甲基化试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含DNA转化试剂组分：重亚硫酸盐转化反应液，DNA纯化试剂组分：玻璃纤维膜离心柱、结合缓冲液、漂洗缓冲液、脱硫缓冲液、洗脱缓冲液，甲基化检测试剂组分：2×SYBRGREENI预混反应液、引物RPRM-F与RPRM-R、甲基化阳性对照质粒SM及非甲基化阳性对照质粒SU。
2.根据权利要求1所述的用于定量检测RPRM基因DNA甲基化试剂盒，其特征在于：所述DNA转化试剂组分中，重亚硫酸盐转化反应液含5摩尔/升NaHSO3、12.5wt.%乙二醇二甲醚，pH5.0。
3.根据权利要求1所述的用于定量检测RPRM基因DNA甲基化试剂盒，其特征在于：所述DNA纯化试剂组分中，结合缓冲液含6摩尔/升盐酸胍；漂洗缓冲液含10毫摩尔/升Tris-Cl，pH6.8，体积分数80%乙醇；脱硫缓冲液含200毫摩尔/升NaOH，100毫摩尔/升NaCl，体积分数30%乙醇，体积分数5%甘油；洗脱缓冲液含10毫摩尔/升Tris-Cl，1毫摩尔/升EDTA，pH8.0。
4.根据权利要求1所述的用于定量检测RPRM基因DNA甲基化试剂盒，其特征在于：所述的引物RPRM-F为：5’-GTTTTAGAAGAGTTTAGTTGTTG-3’；RPRM-R为5’-CTACTATTAACCAAAAACAAAC-3’。
5.用于定量检测RPRM基因DNA甲基化的方法，其特征在于：所述方法包括如下：
（1）在0.2毫升的PCR管中，加入含有1纳克至1微克DNA的20微升DNA水溶液，然后加入80微升重亚硫酸盐转化反应液，混匀，使转化反应液终浓度达到4摩尔/升NaHSO3、10wt.%DME，pH5.0的条件；反应条件为：95℃3分钟；接着，95℃30秒，70℃10分钟，共12个循环；接着将上述转化反应后100微升的DNA溶液，进行如下纯化处理；
（2）将上述转化反应后100微升溶液，与500微升结合缓冲液进行混合，然后全部转移至玻璃纤维膜离心柱中，12000转/秒转速离心1分钟；弃去流出液，加入500微升漂洗缓冲液，12000转/秒转速离心1分钟；弃去流出液，加入250微升脱硫缓冲液，室温放置10分钟，12000转/秒转速离心1分钟；弃去流出液，加入500微升漂洗缓冲液，12000转/秒转速离心1分钟，然后再重复此步骤一次；12000转/秒转速离心2分钟彻底甩去残留的漂洗缓冲液，然后将离心柱转移至新的1.5毫升Eppendorf管中；加30微升洗脱缓冲液，室温放置2分钟，然后12000转/秒转速离心1分钟收集纯化后的DNA；
(3)取上述纯化后的DNA溶液1微升转移到0.1毫升的PCR管中，加入10微升2×SYBRGREENI预混反应液，浓度为10微摩尔/升引物RPRM-F、RPRM-R各0.5微升，补足超纯水至20微升，然后在PCR仪器上进行实时聚合酶链式反应扩增；条件如下：扩增阶段：95℃、30秒；[95℃、5秒，56℃、15秒，72℃、30秒]40个循环；熔解曲线阶段：95℃、15秒，然后从72℃-88℃每升高0.1℃读取一次荧光值，将得到的结果进行熔解曲线法分析，以确定样本中RPRM基因启动子特异DNA序列甲基化的程度。
6.根据权利要求5所述的用于定量检测RPRM基因DNA甲基化的方法，其特征在于：步骤（3）中的熔解曲线法分析使用两种标准质粒作为参照：甲基化的RPRM基因序列经重亚硫酸盐转化后的M-seq，序列为SEQIDNO.2，而非甲基化序列转化后U-seq，序列为SEQIDNO.3，然后分别将这两种序列克隆至载体上作为阳性对照标准样品SM和SU，进行上述（3）所描述的实时PCR扩增及熔解曲线分析。
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