TW201840846A - 甲基化dna的擴增方法、dna的甲基化判定方法以及癌症的判定方法 - Google Patents

甲基化dna的擴增方法、dna的甲基化判定方法以及癌症的判定方法 Download PDF

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Abstract

本發明的課題在於提供能夠簡便地進行甲基化DNA的擴增和使用了該擴增的DNA的甲基化判定以及癌症判定的方法。本發明涉及「甲基化的分析物件區域的擴增方法、分析物件區域的甲基化判定方法、甲基化判定用試劑、癌症的判定方法、獲得用於進行癌症的判定的資料的方法、癌症的判定用試劑和用於進行癌症的判定的標記物」。

Description

甲基化DNA的擴增方法、DNA的甲基化判定方法以及癌症的判定方法
本發明涉及甲基化DNA的擴增方法、DNA的甲基化判定方法以及癌症的判定方法。
DNA的甲基化是指利用DNA甲基化酶進行的鹽基修飾，是在CpG序列的胞嘧啶鹽基的5位等附加有甲基的狀態。 DNA的甲基化在高等生物中對正常的發育和細胞的分化起到極其重要的作用。 目前，作為對甲基化DNA進行擴增的方法，例如進行了下述方法：(1)使DNA進行亞硫酸氫鹽反應，接著進行PCR等核酸擴增反應的方法(專利文獻1)；(2)利用甲基化敏感性限制酶和甲基化非敏感性限制酶對DNA進行處理，接著進行PCR等核酸擴增反應的方法(專利文獻2)。另外，在專利文獻1和專利文獻2中，還通過DNA微陣列等對利用擴增甲基化DNA的方法得到的擴增產物進行分析，基於其結果，對DNA是否被甲基化進行判定及分析。 另一方面，還已知DNA的甲基化與癌症化有關。例如，DNA的甲基化模式的差異與癌症或各種疾病有關(非專利文獻1、2)；進行了基於DNA的甲基化率來檢測癌症的方法等(專利文獻3)。 現有技術文獻 專利文獻
專利文獻1：WO2013/089063 專利文獻2：WO2009/131223 專利文獻3：日本特開2008-283947
非專利文獻1：Yu J et al.Cell Res 13：319-33, 2003 非專利文獻2：Kanai Y et al.Hepatology 29：703-9,1999
發明所要解決的課題 但是，專利文獻1的擴增甲基化DNA的方法需要進行亞硫酸氫鹽反應的步驟。另外，專利文獻2的擴增甲基化DNA的方法需要在利用甲基化非敏感性限制酶處理的DNA上連接接頭、之後將接頭除去的步驟。因此，哪種方法都繁雜，需要大量的時間。 因此，希望開發出能夠簡便地進行甲基化DNA的擴增、以及使用了該擴增的DNA的甲基化判定和癌症判定的方法。 即，本發明的課題在於提供一種能夠簡便地進行甲基化DNA的擴增和使用了該擴增的DNA的甲基化判定以及癌症判定的方法。 用於解決課題的手段
本發明是為了解決上述課題而進行的，其由下述構成組成。 [1]一種雙鏈DNA中的甲基化的分析物件區域的擴增方法，其包括下述步驟1和2： (1)步驟1，利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶對包含分析物件區域的雙鏈DNA進行處理； (2)步驟2，對步驟1中處理後的雙鏈DNA的分析物件區域進行擴增。 [2]如[1]所述的擴增方法，其中，所述步驟1在利用S1核酸酶進行處理後，利用甲基化敏感性限制酶進行處理。 [3]如[1]所述的擴增方法，其中，所述步驟1在利用甲基化敏感性限制酶進行處理後，利用S1核酸酶進行處理。 [4]如[1]～[3]中任一項所述的擴增方法，其中，在所述步驟1之前，包括利用在分析物件區域內不存在識別序列的限制酶進行處理的片段化步驟。 [5]一種雙鏈DNA中的分析物件區域的甲基化判定方法，其包括下述步驟1～4： (1)步驟1，利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶對包含分析物件區域的雙鏈DNA進行處理； (2)步驟2，對步驟1中處理後的雙鏈DNA的分析物件區域進行擴增； (3)步驟3，確認步驟2中得到的擴增產物的有無； (4)步驟4，基於步驟3的結果，判定分析物件區域是否被甲基化。 [6]如[5]所述的甲基化判定方法，其中，所述步驟1在利用S1核酸酶進行處理後，利用甲基化敏感性限制酶進行處理。 [7]如[5]所述的甲基化判定方法，其中，所述步驟1在利用甲基化敏感性限制酶進行處理後，利用S1核酸酶進行處理。 [8]如[5]～[7]中任一項所述的甲基化判定方法，其中，在所述步驟1之前，包括利用在分析物件區域內不存在識別序列的限制酶進行處理的片段化步驟。 [9]一種DNA的甲基化判定用試劑，其包含S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶。 [10]一種癌症的判定方法，其包括下述步驟1～4： (1)步驟1，利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶對包含分析物件區域的雙鏈DNA進行處理； (2)步驟2，對步驟1中處理後的雙鏈DNA的分析物件區域進行擴增； (3)步驟3，確認步驟2中得到的擴增產物的有無； (4)步驟4，基於步驟3的結果，對癌症進行判定。 [11]如[10]所述的癌症的判定方法，其中，所述步驟1在利用S1核酸酶進行處理後，利用甲基化敏感性限制酶進行處理。 [12]如[10]所述的癌症的判定方法，其中，所述步驟1在利用甲基化敏感性限制酶進行處理後，利用S1核酸酶進行處理。 [13]如[10]～[12]中任一項所述的癌症的判定方法，其中，在所述步驟1之前，包括利用在分析物件區域內不存在識別序列的限制酶進行處理的片段化步驟。 [14]如[10]～[13]中任一項所述的癌症的判定方法，其中，分析物件區域為包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:11所表示的鹽基序列的鹽基序列。 [15]一種獲得用於進行癌症的判定的資料的方法，其包括下述步驟1～3： (1)步驟1，利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶對包含分析物件區域的雙鏈DNA進行處理； (2)步驟2，對步驟1中處理後的雙鏈DNA的分析物件區域進行擴增； (3)步驟3，確認步驟2中得到的擴增產物的有無。 [16]一種癌症的判定用試劑，其包含S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶。 [17]一種用於進行癌症的判定的標記物，其通過進行下述步驟1和2而獲得： (1)步驟1，利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶對包含分析物件區域的雙鏈DNA進行處理； (2)步驟2，對步驟1中處理後的雙鏈DNA的分析物件區域進行擴增。 本發明還包括以下的構成。 [18]一種分析物件區域的甲基化分析(判定)方法，其包括下述步驟1～5： (1)步驟1，利用S1核酸酶對包含分析物件區域的DNA進行處理； (2)步驟2，利用甲基化敏感性限制酶對步驟1中處理後的雙鏈DNA進行處理； (3)步驟3，對步驟2中處理後的雙鏈DNA的分析物件區域進行擴增； (4)步驟4，確認步驟3中得到的擴增產物的有無； (5)步驟5，基於步驟4的結果，判定分析物件區域是否被甲基化。 [19]如[18]所述的分析(判定)方法，其中，利用PCR進行步驟3的擴增。 [20]如[18]或[19]所述的分析(判定)方法，其中，利用電泳進行步驟4的擴增產物的確認。 [21]如[18]～[20]中任一項所述的分析(判定)方法，其中，接續在步驟1後，進一步包括對步驟1中處理後的DNA進行純化的純化步驟。 [22]如[21]所述的分析(判定)方法，其中，利用柱純化法進行純化步驟的純化。 [23]如[22]所述的分析(判定)方法，其中，在進行純化步驟之前，進一步包括利用在分析物件區域不存在識別序列的限制酶進行處理的片段化步驟。 [24]一種DNA甲基化分析(判定)用試劑，其包含S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶。 [25]一種癌症的判定方法，其包括下述步驟1～5： (1)步驟1，利用S1核酸酶對包含分析物件區域的DNA進行處理； (2)步驟2，利用甲基化敏感性限制酶對步驟1中處理後的雙鏈DNA進行處理； (3)步驟3，對步驟2中處理後的雙鏈DNA的分析物件區域進行擴增； (4)步驟4，確認步驟3中得到的擴增產物的有無； (5)步驟5，基於步驟4的結果，對癌症進行判定。 [26]如[25]所述的判定方法，其中，分析物件區域為啟動子區域。 [27]如[25]或[26]所述的判定方法，其中，步驟2的甲基化敏感性限制酶為HapII、HpaII或SacII。 [28]如[25]～[27]中任一項所述的判定方法，其中，步驟3中擴增的核酸是包含SEQ ID NO:1所表示的鹽基序列的連續的鹽基序列。 [29]如[25]～[28]中任一項所述的判定方法，其中，利用PCR進行步驟3的擴增。 [30]如[29]所述的判定方法，其中，PCR使用由SEQ ID NO:2所表示的鹽基序列構成的正向引子和SEQ ID NO:3所表示的反向引子來進行。 [31]如[25]～[30]中任一項所述的判定方法，其中，利用電泳進行步驟4的擴增產物有無的確認。 [32]如[25]～[31]中任一項所述的判定方法，其中，接續在步驟1後，進一步包括對步驟1中處理後的DNA進行純化的純化步驟。 [33]如[32]所述的判定方法，其中，利用柱純化法進行純化步驟的純化。 [34]如[33]所述的判定方法，其中，在進行純化步驟之前，進一步包括利用在分析物件區域不存在識別序列的限制酶進行處理的片段化步驟。 [35]一種獲得用於進行癌症的判定的資料的方法，其包括下述步驟1～4： (1)步驟1，利用S1核酸酶對包含分析物件區域的DNA進行處理； (2)步驟2，利用甲基化敏感性限制酶對步驟1中處理後的雙鏈DNA進行處理； (3)步驟3，對步驟2中處理後的雙鏈DNA的分析物件區域進行擴增； (4)步驟4，確認步驟3中得到的擴增產物的有無。 [36]一種癌症的判定用試劑，其包含S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶。 [37]一種用於進行癌症的判定的標記物，其通過進行下述步驟1～3而獲得： (1)步驟1，利用S1核酸酶對包含分析物件區域的DNA進行處理； (2)步驟2，利用甲基化敏感性限制酶對步驟1中處理後的雙鏈DNA進行處理； (3)步驟3，對步驟2中處理後的雙鏈DNA的分析物件區域進行擴增。 發明的效果
根據本發明的擴增方法、甲基化判定方法、癌症的判定方法和獲得用於進行癌症的判定的資料的方法，能夠簡便且以短時間進行甲基化DNA的擴增、DNA的甲基化的判定、癌症的判定和用於進行癌症的判定的資料的獲得。
此外，根據本發明的擴增方法、甲基化判定方法、癌症的判定方法和獲得用於進行癌症的判定的資料的方法，能夠排除PCR等擴增反應時的非特異性擴增產物，因此還能夠以良好的精度進行甲基化DNA的擴增、DNA的甲基化的判定、癌症的判定和用於進行癌症的判定的資料的獲得。
＜本發明的擴增方法＞ 本發明的擴增方法的特徵在於，包括下述步驟：(1)步驟1，利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶對包含分析物件區域的雙鏈DNA進行處理；(2)步驟2，對步驟1中處理後的雙鏈DNA的分析物件區域進行擴增。
[ 雙鏈 DNA 和該 DNA 的萃取 ] 作為本發明的雙鏈DNA，只要是包含CpG序列(-CG-)的雙鏈DNA則可以為任一種。
本發明的雙鏈DNA從包含該DNA的試樣中萃取即可，該萃取方法基於自身公知的DNA的萃取方法進行即可。作為該DNA的萃取方法，具體而言，例如可以舉出：將試樣和包含表面活性劑(膽酸鈉、十二烷基硫酸鈉等)的處理液混合，對所得到的混合液進行物理處理(攪拌、均質化、超聲波粉碎等)，使試樣中包含的DNA游離到混合液中，由此萃取DNA的方法；使用苯酚/氯仿從試樣中萃取DNA的方法；柱萃取法等。其中，更優選使用苯酚/氯仿從試樣中萃取DNA的方法或柱萃取法。
使用苯酚/氯仿從試樣中萃取DNA的方法是指下述方法：基於使試樣中包含的蛋白質變性的苯酚的性質和促進該作用的氯仿的性質，除去試樣中存在的蛋白質，從而萃取DNA。具體方法基於自身公知的方法進行即可。
另外，上述DNA萃取方法也可以使用市售的試劑盒[例如，Phase Lock Gel(QTB公司製造)等]來進行。
另一方面，柱萃取法是指下述方法：將試樣添加至內部具備膜等的柱等筒狀容器中，利用物質的大小、吸附力、電荷、疏水性等的差異，從試樣中萃取DNA。具體方法基於自身公知的方法進行即可。
另外，上述DNA萃取方法也可以使用市售的試劑盒[例如，QuickGene SP組織DNA 萃取試劑盒(倉敷紡績株式會社製造)、MagMAX™游離DNA分離試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司製造)、Nucleo Spin(商標) Plasma XS(MACHEREY-NAGEL公司製造)等]來進行。
作為上述試樣，具體而言，例如可以舉出全血、血清、血漿、尿等體液、組織、細胞等。在使用這樣的全血、血清、血漿、尿等體液、組織、細胞等作為試樣的情況下，能夠將利用本發明的擴增方法得到的擴增產物用於DNA的甲基化的判定、DNA的甲基化相關的疾病的判定或/和診斷。
需要說明的是，作為使用上述試樣時的本發明的雙鏈DNA，例如可以舉出存在於血清、血漿、尿等體液中的循環癌(腫瘤)細胞(Circulating Tumor Cell：CTC)來源的雙鏈DNA、癌(腫瘤)細胞、白細胞等血液細胞、各組織來源的細胞等的死亡所來源的雙鏈DNA[游離DNA(cell free DNA，cfDNA)]或外泌體(Exosome)來源的雙鏈DNA、或存在於組織、細胞、全血、尿等中的細胞來源的雙鏈DNA。
[ 分析物件區域 ] 本發明的分析物件區域是本發明的雙鏈DNA中存在的包含CpG序列的連續的特定雙鏈DNA部分，可以為本發明的雙鏈DNA的一部分或全部。 在這樣的分析物件區域中，本發明的擴增方法中所擴增的分析物件區域是包含胞嘧啶被甲基化的CpG序列的連續的特定雙鏈DNA部分。 需要說明的是，上述「甲基化」是指利用DNA甲基化酶進行的鹽基修飾，是指在胞嘧啶之後接著出現鳥嘌呤的2鹽基序列CpG序列的胞嘧啶鹽基的5位等附加有甲基的狀態。
本發明的分析物件區域的大小(鹽基對數)通常為50～1000鹽基對，優選50～700鹽基對，更優選50～500鹽基對。 作為本發明的分析物件區域，具體而言，例如可以舉出任意選擇的適當基因的啟動子區域內的特定區域的DNA，更優選FOXB2基因的啟動子區域內的特定區域的DNA，進一步優選人來源的FOXB2基因的啟動子區域內的特定區域的DNA或犬來源的FOXB2基因的啟動子區域內的特定區域的DNA，特別優選人來源的FOXB2基因的啟動子區域內的由SEQ ID NO:1所表示的鹽基序列構成的區域(267鹽基對)、人來源的FOXB2基因的啟動子區域內的由SEQ ID NO:11所表示的鹽基序列構成的區域(149鹽基對)或犬來源的FOXB2基因的啟動子區域內的由SEQ ID NO:4所表示的鹽基序列構成的區域(433鹽基對)。
[ 步驟 1] 本發明的步驟1是利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶對包含分析物件區域的雙鏈DNA進行處理的步驟。
本發明的步驟1中的S1核酸酶是單鏈特異性核酸酶的一種，是對單鏈DNA和雙鏈DNA的單鏈的區域進行分解的酶。 本發明的步驟1中的S1核酸酶的濃度(單位數)通常相對於1～200ng目標DNA為1～200單位/μL，優選5～190單位/μL，更優選20～180單位/μL。 本發明的步驟1中的利用S1核酸酶的處理通常在10～37℃、優選在15～25℃進行通常5～30分鐘、優選10～20分鐘的反應即可。 另外，本發明的步驟1中的利用S1核酸酶的處理優選在pH4～5的條件下進行，作為此處使用的緩衝液，例如使用乙酸鈉緩衝液等即可。
本發明的步驟1中的甲基化敏感性限制酶是指切割活性根據識別序列中的CpG序列中的胞嘧啶是否被甲基化而受到影響的限制酶。即，甲基化敏感性限制酶是指下述的限制酶：在識別序列具有包含甲基化的胞嘧啶鹽基的CpG序列的情況下，無法切斷該識別序列，但在識別序列不具有包含甲基化的胞嘧啶鹽基的CpG序列的情況下，能夠切斷該識別序列。 關於本發明的步驟1中的甲基化敏感性限制酶，只要在分析物件區域記憶體在其所識別的鹽基序列，則可以為任意的甲基化敏感性限制酶。即，根據分析物件區域適當選擇即可。 作為本發明的步驟1中的甲基化敏感性限制酶，具體而言，例如可以舉出AatII、AccI、AccII、AfaI、Aor13HI、Aor51HI、ApaI、ApaLI、BglI、BmgT120I、BspT104I、BssHII、Cfr10I、ClaI、CpoI、EaeI、Eco52I、HaeII、HapII、HpaII、HhaI、MluI、NaeI、NheI、NotI、NruI、NsbI、PmaCI、Psp1406I、PvuI、SacII、SalI、Sau3AI、SmaI、SnaBI、VpaK11BI等。其中，在將人來源的FOXB2基因的啟動子區域中由SEQ ID NO:1所表示的鹽基序列構成的區域設定為分析物件區域的情況下，優選使用HapII、HpaII或SacII，更優選使用HpaII或HapII。另外，在將人來源的FOXB2基因的啟動子區域中由SEQ ID NO:11所表示的鹽基序列構成的區域、或犬來源的FOXB2基因的啟動子區域中由SEQ ID NO:4所表示的鹽基序列構成的區域設定為分析物件區域的情況下，優選使用HapII或HpaII。 本發明的步驟1中的甲基化敏感性限制酶的濃度(單位數)通常相對於1～200ng目標DNA為1～50單位/μL，優選5～50單位/μL，更優選10～50單位/μL。 本發明的步驟1中的利用甲基化敏感性限制酶的處理通常在20～50℃、優選在35～45℃進行通常60～150分鐘、優選60～120分鐘反應即可。 另外，本發明的步驟1中的利用甲基化敏感性限制酶的處理優選在pH6～8的條件下進行，作為此處使用的緩衝液，例如使用三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩衝液等。
本發明的步驟1中，利用S1核酸酶的處理與利用甲基化敏感性限制酶的處理(i)可以同時進行；(ii)可以在利用S1核酸酶的處理之後，進行利用甲基化敏感性限制酶的處理；或者(iii)可以在利用甲基化敏感性限制酶的處理之後，進行利用S1核酸酶的處理，但由於利用S1核酸酶的處理與利用甲基化敏感性限制酶的處理中優選的pH不同，因而更優選上述(ii)或(iii)，進一步優選(ii)。
此外，在本發明的步驟1中的利用S1核酸酶的處理或/和利用甲基化敏感性限制酶的處理之後，優選對包含分析物件區域的DNA進行純化，該純化的詳細情況在[純化步驟]的項中進行詳細說明。 另外，在本發明的步驟1之前，優選利用在分析物件區域內不存在識別序列的限制酶進行處理，該限制酶的詳細情況在[利用在分析物件區域內不存在識別序列的限制酶進行處理的片段化步驟]的項中進行詳細說明。
通過如此進行本發明的步驟1中的利用S1核酸酶的處理，能夠特異性地切斷因人為操作和內源性現象(DNA-DNA、DNA-RNA雜交體中的環區域)而產生的單鏈DNA。其結果，在本發明的步驟2(對本發明的步驟1中處理後的雙鏈DNA的分析物件區域進行擴增的步驟)中非特異性擴增產物的生成受到抑制。 另外，通過進行本發明的步驟1中的利用甲基化敏感性限制酶的處理，甲基化的雙鏈DNA的分析物件區域不被切斷，未被甲基化的雙鏈DNA的分析物件區域被切斷，因此能夠特異性地擴增甲基化的雙鏈DNA的分析物件區域。 因此，通過在本發明的步驟1中對包含分析物件區域的DNA進行處理，在本發明的步驟2中，能夠特異性且高靈敏度地擴增甲基化的雙鏈DNA的分析物件區域。
[ 步驟 2] 本發明的步驟2是對本發明的步驟1中處理後的雙鏈DNA的分析物件區域進行擴增的步驟。 本發明的步驟2中的擴增產物可以為分析物件區域本身，也可以包含分析物件區域以外的鹽基序列(例如，引子等)，作為該擴增產物的大小(鹽基對數)，通常為50～1100鹽基對，優選50～800鹽基對，更優選50～600鹽基對。 作為本發明的步驟2中的擴增產物，具體而言，例如可以舉出任意選擇的適當基因的啟動子區域內的特定區域的DNA，更優選FOXB2基因的啟動子區域內的特定區域的DNA，進一步優選人來源的FOXB2基因的啟動子區域內的特定區域的DNA或犬來源的FOXB2基因的啟動子區域內的特定區域的DNA，特別優選人來源的FOXB2基因的啟動子區域內的由SEQ ID NO:1所表示的鹽基序列構成的區域(267鹽基對)、人來源的FOXB2基因的啟動子區域內的由SEQ ID NO:11所表示的鹽基序列構成的區域(149鹽基對)或犬來源的FOXB2基因的啟動子區域內的由SEQ ID NO:4所表示的鹽基序列構成的區域(433鹽基對)。
本發明的步驟2中的對分析物件區域進行擴增的方法沒有特別限制，基於自身公知的方法進行即可。作為這樣的自身公知的擴增法，具體而言，例如可以舉出PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應)法、LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification，環介導等溫擴增)法等，更優選PCR法。
上述PCR法使用引子、核酸合成酶、核酸合成底物、緩衝液、必要時的探針等利用公知的方法進行即可。具體而言，例如基於Nucleic Acids Research,1991,Vol.19,3749、BioTechniques,1994,Vol.16,1134-1137或「目的別で選べるＰＣＲ実験プロトコール(根據目的選擇的PCR實驗方案), 2011, p.p. 56-73, 120-131」中記載的方法進行即可。
作為上述PCR法，在將存在於血清、血漿、尿等體液中的CTC來源的DNA的特定區域、cfDNA的特定區域或外泌體(Exosome)來源的DNA的特定區域設定為分析物件區域的情況下，優選數位PCR法。
上述數字PCR法為下述方法：按照使DNA片段為1分子的方式將PCR反應液分割成多個小區劃來實施PCR反應，基於檢測出擴增產物的小區劃的數量來檢測、定量靶DNA。數字PCR法例如基於日本特表2014-506465號公報中記載的方法、或Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 96, p.p 9236-9241, August 1999 Genetics中記載的方法進行即可。 具體而言，例如，製備包含作為範本的含DNA溶液、由正向引子和反向引子構成的引子對、探針、核酸合成底物、核酸合成酶等的數位PCR用反應液，利用液滴製作裝置[例如，QX200液滴發生器(Bio-Rad Laboratories公司製造)、自動化液滴發生器(Bio-Rad Laboratories公司製造)等]將該反應液分割成多個液滴(每一個樣品分割成1萬～3萬個)。之後，利用數位PCR裝置[例如，Droplet Digital PCR(Bio-Rad Laboratories公司製造)、QuantStudio 3D數位PCR系統(Thermo Fisher Scientific公司製造)等]進行PCR反應即可。
上述PCR法中的由正向引子和反向引子(下文中有時簡記為本發明的引子)構成的引子對(下文中有時簡記為本發明的引子對)只要按照可擴增本發明的分析物件區域的方式進行設計，則可以為任意的引子對。 作為構成本發明的引子對的引子的大小(鹽基數)，通常為10～50鹽基，優選10～35鹽基，更優選15～35鹽基，特別優選20～30鹽基。 作為本發明的引子對，具體而言，例如，在將人來源的FOXB2基因的啟動子區域中由SEQ ID NO:1所表示的鹽基序列構成的區域設定為分析物件區域的情況下，作為正向引子，優選由SEQ ID NO:2所表示的鹽基序列構成的引子，作為反向引子，優選由SEQ ID NO:3所表示的鹽基序列構成的引子。在將人來源的FOXB2基因的啟動子區域中由SEQ ID NO:11所表示的鹽基序列構成的區域設定為分析物件區域的情況下，作為正向引子，優選由SEQ ID NO:12所表示的鹽基序列構成的引子，作為反向引子，優選由SEQ ID NO:13所表示的鹽基序列構成的引子。另外，在將犬來源的FOXB2基因的啟動子區域中由SEQ ID NO:4所表示的鹽基序列構成的區域設定為分析物件區域的情況下，作為正向引子，優選由SEQ ID NO:5所表示的鹽基序列構成的引子，作為反向引子，優選由SEQ ID NO:6所表示的鹽基序列構成的引子。 以下，示出構成上述引子對的各引子的鹽基序列、名稱和利用引子對所擴增的區域。
【表1】
另外，本發明的引子對優選直接使用本發明的引子對，但也可以是由利用標記物質對正向引子或反向引子中的任一者或兩者進行了標記的引子構成的引子對。
作為利用標記物質對本發明的引子進行標記的方法，沒有特別限制，基於自身公知的方法進行即可。 作為為了利用標記物質對本發明的引子進行標記而使用的標記物質，可以舉出螢光物質、放射性同位素、酶和發光物質等公知的標記物質，特別優選螢光物質。 例如，作為螢光物質，可以舉出TAMRATM (Sigma Aldrich公司製造)、Alexa555、Alexa647(Invitrogen公司製造)、花青染料系的Cy3、Cy5(Amersham Biosciences公司製造)、螢光素等。 作為放射性同位素，可以舉出32 P、33 P、35 S等。 作為酶，可以舉出鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶等。 作為發光物質，可以舉出包含吖啶酯的化學發光試劑等。
作為利用螢光物質對本發明的引子進行標記的方法，例如可以舉出基於自身公知的方法將螢光素標記的核苷酸引入引子中的方法。另外，通過將具有連接臂的核苷酸置換到序列的寡核苷酸中的方法(參照Nucleic Acids Res.,1986年、第14卷、p.6115)，也能夠利用螢光物質對核苷酸進行標記。例如有下述方法：利用日本特開昭60-500717號公報中公開的合成法，由去氧尿苷化學合成在5位元具有連接臂的尿苷，合成含有該去氧尿苷的寡核苷酸，接著將螢光物質導入該寡核苷酸鏈中(日本特開昭60-500717號公報)。
作為利用放射性同位素對本發明的引子進行標記的方法，可以舉出：在合成引子時引入利用放射性同位素進行了標記的核苷酸，由此對引子進行標記的方法；在合成引子後利用放射性同位素進行標記的方法；等等。具體而言，可以舉出通常使用的隨機引子法、切口平移法、利用T4多核苷酸激酶的5’端標記法、利用末端去氧核苷酸轉移酶的3’端標記法等。
作為利用酶對本發明的引子進行標記的方法，可以舉出使鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶等酶分子與待標記的引子直接進行共價結合等直接標記法。
作為利用發光物質對本發明的引子進行標記的方法，可以舉出基於自身公知的方法對核苷酸進行發光標記的方法。
另外，也可以根據「利用了生物素-親和素反應的檢測系統」使上述標記物質與本發明的引子結合，該情況下，基於自身公知的方法進行即可。
上述PCR法中的探針(下文中有時簡記為本發明的探針)按照在利用本發明的引子對進行本發明的擴增方法時與被擴增的區域雜交的方式進行設計，只要其5’端被報告螢光色素標記、3’端被猝滅螢光色素標記，則可以為任意的探針。 作為本發明的探針的大小(鹽基數)，通常為10～50鹽基，優選15～40鹽基，更優選20～30鹽基。 作為本發明的探針，具體而言，例如在將人來源的FOXB2基因的啟動子區域中由SEQ ID NO:11所表示的鹽基序列構成的區域設定為分析物件區域的情況下，優選由SEQ ID NO:14所表示的鹽基序列構成的探針。 以下示出上述探針的鹽基序列和名稱。
【表2】
作為用報告螢光色素標記本發明的探針的5’端、用猝滅螢光色素標記3’端的方法，與利用標記物質對上述本發明的引子對進行標記的方法相同。
作為為了利用報告螢光色素和猝滅螢光色素對本發明的探針進行標記而使用的報告螢光色素，可以舉出FAM、HEX、VIC等，作為猝滅螢光色素，可以舉出TAMRA、BHQ1、BHQ2等。 需要說明的是，在使用由SEQ ID NO:14所表示的鹽基序列構成的探針作為本發明的探針的情況下，作為報告螢光色素優選FAM，作為猝滅螢光色素優選BHQ1。
另外，作為上述PCR法中的核酸合成酶，可以舉出Taq DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶等，作為核酸合成底物，可以舉出dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dGTTP)等，作為緩衝液，可以舉出Tris緩衝液、磷酸緩衝液等，只要是通常在該領域中使用的物質均可。 此外，在上述PCR用反應液中可以包含MgCl2 、KCl、(NH4 )2 SO4 等鹽、聚乙二醇、Triton(Union Carbide公司製造)、Nohidet(殼牌化學公司製造)、CHAPS(株式會社同仁化學製造)等表面活性劑、ProClin 300(Sigma Aldrich公司製造)等防腐劑、HapII、HpaII、SacII等甲基化敏感性限制酶等。
通過如此進行本發明的步驟2，能夠特異性地擴增未被本發明的步驟1中的甲基化敏感性限制酶切斷而殘存的甲基化的分析物件區域。
[ 純化步驟 ] 本發明的純化步驟是對DNA進行純化的步驟。 由此，能夠在接下來進行的處理或步驟之前將雜質除去，因而優選進行該純化步驟。 在進行本發明的純化步驟的情況下，在本發明的步驟1之後且在本發明的步驟2之前、或/和在後述的[利用在分析物件區域內不存在識別序列的限制酶進行處理的片段化步驟]之後且在本發明的步驟1之前進行該純化步驟即可。 需要說明的是，作為在本發明的步驟1之後且在本發明的步驟2之前進行該純化步驟的情況，可以舉出下述情況。 (i)在本發明的步驟1中同時進行利用S1核酸酶的處理和利用甲基化敏感性限制酶的處理的情況下，在這些處理之後且在本發明的步驟2之前進行純化步驟即可。 (ii)在本發明的步驟1中在利用S1核酸酶的處理之後進行利用甲基化敏感性限制酶的處理的情況下，在利用S1核酸酶的處理之後或/和甲基化敏感性限制酶處理之後且在本發明的步驟2之前進行純化步驟即可，優選至少在利用S1核酸酶的處理之後(且在利用甲基化敏感性限制酶的處理之前)進行純化步驟。 (iii)在本發明的步驟1中在利用甲基化敏感性限制酶的處理之後進行利用S1核酸酶的處理的情況下，在利用甲基化敏感性限制酶的處理之後或/和利用S1核酸酶的處理之後且在本發明的步驟2之前進行純化步驟即可，優選在利用甲基化敏感性限制酶的處理之後和利用S1核酸酶的處理之後且在本發明的步驟2之前分別進行純化步驟。 本發明的步驟1中的利用S1核酸酶的處理與本發明的步驟1中的利用甲基化敏感性限制酶的處理和本發明的步驟2中的優選的pH不同。因此，在上述(ii)的情況下，通過在利用S1核酸酶的處理之後接著實施該純化步驟，能夠在除去雜質的同時調整pH，高效地進行本發明的步驟1中的甲基化敏感性限制酶的反應。 另外，在上述(iii)的情況下，通過在利用甲基化敏感性限制酶的處理和利用S1核酸酶的處理後接著實施該純化步驟，能夠在除去雜質的同時調整pH，能夠高效地進行本發明的步驟2。
本發明的純化步驟只要是通常在該領域中進行的自身公知的純化方法，則沒有特別限制。具體而言，例如可以舉出醇沉澱法、柱純化法等，從能夠應用于高通量的方面出發，更優選柱純化法。
醇沉澱法是指下述方法：利用作為親水性高分子的DNA的性質，向含DNA溶液中添加醇，使DNA沉澱，由此對DNA進行純化。在利用醇沉澱法進行純化的情況下，例如如下進行即可。 即，向10～100μL含DNA溶液中加入50～100μL醇和30～100μL緩衝液，以10000～22000×g離心分離1～30分鐘，回收穿柱液，由此得到純化的DNA。 作為上述醇，可以舉出異丙醇、乙醇、丁醇等，更優選異丙醇或乙醇，進一步優選異丙醇。 作為上述緩衝液，可以舉出Tris緩衝液、磷酸緩衝液、甘氨酸緩衝液等，更優選Tris緩衝液或磷酸緩衝液，進一步優選Tris緩衝液。需要說明的是，上述緩衝液的濃度、pH只要是通常在該領域中使用的範圍即可。
另外，上述純化方法可以使用市售的試劑盒進行。
柱純化法是指下述方法：向內部具備矽膠、聚丙烯醯胺凝膠、聚丙烯醯胺葡聚糖等填充劑的柱等筒狀容器[例如，EconoSpin(GeneDesign Inc.製造)、Mobi Spin S-4000(Molecular Biotechnology公司製造)等]中添加含DNA溶液，利用DNA與填充劑的親和性的差異對DNA進行純化。在利用柱純化法進行純化的情況下，例如如下進行即可。 即，向10～150μL含DNA溶液中加入200～700μL蛋白變性劑或/和200～700μL緩衝液並混合，例如移至填充有填充劑的柱[例如，EconoSpin(GeneDesign Inc.製造)]中，以10000～22000×g在室溫下離心分離1～3分鐘，除去管內的溶液。接著，加入500～700μL緩衝液和500～700μL醇，以10000～22000×g在室溫下離心分離1～3分鐘，除去管內的溶液。進而，以10000～22000×g在室溫下離心分離1～10分鐘，更換至新的管中，加入20～60μL緩衝液或滅菌水，以10000～22000×g在室溫下離心分離1～3分鐘，回收穿柱液，由此得到純化的DNA。 作為上述蛋白變性劑，可以舉出鹽酸胍、甲醯胺、尿素等，更優選鹽酸胍。 作為上述醇，可以舉出乙醇、異丙醇、丁醇等，更優選乙醇或異丙醇，進一步優選乙醇。 作為上述緩衝液，可以舉出Tris緩衝液、磷酸緩衝液、甘氨酸緩衝液等，更優選Tris緩衝液或磷酸緩衝液，進一步優選Tris緩衝液。需要說明的是，上述緩衝液的濃度、pH為通常在該領域中使用的範圍即可。
另外，上述純化方法可以使用市售的試劑盒進行。
[ 利用在分析物件區域內不存在識別序列的限制酶進行處理的片段化步驟 ] 本發明的擴增方法中，優選在從試樣中萃取出包含分析物件區域的DNA後，進行利用在分析物件區域內不存在識別序列的限制酶進行處理的片段化步驟(下文中有時簡記為本發明的片段化步驟)。特別是，在將存在於血清、血漿、尿等體液中的CTC來源的DNA的特定區域、cfDNA的特定區域或外泌體(Exosome)來源的DNA的特定區域設定為分析物件區域的情況下，優選進行該片段化步驟。另外，在進行本發明的片段化步驟的情況下，在進行本發明的步驟1之前進行該片段化步驟即可。 本發明的片段化步驟中的限制酶只要可切斷雙鏈DNA且其識別序列不存在於分析物件區域內，則可以為任意的限制酶，根據分析物件區域適當選擇即可。此外，本發明的片段化步驟中的限制酶可以根據需要使用兩種以上。 上述「其識別序列不存在於分析物件區域內」與「限制酶的識別序列無法切斷分析物件區域」或「限制酶不識別分析物件區域中的鹽基序列」表示相同含義。 作為本發明的片段化步驟中的限制酶，在將人來源的FOXB2基因的啟動子區域中由SEQ ID NO:1所表示的鹽基序列構成的區域或犬來源的FOXB2基因的啟動子區域中由SEQ ID NO:4所表示的鹽基序列構成的區域設定為分析物件區域的情況下，優選使用BamHI或/和HindIII。另外，在將人來源的FOXB2基因的啟動子區域中由SEQ ID NO:11所表示的鹽基序列構成的區域設定為分析物件區域的情況下，優選使用MboI。
本發明的片段化步驟中的限制酶的濃度(單位數)通常相對於1～200ng目標DNA為0.5～30單位/μL，優選1～25單位/μL。另外，在使用多種限制酶進行處理的情況下，本發明的片段化步驟中的限制酶的濃度(單位數)也與上述相同，分別通常為0.5～30單位/μL，優選1～25單位/μL。 本發明的片段化步驟中的利用限制酶的處理通常在20～50℃、優選在35～40℃進行通常60～150分鐘、優選60～120分鐘反應即可。
另外，本發明的片段化步驟優選在pH6～8的條件下進行，作為此處使用的緩衝液，例如使用Tris緩衝液等即可。 需要說明的是，如上所述，本發明的片段化步驟與本發明的步驟1中的利用甲基化敏感性限制酶的處理中的優選pH相同。因此，除了本發明的步驟1中的利用甲基敏感性限制酶的處理外，可以與本發明的片段化步驟中的利用限制酶的處理同時進行利用甲基化敏感性限制酶的處理。
通過如此進行本發明的片段化步驟，能夠將DNA中的分析物件區域的外側的DNA片段化，因而能夠高效地進行後續進行的步驟的反應。 需要說明的是，在該片段化步驟之後，可以進行上述純化步驟。
[ 本發明的擴增方法的具體例 ] 關於本發明的擴增方法的具體例，以下分成(A)將存在於血清、血漿、尿等體液中的DNA的特定區域設定為分析物件區域的情況、(B)將存在於組織、細胞、全血、尿等中的DNA的特定區域設定為分析物件區域的情況來進行說明。
(A)將存在於血清、血漿、尿等體液中的DNA的特定區域(例如，由SEQ ID NO:11所表示的鹽基序列構成的區域)設定為分析物件區域的情況 (1)DNA的萃取 例如，利用核酸萃取試劑盒[例如，NucleoSpin(商標) Plasma XS(MACHEREY-NAGEL公司製造)或MagMAX™游離DNA分離試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司製造)]，從試樣(例如，血漿)中萃取DNA(例如，cfDNA)。 (2)本發明的片段化步驟 向上述(1)中得到的DNA中加入5～15μL本發明的片段化步驟中的緩衝液(例如，Tris緩衝液)和0.5～5μL 0.5～30單位/μL的片段化步驟中的限制酶(例如，MboI)，利用滅菌水製備成50～100μL。需要說明的是，優選包含0.5～5μL 1～50單位/μL的甲基化敏感性限制酶(例如，HapII或HpaII)。 之後，在20～50℃反應60～150分鐘，得到本發明的片段化步驟中處理後的溶液。 進而，根據需要，可以將本發明的片段化步驟中處理後的溶液如下付之于本發明的純化步驟。 即，向上述本發明的片段化步驟中處理後的溶液中加入500～700μL蛋白變性劑(例如，鹽酸胍)和500～700μL pH5～8的緩衝液(例如，Tris緩衝液)並混合，例如移至填充有填充劑的柱[例如，EconoSpin(GeneDesign Inc.製造)]中，以10000～22000×g在室溫下離心分離1～3分鐘，除去管內的溶液。之後，加入500～700μL pH5～8的緩衝液(例如，Tris緩衝液)和500～700μL醇(例如，乙醇)，以10000～22000×g在室溫下離心分離1～5分鐘，除去管內的溶液。再重複一次該操作，進而以10000～22000×g在室溫下離心分離1～5分鐘後，更換至新的管中，加入20～60μL滅菌水，以10000～22000×g在室溫下離心分離1～3分鐘，回收穿柱液。 將上述得到的本發明的片段化步驟中處理後的溶液或穿柱液付之于本發明的步驟1。 (3)本發明的步驟1 (3)-1 利用S1核酸酶的處理 向40～60μL上述本發明的片段化步驟中處理過的溶液或穿柱液中加入20～50μL滅菌水、5～15μL本發明的步驟1中的緩衝液(例如，乙酸鈉緩衝液)和0.5～1.5μL 1～200單位/μL的S1核酸酶，在10～37℃反應10～20分鐘，得到本發明的步驟1(利用S1核酸酶的處理)中處理後的溶液。 進而，根據需要，可以將本發明的步驟1(利用S1核酸酶的處理)中處理後的溶液如下付之于本發明的純化步驟。 即，向上述本發明的步驟1(利用S1核酸酶的處理)中處理後的溶液中加入500～700μL蛋白變性劑(例如，鹽酸胍)和500～700μL pH5～8的緩衝液(例如，Tris緩衝液)並混合，例如移至填充有填充劑的柱[例如，EconoSpin(GeneDesign Inc.製造)]中，以10000～22000×g在室溫下離心分離1～3分鐘，除去管內的溶液。之後，加入500～700μL pH5～8的緩衝液(例如，Tris緩衝液)和500～700μL醇(例如，乙醇)，以10000～22000×g在室溫下離心分離1～5分鐘，除去管內的溶液。再重複一次該操作後，進一步以10000～22000×g在室溫下離心分離1～5分鐘後，更換至新的管中，加入20～60μL滅菌水，以10000～22000×g在室溫下離心分離1～3分鐘，回收穿柱液。 將上述得到的本發明的步驟1(利用S1核酸酶的處理)中處理後的溶液或穿柱液付之于本發明的步驟1(利用甲基化敏感性限制酶的處理)。 (3)-2 利用甲基化敏感性限制酶的處理 向40～60μL上述本發明的步驟1(利用S1核酸酶的處理)中處理後的溶液或穿柱液中加入20～50μL滅菌水、5～15μL本發明的步驟1中的緩衝液(例如，Tris緩衝液)和1～5μL 1～50單位/μL的甲基化敏感性限制酶(例如，HapII或HpaII)，在20～50℃反應60～150分鐘，得到本發明的步驟1(利用甲基化敏感性限制酶的處理)中處理後的溶液。 進而，根據需要，可以將本發明的步驟1(利用甲基化敏感性限制酶的處理)中處理後的溶液如下付之于本發明的純化步驟。 即，向上述本發明的步驟1(利用甲基化敏感性限制酶的處理)中處理後的溶液中加入500～700μL蛋白變性劑(例如，鹽酸胍)和500～700μL pH5～8的緩衝液(例如，Tris緩衝液)並混合，例如移至填充有填充劑的柱[例如，EconoSpin(GeneDesign Inc.製造)]中，以10000～22000×g在室溫下離心分離1～3分鐘，除去管內的溶液。之後，加入500～700μL pH5～8的緩衝液(例如，Tris緩衝液)和500～700μL醇(例如，乙醇)，以10000～22000×g在室溫下離心分離1～5分鐘，除去管內的溶液。再重複一次該操作，進一步以10000～22000×g在室溫下離心分離1～5分鐘後，更換至新的管中，加入20～60μL滅菌水，以10000～22000×g在室溫下離心分離1～3分鐘，回收穿柱液。 將上述得到的本發明的步驟1(利用甲基化敏感性限制酶的處理)中處理後的溶液或穿柱液付之于本發明的步驟2。 (4)本發明的擴增方法的步驟2 向1～3μL上述本發明的步驟1中處理後的溶液或穿柱液中加入4～6μL滅菌水、5～12μL包含核酸合成底物、核酸合成酶等的數位PCR用試劑[例如，ddPCRTM Supermix for Probes(Bio-Rad Laboratories公司製造)]、0.5～1.5μL 1～20μM的正向引子(例如，hcf-F-fox)、0.5～1.5μL 1～20μM的反向引子(例如，hcf-R-fox)、0.5～1μL 1～10μM的探針(例如，hcf-Probe fox)和0.5～1.5μL 1～50單位/μL的甲基化敏感性限制酶(例如，HapII或HpaII)，製備數位PCR用反應液。接著，將上述數位PCR用反應液設置於核酸擴增裝置[例如，熱循環儀(Bio-Rad公司製造)]中，在30～40℃溫育30～60分鐘。之後，利用液滴製作裝置[例如，QX 200液滴發生器(Bio-Rad Laboratories公司製造)或自動化液滴發生器(Bio-Rad Laboratories公司製造)]製作液滴。接著，將該液滴分注至微孔板(例如，96孔板)中後，利用核酸擴增裝置[例如，熱循環儀(Bio-Rad公司製造)]在90～97℃加熱5～15分鐘，之後以(1)90～95℃下25～30秒、(2)60～65℃下30～90秒作為1個循環，加熱30～50個循環，由此能夠擴增甲基化的分析物件區域(例如，由SEQ ID NO:11所表示的鹽基序列構成的區域)。
(B)將存在於組織、細胞、全血、尿等中的DNA的特定區域(例如，由SEQ ID NO:1所表示的鹽基序列構成的區域)設定為分析物件區域的情況
(1)DNA的萃取 例如，利用核酸萃取試劑盒[例如，QuickGene SP組織DNA 萃取試劑盒(倉敷紡績株式會社製造)]，從試樣(例如，細胞)中萃取DNA(例如，基因組DNA)。 (2)本發明的片段化步驟 向上述(1)中得到的DNA中加入3～7μL本發明的片段化步驟中的緩衝液(例如，Tris緩衝液)和0.5～1.5μL 0.5～25單位/μL的片段化步驟中的限制酶(例如，BamHI或/和HindIII)，用滅菌水製備成30～60μL。之後，在20～50℃反應40～80分鐘，得到本發明的片段化步驟中處理後的溶液。 進而，根據需要，可以將本發明的片段化步驟中處理後的溶液如下付之于本發明的純化步驟。 即，向上述本發明的片段化步驟中處理後的溶液中加入200～300μL蛋白變性劑(例如，鹽酸胍)和200～300μL pH5～8的緩衝液(例如，Tris緩衝液)並混合，例如移至填充有填充劑的柱[例如，EconoSpin(GeneDesign Inc.製造)]中，以10000～22000×g在室溫下離心分離1～3分鐘，除去管內的溶液。之後，加入500～700μL pH5～8的緩衝液(例如，Tris緩衝液)和500～700μL醇(例如，乙醇)，以10000～22000×g在室溫下離心分離1～5分鐘，更換至新的管中，加入20～40μL緩衝液(例如，Tris緩衝液)，以10000～22000×g在室溫下離心分離1～3分鐘，回收穿柱液。 將上述得到的本發明的片段化步驟中處理後的溶液或穿柱液付之于本發明的步驟1。 (3)本發明的步驟1 (3)-1 利用S1核酸酶的處理 向20～40μL上述本發明的片段化步驟中處理後的溶液或穿柱液中加入15～25μL滅菌水、2～6μL本發明的步驟1中的緩衝液(例如，乙酸鈉緩衝液)和0.5～1.5μL 1～200單位/μL的S1核酸酶，在10～37℃反應10～20分鐘。之後，加入0.5～1.5μL反應停止液(例如，0.5M EDTA)，用25～35μL的緩衝液(例如，Tris緩衝液)溶出，得到本發明的步驟1(利用S1核酸酶的處理)中處理後的溶液。 進而，根據需要，可以將本發明的步驟1中處理後的溶液如下付之于本發明的純化步驟。 即，向10～20μL上述本發明的步驟1(利用S1核酸酶的處理)中處理後的溶液中加入200～300μL蛋白變性劑(例如，鹽酸胍)和200～300μL pH5～8的緩衝液(例如，Tris緩衝液)並混合，例如移至填充有填充劑的柱[例如，EconoSpin(GeneDesign Inc.製造)]中，以10000～22000×g在室溫下離心分離1～3分鐘，除去管內的溶液。之後，加入500～700μL pH5～8的緩衝液(例如，Tris緩衝液)和500～700μL醇(例如，乙醇)，以10000～22000×g在室溫下離心分離1～5分鐘，更換至新的管中，加入20～40μL緩衝液(例如，Tris緩衝液)，以10000～22000×g在室溫下離心分離1～3分鐘，回收穿柱液。 將上述得到的本發明的步驟1(利用S1核酸酶的處理)中處理後的溶液或穿柱液付之于本發明的步驟1(利用甲基化敏感性限制酶的處理)。 (3)-2 利用甲基化敏感性限制酶的處理 向20～30μL上述本發明的步驟1(利用S1核酸酶的處理)中處理後的溶液或穿柱液中加入5～15μL滅菌水、2～6μL本發明的步驟1中的緩衝液(例如，Tris緩衝液)和0.5～1.5μL 1～50單位/μL的甲基化敏感性限制酶(例如，HapII、HpaII或SacII)，在20～50℃反應60～150分鐘，得到本發明的步驟1(利用甲基化敏感性限制酶的處理)中處理後的溶液。 進而，根據需要，可以將本發明的步驟1(利用甲基化敏感性限制酶的處理)中處理後的溶液如下付之于本發明的純化步驟。 即，向上述本發明的步驟1(利用甲基化敏感性限制酶的處理)中處理後的溶液中加入200～300μL蛋白變性劑(例如，鹽酸胍)和200～300μL pH5～8的緩衝液(例如，Tris緩衝液)並混合，例如移至填充有填充劑的柱[例如，EconoSpin(GeneDesign Inc.製造)]中，以10000～22000×g在室溫下離心分離1～3分鐘，除去管內的溶液。之後，加入500～700μL pH5～8的緩衝液(例如，Tris緩衝液)和500～700μL醇(例如，乙醇)，以10000～22000×g在室溫下離心分離1～5分鐘，更換至新的管中，加入20～40μL緩衝液(例如，Tris緩衝液)，以10000～22000×g在室溫下離心分離1～3分鐘，回收穿柱液。 將上述得到的本發明的步驟1(利用甲基化敏感性限制酶的處理)中處理後的溶液或穿柱液付之于本發明的步驟2。 (4)本發明的步驟2 向0.5～1.5μL上述本發明的步驟1中處理後的溶液或穿柱液中加入15～20μL滅菌水、2～3μL PCR反應用緩衝液(例如，Tris緩衝液)、1.5～2.5μL核酸合成底物、0.1～0.3μL 1～10單位/μL的核酸合成酶、0.5～1.5μL 5～15μM的正向引子(例如，h-F-fox)和0.5～1.5μL 5～15μM的反向引子(例如，h-R-fox)，製備PCR用反應液。接著，利用核酸擴增裝置[例如，熱循環儀(Bio-Rad Laboratories公司製造)]在92～96℃加熱1～3分鐘後，以(1)92～98℃下2～10秒、(2)65～72℃下10～20秒作為1個循環，加熱30～60個循環後，進一步在65～72℃加熱50～70秒，由此能夠擴增甲基化的分析物件區域(例如，由SEQ ID NO:1所表示的鹽基序列構成的區域)。
將本發明的擴增方法的流程圖分成各種模式示於圖1。作為本發明的擴增方法，可以舉出模式1～5的方法，更優選模式1～3，進一步優選模式1或2，特別優選模式1。
＜本發明的甲基化判定方法＞ 本發明的甲基化判定方法基於利用本發明的擴增方法得到的結果來判定分析物件區域是否被甲基化。 即，該甲基化判定方法是在上述本發明的擴增方法之後接著進行擴增產物的確認和判定分析物件區域是否被甲基化的方法，其特徵在於，包括：(1)利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶進行處理的步驟1；(2)對步驟1中處理後的雙鏈DNA的分析物件區域進行擴增的步驟2；(3)確認步驟2中得到的擴增產物的有無的步驟3；(4)基於步驟3的結果來判定分析物件區域是否被甲基化的步驟4。 需要說明的是，至獲得擴增產物為止的步驟3之前的步驟(步驟1和2)與上述本發明的擴增方法相同，其具體例、優選例等也相同。下面，對步驟3之後進行詳細說明。
[ 步驟 3] 本發明的步驟3是確認本發明的步驟2中得到的擴增產物的有無的步驟。即，在本發明的步驟2中，甲基化的分析物件區域被擴增，因而，本發明的步驟3是確認該甲基化的分析物件區域的有無的步驟。
本發明的步驟3中的確認擴增產物的有無的方法只要是通常在該領域中進行的方法，則沒有特別限制，基於自身公知的方法進行即可。 具體而言，例如可以舉出(a)通過電泳來確認的方法；(b)通過螢光酶標儀來確認的方法；等等。
(a)通過電泳來確認的方法 通過電泳來確認的方法是指通過電泳來分離、確認本發明的步驟2中得到的擴增產物的方法，作為具體方法，可以舉出(a-1)標記引子法、(a-2)嵌和劑法、(a-3)標記探針法等。
(a-1)標記引子法 標記引子法是指下述方法：「使用包含利用標記物質對本發明的引子中的至少一者進行了標記的標記引子的引子對，進行本發明的步驟2。接著，通過電泳將所得到的擴增產物分離，對該擴增產物中的標記進行檢測，由此確認本發明的步驟2中得到的擴增產物的有無」。 需要說明的是，本說明書中，「對標記進行檢測」是指，基於標記物質的性質直接或間接地測定標記物質。 作為標記引子法中的電泳，只要基於依賴於物質的帶電強度而以不同速度移動或移動不同距離的方法即可，具體而言，例如可以舉出瓊脂糖凝膠電泳法、丙烯醯胺凝膠電泳法、毛細管電泳法等，更優選瓊脂糖凝膠電泳法或毛細管電泳法。 需要说明的是，上述瓊脂糖凝膠電泳法例如基於「バイオ実験イラステッドＩＩ遺伝子解析の基礎(生物實驗圖解II基因分析的基礎), 2006, p.p. 53-56」中記載的方法進行即可。另外，上述毛細管電泳法例如基於WO2007/027495、WO2011/118496、WO2008/075520等中記載的方法進行即可。
(a-2)嵌和劑法 嵌和劑法是指下述方法：「使用本發明的引子對進行本發明的步驟2，通過電泳將所得到的擴增產物分離。接著，利用嵌和劑將該擴增產物染色，對該嵌和劑來源的螢光進行檢測，由此確認本發明的步驟2中得到的擴增產物的有無」。 作為嵌和劑法中的電泳，可以舉出與(a-1)標記引子法相同的電泳，優選的電泳也相同。 另外，作為嵌和劑法中的嵌和劑，只要是通常在該領域中使用的嵌和劑，則可以為任意的嵌和劑。具體而言，例如可以舉出(1)～(5)的嵌和劑以及下述(6)和(7)的嵌和劑類似物質。 可以舉出： (1)乙錠化合物[例如，溴化乙錠、乙錠均二聚物1(EthD-1)、乙錠均二聚物2(EthD-2)、溴化乙錠單疊氮溴(EMA)、二氫乙錠等]、 (2)吖啶色素(例如，吖啶橙等)、 (3)碘化合物(碘化丙啶、碘化己錠等)、花青二聚物系色素[例如，POPO-1、BOBO-1、YOYO-1、TOTO-1、JOJO-1、POPO-3、LOLO-1、BOBO-3、YOYO-3、TOTO-3(均為Molecular Probes公司製造)等]、 (4)花青單體系色素[例如，PO-PRO-1、BO-PRO-1、YO-PRO-1、TO-PRO-1、JO-PRO-1、PO-PRO-3、LO-PRO-1、BO-PRO-3、YO-PRO-3、TO-PRO-3、TO-PRO-5(均為Molecular Probes公司製造)等]、 (5)SYTOX系色素[例如，SYBR金、SYBR綠I、SYBR綠II、SYTOX綠、SYTOX藍、SYTOX橙(均為Molecular Probes公司製造)等]、GelRed系色素[例如，GelRed核酸凝膠染色液(和光純藥工業株式會社製造)等]、 (6)與DNA雙螺旋的小溝結合的物質[例如，4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI：Molecular Probes公司製造)等]、 (7)與腺嘌呤-胸腺嘧啶(A-T)序列特異性地結合的物質[例如，五水合物(雙苯醯亞胺)(Hoechst 33258：Molecular Probes公司製造)、三鹽酸鹽(Hoechst 33342：Molecular Probes公司製造)、雙苯醯亞胺色素(Hoechst 34580：Molecular Probes公司製造)等]。其中，更優選SYTOX系色素[例如，SYBR金、SYBR綠I、SYBR綠II、SYTOX綠、SYTOX藍、SYTOX橙(均為Molecular Probes公司製造)等]、GelRed系色素[例如，GelRed核酸凝膠染色液(和光純藥工業株式會社製造)等]，特別優選GelRed系色素[例如，GelRed核酸凝膠染色液(和光純藥工業株式會社製造)等]。
(a-3)標記探針法 標記探針法是指下述方法：「使用本發明的引子對進行本發明的步驟2，通過電泳將所得到的擴增產物分離。接著，對該擴增產物進行熱處理，由此形成單鏈。接著，使利用標記物質進行了標記的、具有與該擴增產物的鹽基序列互補的鹽基序列的探針進行雜交，由此得到雜交體，對該雜交體中的標記進行檢測，由此確認本發明的步驟2中得到的擴增產物的有無」。 作為標記探針中的電泳，可以舉出與(a-1)標記引子法相同的電泳，優選的電泳也相同。
(b)通過螢光酶標儀來檢測的方法 通過螢光酶標儀來檢測的方法是指下述方法：「進行使用本發明的引子對和探針的本發明的步驟2，之後，利用螢光酶標儀對各液滴來源的螢光進行檢測，由此確認本發明的步驟2中得到的擴增產物的有無」。 作為通過螢光酶標儀來檢測的方法中的螢光酶標儀，使用數位PCR裝置附帶的螢光酶標儀[例如，QX200 Droplet Reader(Bio-Rad Laboratories公司製造)等]即可。
通過如此進行本發明的步驟3，能夠確認甲基化的分析物件區域是否被擴增。
[ 步驟 4] 本發明的甲基化判定方法的步驟4是基於本發明的步驟3的結果來判定分析物件區域是否被甲基化的步驟。 即，本發明的分析物件區域是否被甲基化的判定基於本發明的步驟2中所擴增的擴增產物的有無的確認結果來進行。在分析物件區域被甲基化的情況下，在本發明的步驟2中，該分析物件區域被擴增，因而得到擴增產物。另一方面，在分析物件區域未被甲基化的情況下，在本發明的步驟2中，該分析物件區域未被擴增，因而未得到擴增產物。這是由本發明的步驟1中的甲基化敏感性限制酶的性質決定的。 即，在分析物件區域被甲基化的情況下，即使利用甲基化敏感性限制酶進行處理，分析物件區域也不被切斷，因而，在本發明的步驟2的擴增反應中分析物件區域被擴增，在本發明的步驟3中確認到擴增產物。 另一方面，在分析物件區域未被甲基化的情況下，分析物件區域被甲基化敏感性限制酶切斷，因而，在本發明的步驟2中分析物件區域不被擴增，在本發明的步驟3中未確認到擴增產物。 因此，在本發明的步驟3中進行(a)通過電泳來確認的方法的情況下，(i)在確認到擴增產物的情況下，可以判定該分析物件區域被甲基化，(ii)在未確認到擴增產物的情況下，可以判定該分析物件區域未被甲基化。 另一方面，在本發明的步驟3中進行(b)通過螢光酶標儀來確認的方法的情況下，(i)在確認到至少1個發出超過預先設定的閾值的螢光的液滴的情況下，可以判定該分析物件區域被甲基化，(ii)在未確認到發出超過預先設定的閾值的螢光的液滴的情況下，可以判定該分析物件區域未被甲基化。 需要說明的是，關於上述閾值，可以根據上述螢光酶標儀[例如，QX200 Droplet Reader(Bio-Rad Laboratories公司製造)]的閾值設定功能來決定，也可以由對分析物件區域進行擴增的結果來決定。
通過如此進行本發明的甲基化判定方法的步驟4，能夠進行分析物件區域是否被甲基化的判定。
另外，本發明的甲基化判定方法通過如上確認擴增產物的有無，能夠判定分析物件區域是否被甲基化，因此是非常簡便的方法。
[ 本發明的甲基化判定方法的具體例 ] 關於本發明的甲基化判定方法的具體例，以下分成(A)將存在於血清、血漿、尿等體液中的DNA的特定區域設定為分析物件區域的情況、(B)將存在於組織、細胞、全血、尿等中的DNA的特定區域設定為分析物件區域的情況來進行說明。
(A)將存在於血清、血漿、尿等體液中的DNA的特定區域(例如，由SEQ ID NO:11所表示的鹽基序列構成的區域)設定為分析物件區域的情況 關於(1)DNA的萃取、(2)本發明的片段化步驟、(3)本發明的步驟1和(4)本發明的步驟2，如[本發明的擴增方法的具體例]中所說明的那樣。 (5)本發明的步驟3 利用螢光酶標儀[例如，QX200 Droplet Reader(Bio-Rad Laboratories公司製造)等]，對各液滴中的上述本發明的步驟2中所擴增的擴增產物中的螢光進行檢測，由此能夠確認上述本發明的步驟2中擴增的擴增產物的有無。 (6)本發明的甲基化判定方法的步驟4 上述本發明的步驟3的擴增產物有無的確認結果，在確認到至少1個發出超過預先設定的閾值的螢光的液滴的情況下，可以判定「該分析物件區域被甲基化」。另一方面，在未確認到發出超過預先設定的閾值的螢光的液滴的情況下，可以判定「該分析物件區域未被甲基化」。
(B)將存在於組織、細胞、全血、尿等中的DNA的特定區域設定為分析物件區域(例如，由SEQ ID NO:1所表示的鹽基序列構成的區域)的情況 關於(1)DNA的萃取、(2)本發明的片段化步驟、(3)本發明的步驟1和(4)本發明的步驟2，如[本發明的擴增方法的具體例]中所說明的那樣。 (5)本發明的步驟3 將上述本發明的步驟2中所擴增的擴增產物與分子量標記物一起付之於0.5～5%的瓊脂糖凝膠電泳。接著，利用嵌和劑[例如，GelRed核酸凝膠染色液(和光純藥工業株式會社製造)等]進行染色後，照射UV，對擴增產物進行檢測，由此能夠確認上述本發明的步驟2中所擴增的擴增產物的有無。 (6)本發明的甲基化判定方法的步驟4 上述本發明的步驟3的擴增產物有無的確認結果，在確認到擴增產物的情況下，可以判定「該分析物件區域被甲基化」。另一方面，在未確認到擴增產物的情況下，可以判定「該分析物件區域未被甲基化」。
將本發明的甲基化判定方法的流程圖分成各種模式示於圖2。作為本發明的甲基化判定方法，可以舉出模式1～5的方法，更優選模式1～3，進一步優選模式1或2，特別優選模式1。
需要說明的是，在進行了本發明的甲基化判定方法後，可以根據需要進行亞硫酸氫鹽序列分析、微陣列分析等。由此，不僅可知本發明的分析物件區域是否被甲基化，還可知哪個CpG序列被甲基化。
＜本發明的甲基化判定用試劑＞ 本發明的甲基化判定用試劑的特徵在於，包含S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶。 本發明的甲基化判定用試劑中所用的甲基化敏感性限制酶的具體例和優選例如上所述。 此外，也可以加上在該領域中通常使用的下述試劑類中的任意1種而製成本發明的判定用試劑。 a)DNA純化用的柱[例如，EconoSpin(GeneDesign Inc.製造)等]、 b)PCR等的擴增反應用試劑(例如，1種或多種引子、探針、核酸合成底物、核酸合成酶等)、 c)片段化用的限制酶、 d)核酸擴增產物確認用試劑[例如，瓊脂糖凝膠、上樣緩衝液、染色用試劑(Gel Red系染色液、溴化乙錠等)]、 e)DNA萃取用試劑[例如，QuickGene SP組織DNA萃取試劑盒(倉敷紡績株式會社製造)、NucleoSpin(商標) Plasma XS(MACHEREY-NAGEL公司製造)或MagMAX™游離DNA分離試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司製造)等]。 另外，本發明的甲基化判定用試劑中也可以包含用於實施本發明的甲基化判定方法的說明書等。該「說明書」是指通過文章或圖表等實質性地記載了本發明的甲基化判定方法中的特點、原理和操作步驟等的本發明的甲基化判定用試劑的操作說明書、附加文章或小冊子(傳單)等。 如此利用本發明的甲基化判定用試劑，能夠簡便、以短時間且高精度地進行本發明的甲基化判定方法。
＜本發明的癌症的判定方法＞ 本發明的癌症的判定方法基於利用本發明的擴增方法得到的結果，對於進行是否為癌症的判定的對象做出癌症的判定。即，該癌症的判定方法是在上述本發明的擴增方法後接著進行確認擴增產物的步驟和判定癌症的步驟的方法，其特徵在於，包括：(1)利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶對包含分析物件區域的DNA進行處理的步驟1；(2)對步驟1中處理後的雙鏈DNA的分析物件區域進行擴增的步驟2；(3)確認步驟2中得到的擴增產物的有無的步驟3；(4)基於步驟3的結果對癌症進行判定的步驟4。 需要說明的是，至獲得擴增產物為止的步驟3之前的步驟(步驟1～2)與上述本發明的擴增方法相同，其具體例、優選例等也相同。另外，進行擴增產物的確認的步驟3與上述本發明的甲基化判定方法相同，其具體例、優選例等也相同。
[ 癌症 ] 本發明的癌症的判定方法所涉及的癌症是指特徵在於通過無法控制的細胞分裂和浸潤向相鄰組織直接增殖或轉移等的疾病或疾患。作為通過本發明的判定方法判定的癌症的具體例，可以舉出細胞癌、腺癌、淋巴瘤、白血病、肉瘤、間皮瘤、神經瘤、骨肉瘤、生殖細胞瘤、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、結腸直腸癌、胃腸癌、膀胱癌、胰腺癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、卵巢癌、黑色素瘤、腦癌、睾丸癌、腎癌、皮膚癌、甲狀腺癌、頭頸癌、肝癌、食道癌、胃癌、大腸癌、骨髄癌、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤等，更優選肺癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、胃癌或大腸癌。
[ 步驟 4] 本發明的癌症的判定方法的步驟4是基於本發明的步驟3的結果進行癌症的判定的步驟。即，基於本發明的步驟2中所擴增的擴增產物的有無的確認結果來進行。 本發明的癌症的判定方法的步驟4中的癌症的判定使用由本發明的步驟1～3的結果得到的資料來進行。即，對本發明的步驟2中所擴增的目標擴增產物進行檢測，在得到檢測出該擴增產物的結果時，對於進行是否為癌症的判定的物件做出癌症的判定。
上述進行是否為癌症的判定的物件根據包含分析物件區域的DNA來源的試樣來確定。 例如，在包含分析物件區域的DNA來源的試樣為組織、細胞等的情況下，進行是否為癌症的判定的物件為該組織、細胞等自身、以及該組織、細胞等所來源的動物。即，在包含分析物件區域的DNA來源的試樣為組織、細胞等的情況下，判定該組織、細胞等自身是否癌(化)，進而判定該組織、細胞等所來源的動物是否罹患癌症或該動物中是否存在癌細胞。 另一方面，在包含分析物件區域的DNA來源的試樣為全血、血清、血漿、尿等體液的情況下，進行是否為癌症的判定的物件如下所述。 在包含分析物件區域的DNA來自上述全血、血清、血漿、尿等體液中的細胞(白細胞等血液細胞、各組織來源的細胞、CTC等)的情況下，為該細胞自身、以及該細胞所來源的動物。即，在包含分析物件區域的DNA來自全血、血清、血漿、尿等體液中的細胞(白細胞等血液細胞、各組織來源的細胞、CTC等)的情況下，判定該細胞自身是否癌(化)，進而判定該細胞所來源的動物是否罹患癌症或該動物中是否存在癌細胞。 另外，在包含分析物件區域的DNA來自上述血清、血漿、尿等體液中的cfDNA、外泌體(Exosome)等的情況下，進行是否為癌症的判定的物件為上述血清、血漿、尿等體液所來源的動物。即，在包含分析物件區域的DNA來自上述血清、血漿、尿等體液中的cfDNA、外泌體(Exosome)等的情況下，判定上述血清、血漿、尿等體液所來源的動物是否罹患癌症或該動物中是否存在癌細胞。
在進行是否為癌症的判定的物件罹患癌症或該物件中存在癌細胞的情況下，在本發明的步驟2中，該分析物件區域被擴增，因而獲得擴增產物。另一方面，在進行是否為癌症的判定的物件未罹患癌症或該物件中不存在癌細胞的情況下，在本發明的步驟2中，該分析物件區域不被擴增，因而未檢測出擴增產物。這是由本發明的步驟1中的甲基化敏感性限制酶的性質決定的。 即，在分析物件區域被甲基化的情況下，即使用甲基化敏感性限制酶進行處理，分析物件區域也不被切斷，因而，在本發明的步驟2的擴增反應中分析物件區域被擴增，在本發明的步驟3中確認到擴增產物。 另一方面，在分析物件區域未被甲基化的情況下，分析物件區域被甲基化敏感性限制酶切斷，因而，在本發明的步驟2中分析物件區域不被擴增，在本發明的步驟3中未確認到擴增產物。 因此，在本發明的步驟3中進行(a)通過電泳來確認的方法的情況下，(i)在確認到擴增產物的情況下，可以判定，進行是否為該分析物件區域來源的癌症的判定的物件罹患癌症或該對象中存在癌細胞，(ii)在未確認到擴增產物的情況下，可以判定，進行是否為該分析物件區域來源的癌症的判定的物件未罹患癌症或該對象中不存在癌細胞。 另一方面，在本發明的步驟3中進行(b)通過螢光酶標儀來確認的方法的情況下，(i)在確認到至少1個發出超過預先設定的閾值的螢光的液滴的情況下，可以判定，進行是否為該分析物件區域來源的癌症的判定的物件罹患癌症或該對象中存在癌細胞，(ii)在未確認到發出超過預先設定的閾值的螢光的液滴的情況下，可以判定，進行是否為該分析物件區域來源的癌症的判定的物件未罹患癌症或該對象中不存在癌細胞。 需要說明的是，關於上述閾值，可以根據上述螢光酶標儀[例如，QX200 Droplet Reader(Bio-Rad Laboratories公司製造)]的閾值設定功能來決定，也可以由對分析物件區域進行擴增的結果來決定。
通過如此進行本發明的癌症的判定方法的步驟4，能夠進行癌症的判定。
這樣，本發明的癌症的判定方法僅通過確認擴增產物的有無即可，因而是非常簡便的方法。
[ 本發明的癌症的判定方法的具體例 ] 關於本發明的癌症的判定方法的具體例，以下分成(A)將存在於血清、血漿、尿等體液中的DNA的特定區域設定為分析物件區域的情況、(B)將存在於組織、細胞、全血、尿等中的DNA的特定區域設定為分析物件區域的情況來進行說明。
(A)將存在於血清、血漿、尿等體液中的DNA的特定區域(例如，由SEQ ID NO:11所表示的鹽基序列構成的區域)設定為分析物件區域的情況 關於(1)DNA的萃取、(2)本發明的片段化步驟、(3)本發明的步驟1和(4)本發明的步驟2，如[本發明的擴增方法的具體例]中所說明的那樣。另外，關於(5)本發明的步驟3，如[本發明的甲基化判定方法的具體例]中所說明的那樣。 (6)本發明的癌症的判定方法的步驟4 本發明的步驟3的擴增產物有無的確認結果，在確認到至少1個發出超過預先設定的閾值的螢光的液滴的情況下，可以判定「進行是否為該分析物件區域來源的癌症的判定的物件罹患癌症或該對象中存在癌細胞」。另一方面，在未確認到至少1個發出超過預先設定的閾值的螢光的液滴的情況下，可以判定「進行是否為該分析物件區域來源的癌症的判定的物件未罹患癌症或該對象中不存在癌細胞」。 (B)將存在於組織、細胞、全血、尿等中的DNA的特定區域(例如，由SEQ ID NO:1所表示的鹽基序列構成的區域)設定為分析物件區域的情況 關於(1)DNA的萃取、(2)本發明的片段化步驟、(3)本發明的步驟1和(4)本發明的步驟2，如[本發明的擴增方法的具體例]中所說明的那樣。另外，關於(5)本發明的步驟3，如[本發明的甲基化判定方法的具體例]中所說明的那樣。 (6)本發明的癌症的判定方法的步驟4 本發明的步驟3的擴增產物有無的確認結果，在確認到擴增產物的情況下，可以判定「進行是否為該分析物件區域來源的癌症的判定的物件罹患癌症或該對象中存在癌細胞」。另一方面，在未確認到擴增產物的情況下，可以判定「進行是否為該分析物件區域來源的癌症的判定的物件未罹患癌症或該對象中不存在癌細胞」。
將本發明的癌症的判定方法的流程圖分成各種模式示於圖2。作為本發明的癌症的判定方法，可以舉出模式1～5的方法，更優選模式1～3，進一步優選模式1或2，特別優選模式1。
＜本發明的獲得用於進行癌症的判定的資料的方法＞ 本發明的獲得用於進行癌症的判定的資料的方法(下文中有時簡記為本發明的獲得資料的方法)基於利用本發明的擴增方法得到的結果，獲得用於對於進行是否為癌症的判定的物件做出癌症的判定的資料。即，該獲得用於進行癌症的判定的資料的方法是在上述本發明的擴增方法後接著進行確認擴增產物的有無的步驟的方法，其特徵在於，包括：(1)利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶對包含分析物件區域的DNA進行處理的步驟1；(2)對步驟1中處理後的雙鏈DNA的分析物件區域進行擴增的步驟2；(3)確認步驟2中得到的擴增產物的有無的步驟3。 需要說明的是，至獲得擴增產物為止的步驟3之前的步驟(步驟1和2)與上述本發明的擴增方法相同，其具體例、優選例等也相同。另外，進行擴增產物的確認的步驟3與上述本發明的甲基化判定方法相同，其具體例、優選例等也相同。
＜本發明的癌症的判定用試劑＞ 本發明的癌症的判定用試劑(下文中有時簡記為本發明的癌症的判定用試劑)的特徵在於，包含S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶。 本發明的癌症的判定用試劑中使用的甲基化敏感性限制酶的具體例和優選例如如上所述。 此外，也可以加上該領域中通常使用的下述試劑類中的任意1種以上而製成本發明的判定用試劑。 a)DNA純化用的柱[例如，EconoSpin(GeneDesign Inc.製造)等]、 b)PCR等的擴增反應用試劑(例如，1種或2種以上的引子、探針、核酸合成底物、核酸合成酶等)、 c)片段化用的限制酶、 d)核酸擴增產物確認用試劑[例如，瓊脂糖凝膠、上樣緩衝液、染色用試劑(Gel Red系染色液、溴化乙錠等)]、 e)DNA萃取用試劑[例如，QuickGene SP組織DNA萃取試劑盒(倉敷紡績株式會社製造)、NucleoSpin(商標) Plasma XS(MACHEREY-NAGEL公司製造)或MagMAX™游離DNA分離試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司製造)等]。 另外，本發明的癌症的判定用試劑中也可以包含用於實施本發明的癌症的判定方法的說明書等。該「說明書」是指通過文章或圖表等實質性地記載了本發明的癌症的判定方法中的特點、原理和操作步驟等的本發明的癌症的判定用試劑的操作說明書、附加文章或小冊子(傳單)等。 如此利用本發明的癌症的判定用試劑，能夠簡便、短時間且高精度地進行本發明的癌症的判定方法。
＜本發明的用於進行癌症的判定的標記物＞ 本發明的用於進行癌症的判定的標記物(下文中有時簡記為本發明的標記物)是通過進行本發明的擴增方法而得到的擴增產物，是能夠對於根據該標記物(擴增產物)的有無來進行是否為分析物件區域來源的癌症的判定的物件做出癌症的判定的標記物。即，其是通過進行(1)利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶對包含分析物件區域的DNA進行處理的步驟1、(2)對步驟1中處理後的雙鏈DNA的分析物件區域進行擴增的步驟2而獲得的標記物。 需要說明的是，至獲得擴增產物為止的步驟3之前的步驟(步驟1和2)與上述本發明的擴增方法相同，其具體例、優選例等也相同。另外，關於癌症和進行是否為癌症的判定的物件，與本發明的癌症的判定方法相同，其具體例、優選例等也相同。
＜檢測本發明的標記物的方法＞ 檢測本發明的標記物的方法利用自身公知的方法對本發明的標記物進行檢測，優選利用本發明的步驟3中說明的方法進行檢測。
通過如此使用本發明的標記物，能夠簡便、短時間且高精度地進行本發明的癌症的判定方法。
下面，通過實施例等詳細說明本發明，但本發明不受這些實施例等的任何限定。 實施例
實驗例 1 各種正常細胞和各種癌細胞來源的 DNA 的甲基化狀態的確認 對於下述各種正常細胞和各種癌細胞來源的DNA，利用亞硫酸氫鹽序列分析進行了甲基化狀態的確認。
(1)條件的設定 如下設定了試樣和甲基化狀態的確認區域。 ･試樣 人誘導性多能幹細胞(hiPS)：正常細胞 正常纖維母細胞(HDF)：正常細胞 膠質母細胞瘤細胞(U251-MG-P1)：癌細胞 乳腺癌細胞(MCF-7)：癌細胞 前列腺癌細胞(LNCap clone FGC)：癌細胞 髄性白血病細胞(HL60)：癌細胞 ･甲基化狀態的確認區域 在人來源的FOXB2基因啟動子區域內的由SEQ ID NO:1所表示的鹽基序列構成的區域(267鹽基對)記憶體在的、圖3中所示的由四邊形圍起的3個包含CpG序列的序列(CCGG)
(2)基因組DNA的萃取 使用QuickGene SP組織DNA萃取試劑盒(倉敷紡績株式會社製造)，由上述各種細胞分別萃取出基因組DNA。
(3)亞硫酸氫鹽反應 將400ng上述(2)中得到的基因組DNA分別溶解於10μL的蒸餾水中。之後，使用Episight亞硫酸氫鹽轉化試劑盒(和光純藥工業株式會社製造)，依照試劑盒所記載的方法對該溶液分別進行亞硫酸氫鹽反應。
(4)PCR擴增反應 在上述(3)中得到的含有亞硫酸氫鹽反應產物的溶液1μL中分別加入17.3μL蒸餾水、2.5μL Blend Taq用10×緩衝液(東洋紡株式會社製造)、2μL 2mM dNTPs(東洋紡株式會社製造)、0.2μL 2.5單位/μL的Blend Taq-Plus(東洋紡株式會社製造)、1μL 10μM的正向引子[GGAATTAGTGGGGGCAGCCAGGCCCCAGG(SEQ ID NO:7)]和1μL 10μM的反向引子[CCCAAAAACTACCCTTACCAAACTAATC(SEQ ID NO:8)]並混合，將其作為PCR用反應液。 接著，將上述PCR用反應液分別設置於熱循環儀(Bio-Rad Laboratories公司製造)中，以下述反應條件進行PCR擴增反應。 ※反應條件 94℃ 2分鐘 ↓ 以94℃ 10秒→55℃ 10秒→72℃ 20秒為1個循環，進行36個循環 ↓ 72℃ 2分鐘
(5)PCR擴增產物的選殖 利用1.5%瓊脂糖凝膠，對上述(4)中得到的PCR擴增產物分別進行電泳。電泳後，用GelRed核酸凝膠染色液(和光純藥工業株式會社製造)進行染色，使用QIAquick凝膠萃取試劑盒(QIAGEN公司製造)分別回收PCR擴增產物。
(6)用於對PCR擴增產物附加限制酶識別位點的PCR擴增反應 在上述(5)中得到的含PCR擴增產物的溶液1μL中分別加入17.3μL蒸餾水、2.5μL Blend Taq 用10×緩衝液(東洋紡株式會社製造)、2μL 2mM的dNTPs(東洋紡株式會社製造)、0.2μL 2.5單位/μL的Blend Taq-Plus(東洋紡株式會社製造)、1μL 10μM的正向引子和1μL 10μM的反向引子並混合，將其作為PCR用反應液。 需要說明的是，上述正向引子是對上述(4)的正向引子附加限制酶(HindIII)識別位點(序列中的底線部分)而成的引子，由下述鹽基序列構成。上述反向引子是對上述(4)的反向引子附加限制酶(BamHI)識別位點(序列中的底線部分)而成的引子，由下述鹽基序列構成。 正向引子：TTACCATAAGCTT GGAATTAGTGGGGGCAGCCAGGCCCCAGG(SEQ ID NO:9) 反向引子：TAATTAAGGATCC CCCAAAAACTACCCTTACCAAACTAATC(SEQ ID NO:10) 接著，將上述PCR用反應液分別設置於熱循環儀(Bio-Rad Laboratories公司製造)中，以下述反應條件進行PCR擴增反應。 ※反應條件 94℃ 2分鐘 ↓ 以94℃ 10秒→55℃ 10秒→72℃ 20秒為1個循環，進行12個循環 ↓ 72℃ 2分鐘 接著，向含PCR擴增產物的溶液25μL中分別加入5μL 6×雙色上樣緩衝液(NIPPON GENE公司製造)並混合，利用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳。電泳後，利用GelRed核酸凝膠染色液(和光純藥工業株式會社製造)進行染色，使用QIAquick凝膠萃取試劑盒(QIAGEN公司製造)分別回收PCR擴增產物。
(7)限制酶處理 在上述(6)中得到的含PCR擴增產物的溶液43μL中分別混合5μL 10×B緩衝液(NIPPON GENE公司製造)、1μL 20單位/μL的HindIII(NIPPON GENE公司製造)、1μL 20單位/μL的BamHI(NIPPON GENE公司製造)後，在37℃反應1小時。同樣地向500ng pUC19(NIPPON GENE公司製造)中加入蒸餾水，製備成43μL，加入1μL 20單位/μL的HindIII(NIPPON GENE公司製造)、1μL 20單位/μL的BamHI(NIPPON GENE公司製造)後，在37℃反應1小時。接著，分別加入250μL 5.5M的鹽酸胍(和光純藥工業株式會社製造)並混合，之後移至EconoSpin(GeneDesign Inc.製造)中，以12000×g在室溫下離心分離1分鐘，將管內的溶液除去。接著，分別加入500μL 2mM Tris-HCl pH7.5 (NIPPON GENE公司製造)，以12000×g在室溫下離心分離1分鐘，將管內的溶液除去。進而，以12000×g在室溫下離心分離1分鐘後，更換至新的管中，分別加入25μL 2mM Tris-HCl pH8.0(NIPPON GENE公司製造)，以12000×g在室溫下離心分離1分鐘，由此回收利用限制酶(HindIII和BamHI)處理後的各PCR擴增產物和pUC19。
(8)轉化 向上述(7)中得到的含PCR擴增產物的溶液1μL中分別加入1μL利用限制酶進行了處理的pUC19、2μL DNA連接試劑盒Mighty Mix(寶生物公司製造)並混合，在16℃反應1小時。接著，將全部量4μL分別轉化至ECOSTM 感受態E.coli DH5α(NIPPON GENE公司製造)中，塗抹至添加有氨苄青黴素的LB瓊脂培養基上。之後，將菌落在添加有氨苄青黴素的LB培養基中于37℃培養16小時。之後，使用質粒試劑盒SII(倉敷紡績株式會社製造)，分別萃取質粒。接著，使用所得到的質粒，通過寶生物公司的測序委託服務解讀鹽基序列。 將其結果示於圖4。
圖4是關於正常細胞(hiPS、HDF)、癌細胞(U251-MG-P1、MCF-7、LNCaP clone FGC、HL60)的鹽基序列解讀結果，示出作為甲基化狀態的確認區域的3個包含CpG序列的序列(CCGG)的胞嘧啶為甲基化胞嘧啶或非甲基化胞嘧啶中的哪一種的圖。另外，圖4中的圓圈1～圓圈3對應於圖3中的圓圈1～圓圈3。 需要說明的是，圖4中的○表示CpG序列的胞嘧啶為非甲基化胞嘧啶，●表示CpG序列的胞嘧啶為甲基化胞嘧啶。 由圖4的結果可知，正常細胞(hiPS、HDF)來源的作為甲基化狀態的確認區域的3個包含CpG序列的序列(CCGG)的胞嘧啶為非甲基化胞嘧啶，癌細胞(U251-MG-P1、MCF-7、LNCaP clone FGC、HL60)來源的作為甲基化狀態的確認區域的3個包含CpG序列的序列(CCGG)的胞嘧啶為甲基化胞嘧啶。
實施例 1 和比較例 1 ～ 3 為了驗證本發明的步驟1中的S1核酸酶的效果，在下述條件下進行了本發明的擴增方法以及甲基化判定方法和癌症的判定方法。 ･實施例1：進行了利用單鏈特異性核酸酶(S1核酸酶)進行處理的步驟的情況 ･比較例1：進行了利用單鏈特異性核酸酶(綠豆核酸酶)進行處理的步驟的情況 ･比較例2：進行了利用單鏈特異性核酸酶(核酸外切酶I)進行處理的步驟的情況 ･比較例3：未進行利用單鏈特異性核酸酶進行處理的步驟的情況
實施例 1 (1)條件的設定 如下設定了試樣和分析物件區域。 ･試樣 人誘導性多能幹細胞(hiPS)：正常細胞 ･分析物件區域 人來源的FOXB2基因的啟動子區域中由SEQ ID NO:1所表示的鹽基序列構成的區域(267鹽基對)
(2)基因組DNA的萃取 利用QuickGene SP組織DNA萃取試劑盒(倉敷紡績株式會社製造)，根據其實物說明書萃取出hiPS來源的基因組DNA。
(3)利用限制酶(BamHI和HindIII)的片段化處理和柱純化 向(2)中得到的基因組DNA 150ng中加入5μL 10×B緩衝液(NIPPON GENE公司製造)、1μL 20單位/μL的BamHI(NIPPON GENE公司製造)和1μL 20單位/μL的HindIII(NIPPON GENE公司製造)，用滅菌水製備成總量為50μL。之後，在37℃反應1小時。接著，加入250μL 5.5M的鹽酸胍(和光純藥工業株式會社製造)並混合，之後移至EconoSpin(GeneDesign Inc.製造)中，以20000×g在室溫下離心分離3分鐘，將管內的溶液除去。接著，加入600μL 2mM Tris-HCl pH7.5(NIPPON GENE公司製造)和600μL 80%乙醇(和光純藥工業株式會社製造)，以12000×g在室溫下離心分離1分鐘，將管內的溶液除去。進而，以12000×g在室溫下離心分離5分鐘後，更換至新的管中，加入30μL 2mM Tris-HCl pH8.0(NIPPON GENE公司製造)，以12000×g在室溫下離心分離1分鐘，由此得到利用限制酶(BamHI和HindIII)進行了處理的基因組DNA。
(4)利用單鏈特異性核酸酶(S1核酸酶)的處理和柱純化 向(3)中得到的含基因組DNA的Tris-HCl溶液25μL中加入4μL 10×S1核酸酶緩衝液(寶生物公司製造)和1μL 180單位/μL的S1核酸酶(寶生物公司製造)，用滅菌水製備成總量為40μL。之後，在23℃反應15分鐘後，加入1μL 0.5M的EDTA。接著，加入200μL 5.5M的鹽酸胍(和光純藥工業株式會社製造)和200μL 20mM Tris-HCl pH6.6(和光純藥工業株式會社製造)並混合後，移至EconoSpin(GeneDesign Inc.製造)中，以20000×g在室溫下離心分離3分鐘，將管內的溶液除去。接著，加入600μL 2mM Tris-HCl pH7.5(NIPPON GENE公司製造)、600μL 80%乙醇(和光純藥工業株式會社製造)，以12000×g在室溫下離心分離1分鐘，將管內的溶液除去。進而，以12000×g在室溫下離心分離5分鐘後，更換至新的管中，加入30μL 2mM Tris-HCl pH8.0(NIPPON GENE公司製造)，以12000×g在室溫下離心分離1分鐘，由此得到利用單鏈特異性核酸酶(S1核酸酶)進行了處理的基因組DNA。
(5)利用甲基化敏感性限制酶(HapII)的處理和柱純化 向(4)中得到的含基因組DNA的Tris-HCl溶液25μL中加入4μL 10×L緩衝液(寶生物公司製造)和1μL 25單位/μL的HapII(寶生物公司製造)，用滅菌水製備成總量為40μL。之後，在37℃反應2小時。接著，加入200μL 5.5M的鹽酸胍(和光純藥工業株式會社製造)和200μL 20mM Tris-HCl pH6.6(和光純藥工業株式會社製造)並混合後，移至EconoSpin(GeneDesign Inc.製造)中，以20000×g在室溫下離心分離3分鐘，將管內的溶液除去。接著，加入600μL 2mM Tris-HCl pH7.5(NIPPON GENE公司製造)和600μL 80%乙醇(和光純藥工業株式會社製造)，以12000×g在室溫下離心分離1分鐘，將管內的溶液除去。進而，以12000×g在室溫下離心分離5分鐘後，更換至新的管中，加入30μL 2mM Tris-HCl pH8.0(NIPPON GENE公司製造)，以12000×g在室溫下離心分離1分鐘，由此得到利用甲基化敏感性限制酶(HapII)進行了處理的基因組DNA。 需要說明的是，HapII和HpaII所識別的序列是圖3所表示的人細胞來源的基因組DNA的FOXB2基因的啟動子區域內的由SEQ ID NO:1所表示的鹽基序列構成的區域(267鹽基對)中被四邊形圍起的3個包含CpG序列的序列(CCGG)。
(6)PCR擴增反應 向(5)中得到的含基因組DNA的Tris-HCl溶液1μL中加入2.5μL Blend Taq 用10×緩衝液(東洋紡株式會社製造)、2μL 2mM的dNTPs(東洋紡株式會社製造)、0.2μL 2.5單位/μL的Blend Taq-Plus(東洋紡株式會社製造)、1μL 10μM的正向引子(h-F-Fox)和1μL 10μM的反向引子(h-R-Fox)，用滅菌水製備成25μL，將其作為PCR用反應液。 需要說明的是，利用上述引子得到的擴增產物的大小(鹽基對數)為267鹽基對(SEQ ID NO:1)。 另外，作為範本，使用(3)中得到的DNA，除此以外與上述同樣地製備PCR用反應液，將其作為對照。 將上述PCR用反應液分別設置於熱循環儀(Bio-Rad Laboratories公司製造)中，以下述反應條件進行PCR擴增反應。 ※反應條件 94℃ 2分鐘 ↓ 以94℃ 4秒→68℃ 15秒為1個循環，進行50個循環 ↓ 68℃ 1分鐘
(7)電泳 向(6)中得到的含擴增產物的溶液25μL中分別加入5μL 6×雙色上樣緩衝液(NIPPON GENE公司製造)並混合，之後利用2%瓊脂糖凝膠對該混合物進行電泳。電泳後，利用GelRed核酸凝膠染色液(和光純藥工業株式會社製造)進行染色，通過UV照射裝置分別確認了擴增產物。將其結果示於圖5(泳道1和2)。
比較例 1 作為實施例1中的單鏈特異性核酸酶，代替S1核酸酶而使用綠豆核酸酶(寶生物公司製造)，除此以外，通過與上述實施例1同樣的方法進行擴增產物的確認。將其結果示於圖5(泳道3和4)。
比較例 2 作為實施例2中的單鏈特異性核酸酶，代替S1核酸酶而使用核酸外切酶I(寶生物公司製造)，除此以外，通過與上述實施例2同樣的方法進行擴增產物的確認。將其結果示於圖5(泳道5和6)。
比較例 3 不進行實施例1中的(4)利用單鏈特異性核酸酶的處理，除此以外，通過與實施例1同樣的方法進行擴增產物的確認。將其結果示於圖5(泳道7和8)。
另外，將圖5的各泳道中的試樣、單鏈特異性核酸酶、甲基化敏感性限制酶和擴增產物的有無歸納於下述表3。
【表3】
由圖5的結果可知，在使用S1核酸酶作為單鏈特異性核酸酶、利用甲基化敏感性限制酶對hiPS進行處理、使用本發明的引子對進行PCR擴增反應的情況下(泳道2)，未得到目標擴增產物[由SEQ ID NO:1所表示的鹽基序列構成的區域(267鹽基對)]、即分析物件區域。 因此，hiPS的分析物件區域被甲基化敏感性限制酶切斷，可以判定為非甲基化狀態。即，可以判定分析物件區域來源的hiPS為正常細胞。 另一方面，可知：在使用綠豆核酸酶作為單鏈特異性核酸酶的情況下(泳道4)、使用核酸外切酶I作為單鏈特異性核酸酶的情況下(泳道6)、以及未進行利用單鏈特異性核酸酶進行處理的步驟的情況下(泳道8)，利用甲基化敏感性限制酶對hiPS進行處理並使用本發明的引子對進行PCR擴增反應時，得到目標擴增產物[由SEQ ID NO:1所表示的鹽基序列構成的區域(267鹽基對)]、即與分析物件區域相同大小的擴增產物。 但是，在比較例1～3中，雖然用了與實施例1相同的正常hiPS來源的基因組DNA作為範本，但得到了擴增產物，由此認為該擴增產物是人為地或內源性地存在的單鏈DNA成為範本而擴增的非特異性擴增產物。 因此可知，通過利用S1核酸酶對試樣(DNA)進行處理、即通過進行本發明的步驟1，可抑制可能造成假陽性的非特異性擴增產物的擴增，能夠簡便、高精度地進行甲基化的分析物件區域的擴增以及甲基化的判定和癌症的判定。
實施例 2 各種正常細胞和各種癌細胞的 FOXB2 基因的分析 使用下述正常細胞和癌細胞作為實施例1中的試樣，除此以外，通過與實施例1同樣的方法進行擴增產物的確認。將其結果分別示於圖6(正常細胞)和圖7(癌細胞)。 ･正常細胞 正常纖維母細胞(HDF) 正常纖維母細胞(CCD-8Lu) 正常纖維母細胞(WI-38) HIV和HBV陰性血清(正常全血) 人誘導性多能幹細胞(hiPS) 全胚胎細胞(HE23) ･癌細胞 神經母細胞瘤細胞(IMR-32) 膠質母細胞瘤細胞(U251-MG-P1) 子宮肌瘤細胞(HeLa) 肝癌細胞(HepG2) 結腸腺癌細胞(WiDr) 非小細胞肺癌細胞(NCI-H460) 胰腺癌細胞(CFPAC-1) 卵巢畸胎瘤細胞(PA-1) 乳腺癌細胞(MCF-7) 前列腺癌細胞(LNCaP clone FGC) T淋巴性白血病細胞(Jurkat) 髄性白血病細胞(HL-60)
另外，將圖6的各泳道中的試樣、甲基化敏感性限制酶和擴增產物的有無歸納於下述表4，將圖7的各泳道中的試樣、甲基化敏感性限制酶和擴增產物的有無歸納於下述表5。
【表4】
【表5】
由圖6的結果可知，在使用各種正常細胞的情況下(泳道2、4、6、8、10和12)，均未確認到目標擴增產物[由SEQ ID NO:1所表示的鹽基序列構成的區域(267鹽基對)]，未得到分析物件區域。 即，分析物件區域被甲基化敏感性限制酶切斷，可以判定為非甲基化狀態。因此，由該結果可以判定，分析物件區域來源的各種正常細胞為正常細胞。 由圖7的結果可知，在使用各種癌細胞的情況下(泳道2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24)，均確認到目標擴增產物[由SEQ ID NO:1所表示的鹽基序列構成的區域(267鹽基對)]，得到了分析物件區域。 即，分析物件區域未被甲基化敏感性限制酶切斷，可以判定為甲基化狀態。因此，由該結果可以判定，分析物件區域來源的各種癌細胞為癌細胞。
由以上可知，根據本發明，能夠簡便、高精度地進行甲基化的分析物件區域的擴增以及甲基化的判定和癌症的判定。
實施例 3 乳腺癌患者來源的癌細胞的 FOXB2 基因的分析 作為實施例1中的試樣，使用2名乳腺癌患者[乳腺癌患者1(IIIA期)和乳腺癌患者2(II期)]來源的癌細胞和該癌細胞附近的正常細胞，除此以外，通過與實施例1同樣的方法進行擴增產物的確認。將其結果示於圖8。
另外，將圖8的各泳道中的試樣、甲基化敏感性限制酶和擴增產物的有無歸納於下述表6。
【表6】
由圖8的結果可知，在使用乳腺癌患者1和乳腺癌患者2來源的癌細胞的情況下(泳道4和8)，均確認到目標擴增產物[由SEQ ID NO:1所表示的鹽基序列構成的區域(267鹽基對)]，得到了分析物件區域。 即，分析物件區域未被甲基化敏感性限制酶切斷，可以判定為甲基化狀態。因此，由該結果可以判定，分析物件區域來源的各種癌細胞為癌細胞。 另一方面，可知：在使用各種正常細胞的情況下(泳道2和6)，均未確認到目標擴增產物[由SEQ ID NO:1所表示的鹽基序列構成的區域(267鹽基對)]，未得到分析物件區域。 即，分析物件區域被甲基化敏感性限制酶切斷，可以判定為非甲基化狀態。因此，由該結果可以判定，分析物件區域來源的癌細胞附近的各種正常細胞為正常細胞。
由以上可知，即使是實際的臨床樣本，也能夠進行甲基化的分析物件區域的擴增以及甲基化的判定和癌症的判定。 此外還可知，即使是癌細胞附近的正常細胞，也能夠在不產生假陽性的情況下進行甲基化的分析物件區域的擴增以及甲基化的判定和基於此的癌症的判定。
實施例 4 犬來源的癌細胞的 FOXB2 基因的分析 作為實施例1中的試樣，使用犬來源的癌細胞[MDCK細胞(無轉移能力的良性癌細胞)、肺癌細胞和肝癌細胞]，將分析物件區域設定為犬來源的FoxB2基因的啟動子區域中由SEQ ID NO:4所表示的鹽基序列構成的區域(433鹽基對)，並且使用d-F-Fox和d-R-Fox作為本發明的引子對，除此以外，通過與實施例1同樣的方法進行擴增產物的確認。 需要說明的是，利用本發明的引子對(d-F-Fox和d-R-Fox)所擴增的區域為由SEQ ID NO:4所表示的鹽基序列構成的區域(433鹽基對)。 將其結果示於圖9。
另外，將圖9的各泳道中的細胞和甲基化敏感性限制酶歸納於下述表7。
【表7】
由圖9的結果可知，在使用MDCK細胞(無轉移能力的良性癌細胞)的情況下(泳道2)，均未確認到目標擴增產物[由SEQ ID NO:4所表示的鹽基序列構成的區域(433鹽基對)]，未得到分析物件區域。 即，分析物件區域被甲基化敏感性限制酶切斷，可以判定為非甲基化狀態。因此，由該結果可以判定，分析物件區域來源的MDCK細胞(無轉移能力的良性癌細胞)為正常細胞。 另一方面，可知：在使用肺癌細胞和肝癌細胞的情況下(泳道4和6)，均確認到目標擴增產物[由SEQ ID NO:1所表示的鹽基序列構成的區域(433鹽基對)]，得到了分析物件區域。 即，分析物件區域未被甲基化敏感性限制酶切斷，可以判定為甲基化狀態。因此，由該結果可以判定，分析物件區域來源的肺癌細胞和肝癌細胞為癌細胞。
由以上可知，根據本發明，即使是犬來源的細胞，也能夠進行甲基化的分析物件區域的擴增以及甲基化的判定和癌症的判定。另外還可知，即使是無轉移能力的良性癌細胞，也能夠判定為正常細胞。 此外，暗示了能夠將本發明的甲基化的分析物件區域的擴增方法以及甲基化的判定方法和癌症的判定方法應用於犬等動物的癌症篩檢的可能性。
實施例 5 使用了癌症患者來源的血漿的 FoxB2 基因的分析 如上所述，cfDNA是指由癌(腫瘤)細胞、白細胞等血液細胞、各組織來源的細胞等的死亡所來源的DNA，其存在於血液或尿等體液中。另外，據報導癌症患者中的cfDNA的量較健康人多。 因此，代替使用內窺鏡或針來採集癌(腫瘤)組織的現有的活組織檢查(Biopsy)，使用血液或尿等體液的癌(腫瘤)的篩檢(液體活檢)受到關注。 因此，對於能否將本發明的方法應用於液體活檢進行了驗證。
(1)條件的設定 如下設定了試樣和分析物件區域。 ･試樣 肝癌患者來源的血漿 肺癌患者來源的血漿 ･分析物件區域 人來源的FOXB2基因的啟動子區域中由SEQ ID NO:11所表示的鹽基序列構成的區域(149鹽基對)
(2)cfDNA的萃取 利用NucleoSpin(商標) Plasma XS(MACHEREY-NAGEL公司製造)，根據其實物說明書分別萃取出cfDNA。
(3)利用限制酶(MboI)的片段化處理、利用甲基化敏感性限制酶(HpaII)的處理和柱純化 向(2)中得到的cfDNA中分別加入10μL 10×CutSmart緩衝液(NEB公司製造)、1μL 25單位/μL的MboI(NEB公司製造)和3μL 50單位/μL的HpaII(NEB公司製造)，用滅菌水使總量為100μL。之後，在37℃反應1小時30分鐘。接著，分別加入500μL 5.5M的鹽酸胍(和光純藥工業株式會社製造)和500μL 20mM Tris-HCl pH7.0(NIPPON GENE公司製造)並混合後，移至EconoSpin(GeneDesign Inc.製造)中，以13000×g在室溫下離心2分鐘，將管內的溶液除去。接著，分別加入600μL 2mM Tris-HCl pH7.5(NIPPON GENE公司製造)和600μL 80%乙醇(和光純藥工業株式會社製造)，以13000×g在室溫下離心分離1分鐘，將管內的溶液除去。再重複一次該操作，進而以13000×g在室溫下離心分離3分鐘後，分別更換至新的管中，分別添加50μL滅菌水，以13000×g在室溫下離心分離1分鐘，由此分別得到利用限制酶(MboI)和甲基化敏感性限制酶(HpaII)進行了處理的cfDNA。
(4)利用S1核酸酶的處理和柱純化 向(3)中得到的含cfDNA的滅菌水50μL中分別加入10μL 10×S1核酸酶緩衝液(寶生物公司製造)、1μL 180單位/μL的S1核酸酶，用滅菌水製備成100μL。之後，在23℃反應15分鐘。接著，分別加入500μL 5.5M的鹽酸胍(和光純藥工業株式會社製造)和500μL 20mM Tris-HCl pH7.0(NIPPON GENE公司製造)並混合後，移至EconoSpin(GeneDesign Inc.製造)中，以13000×g在室溫下離心2分鐘，將管內的溶液除去。接著，分別加入600μL 2mM Tris-HCl pH7.5(NIPPON GENE公司製造)和600μL 80%乙醇(和光純藥工業株式會社製造)，以13000×g在室溫下離心分離1分鐘，將管內的溶液除去。再重複一次該操作，進而以13000×g在室溫下離心分離3分鐘後，更換至新的管中，分別添加50μL滅菌水，以13000×g在室溫下離心分離1分鐘，由此分別得到利用S1核酸酶進行了處理的cfDNA。
(5)利用甲基化敏感性限制酶(HpaII)的處理和柱純化 向(4)中得到的含cfDNA的滅菌水50μL中分別加入10μL 10×CutSmart緩衝液(NEB公司製造)和3μL 50單位/μL的HpaII，用滅菌水製備成總量為100μL。之後，在37℃反應1小時30分鐘。接著，分別加入500μL 5.5M的鹽酸胍(和光純藥工業株式會社製造)和500μL 20mM Tris-HCl pH7.0(NIPPON GENE公司製造)並混合後，移至EconoSpin(GeneDesign Inc.製造)中，以13000×g在室溫下離心2分鐘，將管內的溶液除去。接著，分別加入600μL 2mM Tris-HCl pH7.5(NIPPON GENE公司製造)和600μL 80%乙醇(和光純藥工業株式會社製造)，以13000×g在室溫下離心分離1分鐘，將管內的溶液除去。再重複一次該操作，進而以13000×g在室溫下離心分離3分鐘後，分別更換至新的管中，添加50μL滅菌水，以13000×g在室溫下離心分離1分鐘，由此分別得到利用甲基化敏感性限制酶(HpaII)進行了處理的cfDNA。 需要說明的是，HpaII和HapII所識別的序列為圖10所表示的人來源的FOXB2基因的啟動子區域內的由SEQ ID NO:11所表示的鹽基序列構成的區域(149鹽基對)中被四邊形圍起的3個包含CpG序列的序列(CCGG)。
(6)利用數位PCR法的擴增反應 向(5)中得到的含cfDNA的滅菌水3μL中分別加入11μL ddPCRTM 探針用Supermix(Bio-Rad Laboratories公司製造)、0.8μL 50單位/μL的HapII(寶生物公司製造)、1μL 20μM的正向引子(hcf-F-fox)、1μL 20μM的反向引子(hcf-R-fox)和1μL 10μM的探針[hcf-Probe-fox(5’端用FAM標記、3’端用BHQ1標記)]，用滅菌水製備成總量為22μL，將其作為數字PCR用反應液。之後，將上述反應液分別設置於熱循環儀(Bio-Rad Laboratories公司製造)中，在37℃反應40分鐘。接著，利用自動化液滴發生器製作液滴，將該液滴分注至96孔板中後，利用熱循環儀(Bio-Rad Laboratories公司製造)以下述反應條件進行利用數位PCR法的擴增反應。 ※反應條件 95℃ 10分鐘 ↓ 以94℃ 30秒→62℃ 1分鐘為1個循環，進行40個循環 ↓ 98℃ 10分鐘 另外，選擇GAPDH基因作為內源性對照，對於GAPDH基因的特定區域[由SEQ ID NO:15所表示的鹽基序列構成的區域(149鹽基對)]，也使用相同的試樣(樣本)進行分析。GAPDH基因的分析中所用的正向引子、反向引子和探針的鹽基序列如下所述。 需要說明的是，關於其他實驗條件，除了未在數字PCR用反應液中添加HapII以外，與上述相同。 正向引子：gaagcttgtcatcaatggaaatccc(SEQ ID NO:16) 反向引子：gggacaggaccatattgagggacac(SEQ ID NO:17) 探針(5’端用FAM標記、3’端用BHQ1標記)：caactaggatggtgtggctcccttg(SEQ ID NO:18)
(7)利用螢光酶標儀的擴增產物的確認 利用QX200 Droplet Reader(Bio-Rad Laboratories公司製造)，對含有(6)中擴增的擴增產物的各液滴來源的螢光進行檢測，由此進行擴增產物的確認。 需要說明的是，關於GAPDH基因的分析使用1個試樣(樣本)，對於每1試樣(樣本)進行1次分析。另外，關於FOXB2基因的分析使用1個試樣(樣本)，對於每1試樣(樣本)進行2次分析。 將GAPDH基因的分析結果示於圖11，將FOXB2基因的分析結果示於圖12。 關於作為陽性或陰性的判定基準的閾值，對於GAPDH基因，以GAPDH基因的擴增結果為參考，設定為螢光強度8000。另外，對於FOXB2基因，以FOXB2基因的擴增結果為參考，設定為螢光強度8000。即，在存在至少1個螢光強度超過8000的液滴的情況下，判定為陽性(獲得了目標擴增產物)，在不存在螢光強度超過8000的液滴的情況下，判定為陰性(未獲得目標擴增產物)。 另外，將圖11和圖12中的試樣、分析物件區域、陽性液滴數、陰性液滴數、總液滴數和閾值分別歸納於表8和表9。
【表8】
【表9】
根據圖11和表8的結果，在使用肝癌患者來源的血漿的情況下，能夠確認到發出超過閾值的螢光的陽性液滴(253個)，因而可知目標擴增產物[GAPDH基因的特定區域：由SEQ ID NO:15所表示的鹽基序列構成的區域(149鹽基對)]被擴增。 另外，在使用肺癌患者來源的血漿的情況下，也能夠確認到發出超過閾值的螢光的陽性液滴(22個)，因而可知目標擴增產物[GAPDH基因的特定區域：由SEQ ID NO:15所表示的鹽基序列構成的區域(149鹽基對)]被擴增。 由以上表明，試樣(肝癌患者來源的血漿和肺癌患者來源的血漿)中存在cfDNA。
根據圖12和表9的結果，在使用肝癌患者來源的血漿的情況下，能夠確認到發出超過閾值的螢光的陽性液滴(第1次：5個、第2次：4個)，因而可知得到了目標擴增產物[FOXB2基因的特定區域：由SEQ ID NO:11所表示的鹽基序列構成的區域(149鹽基對)]。 另外，在使用肺癌患者來源的血漿的情況下，也能夠確認到發出超過閾值的螢光的陽性液滴(第1次：1個)，因而可知得到了目標擴增產物[FOXB2基因的特定區域：由SEQ ID NO:11所表示的鹽基序列構成的區域(149鹽基對)]。 即，分析物件區域未被甲基化敏感性限制酶切斷，可以判定為甲基化狀態。另外，可以判定血漿來源的物件(肝癌患者和肺癌患者)罹患癌症或該對象(肝癌患者和肺癌患者)中存在癌細胞。
由以上可知，在使用癌症患者來源的血漿作為試樣的情況下，也能夠進行甲基化的分析物件區域的擴增以及使用了該擴增的甲基化的判定和癌症的判定。 因此，暗示了能夠將本發明的甲基化的分析物件區域的擴增方法以及甲基化判定方法和癌症的判定方法應用於液體活檢的可能性。
實施例 6 使用了健康人來源的血漿的 FOXB2 基因的分析 (FOXB2 基因與 GAPDH 基因的同時擴增 / 檢測 ) 在假設為實際的臨床現場的情況下，從檢查的迅速性的方面出發，優選能夠同時對靶基因和作為內源性對照所選擇的基因進行擴增/檢測。 因此，對於能否將本發明的方法應用于靶基因和作為內源性對照所選擇的基因的同時擴增/檢測進行了驗證。 使用健康人來源的血漿作為實施例5中的試樣，如下所述設定閾值，並且使用下述的數位PCR用反應液，除此以外，通過與實施例5同樣的方法進行擴增產物的確認。需要說明的是，實驗使用4個試樣(樣本)，對於每1試樣(樣本)分別實施4次實驗。 將其結果示於圖13(A、B)。 ･閾值 對於FOXB2基因，以FOXB2基因的擴增結果為參考，設定為螢光強度8000。另外，對於GAPDH基因，以GAPDH基因的擴增結果為參考，設定為螢光強度4000。 ･數字PCR用反應液 向利用甲基化敏感性限制酶進行了處理的3μL cfDNA中加入1μL 20μM的正向引子(hcf-F-fox)、1μL 20μM的反向引子(hcf-R-fox)、0.6μL 10μM的探針[hcf-Probe-fox(5’端用FAM標記、3’端用BHQ1標記)]、1μL 20μM的正向引子(SEQ ID NO:16所表示的鹽基序列)、1μL 20μM的反向引子(SEQ ID NO:17所表示的鹽基序列)、0.6μL 10μM的探針[SEQ ID NO:18所表示的鹽基序列(5’端用HEX標記、3’端用BHQ1標記)]、11μL ddPCRTM 探針用Supermix(Bio-Rad Laboratories公司製造)和0.6μL 50單位/μL的HpaII(NEB公司製造)，用滅菌水製備成總量為22μL。 另外，將圖13的A和B中的試樣、分析物件區域、陽性液滴數、陰性液滴數、總液滴數和閾值分別歸納於表10和11。
【表10】
【表11】
根據圖13的A和表10的結果，在使用健康人來源的血漿的情況下，4個樣本(試樣)全部無法確認到發出超過閾值的螢光的陽性液滴，因而可知目標擴增產物[FOXB2基因的特定區域：由SEQ ID NO:11所表示的鹽基序列構成的區域(149鹽基對)]未被擴增。 根據圖13的B和表11的結果，在使用健康人來源的血漿的情況下，4個樣本(試樣)全部確認到發出超過閾值的螢光的陽性液滴，因而可知目標擴增產物[GAPDH基因的特定區域：由SEQ ID NO:15所表示的鹽基序列構成的區域(149鹽基對)]被擴增。 即，分析物件區域被甲基化敏感性限制酶切斷，可以判定不是甲基化狀態。另外，可以判定血漿來源的物件(健康人)未罹患癌症或該對象(健康人)中不存在癌細胞。
實施例 7 使用了各種癌症患者來源的血漿的 FOXB2 基因的分析 (FOXB2 基因與 GAPDH 基因的同時擴增 / 檢測 ) 使用下述物質作為實施例6中的試樣並且如下所述設定閾值，除此以外，通過與實施例6同樣的方法進行擴增產物的確認。需要說明的是，實驗分別使用1個試樣(樣本)，對於每1試樣(樣本)分別進行4次實驗。將其結果分別示於圖14～18。 ･閾值 對於FOXB2基因，以FOXB2基因的擴增結果為參考，設定為螢光強度8000。另外，對於GAPDH基因，以GAPDH基因的擴增結果為參考，設定為螢光強度4000。 ･試樣 乳腺癌患者來源的血漿 大腸癌患者來源的血漿 胰腺癌患者來源的血漿 胃癌患者來源的血漿 抗癌藥給藥後的肺癌患者來源的血漿 另外，將圖14～18中的試樣、分析物件區域、陽性液滴數、陰性液滴數、總液滴數和閾值分別歸納於表12～16。
【表12】
【表13】
【表14】
【表15】
【表16】
根據圖14的A和表12的結果，在使用乳腺癌患者來源的血漿的情況下，能夠確認到發出超過閾值的螢光的陽性液滴(第1次：1個、第2次：1個)，因而可知得到了目標擴增產物[FOXB2基因的特定區域：由SEQ ID NO:11所表示的鹽基序列構成的區域(149鹽基對)]。 另外，根據圖14的B和表12的結果，在使用乳腺癌患者來源的血漿的情況下，能夠確認到發出超過閾值的螢光的陽性液滴(第1次：91個、第2次：129個、第3次：93個、第4次：147個)，因而可知得到了目標擴增產物[GAPDH基因的特定區域：由SEQ ID NO:15所表示的鹽基序列構成的區域(149鹽基對)]。 即，分析物件區域未被甲基化敏感性限制酶切斷，可以判定為甲基化狀態。另外，可以判定血漿來源的物件(乳腺癌患者)罹患癌症或該對象(乳腺癌患者)中存在癌細胞。
根據圖15的A和表13的結果，在使用大腸癌患者來源的血漿的情況下，能夠確認到發出超過閾值的螢光的陽性液滴(第1次：10個、第2次：9個、第3次：2個、第4次：10個)，因而可知得到了目標擴增產物[FOXB2基因的特定區域：由SEQ ID NO:11所表示的鹽基序列構成的區域(149鹽基對)]。 另外，根據圖15的B和表13的結果，在使用大腸癌患者來源的血漿的情況下，能夠確認到發出超過閾值的螢光的陽性液滴(第1次：94個、第2次：126個、第3次：93個、第4次：74個)，因而可知得到了目標擴增產物[GAPDH基因的特定區域：由SEQ ID NO:15所表示的鹽基序列構成的區域(149鹽基對)]。 即，分析物件區域未被甲基化敏感性限制酶切斷，可以判定為甲基化狀態。另外，可以判定血漿來源的物件(大腸癌患者)罹患癌症或該對象(大腸癌患者)中存在癌細胞。
根據圖16的A和表14的結果，在使用胰腺癌患者來源的血漿的情況下，能夠確認到發出超過閾值的螢光的陽性液滴(第2次：1個、第3次：2個、第4次：1個)，因而可知得到了目標擴增產物[FOXB2基因的特定區域：由SEQ ID NO:11所表示的鹽基序列構成的區域(149鹽基對)]。 另外，根據圖16的B和表14的結果，在使用胰腺癌患者來源的血漿的情況下，能夠確認到發出超過閾值的螢光的陽性液滴(第1次：65個、第2次：76個、第3次：81個、第4次：86個)，因而可知得到了目標擴增產物[GAPDH基因的特定區域：由SEQ ID NO:15所表示的鹽基序列構成的區域(149鹽基對)]。 即，分析物件區域未被甲基化敏感性限制酶切斷，可以判定為甲基化狀態。另外，可以判定血漿來源的物件(胰腺癌患者)罹患癌症或該對象(胰腺癌患者)中存在癌細胞。
根據圖17的A和表15的結果，在使用胃癌患者來源的血漿的情況下，能夠確認到發出超過閾值的螢光的陽性液滴(第1次：10個、第2次：9個、第3次：18個、第4次：13個)，因而可知得到了目標擴增產物[FOXB2基因的特定區域：由SEQ ID NO:11所表示的鹽基序列構成的區域(149鹽基對)]。 另外，根據圖17的B和表15的結果，在使用胃癌患者來源的血漿的情況下，能夠確認到發出超過閾值的螢光的陽性液滴(第1次：97個、第2次：101個、第3次：112個、第4次：139個)，因而可知得到了目標擴增產物[GAPDH基因的特定區域：由SEQ ID NO:15所表示的鹽基序列構成的區域(149鹽基對)]。 即，分析物件區域未被甲基化敏感性限制酶切斷，可以判定為甲基化狀態。另外，可以判定血漿來源的物件(胃癌患者)罹患癌症或該對象(胃癌患者)中存在癌細胞。
根據圖18的A和表16的結果，在使用抗癌藥給藥後的肺癌患者來源的血漿的情況下，能夠確認到發出超過閾值的螢光的陽性液滴(第2次：1個、第3次：1個)，因而可知得到了目標擴增產物[FOXB2基因的特定區域：由SEQ ID NO:11所表示的鹽基序列構成的區域(149鹽基對)]。 另外，根據圖18的B和表16的結果，在使用抗癌藥給藥後的肺癌患者來源的血漿的情況下，能夠確認到發出超過閾值的螢光的陽性液滴(第1次：85個、第2次：82個、第3次：62個、第4次：92個)，因而可知得到了目標擴增產物[GAPDH基因的特定區域：由SEQ ID NO:15所表示的鹽基序列構成的區域(149鹽基對)]。 即，分析物件區域未被甲基化敏感性限制酶切斷，可以判定為甲基化狀態。另外，可以判定血漿來源的物件(抗癌藥給藥後的肺癌患者)罹患癌症或該對象(抗癌藥給藥後的肺癌患者)中存在癌細胞。
由實施例6和7可知，根據本發明的方法，即使是靶基因和作為內源性對照所選擇的基因的同時擴增/檢測，也能夠進行甲基化的分析物件區域的擴增以及甲基化的判定和癌症的判定。 因此，大大暗示了在實際的臨床現場中能夠應用本發明的方法的可能性。 另外，根據實施例8的圖18，即使在使用了抗癌藥給藥後的癌症患者來源的血漿的情況下，也得到了目標擴增產物，因而暗示了能夠將本發明用於抗癌藥給藥、放射性照射、手術預後等的經過觀察的可能性。 工業實用性
根據本發明的擴增方法、甲基化判定方法、癌症的判定方法和獲得用於進行癌症的判定的資料的方法，能夠簡便、短時間且高精度地進行甲基化的DNA的擴增、DNA的甲基化的判定、癌症的判定和用於進行癌症判定的資料的獲得。
圖1是將本發明的擴增方法的流程圖分成各種模式示出的圖。 圖2是將本發明的甲基化判定方法和癌症的判定方法的流程圖分成各種模式示出的圖。 圖3是示出實驗例1中的甲基化狀態的確認區域以及HapII和HpaII所識別的序列[在人來源的FOXB2基因啟動子區域內的由SEQ ID NO:1所表示的鹽基序列構成的區域(267鹽基對)中，被四邊形圍起的3個包含CpG序列的序列(CCGG)]的圖。 圖4是關於實驗例1中各種正常細胞和各種癌細胞的鹽基序列解讀結果，示出作為甲基化狀態的確認區域的3個包含CpG序列的序列(CCGG)的胞嘧啶是甲基化胞嘧啶、還是非甲基化胞嘧啶的圖。 圖5是示出在實施例1和比較例1～3中使用正常細胞(hiPS)對FOXB2基因的PCR擴增產物進行電泳的結果的圖。 圖6是示出在實施例2中使用各種正常細胞對FOXB2基因的PCR擴增產物進行電泳的結果的圖。 圖7是示出在實施例2中使用各種癌細胞對FOXB2基因的PCR擴增產物進行電泳的結果的圖。 圖8是示出在實施例3中使用乳腺癌患者來源的癌細胞對FOXB2基因的PCR擴增產物進行電泳的結果的圖。 圖9是示出在實施例4中使用犬來源的癌細胞對FOXB2基因的PCR擴增產物進行電泳的結果的圖。 圖10是示出在人來源的FOXB2基因啟動子區域內的由SEQ ID NO:11所表示的鹽基序列構成的區域(149鹽基對)中HpaII和HapII所識別的序列[被四邊形圍起的3個包含CpG序列的序列(CCGG)]的圖。 圖11是示出在實施例5中使用肝癌患者和肺癌患者來源的血漿、利用數位PCR法對GAPDH基因的特定區域進行擴增的結果的圖。 圖12是示出在實施例5中使用肝癌患者和肺癌患者來源的血漿、利用數位PCR法對FOXB2基因的特定區域進行擴增的結果的圖。 圖13是示出在實施例6中使用健康人來源的血漿、利用數位PCR法對FOXB2基因和GAPDH基因的特定區域同時進行擴增/檢測的結果的圖。 圖14是示出在實施例7中使用乳腺癌患者來源的血漿、利用數位PCR法對FOXB2基因和GAPDH基因的特定區域同時進行擴增/檢測的結果的圖。 圖15是示出在實施例7中使用大腸癌患者來源的血漿、利用數位PCR法對FOXB2基因和GAPDH基因的特定區域同時進行擴增/檢測的結果的圖。 圖16是示出在實施例7中使用胰腺癌患者來源的血漿、利用數位PCR法對FOXB2基因和GAPDH基因的特定區域同時進行擴增/檢測的結果的圖。 圖17是示出在實施例7中使用胃癌患者來源的血漿、利用數位PCR法對FOXB2基因和GAPDH基因的特定區域同時進行擴增/檢測的結果的圖。 圖18是示出在實施例7中使用抗癌藥給藥後的肺癌患者來源的血漿、利用數位PCR法對FOXB2基因和GAPDH基因的特定區域同時進行擴增/檢測的結果的圖。
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Claims (17)

  1. 一種雙鏈DNA中的甲基化的分析物件區域的擴增方法，其包括下述步驟1和2： (1)步驟1，利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶對包含分析物件區域的雙鏈DNA進行處理； (2)步驟2，對步驟1中處理後的雙鏈DNA的分析物件區域進行擴增。
  2. 如請求項1所述的擴增方法，其中，所述步驟1在利用S1核酸酶進行處理後，利用甲基化敏感性限制酶進行處理。
  3. 如請求項1所述的擴增方法，其中，所述步驟1在利用甲基化敏感性限制酶進行處理後，利用S1核酸酶進行處理。
  4. 如請求項1所述的擴增方法，其中，在所述步驟1之前，包括利用在分析物件區域內不存在識別序列的限制酶進行處理的片段化步驟。
  5. 一種雙鏈DNA中的分析物件區域的甲基化判定方法，其包括下述步驟1～4： (1)步驟1，利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶對包含分析物件區域的雙鏈DNA進行處理； (2)步驟2，對步驟1中處理後的雙鏈DNA的分析物件區域進行擴增； (3)步驟3，確認步驟2中得到的擴增產物的有無； (4)步驟4，基於步驟3的結果，判定分析物件區域是否被甲基化。
  6. 如請求項5所述的甲基化判定方法，其中，所述步驟1在利用S1核酸酶進行處理後，利用甲基化敏感性限制酶進行處理。
  7. 如請求項5所述的甲基化判定方法，其中，所述步驟1在利用甲基化敏感性限制酶進行處理後，利用S1核酸酶進行處理。
  8. 如請求項5所述的甲基化判定方法，其中，在所述步驟1之前，包括利用在分析物件區域內不存在識別序列的限制酶進行處理的片段化步驟。
  9. 一種DNA的甲基化判定用試劑，其包含S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶。
  10. 一種癌症的判定方法，其包括下述步驟1～4： (1)步驟1，利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶對包含分析物件區域的雙鏈DNA進行處理； (2)步驟2，對步驟1中處理後的雙鏈DNA的分析物件區域進行擴增； (3)步驟3，確認步驟2中得到的擴增產物的有無； (4)步驟4，基於步驟3的結果，對癌症進行判定。
  11. 如請求項10所述的癌症的判定方法，其中，所述步驟1在利用S1核酸酶進行處理後，利用甲基化敏感性限制酶進行處理。
  12. 如請求項10所述的癌症的判定方法，其中，所述步驟1在利用甲基化敏感性限制酶進行處理後，利用S1核酸酶進行處理。
  13. 如請求項10所述的癌症的判定方法，其中，在所述步驟1之前，包括利用在分析物件區域內不存在識別序列的限制酶進行處理的片段化步驟。
  14. 如請求項10所述的癌症的判定方法，其中，分析物件區域為包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:11所表示的鹽基序列的鹽基序列。
  15. 一種獲得用於進行癌症的判定的資料的方法，其包括下述步驟1～3： (1)步驟1，利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶對包含分析物件區域的雙鏈DNA進行處理； (2)步驟2，對步驟1中處理後的雙鏈DNA的分析物件區域進行擴增； (3)步驟3，確認步驟2中得到的擴增產物的有無。
  16. 一種癌症的判定用試劑，其包含S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶。
  17. 一種用於進行癌症的判定的標記物，其通過進行下述步驟1和2而獲得： (1)步驟1，利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶對包含分析物件區域的雙鏈DNA進行處理； (2)步驟2，對步驟1中處理後的雙鏈DNA的分析物件區域進行擴增。
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