CN102399862A

CN102399862A - 一种基于解链曲线的甲基化dna检测方法

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Publication number: CN102399862A
Application number: CN2010102830916A
Authority: CN
Inventors: 王建
Original assignee: SHANGHAI JIAMEI BIOTECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: Jiangsu Yuanhen Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2010-09-16
Filing date: 2010-09-16
Publication date: 2012-04-04
Anticipated expiration: 2030-09-16
Also published as: CN102399862B

Abstract

本发明涉及一种甲基化DNA检测方法，步骤包括：步骤1，亚硫酸盐处理DNA样品；步骤2，设计并合成PCR引物；步骤3，以标准非甲基化DNA和标准甲基化DNA作为模板分别进行PCR扩增，并测定解链温度；步骤4，对待测DNA样品进行PCR扩增；步骤5，加热PCR扩增产物至标准非甲基化DNA相应的PCR产物的解链温度、和标准甲基化DNA相应的PCR产物的解链温度之间；步骤6，进行消化；步骤7，进行二次PCR扩增并进行解链曲线测定，检测是否存在甲基化DNA。该方法在肿瘤早期检测、个性化治疗、病情判断和复发监控等方面有着重要的意义。

Description

一种基于解链曲线的甲基化DNA检测方法

技术领域

本发明涉及一种甲基化DNA的检测方法，尤其涉及一种不易受干扰的甲基化DNA的检测方法。

背景技术

DNA甲基化是指DNA链上CpG位点的胞嘧啶（C）残基的5’碳上被修饰了一个甲基。DNA甲基化是最早发现的DNA修饰之一，是表观遗传学的重要组成部分。DNA甲基化特征性地发生在DNA链上的CpG二核苷酸的胞嘧啶（C）残基上，这常见于基因5’端表达调控序列。DNA甲基化在基因表达的调控中具有重要作用，参与了动物胚胎发育、基因印记和X染色体失活等过程。研究表明，DNA甲基化的改变能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及蛋白质互相作用方式的改变，从而控制基因表达。

DNA甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素。CpG岛局部甲基化水平的异常升高，可以导致基因组的不稳定和抑癌基因的不表达。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，则发生癌症的机率就会提高。所以DNA甲基化引人注目的地方就是在肿瘤的早期检测中的应用，因为研究表明表观遗传的变化伴随肿瘤的发生与发展，检测DNA甲基化的改变可以有助于肿瘤的早期发现。

目前肿瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。这是因为人们发现肿瘤的发生可能与抑癌基因启动子区的CpG岛甲基化造成抑癌基因关闭有关。由于CpG岛的局部高度甲基化早于细胞的恶性增生，因此DNA甲基化的检测可以用于肿瘤发生的早期预测。

CpG岛甲基化的检测方法众多，其原理分别基于甲基化敏感的限制性内切酶消化法和基于亚硫酸钠修饰DNA的PCR检测法。甲基化敏感性限制性内切酶/Southern法（methylation-sensitive restriction Endonuclease/Southern， MSRE- Southern）是比较传统的方法，灵敏度低，样品需要量大。甲基化DNA特异性PCR法（Methylation Specific PCR，MSP）及其衍生的甲基化DNA检测方法，是目前检测DNA甲基化的常用方法，具有较高的灵敏度，但是假阳性率也很高。

发明内容

本发明提供了一种基于解链曲线的甲基化DNA检测方法。该方法能够有效地排除非甲基化DNA的影响，使样品中的甲基化DNA得以富集，用以解决现有技术检测灵敏度低、方法复杂、容易被干扰的缺点。

本发明甲基化DNA检测方法，步骤如下：

步骤1，采用亚硫酸盐处理待测DNA，和标准非甲基化DNA与标准甲基化DNA；

步骤2，在所要检测的基因序列中，选择富含CpG位点的一段序列作为目标检测序列，并以所选序列的5’端的一部分作为正向PCR引物，以所选序列3’端的一段序列的互补序列作为反向PCR引物；

步骤3，用亚硫酸盐处理过的标准甲基化DNA和非甲基化DNA作为PCR模板，加入DNA聚合酶，以荧光染料为指示剂，用所述正向PCR引物和反向PCR引物，在PCR扩增仪中进行扩增，并分别测定扩增产物的解链温度；

步骤4，在与步骤3相同的条件下，用所述PCR引物对待测DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

步骤5，将步骤4所得PCR扩增产物进行加热，使加热温度处于标准非甲基化DNA相应的PCR扩增产物的解链温度和标准甲基化DNA相应的PCR扩增产物的解链温度之间；

步骤6，立即将步骤5中的加热产物进行冷却，并用单链DNA特异性DNA内切酶将冷却后的体系进行消化；

步骤7，将步骤6所得消化产物作为PCR反应模板，使用所述正向PCR引物和反向PCR引物进行实时定量PCR扩增，并进行解链曲线测定；

步骤8，判断是否存在甲基化DNA，判断方法为：如果在待测DNA样品中检测到与标准甲基化DNA相应PCR产物相一致的特征性解链曲线，则待测样品中存在甲基化DNA；反之，则不存在。

所述步骤1中，亚硫酸盐优选为亚硫酸钠，所述亚硫酸盐处理待测DNA的处理方法为，以0.3M的NaOH变性待测DNA，加入由5M亚硫酸钠、0.5mM氢醌组成的pH值为5.0的混合液，60℃避光温浴4小时；脱硫并纯化DNA。

所述步骤2中，PCR引物设计方法优选为：使所设计的PCR引物为18~32碱基长度，引物序列中CpG位点数量为0~3个，且所设计的引物的3’端的最后一个碱基不处于CpG的C的位置；同时使PCR扩增后的DNA片段大小为80~180碱基长度，并使PCR扩增的序列中含有尽可能多的CpG位点，一般应使PCR扩增序列含有8~20个CpG位点。

进一步地，使所设计的引物的3’端的最后一个碱基不处于CpG的C的位置；且在所述CpG位点的C位置，正向引物可以用C/T混合代替C，反向引物可以用G/A混合代替G。

其中，CpG指的是胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）和连接二者的磷酸酯键（p）组成位点；T指的是胸腺嘧啶，A指的是腺嘌呤。

所述步骤3中，所用的PCR扩增仪优选为实时定量PCR扩增仪。

所述步骤4中，在与步骤3相同的条件是指除所用的作为模板的DNA样品以外，所有的反应条件与步骤3一致。

所述步骤6中，优选为使用冰水浴进行降温。

上述检测方法中，所述单链DNA特异性核酸内切酶优选为T7核酸内切酶 I、S1核酸酶、绿豆核酸酶中的一种或几种的混合；所述PCR扩增反应所用的DNA聚合酶优选为Taq DNA聚合酶；所述荧光染料优选为SYBR GreenⅠ。

其中，所述待测DNA为人类基因组DNA，所述标准非甲基化DNA与标准甲基化DNA为于待测DNA相匹配的、已确定的纯的非甲基化人类基因组DNA和已确定的纯的甲基化人类基因组DNA。

其中，所述待测DNA样品可以是人类正常DNA，癌细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、血细胞DNA、血清DNA、体液DNA或排泄物DNA的样品。如：

所述癌细胞为肺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、淋巴癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞或胰腺癌细胞；

所述肿瘤组织为肺癌组织、胃癌组织、结肠癌组织、直肠癌组织、肝癌组织、乳腺癌组织、淋巴癌组织、膀胱癌组织、卵巢癌组织、肾癌组织或胰腺癌组织；

所述体液为血液、脑脊髓液、胃液、消化液、精液、唾液、泪液、汗液、尿液或阴道分泌液。

以亚硫酸盐处理过的待测DNA中由于非甲基化的胞嘧啶（C）被转变为尿嘧啶（U）而甲基化的胞嘧啶（C）维持不变。由于多数DNA聚合酶将U识别为T，从而使得在以这样的DNA作为模板进行PCR反应时，非甲基化DNA相应的PCR产物的GC含量降低，其解链温度也因此降低。在特定温度下，可以使非甲基化DNA相应的PCR产物先解链成为单链而甲基化DNA相应的PCR产物则维持双链状态，在用单链DNA特异性的核酸内切酶消化时，使非甲基化DNA相应的PCR产物降解，而仅有甲基化DNA相应的PCR产物得以保存，使这一技术可以检测到样品中存在的低丰度的甲基化DNA。

综上所述，本发明提供的甲基化DNA检测方法，检测待测DNA样品中甲基化DNA的存在，具有适用范围大、方法简单、需要样本量小、不易被干扰、适用混合样本等优点。在肿瘤早期检测、个性化治疗、病情判断和复发监控等方面有着重要的意义。

附图说明

图1为本发明甲基化DNA检测方法流程图。

具体实施方式

参照图1，对本发明甲基化DNA检测方法具体介绍如下：

实施方式（一）：

步骤1：采用亚硫酸盐处理待测DNA和已知的标准非甲基化DNA和甲基化DNA。

步骤1：采用亚硫酸盐处理并纯化已知的标准非甲基化DNA和甲基化DNA，将处理过的甲基化DNA作梯度稀释，且与一定量的非甲基化DNA混合，作为待测DNA样品；

其中，标准甲基化DNA和标准非甲基化DNA为已知的甲基化DNA和非甲基化DNA；所述亚硫酸盐具体为亚硫酸钠；所述亚硫酸盐处理待测DNA的处理步骤为，以0.3M的NaOH变性待测DNA，加入由5M亚硫酸钠、0.5mM氢醌组成的pH值为5.0的混合液，60℃避光温浴4小时；脱硫并纯化DNA。

待测DNA中未发生甲基化的胞嘧啶（C）通过上述处理过程转变为尿嘧啶（U），甲基化的胞嘧啶（C）维持不变。

步骤2：确定待测基因检测区域，按照基因序列设计并合成能同时扩增亚硫酸盐处理过的非甲基化DNA和甲基化DNA的正向PCR引物和反向PCR引物。

其中引物设计的要求为：在所要检测的基因序列中，选择一段序列作为目标检测序列进行引物设计，使这一段序列富含CpG位点。以这一段序列的5’端的一段序列作为PCR的正向引物，以这一段序列的3’端的一段序列的互补序列作为PCR的反向引物。

优选地，所设计的PCR引物为18~32碱基长，使PCR扩增的DNA片段大小为80~180碱基长，使PCR扩增的序列中含有尽可能多的CpG位点，一般为8~20个；在引物的序列中不含有或含有不超过3个CpG位点，且使所设计的引物的3’端的最后一个碱基不处于CpG的“C”的位置。

在引物序列中所涉及的CpG位点的“C”的位置，正向引物可以用C/T混合代替C，反向引物可以用G/A混合代替G。

步骤3，以上述的PCR引物，以标准的非甲基化DNA和甲基化DNA为模板，以Taq DNA聚合酶，加入荧光染料，以实时定量PCR仪，进行PCR扩增，并进行解链温度测定。

其中所述的PCR操作过程，由正向和反向PCR引物、PCR扩增缓冲液（Buffer）、Taq DNA聚合酶、四种三磷酸脱氧核糖核苷酸（dNTPs）、所述亚硫酸钠处理过的DNA模板（Template），纯水组成的PCR体系，以荧光染料SYBR Green Ⅰ为指示剂，采用实时定量PCR仪进行扩增，并进行解链温度测定，分别测定标准甲基化DNA和标准非甲基化DNA样品的PCR产物的解链温度。

步骤4：将一定量的亚硫酸钠处理过的标准非甲基化DNA，与梯度稀释的亚硫酸钠处理过的标准甲基化DNA混合，作为待测样品；在相同条件下进行PCR扩增。

其中，相同条件是指与步骤3相同浓度的PCR引物，PCR扩增缓冲液（Buffer）、Taq DNA聚合酶和四种三磷酸脱氧核糖核苷酸，相同的PCR条件和PCR扩增仪和相同的荧光染料；除模板DNA以外，其他操作均与步骤2相同，但不进行解链温度测定。

步骤5：将步骤4中所得PCR产物进行加热至一个特定温度，使这一温度高于非甲基化DNA相应的PCR产物解链温度，而低于甲基化DNA相应的PCR产物的解链温度。

其中，特定温度是指根据步骤2 测定的甲基化DNA和非甲基化DNA的PCR产物的解链温度，这一温度高于非甲基化DNA相应的PCR产物解链温度，而低于甲基化DNA相应的PCR产物的解链温度。

步骤6：立即冷却，加入对单链DNA特异的核酸内切酶并在适当条件下进行消化处理。

其中，优选为用冰水浴进行冷却；所述对单链DNA特异的核酸内切酶为T7核酸内切酶 I、S1核酸酶或绿豆核酸酶，或者是上述几种的混合。

步骤7：将步骤6所得的消化产物作为PCR反应模板，使用前述相同的PCR引物在与步骤4相同条件下进行PCR扩增，并进行解链曲线测定。

其中，相同条件是指与步骤4相同浓度的PCR引物，PCR扩增缓冲液（Buffer）、Taq DNA聚合酶和四种三磷酸脱氧核糖核苷酸，相同的PCR条件和PCR扩增仪。

步骤8：将步骤7中所测待测DNA样品的结果与标准样品的信号作对照，如果待测样品中出现与甲基化DNA标准样品一致的迁移率信号，则表明待测样品中存在甲基化DNA；反之，则不存在。

本发明一种甲基化DNA检测方法，通过上述步骤检验本发明的准确度和灵敏度。

在医学领域，能够准确而灵敏地测出DNA中是否存在甲基化DNA，就能够对于肿瘤的早期检测、病情判断和癌症的复发监控提供一种很好的指标。

实施方式（二）

在实施方式（一）的基础上，以实际临床样品提取的DNA为待测样品，在与上述实施方式（一）相同的条件下，检验本发明的实用性。

其中，与上述在实施方式（一）相同的条件，指的是除以实际临床样品提取的DNA为待测样品外，所有操作与上述在实施方式（一）相同。

所述临床提取的待测DNA样品，为人类正常和癌细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、血细胞DNA、血清DNA、各种体液DNA或各种排泄物DNA的样品。

所述癌细胞可以是肺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、淋巴癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞或胰腺癌细胞；所述肿瘤组织可以是肺癌组织、胃癌组织、结肠癌组织、直肠癌组织、肝癌组织、乳腺癌组织、淋巴癌组织、膀胱癌组织、卵巢癌组织、肾癌组织或胰腺癌组织；所述各种体液可以是血液、脑脊髓液、胃液及各种消化液、精液、唾液、泪液、汗液、尿液、阴道分泌液等。

实施方式（三）

在实施方式（一）和（二）的基础上，以P16基因转录启动区的序列为例，具体PCR引物设计如下：

P16基因转录启动区的甲基化是肺癌等多种癌症细胞具有的特征。P16基因转录启动区的序列如下，有下划线的部分为所选的要检测的区域。

Homo sapiens p16 protein（CDKN2A）gene，CpG island and partial cds，DQ325544.1

CGGACCGCGTGCGCTCGGCGGCTGCGGAGAGGGGGAGAGCAGGCAGCGGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCGGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCCTTCGGCTGACTGGCTGGCCACGGCCGCGGCCCGGGCTCGGGTAGAGGAGGTGCGGGCGCTGCTGGAGGCGGGGGCGCTGCCCAACGCACCGAATAGTTACGGTCGGAGGCCG

甲基化DNA序列，下划线部分为要检测的区域；

CGGATCGCGTGCGTTCGGCGGTTGCGGAGAGGGGGAGAGTAGGTAGCGGGCGGCGGGGAGTAGTATGGAGCGGGCGGCGGGGAGTAGTATGGAGTTTTCGGTTGATTGGTTGGTTACGGTCGCGGTTCGGGTTCGGGTAGAGGAGGTGCGGGCGTTGTTGGAGGCGGGGGCGTTGTTTAACGTATCGAATAGTTACGGTCGGAGGTCG

非甲基化DNA序列，下划线部分为要检测的区域；

TGGATTGTGTGTGTTTGGTGGTTGTGGAGAGGGGGAGAGTAGGTAGTGGGTGGTGGGGAGTAGTATGGAGTGGGTGGTGGGGAGTAGTATGGAGTTTTTGGTTGATTGGTTGGTTATGGTTGTGGTTTGGGTTTGGGTAGAGGAGGTGTGGGTGTTGTTGGAGGTGGGGGTGTTGTTTAATGTATTGAATAGTTATGGTTGGAGGTTG

所设计的PCR引物

正向引物 5’- GTTGYGGAGAGGGGGAGAGTAGGTAG-3’

反向引物 5’- TTAAACAACGCCCCCRCCTCCAACAA-3’

然后，按照实施方式（一）所述的方法，进行检测。

上述内容为本发明的具体实施例的例举，对于其中未详尽描述的试剂、设备、操作方法等，应当理解为采取本领域已有的普通及常规试剂、设备、操作方法等来予以实施。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种基于解链曲线的甲基化DNA检测方法，其特征在于，步骤如下：

步骤2，在所要检测的基因序列中，选择含多个CpG位点的一段序列作为目标检测序列，并以所选序列的5’端的一部分作为正向PCR引物，以所选序列3’端的一段序列的互补序列作为反向PCR引物；

步骤3，以亚硫酸盐处理过的标准甲基化DNA和非甲基化DNA作为PCR模板，加入DNA聚合酶，以荧光染料为指示剂，用所述正向PCR引物和反向PCR引物，在实时定量PCR扩增仪中进行扩增，并分别测定扩增产物的解链温度；

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，使所设计的PCR引物为18~32碱基长度，引物序列中CpG位点数量为0~3个，且所设计的引物的3’端的最后一个碱基不处于CpG的C的位置；并使PCR扩增后的DNA片段大小为80~180碱基长度，使PCR扩增的序列中含有尽可能多的CpG位点。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，在所述引物序列中的CpG位点的C位置，正向引物用C/T混合代替C，反向引物用G/A混合代替G。

4.根据全力要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤6中，使用冰水浴对加热的PCR产物进行冷却。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应所用的DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶；所述单链DNA特异性核酸内切酶为T7核酸内切酶 I、S1核酸酶、绿豆核酸酶中的一种或几种的混合；所述荧光染料为SYBR Green Ⅰ。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测DNA为人类基因组DNA，所述标准非甲基化DNA与标准甲基化DNA为于待测DNA相匹配的、已确定的纯的非甲基化人类基因组DNA和已确定的纯的甲基化人类基因组DNA。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述待测DNA样品为人类正常DNA，癌细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、血细胞DNA、血清DNA、体液DNA或排泄物DNA的样品。

8.根据全力要求7所述的检测方法，其特征在于，

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤1中所述亚硫酸盐具体为亚硫酸钠；所述亚硫酸盐处理待测DNA的处理步骤为，以0.3M的NaOH变性待测DNA，加入由5M亚硫酸钠、0.5mM氢醌组成的pH值为5.0的混合液，60℃避光温浴4小时；脱硫并纯化DNA。