JP7169192B2 - メチル化されたdnaの増幅方法、dnaのメチル化判定方法並びに癌の判定方法 - Google Patents
メチル化されたdnaの増幅方法、dnaのメチル化判定方法並びに癌の判定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7169192B2 JP7169192B2 JP2018537574A JP2018537574A JP7169192B2 JP 7169192 B2 JP7169192 B2 JP 7169192B2 JP 2018537574 A JP2018537574 A JP 2018537574A JP 2018537574 A JP2018537574 A JP 2018537574A JP 7169192 B2 JP7169192 B2 JP 7169192B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- region
- methylation
- present
- cancer
- analyzed
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
- C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
- C12Q2521/30—Phosphoric diester hydrolysing, i.e. nuclease
- C12Q2521/301—Endonuclease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/154—Methylation markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
DNAのメチル化は、高等生物において、正常な発生と細胞の分化に極めて重要な役割を担っている。
現在、メチル化されたDNAを増幅する方法としては、例えば、(1)DNAをバイサルファイト反応に付し、次いで、PCR等の核酸増幅反応に付す方法(特許文献1)、(2)DNAをメチル化感受性制限酵素及びメチル化非感受性制限酵素で処理し、次いで、PCR等の核酸増幅反応に付す方法(特許文献2)が行われている。また、特許文献1および特許文献2では、メチル化されたDNAを増幅する方法により得られた増幅産物をDNAマイクロアレイ等により解析し、その結果に基づいて、DNAがメチル化されているか否かの判定や解析も行われている。
一方、DNAのメチル化は、癌化と関連することも知られている。例えば、DNAのメチル化のパターンの差異が癌や種々の疾患と関連していること(非特許文献1、2)や、DNAのメチル化率を元に癌を検出する方法等が行われている(特許文献3)。
従って、メチル化されたDNAの増幅、更にはこれを用いたDNAのメチル化判定及び癌の判定を簡便に行うことができる方法の開発が望まれていた。
即ち、本発明は、メチル化されたDNAの増幅及びこれを用いたDNAのメチル化判定並びに癌の判定を簡便に行うことができる方法の提供を課題とする。
[1]下記工程1及び2を含む、二本鎖DNA中のメチル化された分析対象領域の増幅方法:
(1)分析対象領域を含む二本鎖DNAをS1ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程1、
(2)工程1で処理された二本鎖DNAの分析対象領域を増幅する工程2。
[2]前記工程1が、S1ヌクレアーゼで処理した後に、メチル化感受性制限酵素で処理する、[1]に記載の増幅方法。
[3]前記工程1が、メチル化感受性制限酵素で処理した後に、S1ヌクレアーゼで処理する、[1]に記載の増幅方法。
[4]前記工程1の前に、認識配列が分析対象領域内に存在しない制限酵素で処理する断片化工程を含む、[1]~[3]の何れかに記載の増幅方法。
[5]下記工程1~4を含む、二本鎖DNA中の分析対象領域のメチル化判定方法:
(1)分析対象領域を含む二本鎖DNAをS1ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程1、
(2)工程1で処理された二本鎖DNAの分析対象領域を増幅する工程2、
(3)工程2で得られた増幅産物の有無を確認する工程3、
(4)工程3の結果に基づいて、分析対象領域がメチル化されているか否かを判定する工程4。
[6]前記工程1が、S1ヌクレアーゼで処理した後に、メチル化感受性制限酵素で処理する、[5]に記載のメチル化判定方法。
[7]前記工程1が、メチル化感受性制限酵素で処理した後に、S1ヌクレアーゼで処理する、[5]に記載のメチル化判定方法。
[8]前記工程1の前に、認識配列が分析対象領域内に存在しない制限酵素で処理する断片化工程を含む、[5]~[7]の何れかに記載のメチル化判定方法。
[9]S1ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素を含む、DNAのメチル化判定用試薬。
[10]下記工程1~4を含む、癌の判定方法:
(1)分析対象領域を含む二本鎖DNAをS1ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程1、
(2)工程1で処理された二本鎖DNAの分析対象領域を増幅する工程2、
(3)工程2で得られた増幅産物の有無を確認する工程3、
(4)工程3の結果に基づいて、癌を判定する工程4。
[11]前記工程1が、S1ヌクレアーゼで処理した後に、メチル化感受性制限酵素で処理する、[10]に記載の癌の判定方法。
[12]前記工程1が、メチル化感受性制限酵素で処理した後に、S1ヌクレアーゼで処理する、[10]に記載の癌の判定方法。
[13]前記工程1の前に、認識配列が分析対象領域内に存在しない制限酵素で処理する断片化工程を含む、[10]~[12]の何れかに記載の癌の判定方法。
[14]分析対象領域が配列番号1、配列番号4又は配列番号11で表される塩基配列を含む塩基配列である、[10]~[13]の何れかに記載の癌の判定方法。
[15]下記工程1~3を含む、癌の判定を行うためのデータを得る方法:
(1)分析対象領域を含む二本鎖DNAをS1ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程1、
(2)工程1で処理された二本鎖DNAの分析対象領域を増幅する工程2、
(3)工程2で得られた増幅産物の有無を確認する工程3。
[16]S1ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素を含む、癌の判定用試薬。
[17]下記工程1及び2を行うことによって得られる、癌の判定を行うためのマーカー:
(1)分析対象領域を含む二本鎖DNAをS1ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程1、
(2)工程1で処理された二本鎖DNAの分析対象領域を増幅する工程2。
本発明は、更に以下の構成も含む。
[18]下記工程1~5を含む、分析対象領域のメチル化解析(判定)方法:
(1)分析対象領域を含むDNAをS1ヌクレアーゼで処理する工程1、
(2)工程1で処理された二本鎖DNAをメチル化感受性制限酵素で処理する工程2、
(3)工程2で処理された二本鎖DNAの分析対象領域を増幅する工程3、
(4)工程3で得られた増幅産物の有無を確認する工程4、
(5)工程4の結果に基づいて、分析対象領域がメチル化されているか否かの判定を行う工程5。
[19]工程3の増幅をPCRで行う、[18]に記載の解析(判定)方法。
[20]工程4の増幅産物の確認を電気泳動で行う、[18]又は[19]に記載の解析(判定)方法。
[21]更に、工程1に続いて、工程1で処理されたDNAを精製する精製工程を含む、[18]~[20]の何れかに記載の解析(判定)方法。
[22]精製工程の精製をカラム精製法により行う、[21]に記載の解析(判定)方法。
[23]更に、精製工程を行う前に、認識配列が分析対象領域に存在しない制限酵素で処理する断片化工程を含む、[22]に記載の解析(判定)方法。
[24]S1ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素を含む、DNAメチル化解析(判定)用試薬。
[25]下記工程1~5を含む、癌の判定方法:
(1)分析対象領域を含むDNAをS1ヌクレアーゼで処理する工程1、
(2)工程1で処理された二本鎖DNAをメチル化感受性制限酵素で処理する工程2、
(3)工程2で処理された二本鎖DNAの分析対象領域を増幅する工程3、
(4)工程3で得られた増幅産物の有無を確認する工程4、
(5)工程4の結果に基づいて、癌を判定する工程5。
[26]分析対象領域がプロモーター領域である、[25]に記載の判定方法。
[27]工程2のメチル化感受性制限酵素がHapII、HpaII又はSacIIである、[25]又は[26]に記載の判定方法。
[28]工程3で増幅する核酸が、配列番号1で表される塩基配列を含む連続する塩基配列である、[25]~[27]の何れかに記載の判定方法。
[29]工程3の増幅をPCRで行う、[25]~[28]の何れかに記載の判定方法。
[30]PCRが、配列番号2で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号3で表されるリバースプライマーを用いてなされる、[29]に記載の判定方法。
[31]工程4の増幅産物の有無の確認を電気泳動で行う、[25]~[30]の何れかに記載の判定方法。
[32]更に、工程1に続いて、工程1で処理されたDNAを精製する精製工程を含む、[25]~[31]の何れかに記載の判定方法。
[33]精製工程の精製をカラム精製法により行う、[32]に記載の判定方法。
[34]更に、精製工程を行う前に、認識配列が分析対象領域に存在しない制限酵素で処理する断片化工程を含む、[33]に記載の判定方法。
[35]下記工程1~4を含む、癌の判定を行うためのデータを得る方法:
(1)分析対象領域を含むDNAをS1ヌクレアーゼで処理する工程1、
(2)工程1で処理された二本鎖DNAをメチル化感受性制限酵素で処理する工程2、
(3)工程2で処理された二本鎖DNAの分析対象領域を増幅する工程3、
(4)工程3で得られた増幅産物の有無を確認する工程4。
[36]S1ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素を含む、癌の判定用試薬。
[37]下記工程1~3を行うことによって得られる、癌の判定を行うためのマーカー:
(1)分析対象領域を含むDNAをS1ヌクレアーゼで処理する工程1、
(2)工程1で処理された二本鎖DNAをメチル化感受性制限酵素で処理する工程2、
(3)工程2で処理された二本鎖DNAの分析対象領域を増幅する工程3。
本発明の増幅方法は、(1)分析対象領域を含む二本鎖DNAをS1ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程1、(2)工程1で処理された二本鎖DNAの分析対象領域を増幅する工程2を含むことを特徴とするものである。
本発明に係る二本鎖DNAとしては、CpG配列(-CG-)を含む二本鎖DNAであれば何れでもよい。
本発明に係る分析対象領域は、本発明に係る二本鎖DNA中に存在するCpG配列を含む連続した特定の二本鎖DNA部分であり、本発明に係る二本鎖DNAの一部又は全部であってもよい。
このような分析対象領域のうち、本発明の増幅方法において増幅される分析対象領域は、シトシンがメチル化されたCpG配列を含む連続した特定の二本鎖DNA部分である。
尚、上記「メチル化」とは、DNAメチラーゼによる塩基修飾のことであり、シトシンの次にグアニンが現れる2塩基配列であるCpG配列のシトシン塩基の5位等にメチル基が付加した状態を意味する。
本発明に係る分析対象領域としては、具体的には、例えば、任意に選択した適当な遺伝子のプロモーター領域内の特定領域のDNAが挙げられ、FOXB2遺伝子のプロモーター領域内の特定領域のDNAがより好ましく、ヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の特定領域のDNAまたはイヌ由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の特定領域のDNAが更に好ましく、ヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の配列番号1で表される塩基配列からなる領域(267塩基対)、ヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の配列番号11で表される塩基配列からなる領域(149塩基対)またはイヌ由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の配列番号4で表される塩基配列からなる領域(433塩基対)が特に好ましい。
本発明に係る工程1は、分析対象領域を含む二本鎖DNAを、S1ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程である。
本発明に係る工程1におけるS1ヌクレアーゼの濃度(ユニット数)は、通常、目的のDNA1~200ngに対して、1~200ユニット/μLであり、5~190ユニット/μLが好ましく、20~180ユニット/μLがより好ましい。
本発明に係る工程1におけるS1ヌクレアーゼによる処理は、通常10~37℃で、好ましくは15~25℃で、通常5~30分間、好ましくは10~20分間反応を行えばよい。
また、本発明に係る工程1におけるS1ヌクレアーゼによる処理は、pH4~5の条件の下なされることが好ましく、ここで用いられる緩衝液としては、例えば、酢酸ナトリウム緩衝液等を用いればよい。
本発明に係る工程1におけるメチル化感受性制限酵素は、認識する塩基配列が分析対象領域内に存在するものであれば、何れでもよい。即ち、分析対象領域に応じて適宜選択されればよい。
本発明に係る工程1におけるメチル化感受性制限酵素としては、具体的には、例えば、AatII、AccI、AccII、AfaI、Aor13HI、Aor51HI、ApaI、ApaLI、BglI、BmgT120I、BspT104I、BssHII、Cfr10I、ClaI、CpoI、EaeI、Eco52I、HaeII、HapII、HpaII、HhaI、MluI、NaeI、NheI、NotI、NruI、NsbI、PmaCI、Psp1406I、PvuI、SacII、SalI、Sau3AI、SmaI、SnaBI、VpaK11BI等が挙げられる。中でも、ヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域のうち、配列番号1で表される塩基配列からなる領域を分析対象領域として設定した場合、HapII、HpaII又はSacIIを用いることが好ましく、HpaII又はHapIIを用いることがより好ましい。また、ヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域のうち、配列番号11で表される塩基配列からなる領域又はイヌ由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域のうち、配列番号4で表される塩基配列からなる領域を分析対象領域として設定した場合、HapII又はHpaIIを用いることが好ましい。
本発明に係る工程1におけるメチル化感受性制限酵素の濃度(ユニット数)は、通常、目的のDNA1~200ngに対して、1~50ユニット/μLであり、5~50ユニット/μLが好ましく、10~50ユニット/μLがより好ましい。
本発明に係る工程1におけるメチル化感受性制限酵素による処理は、通常20~50℃で、好ましくは35~45℃で、通常60~150分間、好ましくは60~120分間反応を行えばよい。
また、本発明に係る工程1におけるメチル化感受性制限酵素による処理は、pH6~8の条件の下なされることが好ましく、ここで用いられる緩衝液としては、例えば、トリス緩衝液等を用いればよい。
また、本発明に係る工程1の前に、認識配列が分析対象領域内に存在しない制限酵素で処理するのが好ましく、当該制限酵素の詳細は、[認識配列が分析対象領域内に存在しない制限酵素で処理する断片化工程]の項で詳述する。
また、本発明に係る工程1におけるメチル化感受性制限酵素による処理を行うことにより、メチル化されている二本鎖DNAの分析対象領域は切断されず、メチル化されていない二本鎖DNAの分析対象領域が切断されるため、メチル化されている二本鎖DNAの分析対象領域を特異的に増幅させることができる。
従って、分析対象領域を含むDNAを本発明に係る工程1で処理することにより、本発明に係る工程2において、メチル化されている二本鎖DNAの分析対象領域を特異的且つ高感度に増幅することができる。
本発明に係る工程2は、本発明に係る工程1で処理された二本鎖DNAの分析対象領域を増幅する工程である。
本発明に係る工程2における増幅産物は、分析対象領域そのものであっても、分析対象領域以外の塩基配列(例えば、プライマー等)を含むものであってもよく、当該増幅産物の大きさ(塩基対数)としては、通常50~1100塩基対であり、50~800塩基対が好ましく、50~600塩基対がより好ましい。
本発明に係る工程2における増幅産物としては、具体的には、例えば、任意に選択した適当な遺伝子のプロモーター領域内の特定領域のDNAが挙げられ、FOXB2遺伝子のプロモーター領域内の特定領域のDNAがより好ましく、ヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の特定領域のDNAまたはイヌ由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の特定領域のDNAが更に好ましく、ヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の配列番号1で表される塩基配列からなる領域(267塩基対)、ヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の配列番号11で表される塩基配列からなる領域(149塩基対)またはイヌ由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の配列番号4で表される塩基配列からなる領域(433塩基対)が特に好ましい。
具体的には、例えば、鋳型となるDNA含有溶液、フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマー対、プローブ、核酸合成基質、核酸合成酵素等を含むデジタルPCR用反応液を調製し、ドロップレット作製装置[例えば、QX200 Droplet Generator(バイオ・ラッドラボラトリーズ(株)製)、Automated Droplet Generator(バイオ・ラッドラボラトリーズ(株)製)等]により当該反応液を多数のドロップレット(1サンプルにつき1万~3万個)に分割する。その後、デジタルPCR装置[例えば、Droplet Digital PCR(バイオ・ラッドラボラトリーズ(株)製)、QuantStudio 3D Digital PCR System(サーモフィッシャーサイエンティフィック(株)製)等]により、PCR反応を行えばよい。
本発明に係るプライマー対を構成するプライマーの大きさ(塩基数)としては、通常10~50塩基であり、10~35塩基が好ましく、15~35塩基がより好ましく、20~30塩基が特に好ましい。
本発明に係るプライマー対としては、具体的には、例えば、ヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域のうち、配列番号1で表される塩基配列からなる領域を、分析対象領域として設定した場合、フォワードプライマーとしては、配列番号2で表される塩基配列からなるものが好ましく、リバースプライマーとしては、配列番号3で表される塩基配列からなるものが好ましい。ヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域のうち、配列番号11で表される塩基配列からなる領域を、分析対象領域として設定した場合、フォワードプライマーとしては、配列番号12で表される塩基配列からなるものが好ましく、リバースプライマーとしては、配列番号13で表される塩基配列からなるものが好ましい。また、イヌ由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域のうち、配列番号4で表される塩基配列からなる領域を、分析対象領域として設定した場合、フォワードプライマーとしては、配列番号5で表される塩基配列からなるものが好ましく、リバースプライマーとしては、配列番号6で表される塩基配列からなるものが好ましい。
以下に、上記プライマー対を構成する各プライマーの塩基配列、名称及びプライマー対により増幅される領域を示す。
本発明に係るプライマーを標識物質で標識するために用いられる標識物質としては、蛍光物質、放射性同位体、酵素及び発光物質など公知の標識物質が挙げられ、蛍光物質が特に好ましい。
例えば、蛍光物質としては、TAMRATM(シグマアルドリッチ(株)製)、Alexa555、Alexa647(インビトロジェン(株)製)、Cyanine Dye系のCy3、Cy5(アマシャムバイオサイエンス(株)製)、フルオレセイン等が挙げられる。
放射性同位体としては、32P、33P、35S等が挙げられる。
酵素としては、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等が挙げられる。
発光物質としては、Acridinium Easterを含む化学発光試薬等が挙げられる。
本発明に係るプローブの大きさ(塩基数)としては、通常10~50塩基であり、15~40塩基が好ましく、20~30塩基がより好ましい。
本発明に係るプローブとしては、具体的には、例えば、ヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域のうち、配列番号11で表される塩基配列からなる領域を、分析対象領域として設定した場合、配列番号14で表される塩基配列からなるものが好ましい。
以下に、上記プローブの塩基配列および名称を示す。
尚、本発明に係るプローブとして配列番号14で表される塩基配列からなるものを用いた場合、レポーター蛍光色素としてはFAMが好ましく、クエンチャー蛍光色素としてはBHQ1が好ましい。
更に、上記PCR用反応液中に、MgCl2、KCl、(NH4)2SO4等の塩、ポリエチレングリコール、Triton(ユニオンカーバイド(株)製)、Nohidet(シェルケミカルズ(株)製)、CHAPS((株)同仁化学製)等の界面活性剤、プロクリン300(シグマルドリッチ(株)製)等の防腐剤、HapII、HpaII、SacII等のメチル化感受性制限酵素等が含まれていてもよい。
本発明に係る精製工程は、DNAを精製する工程のことである。
これにより、引き続き行われる処理や工程の前に不純物を取り除くことができるため当該精製工程を行うのが好ましい。
本発明に係る精製工程を行う場合は、本発明に係る工程1の後且つ本発明に係る工程2の前、又は/及び後述する[認識配列が分析対象領域内に存在しない制限酵素で処理する断片化工程]の後且つ本発明に係る工程1の前に当該精製工程を行えばよい。
尚、本発明に係る工程1の後且つ本発明に係る工程2の前に当該精製工程を行う場合としては、以下の場合が挙げられる。
(i)本発明に係る工程1においてS1ヌクレアーゼによる処理とメチル化感受性制限酵素による処理を同時に行う場合は、これらの処理の後且つ本発明に係る工程2の前に精製工程を行えばよい。
(ii)本発明に係る工程1においてS1ヌクレアーゼによる処理の後にメチル化感受性制限酵素による処理を行う場合は、S1ヌクレアーゼによる処理の後、又は/及びメチル化感受性制限酵素処理の後、且つ本発明に係る工程2の前に精製工程を行えばよく、少なくともS1ヌクレアーゼによる処理の後(且つメチル化感受性制限酵素による処理の前)に精製工程を行うのが好ましい。
(iii)本発明に係る工程1においてメチル化感受性制限酵素による処理の後にS1ヌクレアーゼによる処理を行う場合は、メチル化感受性制限酵素による処理の後、又は/及びS1ヌクレアーゼによる処理の後、且つ本発明に係る工程2の前に精製工程を行えばよく、メチル化感受性制限酵素による処理の後及びS1ヌクレアーゼによる処理の後且つ本発明に係る工程2の前にそれぞれ精製工程を行うのが好ましい。
本発明に係る工程1におけるS1ヌクレアーゼによる処理と本発明に係る工程1におけるメチル化感受性制限酵素による処理および本発明に係る工程2とでは好ましいpHが異なる。そのため、上記(ii)の場合、S1ヌクレアーゼによる処理の後に引き続いて当該精製工程を実施することにより、不純物を取り除くとともにpHを調整し、本発明に係る工程1におけるメチル化感受性制限酵素の反応を効率的に行うことができる。
また、上記(iii)の場合、メチル化感受性制限酵素による処理及びS1ヌクレアーゼによる処理に引き続いて当該精製工程を実施することにより、不純物を取り除くとともにpHを調整し、本発明に係る工程2を効率的に行うことができる。
即ち、DNA含有溶液 10~100μLに、アルコール 50~100μL及び緩衝液 30~100μLを加え、10000~22000×gで1~30分間遠心分離し、フロースルー液を回収することにより、精製されたDNAが得られる。
上記アルコールとしては、イソプロパノール、エタノール、ブタノール等が挙げられ、イソプロパノール又はエタノールがより好ましく、イソプロパノールが更に好ましい。
上記緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液等が挙げられ、トリス緩衝液又はリン酸緩衝液がより好ましく、トリス緩衝液が更に好ましい。尚、上記緩衝液の濃度、pHは通常この分野で用いられる範囲であればよい。
即ち、DNA含有溶液 10~150μLに、タンパク質変性剤 200~700μL又は/及び緩衝液 200~700μLを加えて混合し、例えば、充填剤を充填したカラム[例えば、エコノスピン((株)ジーンデザイン製)]に移し、10000~22000×g、室温で1~3分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。次いで、緩衝液 500~700μL及びアルコール 500~700μLを加え、10000~22000×g、室温で1~3分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。更に、10000~22000×g、室温で1~10分間遠心分離し、新しいチューブに交換し、緩衝液又は滅菌水 20~60μLを加え、10000~22000×g、室温で1~3分間遠心分離し、フロースルー液を回収することにより、精製されたDNAが得られる。
上記タンパク質変性剤としては、グアニジン塩酸塩、ホルムアミド、尿素等が挙げられ、グアニジン塩酸塩がより好ましい。
上記アルコールとしては、エタノール、イソプロパノール、ブタノール等が挙げられ、エタノール又はイソプロパノールがより好ましく、エタノールが更に好ましい。
上記緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液等が挙げられ、トリス緩衝液又はリン酸緩衝液がより好ましく、トリス緩衝液が更に好ましい。尚、上記緩衝液の濃度、pHは通常この分野で用いられる範囲であればよい。
本発明の増幅方法においては、試料から分析対象領域を含むDNAを抽出した後、認識配列が分析対象領域内に存在しない制限酵素で処理する断片化工程(以下、本発明に係る断片化工程と略記する場合がある。)を行うのが好ましい。特に、血清、血漿、尿等の体液中に存在する、CTC由来のDNAの特定領域、cfDNAの特定領域又はエクソソーム(エキソソーム)由来のDNAの特定領域を分析対象領域として設定する場合、当該断片化工程を行うのが好ましい。また、本発明に係る断片化工程を行う場合は、本発明に係る工程1を行う前に当該断片化工程を行えばよい。
本発明に係る断片化工程における制限酵素は、二本鎖DNAを切断するものであり、その認識配列が分析対象領域内に存在しないものであれば何れでもよく、分析対象領域に応じて、適宜選択されればよい。更に、本発明に係る断片化工程における制限酵素は、必要に応じて複数種用いてもよい。
上記「その認識配列が分析対象領域内に存在しない」とは、「制限酵素の認識配列が分析対象領域を切断することができない」または「制限酵素が分析対象領域中の塩基配列を認識しない」と同一の意味を表すものである。
本発明に係る断片化工程における制限酵素としては、ヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域のうち、配列番号1で表される塩基配列からなる領域またはイヌ由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域のうち、配列番号4で表される塩基配列からなる領域を分析対象領域と設定した場合、BamHI又は/及びHindIIIを用いることが好ましい。また、ヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域のうち、配列番号11で表される塩基配列からなる領域を分析対象領域と設定した場合、MboIを用いることが好ましい。
本発明に係る断片化工程における制限酵素による処理は、通常20~50℃で、好ましくは35~40℃で、通常60~150分間、好ましくは60~120分間反応を行えばよい。
尚、上述の通り、本発明に係る断片化工程と本発明に係る工程1におけるメチル化感受性制限酵素による処理における好ましいpHは同じである。そのため、本発明に係る工程1におけるメチル感受性制限酵素による処理に加えて、本発明に係る断片化工程における制限酵素による処理と同時にメチル化感受性制限酵素による処理を行ってもよい。
尚、当該断片化工程の後に、前述した精製工程を行ってもよい。
本発明の増幅方法の具体例を、(A)血清、血漿、尿等の体液中に存在するDNAの特定領域を分析対象領域として設定する場合、(B)組織、細胞、全血、尿等の中に存在するDNAの特定領域を分析対象領域として設定する場合に分けて、以下に説明する。
(1)DNAの抽出
例えば、核酸抽出キット[例えば、NucleoSpin(商標) Plasma XS(マッハライ・ナーゲル(株)製)又はMagMAXTM Cell-Free DNA Isolation Kit(サーモフィッシャーサイエンティフィック(株)製)]により、試料(例えば、血漿)からDNA(例えば、cfDNA)を抽出する。
(2)本発明に係る断片化工程
上記(1)で得たDNAに、本発明に係る断片化工程における緩衝液(例えば、トリス緩衝液) 5~15μLおよび0.5~30ユニット/μL 断片化工程における制限酵素(例えば、MboI) 0.5~5μLを加え、滅菌水で50~100μLに調製する。尚、1~50ユニット/μL メチル化感受性制限酵素(例えば、HapII又はHpaII) 0.5~5μLを含むのが好ましい。
その後、20~50℃で60~150分間反応させて本発明に係る断片化工程で処理された溶液を得る。
更に、必要に応じて、本発明に係る断片化工程で処理された溶液を以下のように本発明に係る精製工程に付してもよい。
即ち、上記本発明に係る断片化工程で処理された溶液に、タンパク質変性剤(例えば、グアニジン塩酸塩) 500~700μL及び緩衝液(例えば、トリス緩衝液) pH5~8 500~700μLを加えて混合し、例えば、充填剤を充填したカラム[例えば、エコノスピン((株)ジーンデザイン製)]に移し、10000~22000×g、室温で1~3分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。その後、緩衝液(例えば、トリス緩衝液) pH5~8 500~700μL及びアルコール(例えば、エタノール) 500~700μLを加え、10000~22000×g、室温で1~5分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。この操作をもう一度繰り返し、更に、10000~22000×g、室温で1~5分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、滅菌水 20~60μLを加え、10000~22000×g、室温で1~3分間遠心分離し、フロースルー液を回収する。
上記で得られた、本発明に係る断片化工程で処理された溶液又はフロースルー液を、本発明に係る工程1に付す。
(3)本発明に係る工程1
(3)-1 S1ヌクレアーゼによる処理
上記本発明に係る断片化工程で処理された溶液又はフロースルー液 40~60μLに、滅菌水 20~50μL、本発明に係る工程1における緩衝液(例えば、酢酸ナトリウム緩衝液) 5~15μL及び1~200ユニット/μL S1ヌクレアーゼ 0.5~1.5μLを加え、10~37℃で10~20分間反応させて本発明に係る工程1(S1ヌクレアーゼによる処理)で処理された溶液を得る。
更に、必要に応じて、本発明に係る工程1(S1ヌクレアーゼによる処理)で処理された溶液を以下のように本発明に係る精製工程に付してもよい。
即ち、上記本発明に係る工程1(S1ヌクレアーゼによる処理)で処理された溶液に、タンパク質変性剤(例えば、グアニジン塩酸塩) 500~700μL及び緩衝液(例えば、トリス緩衝液) pH5~8 500~700μLを加えて混合し、例えば、充填剤を充填したカラム[例えば、エコノスピン((株)ジーンデザイン製)]に移し、10000~22000×g、室温で1~3分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。その後、緩衝液(例えば、トリス緩衝液) pH5~8 500~700μL及びアルコール(例えば、エタノール) 500~700μLを加え、10000~22000×g、室温で1~5分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。この操作をもう一度繰り返した後、更に、10000~22000×g、室温で1~5分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、滅菌水 20~60μLを加え、10000~22000×g、室温で1~3分間遠心分離し、フロースルー液を回収する。
上記で得られた、本発明に係る工程1(S1ヌクレアーゼによる処理)で処理された溶液又はフロースルー液を、本発明に係る工程1(メチル化感受性制限酵素による処理)に付す。
(3)-2 メチル化感受性制限酵素による処理
上記本発明に係る工程1(S1ヌクレアーゼによる処理)で処理された溶液又はフロースルー液 40~60μLに、滅菌水 20~50μL、本発明に係る工程1における緩衝液(例えば、トリス緩衝液) 5~15μL及び1~50ユニット/μL メチル化感受性制限酵素(例えば、HapII又はHpaII) 1~5μLを加え、20~50℃で60~150分間反応させて本発明に係る工程1(メチル化感受性制限酵素による処理)で処理された溶液を得る。
更に、必要に応じて、本発明に係る工程1(メチル化感受性制限酵素による処理)で処理された溶液を以下のように本発明に係る精製工程に付してもよい。
即ち、上記本発明に係る工程1(メチル化感受性制限酵素による処理)で処理された溶液に、タンパク質変性剤(例えば、グアニジン塩酸塩) 500~700μL及び緩衝液(例えば、トリス緩衝液) pH5~8 500~700μLを加えて混合し、例えば、充填剤を充填したカラム[例えば、エコノスピン((株)ジーンデザイン製)]に移し、10000~22000×g、室温で1~3分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。その後、緩衝液(例えば、トリス緩衝液) pH5~8 500~700μL及びアルコール(例えば、エタノール) 500~700μLを加え、10000~22000×g、室温で1~5分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。この操作をもう一度繰り返し、更に、10000~22000×g、室温で1~5分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、滅菌水 20~60μLを加え、10000~22000×g、室温で1~3分間遠心分離し、フロースルー液を回収する。
上記で得られた、本発明に係る工程1(メチル化感受性制限酵素による処理)で処理された溶液又はフロースルー液を、本発明に係る工程2に付す。
(4)本発明の増幅方法に係る工程2
上記本発明に係る工程1で処理された溶液又はフロースルー液 1~3μLに、滅菌水 4~6μL、核酸合成基質、核酸合成酵素等を含むデジタルPCR用試薬[例えば、ddPCRTMSupermix for Probes(バイオ・ラッドラボラトリーズ(株)製)] 5~12μL、1~20μM フォワードプライマー(例えば、hcf-F-fox) 0.5~1.5μL、1~20μM リバースプライマー(例えば、hcf-R-fox) 0.5~1.5μL、1~10μM プローブ(例えば、hcf-Probe fox) 0.5~1μL及び1~50ユニット/μL メチル化感受性制限酵素(例えば、HapII又はHpaII) 0.5~1.5μLを加え、デジタルPCR用反応液を調製する。次いで、上記デジタルPCR用反応液を核酸増幅装置[例えば、サーマルサイクラ―(バイオ・ラッド(株)製)]にセットし、30~40℃で30~60分間インキュベートする。その後、ドロップレット作製装置[例えば、QX 200 Droplet Generator(バイオ・ラッドラボラトリーズ(株)製)又はAutomated Droplet Generator(バイオ・ラッドラボラトリーズ(株)製)]にてドロップレットを作製する。次いで、該ドロップレットをウェルプレート(例えば、96ウェルプレート)に分注した後、核酸増幅装置[例えば、サーマルサイクラ―(バイオ・ラッド(株)製)]を用いて、90~97℃で5~15分間加熱した後、(1)90~95℃で25~30秒間、(2)60~65℃で30~90秒間を1サイクルとして、30~50サイクル加熱することにより、メチル化されている分析対象領域(例えば、配列番号11で表される塩基配列からなる領域)を増幅させることができる。
例えば、核酸抽出キット[例えば、QuickGene SP kit DNA tissue(倉敷紡績(株)製)]により、試料(例えば、細胞)からDNA(例えば、ゲノムDNA)を抽出する。
(2)本発明に係る断片化工程
上記(1)で得たDNAに、本発明に係る断片化工程における緩衝液(例えば、トリス緩衝液) 3~7μL及び0.5~25ユニット/μL 断片化工程における制限酵素(例えば、BamHI又は/及びHindIII) 0.5~1.5μLを加え、滅菌水で30~60μLに調製する。その後、20~50℃で40~80分間反応させて、本発明に係る断片化工程で処理された溶液を得る。
更に、必要に応じて、本発明に係る断片化工程で処理された溶液を以下のように本発明に係る精製工程に付してもよい。
即ち、上記本発明に係る断片化工程で処理された溶液に、タンパク質変性剤(例えば、グアニジン塩酸塩) 200~300μL及び緩衝液(例えば、トリス緩衝液) pH5~8 200~300μLを加えて混合し、例えば、充填剤を充填したカラム[例えば、エコノスピン((株)ジーンデザイン製)]に移し、10000~22000×g、室温で1~3分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。その後、緩衝液(例えば、トリス緩衝液) pH5~8 500~700μL及びアルコール(例えば、エタノール) 500~700μLを加え、10000~22000×g、室温で1~5分間遠心分離し、新しいチューブに交換し、緩衝液(例えば、トリス緩衝液) 20~40μLを加え、10000~22000×g、室温で1~3分間遠心分離し、フロースルー液を回収する。
上記で得られた、本発明に係る断片化工程で処理された溶液又はフロースルー液を、本発明に係る工程1に付す。
(3)本発明に係る工程1
(3)-1 S1ヌクレアーゼによる処理
上記本発明に係る断片化工程で処理された溶液又はフロースルー液 20~40μLに、滅菌水 15~25μL、本発明に係る工程1における緩衝液(例えば、酢酸ナトリウム緩衝液) 2~6μL及び1~200ユニット/μL S1ヌクレアーゼ 0.5~1.5μLを加え、10~37℃で10~20分間反応させる。その後、反応停止液(例えば、0.5M EDTA) 0.5~1.5μLを加え、25~35μLの緩衝液(例えば、トリス緩衝液)で溶出し、本発明に係る工程1(S1ヌクレアーゼによる処理)で処理された溶液を得る。
更に、必要に応じて、本発明に係る工程1で処理された溶液を以下のように本発明に係る精製工程に付してもよい。
即ち、上記本発明に係る工程1(S1ヌクレアーゼによる処理)で処理された溶液 10~20μLに、タンパク質変性剤(例えば、グアニジン塩酸塩) 200~300μL及び緩衝液(例えば、トリス緩衝液) pH5~8 200~300μLを加えて混合し、例えば、充填剤で充填したカラム[例えば、エコノスピン((株)ジーンデザイン製)]に移し、10000~22000×g、室温で1~3分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。その後、緩衝液(例えば、トリス緩衝液) pH5~8 500~700μL及びアルコール(例えば、エタノール) 500~700μLを加え、10000~22000×g、室温で1~5分間遠心分離し、新しいチューブに交換し、緩衝液(例えば、トリス緩衝液) 20~40μLを加え、10000~22000×g、室温で1~3分間遠心分離し、フロースルー液を回収する。
上記で得られた、本発明に係る工程1(S1ヌクレアーゼによる処理)で処理された溶液又はフロースルー液を、本発明に係る工程1(メチル化感受性制限酵素による処理)に付す。
(3)-2 メチル化感受性制限酵素による処理
上記本発明に係る工程1(S1ヌクレアーゼによる処理)で処理された溶液又はフロースルー液 20~30μLに、滅菌水 5~15μL、本発明に係る工程1における緩衝液(例えば、トリス緩衝液) 2~6μL及び1~50ユニット/μL メチル化感受性制限酵素(例えば、HapII、HpaII又はSacII) 0.5~1.5μLを加え、20~50℃で60~150分間反応させて本発明に係る工程1(メチル化感受性制限酵素による処理)で処理された溶液を得る。
更に、必要に応じて、本発明に係る工程1(メチル化感受性制限酵素による処理)で処理された溶液を以下のように本発明に係る精製工程に付してもよい。
即ち、上記本発明に係る工程1(メチル化感受性制限酵素による処理)で処理された溶液に、タンパク質変性剤(例えば、グアニジン塩酸塩) 200~300μL及び緩衝液(例えば、トリス緩衝液) pH5~8 200~300μLを加えて混合し、例えば、充填剤で充填したカラム[例えば、エコノスピン((株)ジーンデザイン製)]に移し、10000~22000×g、室温で1~3分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。その後、緩衝液(例えば、トリス緩衝液) pH5~8 500~700μL及びアルコール(例えば、エタノール) 500~700μLを加え、10000~22000×g、室温で1~5分間遠心分離し、新しいチューブに交換し、緩衝液(例えば、トリス緩衝液) 20~40μLを加え、10000~22000×g、室温で1~3分間遠心分離し、フロースルー液を回収する。
上記で得られた、本発明に係る工程1(メチル化感受性制限酵素による処理)で処理された溶液又はフロースルー液を、本発明に係る工程2に付す。
(4)本発明に係る工程2
上記本発明に係る工程1で処理された溶液又はフロースルー液 0.5~1.5μLに、滅菌水 15~20μL、PCR反応用緩衝液(例えば、トリス緩衝液) 2~3μL、核酸合成基質 1.5~2.5μL、1~10ユニット/μL 核酸合成酵素 0.1~0.3μL、5~15μM フォワードプライマー(例えば、h-F-fox) 0.5~1.5μL及び5~15μM リバースプライマー(例えば、h-R-fox) 0.5~1.5μLを加えPCR用反応液を調製する。次いで、核酸増幅装置[例えば、サーマルサイクラ―(バイオ・ラッドラボラトリーズ(株)製)]を用いて、92~96℃で1~3分間加熱した後、(1)92~98℃で2~10秒間、(2)65~72℃で10~20秒間を1サイクルとして、30~60サイクル加熱した後、更に、65~72℃で50~70秒加熱することにより、メチル化されている分析対象領域(例えば、配列番号1で表される塩基配列からなる領域)を増幅させることができる。
本発明のメチル化判定方法は、本発明の増幅方法により得られた結果に基づいて、分析対象領域がメチル化されているか否かを判定するものである。
即ち、上述した本発明の増幅方法に引き続いて、増幅産物の確認および分析対象領域がメチル化されているか否かを判定するものであり、(1)S1ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程1、(2)工程1で処理された二本鎖DNAの分析対象領域を増幅する工程2、(3)工程2で得られた増幅産物の有無を確認する工程3、(4)工程3の結果に基づいて、分析対象領域がメチル化されているか否かを判定する工程4を含むことを特徴とするものである。
尚、増幅産物を得るまでの工程3の前までの工程(工程1及び2)は、前述した本発明の増幅方法と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。工程3以降について以下に詳述する。
本発明に係る工程3は、本発明に係る工程2で得られた増幅産物の有無を確認する工程である。即ち、本発明に係る工程2においては、メチル化されている分析対象領域が増幅されるため、本発明に係る工程3は、そのメチル化されている分析対象領域の有無を確認する工程である。
具体的には、例えば、(a)電気泳動により確認する方法、(b)蛍光リーダーにより確認する方法等が挙げられる。
電気泳動により確認する方法とは、本発明に係る工程2で得られた増幅産物を、電気泳動により分離し、確認する方法であり、具体的な方法としては、(a-1)標識プライマー法、(a-2)インターカレーター法、(a-3)標識プローブ法等が挙げられる。
標識プライマー法とは、『本発明に係るプライマーの少なくとも一方を標識物質で標識した標識プライマーを含むプライマー対を用い、本発明に係る工程2を行う。次いで、得られた増幅産物を電気泳動により分離し、該増幅産物中の標識を検出することにより、本発明に係る工程2で得られた増幅産物の有無を確認する』方法である。
尚、本明細書において、「標識を検出する」とは、標識物質の性質に基づいて標識物質を直接又は間接的に測定することを意味する。
標識プライマー法における電気泳動としては、物質の荷電強度に依存して異なる速度で移動又は異なる距離を移動する方法に基づくものであればよく、具体的には、例えば、アガロースゲル電気泳動法、アクリルアミドゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法等が挙げられ、アガロースゲル電気泳動法又はキャピラリー電気泳動法がより好ましい。
尚、上記アガロースゲル電気泳動法は、例えば、「バイオ実験イラステッドII遺伝子解析の基礎, 2006, p.p. 53-56」に記載の方法に基づいてなされればよい。また、上記キャピラリー電気泳動法は、例えば、WO2007/027495、WO2011/118496、WO2008/075520等に記載の方法に基づいてなされればよい。
インターカレーター法とは、『本発明に係るプライマー対を用い、本発明に係る工程2を行い、得られた増幅産物を電気泳動により分離する。次いで、該増幅産物をインターカレーターで染色し、該インターカレーター由来の蛍光を検出することにより、本発明に係る工程2で得られた増幅産物の有無を確認する』方法である。
インターカレーター法における電気泳動としては、(a-1)標識プライマー法と同じものが挙げられ、好ましいものも同じである。
また、インターカレーター法におけるインターカレーターとしては、通常、この分野で用いられているインターカレーターであれば何れでもよい。具体的には、例えば、(1)~(5)のインターカレーター並びに下記(6)及び(7)のインターカレーター類似物質が挙げられる。
(1)エチジウム化合物[例えば、エチジウムブロマイド、エチジウムホモダイマー1(EthD-1)、エチジウムホモダイマー2(EthD-2)、臭化エチジウムモノアジド(EMA)、ジヒドロエチジウム等]、
(2)アクリジン色素(例えば、アクリジンオレンジ等)、
(3)ヨウ素化合物(ヨウ素化プロピジウム、ヨウ素化ヘキシジウム等)、シアニンダイマー系色素[例えば、POPO-1、BOBO-1、YOYO-1、TOTO-1、JOJO-1、POPO-3、LOLO-1、BOBO-3、YOYO-3、TOTO-3(何れもモレキュラープローブ(株)製)等]、
(4)シアニンモノマー系色素[例えば、PO-PRO-1、BO-PRO-1、YO-PRO-1、TO-PRO-1、JO-PRO-1、PO-PRO-3、LO-PRO-1、BO-PRO-3、YO-PRO-3、TO-PRO-3、TO-PRO-5(何れもモレキュラープローブ(株)製)等]、
(5)SYTOX系色素[例えば、SYBR Gold、SYBR Green I、SYBR Green II、SYTOX Green、SYTOX Blue、SYTOX Orange(何れもモレキュラープローブ(株)製)等]、GelRed系色素[例えば、GelRed核酸ゲル染色液(和光純薬工業(株)製)等]、
(6)DNA二重らせんのマイナーグルーブに結合するもの〔例えば、4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI:モレキュラープローブ(株)製)等〕、
(7)アデニン-チミン(A-T)配列に特異的に結合するもの〔例えば、ペンタハイドレ-ト(ビス-ベンズイミド)(Hoechst 33258:モレキュラープローブ(株)製)、トリヒドロクロライド(Hoechst 33342:モレキュラープローブ(株)製)、ビスベンズイミド色素(Hoechst 34580:モレキュラープローブ(株)製)等]が挙げられる。中でも、SYTOX系色素[例えば、SYBR Gold、SYBR Green I、SYBR Green II、SYTOX Green、SYTOX Blue、SYTOX Orange(何れもモレキュラープローブ(株)製)等]、GelRed系色素[例えば、GelRed核酸ゲル染色液(和光純薬工業(株)製)等]がより好ましく、GelRed系色素[例えば、GelRed核酸ゲル染色液(和光純薬工業(株)製)等]が特に好ましい。
標識プローブ法とは、『本発明に係るプライマー対を用い、本発明に係る工程2を行い、得られた増幅産物を電気泳動により分離する。次いで、該増幅産物を熱処理に付すことにより、一本鎖にする。次いで、標識物質で標識された、該増幅産物の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプローブをハイブリダイズさせることで、ハイブリッド体を得て、該ハイブリッド体中の標識を検出することにより、本発明に係る工程2で得られた増幅産物の有無を確認する』方法である。
標識プローブにおける電気泳動としては、(a-1)標識プライマー法と同じものが挙げられ、好ましいものも同じである。
蛍光リーダーにより検出する方法とは、『本発明に係るプライマー対およびプローブを用いた本発明に係る工程2を行い、その後、各ドロップレット由来の蛍光を蛍光リーダーにより検出することにより、本発明に係る工程2で得られた増幅産物の有無を確認する』方法である。
蛍光リーダーにより検出する方法における蛍光リーダーとしては、デジタルPCR装置に付属のもの[例えば、QX200 Droplet Reader(バイオ・ラッドラボラトリーズ(株)製)等]を用いればよい。
本発明のメチル化判定方法に係る工程4は、本発明に係る工程3の結果に基づいて分析対象領域がメチル化されているか否かの判定を行う工程である。
即ち、本発明に係る分析対象領域がメチル化されているか否かの判定は、本発明に係る工程2で増幅された増幅産物の有無の確認の結果に基づいてなされる。分析対象領域がメチル化されている場合、本発明に係る工程2において、当該分析対象領域が増幅されるので、増幅産物が得られる。一方、分析対象領域がメチル化されていない場合、本発明に係る工程2において、当該分析対象領域が増幅されないので、増幅産物が得られない。これは、本発明に係る工程1におけるメチル化感受性制限酵素の性質によるものである。
つまり、分析対象領域がメチル化されている場合、メチル化感受性制限酵素で処理しても、分析対象領域は切断されないので、本発明に係る工程2の増幅反応において分析対象領域が増幅され、本発明に係る工程3において増幅産物が確認される。
一方、分析対象領域がメチル化されていない場合、メチル化感受性制限酵素により分析対象領域が切断されるので、本発明に係る工程2において分析対象領域が増幅されず、本発明に係る工程3において増幅産物が確認されない。
従って、本発明に係る工程3において(a)電気泳動により確認する方法を行った場合、(i)増幅産物が確認された場合、当該分析対象領域はメチル化されていると判定することができ、(ii)増幅産物が確認されなかった場合、当該分析対象領域はメチル化されていないと判定することができる。
一方、本発明に係る工程3において(b)蛍光リーダーにより確認する方法を行った場合、(i)予め設定した閾値を超える蛍光を発するドロップレットが少なくとも1つ確認された場合、当該分析対象領域はメチル化されていると判定することができ、(ii)予め設定した閾値を超える蛍光を発するドロップレットが確認されなかった場合、当該分析対象領域はメチル化されていないと判定することができる。
尚、上記閾値については、上記蛍光リーダー[例えば、QX200 Droplet Reader(バイオ・ラッドラボラトリーズ(株)製)]の閾値設定機能に従って決定してもよく、分析対象領域を増幅した結果から決定してもよい。
本発明のメチル化判定方法の具体例を、(A)血清、血漿、尿等の体液中に存在するDNAの特定領域を分析対象領域として設定する場合、(B)組織、細胞、全血、尿等の中に存在するDNAの特定領域を分析対象領域として設定する場合に分けて、以下に説明する。
(1)DNAの抽出、(2)本発明に係る断片化工程、(3)本発明に係る工程1および(4)本発明に係る工程2については、[本発明の増幅方法の具体例]で説明した通りである。
(5)本発明に係る工程3
各ドロップレットにおける上記本発明に係る工程2で増幅された増幅産物中の蛍光を、蛍光リーダー[例えば、QX200 Droplet Reader(バイオ・ラッドラボラトリーズ(株)製)等]により検出することにより、上記本発明に係る工程2で増幅された増幅産物の有無を確認することができる。
(6)本発明のメチル化判定方法に係る工程4
上記本発明に係る工程3の増幅産物の有無の確認の結果、予め設定した閾値を超える蛍光を発するドロップレットが少なくとも1つ確認された場合、「その分析対象領域はメチル化されている」と判定することができる。一方、予め設定した閾値を超える蛍光を発するドロップレットが確認されなった場合、「その分析対象領域はメチル化されていない」と判定することができる。
(1)DNAの抽出、(2)本発明に係る断片化工程、(3)本発明に係る工程1および(4)本発明に係る工程2については、[本発明の増幅方法の具体例]で説明した通りである。
(5)本発明に係る工程3
上記本発明に係る工程2で増幅された増幅産物を、分子量マーカーとともに、0.5~5%アガロースゲル電気泳動に付す。次いで、インターカレーター[例えば、GelRed核酸ゲル染色液(和光純薬工業(株)製)等]で染色した後、UV照射して増幅産物を検出することにより、上記本発明に係る工程2で増幅された増幅産物の有無を確認することができる。
(6)本発明のメチル化判定方法に係る工程4
上記本発明に係る工程3の増幅産物の有無の確認の結果、増幅産物が確認された場合、「その分析対象領域はメチル化されている」と判定することができる。一方、増幅産物が確認されなかった場合、「その分析対象領域はメチル化されていない」と判定することができる。
本発明のメチル化判定用試薬は、S1ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素を含むことを特徴とするものである。
本発明のメチル化判定用試薬に用いられるメチル化感受性制限酵素の具体例及び好ましい例は、前述の通りである。
さらに、この分野で通常用いられる下記のような試薬類何れか1種以上を加えて、本発明の判定用試薬とすることもできる。
a)DNA精製用のカラム[例えば、エコノスピン((株)ジーンデザイン製)等]、
b)PCR等の増幅反応用試薬(例えば、1種又は複数種のプライマー、プローブ、核酸合成基質、核酸合成酵素等)、
c)断片化用の制限酵素、
d)核酸増幅産物確認用試薬[例えば、アガロースゲル、ローディング緩衝液、染色用試薬(Gel Red系染色液、臭化エチジウム等)]、
e)DNA抽出用試薬[例えば、QuickGene SP kit DNA tissue(倉敷紡績(株)製)、NucleoSpin(商標) Plasma XS(マッハライ・ナーゲル(株)製)又はMagMAXTM Cell-Free DNA Isolation Kit(サーモフィッシャーサイエンティフィック(株)製)等]。
また、本発明のメチル化判定用試薬には、本発明のメチル化判定方法を実施するための説明書等を含ませておいてもよい。当該「説明書」とは、本発明のメチル化判定方法における特徴、原理および操作手順などが文章又は図表等により実質的に記載されている本発明のメチル化判定用試薬の取り扱い説明書、添付文章或いはパンフレット(リーフレット)等を意味する。
このように本発明のメチル化判定用試薬により、本発明のメチル化判定方法を簡便、短時間で且つ精度よく行うことができる。
本発明の癌の判定方法は、本発明の増幅方法により得られた結果に基づいて、癌であるか否かが判定される対象について、癌の判定を下すものである。即ち、上述した本発明の増幅方法に引き続いて、増幅産物の確認をする工程および癌の判定を行う工程を行うものであり、(1)分析対象領域を含むDNAをS1ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程1、(2)工程1で処理された二本鎖DNAの分析対象領域を増幅する工程2、(3)工程2で得られた増幅産物の有無を確認する工程3、(4)工程3の結果に基づいて、癌を判定する工程4を含むことを特徴とするものである。
尚、増幅産物を得るまでの工程3の前までの工程(工程1~2)は、前述した本発明の増幅方法と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。また、増幅産物の確認を行う工程3は、前述した本発明のメチル化判定方法と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
本発明の癌の判定方法に係る癌とは、制御不能な細胞分裂及び浸潤を通しての隣接組織への直接的な増殖又は転移等に特徴付けられる、疾病又は疾患のことである。本発明の判定方法により判定される癌の具体例としては、細胞癌、腺癌、リンパ腫、白血病、肉腫、中皮腫、神経腫、骨肉腫、胚細胞腫、前立腺癌、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、胃腸癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、卵巣癌、メラノーマ、脳癌、精巣癌、腎臓癌、皮膚癌、甲状腺癌、頭頸部癌、肝臓癌、食道癌、胃癌、大腸癌、骨髄癌、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫等が挙げられ、肺癌、乳癌、膵臓癌、肝臓癌、胃癌又は大腸癌がより好ましい。
本発明の癌の判定方法に係る工程4は、本発明に係る工程3の結果に基づいて、癌の判定を行う工程である。即ち、本発明に係る工程2で増幅された増幅産物の有無の確認の結果に基づいてなされる。
本発明の癌の判定方法に係る工程4における癌の判定とは、本発明に係る工程1~3の結果により得られたデータを用いてなされる。即ち、本発明に係る工程2で増幅された目的の増幅産物を検出し、当該増幅産物が検出されたとの結果が得られたとき、癌であるか否かが判定される対象について、癌の判定を下すことである。
例えば、分析対象領域を含むDNA由来の試料が組織、細胞等の場合、癌であるか否かが判定される対象は、当該組織、細胞等自体、更には、当該組織、細胞等が由来する動物である。即ち、分析対象領域を含むDNA由来の試料が組織、細胞等の場合には、当該組織、細胞等自体が癌(化)されているか否かが判定され、更には、当該組織、細胞等が由来する動物が癌に罹患しているか又は当該動物に癌細胞が存在しているか否かが判定される。
一方、分析対象領域を含むDNA由来の試料が全血、血清、血漿、尿等の体液である場合、癌であるか否かが判定される対象は、以下の通りである。
分析対象領域を含むDNAが上記全血、血清、血漿、尿等の体液中の細胞(白血球等の血液細胞、各組織由来の細胞、CTC等)に由来する場合には、当該細胞自体、更には、当該細胞が由来する動物である。即ち、分析対象領域を含むDNAが全血、血清、血漿、尿等の体液中の細胞(白血球等の血液細胞、各組織由来の細胞、CTC等)に由来する場合には、当該細胞自体が癌(化)されているか否かが判定され、更には、当該細胞が由来する動物が癌に罹患しているか又は当該動物に癌細胞が存在しているか否かが判定される。
また、分析対象領域を含むDNAが上記血清、血漿、尿等の体液中のcfDNA、エクソソーム(エキソソーム)等に由来する場合には、癌であるか否かが判定される対象は、上記血清、血漿、尿等の体液に由来する動物である。即ち、分析対象領域を含むDNAが上記血清、血漿、尿等の体液中のcfDNA、エクソソーム(エキソソーム)等に由来する場合には、上記血清、血漿、尿等の体液に由来する動物が癌に罹患しているか又は当該動物に癌細胞が存在しているか否かが判定される。
つまり、分析対象領域がメチル化されている場合、メチル化感受性制限酵素で処理しても、分析対象領域は切断されないため、本発明に係る工程2の増幅反応において分析対象領域が増幅され、本発明に係る工程3において増幅産物が確認される。
一方、分析対象領域がメチル化されていない場合、メチル化感受性制限酵素により分析対象領域が切断されるため、本発明に係る工程2において分析対象領域が増幅されず、本発明に係る工程3において増幅産物が確認されない。
従って、本発明に係る工程3において(a)電気泳動により確認する方法を行った場合、(i)増幅産物が確認された場合、当該分析対象領域由来の癌であるか否かが判定される対象は癌に罹患している又は当該対象中に癌細胞が存在していると判定することができ、(ii)増幅産物が確認されなかった場合、当該分析対象領域由来の癌であるか否かが判定される対象は、癌に罹患していない又は当該対象中に癌細胞が存在していないと判定することができる。
一方、本発明に係る工程3において(b)蛍光リーダーにより確認する方法を行った場合、(i)予め設定した閾値を超える蛍光を発するドロップレットが少なくとも1つ確認された場合、当該分析対象領域由来の癌であるか否かが判定される対象は癌に罹患している又は当該対象中に癌細胞が存在していると判定することができ、(ii)予め設定した閾値を超える蛍光を発するドロップレットが確認されなかった場合、当該分析対象領域由来の癌であるか否かが判定される対象は、癌に罹患していない又は当該対象中に癌細胞が存在していないと判定することができる。
尚、上記閾値については、上記蛍光リーダー[例えば、QX200 Droplet Reader(バイオ・ラッドラボラトリーズ(株)製)]の閾値設定機能に従って決定してもよく、分析対象領域を増幅した結果から決定してもよい。
本発明の癌の判定方法の具体例を、(A)血清、血漿、尿等の体液中に存在するDNAの特定領域を分析対象領域として設定する場合、(B)組織、細胞、全血、尿等の中に存在するDNAの特定領域を分析対象領域として設定する場合に分けて、以下に説明する。
(1)DNAの抽出、(2)本発明に係る断片化工程、(3)本発明に係る工程1および(4)本発明に係る工程2については、[本発明の増幅方法の具体例]で説明した通りである。また、(5)本発明に係る工程3については、[本発明のメチル化判定方法の具体例]で説明した通りである。
(6)本発明の癌の判定方法に係る工程4
本発明に係る工程3の増幅産物の有無の確認の結果、予め設定した閾値を超える蛍光を発するドロップレットが少なくとも1つ確認された場合、「その分析対象領域由来の癌であるか否かが判定される対象は、癌に罹患している又は当該対象中に癌細胞が存在している」と判定することができる。一方、予め設定した閾値を超える蛍光を発するドロップレットが少なくとも1つ確認されなかった場合、「その分析対象領域由来の癌であるか否かが判定される対象は、癌に罹患していない又は当該対象中に癌細胞が存在していない」と判定することができる。
(B)組織、細胞、全血、尿等の中に存在するDNAの特定領域(例えば、配列番号1で表される塩基配列からなる領域)を分析対象領域として設定する場合
(1)DNAの抽出、(2)本発明に係る断片化工程、(3)本発明に係る工程1および(4)本発明に係る工程2については、[本発明の増幅方法の具体例]で説明した通りである。また、(5)本発明に係る工程3については、[本発明のメチル化判定方法の具体例]で説明した通りである。
(6)本発明の癌の判定方法に係る工程4
本発明に係る工程3の増幅産物の有無の確認の結果、増幅産物が確認された場合、「その分析対象領域由来の癌であるか否かが判定される対象は、癌に罹患している又は当該対象中に癌細胞が存在している」と判定することができる。一方、増幅産物が確認されなかった場合、「その分析対象領域由来の癌であるか否かが判定される対象は、癌に罹患していない又は当該対象中に癌細胞が存在していない」と判定することができる。
本発明の癌の判定を行うためのデータを得る方法(以下、本発明のデータを得る方法と略記する場合がある。)は、本発明の増幅方法により得られた結果に基づいて、癌であるか否かが判定される対象について、癌の判定を下すためのデータを取得するものである。即ち、上述した本発明の増幅方法に引き続いて、増幅産物の有無を確認する工程を行うものであり、(1)分析対象領域を含むDNAをS1ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程1、(2)工程1で処理された二本鎖DNAの分析対象領域を増幅する工程2、(3)工程2で得られた増幅産物の有無を確認する工程3を含むことを特徴とするものである。
尚、増幅産物を得るまでの工程3の前までの工程(工程1及び2)は、前述した本発明の増幅方法と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。また、増幅産物の確認を行う工程3は、前述した本発明のメチル化判定方法と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
本発明の癌の判定用試薬(以下、本発明の癌の判定用試薬と略記する場合がある。)は、S1ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素を含むことを特徴とするものである。
本発明の癌の判定用試薬に用いられるメチル化感受性制限酵素の具体例及び好ましい例は、前述の通りである。
さらに、この分野で通常用いられる下記のような試薬類何れか1種以上を加えて、本発明の判定用試薬とすることもできる。
a)DNA精製用のカラム[例えば、エコノスピン((株)ジーンデザイン製)等]、
b)PCR等の核酸増幅反応用試薬(例えば、1種又は2種以上のプライマー、プローブ、核酸合成基質、核酸合成酵素等)、
c)断片化用の制限酵素、
d)核酸増幅産物確認用試薬[例えば、アガロースゲル、ローディング緩衝液、染色用試薬(Gel Red系染色液、臭化エチジウム等)]、
e)DNA抽出用試薬[例えば、QuickGene SP kit DNA tissue(倉敷紡績(株)製)、NucleoSpin(商標) Plasma XS(マッハライ・ナーゲル(株)製)又はMagMAXTM Cell-Free DNA Isolation Kit(サーモフィッシャーサイエンティフィック(株)製)等]。
また、本発明の癌の判定用試薬には、本発明の癌の判定方法を実施するための説明書等を含ませておいてもよい。当該「説明書」とは、本発明の癌の判定方法における特徴、原理および操作手順などが文章又は図表等により実質的に記載されている本発明の癌の判定用試薬の取り扱い説明書、添付文章或いはパンフレット(リーフレット)等を意味する。
このように本発明の癌の判定用試薬により、本発明の癌の判定方法を簡便、短時間且つ精度よく行うことができる。
本発明の癌の判定を行うためのマーカー(以下、本発明のマーカーと略記する場合がある。)は、本発明の増幅方法を行うことによって得られる増幅産物であって、当該マーカー(増幅産物)の有無によって分析対象領域由来の癌であるか否かが判定される対象について、癌の判定を下すことができるものである。即ち、(1)分析対象領域を含むDNAをS1ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程1、(2)工程1で処理された二本鎖DNAの分析対象領域を増幅する工程2を行うことによって得られるものである。
尚、増幅産物を得るまでの工程(工程1及び2)は、前述した本発明の増幅方法と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。また、癌および癌であるか否かが判定される対象については、本発明の癌の判定方法と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
本発明のマーカーを検出する方法は、本発明のマーカーを自体公知の方法により検出するものであり、本発明に係る工程3で説明した方法により検出するのが好ましい。
下記各種正常細胞及び各種癌細胞由来のDNAについて、バイサルファイトシークエンス解析によるメチル化状態の確認を行った。
下記の通りに試料及びメチル化状態の確認領域を設定した。
・試料
ヒト人工多能性幹細胞(hiPS):正常細胞
正常線維芽細胞(HDF):正常細胞
グリア芽腫細胞(U251-MG-P1):癌細胞
乳腺癌細胞(MCF-7):癌細胞
前立腺癌細胞(LNCap clone FGC):癌細胞
骨髄性白血病細胞(HL60):癌細胞
・メチル化状態の確認領域
ヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の配列番号1で表される塩基配列からなる領域(267塩基対)内に存在する、図3で表される四角で囲まれた3つの、CpG配列を含む配列(CCGG)
上記各種細胞より、QuickGene SP kit DNA tissue(倉敷紡績(株)製)を使用して、ゲノムDNAをそれぞれ抽出した。
上記(2)で得たゲノムDNA 400ngそれぞれを、10μLの蒸留水に溶解した。その後、Episight Bisulfite Conversion kit(和光純薬工業(株)製)を使用して、当該溶液それぞれをキット記載の方法に準じてバイサルファイト反応に付した。
上記(3)で得たバイサルファイト反応産物含有溶液 1μLそれぞれに、蒸留水 17.3μL、10×バッファー for Blend Taq(東洋紡(株)製) 2.5μL、2mM dNTPs(東洋紡(株)製) 2μL、2.5ユニット/μL Blend Taq-Plus(東洋紡(株)製) 0.2μL、10μM フォワードプライマー[GGAATTAGTGGGGGCAGCCAGGCCCCAGG(配列番号7)] 1μL及び10μM リバースプライマー[CCCAAAAACTACCCTTACCAAACTAATC(配列番号8)] 1μLを加えて混合し、これをPCR用反応液とした。
次いで、上記PCR用反応液それぞれを、サーマルサイクラ―(バイオ・ラッドラボラトリーズ(株)製)にセットし、下記反応条件でPCR増幅反応を行った。
※反応条件
94℃ 2分間
↓
94℃ 10秒間→55℃ 10秒間→72℃ 20秒間を1サイクルとして36サイクル
↓
72℃ 2分間
上記(4)で得たPCR増幅産物それぞれを、1.5%アガロースゲルにて電気泳動した。泳動後、GelRed核酸ゲル染色液(和光純薬工業(株)製)で染色し、QIAquick Gel Extraction kit((株)キアゲン製)を使用して、PCR増幅産物をそれぞれ回収した。
上記(5)で得たPCR増幅産物含有溶液 1μLそれぞれに、蒸留水17.3μL、10×バッファー for Blend Taq(東洋紡(株)製) 2.5μL、2mM dNTPs(東洋紡(株)製) 2μL、2.5ユニット/μL Blend Taq-Plus(東洋紡(株)製) 0.2μL、10μM フォワードプライマー 1μL及び10μM リバースプライマー 1μLを加えて混合し、これをPCR用反応液とした。
尚、上記フォワードプライマーは、上記(4)のフォワードプライマーに制限酵素(HindIII)認識部位(配列中の下線部)を付加したものであり、下記塩基配列からなる。上記リバースプライマーは、上記(4)のリバースプライマーに制限酵素(BamHI)認識部位(配列中の下線部)を付加したものであり、下記塩基配列からなる。
フォワードプライマー:TTACCATAAGCTTGGAATTAGTGGGGGCAGCCAGGCCCCAGG(配列番号9)
リバースプライマー:TAATTAAGGATCCCCCAAAAACTACCCTTACCAAACTAATC(配列番号10)
次いで、上記PCR用反応液それぞれを、サーマルサイクラ―(バイオ・ラッドラボラトリーズ(株)製)にセットし、下記反応条件でPCR増幅反応を行った。
※反応条件
94℃ 2分間
↓
94℃ 10秒間→55℃ 10秒間→72℃ 20秒間を1サイクルとして12サイクル
↓
72℃ 2分間
次いで、PCR増幅産物含有溶液 25μLそれぞれに、6×Loading Buffer Double Dye((株)ニッポンジーン製) 5μLを加えて混合し、1.5%アガロースゲルにて電気泳動した。泳動後、GelRed核酸ゲル染色液(和光純薬工業(株)製)で染色し、QIAquick Gel Wxtraction Kit((株)キアゲン製)を使用して、PCR増幅産物それぞれを回収した。
上記(6)で得たPCR増幅産物含有溶液 43μLそれぞれに、10×Bバッファー((株)ニッポンジーン社製) 5μL、20ユニット/μL HindIII((株)ニッポンジーン製) 1μL、20ユニット/μL BamHI((株)ニッポンジーン製) 1μLを混合した後、37℃で1時間反応させた。同様にpUC19((株)ニッポンジーン製) 500ngに蒸留水を加えて43μLに調製し、20ユニット/μL HindIII((株)ニッポンジーン製) 1μL、20ユニット/μL BamHI((株)社ニッポンジーン製) 1μLを加えた後、37℃で1時間反応させた。次いで、5.5M グアニジン塩酸塩(和光純薬工業(株)製)を250μLそれぞれ加えて混合した後、エコノスピン((株)ジーンデザイン製)に移し、12000×g、室温で1分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。次いで、2mM Tris-HCl pH7.5((株)ニッポンジーン製)を500μLそれぞれ加え、12000×g、室温で1分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。更に、12000×g、室温で1分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、2mM Tris-HCl pH8.0((株)ニッポンジーン製)を25μLそれぞれ加え、12000×g、室温で1分間遠心分離することにより、制限酵素(HindIII及びBamHI)により処理した各PCR増幅産物及びpUC19を回収した。
上記(7)で得たPCR増幅産物含有溶液 1μLぞれぞれに、制限酵素により処理したpUC19 1μL、DNA Ligation Kit Mighty Mix(タカラバイオ(株)製) 2μLを加えて混合し、16℃で1時間反応させた。次いで、全量4μLそれぞれをECOSTMCompetentE.coli DH5α((株)ニッポンジーン製)に形質転換し、アンピシリン添加LB寒天培地にスプレッドした。その後、コロニーをアンピシリン添加LB培地おいて、37℃で16時間培養した。その後、プラスミドキットSII(倉敷紡績(株)製)を使用して、プラスミドをそれぞれ抽出した。次いで、得られたプラスミドを用いて、タカラバイオ(株)のシークエンス受託サービスにて塩基配列を解読した。
その結果を図4に示す。
尚、図4中の○は、CpG配列のシトシンが非メチル化シトシンであることを、●は、CpG配列のシトシンがメチル化シトシンであること表す。
図4の結果から明らかな通り、正常細胞(hiPS、HDF)由来のメチル化状態の確認領域である3つの、CpG配列を含む配列(CCGG)のシトシンは、非メチル化シトシンであり、癌細胞(U251-MG-P1、MCF-7、LNCaP clone FGC、HL60)由来のメチル化状態の確認領域である3つの、CpG配列を含む配列(CCGG)のシトシンは、メチル化シトシンであることが分かった。
本発明に係る工程1におけるS1ヌクレアーゼの効果を検証するために、下記の条件の下、本発明の増幅方法並びにメチル化判定方法及び癌の判定方法を行った。
・実施例1:一本鎖特異的ヌクレアーゼ(S1ヌクレアーゼ)で処理する工程を行った場合
・比較例1:一本鎖特異的ヌクレアーゼ(マングビーンヌクレアーゼ)で処理する工程を行った場合
・比較例2:一本鎖特異的ヌクレアーゼ(エキソヌクレアーゼI)で処理する工程を行った場合
・比較例3:一本鎖特異的ヌクレアーゼで処理する工程を行わなかった場合
(1)条件の設定
下記の通りに試料及び分析対象領域を設定した。
・試料
ヒト人工多能性幹細胞(hiPS):正常細胞
・分析対象領域
ヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域のうち、配列番号1で表される塩基配列からなる領域(267塩基対)
QuickGene SP kit DNA tissue(倉敷紡績(株)製)により、その現品説明書に従ってhiPS由来のゲノムDNAを抽出した。
(2)で得たゲノムDNA 150ngに、10×B バッファー((株)ニッポンジーン製)5μL、20ユニット/μL BamHI((株)ニッポンジーン製) 1μL及び20ユニット/μL HindIII((株)ニッポンジーン製) 1μLを加え、滅菌水で全量50μLに調製した。その後、37℃で1時間反応させた。次いで、5.5M グアニジン塩酸塩(和光純薬工業(株)製)を250μL加えて混合した後、エコノスピン((株)ジーンデザイン製)に移し、20000×g、室温で3分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。次いで、2mM Tris-HCl pH7.5((株)ニッポンジーン製) 600μL及び80%エタノール(和光純薬工業(株)製) 600μLを加え、12000×g、室温で1分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。更に、12000×g、室温で5分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、2mM Tris-HCl pH8.0((株)ニッポンジーン製)を30μL加え、12000×g、室温で1分間遠心分離することにより、制限酵素(BamHI及びHindIII)により処理したゲノムDNAを得た。
(3)で得たゲノムDNA含有Tris-HCl溶液 25μLに、10×S1ヌクレアーゼバッファー(タカラバイオ(株)製) 4μL及び180ユニット/μL S1ヌクレアーゼ(タカラバイオ(株)製) 1μLを加え、滅菌水で全量40μLに調製した。その後、23℃で15分間反応させた後、0.5M EDTA 1μLを加えた。次いで、5.5M グアニジン塩酸塩(和光純薬工業(株)製) 200μL及び20mM Tris-HCl pH6.6(和光純薬工業(株)製)を200μL加えて混合した後、エコノスピン((株)ジーンデザイン製)に移し、20000×g、室温で3分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。次いで、2mM Tris-HCl pH7.5((株)ニッポンジーン製)600μL、80%エタノール(和光純薬工業(株)製) 600μLを加え、12000×g、室温で1分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。更に、12000×g、室温で5分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、2mM Tris-HCl pH8.0((株)ニッポンジーン製)を30μL加え、12000×g、室温で1分間遠心分離することにより、一本鎖特異的ヌクレアーゼ(S1ヌクレアーゼ)により処理したゲノムDNAを得た。
(4)で得たゲノムDNA含有Tris-HCl溶液 25μLに、10×Lバッファー(タカラバイオ(株)製) 4μL及び25ユニット/μL HapII(タカラバイオ(株)製) 1μLを加え、滅菌水で全量40μLに調製した。その後、37℃で2時間反応させた。次いで、5.5M グアニジン塩酸塩(和光純薬工業(株)製) 200μL及び20mM Tris-HCl pH6.6(和光純薬工業(株)製)を200μL加えて混合した後、エコノスピン((株)ジーンデザイン製)に移し、20000×g、室温で3分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。次いで、2mM Tris-HCl pH7.5((株)ニッポンジーン製)600μL及び80%エタノール(和光純薬工業(株)製) 600μLを加え、12000×g、室温で1分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。更に、12000×g、室温で5分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、2mM Tris-HCl pH8.0((株)ニッポンジーン製)を30μL加え、12000×g、室温で1分間遠心分離することにより、メチル化感受性制限酵素(HapII)により処理したゲノムDNAを得た。
尚、HapII及びHpaIIが認識する配列は、図3で表されるヒト細胞由来ゲノムDNAのFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の配列番号1で表される塩基配列からなる領域(267塩基対)のうち、四角で囲まれた3つの、CpG配列を含む配列(CCGG)である。
(5)で得たゲノムDNA含有Tris-HCl溶液 1μLに、10×バッファー for Blend Taq(東洋紡(株)製) 2.5μL、2mM dNTPs(東洋紡(株)製) 2μL、2.5ユニット/μL Blend Taq-Plus(東洋紡(株)製) 0.2μL、10μMフォワードプライマー(h-F-Fox) 1μL及び10μMリバースプライマー(h-R-Fox) 1μLを加え、滅菌水で25μLに調製し、これをPCR用反応液とした。
尚、上記プライマーにより得られる増幅産物の大きさ(塩基対数)は、267塩基対(配列番号1)である。
また、鋳型として(3)で得たものを用いた以外は、上記と同様にしてPCR用反応液を調製し、これをコントロールとした。
上記PCR用反応液それぞれをサーマルサイクラ―(バイオ・ラッドラボラトリーズ(株)製)にセットし、下記反応条件でPCR増幅反応を行った。
※反応条件
94℃ 2分間
↓
94℃ 4秒間→68℃ 15秒間を1サイクルとして50サイクル
↓
68℃ 1分間
(6)で得た増幅産物含有溶液 25μLそれぞれに、6×Loading Buffer Double Dye((株)ニッポンジーン製)5μLを加えて混合した後、該混合物を2%アガロースゲルにて電気泳動した。泳動後、GelRed核酸ゲル染色液(和光純薬工業(株)製)で染色し、UV照射装置により増幅産物をそれぞれ確認した。その結果を、図5(レーン1及び2)に示す。
実施例1における一本鎖特異的ヌクレアーゼとして、S1ヌクレアーゼの代わりにマングビーンヌクレアーゼ(タカラバイオ(株)製)を用いた以外は、上記実施例1と同様の方法により、増幅産物の確認を行った。その結果を図5(レーン3及び4)に示す。
実施例2における一本鎖特異的ヌクレアーゼとして、S1ヌクレアーゼの代わりにエキソヌクレアーゼI(タカラバイオ(株)製)を用いた以外は、上記実施例2と同様の方法により、増幅産物の確認を行った。その結果を図5(レーン5及び6)に示す。
実施例1における(4)一本鎖特異的ヌクレアーゼによる処理を行わなかった以外は、実施例1と同様の方法により、増幅産物の確認を行った。その結果を、図5(レーン7及び8)に示す。
よって、hiPSの分析対象領域は、メチル化感受性制限酵素で切断されており、非メチル化状態であると判定できる。即ち、分析対象領域由来のhiPSは、正常細胞であると判定できる。
一方、一本鎖特異的ヌクレアーゼとしてマングビーンヌクレアーゼを用いた場合(レーン4)、一本鎖特異的ヌクレアーゼとしてエキソヌクレアーゼIを用いた場合(レーン6)、及び一本鎖特異的ヌクレアーゼで処理する工程を行わなかった場合(レーン8)、hiPSをメチル化感受性制限酵素により処理し、本発明に係るプライマー対を用いてPCR増幅反応を行うと、目的の増幅産物[配列番号1で表される塩基配列からなる領域(267塩基対)]、即ち、分析対象領域と同じ大きさの増幅産物が得られることが分かる。
しかし、比較例1~3では、実施例1と同じ正常hiPS由来ゲノムDNAを鋳型として用いているにも拘わらず増幅産物が得られていることから、この増幅産物は、人為的或いは内在的に存在する一本鎖DNAが鋳型となって増幅されてしまった非特異的な増幅産物であると考えられた。
従って、試料(DNA)をS1ヌクレアーゼで処理することによって、即ち、本発明に係る工程1を行うことによって、偽陽性の原因となり得る非特異的な増幅産物の増幅を抑制し、メチル化された分析対象領域の増幅並びにメチル化の判定及び癌の判定を簡便に精度よく行えることが分かった。
実施例1における試料として下記正常細胞及び癌細胞を用いた以外は、実施例1と同様の方法により、増幅産物の確認を行った。その結果を図6(正常細胞)及び図7(癌細胞)にそれぞれ示す。
・正常細胞
正常線維芽細胞(HDF)
正常線維芽細胞(CCD-8Lu)
正常線維芽細胞(WI-38)
HIV及びHBV陰性血清(Normal whole blood)
人工多能性幹細胞(hiPS)
全胎児細胞(HE23)
・癌細胞
神経芽腫細胞(IMR-32)
グリア芽腫細胞(U251-MG-P1)
子宮筋腫細胞(HeLa)
肝癌細胞(HepG2)
結腸腺癌細胞(WiDr)
非小細胞性肺癌細胞(NCI-H460)
膵臓腺癌細胞(CFPAC-1)
卵巣奇形腫細胞(PA-1)
乳腺癌細胞(MCF-7)
前立腺癌細胞(LNCaP clone FGC)
Tリンパ性白血病細胞(Jurkat)
骨髄性白血病細胞(HL-60)
即ち、分析対象領域はメチル化感受性制限酵素により切断されており、非メチル化状態と判定できる。よって、この結果より、分析対象領域由来の各種正常細胞は正常細胞であると判定することができる。
図7の結果より、各種癌細胞を用いた場合(レーン2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22及び24)、何れも目的の増幅産物[配列番号1で表される塩基配列からなる領域(267塩基対)]は確認され、分析対象領域が得られていることが分かる。
即ち、分析対象領域はメチル化感受性制限酵素により切断されておらず、メチル化状態と判定できる。よって、この結果より、分析対象領域由来の各種癌細胞は癌細胞であると判定することができる。
実施例1における試料として2人の乳癌患者[乳癌患者1(ステージIIIA)及び乳癌患者2(ステージII)]由来の癌細胞及び当該癌細胞の近傍の正常細胞を用いた以外は、実施例1と同様の方法により、増幅産物の確認を行った。その結果を図8に示す。
即ち、分析対象領域はメチル化感受性制限酵素により切断されておらず、メチル化状態と判定できる。よって、この結果より、分析対象領域由来の各種癌細胞は癌細胞であると判定することができる。
一方、各種正常細胞を用いた場合(レーン2及び6)、何れも目的の増幅産物[配列番号1で表される塩基配列からなる領域(267塩基対)]確認されず、分析対象領域が得られていないことが分かる。
即ち、分析対象領域はメチル化感受性制限酵素により切断されており、非メチル化状態と判定できる。よって、この結果より、分析対象領域由来の癌細胞の近傍の各種正常細胞は、正常細胞であると判定することができる。
更に、癌細胞の近傍の正常細胞であっても偽陽性を生じることなくメチル化された分析対象領域の増幅並びにメチル化の判定及びこれに基づく癌の判定を行えることも分かった。
実施例1における試料として、イヌ由来の癌細胞[MDCK細胞(転移能はない良性癌細胞)、肺癌細胞及び肝臓癌細胞]を用いたこと、分析対象領域をイヌ由来のFoxB2遺伝子のプロモーター領域のうち、配列番号4で表される塩基配列からなる領域(433塩基対)に設定したこと、及び本発明に係るプライマー対としてd-F-Fox及びd-R-Foxを用いたこと以外は、実施例1と同様の方法により、増幅産物の確認を行った。
尚、本発明に係るプライマー対(d-F-Fox及びd-R-Fox)により増幅される領域は、配列番号4で表される塩基配列からなる領域(433塩基対)である。
その結果を図9に示す。
即ち、分析対象領域はメチル化感受性制限酵素により切断されており、非メチル化状態と判定できる。よって、この結果より、分析対象領域由来のMDCK細胞(転移能はない良性癌細胞)は、正常細胞であると判定することができる。
一方、肺癌細胞及び肝臓癌細胞を用いた場合(レーン4及び6)、何れも目的の増幅産物[配列番号1で表される塩基配列からなる領域(433塩基対)]が確認され、分析対象領域が得られていることが分かる。
即ち、分析対象領域はメチル化感受性制限酵素により切断されておらず、メチル化状態と判定できる。よって、この結果より、分析対象領域由来の肝癌細胞及び肝臓癌細胞は、癌細胞であると判定することができる。
更に、イヌ等の動物の癌検診に、本発明のメチル化された分析対象領域の増幅方法並びにメチル化の判定方法及び癌の判定方法を適用できる可能性が示唆された。
上述の通り、cfDNAとは、癌(腫瘍)細胞、白血球等の血液細胞、各組織由来の細胞等の死滅に由来するDNAのことであり、血液や尿等の体液中に存在している。また、癌患者におけるcfDNAの量は、健常人と比較して多いことが報告されている。
そのため、内視鏡や針を使用して癌(腫瘍)組織を採取する従来の生検(バイオプシー)に代えて、血液や尿等の体液を用いた癌(腫瘍)の検診(リキッドバイオプシー)が注目されている。
そこで、本発明の方法を、リキッドバイオプシーに適用できるか否かの検証を行った。
下記の通りに試料及び分析対象領域を設定した。
・試料
肝臓癌患者由来の血漿
肺癌患者由来の血漿
・分析対象領域
ヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域のうち、配列番号11で表される塩基配列からなる領域(149塩基対)
NucleoSpin(商標) Plasma XS(マッハライ・ナーゲル(株)製)により、その現品説明書に従って、cfDNAをそれぞれ抽出した。
(2)で得たcfDNAそれぞれに、10×CutSmart Buffer(NEB(株)製) 10μL、25ユニット/μL MboI(NEB(株)製) 1μL及び50ユニット/μL HpaII(NEB(株)製) 3μLを加え、滅菌水で全量100μLにした。その後、37℃で1時間30分反応させた。次いで、5.5M グアニジン塩酸塩(和光純薬工業(株)製) 500μLおよび20mM Tris-HCl pH7.0((株)ニッポンジーン製) 500μLをそれぞれ加えて混合した後、エコノスピン((株)ジーンデザイン製)に移し、13000×g、室温で2分間遠心し、チューブ内の溶液を除去した。次いで、2mM Tris-HCl pH7.5((株)ニッポンジーン製) 600μL及び80%エタノール(和光純薬工業(株)製) 600μLをそれぞれ加え、13000×g、室温で1分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。この操作をもう一度繰り返し、更に、13000×g、室温で3分間遠心分離した後、それぞれ新しいチューブに交換し、滅菌水 50μLをそれぞれ添加し、13000×g、室温で1分間遠心分離することにより、制限酵素(MboI)およびメチル化感受性制限酵素(HpaII)により処理したcfDNAをそれぞれ得た。
(3)で得たcfDNA含有滅菌水 50μLそれぞれに、10×S1ヌクレアーゼバッファー(タカラバイオ(株)製) 10μL、180ユニット/μL S1ヌクレアーゼ 1μLを加え、滅菌水で100μLに調製した。その後、23℃で15分間反応させた。次いで、5.5M グアニジン塩酸塩(和光純薬工業(株)製) 500μLおよび20mM Tris-HCl pH7.0((株)ニッポンジーン製) 500μLをそれぞれ加えて混合した後、エコノスピン((株)ジーンデザイン製)に移し、13000×g、室温で2分間遠心し、チューブ内の溶液を除去した。次いで、2mM Tris-HCl pH7.5((株)ニッポンジーン製) 600μL及び80%エタノール(和光純薬工業(株)製) 600μLをそれぞれ加え、13000×g、室温で1分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。この操作をもう一度繰り返し、更に、13000×g、室温で3分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、滅菌水 50μLをそれぞれ添加し、13000×g、室温で1分間遠心分離することにより、S1ヌクレアーゼにより処理したcfDNAをそれぞれ得た。
(4)で得たcfDNA含有滅菌水 50μLそれぞれに、10×CutSmart Buffer(NEB(株)製) 10μL及び50ユニット/μL HpaII 3μLを加え、滅菌水で全量100μLに調製した。その後、37℃で1時間30分反応させた。次いで、5.5M グアニジン塩酸塩(和光純薬工業(株)製) 500μLおよび20mM Tris-HCl pH7.0((株)ニッポンジーン製) 500μLをそれぞれ加えて混合した後、エコノスピン((株)ジーンデザイン製)に移し、13000×g、室温で2分間遠心し、チューブ内の溶液を除去した。次いで、2mM Tris-HCl pH7.5((株)ニッポンジーン製) 600μL及び80%エタノール(和光純薬工業(株)製) 600μLをそれぞれ加え、13000×g、室温で1分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。この操作をもう一度繰り返し、更に、13000×g、室温で3分間遠心分離した後、それぞれ新しいチューブに交換し、滅菌水 50μLを添加し、13000×g、室温で1分間遠心分離することにより、メチル化感受性制限酵素(HpaII)により処理したcfDNAをそれぞれ得た。
尚、HpaII及びHapIIが認識する配列は、図10で表されるヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の配列番号11で表される塩基配列からなる領域(149塩基対)のうち、四角で囲まれた3つの、CpG配列を含む配列(CCGG)である。
(5)で得たcfDNA含有滅菌水 3μLそれぞれに、ddPCRTM Supermix for Probes(バイオ・ラッドラボラトリーズ(株)製) 11μL、50ユニット/μL HapII(タカラバイオ(株)製) 0.8μL、20μM フォワードプライマー(hcf-F-fox) 1μL、20μM リバースプライマー(hcf-R-fox) 1μLおよび10μM プローブ[hcf-Probe-fox(5’末端をFAM、3’末端をBHQ1で標識)] 1μLを加え、滅菌水で全量22μLに調製し、これをデジタルPCR用反応液とした。その後、上記反応液それぞれをサーマルサイクラ―(バイオ・ラッドラボラトリーズ(株)製)にセットし、37℃で40分間反応させた。次いで、Automated Droplet Generatorにてドロップレットを作成し、このドロップレットを96ウェルプレートに分注した後、サーマルサイクラ―(バイオ・ラッドラボラトリーズ(株)製)にて、下記反応条件でデジタルPCR法による増幅反応を行った。
※反応条件
95℃ 10分間
↓
94℃ 30秒間→62℃ 1分間を1サイクルとして40サイクル
↓
98℃ 10分間
また、内在性コントロールとしてGAPDH遺伝子を選択し、GAPDH遺伝子の特定領域[配列番号15で表される塩基配列からなる領域(149塩基対)]についても、同じ試料(検体)を用い、解析を行った。GAPDH遺伝子の解析に用いたフォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブの塩基配列は下記の通りである。
尚、その他の実験条件については、デジタルPCR用反応液にHapIIを添加しなかった以外は、上記と同様である。
フォワードプライマー:gaagcttgtcatcaatggaaatccc(配列番号16)
リバースプライマー:gggacaggaccatattgagggacac(配列番号17)
プローブ(5’末端をFAM、3’末端をBHQ1で標識):caactaggatggtgtggctcccttg(配列番号18)
(6)で増幅された増幅産物を含有する各ドロップレット由来の蛍光を、QX200 Droplet Reader(バイオ・ラッドラボラトリーズ(株)製)にて検出することにより、増幅産物の確認を行った。
尚、GAPDH遺伝子に関する解析は1試料(検体)を用い、1試料(検体)につき1回行った。また、FOXB2遺伝子に関する解析は1試料(検体)を用い、1試料(検体)につき2回行った。
GAPDH遺伝子の解析結果を図11に、FOXB2遺伝子の解析結果を図12にそれぞれ示す。
陽性又は陰性の判定の基準となる閾値については、GAPDH遺伝子については、GAPDH遺伝子の増幅結果を参考とし、蛍光強度8000に設定した。また、FOXB2遺伝子については、FOXB2遺伝子の増幅結果を参考とし、蛍光強度8000に設定した。即ち、蛍光強度8000を超えるドロップレットが少なくとも1つあった場合、陽性(目的の増幅産物が得られた)と判定し、蛍光強度8000を超えるドロップレットが存在しなかった場合、陰性(目的の増幅産物が得られなかった)と判定した。
また、図11および図12における試料、分析対象領域、陽性ドロップレット数、陰性ドロップレット数、総ドロップレット数および閾値を表8および表9にそれぞれにまとめた。
また、肺癌患者由来の血漿を用いた場合についても、閾値を超える蛍光を発する陽性ドロップレットが確認(22個)確認できることから、目的の増幅産物[GAPDH遺伝子の特定領域:配列番号15で表される塩基配列からなる領域(149塩基対)]が増幅されていることが分かる。
以上より、試料(肝臓癌患者由来の血漿および肺癌患者由来の血漿)中にcfDNAが存在していることが示された。
また、肺癌患者由来の血漿を用いた場合についても、閾値を超える蛍光を発する陽性ドロップレットが確認(1回目:1個)できることから、目的の増幅産物[FOXB2遺伝子の特定領域:配列番号11で表される塩基配列からなる領域(149塩基対)]が得られていることが分かる。
即ち、分析対象領域はメチル化感受性制限酵素により切断されておらず、メチル化状態であると判定することができる。また、血漿に由来する対象(肝臓癌患者および肺癌患者)は、癌に罹患している又は当該対象(肝臓癌患者および肺癌患者)中に癌細胞が存在していると判定することができる。
従って、本発明のメチル化された分析対象領域の増幅方法並びにメチル化判定方法及び癌の判定方法をリキッドバイオプシーに適用できる可能性が示唆された。
実際の臨床現場を想定した場合、検査の迅速性という観点から、ターゲット遺伝子および内在性コントロールとして選択した遺伝子を同時に増幅・検出することが好ましい。
そこで、本発明の方法を、ターゲット遺伝子および内在性コントロールとして選択した遺伝子の同時増幅・検出に適用できるか否かの検証を行った。
実施例5における試料として健常者由来の血漿を用いたこと、閾値を下記の通りに設定したこと及び下記のデジタルPCR用反応液を用いたこと以外は、実施例5と同様の方法により、増幅産物の確認を行った。尚、実験は4試料(検体)を用い、1試料(検体)につきそれぞれ4回ずつ実施した。
その結果を図13(A、B)に示す。
・閾値
FOXB2遺伝子については、FOXB2遺伝子の増幅結果を参考とし、蛍光強度8000に設定した。また、GAPDH遺伝子については、GAPDH遺伝子の増幅結果を参考とし、蛍光強度4000に設定した。
・デジタルPCR用反応液
メチル化感受性制限酵素により処理したcfDNA 3μLに、20μM フォワードプライマー(hcf-F-fox) 1μL、20μM リバースプライマー(hcf-R-fox) 1μL、10μM プローブ[hcf-Probe-fox(5’末端をFAM、3’末端をBHQ1で標識)] 0.6μL、20μM フォワードプライマー(配列番号16で表される塩基配列) 1μL、20μM リバースプライマー(配列番号17で表される塩基配列) 1μL、10μM プローブ[配列番号18で表される塩基配列(5’末端をHEX、3’末端をBHQ1で標識)] 0.6μL、ddPCRTM Supermix for Probes(バイオ・ラッドラボラトリーズ(株)製) 11μLおよび50ユニット/μL HpaII(NEB(株)製) 0.6μLを加え、滅菌水にて全量22μLに調製したもの。
また、図13のAおよびBにおける試料、分析対象領域、陽性ドロップレット数、陰性ドロップレット数、総ドロップレット数および閾値を表10および11にそれぞれまとめた。
図13のB及び表11の結果より、健常者由来の血漿を用いた場合、4検体(試料)全てで、閾値を超える蛍光を発する陽性ドロップレットが確認できたことから、目的の増幅産物[GAPDH遺伝子の特定領域:配列番号15で表される塩基配列からなる領域(149塩基対)]が増幅されていることが分かる。
即ち、分析対象領域はメチル化感受性制限酵素により切断されており、メチル化状態でないと判定することができる。また、血漿に由来する対象(健常者)は、癌に罹患していない又は当該対象(健常者)中に癌細胞が存在していないと判定することができる。
実施例6における試料として下記のものを用いたこと、及び閾値を下記の通り設定したこと以外は、実施例6と同様の方法により、増幅産物の確認を行った。尚、実験はそれぞれ1試料(検体)を用い、1試料(検体)につきそれぞれ4回行った。その結果を図14~18にそれぞれ示す。
・閾値
FOXB2遺伝子については、FOXB2遺伝子の増幅結果を参考とし、蛍光強度8000に設定した。また、GAPDH遺伝子については、GAPDH遺伝子の増幅結果を参考とし、蛍光強度4000に設定した。・試料
乳癌患者由来の血漿
大腸癌患者由来の血漿
膵臓癌患者由来の血漿
胃癌患者由来の血漿
抗癌剤投与後の肺癌患者由来の血漿
また、図14~18における試料、分析対象領域、陽性ドロップレット数、陰性ドロップレット数、総ドロップレット数および閾値を表12~16にそれぞれまとめた。
また、図14のB及び表12の結果より、乳癌患者由来の血漿を用いた場合、閾値を超える蛍光を発する陽性ドロップレットが確認(1回目:91個、2回目:129個、3回目:93個、4回目:147個)できることから、目的の増幅産物[GAPDH遺伝子の特定領域:配列番号15で表される塩基配列からなる領域(149塩基対)]が得られていることが分かる。
即ち、分析対象領域はメチル化感受性制限酵素により切断されておらず、メチル化状態であると判定することができる。また、血漿に由来する対象(乳癌患者)は、癌に罹患している又は当該対象(乳癌患者)中に癌細胞が存在していると判定することができる。
また、図15のB及び表13の結果より、大腸癌患者由来の血漿を用いた場合、閾値を超える蛍光を発する陽性ドロップレットが確認(1回目:94個、2回目:126個、3回目:93個、4回目:74個)できることから、目的の増幅産物[GAPDH遺伝子の特定領域:配列番号15で表される塩基配列からなる領域(149塩基対)]が得られていることが分かる。
即ち、分析対象領域はメチル化感受性制限酵素により切断されておらず、メチル化状態であると判定することができる。また、血漿に由来する対象(大腸癌患者)は、癌に罹患している又は当該対象(大腸癌患者)中に癌細胞が存在していると判定することができる。
また、図16のB及び表14の結果より、膵臓癌患者由来の血漿を用いた場合、閾値を超える蛍光を発する陽性ドロップレットが確認(1回目:65個、2回目:76個、3回目:81個、4回目:86個)できることから、目的の増幅産物[GAPDH遺伝子の特定領域:配列番号15で表される塩基配列からなる領域(149塩基対)]が得られていることが分かる。
即ち、分析対象領域はメチル化感受性制限酵素により切断されておらず、メチル化状態であると判定することができる。また、血漿に由来する対象(膵臓癌患者)は、癌に罹患している又は当該対象(膵臓癌患者)中に癌細胞が存在していると判定することができる。
また、図17のB及び表15の結果より、胃癌患者由来の血漿を用いた場合、閾値を超える蛍光を発する陽性ドロップレットが確認(1回目:97個、2回目:101個、3回目:112個、4回目:139個)できることから、目的の増幅産物[GAPDH遺伝子の特定領域:配列番号15で表される塩基配列からなる領域(149塩基対)]が得られていることが分かる。
即ち、分析対象領域はメチル化感受性制限酵素により切断されておらず、メチル化状態であると判定することができる。また、血漿に由来する対象(胃癌患者)は、癌に罹患している又は当該対象(胃癌患者)中に癌細胞が存在していると判定することができる。
また、図18のB及び表16の結果より、抗癌剤投与後の肺癌患者由来の血漿を用いた場合、閾値を超える蛍光を発する陽性ドロップレットが確認(1回目:85個、2回目:82個、3回目:62個、4回目:92個)できることから、目的の増幅産物[GAPDH遺伝子の特定領域:配列番号15で表される塩基配列からなる領域(149塩基対)]が得られていることが分かる。
即ち、分析対象領域はメチル化感受性制限酵素により切断されておらず、メチル化状態であると判定することができる。また、血漿に由来する対象(抗癌剤投与後の肺癌患者)は、癌に罹患している又は当該対象(抗癌剤投与後の肺癌患者)中に癌細胞が存在していると判定することができる。
そのため、実際の臨床現場において、本発明の方法を適用できる可能性が大きく示唆された。
また、実施例8の図18より、抗癌剤投与後の癌患者由来の血漿を用いた場合であっても、目的の増幅産物が得られていることから、本発明を抗癌剤投与、放射線照射、手術予後等の経過観察に使用できる可能性が示唆された。
Claims (13)
- 下記工程1及び2を含み、下記工程1の前に、認識配列が分析対象領域内に存在しない制限酵素で処理する断片化工程を含む、二本鎖DNA中のメチル化された分析対象領域の増幅方法(ただし、下記工程1の前に分析対象領域を含む二本鎖DNAを熱濃縮する場合を除く):
(1)前記断片化工程により得られた二本鎖DNAであって、分析対象領域を含む二本鎖DNAを変性させずにS1ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程1、
(2)工程1で処理された二本鎖DNAの分析対象領域を増幅する工程2。 - 前記工程1が、S1ヌクレアーゼで処理した後に、メチル化感受性制限酵素で処理する、請求項1に記載の増幅方法。
- 前記工程1が、メチル化感受性制限酵素で処理した後に、S1ヌクレアーゼで処理する、請求項1に記載の増幅方法。
- 下記工程1~4を含み、下記工程1の前に、認識配列が分析対象領域内に存在しない制限酵素で処理する断片化工程を含む、二本鎖DNA中の分析対象領域のメチル化判定方法(ただし、下記工程1の前に分析対象領域を含む二本鎖DNAを熱濃縮する場合を除く):
(1)前記断片化工程により得られた二本鎖DNAであって、分析対象領域を含む二本鎖DNAを変性させずにS1ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程1、
(2)工程1で処理された二本鎖DNAの分析対象領域を増幅する工程2、
(3)工程2で得られた増幅産物の有無を確認する工程3、
(4)工程3の結果に基づいて、分析対象領域がメチル化されているか否かを判定する工程4。 - 前記工程1が、S1ヌクレアーゼで処理した後に、メチル化感受性制限酵素で処理する、請求項4に記載のメチル化判定方法。
- 前記工程1が、メチル化感受性制限酵素で処理した後に、S1ヌクレアーゼで処理する、請求項4に記載のメチル化判定方法。
- 請求項1~3から選ばれるいずれか一項に記載の二本鎖DNA中のメチル化された分析対象領域の増幅方法、又は請求項4~6から選ばれるいずれか一項に記載の二本鎖DNA中の分析対象領域のメチル化判定方法に用いるための、前記S1ヌクレアーゼ及び前記メチル化感受性制限酵素を含む、試薬。
- 下記工程1~4を含み、下記工程1の前に、認識配列が分析対象領域内に存在しない制限酵素で処理する断片化工程を含む、癌の診断を補助する方法(ただし、下記工程1の前に分析対象領域を含む二本鎖DNAを熱濃縮する場合を除く):
(1)前記断片化工程により得られた二本鎖DNAであって、分析対象領域を含む二本鎖DNAを変性させずにS1ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程1、
(2)工程1で処理された二本鎖DNAの分析対象領域を増幅する工程2、
(3)工程2で得られた増幅産物の有無を確認する工程3、
(4)工程3において増幅物が有る場合に、癌であると判定する工程4。 - 前記工程1が、S1ヌクレアーゼで処理した後に、メチル化感受性制限酵素で処理する、請求項8に記載の癌の診断を補助する方法。
- 前記工程1が、メチル化感受性制限酵素で処理した後に、S1ヌクレアーゼで処理する、請求項8に記載の癌の診断を補助する方法。
- 分析対象領域が配列番号1、配列番号4又は配列番号11で表される塩基配列を含む塩基配列である、請求項8に記載の癌の診断を補助する方法。
- 下記工程1~3を含み、下記工程1の前に、認識配列が分析対象領域内に存在しない制限酵素で処理する断片化工程を含む、癌の診断を補助するためのデータを得る方法(ただし、下記工程1の前に分析対象領域を含む二本鎖DNAを熱濃縮する場合を除く):
(1)前記断片化工程により得られた二本鎖DNAであって、分析対象領域を含む二本鎖DNAを変性させずにS1ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程1、
(2)工程1で処理された二本鎖DNAの分析対象領域を増幅する工程2、
(3)工程2で得られた増幅産物の有無を確認する工程3。 - 請求項8~11から選ばれるいずれか一項に記載の癌の診断を補助する方法、又は請求項12に記載の癌の診断を補助するためのデータを得る方法に用いるための、前記S1ヌクレアーゼ及び前記メチル化感受性制限酵素を含む、試薬。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016171550 | 2016-09-02 | ||
JP2016171550 | 2016-09-02 | ||
PCT/JP2017/031670 WO2018043724A1 (ja) | 2016-09-02 | 2017-09-01 | メチル化されたdnaの増幅方法、dnaのメチル化判定方法並びに癌の判定方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2018043724A1 JPWO2018043724A1 (ja) | 2019-06-24 |
JP7169192B2 true JP7169192B2 (ja) | 2022-11-10 |
Family
ID=61301141
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018537574A Active JP7169192B2 (ja) | 2016-09-02 | 2017-09-01 | メチル化されたdnaの増幅方法、dnaのメチル化判定方法並びに癌の判定方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20190226031A1 (ja) |
EP (1) | EP3508588A4 (ja) |
JP (1) | JP7169192B2 (ja) |
KR (1) | KR102460747B1 (ja) |
CN (1) | CN109563542A (ja) |
TW (1) | TWI732930B (ja) |
WO (1) | WO2018043724A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3470528A4 (en) * | 2016-06-10 | 2019-12-25 | National Cancer Center | METHOD FOR PROGNOSING THE EFFECT OF PHARMACOTHERAPY IN CANCER |
JPWO2019163602A1 (ja) * | 2018-02-21 | 2021-02-18 | 富士フイルム和光純薬株式会社 | 標的領域の精製方法、検出方法及び癌の判定方法 |
KR20200136977A (ko) * | 2018-03-28 | 2020-12-08 | 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 | 엑소좀으로부터 단리된 dna에서의 후성유전학적 변화의 식별 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050202490A1 (en) | 2004-03-08 | 2005-09-15 | Makarov Vladimir L. | Methods and compositions for generating and amplifying DNA libraries for sensitive detection and analysis of DNA methylation |
US20100273151A1 (en) | 2004-05-28 | 2010-10-28 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Genome-wide analysis of palindrome formation and dna methylation |
CN102399862A (zh) | 2010-09-16 | 2012-04-04 | 上海迦美生物科技有限公司 | 一种基于解链曲线的甲基化dna检测方法 |
CN102399865A (zh) | 2010-09-16 | 2012-04-04 | 上海迦美生物科技有限公司 | 基于核酸内切酶消化的甲基化dna定量检测方法 |
US20120088677A1 (en) | 2002-11-15 | 2012-04-12 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for analysis of regulatory sequences |
WO2016027794A1 (ja) | 2014-08-18 | 2016-02-25 | 和光純薬工業株式会社 | 癌マーカー及び癌の判定方法 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002171973A (ja) * | 2000-12-07 | 2002-06-18 | Univ Tokyo | Dnaメチル化パターンによる細胞の同定法 |
JP2006149334A (ja) * | 2004-12-01 | 2006-06-15 | Hitachi Software Eng Co Ltd | メチル化検出方法 |
JP2008283947A (ja) | 2007-04-19 | 2008-11-27 | Tokyo Medical & Dental Univ | 食道癌の判別方法 |
JP5206059B2 (ja) * | 2008-03-25 | 2013-06-12 | 住友化学株式会社 | メチル化されたdnaの含量を測定する方法 |
JP5618369B2 (ja) | 2008-04-25 | 2014-11-05 | 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター | Dnaメチル化分析方法 |
WO2013089063A1 (ja) | 2011-12-14 | 2013-06-20 | 和光純薬工業株式会社 | バイサルファイト反応を利用したメチル化シトシンの検出方法 |
WO2013109950A1 (en) * | 2012-01-20 | 2013-07-25 | Kennesaw State University Research And Services Foundation | Methods to mutate circular deoxyribonucleotides |
-
2017
- 2017-09-01 TW TW106130021A patent/TWI732930B/zh not_active IP Right Cessation
- 2017-09-01 JP JP2018537574A patent/JP7169192B2/ja active Active
- 2017-09-01 EP EP17846727.0A patent/EP3508588A4/en not_active Withdrawn
- 2017-09-01 CN CN201780049054.9A patent/CN109563542A/zh active Pending
- 2017-09-01 KR KR1020197008919A patent/KR102460747B1/ko active IP Right Grant
- 2017-09-01 US US16/329,106 patent/US20190226031A1/en not_active Abandoned
- 2017-09-01 WO PCT/JP2017/031670 patent/WO2018043724A1/ja unknown
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120088677A1 (en) | 2002-11-15 | 2012-04-12 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for analysis of regulatory sequences |
US20050202490A1 (en) | 2004-03-08 | 2005-09-15 | Makarov Vladimir L. | Methods and compositions for generating and amplifying DNA libraries for sensitive detection and analysis of DNA methylation |
US20100273151A1 (en) | 2004-05-28 | 2010-10-28 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Genome-wide analysis of palindrome formation and dna methylation |
CN102399862A (zh) | 2010-09-16 | 2012-04-04 | 上海迦美生物科技有限公司 | 一种基于解链曲线的甲基化dna检测方法 |
CN102399865A (zh) | 2010-09-16 | 2012-04-04 | 上海迦美生物科技有限公司 | 基于核酸内切酶消化的甲基化dna定量检测方法 |
WO2016027794A1 (ja) | 2014-08-18 | 2016-02-25 | 和光純薬工業株式会社 | 癌マーカー及び癌の判定方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20190044651A (ko) | 2019-04-30 |
CN109563542A (zh) | 2019-04-02 |
JPWO2018043724A1 (ja) | 2019-06-24 |
WO2018043724A1 (ja) | 2018-03-08 |
TWI732930B (zh) | 2021-07-11 |
EP3508588A4 (en) | 2020-05-27 |
KR102460747B1 (ko) | 2022-11-04 |
EP3508588A1 (en) | 2019-07-10 |
US20190226031A1 (en) | 2019-07-25 |
TW201840846A (zh) | 2018-11-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2381204T3 (es) | Métodos mejorados para BEAMING | |
WO2013039228A1 (ja) | 標的核酸の検出方法 | |
JP7169192B2 (ja) | メチル化されたdnaの増幅方法、dnaのメチル化判定方法並びに癌の判定方法 | |
JP3844996B2 (ja) | 反復性pcr産物の融解曲線解析方法 | |
CN110541033B (zh) | Egfr基因突变检测用组合物及检测方法 | |
KR20130099092A (ko) | 광을 이용한 핵산의 증폭 억제 방법 및 고감도의 선택적 핵산 증폭 방법 | |
CN105555971A (zh) | 用于在核酸测定中改善熔链分辨和多重性的探针 | |
JP2015508995A (ja) | 核酸ハイブリダイゼーションプローブ | |
JP6844613B2 (ja) | クラミジア・トラコマティス検出用プライマーセット及びこれを用いたクラミジア・トラコマティス検出方法、並びにそのための試薬キット | |
JP2022531589A (ja) | 核酸分子の配列決定方法 | |
KR20170037095A (ko) | 현미부수체 불안정성의 진단을 위한 pna 프로브를 이용한 융해곡선 분석방법, 및 이를 이용한 현미부수체 불안정성의 진단방법 및 현미부수체 불안정성의 진단용 키트 | |
US8673563B2 (en) | Amplification method of methylated or unmethylated nucleic acid | |
CN111349691B (zh) | Egfr基因缺失突变检测用组合物、试剂盒及检测方法 | |
US20040106109A1 (en) | Detection of ras mutations | |
JPWO2019163602A1 (ja) | 標的領域の精製方法、検出方法及び癌の判定方法 | |
JP6202455B2 (ja) | 標的核酸の検出方法 | |
JP4359497B2 (ja) | 核酸増幅用プライマー、核酸増幅用プライマーセット及びこれを用いた癌の検査方法 | |
WO2017142070A1 (ja) | Foxb2遺伝子を用いた癌細胞の判定方法 | |
EP4253564A1 (en) | Target nucleic acid amplification method with high specificity and target nucleic acid amplifying composition using same | |
AU2001296955A1 (en) | Detection of RAS mutations | |
KR20240005282A (ko) | Crispr/cas 기반의 핵산 검출용 키트 및 이에 기초한 핵산 검출 방법 | |
CN113897429A (zh) | 人nras基因突变的数字pcr检测方法及应用 | |
CN104204203A (zh) | 具有微卫星区域的dna的检测方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200820 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200820 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210907 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20211029 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20211213 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211221 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220308 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20220428 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20220516 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220624 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20221018 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20221028 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7169192 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |