CN102399865A - 基于核酸内切酶消化的甲基化dna定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种甲基化DNA的定量检测方法，包括以下步骤：步骤1，用亚硫酸盐处理待测DNA样品和标准DNA样品；步骤2，设计并合成PCR引物；步骤3，对标准DNA进行PCR扩增，并测定解链温度；步骤4，对待测DNA进行PCR扩增；步骤5，将待测DNA的PCR扩增产物加热到一特定温度后立即冷却；步骤6，对PCR产物进行消化；步骤7，加入对双链DNA特异的荧光染料，以荧光分光光度计测定荧光强度，并计算甲基化DNA含量。该方法操作简单，检测灵敏度高，特异性强，适用范围大，并且不受干扰，在肿瘤早期检测、个性化治疗、病情判断和复发监控等方面有着重要的意义。

Description

基于核酸内切酶消化的甲基化DNA定量检测方法

技术领域

本发明涉及一种甲基化DNA的定量检测方法，尤其涉及一种基于核酸内切酶消化的甲基化DNA定量检测方法。

背景技术

DNA甲基化是指DNA链上CpG位点的胞嘧啶（C）残基的5’碳上被修饰了一个甲基。DNA甲基化是最早发现的DNA修饰之一，是表观遗传学的重要组成部分。DNA甲基化特征性地发生在DNA链上的CpG二核苷酸的胞嘧啶（C）残基上，这常见于基因5’端表达调控序列。DNA甲基化在基因表达的调控中具有重要作用，参与了动物胚胎发育、基因印记和X染色体失活等过程。研究表明，DNA甲基化的改变能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及蛋白质互相作用方式的改变，从而控制基因表达。

DNA甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素。CpG岛局部甲基化水平的异常升高，可以导致基因组的不稳定和抑癌基因的不表达。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，则发生癌症的机率就会提高。所以DNA甲基化引人注目的地方就是在肿瘤的早期检测中的应用，因为研究表明表观遗传的变化伴随肿瘤的发生与发展，检测DNA甲基化改变可以有助于肿瘤的早期发现。

目前肿瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。这是因为人们发现肿瘤的发生可能与抑癌基因启动子区的CpG岛甲基化造成抑癌基因关闭有关。由于CpG岛的局部高度甲基化早于细胞的恶性增生，因此DNA甲基化的检测可以用于肿瘤发生的早期预测。

CpG岛甲基化的检测方法众多，其原理分别基于甲基化敏感的限制性内切酶消化法和基于亚硫酸钠修饰DNA的PCR检测法。甲基化敏感性限制性内切酶/Southern法（methylation-sensitive restriction Endonuclease/Southern，MSRE- Southern）是比较传统的方法，灵敏度低，样品需要量大。甲基化DNA特异性PCR法（Methylation Specific PCR，MSP）及其衍生的甲基化DNA检测方法，是目前检测DNA甲基化的常用方法，具有高灵敏度的同时，假阳性率也很高。

发明内容

本发明提供了一种甲基化DNA的定量检测方法，能够有效的分离出甲基化DNA和非甲基化DNA，并且解决了现有技术局限性大、方法复杂、需要样本量大、容易被干扰、不适用混合样本等缺点。

        本发明一种基于核酸内切酶消化的甲基化DNA定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，用亚硫酸盐处理待测DNA，和标准非甲基化DNA与标准甲基化DNA；

步骤2，在要检测的目标区域内，选择富含CpG位点的一段序列，以所选序列5’端的一部分的作为正向引物，以所选序列3’端的一段序列的互补序列作为反向引物；

步骤3，亚硫酸盐处理过的标准甲基化DNA和非甲基化DNA作为PCR模板，用所述步骤2所设计的正向和反向PCR引物，加入Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，并测定标准甲基化和非甲基化DNA扩增产物的解链温度；

步骤4，以亚硫酸盐处理的待测DNA样品作为PCR模板，在与步骤3相同的条件下，进行PCR扩增，得到PCR产物；

步骤5，将步骤4所得PCR扩增产物进行加热，使其温度高于标准非甲基化DNA相应的PCR扩增产物解链温度，而低于标准甲基化DNA相应的PCR扩增产物的解链温度；

步骤6，立即将步骤5中加热的PCR产物进行冷却，将冷却后的产物分为两部分，一部分加入单链DNA特异性核酸内切酶，另一部分不加单链DNA特异性核酸内切酶，在相同的反应条件下进行消化，得到消化产物；

步骤7，向步骤6所得消化产物中分别加入对双链DNA特异的荧光染料，用荧光分光光度计测定双链DNA的含量。

上述检测方法，其中，所述步骤1中所述亚硫酸盐优选为亚硫酸钠；所述亚硫酸盐处理待测DNA的处理方法为：以0.3M的NaOH变性待测DNA，加入由5M亚硫酸钠、0.5mM氢醌组成的pH值为5.0的混合液，60℃避光温浴4小时；脱硫并纯化DNA。

上述检测方法，其中，所述步骤2中，使所设计的PCR引物优选为18~32碱基长度，在引物序列中所涉及的CpG位点数量可以为0~3个，且使所设计的引物的3’端的最后一个碱基不处于CpG的C的位置，以使PCR扩增的DNA片段大小为80~180碱基长度，并使PCR扩增的序列中含有尽可能多的CpG位点。

上述检测方法，其中，在所述的引物序列中所涉及的CpG位点的C的位置，正向引物中可以用C/T混合代替C，反向引物中可以用G/A混合代替G。

上述检测方法，其中，所述步骤3中，使用实时定量PCR扩增仪进行扩增，并分别测定标准甲基化和非甲基化DNA扩增产物解链温度。

上述检测方法，其中，所述单链DNA特异性核酸内切酶为T7核酸内切酶 I、S1核酸酶或绿豆核酸酶中的一种或几种的混合。

上述检测方法，其中，所述对双链DNA特异的荧光染料为SYBR Green Ⅰ。

上述检测方法，其中，所述待测DNA为人类基因组DNA，所述标准非甲基化DNA与标准甲基化DNA为已确定的纯的非甲基化人类基因组DNA和已确定的纯的甲基化人类基因组DNA。

上述检测方法，其中，所述待测DNA样品为人类正常DNA，癌细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、血细胞DNA、血清DNA、体液DNA或排泄物DNA的样品。

上述检测方法，其中，所述癌细胞为肺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、淋巴癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞或胰腺癌细胞；

所述肿瘤组织为肺癌组织、胃癌组织、结肠癌组织、直肠癌组织、肝癌组织、乳腺癌组织、淋巴癌组织、膀胱癌组织、卵巢癌组织、肾癌组织或胰腺癌组织；

所述体液为血液、脑脊髓液、胃液、消化液、精液、唾液、泪液、汗液、尿液或阴道分泌液。

本发明提供了一种甲基化DNA定量检测方法，该方法具有适用范围大、方法简单、需要样本量小、不易被干扰、适用混合样本等优点。在肿瘤早期检测、个性化治疗、病情判断和复发监控等方面有着重要的意义。

附图说明

图1为本发明甲基化DNA定量检测方法流程图。

具体实施方式

参照图1，对本发明甲基化DNA定量检测方法具体介绍如下：

实施方式（一）：

步骤1：采用亚硫酸盐处理并纯化已知的标准非甲基化DNA和甲基化DNA，将处理过的甲基化DNA作梯度稀释，且与一定量的非甲基化DNA混合，作为待测DNA样品。

其中，标准甲基化DNA和标准非甲基化DNA为已知的甲基化DNA和非甲基化DNA；所述亚硫酸盐具体为亚硫酸钠；所述亚硫酸盐处理待测DNA的处理步骤为，以0.3M NaOH变性待测DNA，加入由5M亚硫酸钠、0.5mM氢醌、pH5.0的混合液，60℃避光温浴4小时；脱硫并纯化DNA。

步骤2：确定待测基因检测区域，按照基因序列设计并合成能同时扩增亚硫酸盐处理过的非甲基化DNA和甲基化DNA的正向PCR引物和反向PCR引物。

其中引物设计的要求为：在所要检测的基因序列中，选择一段序列作为目标检测序列进行引物设计，使这一段序列富含CpG位点。以这一段序列的5’端的一段序列作为PCR的正向引物，以这一段序列的3’端的一段序列的互补序列作为PCR的反向引物，使PCR扩增的DNA片段大小为80~180碱基长，使PCR扩增的序列中含有尽可能多的CpG位点，一般为8~20个；所设计的PCR引物为18~32碱基长，在引物的序列中不含有或含有不超过3个CpG位点，在所涉及CpG位点的“C”的位置，正向引物可以用C/T混合代替C，反向引物可以用G/A混合代替G；且使所设计的引物的3’端的最后一个碱基不处于CpG的“C”的位置。

步骤3：以上述的PCR引物，以标准的非甲基化DNA和甲基化DNA为模板，以Taq DNA聚合酶，加入荧光染料，以实时定量PCR仪，进行PCR扩增，并进行解链温度测定。

其中所述的PCR操作过程，由正向和反向PCR引物、PCR扩增缓冲液（Buffer）、Taq DNA聚合酶、四种三磷酸脱氧核糖核苷酸（dNTPs）、所述亚硫酸钠处理过的DNA模板（Template），纯水组成的PCR体系，以荧光染料SYBR Green Ⅰ为指示剂，采用实时定量PCR仪进行扩增，并进行解链温度测定，分别测定标准甲基化DNA和标准非甲基化DNA样品的PCR产物的解链温度。

步骤4：将一定量的亚硫酸钠处理过的标准非甲基化DNA，与梯度稀释的亚硫酸钠处理过的标准甲基化DNA混合，作为待测样品；在相同条件下进行PCR扩增。

其中，相同条件是指除模板DNA以外，其他操作均与步骤2相同；但不进行解链温度测定。

步骤5：将步骤4中所得PCR产物进行加热至一个特定温度，使这一温度高于非甲基化DNA相应的PCR产物解链温度，而低于甲基化DNA相应的PCR产物的解链温度，然后立即冷却。

步骤6：将步骤5中所加热处理并冷却的样品，分为两份，其中一份加入对单链DNA特异的核酸内切酶和相应的反应缓冲液，在适当条件下进行消化处理，另一份作为对照。

其中，所述对单链DNA特异的核酸内切酶为T7核酸内切酶 I、S1核酸酶或绿豆核酸酶，或者是上述几种的混合。

步骤7：将步骤6所得消化产物，加入对双链DNA特异的荧光染料SYBR Green Ⅰ，以荧光分光光度计进行荧光强度测定，记录所测定的加入单链DNA特异性核酸内切酶时及不加入单链DNA特异性核酸内切酶时双链DNA的浓度比例变化，并计算待测样品中所含甲基化DNA的量。

本发明一种甲基化DNA检测方法，通过上述步骤检验本发明的准确度和灵敏度。

在医学领域，能够准确而灵敏地测出DNA中是否存在甲基化DNA，就能够对于肿瘤的早期检测、病情判断和癌症的复发监控提供一种很好的指标。

实施方式（二）

在实施方式（一）的基础上，以实际临床样品提取的DNA为待测样品，在与上述实施方式（一）相同的条件下，检验本发明的实用性。

其中，与上述在实施方式（一）相同的条件，指的是除以实际临床样品提取的DNA为待测样品外，所有操作与上述在实施方式（一）相同。

所述临床提取的待测DNA样品，为人类正常和癌细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、血细胞DNA、血清DNA、各种体液DNA或各种排泄物DNA的样品。

所述癌细胞可以是肺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、淋巴癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞或胰腺癌细胞；所述肿瘤组织可以是肺癌组织、胃癌组织、结肠癌组织、直肠癌组织、肝癌组织、乳腺癌组织、淋巴癌组织、膀胱癌组织、卵巢癌组织、肾癌组织或胰腺癌组织；所述各种体液可以是血液、脑脊髓液、胃液及各种消化液、精液、唾液、泪液、汗液、尿液、阴道分泌液等。

实施方式（三）

在实施方式（一）和（二）的基础上，以P16基因转录启动区的序列为例，具体PCR引物设计如下：

P16基因转录启动区的甲基化是肺癌等多种癌症细胞具有的特征。P16基因转录启动区的序列如下，

Homo sapiens p16 protein (CDKN2A) gene, CpG island and partial cds，DQ325544.1

CGGACCGCGTGCGCTCGGCGGCTGCGGAGAGGGGGAGAGCAGGCAGCGGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCGGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCCTTCGGCTGACTGGCTGGCCACGGCCGCGGCCCGGGCTCGGGTAGAGGAGGTGCGGGCGCTGCTGGAGGCGGGGGCGCTGCCCAACGCACCGAATAGTTACGGTCGGAGGCCG

    甲基化DNA序列，下划线部分为要检测的区域；

CGGATCGCGTGCGTTCGGCGGTTGCGGAGAGGGGGAGAGTAGGTAGCGGGCGGCGGGGAGTAGTATGGAGCGGGCGGCGGGGAGTAGTATGGAGTTTTCGGTTGATTGGTTGGTTACGGTCGCGGTTCGGGTTCGGGTAGAGGAGGTGCGGGCGTTGTTGGAGGCGGGGGCGTTGTTTAACGTATCGAATAGTTACGGTCGGAGGTCG

    非甲基化DNA序列，下划线部分为要检测的区域；

TGGATTGTGTGTGTTTGGTGGTTGTGGAGAGGGGGAGAGTAGGTAGTGGGTGGTGGGGAGTAGTATGGAGTGGGTGGTGGGGAGTAGTATGGAGTTTTTGGTTGATTGGTTGGTTATGGTTGTGGTTTGGGTTTGGGTAGAGGAGGTGTGGGTGTTGTTGGAGGTGGGGGTGTTGTTTAATGTATTGAATAGTTATGGTTGGAGGTTG

    所设计的PCR引物

    正向引物     5’- GTTGYGGAGAGGGGGAGAGTAGGTAG-3’

    反向引物     5’- TTAAACAACRCCCCCRCCTCCAACAA-3’

然后，按照实施方式（一）所述的方法，进行检测。

上述内容为本发明的具体实施例的例举，对于其中未详尽描述的试剂、设备、操作方法等，应当理解为采取本领域已有的普通及常规试剂、设备、操作方法等来予以实施。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (9)

1.一种基于核酸内切酶消化的甲基化DNA定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，用亚硫酸盐处理待测DNA、和标准非甲基化DNA与标准甲基化DNA；

步骤2，在要检测的目标区域内，选择含多个CpG位点的一段序列，以所选序列5’端的一部分的作为正向引物，以所选序列3’端的一段序列的互补序列作为反向引物；

步骤3，以亚硫酸盐处理过的标准甲基化DNA和非甲基化DNA作为PCR模板，用所述步骤2所设计的正向和反向PCR引物，加入Taq DNA聚合酶，以实时定量PCR仪进行PCR扩增，并测定标准甲基化和非甲基化DNA扩增产物的解链温度；

步骤4，以亚硫酸盐处理的待测DNA样品作为PCR模板，在与步骤3相同的条件下，进行PCR扩增，得到PCR产物；

步骤5，将步骤4所得PCR扩增产物进行加热，使其温度高于标准非甲基化DNA相应的PCR扩增产物解链温度，而低于标准甲基化DNA相应的PCR扩增产物的解链温度；

步骤6，立即将步骤5中加热的PCR产物进行冷却，将冷却后的产物分为两部分，一部分加入单链DNA特异性核酸内切酶，另一部分不加单链DNA特异性核酸内切酶，在相同的反应条件下进行消化，得到消化产物；

步骤7，向步骤6所得消化产物中分别加入对双链DNA特异的荧光染料，用荧光分光光度计测定双链DNA的含量。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤1中所述亚硫酸盐具体为亚硫酸钠；所述亚硫酸盐处理待测DNA的处理方法为：以0.3M的NaOH变性待测DNA，加入由5M亚硫酸钠、0.5mM氢醌组成的pH值为5.0的混合液，60℃避光温浴4小时；脱硫并纯化DNA。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，使所设计的PCR引物为18~32碱基长度，在引物序列中所涉及的CpG位点数量可以为0~3个，且所设计的引物的3’端的最后一个碱基不处于CpG的C的位置；并使PCR扩增的DNA片段大小为80~180碱基长度，使PCR扩增的序列中含有尽可能多的CpG位点。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，在所述的引物序列中所涉及的CpG位点的C的位置，正向引物中用C/T混合代替C，反向引物中用G/A混合代替G。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述单链DNA特异性核酸内切酶为T7核酸内切酶 I、S1核酸酶或绿豆核酸酶中的一种或几种的混合。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述对双链DNA特异的荧光染料为SYBR Green Ⅰ。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测DNA为人类基因组DNA，所述标准非甲基化DNA与标准甲基化DNA为已确定的纯的非甲基化人类基因组DNA和已确定的纯的甲基化人类基因组DNA。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述待测DNA样品为人类正常DNA，癌细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、血细胞DNA、血清DNA、体液DNA或排泄物DNA的样品。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，

所述癌细胞为肺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、淋巴癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞或胰腺癌细胞；

所述肿瘤组织为肺癌组织、胃癌组织、结肠癌组织、直肠癌组织、肝癌组织、乳腺癌组织、淋巴癌组织、膀胱癌组织、卵巢癌组织、肾癌组织或胰腺癌组织；

所述体液为血液、脑脊髓液、胃液、消化液、精液、唾液、泪液、汗液、尿液或阴道分泌液。

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