WO2019163602A1 - 標的領域の精製方法、検出方法及び癌の判定方法 - Google Patents

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WO2019163602A1
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dna fragment
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target
target region
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幸信 林田
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富士フイルム和光純薬株式会社
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)

Definitions

  • the present invention relates to a target region purification method, detection method, and cancer determination method.
  • a target region in DNA derived from a sample such as a body fluid such as blood, a cell, or a tissue is an important process for detecting the target region. If the target region is not sufficiently purified, when the target region is amplified by a nucleic acid amplification reaction such as PCR, the primer anneals to a region other than the target region (non-target region), and the non-target region is amplified. It is because it will be done. As a result, it becomes difficult to detect the target area.
  • a nucleic acid amplification reaction such as PCR
  • purification of the target region is particularly important when detecting a target region in DNA derived from rare cells in the sample [for example, circulating tumor cells (CTC) in the blood, etc.]. Processing. This is because when detecting a target region in DNA derived from rare cells present in a sample, it is necessary to extract a large amount of DNA (for example, 2 ⁇ g to 100 ⁇ g) from the sample, and due to the presence of this large amount of DNA, This is because a large number of primers are annealed to non-target regions, and a large number of non-target regions are amplified. As a result, it becomes extremely difficult to detect the target area.
  • a target region in DNA derived from rare cells in the sample for example, circulating tumor cells (CTC) in the blood, etc.
  • CTC circulating tumor cells
  • Examples of the method for purifying the target region include a method using a probe having a base sequence complementary to a part or all of the target region (Patent Document 1).
  • Patent Document 1 it is necessary to design an appropriate probe, and it is necessary to repeat various steps a plurality of times in order to remove the non-target region. Therefore, the method of Patent Document 1 is complicated and low in accuracy. Therefore, it has been desired to develop a method capable of simply and highly accurately purifying the target region.
  • An object of the present invention is to provide a method capable of simply, quickly and accurately purifying a target region.
  • a method for purifying a target region in double-stranded DNA comprising the following steps 1 to 3: (1) (a) a double strand having a target region using (a) one or more restriction enzymes A that generate a 3 ′ overhang at the end and (b) one or more restriction enzymes B that generate a 5 ′ overhang at the end From DNA, (i) a double-stranded DNA fragment having a target region and 3 ′ overhangs at both ends [3 ′ overhanging target double-stranded DNA fragment], and (ii) having no target region and 5 at both ends 'Overhanging double-stranded DNA fragment [5' overhanging non-target double-stranded DNA fragment] or / and (iii) Double-stranded DNA that does not have a target region and has 5 'and 3' overhangs, respectively.
  • Step 1 for generating a fragment [5 ′ / 3 ′ overhanging non-target double-stranded DNA fragment], wherein the restriction enzyme A does not cleave the nucleotide sequence in the target region, and the restriction enzyme B The base sequence in the protruding target double-stranded DNA fragment is not cleaved.
  • a method for detecting a target region in double-stranded DNA comprising the following steps 1 to 5: (1) (a) a double strand having a target region using (a) one or more restriction enzymes A that generate a 3 ′ overhang at the end and (b) one or more restriction enzymes B that generate a 5 ′ overhang at the end From DNA, (i) a double-stranded DNA fragment having a target region and 3 ′ overhangs at both ends [3 ′ overhanging target double-stranded DNA fragment], and (ii) having no target region and 5 at both ends 'Overhanging double-stranded DNA fragment [5' overhanging non-target double-stranded DNA fragment] or / and (iii) Double-stranded DNA that does not have a target region and has 5 'and 3' overhangs, respectively.
  • Step 1 for generating a fragment [5 ′ / 3 ′ overhanging non-target double-stranded DNA fragment], wherein the restriction enzyme A does not cleave the nucleotide sequence in the target region, and the restriction enzyme B The base sequence in the protruding target double-stranded DNA fragment is not cleaved.
  • a method for determining cancer comprising the following steps 1 to 7: (1) (a) a double strand having a target region using (a) one or more restriction enzymes A that generate a 3 ′ overhang at the end and (b) one or more restriction enzymes B that generate a 5 ′ overhang at the end From DNA, (i) a double-stranded DNA fragment having a target region and 3 ′ overhangs at both ends [3 ′ overhanging target double-stranded DNA fragment], and (ii) having no target region and 5 at both ends 'Overhanging double-stranded DNA fragment [5' overhanging non-target double-stranded DNA fragment] or / and (iii) Double-stranded DNA that does not have a target region and has 5 'and 3' overhangs, respectively.
  • Step 1 for generating a fragment [5 ′ / 3 ′ overhanging non-target double-stranded DNA fragment], wherein the restriction enzyme A does not cleave the nucleotide sequence in the target region, and the restriction enzyme B The base sequence in the protruding target double-stranded DNA fragment is not cleaved.
  • Step 4 of treating the smooth target double-stranded DNA fragment generated in the step 3 with a methylation sensitive restriction enzyme, (5) Step 5 of subjecting the target region in the smooth target double-stranded DNA fragment treated in Step 4 to amplification treatment (v), (6) Step 6 for confirming the presence or absence of an amplification product generated in Step 5 above, (7) Step 7 for determining cancer based on the confirmation result of Step 6 above.
  • the purification and detection of the target region in the double-stranded DNA of the present invention can be performed simply, in a short time and with high accuracy.
  • the cancer determination method of the present invention using the method for purifying and detecting the target region in the double-stranded DNA of the present invention, the determination of cancer can be performed easily, in a short time and with high accuracy.
  • FIG. 3 is a diagram showing a methylated state confirmation region in Experimental Example 1 for a region (267 base pairs) consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the human-derived FOXB2 gene promoter region.
  • FIG. 3 is a diagram showing a methylated state confirmation region in Experimental Example 1 for a region (149 base pairs) consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the human-derived FOXB2 gene promoter region.
  • Example 1 the cytosine of the sequence (CCGG and GCGG) containing the CpG sequence, which is the confirmation region for methylation status, is methylated cytosine It is the figure which showed whether it is an unmethylated cytosine.
  • Example 1 it is the figure which showed the result of having electrophoresed the PCR amplification product of FOXB2 gene using the human induced pluripotent stem cell and the colon cancer cell.
  • Example 2 it is the figure which showed the result of having electrophoresed the PCR amplification product of FOXB2 gene using normal human whole blood.
  • Example 3 it is the figure which showed the result of having amplified and detected the specific area
  • the method for purifying a target region in the double-stranded DNA of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the purification method of the present invention) is as follows.
  • (1) (a) a double strand having a target region using (a) one or more restriction enzymes A that generate a 3 ′ overhang at the end and (b) one or more restriction enzymes B that generate a 5 ′ overhang at the end From DNA, (i) a double-stranded DNA fragment having a target region and 3 ′ overhangs at both ends [3 ′ overhanging target double-stranded DNA fragment], and (ii) having no target region and 5 at both ends 'Overhanging double-stranded DNA fragment [5' overhanging non-target double-stranded DNA fragment] or / and (iii) Double-stranded DNA that does not have a target region and has 5 'and 3' overhangs, respectively.
  • Step 1 for generating a fragment [5 ′ / 3 ′ overhanging non-target double-stranded DNA fragment], wherein the restriction enzyme A does not cleave the nucleotide sequence in the target region, and the restriction enzyme B The base sequence in the protruding target double-stranded DNA fragment is not cleaved.
  • step 3 of generating a double-stranded DNA fragment [smooth target double-stranded DNA fragment] having a target region and smooth at both ends from (3) a 3 ′ protruding target double-stranded DNA fragment It is characterized by including.
  • the double-stranded DNA according to the present invention is (i) a double-stranded DNA having a target region and having both ends protruding 3 ′ by the action of restriction enzyme A and restriction enzyme B in step 1 of the present invention described later.
  • the double-stranded DNA according to the present invention has a target region described later, two or more restriction enzyme A recognition sequences and a restriction enzyme B recognition sequence.
  • the positional relationship between the target region, the recognition sequence of restriction enzyme A and the recognition sequence of restriction enzyme B as shown in the following schematic diagram,
  • the restriction enzyme A recognition sequence exists outside the target region
  • the restriction enzyme B recognition sequence exists outside the restriction enzyme A recognition sequence (terminal-restriction enzyme B recognition sequence-restriction enzyme A).
  • the positional relationship is closest to the target region and the restriction enzyme A recognition sequence and target region closest to the target region.
  • the recognition sequence of restriction enzyme B is shown. Further, at least the recognition sequence of restriction enzyme A closest to the target region and the recognition sequence of restriction enzyme B do not overlap.
  • the double-stranded DNA according to the present invention may be extracted from a sample containing the DNA, and the extraction may be performed based on a known DNA extraction method.
  • the DNA extraction method include, for example, subjecting a mixture of a sample and a surfactant (sodium cholate, sodium dodecyl sulfate, etc.) to physical treatment (stirring, homogenization, sonication, etc.).
  • a method for extracting DNA by releasing DNA contained in a sample into the mixed solution a method for extracting DNA from a sample using phenol / chloroform, and a column extraction method.
  • a method of extracting DNA from a sample using phenol / chloroform or a column extraction method is preferable, and a column extraction method is more preferable.
  • a sample is added to a cylindrical container such as a column equipped with a membrane, etc., and DNA is extracted from the sample using differences in the size, adsorption power, charge, hydrophobicity, etc. of the substance. It is done by doing.
  • the specific method may be based on a method known per se, such as a commercially available kit [for example, QuickGene SP kit DNA tissue (manufactured by Kurashiki Boseki Co., Ltd.), MagMAX (trademark) Cell-Free DNA Isolation Kit (thermo Fischer Scientific Co., Ltd.) Nucleo Spin (trademark) Plasma XS (Machalai Nagel Co., Ltd.) etc.] may be used.
  • sample examples include whole blood, serum, plasma, urine and other body fluids, tissues, cells, etc., preferably whole blood, serum or plasma, and more preferably whole blood.
  • the target region according to the present invention is a specific known double-stranded DNA portion in the double-stranded DNA according to the present invention.
  • the size (number of base pairs) of the target region according to the present invention is usually 50 to 1000 base pairs, preferably 50 to 700 base pairs, and more preferably 50 to 500 base pairs.
  • a numerical range expressed using “to” means a range including numerical values described before and after “to” as a lower limit value and an upper limit value.
  • Specific examples of the target region according to the present invention include (i) to (iii) shown in Table 1, with (i) or (ii) being preferred, and (ii) being more preferred.
  • Restriction enzyme A in step 1 according to the present invention has the following properties (i) and (ii).
  • (I) A restriction enzyme that generates a 3 ′ overhang at the end of double-stranded DNA. That is, a restriction enzyme capable of cleaving double-stranded DNA into “fragments having 3 ′ protruding ends”.
  • (Ii) a restriction enzyme that does not cleave the base sequence in the target region.
  • restriction enzyme A in step 1 according to the present invention include, for example, AatII, ApaI, BanII, BbeI, Bsp1286I, EcoT22I, HaeII, KpnI, PstI, PvuI, SacI, SacII, Sse8387I and the like. Can be mentioned.
  • the restriction enzyme A in step 1 according to the present invention may be appropriately selected according to the target region and the base sequence of the double-stranded DNA according to the present invention. ) Is preferred, PstI is preferred.
  • the number of restriction enzyme A units in step 1 according to the present invention is usually 1 to 150 units / ⁇ L, preferably 5 to 100 units / ⁇ L, per 1 to 100 ⁇ g of DNA.
  • the number of restriction enzyme A units in step 1 according to the present invention when a plurality of types of restriction enzymes A are used is also the same as described above, and usually 1 to 150 units / ⁇ L for 1 to 100 ⁇ g of DNA. 5 to 100 units / ⁇ L is preferable.
  • the treatment with restriction enzyme A in step 1 according to the present invention may be performed usually at 20 to 50 ° C., preferably at 35 to 45 ° C., usually for 40 to 150 minutes, preferably 60 to 120 minutes.
  • the treatment with restriction enzyme A in step 1 according to the present invention is preferably performed under a pH of 6 to 10, and examples of the buffer used here include MES, ADA, PIPES, ACES, MOPS, BES. Good buffers such as TES, HEPES, TRINCE, and BICINE, phosphate buffers, Tris buffers, glycine buffers, borate buffers, and the like may be used.
  • the restriction enzyme B in step 1 according to the present invention has the following properties (i) and (ii).
  • the restriction enzyme B in step 1 according to the present invention is (iii) a 3 ′ overhang target that has a target region and has 3 ′ overhangs at both ends, resulting from the action of the restriction enzyme A in step 1 according to the present invention. It also has the property of not cleaving the base sequence in the region “corresponding” to the double-stranded DNA fragment.
  • the region “corresponding” to the 3 ′ protruding target double-stranded DNA as used herein means a base sequence supplemented with a complementary base of the 3 ′ protruding base in the 3 ′ protruding target double-stranded DNA fragment.
  • restriction enzyme B in step 1 includes, for example, AccI, AccIII, AflII, Aor13HI, ApalI, AvaI, AvaII, BamHI, BcnI, BglII, BlnI, BmeT110I, BmgT120I, Bpu1102I, BspT104I, Bsp1407I, BssHII , Cfr10I, Cfr13I, ClaI, CpoI, EaeI, EcoO109I, EcoRI, EcoT14I, Eco52I, Eco81I, FbaI, HapII, HindIII, Hin1I, MboI, MflI, MluI, MunI, McoI, Rsp, NheI, P , SalI, Sau3AI, SpeI, TaqI, XbaI, XhoI, XspI and the like.
  • the restriction enzyme B in step 1 according to the present invention may be appropriately selected according to the target region and the base sequence of the double-stranded DNA according to the present invention. ) Is preferred, MboI or BamHI and BglII are preferred.
  • the number of restriction enzyme B units in step 1 according to the present invention is usually 1 to 150 units / ⁇ L, preferably 5 to 100 units / ⁇ L, per 1 to 100 ⁇ g of DNA.
  • the number of restriction enzyme B units in step 1 according to the present invention when a plurality of types of restriction enzymes B are used is the same as described above, and usually 1 to 150 units / ⁇ L for 1 to 100 ⁇ g of DNA. 5 to 100 units / ⁇ L is preferable.
  • the treatment with the restriction enzyme B in the step 1 according to the present invention is usually performed at 20 to 50 ° C., preferably at 35 to 45 ° C., usually for 40 to 150 minutes, preferably 60 to 120 minutes.
  • the treatment with restriction enzyme B in step 1 according to the present invention is preferably performed under pH 6 to 10, and examples of the buffer used here include MES, ADA, PIPES, ACES, MOPS, and BES.
  • Good buffers such as TES, HEPES, TRINCE, and BICINE, phosphate buffers, Tris buffers, glycine buffers, borate buffers, and the like may be used.
  • the positional relationship among the target region, the restriction enzyme A recognition sequence and the restriction enzyme B recognition sequence in the double-stranded DNA according to the present invention is [end-restriction enzyme B recognition sequence-restriction enzyme A recognition]. Sequence-target region-recognition sequence of restriction enzyme A-recognition sequence of restriction enzyme B-terminal].
  • the above positional relationship is [terminal-recognition sequence of restriction enzyme B (closest to the target region)-(target region Restriction enzyme A recognition sequence-target region-restriction enzyme A recognition sequence (closest to the target region) -restriction enzyme B recognition sequence (closest to the target region)].
  • the restriction enzyme B in step 1 due to the action of the restriction enzyme B in step 1 according to the present invention, at least (ii) from the portion other than the region corresponding to the 3 ′ protruding target double-stranded DNA fragment in the double-stranded DNA having the target region (i) Double-stranded DNA fragment [5 'overhanging non-target double-stranded DNA fragment] that does not have a target region and its ends are 5' overhangs and / or (iii) Both ends of the DNA do not have a target region 5 'overhangs And a double-stranded DNA fragment [5 ′ / 3′-overhanging non-target double-stranded DNA fragment] that is 3 ′ overhangs. Also,
  • the portions other than the ends are represented, for example, by the following schematic diagrams (1) to ( As shown in 11), various double-stranded DNA fragments depending on the number of restriction enzyme A recognition sequences, the number of restriction enzyme B recognition sequences, and the order of restriction enzyme A recognition sequences and restriction enzyme B recognition sequences. Occurs.
  • the left (upstream) portion of the double-stranded DNA according to the present invention is shown with the target region as the center, but the right (downstream) portion is the same.
  • step 1 (i) 3 ′ protruding target double-stranded DNA fragment and (ii) 5 ′ protruding non-target double-stranded DNA fragment or / and (iii) 5 ′ / 3 'An overhanging non-target double-stranded DNA fragment is generated, the number of restriction enzyme A and restriction enzyme B recognition sequences in step 1 according to the present invention, the order of restriction enzyme A recognition sequence and restriction enzyme B recognition sequence, and Depending on the shape of the ends of the double-stranded DNA according to the invention, various double-stranded DNA fragments are generated as shown in the following schematic diagram.
  • a 3 ′ protruding non-target double-stranded DNA fragment within a dotted line a smooth / 5 ′ protruding non-target double-stranded DNA fragment, a smooth / 3 ′ protruding non-target double-stranded DNA fragment, and the like are generated.
  • a smooth / 5 ′ protruding non-target double-stranded DNA fragment a smooth / 3 ′ protruding non-target double-stranded DNA fragment, and the like are generated.
  • restriction enzyme A and restriction enzyme B may be used (i) simultaneously, (ii) after using restriction enzyme A, then using restriction enzyme B, or (iii) restriction enzyme After using B, restriction enzyme A may be used.
  • restriction enzyme A may be used.
  • the treated product may be further treated with restriction enzyme B, or (iii) the treated product may be further treated with restriction enzyme A after treating the double-stranded DNA according to the present invention with restriction enzyme B.
  • the above (i) is preferable.
  • the number of restriction enzyme A recognition sequences, the number of restriction enzyme B recognition sequences, the order of the restriction enzyme A recognition sequences and the restriction enzyme B recognition sequences, and the double-stranded DNA having the target region Depending on the shape of both ends (3 ′ overhang, 5 ′ overhang, smooth), etc., various double-stranded DNA fragments may be generated.
  • restriction enzyme B When restriction enzyme B is used after restriction enzyme A
  • treatment with restriction enzyme B is carried out after treatment with restriction enzyme A, first, the two having the target region by the action of restriction enzyme A From the strand DNA, (i) a double-stranded DNA fragment having a target region and 3 ′ overhangs at both ends [3 ′ overhanging target double-stranded DNA fragment]; A certain double-stranded DNA [3 ′ protruding non-target double-stranded DNA fragment] or the like is generated. Next, a 3 ′ protruding non-target double-stranded DNA fragment having a restriction enzyme B recognition sequence is generated by the action of the restriction enzyme B.
  • the number of restriction enzyme A recognition sequences, the number of restriction enzyme B recognition sequences, the order of the restriction enzyme A recognition sequences and the restriction enzyme B recognition sequences, and the double-stranded DNA having the target region Depending on the shape of both ends (3 ′ overhang, 5 ′ overhang, smooth), etc., various double-stranded DNA fragments may be generated.
  • 5 ′ overhanging target double-stranded DNA fragment, smooth / 5 ′ overhanging non-target double-stranded DNA fragment having restriction enzyme A recognition sequence is generated by the action of restriction enzyme A, and (ii) 5 ′ overhang From non-target double-stranded DNA fragments, etc., (i) a double-stranded DNA fragment having a target region and 3 ′ overhangs at both ends [3 ′ overhanging target double-stranded DNA fragment], (iii) having a target region
  • double-stranded DNA fragments [5 ′ / 3′-overhanging non-target double-stranded DNA fragments] having both 5 ′ overhangs and 3 ′ overhangs, respectively, are generated.
  • the number of restriction enzyme A recognition sequences, the number of restriction enzyme B recognition sequences, the order of the restriction enzyme A recognition sequences and the restriction enzyme B recognition sequences, and the double-stranded DNA having the target region Depending on the shape of both ends (3 ′ overhang, 5 ′ overhang, smooth), etc., various double-stranded DNA fragments may be generated.
  • step 1 it is preferable to purify each DNA fragment produced in step 1 according to the present invention.
  • the details of the above purification will be described in detail in [Purification step].
  • step 1 from the double-stranded DNA having the target region, (i) a 3 ′ protruding target double-stranded DNA fragment and (ii) a 5 ′ protruding non-target double-stranded DNA Fragments or / and (iii) 5 ′ / 3 ′ overhanging non-targeted double stranded DNA fragments can be generated.
  • the treatment with exonuclease III in step 2 according to the present invention which will be described later, can be efficiently advanced.
  • Step 2 includes (i) 3 ′ protruding target double-stranded DNA fragment and (ii) 5 ′ protruding non-target double-stranded DNA fragment or / and (iii) 5 ′ /
  • Step 2 includes (i) 3 ′ protruding target double-stranded DNA fragment and (ii) 5 ′ protruding non-target double-stranded DNA fragment or / and (iii) 5 ′ /
  • a step of generating single-stranded DNA fragments each having no target region from the strand DNA fragments is shown below.
  • Exonuclease III in step 2 according to the present invention is a kind of double-stranded DNA-specific nuclease, which acts from the 3 ′ recessed end of double-stranded DNA and generates single-stranded DNA from double-stranded DNA It is.
  • the number of exonuclease III units in Step 2 according to the present invention is usually 1 to 300 units / ⁇ L, preferably 5 to 250 units / ⁇ L, per 1 to 10 ⁇ g of DNA.
  • the treatment with exonuclease III in step 2 according to the present invention is usually performed at 15 to 50 ° C., preferably at 20 to 45 ° C., usually for 40 to 120 minutes, preferably 60 to 100 minutes.
  • the treatment with exonuclease III in step 2 according to the present invention is preferably performed under pH 6 to 10, and examples of the buffer used here include MES, ADA, PIPES, ACES, MOPS, BES.
  • Good buffers such as TES, HEPES, TRINCE, and BICINE, phosphate buffers, Tris buffers, glycine buffers, borate buffers, and the like may be used.
  • step 2 it is preferable to purify the DNA fragment produced by step 2 according to the present invention.
  • the details of the above purification will be described in detail in [Purification step].
  • step 2 by performing step 2 according to the present invention, (i) a 3 ′ protruding target double-stranded DNA fragment and (ii) a 5 ′ protruding non-target double-stranded DNA fragment or / and (iii) 5 ′ / 3 'protruding non-target double-stranded DNA fragment having 3' recessed end (3) 5 'protruding non-target double-stranded DNA fragment or / and (iii) 5' / 3 'protruding non-target double strand From the DNA fragments, (iv) single-stranded DNA fragments having no target region can be generated.
  • Step 3 comprises (iv) a single-stranded DNA fragment having no target region and (i) a 3 ′ protruding target double-stranded DNA fragment generated in Step 2 with a single-strand-specific nuclease.
  • a step of generating a smooth target double-stranded DNA fragment having a target region and smooth at both ends thereof is shown below.
  • the single-strand-specific nuclease in step 3 according to the present invention is an enzyme that degrades single-stranded regions of single-stranded DNA and double-stranded DNA.
  • Specific examples of the single-strand specific nuclease in Step 3 according to the present invention include S1 nuclease, exonuclease I, mung bean nuclease and the like.
  • S1 nuclease is preferable as the single-strand-specific nuclease in Step 3 according to the present invention.
  • the number of single-strand-specific nuclease units in Step 3 according to the present invention is usually 1 to 300 units / ⁇ L, preferably 5 to 250 units / ⁇ L, per 1 to 10 ⁇ g of DNA.
  • the treatment with the single-strand specific nuclease in step 3 according to the present invention is usually performed at 10 to 37 ° C., preferably at 15 to 25 ° C., usually for 5 to 30 minutes, preferably for 10 to 25 minutes. .
  • the treatment with the single-strand specific nuclease in step 3 according to the present invention is preferably performed under pH 4 to 6, and examples of the buffer used here include acetate buffer such as sodium acetate buffer A liquid or the like may be used.
  • step 3 by performing step 3 according to the present invention, (iv) a single-stranded DNA fragment having no target region generated in step 2 according to the present invention, and (i) a 3 ′ protruding target double strand From the DNA fragment, (v) a smooth target double-stranded DNA fragment can be generated. That is, a single-stranded specific nuclease digests (iv) a single-stranded DNA fragment not having a target region and (i) a single-stranded region in a 3 ′ protruding target double-stranded DNA fragment, respectively. Thus, (v) a smooth target double-stranded DNA fragment can be generated.
  • the purification step according to the present invention is a step of purifying DNA. Accordingly, it is preferable to perform the purification step because impurities can be removed before the subsequent processing or steps.
  • the purification step according to the present invention is preferably performed after step 1 according to the present invention and before step 2 according to the present invention, and after step 2 according to the present invention and before step 3 according to the present invention. Further, when the purification step is performed after the step 1 according to the present invention and before the step 2 according to the present invention, it is performed as follows according to the order of the processing of the restriction enzyme A and the restriction enzyme B in the step 1.
  • the purification step according to the present invention is not particularly limited as long as it is a purification method known per se usually performed in this field. Specifically, for example, an alcohol precipitation method, a column purification method, and the like can be mentioned, and a column purification method is preferable because it can be applied to high throughput.
  • the alcohol precipitation method is performed by adding a salt such as a sodium salt or an ammonium salt to a DNA-containing solution, then adding an alcohol, and precipitating the DNA to purify the DNA.
  • a salt such as a sodium salt or an ammonium salt
  • the alcohol precipitation method for example, the following may be performed. That is, add 1-5M sodium acetate 10-50 ⁇ L, alcohol 50-100 ⁇ L and buffer 30-100 ⁇ L to DNA-containing solution 10-200 ⁇ L, and centrifuge at 10000-25000 ⁇ g for 1-30 minutes to collect the precipitate. By doing so, purified DNA can be obtained.
  • the alcohol include isopropanol, ethanol, butanol and the like. Isopropanol or ethanol is preferable, and isopropanol is more preferable.
  • buffer examples include MES, ADA, PIPES, ACES, MOPS, BES, TES, HEPES, TRINCE, BICINE and other Good buffers, phosphate buffers, Tris buffers, glycine buffers, borate buffers, etc. And Tris buffer or phosphate buffer is preferable, and Tris buffer is more preferable.
  • concentration and pH of the buffer solution may be in the range normally used in this field.
  • the alcohol precipitation method may be performed using a commercially available kit.
  • the column purification method is a cylindrical container such as a column equipped with a packing material such as silica gel, polyacrylamide gel, or Sephacryl [for example, Econospin (manufactured by Gene Design), Mobi Spin s-4000 (Molecular Bio). Technology), etc.] is added to the solution, and the DNA is purified using the difference in affinity between the DNA and the filler.
  • a packing material such as silica gel, polyacrylamide gel, or Sephacryl [for example, Econospin (manufactured by Gene Design), Mobi Spin s-4000 (Molecular Bio). Technology), etc.]
  • a packing material such as silica gel, polyacrylamide gel, or Sephacryl [for example, Econospin (manufactured by Gene Design), Mobi Spin s-4000 (Molecular Bio). Technology), etc.]
  • a packing material such as silica gel, polyacrylamide gel, or Sephacryl [for example, Econospin (manufactured by Gene Design), Mobi Spin s-4000 (Molecular Bio
  • centrifuge at 1000-20000 ⁇ g at room temperature for 1-5 minutes to remove the solution in the tube Next, 100 to 700 ⁇ L of buffer solution and 100 to 700 ⁇ L of alcohol are added, and centrifuged at 1000 to 20000 ⁇ g at room temperature for 1 to 5 minutes to remove the solution in the tube. Further, centrifuge at 1000-20000 ⁇ g at room temperature for 1-10 minutes, replace with a new tube, add 10-100 ⁇ L of buffer or sterilized water, and centrifuge at 1000-20000 ⁇ g at room temperature for 1-5 minutes.
  • the purified DNA can be obtained by collecting the flow-through solution.
  • Examples of the protein denaturant include guanidine hydrochloride, formamide, urea and the like, and guanidine hydrochloride is preferable.
  • Examples of the alcohol include ethanol, isopropanol, butanol and the like. Ethanol or isopropanol is preferable, and ethanol is more preferable.
  • Examples of the buffer include MES, ADA, PIPES, ACES, MOPS, BES, TES, HEPES, TRINCE, BICINE and other Good buffers, phosphate buffers, Tris buffers, glycine buffers, borate buffers, etc. And Tris buffer or phosphate buffer is preferable, and Tris buffer is more preferable.
  • the concentration and pH of the buffer solution may be in the range normally used in this field.
  • the above column purification method may be performed using a commercially available kit.
  • nucleic acid extraction kit for example, NucleoSpin (trademark) Plasma XS (manufactured by Machalai Nagel), MagMAX (trademark) Cell-Free DNA Isolation Kit (manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) ) Or QuickGene SP kit DNA tissue (manufactured by Kurashiki Boseki Co., Ltd.)] to extract double-stranded DNA having a target region (for example, a base sequence represented by SEQ ID NO: 2) from a sample (for example, whole blood) To do.
  • a target region for example, a base sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • the solution treated in step 1 according to the present invention may be subjected to a purification step according to the present invention as follows. That is, 100-700 ⁇ L of a protein denaturant (eg, guanidine hydrochloride) and 100-700 ⁇ L of a buffer solution (eg, Tris buffer solution) are added to the solution treated in step 1 of the present invention, and mixed, and filled. Transfer to a column [Econospin (manufactured by Gene Design Co., Ltd.)] packed with the agent, and centrifuge at 1000 to 20000 ⁇ g at room temperature for 1 to 5 minutes to remove the solution in the tube.
  • a protein denaturant eg, guanidine hydrochloride
  • a buffer solution eg, Tris buffer solution
  • step 1 add 100-700 ⁇ L of buffer solution (for example, Tris buffer) and 100-700 ⁇ L of alcohol (for example, ethanol), and centrifuge at 1000-20000 ⁇ g for 1-5 minutes at room temperature to remove the solution in the tube. To do. Furthermore, after centrifuging at 1000-20000 ⁇ g at room temperature for 1-10 minutes, replace with a new tube, add 10-100 ⁇ L of buffer solution (eg, Tris buffer), and add 1000-100,000 ⁇ g at room temperature, 1– Centrifuge for 5 minutes and collect the flow-through.
  • the solution or flow-through liquid obtained in the above-described step 1 according to the present invention is subjected to step 2 according to the present invention.
  • Process 2 according to the present invention 1 to 300 units / ⁇ L of exonuclease III 1 to 5 ⁇ L and exonuclease III processing buffer solution (for example, Tris buffer) 1 to 10 to 50 ⁇ L of the solution or flow-through solution processed in step 1 according to the present invention 1
  • a reaction stop solution for example, EDTA
  • the solution treated in step 2 according to the present invention may be subjected to a purification step according to the present invention as follows. That is, 100-700 ⁇ L of a protein denaturant (eg, guanidine hydrochloride) and 100-700 ⁇ L of a buffer solution (eg, Tris buffer solution) are added to the solution treated in step 2 of the present invention and mixed, and filled. Transfer to a column [Econospin (manufactured by Gene Design Co., Ltd.)] packed with the agent, and centrifuge at 1000 to 20000 ⁇ g at room temperature for 1 to 5 minutes to remove the solution in the tube.
  • a protein denaturant eg, guanidine hydrochloride
  • a buffer solution eg, Tris buffer solution
  • step 3 The solution or flow-through solution obtained in the above and processed in step 2 according to the present invention is subjected to step 3 according to the present invention.
  • buffer solution for example, Tris buffer
  • alcohol for example, ethanol
  • Process 3 1 to 5 ⁇ L of a single-strand specific nuclease (for example, S1 nuclease) 1 to 5 ⁇ L and a single-strand specific nuclease in 10 to 50 ⁇ L of the solution or flow-through solution treated in Step 2 of the present invention
  • a single-strand specific nuclease for example, S1 nuclease
  • a single-strand specific nuclease in 10 to 50 ⁇ L of the solution or flow-through solution treated in Step 2 of the present invention
  • the solution treated in step 3 according to the present invention may be subjected to the purification step according to the present invention as follows.
  • a protein denaturant eg, guanidine hydrochloride
  • a buffer solution eg, Tris buffer solution
  • buffer solution for example, Tris buffer
  • alcohol for example, ethanol
  • the method for detecting a target region in the double-stranded DNA of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the detection method of the present invention) is used in double-stranded DNA having a target region purified by the purification method of the present invention. It detects the target area. That is, following the purification method of the present invention, the target region is subjected to amplification treatment, and the target region is detected by confirming the presence or absence of the target amplification product, and includes the following steps 1 to 5.
  • (1) (a) a double strand having a target region using (a) one or more restriction enzymes A that generate a 3 ′ overhang at the end and (b) one or more restriction enzymes B that generate a 5 ′ overhang at the end From DNA, (i) a double-stranded DNA fragment having a target region and 3 ′ overhangs at both ends [3 ′ overhanging target double-stranded DNA fragment], and (ii) having no target region and 5 at both ends 'Overhanging double-stranded DNA fragment [5' overhanging non-target double-stranded DNA fragment] or / and (iii) Double-stranded DNA that does not have a target region and has 5 'and 3' overhangs, respectively.
  • Step 1 for generating a fragment [5 ′ / 3 ′ overhanging non-target double-stranded DNA fragment], wherein the restriction enzyme A does not cleave the nucleotide sequence in the target region, and the restriction enzyme B The base sequence in the region corresponding to the protruding target double-stranded DNA fragment is not cleaved.
  • Step 4 of subjecting the target region in the smooth target double-stranded DNA fragment generated in Step 3 to amplification treatment, And (5) Step 5 for confirming the presence or absence of the amplification product generated in Step 4 above.
  • Steps 1 to 3 before the step of subjecting the target region to amplification treatment are the same as steps 1 to 3 in the above-described purification method of the present invention, and specific examples and preferred examples thereof are also the same.
  • the method for amplifying the target region in step 4 according to the detection method of the present invention is not particularly limited, and may be performed based on a method known per se.
  • amplification methods known per se include, for example, a PCR (Polymerase Chain Reaction) method, a LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) method, and the like, and the PCR method is preferred.
  • the PCR method may be performed by a known method using a primer, a nucleic acid synthesizing enzyme, a nucleic acid synthesis substrate, a buffer, and a probe if necessary.
  • a primer for example, Nucleic® Acids® Research, 1991, Vol.19, 3749, BioTechniques, 1994, Vol.16, 1134-1137 It may be made based on the method described in the above.
  • a target region in CTC-derived DNA, a target region in cfDNA, or a target region in exosome (exosome) -derived DNA that is present in body fluids such as whole blood, plasma, and urine is preferred.
  • the above-mentioned digital PCR reaction solution is introduced into a number of droplets using a droplet preparation apparatus [eg, QX200 Droplet Generator (manufactured by Bio-Rad Laboratories), Automated Droplet Generator (manufactured by Bio-Rad Laboratories), etc.]]. Divide into 5,000 to 40,000 samples per sample. Then, nucleic acid amplification devices [for example, thermal cycler (Bio-Rad Laboratories), Droplet Digital PCR (Bio-Rad Laboratories), QuantStudio 3D Digital PCR System (Thermo Fisher Scientific) Etc.)] is performed.
  • a droplet preparation apparatus eg, QX200 Droplet Generator (manufactured by Bio-Rad Laboratories), Automated Droplet Generator (manufactured by Bio-Rad Laboratories), etc.
  • nucleic acid amplification devices for example, thermal cycler (Bio-Rad Laboratories), Droplet Digital PCR (Bio-R
  • a primer pair (hereinafter sometimes abbreviated as a primer pair according to the present invention) composed of a forward primer and a reverse primer (hereinafter sometimes abbreviated as a primer according to the present invention) in the PCR method described above. Any of those designed to amplify the target region according to the above may be used.
  • the size (number of bases) of the primer according to the present invention is usually 10 to 50 bases, preferably 10 to 35 bases, more preferably 15 to 35 bases, and particularly preferably 20 to 30 bases. Table 3 below shows primer pairs according to the present invention used for amplifying various target regions.
  • the primer pair according to the present invention is preferably the primer pair according to the present invention as it is, but may be composed of a primer obtained by labeling one or both of the forward primer and the reverse primer with a labeling substance. .
  • the method for labeling the primer according to the present invention with a labeling substance is not particularly limited, and may be performed based on a method known per se.
  • the labeling substance used for labeling the primer according to the present invention with a labeling substance include known labeling substances such as a fluorescent substance, a radioisotope, an enzyme, and a luminescent substance, and a fluorescent substance is preferable.
  • the fluorescent substance include TAMRA (trademark) (manufactured by Sigma Aldrich), Alexa555, Alexa647 (manufactured by Invitrogen), Cyine Dye-based Cy3, Cy5 (manufactured by Amersham Biosciences), fluorescein and the like. Is mentioned.
  • radioactive isotopes examples include 32 P, 33 P, 35 S and the like.
  • the enzyme examples include alkaline phosphatase and horseradish peroxidase.
  • the luminescent substance examples include chemiluminescent reagents containing Acridinium Easter.
  • Examples of the method of labeling the primer according to the present invention with a fluorescent substance include a method of incorporating a fluorescein-labeled nucleotide into a primer based on a method known per se, and a nucleotide having a linker arm is substituted into a sequence oligonucleotide. And the like (Nucleic® Acids® Res., 1986, Vol. 14, p. 6115).
  • a method of labeling the primer according to the present invention with a radioisotope when synthesizing the primer, a method of labeling the primer by incorporating a nucleotide labeled with a radioisotope, after synthesizing the primer, examples include a method of labeling with an isotope. Specific examples include commonly used random primer methods, nick translation, 5 'end labeling method using T4 polynucleotide kinase, 3' end labeling method using terminal deoxynucleotidyl transferase, and the like.
  • Examples of the method for labeling the primer according to the present invention with an enzyme include direct labeling methods such as direct covalent binding of enzyme molecules such as alkaline phosphatase and horseradish peroxidase to the labeling primer.
  • Examples of a method for labeling the primer according to the present invention with a luminescent substance include a method for labeling a nucleotide with a luminescence based on a method known per se.
  • the above-mentioned labeling substance may be bound to the primer according to the present invention, and in that case, it may be carried out based on a method known per se.
  • the method for labeling the 5 ′ end of the probe according to the present invention with a reporter fluorescent dye and the 3 ′ end with a quencher fluorescent dye is as described in the method for labeling the primer pair according to the present invention with a labeling substance. is there.
  • Examples of the reporter fluorescent dye used for labeling the probe according to the present invention with a reporter fluorescent dye and a quencher fluorescent dye include FAM, HEX, and VIC.
  • Examples of the quencher fluorescent dye include TAMRA (trademark) and BHQ1. , BHQ2 and the like.
  • FAM is preferable as the reporter fluorescent dye
  • BHQ1 is preferable as the quencher fluorescent dye.
  • step 4 by performing step 4 according to the detection method of the present invention, (v) the target region in the smooth target double-stranded DNA fragment produced in step 3 according to the detection method of the present invention is specifically amplified. be able to.
  • Step 5 of the detection method of the present invention is a step of confirming the presence or absence of the amplification product generated in step 4 according to the detection method of the present invention.
  • the method for confirming the presence or absence of the amplification product in step 5 according to the detection method of the present invention is not particularly limited as long as it is a method usually performed in this field, and may be performed based on a method known per se. Specifically, for example, (a) a method for confirmation by electrophoresis, (b) a method for confirmation by a fluorescence reader, and the like can be mentioned.
  • (A) Method of confirming by electrophoresis The method of confirming by electrophoresis is to subject the amplification product obtained in step 4 according to the detection method of the present invention to electrophoresis, and to its mobility (mobility, etc.). Specific methods include (a-1) labeled primer method, (a-2) intercalator method, (a-3) labeled probe method and the like.
  • the labeled primer method is “using a primer pair including a labeled primer obtained by labeling at least one of the primers according to the present invention with a labeling substance, and performing step 4 according to the detection method of the present invention.
  • the obtained amplification product is subjected to electrophoresis, and the presence or absence of the amplification product obtained in step 4 according to the detection method of the present invention is confirmed by detecting the label in the amplification product ” .
  • the labeled primer labeled with the labeling substance is as described in Step 4 according to the detection method of the present invention. Further, the above “detecting the label” means that the labeling substance is directly or indirectly measured based on the property of the labeling substance.
  • the electrophoresis in the labeled primer method may be based on a method that moves at different speeds or moves at different distances depending on the charge intensity of the substance.
  • agarose gel electrophoresis acrylamide, etc.
  • examples thereof include gel electrophoresis and capillary electrophoresis, and agarose gel electrophoresis or capillary electrophoresis is more preferable.
  • the agarose gel electrophoresis method may be performed based on, for example, the method described in “Basics of Bio-Experiment Illustrated II Gene Analysis, 2006, pp 53-56”.
  • the capillary electrophoresis may be performed based on, for example, the methods described in WO2007 / 027495, WO2011 / 118496, WO2008 / 075520, and the like.
  • Ethidium compounds eg, ethidium bromide, ethidium homodimer 1 (EthD-1), ethidium homodimer 2 (EthD-2), ethidium bromide monoazide (EMA), dihydroethidium, etc.
  • Acridine dye for example, acridine orange
  • Iodine compounds propidium iodide, hexidinium iodide, etc.
  • cyanine dimer dyes eg POPO-1, BOBO-1, YOYO-1, TOTO-1, JOJO-1, POPO-3, LOLO-1 , BOBO-3, YOYO-3, TOTO-3 (all manufactured by Molecular Probes) etc.
  • Cyanine monomer dyes eg PO-PRO-1, BO-PRO-1, YO-PRO-1, TO-PRO-1, JO-PRO-1, PO-PRO-3
  • the labeled probe method is “use the primer pair according to the present invention, perform step 4 according to the detection method of the present invention, and subject the obtained amplification product to electrophoresis. Next, the amplification product is subjected to heat treatment to form a single strand. Next, a hybrid having a base sequence complementary to the base sequence of the amplification product labeled with a labeling substance is hybridized to obtain a hybrid, and the label in the hybrid is detected.
  • the method for confirming the presence or absence of the amplification product obtained in step 4 according to the detection method of the invention is.
  • Examples of the labeled probe labeled with a labeling substance include the same as those described in Step 4 of the detection method of the present invention, and specific examples and preferred examples thereof are also the same.
  • Examples of electrophoresis in the labeled probe method include the same ones as described in (a-1) Labeled primer method, and specific examples and preferred examples thereof are also the same.
  • (B) Method of Detecting with Fluorescence Reader The method of detecting with a fluorescence reader is “perform step 4 according to the detection method of the present invention using the primer pair and probe of the present invention. Next, the presence or absence of the amplification product obtained in step 4 according to the detection method of the present invention is confirmed by detecting the fluorescence derived from each droplet with a fluorescence reader.
  • a fluorescence reader in the method of detecting with a fluorescence reader the one attached to the nucleic acid amplification device [for example, QX200 Droplet Reader (manufactured by Bio-Rad Laboratories), etc.] may be used.
  • Step 4 according to the detection method of the present invention A reagent for digital PCR containing a nucleic acid synthesis substrate, a nucleic acid synthase, etc.
  • the reaction solution for digital PCR is set in a nucleic acid amplification apparatus [for example, manufactured by Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories)] and incubated at 30 to 40 ° C. for 15 to 60 minutes. Then, a droplet is produced with a droplet production apparatus [for example, QX 200 Droplet Generator (manufactured by Bio-Rad Laboratories) or Automated Droplet Generator (manufactured by Bio-Rad Laboratories)].
  • a droplet production apparatus for example, QX 200 Droplet Generator (manufactured by Bio-Rad Laboratories) or Automated Droplet Generator (manufactured by Bio-Rad Laboratories)].
  • the droplet is dispensed into a well plate (for example, a 96-well plate), and then a nucleic acid amplification apparatus [for example, thermal cycler (manufactured by Bio-Rad Co., Ltd.)] is used at 90 to 97 ° C. for 1 After heating for ⁇ 15 minutes, (1) 90-97 ° C. for 5 to 35 seconds and (2) 60-70 ° C. for 10 to 90 seconds as one cycle, heating for 30-50 cycles, , The nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2) can be amplified.
  • a nucleic acid amplification apparatus for example, thermal cycler (manufactured by Bio-Rad Co., Ltd.)
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 can be amplified.
  • Step 5 By detecting the fluorescence in the amplification product amplified in step 4 according to the detection method of the present invention in each droplet with a fluorescence reader [for example, QX200 Droplet Reader (manufactured by Bio-Rad Laboratories Co., Ltd.)]. The presence or absence of the amplification product amplified in step 4 according to the detection method of the present invention can be confirmed.
  • a fluorescence reader for example, QX200 Droplet Reader (manufactured by Bio-Rad Laboratories Co., Ltd.)
  • the cancer determination method of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the determination method of the present invention) is sensitive to methylation against double-stranded DNA having a target region purified by the purification method of the present invention. A treatment with a restriction enzyme is performed, then the target region is amplified, and it is determined whether or not the cancer is based on the result, and includes the following steps 1 to 7.
  • (1) (a) a double strand having a target region using (a) one or more restriction enzymes A that generate a 3 ′ overhang at the end and (b) one or more restriction enzymes B that generate a 5 ′ overhang at the end From DNA, (i) a double-stranded DNA fragment having a target region and 3 ′ overhangs at both ends [3 ′ overhanging target double-stranded DNA fragment], and (ii) having no target region and 5 at both ends 'Overhanging double-stranded DNA fragment [5' overhanging non-target double-stranded DNA fragment] or / and (iii) Double-stranded DNA that does not have a target region and has 5 'and 3' overhangs, respectively.
  • Step 1 to generate a 5 ′ / 3 ′ overhanging non-target double-stranded DNA fragment, wherein the restriction enzyme A does not cleave the base sequence in the target region, and the restriction enzyme B does not cut the 3 ′ overhang.
  • the base sequence in the target double-stranded DNA fragment is not cleaved.
  • step 4 of treating the smooth target double-stranded DNA fragment generated in the step 3 with a methylation sensitive restriction enzyme, (5) Step 5 of subjecting the target region in the smooth target double-stranded DNA fragment treated in Step 4 to amplification treatment (v), (6) Step 6 for confirming the presence or absence of an amplification product generated in Step 5 above, And (7) including the step 7 of determining cancer based on the confirmation result of the step 6.
  • Steps 1 to 3 before the treatment with the methylation-sensitive restriction enzyme are the same as steps 1 to 3 in the above-described purification method of the present invention, and specific examples and preferred examples thereof are also the same.
  • Step 5 for amplifying the target region and Step 6 for confirming the presence or absence of the amplification product are the same as Step 4 and Step 5 in the detection method of the present invention described above, and specific examples and preferred examples thereof are also the same. is there.
  • [Double-stranded DNA], [Target region], [Cancer], [Step 4] and [Step 7] will be described in detail below.
  • a purification step may be performed subsequent to each step, and specific examples and preferred examples thereof are as described in [Purification step] in the purification method of the present invention.
  • the double-stranded DNA according to the determination method of the present invention is a double-stranded DNA containing a CpG sequence (-CG-), and due to the action of restriction enzyme A and restriction enzyme B in step 1 of the present invention, ( i) a double-stranded DNA fragment having a target region and 3 ′ overhangs at both ends [3 ′ overhanging target double-stranded DNA fragment], and (ii) having no target region and 5 ′ overhangs at both ends Double-stranded DNA fragment [5 ′ overhanging non-target double-stranded DNA fragment] or / and (iii) Double-stranded DNA fragment [5 ′ without target region and 5 ′ overhang and 3 ′ overhang, respectively.
  • -CG- CpG sequence
  • / 3 'protruding non-target double-stranded DNA fragment may be used as long as it can generate (1) both ends protruding (3' protruding or / and 5 'protruding), (2) both ends smooth, 3) Either one end may protrude (3 ′ protrusion or 5 ′ protrusion) and the other end may be smooth, or (4) annular.
  • the target region, the positional relationship between the recognition sequence of restriction enzyme A and the recognition sequence of restriction enzyme B, and the extraction of double-stranded DNA according to the determination method of the present invention Is the same as [double-stranded DNA] in the purification method of the present invention described above, and specific examples and preferred examples thereof are also the same.
  • the target region according to the determination method of the present invention is a continuous specific double-stranded DNA portion containing a CpG sequence in which cytosine present in the double-stranded DNA according to the determination method of the present invention is methylated.
  • the above methylation means base modification by DNA methylase, and means a state in which a methyl group is added to the 5-position of the cytosine base of the CpG sequence, which is a 2-base sequence in which guanine appears next to cytosine.
  • Specific examples and preferred examples of the target region according to the determination method of the present invention are as described in [Target region] in the above-described purification method of the present invention.
  • the cancer according to the determination method of the present invention is a disease or disease characterized by direct proliferation or / and metastasis to adjacent tissues through uncontrollable cell division or / and invasion.
  • Specific examples of cancer determined by the determination method of the present invention include cell cancer, adenocarcinoma, lymphoma, leukemia, sarcoma, mesothelioma, neuroma, osteosarcoma, germ cell tumor, prostate cancer, lung cancer, breast cancer, colon Rectal cancer, gastrointestinal cancer, bladder cancer, pancreatic cancer, endometrial cancer, cervical cancer, ovarian cancer, melanoma, brain cancer, testicular cancer, kidney cancer, skin cancer, thyroid cancer, head and neck cancer, liver cancer, esophageal cancer Gastric cancer, colon cancer, bone marrow cancer, neuroblastoma, retinoblastoma and the like. Lung cancer, breast cancer, pancreatic cancer, liver cancer, stomach cancer or colon cancer are preferable,
  • Step 4 according to the determination method of the present invention is a step of treating the smooth target double-stranded DNA fragment generated in step 3 according to the determination method of the present invention with a methylation sensitive restriction enzyme.
  • the methylation sensitive restriction enzyme in Step 4 according to the determination method of the present invention is a restriction enzyme whose cleavage activity changes depending on whether cytosine in the CpG sequence in the recognition sequence is methylated. That is, a methylation-sensitive restriction enzyme means that when a recognition sequence has a CpG sequence containing a methylated cytosine base, the recognition sequence cannot be cleaved, but the recognition sequence has a CpG sequence containing a methylated cytosine base.
  • the methylation sensitive restriction enzyme in step 4 according to the determination method of the present invention may be any as long as the base sequence to be recognized exists in the target region. That is, it may be appropriately selected according to the target area.
  • methylation-sensitive restriction enzyme in Step 4 include, for example, AatII, AccI, AccII, AciI, AfaI, Aor13HI, Aor51HI, ApaI, ApalI, BglI, BmgT120I, BspT104I, BssHII , BstuI, Cfr10I, ClaI, CpoI, EaeI, Eco52I, FauI, HaeII, HapII, HpaII, HhaI, MluI, NaeI, NheI, NotI, NruI, NsbI, PmaCI, Psp1406I, PvuI, SacII, SalI, Sac3, SalI, Sac3 , VpaK11BI and the like.
  • methylation sensitive restriction enzymes in Step 4 include HapII, HpaII, BstUI, AciI and / or FauI is preferred.
  • the number of methylation-sensitive restriction enzyme units in step 4 according to the determination method of the present invention is usually 1 to 150 units / ⁇ L, preferably 5 to 100 units / ⁇ L, with respect to 1 to 10 ⁇ g of the target DNA. ⁇ 50 units / ⁇ L is more preferred. Further, the number of units of the methylation sensitive restriction enzyme in step 4 according to the determination method of the present invention when using multiple types of methylation sensitive restriction enzymes is the same as described above, and for 1 to 10 ⁇ g of the target DNA, 1 to 150 units / ⁇ L, preferably 5 to 100 units / ⁇ L, more preferably 10 to 50 units / ⁇ L.
  • Treatment with a methylation sensitive restriction enzyme in Step 4 according to the determination method of the present invention is usually 20 to 50 units.
  • the reaction may be performed at a temperature of 35 ° C., preferably 35 to 45 ° C., usually for 30 to 150 minutes, preferably 30 to 120 minutes.
  • the treatment with the methylation sensitive restriction enzyme in Step 4 according to the determination method of the present invention is preferably performed under the condition of pH 6 to 10, and examples of the buffer used here include MES, ADA, PIPES.
  • Good buffers such as ACES, MOPS, BES, TES, HEPES, TRINCE, and BICINE, phosphate buffer, Tris buffer, glycine buffer, borate buffer, and the like may be used.
  • the DNA fragment after step 4 is preferable to purify the DNA fragment after step 4 according to the determination method of the present invention.
  • the above purification is the same as the [Purification step] in the purification method of the present invention, and specific examples and preferred examples thereof are also the same.
  • the target region of the double-stranded DNA that is methylated is not cleaved, and the two that are not methylated Since the target region of the strand DNA is cleaved, the target region of the double-stranded DNA that is methylated can be specifically and highly amplified in Step 5 according to the determination method of the present invention.
  • Step 7 according to the determination method of the present invention is a step of determining cancer based on the result of step 6 according to the determination method of the present invention. That is, the determination is made based on the result of confirmation of the presence or absence of the amplification product amplified in step 5 according to the determination method of the present invention.
  • the determination of cancer in step 7 according to the determination method of the present invention is performed using data obtained from the results of steps 1 to 6 according to the determination method of the present invention. That is, the target amplification product amplified in step 5 according to the determination method of the present invention is detected, and cancer is determined based on the result that the amplification product is detected.
  • the determination target of the cancer is based on a sample derived from DNA including the target region.
  • a sample derived from a DNA containing a target region is a tissue, a cell, or the like
  • a cancer determination target is the tissue, the cell, or the like itself, or an animal from which the tissue, the cell, or the like is derived. That is, not only is it determined whether or not the tissue, cell, etc. itself is cancerous, but the animal from which the tissue, cell, etc. is derived suffers from cancer or there are cancer cells in the animal It is also determined whether or not.
  • the determination target of cancer is as follows (i) and (ii).
  • the DNA containing the target region is derived from cells in body fluids such as whole blood, serum, plasma, urine (blood cells such as leukocytes, cells derived from each tissue, CTC, etc.), the cells themselves Furthermore, it is an animal from which the cells are derived. That is, not only is it determined whether or not the cell itself is cancerous, but it is also determined whether or not the animal from which the cell is derived has cancer or whether the animal has cancer cells. Is done.
  • the determination target of cancer is the whole blood, serum, plasma
  • body fluids such as urine. That is, it is determined whether or not an animal derived from a body fluid such as whole blood, serum, plasma, or urine suffers from cancer or whether cancer cells are present in the animal.
  • the target region is amplified in step 5 according to the determination method of the present invention, and thus an amplification product is obtained.
  • the amplification product is not detected because the target region is not amplified in step 5 according to the determination method of the present invention. .
  • the target region is amplified in the amplification process of step 5 according to the determination method of the present invention.
  • step 6 of the determination method of the invention the amplification product is confirmed.
  • the target region is not methylated, the target region is cleaved by the methylation-sensitive restriction enzyme. Therefore, the target region is not amplified in the amplification process of step 5 according to the determination method of the present invention. No amplification product is confirmed in step 6 of the method. Accordingly, in the step 6 according to the determination method of the present invention, when (a) the method for confirming by electrophoresis is performed, (i) when the amplification product is confirmed, the target for determining the cancer derived from the target region is affected by cancer.
  • the target for determining the cancer derived from the target region is suffering from cancer. It can be determined that no or no cancer cells are present in the subject.
  • step 6 when (b) a method of confirming by a fluorescence reader is performed, (i) when at least one droplet emitting fluorescence exceeding a preset threshold is confirmed, The target of cancer from the target region can be determined as having cancer or having cancer cells in the target, and (ii) a droplet emitting fluorescence exceeding a preset threshold is confirmed. If not, it can be determined that the target for determining cancer from the target region is not suffering from cancer or cancer cells are not present in the target.
  • the threshold value setting function of the said fluorescence reader [For example, QX200 Droplet Reader (Bio-Rad Laboratories Co., Ltd. product)], and may determine from the result of having amplified the target area
  • Step 4 according to the determination method of the present invention 1 to 150 units / ⁇ L of a methylation sensitive restriction enzyme (for example, HapII, HpaII, SacII, BstUI, AciI or / and 5 to 50 ⁇ L of the solution or flow-through solution treated in Step 3 according to the determination method of the present invention.
  • a methylation sensitive restriction enzyme for example, HapII, HpaII, SacII, BstUI, AciI or / and 5 to 50 ⁇ L of the solution or flow-through solution treated in Step 3 according to the determination method of the present invention.
  • FauI Add 0.5 to 3 ⁇ L of methylation sensitive restriction enzyme treatment buffer (eg, Tris buffer) 2.5 to 15 ⁇ L, and prepare 25 to 100 ⁇ L with sterile water.
  • the solution treated in Step 4 according to the determination method of the present invention is obtained by reacting at 20 to 50 ° C. for 30 to 150 minutes.
  • the solution treated in step 4 according to the determination method of the present invention may be subjected to the purification step according to the present invention as follows. That is, 100 to 700 ⁇ L of a protein denaturant (for example, guanidine hydrochloride) and 100 to 700 ⁇ L of a buffer solution (for example, Tris buffer solution) are added to the solution processed in step 4 according to the determination method of the present invention and mixed. Then, transfer to a column packed with packing material (for example, Econospin (manufactured by Gene Design Co., Ltd.)), and centrifuge at 1000 to 20000 ⁇ g at room temperature for 1 to 5 minutes to remove the solution in the tube.
  • a protein denaturant for example, guanidine hydrochloride
  • a buffer solution for example, Tris buffer solution
  • buffer solution for example, Tris buffer
  • alcohol for example, ethanol
  • Step 7 according to the determination method of the present invention
  • the target for determining cancer from the target region is It is possible to determine that the patient is suffering from cancer or cancer cells are present in the subject.
  • the target of cancer determination from the target region is not affected by cancer or cancer cells are not present in the target. Can be determined.
  • the reagent for determining cancer according to the present invention comprises restriction enzyme A, restriction enzyme B, exonuclease III, single-strand specific nuclease and methylation sensitive restriction enzyme.
  • restriction enzyme A restriction enzyme B
  • restriction enzyme B single-strand specific nuclease and methylation sensitive restriction enzyme used in the cancer determination reagent according to the present invention
  • the purification method of the present invention> ⁇ the detection method of the present invention>
  • specific examples and preferred examples thereof are also the same.
  • the cancer determination reagent according to the present invention may further contain one or more of the following reagents usually used in this field.
  • the cancer determination reagent may include instructions for carrying the following steps: a) DNA purification column [e.g., Econospin (manufactured by Gene Design Co., Ltd.)], b) Nucleic acid amplification reaction reagents [eg, one or more primers, probes, nucleic acid synthesis substrates, nucleic acid synthases, etc.] c) Reagent for nucleic acid amplification product confirmation [for example, agarose gel, loading buffer, staining reagent (GeL Red TM stain, ethidium bromide, etc.)] d) Reagent for DNA extraction [for example, QuickGene SP kit DNA tissue (manufactured by Kurashiki Boseki Co., Ltd.), NucleoSpin (trademark) Plasma XS (manufactured by Machalai Nagel Co., Ltd.), MagMAX (trademark) Cell-Free DNA Isolation Kit ( Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.)] Further,
  • the “instructions” means the instruction manual for the cancer determination reagent according to the present invention, and the accompanying text, in which the characteristics, principles, operation procedures, etc. in the determination method of the present invention are substantially described by text or diagrams. Or it means a pamphlet (leaflet).
  • the determination method of the present invention can be performed simply, in a short time and with high accuracy.
  • the method for obtaining data for determining cancer according to the present invention includes two target regions purified by the purification method of the present invention.
  • the target DNA is subjected to treatment with a methylation-sensitive restriction enzyme, then the target region is amplified, and a target to be judged whether or not it is cancer based on the result is used to make a cancer judgment Data is acquired.
  • Steps 1 to 6 in the determination method are performed.
  • the process steps 1 to 3 before the treatment with the methylation-sensitive restriction enzyme are the same as the processes 1 to 3 in the purification method of the present invention described above, and specific examples and preferred examples thereof are also the same.
  • Step 5 for amplifying the target region and step 6 for confirming the presence or absence of the amplification product are the same as Step 4 and Step 5 in the detection method of the present invention described above, and specific examples and preferred examples thereof are also the same.
  • Step 4 of treatment with a methylation-sensitive restriction enzyme is the same as step 4 in the determination method of the present invention described above, and specific examples, preferred examples, and the like are also the same.
  • [Double-stranded DNA], [Target region] and [Cancer] are [Double-stranded DNA according to the determination method of the present invention], [Target region according to the determination method of the present invention] and [Cancer] in the determination method of the present invention. Cancer according to the determination method of the present invention], and specific examples and preferred examples thereof are also the same.
  • the data in the method for obtaining data according to the present invention includes (i) the result value obtained in step 6 (for example, fluorescence intensity, electrophoretic diagram, etc.) according to the method for obtaining data according to the present invention, (ii) ) Further obtained values are subjected to multivariate analysis such as multiple logistic regression analysis, discriminant analysis, Poisson regression analysis, multiple regression analysis, Cox proportional hazard model, path analysis, etc.
  • multivariate analysis such as multiple logistic regression analysis, discriminant analysis, Poisson regression analysis, multiple regression analysis, Cox proportional hazard model, path analysis, etc.
  • Comparison data for example, data indicating magnitude relationship
  • a reference value for example, cut-off value
  • the determination target include data indicating that cancer is present or cancer cells are present in the target, and (i) or (iii) is preferable, and (i) is more preferable.
  • a purification step may be performed subsequent to each step, and specific examples and preferred examples thereof are as described in [Purification step] in the purification method of the present invention. is there. As described above, according to the method for obtaining data according to the present invention, it is possible to obtain data for accurately determining cancer.
  • a marker for determining cancer according to the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as a marker according to the present invention) is used for double-stranded DNA having a target region purified by the purification method of the present invention.
  • an amplification product obtained by treating with a methylation sensitive restriction enzyme and then amplifying the target region can be determined for the target for determining cancer derived from the target region based on the presence or absence of the marker according to the present invention.
  • Step 1 in the determination method of the present invention described above is obtained by performing steps 5 to 5.
  • Steps 1 to 3 before carrying out the methylation-sensitive restriction enzyme are the same as steps 1 to 3 in the purification method of the present invention described above, and specific examples and preferred examples thereof are also the same.
  • Step 5 for amplifying the target region is the same as step 4 in the detection method of the present invention described above, and specific examples and preferred examples thereof are also the same.
  • Step 4 of treatment with a methylation-sensitive restriction enzyme is the same as step 4 in the determination method of the present invention described above, and specific examples, preferred examples, and the like are also the same.
  • [Double-stranded DNA], [Target region] and [Cancer] are [Double-stranded DNA according to the determination method of the present invention] and [Target region according to the determination method of the present invention] in the determination method of the present invention.
  • [cancer according to the determination method of the present invention] and specific examples and preferred examples thereof are also the same.
  • a purification step may be performed, and specific examples and preferred examples thereof are as described in [Purification step] in the purification method of the present invention.
  • a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 wherein at least one cytosine in the base sequence is methylated
  • a sequence A nucleotide sequence represented by No. 2 wherein at least one cytosine in the nucleotide sequence is methylated
  • a nucleotide sequence represented by SEQ ID No. 3 comprising at least Examples include a base sequence in which one cytosine is methylated, (i) or (ii) is preferred, and (ii) is more preferred.
  • the cytosine in the above (i) to (iii) may be any cytosine in the base sequence, but is preferably a cytosine derived from the CpG sequence.
  • the determination method of the present invention can be performed simply, in a short time and with high accuracy.
  • a double-stranded DNA having a target region purified by the purification method of the present invention is treated with a methylation-sensitive restriction enzyme, then the target region is amplified, Based on the result, it is determined whether or not the target region is methylated. That is, following the purification method of the present invention, a step of treating with a methylation-sensitive restriction enzyme, a step of amplifying a target region, a step of checking the presence or absence of an amplification product, and a step of determining methylation are performed.
  • the method includes the step 7 of determining whether the target region is methylated based on the results of the steps 1 to 6 and (7) step 6 in the determination method of the invention.
  • Steps 1 to 3 before the treatment with the methylation-sensitive restriction enzyme are the same as steps 1 to 3 in the above-described purification method of the present invention, and specific examples and preferred examples thereof are also the same.
  • Step 5 for amplifying the target region and step 6 for confirming the presence or absence of the amplification product are the same as Step 4 and Step 5 in the detection method of the present invention described above, and specific examples and preferred examples thereof are also the same.
  • Step 4 of treatment with a methylation-sensitive restriction enzyme is the same as step 4 in the determination method of the present invention described above, and specific examples, preferred examples, and the like are also the same.
  • [Double-stranded DNA] and [Target region] are the same as [Double-stranded DNA according to the determination method of the present invention] and [Target region according to the determination method of the present invention] in the determination method of the present invention.
  • the specific examples and preferred examples thereof are also the same.
  • a purification step may be performed subsequent to each step. Specific examples and preferred examples thereof are as described in [Purification step] in the purification method of the present invention. is there. [Step 7] will be described in detail below.
  • Step 7 in the methylation determination method according to the present invention is a step of determining whether or not the target region is methylated based on the result of step 6 in the methylation determination method according to the present invention. That is, the determination of whether or not the target region in the methylation determination method according to the present invention is methylated is based on the result of confirmation of the presence or absence of the amplification product amplified in step 5 in the methylation determination method according to the present invention. It is done. When the target region is methylated, the target region is amplified in step 5 in the methylation determination method according to the present invention, so that an amplification product is obtained.
  • the amplification product is not obtained because the target region is not amplified in step 5 in the methylation determination method according to the present invention.
  • step 6 of the methylation determination method according to the present invention when (a) a method for confirmation by electrophoresis is performed, (i) when an amplification product is confirmed, it is determined that the target region is methylated. (Ii) If no amplification product is confirmed, it can be determined that the target region is not methylated.
  • step 6 in the methylation determination method according to the present invention when (b) a method of confirming with a fluorescence reader is performed, (i) when at least one droplet emitting fluorescence exceeding a preset threshold is confirmed.
  • the target region can be determined to be methylated, and (ii) if no droplet emitting fluorescence exceeding a preset threshold value is confirmed, the target region is determined not to be methylated be able to.
  • a double-stranded DNA having a target region purified by the purification method of the present invention is treated with a methylation sensitive restriction enzyme, and then the target region Is to amplify. That is, following the purification method of the present invention, a step of treating with a methylation-sensitive restriction enzyme and a step of amplifying the target region are performed, and steps 1 to 5 in the determination method of the present invention are performed.
  • Steps 1 to 3 before the treatment with the methylation-sensitive restriction enzyme are the same as steps 1 to 3 in the above-described purification method of the present invention, and specific examples and preferred examples thereof are also the same.
  • Step 5 for amplifying the target region is the same as step 4 in the detection method of the present invention described above, and specific examples and preferred examples thereof are also the same.
  • Step 4 of treatment with a methylation-sensitive restriction enzyme is the same as step 4 in the determination method of the present invention described above, and specific examples, preferred examples, and the like are also the same.
  • [Double-stranded DNA] and [Target region] are the same as [Double-stranded DNA according to the determination method of the present invention] and [Target region according to the determination method of the present invention] in the determination method of the present invention.
  • the specific examples and preferred examples thereof are also the same.
  • a purification step may be carried out subsequent to each step.
  • Specific examples and preferred examples thereof are the [Purification step] in the purification method of the present invention.
  • amplification of methylated DNA can be performed simply, in a short time and with high accuracy.
  • the reagent for determining methylation according to the present invention is characterized by containing restriction enzyme A, restriction enzyme B, exonuclease III, single-strand specific nuclease and methylation sensitive restriction enzyme, specific examples thereof, Preferred examples and the like are as described in ⁇ Cancer determination reagent of the present invention>.
  • the methylation determination reagent according to the present invention may include instructions for carrying out the methylation determination method according to the present invention.
  • the “instruction” is an instruction manual for the reagent for determining methylation according to the present invention, in which the features, principles, operation procedures, etc.
  • the methylation determination method according to the present invention can be performed simply, in a short time and with high accuracy.
  • Example> Human induced pluripotent stem cells (normal cells) ⁇ Normal human whole blood, colon cancer cells (cancer cells) ⁇ Methylation status confirmation area> ⁇ Includes three CpG sequences surrounded by a square in the region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (267 base pairs) within the promoter region of the human-derived FOXB2 gene represented in FIG. Sequence (CCGG) ⁇ Includes 7 CpG sequences surrounded by a square among the region (149 base pairs) consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the promoter region of the human-derived FOXB2 gene represented in FIG. Sequence (CCGG and GCGG)
  • the forward primer is obtained by adding a restriction enzyme (HindIII) recognition site (in parentheses in the sequence) to the forward primer of (4) above, and has the following base sequence.
  • the reverse primer is obtained by adding a restriction enzyme (BamHI) recognition site (in parentheses in the sequence) to the reverse primer of (4), and has the following base sequence.
  • Figure 3 shows the results of deciphering the base sequences of human induced pluripotent stem cells, human normal whole blood, and colon cancer cells, and the cytosine of the sequence containing the CpG sequence (CCGG and GCGG) is methylated. It represents whether it is cytosine or unmethylated cytosine.
  • Circles 1 to 3 in FIG. 3 correspond to circles 1 to 3 in FIGS.
  • circles 4 to 7 in FIG. 3 correspond to circles 4 to 7 in FIG.
  • ⁇ indicates that the cytosine of the CpG sequence is unmethylated cytosine
  • ⁇ indicates that the cytosine of the CpG sequence is methylated cytosine.
  • cytosine of the sequence (CCGG and GCGG) containing the CpG sequence which is a confirmation region of the methylation state of human induced pluripotent stem cells and human normal whole blood, is unmethylated cytosine.
  • cytosine of sequences (CCGG and GCGG) containing the CpG sequence which is a confirmation region of the methylation state of colon cancer cells, is methylated cytosine.
  • Table 4 shows the sample used in Example 1, the amount of template DNA derived from the sample, and the target region.
  • S1 nuclease single-strand-specific nuclease
  • purification 30 ⁇ L of DNA-containing Tris-HCL solution obtained in (4) above 10 ⁇ L and 180 ⁇ 10 ⁇ S1 nuclease buffer (Takara Bio Inc.) 2 ⁇ L of unit / ⁇ L of S1 nuclease was added and adjusted to 100 ⁇ L with sterile water. Then, after reacting for 20 minutes at 23 ° C., 1 ⁇ L of 0.5 M EDTA (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) was added.
  • 0.5 M EDTA manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.
  • HapII methylation-sensitive restriction enzyme
  • HapII methylation sensitive restriction enzyme
  • the size (number of base pairs) of the amplification product obtained with the above primer is 267 base pairs (SEQ ID NO: 1).
  • a PCR reaction solution was prepared in the same manner as above except that the template obtained in (5) above was used as a template, and this was used as a control.
  • Each of the PCR reaction solutions was set in a thermal cycler (manufactured by Bio-Rad Laboratories Co., Ltd.), and PCR was performed under the following reaction conditions. * Reaction conditions 94 °C for 2 minutes ⁇ 96 cycles for 5 seconds ⁇ 68 ° C for 20 seconds, 40 cycles ⁇ 68 ° C for 2 minutes
  • Electrophoresis After adding and mixing 3 ⁇ L of 6 ⁇ Loading Buffer Double Dye (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) to each 15 ⁇ L of the amplification product-containing solution obtained in (7) above, the mixture was mixed with 2% agarose gel. Electrophoresis was performed. Subsequently, it was stained with GeLRed nucleic acid gel staining solution (manufactured by FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and amplification products were each confirmed by a UV irradiation apparatus. The results are shown in FIG.
  • Table 5 summarizes the sample in each lane of FIG. 4, the amount of template DNA derived from the sample, and the target region.
  • DNA derived from human induced pluripotent stem cells 100 ⁇ g was treated with restriction enzyme A, restriction enzyme B, exonuclease III, single-strand specific nuclease, and methylation sensitive restriction enzyme.
  • restriction enzyme A restriction enzyme B
  • exonuclease III single-strand specific nuclease
  • methylation sensitive restriction enzyme a methylation sensitive restriction enzyme
  • the sample human induced pluripotent stem cell
  • the sample human induced pluripotent stem cell
  • a normal cell DNA derived from colorectal cancer cells (3 ⁇ g) was treated with a methylation-sensitive restriction enzyme and a PCR amplification reaction was performed using the primer pair according to the present invention (lane 4), the desired amplification product [human origin] The specific region (267 base pairs, SEQ ID NO: 1)] of the FOXB2 gene was confirmed, and it was found that the target region was obtained. Therefore, the target region was not cleaved by the methylation sensitive restriction enzyme, and it was determined that “the target region is methylated”. It was also possible to determine that “the sample (colorectal cancer cell) is a cancer cell”.
  • Example 1 From the results of Example 1, it was found that according to the method of the present invention, it can be easily and accurately determined whether or not the sample (cell) is a cancer cell.
  • Example 2 Analysis of FOXB2 gene in normal human whole blood A sample, the amount of template DNA derived from the sample and the target region were set as shown in Table 6, and amplification products were confirmed by the same method as in Example 1. The results are shown in FIG.
  • human normal whole blood-derived DNA (60.5 ⁇ g) was treated with restriction enzyme A, restriction enzyme B, exonuclease III, single-strand specific nuclease and methylation sensitive restriction enzyme,
  • restriction enzyme A restriction enzyme B
  • restriction enzyme B restriction enzyme B
  • exonuclease III single-strand specific nuclease and methylation sensitive restriction enzyme
  • the target amplification product [specific region of human-derived FOXB2 gene (267 base pairs, SEQ ID NO: 1)] was not confirmed, and the target region It can be seen that is not obtained. Therefore, the target region was cleaved by a methylation-sensitive restriction enzyme, and it was determined that “the target region is not methylated”. It can also be determined that “no cancer cells are present in the sample (human normal whole blood)” or “the subject (human) derived from the sample (human normal whole blood) is not afflicted with cancer”. It was.
  • Example 3 Analysis of FOXB2 gene in whole blood of cancer patient and normal human whole blood FOXB2 gene was analyzed for DNA derived from pancreatic cancer patient (stage IV) whole blood and normal human whole blood.
  • Table 7 shows the sample used in Example 3, the amount of template DNA derived from the sample, and the target region.
  • S1 nuclease single-strand specific nuclease
  • 10 ⁇ S1 nuclease buffer Takara Bio Inc.
  • 180 units / 1 ⁇ L of ⁇ L of S1 nuclease was added and adjusted to 100 ⁇ L with sterile water. Then, it was made to react at 23 degreeC for 15 minutes.
  • sequence recognized by HpaII is surrounded by a square among the region (149 base pairs) consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the human-derived FOXB2 gene promoter region shown in FIG.
  • One (circle 1, circle 2 and circle 3) is a sequence (CCGG) containing a CpG sequence.
  • sequence recognized by AciI is 4 surrounded by a square in the region (149 base pairs) consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the human-derived FOXB2 gene promoter region shown in FIG. This is a sequence (5′-CCGC-3 ′, 3′-GGCG-5 ′) containing the CpG sequence (circle 4, circle 5, circle 6 and circle 7).
  • reaction solution for digital PCR was set in a thermal cycler (manufactured by Bio-Rad Laboratories) and reacted at 37 ° C. for 30 minutes.
  • create droplets with Automated Droplet Generator Bio-Rad Laboratories Co., Ltd.
  • dispense these droplets into 96-well plates and then use a thermal cycler (Bio-Rad Laboratories Co., Ltd.).
  • An amplification reaction by digital PCR was performed under the following reaction conditions. PCR was performed under the following reaction conditions. * Reaction conditions 95 °C for 10 minutes ⁇ 94 ° C 30 seconds ⁇ 62 ° C 1 minute for 40 cycles ⁇ 98 ° C.
  • the primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NOs: 16 and 17 and the probe consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 18 are specific regions (sequences) of the GAPDH gene selected as an endogenous control.
  • the GAPDH gene was analyzed with a fluorescence intensity of 4000 based on the GAPDH gene analysis results. Therefore, for the analysis of the FOXB2 gene, if there is at least one droplet with a fluorescence intensity of 8000, it is determined as positive (the target amplification product was obtained), and there is no droplet with a fluorescence intensity of 8000. In the case of negative, the target amplification product was not obtained. For GAPDH gene analysis, if there is at least one droplet with a fluorescence intensity of 4000, it is determined to be positive (the target amplification product was obtained), and there is no droplet with a fluorescence intensity of 4000 or more. In the case of negative, the target amplification product was not obtained. Table 8 and Table 9 show the sample, target region, number of positive droplets, number of negative droplets, total number of droplets, and threshold values in FIG.
  • the target region was not cleaved by a methylation sensitive restriction enzyme, and it was determined that “the target region is methylated”. Further, it is determined that “a subject (pancreatic cancer patient) derived from a sample (whole blood derived from a pancreatic cancer patient) suffers from cancer or cancer cells are present in the subject (pancreatic cancer patient)”. I was able to. On the other hand, for human normal whole blood, the target region was cleaved by a methylation sensitive restriction enzyme, and it was determined that “the target region was not methylated”. It was also possible to determine that “the subject (human) derived from the sample (human normal whole blood) does not suffer from cancer or no cancer cells are present in the subject (human)”.
  • target region purification and detection and cancer determination can be performed easily, in a short time, and with high accuracy.

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Abstract

本発明の課題は、標的領域の精製を、簡便、短時間且つ精度よく行うことができる方法の提供することにある。　本発明は、「二本鎖ＤＮＡ中の標的領域の精製方法及び検出方法、並びに癌の判定方法」に関する。

Description

標的領域の精製方法、検出方法及び癌の判定方法
　本発明は、標的領域の精製方法、検出方法及び癌の判定方法に関する。
　血液等の体液、細胞、組織等の試料に由来するDNA中の標的領域の精製は、標的領域を検出する上で重要な処理である。
　これは、標的領域の精製が十分に行われないと、PCR等の核酸増幅反応により標的領域を増幅する際、プライマーが標的領域以外の領域（非標的領域）にアニーリングし、非標的領域が増幅されてしまうためである。その結果、標的領域の検出が困難となる。
　また、標的領域の精製は、試料中の希少細胞[例えば、血液中に存在する血中循環腫瘍細胞（CTC：Circulating Tumor Cell）等]に由来するDNA中の標的領域を検出する場合、特に重要な処理である。
　これは、試料中に存在する希少細胞に由来するDNA中の標的領域を検出する場合、試料から多量のDNA（例えば、2μg～100μg）を抽出する必要があり、この多量のDNAの存在により、プライマーが非標的領域に多数アニーリングし、非標的領域が多数増幅されてしまうためである。その結果、標的領域の検出が極めて困難となる。
　標的領域の精製方法としては、例えば、標的領域の一部又は全部に相補的な塩基配列を有するプローブ等を用いる方法が挙げられる（特許文献1）。
　しかしながら、特許文献1の方法は適切なプローブを設計する必要があり、また、非標的領域を除去するために種々の工程を複数回繰り返す必要がある。そのため、特許文献1の方法は、煩雑且つ精度が低いものである。
　従って、標的領域の精製を、簡便且つ高精度に行うことができる方法の開発が望まれていた。
特開2002-223761
　本発明は、標的領域の精製を、簡便、短時間且つ精度よく行うことができる方法の提供を課題とする。
　本発明は、上記課題を解決する目的でなされたものであり、以下の構成よりなる。
［1］下記工程1～3を含む、二本鎖DNA中の標的領域の精製方法：
（1）（a）末端に3’突出を生じさせる制限酵素Aを1種以上及び（b）末端に5’突出を生じさせる制限酵素Bを1種以上用いて、標的領域を有する二本鎖DNAから、（i）標的領域を有しその両端が3’突出である二本鎖DNA断片［3’突出標的二本鎖DNA断片］並びに、（ii）標的領域を有さずその両端が5’突出である二本鎖DNA断片［5’突出非標的二本鎖DNA断片］又は／及び（iii）標的領域を有さずその両端がそれぞれ5’突出及び3’突出である二本鎖DNA断片［5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片］を生じさせる工程1、ここで、当該制限酵素Aは当該標的領域中の塩基配列を切断せず、当該制限酵素Bは当該3’突出標的二本鎖DNA断片中の塩基配列を切断しないものである、
（2）前記工程1で生じた、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片並びに、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片を、エキソヌクレアーゼIIIで処理することにより、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片から、それぞれ（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片を生じさせる工程2、
（3）前記工程2で生じた、（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片及び（i）3’突出標的二本鎖DNA断片を、一本鎖特異的ヌクレアーゼで処理することにより、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片から、（v）標的領域を有しその両端が平滑である二本鎖DNA断片［平滑標的二本鎖DNA断片］を生じさせる工程3。
［2］前記工程1において、制限酵素A及び制限酵素Bを同時に用いる、［1］に記載の精製方法。
［3］下記工程1～5を含む、二本鎖DNA中の標的領域の検出方法：
（1）（a）末端に3’突出を生じさせる制限酵素Aを1種以上及び（b）末端に5’突出を生じさせる制限酵素Bを1種以上用いて、標的領域を有する二本鎖DNAから、（i）標的領域を有しその両端が3’突出である二本鎖DNA断片［3’突出標的二本鎖DNA断片］並びに、（ii）標的領域を有さずその両端が5’突出である二本鎖DNA断片［5’突出非標的二本鎖DNA断片］又は／及び（iii）標的領域を有さずその両端がそれぞれ5’突出及び3’突出である二本鎖DNA断片［5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片］を生じさせる工程1、ここで、当該制限酵素Aは当該標的領域中の塩基配列を切断せず、当該制限酵素Bは当該3’突出標的二本鎖DNA断片中の塩基配列を切断しないものである、
（2）前記工程1で生じた、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片並びに、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片を、エキソヌクレアーゼIIIで処理することにより、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片から、それぞれ（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片を生じさせる工程2、
（3）前記工程2で生じた、（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片及び（i）3’突出標的二本鎖DNA断片を、一本鎖特異的ヌクレアーゼで処理することにより、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片から、（v）標的領域を有しその両端が平滑である二本鎖DNA断片［平滑標的二本鎖DNA断片］を生じさせる工程3、
（4）前記工程３で生じた、（v）平滑標的二本鎖DNA断片中の標的領域を増幅処理に付す工程４、
（5）前記工程４で生じた、増幅産物の有無を確認する工程５。
［4］前記工程1において、制限酵素A及び制限酵素Bを同時に用いる、［3］に記載の検出方法。
［5］下記工程1～7を含む、癌の判定方法：
（1）（a）末端に3’突出を生じさせる制限酵素Aを1種以上及び（b）末端に5’突出を生じさせる制限酵素Bを1種以上用いて、標的領域を有する二本鎖DNAから、（i）標的領域を有しその両端が3’突出である二本鎖DNA断片［3’突出標的二本鎖DNA断片］並びに、（ii）標的領域を有さずその両端が5’突出である二本鎖DNA断片［5’突出非標的二本鎖DNA断片］又は／及び（iii）標的領域を有さずその両端がそれぞれ5’突出及び3’突出である二本鎖DNA断片［5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片］を生じさせる工程1、ここで、当該制限酵素Aは当該標的領域中の塩基配列を切断せず、当該制限酵素Bは当該3’突出標的二本鎖DNA断片中の塩基配列を切断しないものである、
（2）前記工程1で生じた、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片並びに、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片を、エキソヌクレアーゼIIIで処理することにより、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片から、それぞれ（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片を生じさせる工程2、
（3）前記工程2で生じた、（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片及び（i）3’突出標的二本鎖DNA断片を、一本鎖特異的ヌクレアーゼで処理することにより、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片から、（v）標的領域を有しその両端が平滑である二本鎖DNA断片［平滑標的二本鎖DNA断片］を生じさせる工程3、
（4）前記工程3で生じた、（v）平滑標的二本鎖DNA断片を、メチル化感受性制限酵素で処理する工程4、
（5）前記工程4で処理された、（v）平滑標的二本鎖DNA断片中の標的領域を増幅処理に付す工程5、
（6）前記工程5で生じた、増幅産物の有無を確認する工程6、
（7）前記工程6の確認結果に基づいて、癌を判定する工程7。
［6］前記工程1において、制限酵素A及び制限酵素Bを同時に用いる、［5］に記載の判定方法。
［7］前記標的領域が配列番号1又は配列番号2で表される塩基配列を含む塩基配列である、［5］又は［6］に記載の判定方法。
［8］前記工程1の制限酵素AがPstIであって、制限酵素BがMboI、BamHI、BglII又はHindIIIである、［5］～［7］の何れかに記載の判定方法。
［9］前記工程3の一本鎖特異的ヌクレアーゼが、S１ヌクレアーゼである、［5］～［8］の何れかに記載の判定方法。
［10］前記工程４のメチル化感受性制限酵素が、HapII、HpaII、SacII、BstuI、AciI又はFauIである、［5］～［9］の何れかに記載の判定方法。
　本発明の二本鎖DNA中の標的領域の精製方法及び検出方法によれば、標的領域の精製及び検出を簡便、短時間且つ精度よく行うことができる。
　また、本発明の二本鎖DNA中の標的領域の精製方法及び検出方法を利用した、本発明の癌の判定方法によれば、癌の判定を簡便、短時間且つ精度よく行うことができる。
ヒト由来のFOXB2遺伝子プロモーター領域内の配列番号1で表される塩基配列からなる領域（267塩基対）について、実験例1におけるメチル化状態の確認領域を示した図である。 ヒト由来のFOXB2遺伝子プロモーター領域内の配列番号2で表される塩基配列からなる領域(149塩基対)について、実験例1におけるメチル化状態の確認領域を示した図である。 実験例1におけるヒト人工多能性幹細胞、ヒト正常全血及び大腸癌細胞の塩基配列解読結果について、メチル化状態の確認領域であるCpG配列を含む配列（CCGG及びGCGG）のシトシンがメチル化シトシン又は非メチル化シトシンの何れであるかを示した図である。 実施例1において、ヒト人工多能性幹細胞及び大腸癌細胞を用いてFOXB2遺伝子のPCR増幅産物を電気泳動した結果を示した図である。 実施例2において、ヒト正常全血を用いてFOXB2遺伝子のPCR増幅産物を電気泳動した結果を示した図である。 実施例3において、膵臓癌患者由来の全血及びヒト正常全血を用いてFOXB2遺伝子及びGAPDH遺伝子の特定領域をデジタルPCR法により増幅・検出した結果を示した図である。
＜本発明の二本鎖DNA中の標的領域の精製方法＞
　本発明の二本鎖DNA中の標的領域の精製方法（以下、本発明の精製方法と略記する場合がある。）は、
（1）（a）末端に3’突出を生じさせる制限酵素Aを1種以上及び（b）末端に5’突出を生じさせる制限酵素Bを1種以上用いて、標的領域を有する二本鎖DNAから、（i）標的領域を有しその両端が3’突出である二本鎖DNA断片［3’突出標的二本鎖DNA断片］並びに、（ii）標的領域を有さずその両端が5’突出である二本鎖DNA断片［5’突出非標的二本鎖DNA断片］又は／及び（iii）標的領域を有さずその両端がそれぞれ5’突出及び3’突出である二本鎖DNA断片［5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片］を生じさせる工程1、ここで、当該制限酵素Aは当該標的領域中の塩基配列を切断せず、当該制限酵素Bは当該3’突出標的二本鎖DNA断片中の塩基配列を切断しないものである、
（2）前記工程1で生じた、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片並びに、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片を、エキソヌクレアーゼIIIで処理することにより、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片から、それぞれ（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片を生じさせる工程2、
及び
（3）前記工程2で生じた、（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片及び（i）3’突出標的二本鎖DNA断片を、一本鎖特異的ヌクレアーゼで処理することにより、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片から、（v）標的領域を有しその両端が平滑である二本鎖DNA断片［平滑標的二本鎖DNA断片］を生じさせる工程3を含むことを特徴とするものである。
［二本鎖DNA］
　本発明に係る二本鎖DNAは、後述の本発明に係る工程1における制限酵素A及び制限酵素Bの作用により、(i)標的領域を有しその両端が3’突出である二本鎖DNA断片［3’突出標的二本鎖DNA断片］並びに、(ii)標的領域を有さずその両端が5’突出である二本鎖DNA断片［5’突出非標的二本鎖DNA断片］又は／及び（iii）標的領域を有さずその両端がそれぞれ5’突出及び3’突出である二本鎖DNA断片［5’ ／3’突出非標的二本鎖DNA断片］を生じ得るものであればよく、（1）その両端がそれぞれ突出（3’突出又は／及び5’突出）、（2）その両端がそれぞれ平滑、（3）一方の端が突出（3’突出又は5’突出）且つもう一方の端が平滑、又は（4）環状、の何れであってもよい。
　即ち、本発明に係る二本鎖DNAは、後述の標的領域、2ヶ所以上の制限酵素Aの認識配列及び制限酵素Bの認識配列を有するものである。また、本発明に係る二本鎖DNAにおける、標的領域、制限酵素Aの認識配列及び制限酵素Bの認識配列の位置関係は、下記模式図に示す通り、当該標的領域を中心とした場合、当該標的領域の外側に当該制限酵素Aの認識配列が存在し、更に当該制限酵素Aの認識配列の外側に当該制限酵素Bの認識配列が存在する（末端－制限酵素Bの認識配列－制限酵素Aの認識配列－標的領域－制限酵素Aの認識配列－制限酵素Bの認識配列－末端）ものである。
　尚、制限酵素Aの認識配列及び制限酵素Bの認識配列が3ヶ所以上存在する場合には、上記位置関係は、標的領域、標的領域に最も近い制限酵素Aの認識配列及び標的領域に最も近い制限酵素Bの認識配列を示す。
　また、少なくとも、標的領域に最も近い制限酵素Aの認識配列と制限酵素Bの認識配列とは重複しないものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　本発明に係る二本鎖DNAは、当該DNAを含む試料から抽出すればよく、当該抽出は、自体公知のDNAの抽出方法に基づいてなされればよい。当該DNAの抽出方法としては、具体的には、例えば、試料と界面活性剤（コール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム等）との混合液を物理的処理（撹拌、ホモジナイズ、超音波処理等）に付し、試料に含まれるDNAを当該混合液中に遊離させることによりDNAを抽出する方法、フェノール・クロロホルムを用いて試料からDNAを抽出する方法、カラム抽出法等が挙げられる。中でも、フェノール・クロロホルムを用いて試料からDNAを抽出する方法又はカラム抽出法が好ましく、カラム抽出法がより好ましい。
　フェノール・クロロホルムを用いて試料からDNAを抽出する方法は、試料中に含まれるタンパク質を変性させる作用を有するフェノールの性質と、当該作用を促進させるクロロホルムの性質とに基づいて、試料中に存在するタンパク質を除き、DNAを抽出することによりなされる。
　具体的な方法は、自体公知の方法に基づいてなされればよく、市販のキット［例えば、Phase Lock Gel(QTB（株）製)等］を用いて行ってもよい。
　カラム抽出法は、メンブレン等を内部に備えたカラム等の筒状の容器に試料を添加し、物質の大きさ、吸着力、電荷、疎水性等の違いを利用して、試料からDNAを抽出することによりなされる。
　具体的な方法は、自体公知の方法に基づいてなされればよく、市販のキット［例えば、QuickGene SP kit DNA tissue(倉敷紡績（株）製)、MagMAX（商標） Cell-Free DNA Isolation Kit（サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）製）Nucleo Spin（商標） Plasma XS（マッハライ・ナーゲル（株）製）等］を用いて行ってもよい。
　上記試料としては、具体的には、例えば、全血、血清、血漿、尿等の体液、組織、細胞等が挙げられ、全血、血清又は血漿が好ましく、全血がより好ましい。
　尚、上記試料を用いた場合の本発明に係る二本鎖DNAとしては、具体的には、例えば、全血、血清、血漿、尿等の体液中に存在する、循環癌（腫瘍）細胞（CTC：Circulating Tumor Cell）由来の二本鎖DNA、癌（腫瘍）細胞、白血球等の血液細胞、各組織由来の細胞等の死滅に由来する二本鎖DNA（cf DNA：cell free DNA）、エクソソーム（エキソソーム）由来の二本鎖DNA、組織、細胞、全血、尿等の中に存在する細胞由来の二本鎖DNA等が挙げられ、CTC由来の二本鎖DNAが好ましい。
［標的領域］
　本発明に係る標的領域は、本発明に係る二本鎖DNA中の特定の既知の二本鎖DNA部分である。
　本発明に係る標的領域の大きさ（塩基対数）は、通常50～1000塩基対であり、50～700塩基対が好ましく、50～500塩基対がより好ましい。
　尚、本明細書において「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
　本発明に係る標的領域としては、具体的には、例えば、表1に示す（i）～（iii）が挙げられ、（i）又は（ii）が好ましく、（ii）がより好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［工程１］
　本発明に係る工程１は、（1）（a）末端に3’突出を生じさせる制限酵素Aを1種以上及び（b）末端に5’突出を生じさせる制限酵素Bを1種以上用いて、標的領域を有する二本鎖DNAから、（i）標的領域を有しその両端が3’突出である二本鎖DNA断片［3’突出標的二本鎖DNA断片］並びに、（ii）標的領域を有さずその両端が5’突出である二本鎖DNA断片［5’突出非標的二本鎖DNA断片］又は／及び（iii）標的領域を有さずその両端がそれぞれ5’突出及び3’突出である二本鎖DNA断片［5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片］を生じさせる工程である。
　本発明に係る工程１における制限酵素Aは、下記（i）及び（ii）の性質を有するものである。
（i）二本鎖DNAの末端に3’突出を生じさせる制限酵素。即ち、二本鎖DNAを、「3’突出末端を有する断片」に切断し得る制限酵素。
（ii）標的領域中の塩基配列を切断しない制限酵素。
　本発明に係る工程１における制限酵素Aの具体例としては、具体的には、例えば、AatII、ApaI、BanII、BbeI、Bsp1286I、EcoT22I、HaeII、KpnI、PstI、PvuI、SacI、SacII、Sse8387I等が挙げられる。
　本発明に係る工程1における制限酵素Aは、標的領域及び本発明に係る二本鎖DNAの塩基配列に応じて適宜選択されればよいが、標的領域として上記表1の（i）～（iii）を選択する場合には、PstIが好ましい。
　本発明に係る工程１における制限酵素Aのユニット数は、通常、DNA1～100μgに対して、1～150ユニット／μLであり、5～100ユニット／μLが好ましい。また、複数種の制限酵素Aを用いた場合の本発明に係る工程１における制限酵素Aのユニット数についても上記と同様であり、通常、DNA1～100μgに対して、それぞれ1～150ユニット／μLであり、5～100ユニット／μLが好ましい。
　本発明に係る工程１における制限酵素Aによる処理は、通常、20～50℃で、好ましくは35～45℃で、通常40～150分間、好ましくは60～120分間反応を行えばよい。
　また、本発明に係る工程１における制限酵素Aによる処理は、pH6～10の下でなされることが好ましく、ここで用いられる緩衝液としては、例えば、MES、ADA、PIPES、ACES、MOPS、BES、TES、HEPES、TRINCE、BICINE等のグッド緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等を用いればよい。
　本発明に係る工程１における制限酵素Bは、下記（i）及び（ii）の性質を有するものである。
（i）二本鎖DNAの末端に5’突出を生じさせる制限酵素。即ち、二本鎖DNAを、「5’突出末端を有する断片」に切断し得る制限酵素。
（ii）本発明に係る工程1における制限酵素Aの作用により生じる、標的領域を有しその両端が3’突出である、3’突出標的二本鎖DNA断片中の塩基配列を切断しない制限酵素。
　尚、制限酵素Aを用いた後に、制限酵素Bを用いる場合には、制限酵素Bによる処理の際、上記3’突出標的二本鎖DNA断片は既に生じているが、制限酵素Bを用いた後に、制限酵素Aを用いる場合、制限酵素Bによる処理の際、上記3’突出標的二本鎖DNA断片は生じていない。そのため、本発明に係る工程1における制限酵素Bは、(iii)本発明に係る工程1における制限酵素Aの作用により生じる、標的領域を有しその両端が3’突出である、3’突出標的二本鎖DNA断片に「対応する」領域中の塩基配列を切断しない、という性質も有する。ここで言う3’突出標的二本鎖DNAに「対応する」領域とは、3’突出標的二本鎖DNA断片において、3’突出の塩基の相補塩基を補った塩基配列を意味する。
　本発明に係る工程１における制限酵素Bの具体例として、例えば、AccI、AccIII、AflII、Aor13HI、ApalI、AvaI、AvaII、BamHI、BcnI、BglII、BlnI、BmeT110I、BmgT120I、Bpu1102I、BspT104I、Bsp1407I、BssHII、Cfr10I、Cfr13I、ClaI、CpoI、EaeI、EcoO109I、EcoRI、EcoT14I、Eco52I、Eco81I、FbaI、HapII、HindIII、Hin1I、MboI、MflI、MluI、MunI、MvaI、NcoI、NheI、NotI、PshBI、Psp1406I、RspRSII、SalI、Sau3AI、SpeI、TaqI、XbaI、XhoI、XspI等が挙げられる。
　本発明に係る工程1における制限酵素Bは、標的領域及び本発明に係る二本鎖DNAの塩基配列に応じて適宜選択されればよいが、標的領域として上記表1の（i）～（iii）を選択する場合には、MboI、又はBamHI及びBglIIが好ましい。
　本発明に係る工程１における制限酵素Bのユニット数は、通常、DNA1～100μgに対して、1～150ユニット／μLであり、5～100ユニット／μLが好ましい。また、複数種の制限酵素Bを用いた場合の本発明に係る工程１における制限酵素Bのユニット数についても上記と同様であり、通常、DNA1～100μgに対して、それぞれ1～150ユニット／μLであり、5～100ユニット／μLが好ましい。
　本発明に係る工程１における制限酵素Bによる処理は、通常、20～50℃で、好ましくは35～45℃で、通常40～150分間、好ましくは60～120分間反応を行えばよい。
　また、本発明に係る工程１における制限酵素Bによる処理は、pH6～10の下でなされることが好ましく、ここで用いられる緩衝液としては、例えば、MES、ADA、PIPES、ACES、MOPS、BES、TES、HEPES、TRINCE、BICINE等のグッド緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等を用いればよい。
　本発明に係る工程1における制限酵素A及び制限酵素Bによる処理を行った場合に生じるDNA断片について、以下に説明する。
　上述の通り、本発明に係る二本鎖DNAにおける、標的領域、制限酵素Aの認識配列及び制限酵素Bの認識配列の位置関係は、［末端－制限酵素Bの認識配列－制限酵素Aの認識配列－標的領域－制限酵素Aの認識配列－制限酵素Bの認識配列－末端］である。
　また、制限酵素Aの認識配列及び制限酵素Bの認識配列が3ヶ所以上存在する場合には、上記位置関係は、［末端－（標的領域に最も近い）制限酵素Bの認識配列－（標的領域に最も近い）制限酵素Aの認識配列－標的領域－（標的領域に最も近い）制限酵素Aの認識配列－（標的領域に最も近い）制限酵素Bの認識配列］である。
　そのため、本発明に係る工程1における制限酵素Aの作用により、標的領域を有する二本鎖DNAから、(i)標的領域を有しその両端が3’突出である二本鎖DNA断片［3’突出標的二本鎖DNA断片］が生じることとなる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
　一方、本発明に係る工程1における制限酵素Bの作用により、標的領域を有する二本鎖DNAにおける(i)3’突出標的二本鎖DNA断片に対応する領域以外の部分から、少なくとも(ii)標的領域を有さずその両端が5’突出である二本鎖DNA断片［5’突出非標的二本鎖DNA断片］又は／及び（iii）標的領域を有さずその両端がそれぞれ5’突出及び3’突出である二本鎖DNA断片［5’/3’突出非標的二本鎖DNA断片］が生じることとなる。また、
　また、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片に対応する領域以外の部分における制限酵素Aの認識配列の数、制限酵素Bの認識配列の数及び制限酵素Aの認識配列と制限酵素Bの認識配列の順序や、本発明に係る二本鎖DNAの両端の形状（3’突出、5’突出、平滑）等によって、更に種々の二本鎖DNA断片が生じることとなる。
・制限酵素の認識配列の数及び順序の違いによる二本鎖DNA断片の種類
　上述の通り、制限酵素Aの認識配列の数、制限酵素Bの認識配列の数及び制限酵素Aの認識配列と制限酵素Bの認識配列の順序によって種々の二本鎖DNA断片が生じることとなる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　従って、標的領域を有する二本鎖DNAにおける(i)3’突出標的二本鎖DNA断片に対応する領域以外の部分のうち、末端を除く部分については、例えば、下記模式図（1）～（11）に示すように、制限酵素Aの認識配列の数、制限酵素Bの認識配列の数及び制限酵素Aの認識配列と制限酵素Bの認識配列の順序の違いにより種々の二本鎖DNA断片が生じる。
　尚、下記模式図には、標的領域を中心として本発明に係る二本鎖DNAの左側（上流）部分のみを示すが、右側（下流）部分も同様である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000016

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000017
・二本鎖DNA両端の形状（3’突出、5’突出、平滑）の違いによる二本鎖DNA断片の種類
　標的領域を有する二本鎖DNAにおける(i)3’突出標的二本鎖DNA断片に対応する領域以外の部分のうち、末端部分については、例えば、下記模式図（12）～（17）に示すように、両端の形状（3’突出、5’突出、平滑）と両端に近接する制限酵素A又は制限酵素Bの種類によって種々の二本鎖DNA断片が生じる。尚、下記模式図には、標的領域を中心として本発明に係る二本鎖DNAの左側（上流）部分のみを示すが、右側（下流）部分も同様である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000018

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000019

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000020

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000021

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000022

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000023
　上述の通り、本発明に係る工程1においては、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片並びに、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片が生じ、本発明に係る工程1における制限酵素A及び制限酵素Bの認識配列の数、制限酵素Aの認識配列と制限酵素Bの認識配列の順序、並びに本発明に係る二本鎖DNAの末端の形状の違いによって、下記模式図の通り、種々の二本鎖DNA断片が生じることとなる。例えば、点線内の3’突出非標的二本鎖DNA断片、平滑／5’突出非標的二本鎖DNA断片、平滑／3’突出非標的二本鎖DNA断片等が生じる。以下、模式図では同様に記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000024
　本発明に係る工程１においては、制限酵素Aと制限酵素Bは（i）同時に用いても、（ii）制限酵素Aを用いた後、制限酵素Bを用いても、又は（iii）制限酵素Bを用いた後、制限酵素Aを用いてもよい。
　言い換えれば、（i）本発明に係る二本鎖DNAを制限酵素Aと制限酵素Bとで同時に処理しても、（ii）本発明に係る二本鎖DNAを制限酵素Aで処理した後、処理物を更に制限酵素Bで処理しても、又は（iii）本発明に係る二本鎖DNAを制限酵素Bで処理した後、処理物を更に制限酵素Aで処理してもよい。
　尚、処理に要する時間等を考慮すると、上記（i）が好ましい。
　以下に、上記（i）、（ii）又は（iii）による処理を行った場合の、本発明に係る工程１の模式図を示す。
　（i）制限酵素Aと制限酵素Bを同時に用いる場合
　制限酵素A及び制限酵素Bによる処理を同時に行った場合、標的領域を有する二本鎖DNAから、（i）標的領域を有しその両端が3’突出である二本鎖DNA断片［3’突出標的二本鎖DNA断片］（ii）標的領域を有さずその両端が5’突出である二本鎖DNA断片［5’突出非標的二本鎖DNA断片］、（iii）標的領域を有さずその両端がそれぞれ5’突出及び3’突出である二本鎖DNA断片［5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片］等が同時にそれぞれ生じることとなる。
　尚、前述の通り、制限酵素Aの認識配列の数、制限酵素Bの認識配列の数及び制限酵素Aの認識配列と制限酵素Bの認識配列の順序や、標的領域を有する二本鎖DNAの両端の形状（3’突出、5’突出、平滑）等によって、更に種々の二本鎖DNA断片が生じる場合がある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000025
　（ii）制限酵素Aを用いた後、制限酵素Bを用いる場合
　制限酵素Aによる処理の後、制限酵素Bによる処理を行った場合、まずは、制限酵素Aの作用により、標的領域を有する二本鎖DNAから、（i）標的領域を有しその両端が3’突出である二本鎖DNA断片［3’突出標的二本鎖DNA断片］、標的領域を有さずその両端が3’突出である二本鎖DNA［3’突出非標的二本鎖DNA断片］等がそれぞれ生じる。
　次いで、制限酵素Bの作用により、制限酵素Bの認識配列を有する、3’突出非標的二本鎖DNA断片が生じ、平滑／3’突出非標的二本鎖DNA断片等から、（ii）標的領域を有さずその両端が5’突出である二本鎖DNA断片［5’突出非標的二本鎖DNA断片］、（iii）標的領域を有さずその両端がそれぞれ5’突出及び3’突出である二本鎖DNA断片［5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片］等がそれぞれ生じる。
　尚、前述の通り、制限酵素Aの認識配列の数、制限酵素Bの認識配列の数及び制限酵素Aの認識配列と制限酵素Bの認識配列の順序や、標的領域を有する二本鎖DNAの両端の形状（3’突出、5’突出、平滑）等によって、更に種々の二本鎖DNA断片が生じる場合がある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000026
　（iii）制限酵素Bを用いた後、制限酵素Aを用いた場合
　制限酵素Bによる処理の後、制限酵素Aによる処理を行った場合、まずは、制限酵素Bの作用により、標的領域を有する二本鎖DNAから、標的領域を有しその両端が5’突出である二本鎖DNA断片［5’突出標的二本鎖DNA断片］、（ii）標的領域を有さずその両端が5’突出である二本鎖DNA［5’突出非標的二本鎖DNA断片］等がそれぞれ生じる。
　次いで、制限酵素Aの作用により、制限酵素Aの認識配列を有する、5’突出標的二本鎖DNA断片、平滑／5’突出非標的二本鎖DNA断片等が生じ、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片等から、（i）標的領域を有しその両端が3’突出である二本鎖DNA断片［3’突出標的二本鎖DNA断片］、（iii）標的領域を有さずその両端がそれぞれ5’突出及び3’突出である二本鎖DNA断片［5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片］等がそれぞれ生じる。
　尚、前述の通り、制限酵素Aの認識配列の数、制限酵素Bの認識配列の数及び制限酵素Aの認識配列と制限酵素Bの認識配列の順序や、標的領域を有する二本鎖DNAの両端の形状（3’突出、5’突出、平滑）等によって、更に種々の二本鎖DNA断片が生じる場合がある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000027
　更に、本発明に係る工程１の後、本発明に係る工程１により生じた各DNA断片を精製するのが好ましい。尚、上記精製の詳細は、［精製工程］の項で詳述する。
　このように本発明に係る工程１を行うことにより、標的領域を有する二本鎖DNAから、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片並びに、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片を生じさせることができる。
　結果として、後述する、本発明に係る工程２におけるエキソヌクレアーゼIIIによる処理を効率よく進めることができる。
［工程2］
　本発明に係る工程2は、工程1で生じた、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片並びに、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片を、エキソヌクレアーゼIIIで処理することにより、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片から、（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片をそれぞれ生じさせる工程である。
　以下に、本発明に係る工程2の模式図を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000028
　本発明に係る工程2におけるエキソヌクレアーゼIIIは、二本鎖DNA特異的ヌクレアーゼの一種であり、二本鎖DNAの3’陥没末端より作用し、二本鎖DNAから一本鎖DNAを生成する酵素である。
　本発明に係る工程2におけるエキソヌクレアーゼIIIのユニット数は、通常、DNA1～10μgに対して、1～300ユニット／μLであり、5～250ユニット／μLが好ましい。
　本発明に係る工程2におけるエキソヌクレアーゼIIIによる処理は、通常、15～50℃で、好ましくは20～45℃で、通常40～120分間、好ましくは60～100分間反応を行えばよい。
　また、本発明に係る工程2におけるエキソヌクレアーゼIIIによる処理は、pH6～10の下でなされることが好ましく、ここで用いられる緩衝液としては、例えば、MES、ADA、PIPES、ACES、MOPS、BES、TES、HEPES、TRINCE、BICINE等のグッド緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等を用いればよい。
　更に、本発明に係る工程2の後、本発明に係る工程2により生じたDNA断片を精製するのが好ましい。尚、上記精製の詳細は、［精製工程］の項で詳述する。
　このように、本発明に係る工程2を行うことにより、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片並びに、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片のうち、3’陥没末端を有する（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片から、（iv）標的領域有さない一本鎖DNA断片をそれぞれ生じさせることができる。
　即ち、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片の3’陥没末端からエキソヌクレアーゼIIIが作用し、二本鎖DNAの片側をそれぞれ消化し、標的領域を有さない一本鎖DNA断片をそれぞれ生じさせることができる。
　結果として、後述する、本発明に係る工程3における一本鎖特異的ヌクレアーゼによる処理を効率よく進めることができる。
［工程3］
　本発明に係る工程3は、工程2で生じた、（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片及び（i）3’突出標的二本鎖DNA断片を、一本鎖特異的ヌクレアーゼで処理することにより、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片から、（v）標的領域を有しその両端が平滑である、平滑標的二本鎖DNA断片を生じさせる工程である。
　以下に、本発明に係る工程3の模式図を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000029
　本発明に係る工程3における一本鎖特異的ヌクレアーゼは、一本鎖DNA及び二本鎖DNAの一本鎖の領域を分解する酵素である。
　本発明に係る工程3における一本鎖特異的ヌクレアーゼとしては、具体的には、例えば、S1ヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼI、マングビーンヌクレアーゼ等が挙げられる。
　ヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の特定領域（配列番号1：267塩基対）、ヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の特定領域（配列番号2：149塩基対）又はイヌ由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の特定領域（配列番号3：433塩基対）を標的領域とする場合、本発明に係る工程3における一本鎖特異的ヌクレアーゼとしては、S1ヌクレアーゼが好ましい。
　本発明に係る工程3における一本鎖特異的ヌクレアーゼのユニット数は、通常、DNA1～10μgに対して、1～300ユニット／μLであり、5～250ユニット／μLが好ましい。
　本発明に係る工程3における一本鎖特異的ヌクレアーゼによる処理は、通常、10～37℃で、好ましくは15～25℃で、通常5～30分間、好ましくは10～25分間反応を行えばよい。
　また、本発明に係る工程3における一本鎖特異的ヌクレアーゼによる処理は、pH4～6の下でなされることが好ましく、ここで用いられる緩衝液としては、例えば、酢酸ナトリウム緩衝液等の酢酸緩衝液等を用いればよい。
　更に、本発明に係る工程3の後、本発明に係る工程3により生じたDNA断片を精製するのが好ましい。尚、上記精製の詳細は、［精製工程］の項で詳述する。
　このように、本発明に係る工程3を行うことにより、本発明に係る工程2で生じた（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片、及び（i）3’突出標的二本鎖DNA断片から、（v）平滑標的二本鎖DNA断片を生じさせることができる。
　即ち、一本鎖特異的ヌクレアーゼにより、（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片、及び（i）3’突出標的二本鎖DNA断片中の一本鎖の領域がそれぞれ消化されることにより、（v）平滑標的二本鎖DNA断片を生じさせることができる。
［精製工程］
　本発明に係る精製工程は、DNAを精製する工程のことである。これにより、引き続き行われる処理や工程の前に不純物を取り除くことができるため、当該精製工程を行うことが好ましい。
　本発明に係る精製工程は、本発明に係る工程1の後且つ本発明に係る工程2の前、及び本発明に係る工程2の後且つ本発明に係る工程3の前に行うことが好ましい。
　また、本発明に係る工程1の後且つ本発明に係る工程2の前に精製工程を行う場合、工程1における制限酵素A、制限酵素Bの処理の順に応じて、以下のようになされる。
（i）本発明に係る工程1において制限酵素Aによる処理と制限酵素Bによる処理を同時に行う場合は、制限酵素A及び制限酵素Bによる処理の後且つ本発明に係る工程2の前に精製工程を行う。
（ii）本発明に係る工程1において制限酵素Aによる処理の後、制限酵素Bによる処理を行う場合は、制限酵素Aによる処理の後且つ制限酵素Bによる処理の前、及び制限酵素Bによる処理の後且つ本発明に係る工程2の前にそれぞれ精製工程を行う。
（iii）本発明に係る工程1において制限酵素Bによる処理の後、制限酵素Aによる処理を行う場合は、制限酵素Bによる処理の後且つ制限酵素Aによる処理の前、及び制限酵素Aによる処理の後且つ本発明に係る工程2の前にそれぞれ精製工程を行う。
　本発明に係る精製工程は、通常この分野でなされる自体公知の精製方法であれば、特に制限されない。具体的には、例えば、アルコール沈殿法、カラム精製法等が挙げられ、ハイスループットに適用できる点から、カラム精製法が好ましい。
　アルコール沈殿法は、DNA含有溶液にナトリウム塩、アンモニウム塩等の塩を添加した後、アルコールを添加し、DNAを沈殿させることでDNAを精製することによりなされる。アルコール沈殿法により精製を行う場合は、例えば、以下のように行えばよい。
　即ち、DNA含有溶液 10～200μLに、1～5M 酢酸ナトリウム 10～50μL、アルコール 50～100μL及び緩衝液 30～100μLを加え、10000～25000×gで1～30分間遠心分離し、沈殿物を回収することにより、精製されたDNAが得られる。
　上記アルコールとしては、イソプロパノール、エタノール、ブタノール等が挙げられ、イソプロパノール又はエタノールが好ましく、イソプロパノールがより好ましい。
　上記緩衝液としては、MES、ADA、PIPES、ACES、MOPS、BES、TES、HEPES、TRINCE、BICINE等のグッド緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられ、トリス緩衝液又はリン酸緩衝液が好ましく、トリス緩衝液がより好ましい。尚、上記緩衝液の濃度、pHは通常この分野で用いられる範囲であればよい。
　また、上記アルコール沈殿法は、市販のキットを用いて行ってもよい。
　カラム精製法は、シリカゲル、ポリアクリルアミドゲル、セファクリル等の充填剤を内部に備えたカラム等の筒状の容器［例えば、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）、Mobi Spin s-4000（モレキュラーバイオテクノロジー（株）製）等］にDNA含有溶液を添加し、DNAと充填剤との親和性の違いを利用してDNAを精製することによりなされる。カラム精製法により精製を行う場合は、例えば、以下のように行えばよい。
　即ち、DNA含有溶液 10～200μLに、タンパク質変性剤 100～700μL又は／及び緩衝液100～700μLを加えて混合し、例えば、充填剤を充填したカラム［例えば、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）］に移し、1000～20000×g、室温で1～5分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。次いで、緩衝液100～700μL及びアルコール 100～700μLを加え、1000～20000×g、室温で1～5分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。更に、1000～20000×g、室温で1～10分間遠心分離し、新しいチューブに交換し、緩衝液又は滅菌水 10～100μLを加え、1000～20000×g、室温で1～5分間遠心分離し、フロースルー液を回収することにより、精製されたDNAが得られる。
　上記タンパク質変性剤としては、グアニジン塩酸塩、ホルムアミド、尿素等が挙げられ、グアニジン塩酸塩が好ましい。
　上記アルコールとしては、エタノール、イソプロパノール、ブタノール等が挙げられ、エタノール又はイソプロパノールが好ましく、エタノールがより好ましい。
　上記緩衝液としては、MES、ADA、PIPES、ACES、MOPS、BES、TES、HEPES、TRINCE、BICINE等のグッド緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられ、トリス緩衝液又はリン酸緩衝液が好ましく、トリス緩衝液がより好ましい。尚、上記緩衝液の濃度、pHは通常この分野で用いられる範囲であればよい。
　また、上記カラム精製法は、市販のキットを用いて行ってもよい。
［本発明の精製方法の具体例］
　本発明の精製方法の具体例を、以下に説明する。
（1）DNAの抽出
　例えば、核酸抽出キット［例えば、NucleoSpin（商標）Plasma XS（マッハライ・ナーゲル（株）製）、MagMAX（商標） Cell-Free DNA Isolation Kit（サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）製）又はQuickGene SP kit DNA tissue（倉敷紡績(株)製）］により、試料（例えば、全血）から、標的領域（例えば、配列番号2で表される塩基配列）を有する二本鎖DNAを抽出する。
（2）本発明に係る工程1
　上記（1）で得たDNAに、本発明に係る工程1における緩衝液（例えば、トリス緩衝液） 5～20μL、1～150ユニット／μLの制限酵素A（例えば、PstI） 0.5～4μL及び1～150ユニット／μLの制限酵素B（例えば、MboI、又はBamHI及びBglII） 0.5～4μLを加え、滅菌水で50～200μLに調製する。
　その後、20～50℃で60～150分間反応させて本発明に係る工程1で処理された溶液を得る。
　更に、必要に応じて、本発明に係る工程1で処理された溶液を、以下のように本発明に係る精製工程に付してもよい。
　即ち、上記本発明に係る工程1で処理された溶液に、タンパク質変性剤（例えば、グアニジン塩酸塩） 100～700μL及び緩衝液（例えば、トリス緩衝液） 100～700μLをそれぞれ加えて混合し、充填剤を充填したカラム［例えば、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）］に移し、1000～20000×g、室温で1～5分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。その後、緩衝液（例えば、トリス緩衝液） 100～700μL及びアルコール（例えば、エタノール） 100～700μLをそれぞれ加え、1000～20000×g、室温で1～5分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。更に、1000～20000×g、室温で1～10分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、緩衝液（例えば、トリス緩衝液） 10～100μLを加え、1000～20000×g、室温で1～5分間遠心分離し、フロースルー液を回収する。
　上記で得られた、本発明に係る工程1で処理された溶液又はフロースルー液を、本発明に係る工程2に付す。
（3）本発明に係る工程2
　上記本発明に係る工程１で処理された溶液又はフロースルー液 10～50μLに、1～300ユニット／μLのエキソヌクレアーゼIII 1～5μL及びエキソヌクレアーゼIII処理用緩衝液（例えば、トリス緩衝液） 1～10μLを加え、滅菌水で50～200μLに調製する。その後、15～50℃で40～120分間反応させ、反応停止液（例えば、EDTA） 0.5～1.5μLを加えることで本発明に係る工程2で処理された溶液を得る。
　更に、必要に応じて、本発明に係る工程2で処理された溶液を、以下のように本発明に係る精製工程に付してもよい。
　即ち、上記本発明に係る工程2で処理された溶液に、タンパク質変性剤（例えば、グアニジン塩酸塩） 100～700μL及び緩衝液（例えば、トリス緩衝液） 100～700μLをそれぞれ加えて混合し、充填剤を充填したカラム［例えば、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）］に移し、1000～20000×g、室温で1～5分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。その後、緩衝液（例えば、トリス緩衝液） 100～700μL及びアルコール（例えば、エタノール） 100～700μLをそれぞれ加え、1000～20000×g、室温で1～5分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。更に、1000～20000×g、室温で1～10分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、緩衝液（例えば、トリス緩衝液） 10～100μLを加え、1000～20000×g、室温で1～5分間遠心分離し、フロースルー液を回収する。
　上記で得られた、本発明に係る工程2で処理された溶液又はフロースルー液を、本発明に係る工程3に付す。
（4）本発明に係る工程3
　上記本発明に係る工程2で処理された溶液又はフロースルー液 10～50μLに、1～300ユニット／μLの一本鎖特異的ヌクレアーゼ（例えば、S1ヌクレアーゼ） 1～5μL及び一本鎖特異的ヌクレアーゼ用緩衝液（例えば、酢酸緩衝液） 1～10μLを加え、滅菌水で50～200μLに調製する。その後、10～37℃で5～30分間反応させることで、本発明に係る工程3で処理された溶液を得る。
　更に、必要に応じて、本発明に係る工程3で処理された溶液を、以下のように本発明に係る精製工程に付してもよい。
　即ち、上記本発明に係る工程3で処理された溶液に、タンパク質変性剤（例えば、グアニジン塩酸塩） 100～700μL及び緩衝液（例えば、トリス緩衝液） 100～700μLをそれぞれ加えて混合し、充填剤を充填したカラム［例えば、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）］に移し、1000～20000×g、室温で1～5分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。その後、緩衝液（例えば、トリス緩衝液） 100～700μL及びアルコール（例えば、エタノール） 100～700μLをそれぞれ加え、1000～20000×g、室温で1～5分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。更に、1000～20000×g、室温で1～10分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、緩衝液（例えば、トリス緩衝液） 10～100μLを加え、1000～20000×g、室温で1～5分間遠心分離し、フロースルー液を回収する。
＜本発明の二本鎖DNA中の標的領域の検出方法＞
　本発明の二本鎖DNA中の標的領域の検出方法（以下、本発明の検出方法と略記する場合がある。）は、本発明の精製方法により精製された標的領域を有する二本鎖DNA中の標的領域を検出するものである。
　即ち、上記本発明の精製方法に引き続いて、標的領域を増幅処理に付し、目的の増幅産物の有無を確認することにより標的領域を検出するものであり、下記工程1～5を含むことを特徴とする。
（1）（a）末端に3’突出を生じさせる制限酵素Aを1種以上及び（b）末端に5’突出を生じさせる制限酵素Bを1種以上用いて、標的領域を有する二本鎖DNAから、（i）標的領域を有しその両端が3’突出である二本鎖DNA断片［3’突出標的二本鎖DNA断片］並びに、（ii）標的領域を有さずその両端が5’突出である二本鎖DNA断片［5’突出非標的二本鎖DNA断片］又は／及び（iii）標的領域を有さずその両端がそれぞれ5’突出及び3’突出である二本鎖DNA断片［5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片］を生じさせる工程1、ここで、当該制限酵素Aは当該標的領域中の塩基配列を切断せず、当該制限酵素Bは当該3’突出標的二本鎖DNA断片に対応する領域中の塩基配列を切断しないものである、
（2）前記工程1で生じた、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片並びに、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片を、エキソヌクレアーゼIIIで処理することにより、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片から、それぞれ（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片を生じさせる工程2、
（3）前記工程2で生じた、（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片及び（i）3’突出標的二本鎖DNA断片を、一本鎖特異的ヌクレアーゼで処理することにより、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片から、（v）標的領域を有しその両端が平滑である二本鎖DNA断片［平滑標的二本鎖DNA断片］を生じさせる工程3、
（4）前記工程３で生じた、（v）平滑標的二本鎖DNA断片中の標的領域を増幅処理に付す工程4、
及び
（5）前記工程４で生じた、増幅産物の有無を確認する工程5
　尚、標的領域を増幅処理に付す工程の前までの工程1～3は、前述の本発明の精製方法における工程1～3と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
　また、［二本鎖DNA］及び［標的領域］は、本発明の精製方法における［二本鎖DNA］及び［標的領域］と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
　尚、本発明の検出方法においても、各工程に引き続いて精製工程を行ってもよく、その具体例、好ましい例等は、本発明の精製方法における［精製工程］で説明した通りである。
［本発明の検出方法に係る工程4］
　本発明の検出方法に係る工程4は、本発明の検出方法に係る工程3で生じた、（v）平滑標的二本鎖DNA断片中の標的領域を増幅処理に付す工程である。
　本発明の検出方法に係る工程4における増幅産物は、標的領域そのものであっても、標的領域以外の塩基配列（例えば、プライマー配列等）を含むものであってもよい。
　本発明の検出方法に係る工程4における増幅産物の大きさ（塩基対数）としては、通常、50～1100塩基対であり、50～800塩基対が好ましく、50～600塩基対がより好ましい。
　本発明の検出方法に係る工程4における増幅産物としては、具体的には、例えば、表2に示すものが挙げられ、（i）又は（ii）が好ましく、（ii）がより好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
　本発明の検出方法に係る工程4における標的領域を増幅する方法は、特に制限されず、自体公知の方法に基づいてなされればよい。このような自体公知の増幅方法としては、具体的には、例えば、PCR（Polymerase Chain Reaction）法、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法等が挙げられ、PCR法が好ましい。
　上記PCR法は、プライマー、核酸合成酵素、核酸合成基質、緩衝液、要すればプローブ等を用いて公知の方法により行えばよい。具体的には、例えば、Nucleic Acids Research, 1991, Vol.19, 3749、 BioTechniques, 1994, Vol.16, 1134-1137や「目的別で選べるPCR実験プロトコール, 2011, p.p. 56-73, 120-131」に記載の方法に基づいてなされればよい。
　上記PCR法としては、全血、血漿、尿等の体液中に存在する、CTC由来のDNA中の標的領域、cfDNA中の標的領域又はエクソソーム（エキソソーム）由来のDNA中の標的領域を増幅する場合、デジタルPCR法が好ましい。
　上記デジタルPCR法は、PCR反応液を、多数の小区画にDNA断片が1分子になるように分割してPCR反応を実施し、増幅産物が検出された小区画の数に基づいてターゲットDNAを検出、定量することによりなされる。
　上記デジタルPCR法は、具体的には、例えば、以下のようになされればよい。
　即ち、鋳型となるDNA含有溶液、フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマー対、プローブ、核酸合成基質、核酸合成酵素等を含むデジタルPCR用反応液を調製する。次いで、ドロップレット作製装置[例えば、QX200 Droplet Generator(バイオ・ラッドラボラトリーズ(株)製)、Automated Droplet Generator(バイオ・ラッドラボラトリーズ(株)製)等]により上記デジタルPCR用反応液を多数のドロップレット（1サンプルにつき5000～4万個）に分割する。その後、核酸増幅装置[例えば、サーマルサイクラ―（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）、Droplet Digital PCR（バイオ・ラッドラボラトリーズ(株)製）、QuantStudio 3D Digital PCR System（サーモフィッシャーサイエンティフィック(株)製）等]によりPCR反応を行う。
　上記PCR法におけるフォワードプライマー及びリバースプライマー（以下、本発明に係るプライマーと略記する場合がある。）からなるプライマー対（以下、本発明に係るプライマー対と略記する場合がある。）は、本発明に係る標的領域を増幅するように設計されたものであれば何れでもよい。
　本発明に係るプライマーの大きさ（塩基数）としては、通常10～50塩基であり、10～35塩基が好ましく、15～35塩基がより好ましく、20～30塩基が特に好ましい。
　各種標的領域を増幅する場合に用いられる、本発明に係るプライマー対を以下表3に記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
　また、本発明に係るプライマー対は、本発明に係るプライマー対をそのまま用いることが好ましいが、フォワードプライマー又はリバースプライマーの何れか一方或いは両方を標識物質で標識したプライマーからなるものであってもよい。
　本発明に係るプライマーを標識物質で標識する方法としては、特に制限されず、自体公知の方法に基づいてなされればよい。
　本発明に係るプライマーを標識物質で標識するために用いられる標識物質としては、蛍光物質、放射性同位体、酵素、発光物質など公知の標識物質が挙げられ、蛍光物質が好ましい。
　蛍光物質としては、例えば、TAMRA（商標）（シグマアルドリッチ（株）製）、Alexa555、Alexa647（インビトロジェン（株）製）、Cyanine　Dye系のCy3、Cy5（アマシャムバイオサイエンス（株）製）、フルオレセイン等が挙げられる。放射性同位体としては、例えば、32P、33P、35S等が挙げられる。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等が挙げられる。また、発光物質としては、例えば、Acridinium Easterを含む化学発光試薬等が挙げられる。
　本発明に係るプライマーを蛍光物質で標識する方法としては、例えば、フルオレセイン標識したヌクレオチドを自体公知の方法に基づいて、プライマーに取り込ませる方法、リンカーアームを有するヌクレオチドを配列のオリゴヌクレオチド中に置換する方法（Nucleic Acids Res., 1986年、第14巻、p.6115）等が挙げられる。
　本発明に係るプライマーを放射性同位体で標識する方法としては、プライマーを合成する際に、放射性同位体で標識されたヌクレオチドを取り込ませることによって、プライマーを標識する方法、プライマーを合成した後、放射性同位体で標識する方法等が挙げられる。具体的には、一般的に用いられるランダムプライマー法、ニックトランスレーション、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによる5’末端標識法、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによる3’末端標識法等が挙げられる。
　本発明に係るプライマーを酵素で標識する方法としては、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素分子を、標識するプライマーに直接共有結合させる等の直接標識法が挙げられる。
　本発明に係るプライマーを発光物質で標識する方法としては、自体公知の方法に基づいて、ヌクレオチドを発光標識する方法が挙げられる。
　また、「ビオチン－アビジン反応を利用した検出システム」に従って、上述の標識物質を本発明に係るプライマーに結合させてもよく、その場合には、自体公知の方法に基づいてなされればよい。
　上記PCR法におけるプローブ（以下、本発明に係るプローブと略記する場合がある。）は、本発明に係るプライマー対を用いてPCR等を行った場合に増幅される領域にハイブリダイズするように設計されたものであり、その5’末端がレポーター蛍光色素で標識され、3’末端がクエンチャー蛍光色素で標識されたものであれば何れでもよい。
　本発明に係るプローブの大きさ（塩基数）としては、通常10～50塩基であり、15～40塩基が好ましく、20～30塩基がより好ましい。
　ヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の特定領域（配列番号2：149塩基対）を標的領域として増幅する場合に用いる、本発明に係るプローブは以下の通りである。
cacagaatctctccgcactccgttc（配列番号10、GenBank Accession No. AL353637：107065-107089）
　本発明に係るプローブの5’末端をレポーター蛍光色素で、3’末端をクエンチャー蛍光色素で標識する方法としては、上述の本発明に係るプライマー対を標識物質で標識する方法で説明した通りである。
　本発明に係るプローブをレポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素により標識するために用いられるレポーター蛍光色素としては、FAM、HEX、VIC等が挙げられ、クエンチャー蛍光色素としては、TAMRA（商標）、BHQ1、BHQ２等が挙げられる。
　尚、本発明に係るプローブとして配列番号10で表される塩基配列からなるものを用いた場合、レポーター蛍光色素としてはFAMが好ましく、クエンチャー蛍光色素としてはBHQ1が好ましい。
　また、上記PCR法における核酸合成酵素としては、Taq　DNAポリメラーゼ、KOD　DNAポリメラーゼ等が挙げられ、核酸合成基質としては、dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）等が挙げられ、緩衝液としては、MES、ADA、PIPES、ACES、MOPS、BES、TES、HEPES、TRINCE、BICINE等のグッド緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられるが、通常この分野で用いられているものであれば何れでもよい。
　更に、上記PCR用反応液中に、MgCl2、KCl、(NH4)2SO4等の塩、ポリエチレングリコール、Triton（ユニオンカーバイド（株）製）、Nohidet（シェルケミカルズ（株）製）、CHAPS（（株）同仁化学製）等の界面活性剤、プロクリン300（シグマアルドリッチ（株）製）等の防腐剤、HapII、HpaII、SacII、FauI、AciI、BstuI等のメチル化感受性制限酵素等が含まれていてもよい。
　このように本発明の検出方法に係る工程4を行うことにより、本発明の検出方法に係る工程3で生じた、（v）平滑標的二本鎖DNA断片中の標的領域を特異的に増幅させることができる。
［本発明の検出方法に係る工程5］
　本発明の検出方法に係る工程5は、本発明の検出方法に係る工程4で生じた増幅産物の有無を確認する工程である。
　本発明の検出方法に係る工程5における増幅産物の有無を確認する方法は、通常、この分野でなされている方法であれば、特に制限されず、自体公知の方法に基づいてなされればよい。
　具体的には、例えば、（a）電気泳動により確認する方法、（b）蛍光リーダーにより確認する方法等が挙げられる。
（a）電気泳動により確認する方法
　電気泳動により確認する方法とは、本発明の検出方法に係る工程4で得られた増幅産物を、電気泳動に付し、その泳動度（移動度等）に基づいて確認する方法であり、具体的な方法としては、（a-1）標識プライマー法、（a-2）インターカレーター法、（a-3）標識プローブ法等が挙げられる。
（a-1）標識プライマー法
　標識プライマー法とは、『本発明に係るプライマーの少なくとも一方を標識物質で標識した標識プライマーを含むプライマー対を用い、本発明の検出方法に係る工程4を行う。次いで、得られた増幅産物を電気泳動に付し、当該増幅産物中の標識を検出することにより、本発明の検出方法に係る工程4で得られた増幅産物の有無を確認する』方法である。
　尚、標識物質で標識した標識プライマーについては、本発明の検出方法に係る工程4で説明した通りである。
　また、上記「標識を検出する」とは、標識物質の性質に基づいて標識物質を直接又は間接的に測定することを意味する。
　標識プライマー法における電気泳動としては、物質の荷電強度に依存して異なる速度で移動又は異なる距離を移動する方法に基づくものであればよく、具体的には、例えば、アガロースゲル電気泳動法、アクリルアミドゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法等が挙げられ、アガロースゲル電気泳動法又はキャピラリー電気泳動法がより好ましい。
　尚、上記アガロースゲル電気泳動法は、例えば、「バイオ実験イラステッドII遺伝子解析の基礎， 2006, p.p. 53-56」に記載の方法に基づいてなされればよい。また、上記キャピラリー電気泳動法は、例えば、WO2007/027495、WO2011/118496、WO2008/075520等に記載の方法に基づいてなされればよい。
（a-2）インターカレーター法
インターカレーター法とは、『本発明に係るプライマー対を用い、本発明の検出方法に係る工程4を行い、得られた増幅産物を電気泳動に付す。次いで、当該増幅産物をインターカレーターで染色し、当該インターカレーター由来の蛍光を検出することにより、本発明の検出方法に係る工程4で得られた増幅産物の有無を確認する』方法である。
　インターカレーター法における電気泳動としては、（a-1）標識プライマー法に記載のものと同じものが挙げられ、その具体例、好ましい例等も同じである。
　また、インターカレーター法におけるインターカレーターとしては、通常、この分野で用いられているインターカレーターであれば何れでもよい。具体的には、例えば、（1）～（5）のインターカレーター並びに下記（6）及び（7）のインターカレーター類似物質が挙げられる。
（1）エチジウム化合物［例えば、エチジウムブロマイド、エチジウムホモダイマー1（EthD-1）、エチジウムホモダイマー2（EthD-2）、臭化エチジウムモノアジド（EMA）、ジヒドロエチジウム等］、
（2）アクリジン色素（例えば、アクリジンオレンジ等）、
（3）ヨウ素化合物（ヨウ素化プロピジウム、ヨウ素化ヘキシジウム等）、シアニンダイマー系色素［例えば、POPO-1、BOBO-1、YOYO-1、TOTO-1、JOJO-1、POPO-3、LOLO-1、BOBO-3、YOYO-3、TOTO-3（何れもモレキュラープローブ（株）製）等］、
（4）シアニンモノマー系色素［例えば、PO-PRO-1、BO-PRO-1、YO-PRO-1、TO-PRO-1、JO-PRO-1、PO-PRO-3、LO-PRO-1、BO-PRO-3、YO-PRO-3、TO-PRO-3、TO-PRO-5（何れもモレキュラープローブ（株）製）等］、
（5）SYTOX（商標）系色素［例えば、SYBR Gold（商標）、SYBR Green I（商標）、SYBR Green II（商標）、SYTOX Green（商標）、SYTOX Blue（商標）、SYTOX Orange（商標）（何れもモレキュラープローブ（株）製）等］、GelRed（商標）系色素［例えば、GelRed（商標）核酸ゲル染色液（富士フイルム和光純薬（株）製）等］、
（6）DNA二重らせんのマイナーグルーブに結合するもの［例えば、4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI：モレキュラープローブ（株）製）等］、
（7）アデニン－チミン（A-T）配列に特異的に結合するもの［例えば、ペンタハイドレ－ト（ビス－ベンズイミド）（Hoechst 33258：モレキュラープローブ（株）製）、トリヒドロクロライド（Hoechst 33342：モレキュラープローブ（株）製）、ビスベンズイミド色素（Hoechst 34580：モレキュラープローブ（株）製）等］
　上記した中でも、SYTOX（商標）系色素［例えば、SYBR Gold（商標）、SYBR Green I（商標）、SYBR Green II（商標）、SYTOX Green（商標）、SYTOX Blue（商標）、SYTOX Orange（商標）（何れもモレキュラープローブ（株）製）等］、GelRed（商標）系色素［例えば、GelRed（商標）核酸ゲル染色液（富士フイルム和光純薬（株）製）等］が好ましく、GelRed（商標）系色素［例えば、GelRed（商標）核酸ゲル染色液（富士フイルム和光純薬（株）製）等］がより好ましい。
（a-3）標識プローブ法
　標識プローブ法とは、『本発明に係るプライマー対を用い、本発明の検出方法に係る工程4を行い、得られた増幅産物を電気泳動に付す。次いで、上記増幅産物を熱処理に付すことにより、一本鎖にする。次いで、標識物質で標識された、上記増幅産物の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプローブをハイブリダイズさせることで、ハイブリッド体を得て、当該ハイブリッド体中の標識を検出することにより、本発明の検出方法に係る工程4で得られた増幅産物の有無を確認する』方法である。
　尚、標識物質で標識した標識プローブとしては、本発明の検出方法に係る工程4に記載のものと同じものが挙げられ、その具体例、好ましい例等も同じである。
　また、標識プローブ法における電気泳動としては、（a-1）標識プライマー法に記載のものと同じものが挙げられ、その具体例、好ましい例等も同じである。
（b）蛍光リーダーにより検出する方法
　蛍光リーダーにより検出する方法とは、『本発明に係るプライマー対及びプローブを用いた本発明の検出方法に係る工程4を行う。次いで、各ドロップレット由来の蛍光を蛍光リーダーにより検出することにより、本発明の検出方法に係る工程4で得られた増幅産物の有無を確認する』方法である。
　蛍光リーダーにより検出する方法における蛍光リーダーとしては、核酸増幅装置に付属のもの［例えば、QX200 Droplet Reader（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）等］を用いればよい。
［本発明の検出方法の具体例］
　（1）DNAの抽出、(2)本発明の検出方法に係る工程1、(3)本発明の検出方法に係る工程2及び（4）本発明の検出方法に係る工程3の具体例については、前述の［本発明の精製方法の具体例］で説明した通りである。本発明の検出方法に係る工程4及び本発明の検出方法に係る工程5の具体例について、以下に説明する。
（5）本発明の検出方法に係る工程4
　本発明の検出方法に係る工程3で処理された溶液又はフロースルー液 1～50μLに、核酸合成基質、核酸合成酵素等を含むデジタルPCR用試薬［例えば、ddPCR（登録商標）Supermix for probes（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）］ 5～15μL、1～20μM フォワードプライマー（例えば、h149-f-fox） 0.5～1.5μL、1～20μM リバースプライマー（例えば、h149-r-fox） 0.5～1.5μL及び1～20μM プローブ（例えば、h149-p-fox） 0.5～1.5μLを加え、滅菌水で15～100μLに調製し、デジタルPCR用反応液とする。
　次いで、上記デジタルPCR用反応液を核酸増幅装置［例えば、サーマルサイクラ―（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株））製］にセットし、30～40℃で15～60分間インキュベートする。その後、ドロップレット作製装置［例えば、QX 200 Droplet Generator（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）又はAutomated Droplet Generator（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）］にてドロップレットを作製する。次いで、上記ドロップレットをウェルプレート（例えば、96ウェルプレート）に分注した後、核酸増幅装置［例えば、サーマルサイクラ―（バイオ・ラッド（株）製）］を用いて、90～97℃で1～15分間加熱した後、（1）90～97℃で5～35秒間、（2）60～70℃で10～90秒間を1サイクルとして、30～50サイクル加熱することにより、標的領域（例えば、配列番号2で表される塩基配列）を増幅させることができる。
(6)本発明の検出方法に係る工程5
　各ドロップレットにおける上記本発明の検出方法に係る工程4で増幅された増幅産物中の蛍光を、蛍光リーダー［例えば、QX200 Droplet Reader（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）等］により検出することにより、上記本発明の検出方法に係る工程4で増幅された増幅産物の有無を確認することができる。
＜本発明の癌の判定方法＞
　本発明の癌の判定方法（以下、本発明の判定方法と略記する場合がある。）は、本発明の精製方法により精製された標的領域を有する二本鎖DNA等に対して、メチル化感受性制限酵素による処理を行い、次いで、標的領域を増幅し、その結果に基づいて癌であるか否か判定をするものであり、下記工程1～7を含むことを特徴とする。
（1）（a）末端に3’突出を生じさせる制限酵素Aを1種以上及び（b）末端に5’突出を生じさせる制限酵素Bを1種以上用いて、標的領域を有する二本鎖DNAから、（i）標的領域を有しその両端が3’突出である二本鎖DNA断片［3’突出標的二本鎖DNA断片］並びに、（ii）標的領域を有さずその両端が5’突出である二本鎖DNA断片［5’突出非標的二本鎖DNA断片］又は／及び（iii）標的領域を有さずその両端がそれぞれ5’突出及び3’突出である二本鎖DNA断片［5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片を生じさせる工程1、ここで、当該制限酵素Aは当該標的領域中の塩基配列を切断せず、当該制限酵素Bは当該3’突出標的二本鎖DNA断片中の塩基配列を切断しないものである、
（2）前記工程1で生じた、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片並びに、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片を、エキソヌクレアーゼIIIで処理することにより、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片から、それぞれ（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片を生じさせる工程2、
（3）前記工程2で生じた、（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片及び（i）3’突出標的二本鎖DNA断片を、一本鎖特異的ヌクレアーゼで処理することにより、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片から、（v）標的領域を有しその両端が平滑である二本鎖DNA断片［平滑標的二本鎖DNA断片］を生じさせる工程3、
（4）前記工程3で生じた、（v）平滑標的二本鎖DNA断片を、メチル化感受性制限酵素で処理する工程4、
（5）前記工程4で処理された、（v）平滑標的二本鎖DNA断片中の標的領域を増幅処理に付す工程5、
（6）前記工程5で生じた、増幅産物の有無を確認する工程6、
及び
（7）前記工程6の確認結果に基づいて、癌を判定する工程7を含むことを特徴とするものである。
　尚、メチル化感受性制限酵素による処理を行う前までの工程1～3は前述の本発明の精製方法における工程1～3と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。また、標的領域を増幅する工程5及び増幅産物の有無を確認する工程6については、前述の本発明の検出方法における工程4及び工程5と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
　［二本鎖DNA］、［標的領域］、［癌］、［工程4］及び［工程7］について以下に詳述する。
　尚、本発明の判定方法においても、各工程に引き続いて精製工程を行ってもよく、その具体例、好ましい例等は、本発明の精製方法における［精製工程］で説明した通りである。
［本発明の判定方法に係る二本鎖DNA］
　本発明の判定方法に係る二本鎖DNAは、CpG配列（－CG－）を含む二本鎖DNAであって、且つ本発明に係る工程1における制限酵素A及び制限酵素Bの作用により、(i)標的領域を有しその両端が3’突出である二本鎖DNA断片［3’突出標的二本鎖DNA断片］並びに、(ii)標的領域を有さずその両端が5’突出である二本鎖DNA断片［5’突出非標的二本鎖DNA断片］又は／及び（iii）標的領域を有さずその両端がそれぞれ5’突出及び3’突出である二本鎖DNA断片［5’ ／3’突出非標的二本鎖DNA断片を生じ得るものであればよく、（1）その両端がそれぞれ突出（3’突出又は／及び5’突出）、（2）その両端がそれぞれ平滑、（3）一方の端が突出（3’突出又は5’突出）且つもう一方の端が平滑、又は（4）環状、の何れであってもよい。
　尚、本発明の判定方法に係る二本鎖DNAにおける、標的領域、制限酵素Aの認識配列及び制限酵素Bの認識配列の位置関係、並びに本発明の判定方法に係る二本鎖DNAの抽出については、前述の本発明の精製方法における［二本鎖DNA］と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
［本発明の判定方法に係る標的領域］
　本発明の判定方法に係る標的領域としては、本発明の判定方法に係る二本鎖DNA中に存在するシトシンがメチル化されたCpG配列を含む連続した特定の二本鎖DNA部分である。
　尚、上記メチル化とは、DNAメチラーゼによる塩基修飾のことであり、シトシンの次にグアニンが現れる2塩基配列であるCpG配列のシトシン塩基の5位等にメチル基が付加した状態を意味する。
　本発明の判定方法に係る標的領域の具体例、好ましい例等は、前述の本発明の精製方法における［標的領域］で説明した通りである。
［本発明の判定方法に係る癌］
　本発明の判定方法に係る癌とは、制御不能な細胞分裂又は／及び浸潤を通しての隣接組織への直接的な増殖又は／及び転移等に特徴付けられる、疾病又は疾患のことである。本発明の判定方法により判定される癌の具体例としては、細胞癌、腺癌、リンパ腫、白血病、肉腫、中皮腫、神経腫、骨肉腫、胚細胞腫、前立腺癌、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、胃腸癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、卵巣癌、メラノーマ、脳癌、精巣癌、腎臓癌、皮膚癌、甲状腺癌、頭頸部癌、肝臓癌、食道癌、胃癌、大腸癌、骨髄癌、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫等が挙げられ、肺癌、乳癌、膵臓癌、肝臓癌、胃癌又は大腸癌が好ましく、膵臓癌又は大腸癌がより好ましい。
［本発明の判定方法に係る工程4］
　本発明の判定方法に係る工程4は、本発明の判定方法に係る工程3で生じた、（v）平滑標的二本鎖DNA断片を、メチル化感受性制限酵素で処理する工程である。
　本発明の判定方法に係る工程4におけるメチル化感受性制限酵素とは、認識配列中におけるCpG配列中のシトシンがメチル化されているか否かにより切断活性が変化する制限酵素のことである。
　即ち、メチル化感受性制限酵素とは、認識配列がメチル化されたシトシン塩基を含むCpG配列を有する場合、当該認識配列を切断できないが、認識配列がメチル化されたシトシン塩基を含むCpG配列を有さない場合、当該認識配列を切断することができる制限酵素のことである。
　本発明の判定方法に係る工程4におけるメチル化感受性制限酵素は、認識する塩基配列が標的領域内に存在するものであれば、何れでもよい。即ち、標的領域に応じて適宜選択されればよい。
　本発明の判定方法に係る工程4におけるメチル化感受性制限酵素としては、具体的には、例えば、AatII、AccI、AccII、AciI、AfaI、Aor13HI、Aor51HI、ApaI、ApalI、BglI、BmgT120I、BspT104I、BssHII、BstuI、Cfr10I、ClaI、CpoI、EaeI、Eco52I、FauI、HaeII、HapII、HpaII、HhaI、MluI、NaeI、NheI、NotI、NruI、NsbI、PmaCI、Psp1406I、PvuI、SacII、SalI、Sau3AI、SmaI、SnaBI、VpaK11BI等が挙げられる。
　ヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の特定領域（配列番号1：267塩基対）、ヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の特定領域（配列番号2：149塩基対）又はイヌ由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の特定領域（配列番号3：433塩基対）を標的領域とした場合、本発明の判定方法に係る工程4におけるメチル化感受性制限酵素としては、HapII、HpaII、BstUI、AciI又は／及びFauIが好ましい。
　本発明の判定方法に係る工程4におけるメチル化感受性制限酵素のユニット数は、通常、目的のDNA1～10μgに対して、1～150ユニット／μLであり、5～100ユニット／μLが好ましく、10～50ユニット／μLがより好ましい。
　また、複数種のメチル化感受性制限酵素を用いた場合の本発明の判定方法に係る工程4におけるメチル化感受性制限酵素のユニット数についても上記と同様であり、目的のDNA1～10μgに対して、1～150ユニット／μLであり、5～100ユニット／μLが好ましく、10～50ユニット／μLがより好ましい
　本発明の判定方法に係る工程4におけるメチル化感受性制限酵素による処理は、通常20～50℃で、好ましくは35～45℃で、通常30～150分間、好ましくは30～120分間反応を行えばよい。
　また、本発明の判定方法に係る工程4におけるメチル化感受性制限酵素による処理は、pH6～10の条件の下なされることが好ましく、ここで用いられる緩衝液としては、例えば、MES、ADA、PIPES、ACES、MOPS、BES、TES、HEPES、TRINCE、BICINE等のグッド緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等を用いればよい。
　更に、本発明の判定方法に係る工程4の後、DNA断片を精製するのが好ましい。尚、上記精製については、本発明の精製方法における[精製工程]と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
　このように、本発明の判定方法に係る工程4におけるメチル化感受性制限酵素による処理を行うことにより、メチル化されている二本鎖DNAの標的領域は切断されず、メチル化されていない二本鎖DNAの標的領域が切断されるため、本発明の判定方法に係る工程5において、メチル化されている二本鎖DNAの標的領域を特異的且つ高感度に増幅することができる。
［本発明の判定方法に係る工程7］
　本発明の判定方法に係る工程7は、本発明の判定方法に係る工程6の結果に基づいて、癌の判定を行う工程である。即ち、本発明の判定方法に係る工程5で増幅された増幅産物の有無の確認の結果に基づいてなされる。
　本発明の判定方法に係る工程7における癌の判定とは、本発明の判定方法に係る工程1～6の結果により得られたデータを用いてなされる。即ち、本発明の判定方法に係る工程5で増幅された目的の増幅産物を検出し、当該増幅産物が検出されたという結果に基づき、癌の判定をすることである。
　上記癌の判定対象は、標的領域を含むDNA由来の試料に基づく。
　例えば、標的領域を含むDNA由来の試料が組織、細胞等の場合、癌の判定対象は、当該組織、細胞等自体、更には、当該組織、細胞等が由来する動物である。
　即ち、当該組織、細胞等自体が癌（化）されているか否かが判定されるのみではなく、当該組織、細胞等が由来する動物が癌に罹患しているか又は当該動物に癌細胞が存在しているか否かも判定される。
　一方、標的領域を含むDNA由来の試料が全血、血清、血漿、尿等の体液である場合、癌の判定対象は、以下（i）及び（ii）の通りである。
　（i）標的領域を含むDNAが上記全血、血清、血漿、尿等の体液中の細胞（白血球等の血液細胞、各組織由来の細胞、CTC等）に由来する場合には、当該細胞自体、更には、当該細胞が由来する動物である。
　即ち、当該細胞自体が癌（化）されているか否かが判定されるのみではなく、当該細胞が由来する動物が癌に罹患しているか又は当該動物に癌細胞が存在しているか否かも判定される。
　（ii）標的領域を含むDNAが上記全血、血清、血漿、尿等の体液中のcfDNA、エクソソーム（エキソソーム）等に由来する場合には、癌の判定対象は、上記全血、血清、血漿、尿等の体液に由来する動物である。
　即ち、上記全血、血清、血漿、尿等の体液に由来する動物が癌に罹患しているか又は当該動物に癌細胞が存在しているか否かが判定される。
　癌の判定対象が癌に罹患している又は当該対象中に癌細胞が存在している場合、本発明の判定方法に係る工程5において、当該標的領域が増幅されるため、増幅産物が得られる。一方、癌の判定対象が癌に罹患していない又は当該対象中に癌細胞が存在していない場合、本発明の判定方法に係る工程5において、標的領域が増幅されないため、増幅産物が検出されない。これは、本発明の判定方法に係る工程4におけるメチル化感受性制限酵素の性質によるものである。
　つまり、標的領域がメチル化されている場合、メチル化感受性制限酵素で処理しても、標的領域は切断されないため、本発明の判定方法に係る工程5の増幅処理において標的領域が増幅され、本発明の判定方法に係る工程6において増幅産物が確認される。
　一方、標的領域がメチル化されていない場合、メチル化感受性制限酵素により標的領域が切断されるため、本発明の判定方法に係る工程5の増幅処理において標的領域が増幅されず、本発明の判定方法に係る工程6において増幅産物が確認されない。
　従って、本発明の判定方法に係る工程6において（a）電気泳動により確認する方法を行った場合、（i）増幅産物が確認された場合、当該標的領域由来の癌の判定対象は癌に罹患している又は当該対象中に癌細胞が存在していると判定することができ、（ii）増幅産物が確認されなかった場合、当該標的領域由来の癌の判定対象は、癌に罹患していない又は当該対象中に癌細胞が存在していないと判定することができる。
　一方、本発明の判定方法に係る工程6において（b）蛍光リーダーにより確認する方法を行った場合、（i）予め設定した閾値を超える蛍光を発するドロップレットが少なくとも1つ確認された場合、当該標的領域由来の癌の判定対象は癌に罹患している又は当該対象中に癌細胞が存在していると判定することができ、（ii）予め設定した閾値を超える蛍光を発するドロップレットが確認されなかった場合、当該標的領域由来の癌の判定対象は、癌に罹患していない又は当該対象中に癌細胞が存在していないと判定することができる。
　尚、上記閾値については、上記蛍光リーダー［例えば、QX200 Droplet Reader（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）］の閾値設定機能に従って決定してもよく、標的領域を増幅した結果から決定してもよい。
　このように本発明の判定方法に係る工程7によれば、増幅産物の有無を確認するのみで、癌の判定を行うことができる。
［本発明の判定方法の具体例］
　本発明の判定方法の具体例を、以下に説明する。
　尚、（1）DNAの抽出、（2）本発明の判定方法に係る工程1、(3)本発明の判定方法に係る工程2及び(4)本発明の判定方法に係る工程3については、［本発明の精製方法の具体例］で説明した通りである。また、（6）本発明の判定方法に係る工程5及び(7)本発明の判定方法に係る工程6については、［本発明の検出方法の具体例］で説明した通りである。本発明の判定方法に係る工程4及び本発明の判定方法に係る工程7の具体例について、以下に説明する。
（5）本発明の判定方法に係る工程4
　本発明の判定方法に係る工程3で処理された溶液又はフロースルー液 5～50μLに、1～150ユニット／μLのメチル化感受性制限酵素（例えば、HapII、HpaII、SacII、BstUI、AciI又は／及びFauI） 0.5～3μL、メチル化感受性制限酵素処理用緩衝液（例えば、トリス緩衝液） 2.5～15μLを加え、滅菌水で25～100μLに調製する。次いで、20～50℃で30～150分間反応させることで本発明の判定方法に係る工程４で処理された溶液を得る。
　更に、必要に応じて、本発明の判定方法に係る工程4で処理された溶液を、以下のように本発明に係る精製工程に付してもよい。
　即ち、上記本発明の判定方法に係る工程4で処理された溶液に、タンパク質変性剤（例えば、グアニジン塩酸塩） 100～700μL及び緩衝液（例えば、トリス緩衝液） 100～700μLをそれぞれ加えて混合し、充填剤を充填したカラム［例えば、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）］に移し、1000～20000×g、室温で1～5分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。その後、緩衝液（例えば、トリス緩衝液） 100～700μL及びアルコール（例えば、エタノール） 100～700μLをそれぞれ加え、1000～20000×g、室温で1～5分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。更に、1000～20000×g、室温で1～10分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、緩衝液（例えば、トリス緩衝液） 10～100μLを加え、1000～20000×g、室温で1～5分間遠心分離し、フロースルー液を回収する。
（8）本発明の判定方法に係る工程7
　本発明の判定方法に係る工程6の増幅産物の有無の確認の結果、予め設定した閾値を超える蛍光を発するドロップレットが少なくとも１つ確認された場合、「その標的領域由来の癌の判定対象は、癌に罹患している又は当該対象中に癌細胞が存在している。」と判定することができる。一方、予め設定した閾値を超える蛍光を発するドロップレットが確認されなかった場合、「その標的領域由来の癌の判定対象は、癌に罹患していない又は当該対象中に癌細胞が存在していない。」と判定することができる。
＜本発明に係る癌の判定用試薬＞
　本発明に係る癌の判定用試薬は、制限酵素A、制限酵素B、エキソヌクレアーゼIII、一本鎖特異的ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素を含むことを特徴とするものである。
　本発明に係る癌の判定用試薬に用いられる制限酵素A、制限酵素B、一本鎖特異的ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素については、＜本発明の精製方法＞、＜本発明の検出方法＞及び＜本発明の癌の判定方法＞で説明した通りであり、その具体例及び好ましい例等も同じである。
　本発明に係る癌の判定用試薬は、更に、この分野で通常用いられる下記のような試薬類何れか1種以上が含まれていてもよい。
a）DNA精製用のカラム［例えば、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）等］、
b）核酸増幅反応用試薬［例えば、1種又は2種以上のプライマー、プローブ、核酸合成基質、核酸合成酵素等］、
c）核酸増幅産物確認用試薬［例えば、アガロースゲル、ローディング緩衝液、染色用試薬（GeL Red（商標）系染色液、臭化エチジウム等）］、
d）DNA抽出用試薬［例えば、QuickGene SP kit DNA tissue（倉敷紡績（株）製）、NucleoSpin（商標） Plasma XS（マッハライ・ナーゲル（株）製）、MagMAX（商標） Cell-Free DNA Isolation Kit（サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）製）等］
　また、本発明に係る癌の判定用試薬には、本発明の判定方法を実施するための説明書等を含ませておいてもよい。当該「説明書」とは、本発明の判定方法における特徴、原理及び操作手順などが文章又は図表等により実質的に記載されている本発明に係る癌の判定用試薬の取扱い説明書、添付文章或いはパンフレット（リーフレット）等を意味する。
　このように本発明に係る癌の判定用試薬により、本発明の判定方法を簡便、短時間且つ精度よく行うことができる。
＜本発明に係る癌の判定を行うためのデータを得る方法＞
　本発明に係る癌の判定を行うためのデータを得る方法（以下、本発明に係るデータを得る方法と略記する場合がある。）は、本発明の精製方法により精製された標的領域を有する二本鎖DNAに対して、メチル化感受性制限酵素による処理を行い、次いで、標的領域を増幅し、その結果に基づいて癌であるか否かが判定される対象について、癌の判定を下すためのデータを取得するものである。
　即ち、本発明の精製方法に引き続いて、メチル化感受性制限酵素により処理する工程、標的領域を増幅する工程及び増幅産物の有無を確認する工程を行うものであり、具体的には、本発明の判定方法における工程1～6を行うものである。
　尚、メチル化感受性制限酵素による処理を行う前までの工程工程1～3は、前述した本発明の精製方法における工程1～3と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
　標的領域を増幅する工程5及び増幅産物の有無を確認する工程6は、前述の本発明の検出方法における工程4及び工程5と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
　メチル化感受性制限酵素による処理の工程4は、前述の本発明の判定方法における工程4と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
　［二本鎖DNA］、［標的領域］及び［癌］は、本発明の判定方法における［本発明の判定方法に係る二本鎖DNA］、［本発明の判定方法に係る標的領域］及び［本発明の判定方法に係る癌］と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
　また、本発明に係るデータを得る方法におけるデータとしては、（i）本発明に係るデータを得る方法に係る工程6で得られた結果値（例えば、蛍光強度、電気泳動図等）、（ii）当該結果値を更に多重ロジスティック回帰分析、判別分析、ポアソン回帰分析、重回帰分析、コックスの比例ハザードモデル、パス解析等の多変量解析に付して得られる値、（iii）本発明に係るデータを得る方法に係る工程6で得られた結果値と、基準値（例えば、カットオフ値等）との比較データ（例えば、大小関係を示すデータ）（iv）前述の、標的領域由来の癌の判定対象は癌に罹患している、又は当該対象中に癌細胞が存在しているとを示すデータ等が挙げられ、（i）又は（iii）が好ましく、（i）がより好ましい。
　尚、本発明に係るデータを得る方法においても、各工程に引き続いて精製工程を行ってもよく、その具体例、好ましい例等は、本発明の精製方法における［精製工程］で説明した通りである。
　このように本発明に係るデータを得る方法によれば、癌の判定を精度よく行うためのデータを取得することができる。
＜本発明に係る癌の判定を行うためのマーカー＞
　本発明に係る癌の判定を行うためのマーカー（以下、本発明に係るマーカーと略記する場合がある。）は、本発明の精製方法により精製された標的領域を有する二本鎖DNA等に対して、メチル化感受性制限酵素による処理を行い、次いで、標的領域を増幅することにより得られる増幅産物である。即ち、本発明に係るマーカーの有無によって標的領域由来の癌の判定対象について、癌の判定をすることができるものである。
　具体的には、本発明の精製方法に引き続いて、メチル化感受性制限酵素により処理する工程及び標的領域を増幅する工程を行うことにより得られるものであり、上述の本発明の判定方法における工程1～5を行うことによって得られるものである。
　尚、メチル化感受性制限酵素を行う前までの工程1～3は、前述の本発明の精製方法における工程1～3と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
　標的領域を増幅する工程5は、前述の本発明の検出方法における工程4と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
　メチル化感受性制限酵素による処理の工程4は、前述の本発明の判定方法における工程4と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
　また、［二本鎖DNA］、［標的領域］及び［癌］は、本発明の判定方法における［本発明の判定方法に係る二本鎖DNA］、［本発明の判定方法に係る標的領域］及び［本発明の判定方法に係る癌］と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
　尚、本発明に係るマーカーを得るための各工程においても、精製工程を行ってもよく、その具体例、好ましい例等は、本発明の精製方法における［精製工程］で説明した通りである。
　本発明に係るマーカーとしては、具体的には、（i）配列番号1で表される塩基配列であって、該塩基配列における少なくとも1つのシトシンがメチル化されている塩基配列、（ii）配列番号2で表される塩基配列であって、該塩基配列における少なくとも1つのシトシンがメチル化されている塩基配列及び（iii）配列番号3で表される塩基配列であって、該塩基配列における少なくとも1つのシトシンがメチル化されている塩基配列が挙げられ、（i）又は（ii）が好ましく、（ii）がより好ましい。
　尚、上記（i）～（iii）におけるシトシンは、当該塩基配列における何れのシトシンでもよいが、CpG配列由来のシトシンであることが好ましい。
　このように本発明に係るマーカーを用いることにより、本発明の判定方法を簡便、短時間且つ精度よく行うことができる。
＜本発明に係るメチル化判定方法＞
　本発明に係るメチル化判定方法は、本発明の精製方法により精製された標的領域を有する二本鎖DNA等に対して、メチル化感受性制限酵素による処理を行い、次いで、標的領域を増幅し、その結果に基づいて標的領域がメチル化されているか否かを判定するものである。
　即ち、本発明の精製方法に引き続いて、メチル化感受性制限酵素により処理する工程、標的領域を増幅する工程、増幅産物の有無を確認する工程及びメチル化を判定する工程を行うものであり、本発明の判定方法における工程1～6及び
（7）工程6の結果に基づいて、標的領域がメチル化されているか否かを判定する工程7を含むことを特徴とするものである。
　尚、メチル化感受性制限酵素による処理を行う前までの工程1～3は、前述の本発明の精製方法における工程1～3と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
　標的領域を増幅する工程5及び増幅産物の有無を確認する工程6は、前述の本発明の検出方法における工程4及び工程5と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
　メチル化感受性制限酵素による処理の工程4は、前述の本発明の判定方法における工程4と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
　また、［二本鎖DNA］及び［標的領域］は、本発明の判定方法における［本発明の判定方法に係る二本鎖DNA］及び［本発明の判定方法に係る標的領域］と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
　尚、本発明に係るメチル化判定方法においても、各工程に引き続いて精製工程を行ってもよく、その具体例、好ましい例等は、本発明の精製方法における［精製工程］で説明した通りである。
　［工程7］について以下に詳述する。
［本発明に係るメチル化判定方法における工程7］
　本発明に係るメチル化判定方法における工程7は、本発明に係るメチル化判定方法における工程6の結果に基づいて標的領域がメチル化されているか否かの判定を行う工程である。
　即ち、本発明に係るメチル化判定方法における標的領域がメチル化されているか否かの判定は、本発明に係るメチル化判定方法における工程5で増幅された増幅産物の有無の確認の結果に基づいてなされる。標的領域がメチル化されている場合、本発明に係るメチル化判定方法における工程5において、当該標的領域が増幅されるので、増幅産物が得られる。一方、標的領域がメチル化されていない場合、本発明に係るメチル化判定方法における工程5において、当該標的領域が増幅されないので、増幅産物が得られない。これは、本発明に係るメチル化判定方法における工程4におけるメチル化感受性制限酵素の性質によるものである。
　つまり、標的領域がメチル化されている場合、メチル化感受性制限酵素で処理しても、標的領域は切断されないので、本発明に係るメチル化判定方法における工程5の増幅反応において標的領域が増幅され、本発明に係るメチル化判定方法における工程6において増幅産物が確認される。
　一方、標的領域がメチル化されていない場合、メチル化感受性制限酵素により標的領域が切断されるので、本発明に係るメチル化判定方法における工程5において標的領域が増幅されず、本発明に係るメチル化判定方法における工程6において増幅産物が確認されない。
　従って、本発明に係るメチル化判定方法における工程6において（a）電気泳動により確認する方法を行った場合、（i）増幅産物が確認された場合、当該標的領域はメチル化されていると判定することができ、（ii）増幅産物が確認されなかった場合、当該標的領域はメチル化されていないと判定することができる。
　一方、本発明に係るメチル化判定方法における工程6において（b）蛍光リーダーにより確認する方法を行った場合、（i）予め設定した閾値を超える蛍光を発するドロップレットが少なくとも１つ確認された場合、当該標的領域はメチル化されていると判定することができ、（ii）予め設定した閾値を超える蛍光を発するドロップレットが確認されなかった場合、当該標的領域はメチル化されていないと判定することができる。
　尚、上記閾値については、上記蛍光リーダー［例えば、QX200 Droplet Reader（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）］の閾値設定機能に従って決定してもよく、標的領域を増幅した結果から決定してもよい。
　このように、本発明に係るメチル化判定方法における工程7によれば、増幅産物の有無を確認するのみで、メチル化の判定を行うことができる。
　従って、本発明に係るメチル化判定方法は、標的領域がメチル化されているか否かの判定を簡便、短時間且つ精度よく行うことができる。
＜本発明に係るメチル化されたDNAの増幅方法＞
　本発明に係るメチル化されたDNAの増幅方法は、本発明の精製方法により精製された標的領域を有する二本鎖DNA等に対して、メチル化感受性制限酵素による処理を行い、次いで、標的領域を増幅するものである。
　即ち、本発明の精製方法に引き続いて、メチル化感受性制限酵素により処理する工程及び標的領域を増幅する工程を行うものであり、本発明の判定方法における工程1～5を行うものである。
　尚、メチル化感受性制限酵素による処理を行う前までの工程1～3は、前述の本発明の精製方法における工程1～3と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
　標的領域を増幅する工程5は、前述の本発明の検出方法における工程4と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
　メチル化感受性制限酵素による処理の工程4は、前述の本発明の判定方法における工程4と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
　また、［二本鎖DNA］、及び［標的領域］は、本発明の判定方法における［本発明の判定方法に係る二本鎖DNA］及び［本発明の判定方法に係る標的領域］と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
　尚、本発明に係るメチル化されたDNAの増幅方法においても、各工程に引き続いて精製工程を行ってもよく、その具体例、好ましい例等は、本発明の精製方法における［精製工程］で説明した通りである。
　このように、本発明に係るメチル化されたDNAの増幅方法により、メチル化されたDNAの増幅を簡便、短時間且つ精度よく行うことができる。
＜本発明に係るメチル化判定用試薬＞
　本発明に係るメチル化判定用試薬は、制限酵素A、制限酵素B、エキソヌクレアーゼIII、一本鎖特異的ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素を含むことを特徴とするものであり、その具体例、好ましい例等は＜本発明に係る癌の判定用試薬＞で説明した通りである。
　また、本発明に係るメチル化判定用試薬には、本発明に係るメチル化判定方法を実施するための説明書等を含ませておいてもよい。当該「説明書」とは、本発明に係るメチル化判定方法における特徴、原理及び操作手順などが文章又は図表等により実質的に記載されている本発明に係るメチル化判定用試薬の取扱い説明書、添付文章或いはパンフレット（リーフレット）等を意味する。
　このように本発明に係るメチル化判定用試薬により、本発明に係るメチル化判定方法を簡便、短時間且つ精度よく行うことができる。
　以下に、実施例等により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例等により何等限定されるものではない。
実験例１　各種DNAのメチル化状態の確認
　後述の実施例で使用する試料に由来するDNAについて、バイサルファイト法によるメチル化状態の確認を行った。
（1）条件の設定
　下記の通りに、試料及びメチル化状態の確認領域を設定した。
＜試料＞
・ヒト人工多能性幹細胞（正常細胞）
・ヒト正常全血
・大腸癌細胞（癌細胞）
＜メチル化状態の確認領域＞
・図1で表されるヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の、配列番号１で表される塩基配列からなる領域（267塩基対）のうち、四角で囲まれた3つの、CpG配列を含む配列（CCGG）
・図2で表されるヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の、配列番号2で表される塩基配列からなる領域（149塩基対）のうち、四角で囲まれた７つの、CpG配列を含む配列（CCGG及びGCGG）
（2）DNAの抽出
　上記試料（ヒト人工多能性幹細胞、ヒト正常全血及び大腸癌細胞）より、QuickGene SP kit DNA tissue（倉敷紡績（株）製）を使用して、DNAをそれぞれ抽出した。
（3）バイサルファイト反応
　上記（2）で得たDNA 400ngそれぞれを、10μLの滅菌水に溶解した。
　その後、Episight Bisulfite Conversion kit（富士フイルム和光純薬（株）製）を使用して、当該溶液それぞれをキット記載の方法に準じてバイサルファイト反応に付した。
（4）PCR増幅反応
　上記（3）で得たバイサルファイト反応産物含有溶液 1μLそれぞれに、滅菌水 17.3μL、10×バッファー for Blend Taq（東洋紡（株）製） 2.5μL、2.5ユニット/μL Blend Taq－Plus（東洋紡（株）製） 0.2μL、2mM dNTPs（東洋紡（株）製） 2μL、10μM フォワードプライマー［GGAATTAGTGGGGGCAGCCAGGCCCCAGG（配列番号11）］ 1μL及び10μM リバースプライマー［CCCAAAAACTACCCTTACCAAACTAATC（配列番号12）］ 1μLを加えて混合し、これをPCR用反応液とした。
　次いで、上記PCR用反応液それぞれを、サーマルサイクラ―（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）にセットし、下記反応条件でPCR増幅反応を行った。
※反応条件
94℃　2分間
↓
94℃　10秒間→55℃　10秒間→72℃　20秒間を1サイクルとして36サイクル
↓
72℃　2分間
　尚、上記PCR増幅反応により得られる増幅産物は、ヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の、配列番号13で表される塩基配列からなる領域（355塩基対）であり、配列番号1及び2で表される塩基配列の一部を有するものである。
（5）PCR増幅産物のクローニング
　上記（4）で得たPCR増幅産物それぞれを、1.5％アガロースゲルにて電気泳動した。次いで、GeLRed核酸ゲル染色液（富士フイルム和光純薬（株）製）で染色し、QIAquick　Gel　Extraction　kit（（株）キアゲン製）を使用して、PCR増幅産物をそれぞれ回収した。
（6）PCR増幅産物に制限酵素認識部位を付加するためのPCR増幅反応
　上記（5）で得たPCR増幅産物含有溶液 1μLそれぞれに、蒸留水17.3μL、10×バッファー for Blend Taq（東洋紡（株）製） 2.5μL、2.5ユニット/μL Blend Taq－PLus（東洋紡（株）製） 0.2μL、2mM dNTPs（東洋紡（株）製） 2μL、10μM フォワードプライマー 1μL及び10μM リバースプライマー 1μLを加えて混合し、これをPCR用反応液とした。
　尚、上記フォワードプライマーは、上記（4）のフォワードプライマーに制限酵素（HindIII）認識部位（配列中の括弧内）を付加したものであり、下記塩基配列からなる。また、上記リバースプライマーは、上記（4）のリバースプライマーに制限酵素（BamHI）認識部位（配列中の括弧内）を付加したものであり、下記塩基配列からなる。
フォワードプライマー：（TTACCATAAGCTT）GGAATTAGTGGGGGCAGCCAGGCCCCAGG（配列番号14）
リバースプライマー：（TAATTAAGGATCC）CCCAAAAACTACCCTTACCAAACTAATC（配列番号15）
　次いで、上記PCR用反応液それぞれを、サーマルサイクラ―（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）にセットし、下記反応条件でPCR増幅反応を行った。
※反応条件
94℃　2分間
↓
94℃　10秒間→55℃　10秒間→72℃　20秒間を1サイクルとして12サイクル
↓
72℃　2分間
　次いで、PCR増幅産物含有溶液　25μLそれぞれに、6×Loading Buffer Double Dye（（株）ニッポンジーン製） 5μLを加えて混合し、1.5％アガロースゲルにて電気泳動した。次いで、GelRed核酸ゲル染色液（富士フイルム和光純薬（株）製）で染色し、QIAquick Gel Extraction Kit（（株）キアゲン製）を使用して、PCR増幅産物それぞれを回収した。
（7）制限酵素処理
　上記（6）で得たPCR増幅産物含有溶液 43μLそれぞれに、10×Bバッファー（（株）ニッポンジーン製） 5μL、20ユニット/μL HindIII（（株）ニッポンジーン製） 1μL及び20ユニット/μL BamHI（（株）ニッポンジーン製） 1μLを混合した後、37℃で1時間反応させた。同様にpUC19（（株）ニッポンジーン製） 500ngに蒸留水を加えて43μLに調製し、20ユニット/μL HindIII（（株）ニッポンジーン製） 1μL及び20ユニット/μL BamHI（（株）社ニッポンジーン製） 1μLを加えた後、37℃で1時間反応させた。次いで、5.5M グアニジン塩酸塩（富士フイルム和光純薬（株）製）を250μLそれぞれ加えて混合した後、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）に移し、12000×g、室温で1分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。次いで、2mM Tris－HCL pH7.5（（株）ニッポンジーン製）を500μLそれぞれ加え、12000×g、室温で1分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。更に、12000×g、室温で1分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、2mM Tris－HCL pH8.0（（株）ニッポンジーン製）を25μLそれぞれ加え、12000×g、室温で１分間遠心分離することにより、制限酵素（HindIII及びBamHI）により処理した各PCR増幅産物及びpUC19をそれぞれ回収した。
（8）形質転換
　上記（7）で得たPCR増幅産物含有溶液 1μLそれぞれに、制限酵素により処理したpUC19 1μL、DNA Ligation Kit Mighty Mix（タカラバイオ（株）製） 2μLを加えて混合し、16℃で1時間反応させた。次いで、全量4μLそれぞれをECOS（商標）CompetentE. coli DH5α（（株）ニッポンジーン製）に形質転換し、アンピシリン添加LB寒天培地にスプレッドした。その後、コロニーをアンピシリン添加LB培地において、37℃で16時間培養した。その後、プラスミドキットSII（倉敷紡績（株）製）を使用して、プラスミドをそれぞれ抽出した。次いで、得られたプラスミドを用いて、タカラバイオ（株）のシークエンス受託サービスにて塩基配列をそれぞれ解読した。
　その結果を図3に示す。
　図3は、ヒト人工多能性幹細胞、ヒト正常全血及び大腸癌細胞の塩基配列解読結果について、メチル化状態の確認領域である、CpG配列を含む配列（CCGG及びGCGG）のシトシンがメチル化シトシン又は非メチル化シトシンの何れかであるかを表したものである。
　図3中の丸1～丸3は、図１及び2中の丸1～丸3に該当する。また、図3中の丸4～7は、図2中の丸4～7に該当する。
　尚、図3中の○は、CpG配列のシトシンが非メチル化シトシンであることを、●は、CpG配列のシトシンがメチル化シトシンであること表す。
　図3の結果から明らかな通り、ヒト人工多能性幹細胞及びヒト正常全血のメチル化状態の確認領域である、CpG配列を含む配列（CCGG及びGCGG）のシトシンは、非メチル化シトシンであることが分かった。
　一方、大腸癌細胞のメチル化状態の確認領域である、CpG配列を含む配列（CCGG及びGCGG）のシトシンは、メチル化シトシンであることが分かった。
実施例１　正常細胞及び癌細胞のFOXB2遺伝子の解析
　正常細胞及び癌細胞に由来するDNAについて、FOXB2遺伝子の解析を行った。
（1）条件の設定
　実施例1に用いた試料、当該試料に由来する鋳型DNA量及び標的領域は表4に示す通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
（2）DNAの抽出
　QuickGene SP kit DNA tissue（倉敷紡績（株）製）により、その現品説明書に従ってヒト人工多能性幹細胞及び大腸癌細胞に由来するDNA（100μg及び3μg）をそれぞれ抽出した。
（3）制限酵素A（PstI）及び制限酵素B（MboI）による処理並びに精製
　上記（2）で得たDNAそれぞれに、10×CutSmart Buffer（ニュー・イングランド・バイオラボ（株）製） 20μL、100ユニット/μLのPstI（ニュー・イングランド・バイオラボ（株）製） 1μL及び10ユニット/μLのMboI（タカラバイオ（株）製） 5μLを加え、滅菌水で200μLに調製した。その後、37℃で1時間反応させた。
　次いで、5.5M グアニジン塩酸塩（富士フイルム和光純薬（株）製） 500μL及び20mM Tris－HCL（pH7.0）（（株）ニッポンジーン製） 500μLをそれぞれ加えて混合した後、600μLずつ2回に分けてエコノスピン（（株）ジーンデザイン製）に移し、25000×g、室温で2分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。その後、2mM Tris－HCL（pH7.5）（（株）ニッポンジーン製） 600μL及び80％ エタノール（富士フイルム和光純薬（株）製） 600μLをそれぞれ加え、12000×g、室温で1分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。更に、12000×g、室温で5分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、2mM Tris－HCL（pH8.0）（（株）ニッポンジーン製） 30μLをそれぞれ加え、12000×g、室温で1分間遠心分離することにより、制限酵素A（PstI）及び制限酵素B（MboI）により処理したDNAをそれぞれ得た。
（4）エキソヌクレアーゼIIIによる処理並びに精製
　上記（3）で得たDNA含有Tris－HCL溶液 30μLそれぞれに、10×エキソヌクレアーゼIIIバッファー（タカラバイオ（株）製） 10μL及び200ユニット／μLのエキソヌクレアーゼIII（タカラバイオ（株）製） 2μLを加え、滅菌水で100μLに調製した。その後、37℃で1時間反応させた後、0.5M EDTA（（株）ニッポンジーン製） 1μLをそれぞれ加えた。
　次いで、5.5M グアニジン塩酸塩（富士フイルム和光純薬（株）製） 500μL及び20mM Tris－HCL（pH7.0）（（株）ニッポンジーン製） 500μLをそれぞれ加えて混合した後、600μLずつ2回に分けてエコノスピン（（株）ジーンデザイン製）に移し、25000×g、室温で2分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。その後、2mM Tris－HCL（pH7.5）（（株）ニッポンジーン製） 600μL及び80％ エタノール（富士フイルム和光純薬（株）製） 600μLをそれぞれ加え、12000×g、室温で1分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。更に、12000×g、室温で5分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、2mM Tris－HCL（pH8.0）（（株）ニッポンジーン製） 30μLをそれぞれ加え、12000×g、室温で1分間遠心分離することにより、エキソヌクレアーゼIIIにより処理したDNAをそれぞれ得た。
（5）一本鎖特異的ヌクレアーゼ（S1ヌクレアーゼ）による処理並びに精製
　上記（4）で得たDNA含有Tris－HCL溶液 30μLそれぞれに、10×S1ヌクレアーゼバッファー（タカラバイオ（株）製） 10μL及び180ユニット/μLのS1ヌクレアーゼ 2μLを加え、滅菌水で100μLに調製した。その後、23℃で20分間反応させた後、0.5M EDTA（（株）ニッポンジーン製） 1μLをそれぞれ加えた。
　次いで、5.5M グアニジン塩酸塩（富士フイルム和光純薬（株）製） 500μL及び20mM Tris－HCL（pH7.0）（（株）ニッポンジーン製） 500μLをそれぞれ加えて混合した後、600μLずつ2回に分けてエコノスピン（（株）ジーンデザイン製）に移し、25000×g、室温で2分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。その後、2mM Tris－HCL（pH7.5）（（株）ニッポンジーン製） 600μL及び80％ エタノール（富士フイルム和光純薬（株）製） 600μLをそれぞれ加え、12000×g、室温で1分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。更に、12000×g、室温で5分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、2mM Tris－HCL（pH8.0）（（株）ニッポンジーン製） 30μLをそれぞれ加え、12000×g、室温で1分間遠心分離することにより、一本鎖特異的ヌクレアーゼ（S1ヌクレアーゼ）により処理したDNAをそれぞれ得た。
（6）メチル化感受性制限酵素（HapII）による処理並びに精製
　上記（5）で得たDNA含有Tris－HCL溶液 30μLそれぞれに、10×Lバッファー（タカラバイオ（株）製） 10μL及び50ユニット/μLのHapII（タカラバイオ（株）製） 2μLを加え、滅菌水で100μLに調製した。その後、37℃で2時間反応させた。
　次いで、5.5M グアニジン塩酸塩（富士フイルム和光純薬（株）製） 500μL及び20mM Tris－HCL（pH7.0）（（株）ニッポンジーン製） 500μLをそれぞれ加えて混合した後、600μLずつ2回に分けてエコノスピン（（株）ジーンデザイン製）に移し、25000×g、室温で2分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。その後、2mM Tris－HCL（pH7.5）（（株）ニッポンジーン製） 600μL及び80％ エタノール（富士フイルム和光純薬（株）製） 600μLをそれぞれ加え、12000×g、室温で1分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。更に、12000×g、室温で5分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、2mM Tris－HCL（pH8.0）（（株）ニッポンジーン製） 30μLをそれぞれ加え、12000×g、室温で1分間遠心分離することにより、メチル化感受性制限酵素（HapII）により処理したDNAをそれぞれ得た。
　尚、HapIIが認識する配列は、図1で表されるヒト由来のFOXB2遺伝子プロモーター領域内の配列番号1で表される塩基配列からなる領域（267塩基対）のうち、四角で囲まれた3つ（丸1、丸2及び丸3）の、CpG配列を含む配列（CCGG）である。
（7）増幅反応
　上記（6）で得たDNA含有Tris－HCL溶液 1μLそれぞれに、10×KOD－Plus－Ver. 2 Buffer（東洋紡（株）製） 1.5μL、1ユニット/μLのKOD－Plus－Ver. 2（東洋紡（株）製） 0.2μL、2mM dNTPs（東洋紡（株）製） 1.5μL、5μM フォワードプライマー（h267-f-fox） １μL及び5μM リバースプライマー（h267-r-fox）を加え、滅菌水で15μLに調製し、これをPCR用反応液とした。
　尚、上記プライマーにより得られる増幅産物の大きさ（塩基対数）は、267塩基対（配列番号1）である。
　また、鋳型として上記（5）で得たものを用いた以外は、上記と同様にしてPCR用反応液を調整し、これをコントロールとした。
　上記PCR用反応液それぞれをサーマルサイクラ―（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）にセットし、下記反応条件でPCRを行った。
※反応条件
94℃　2分間
↓
96℃　5秒間→68℃　20秒間を1サイクルとして40サイクル
↓
68℃　2分間
（8）電気泳動
　上記（7）で得た増幅産物含有溶液 15μLそれぞれに、6×Loading Buffer Double Dye（（株）ニッポンジーン製） 3μLを加えて混合した後、該混合物を2％アガロースゲルにて電気泳動した。次いで、GeLRed核酸ゲル染色液（富士フイルム和光純薬（株）製）で染色し、UV照射装置により増幅産物をそれぞれ確認した。また、その結果を図4に示す。
　また、図4の各レーンにおける試料、試料に由来する鋳型DNA量及び標的領域を表5にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
　図4の結果より、ヒト人工多能性幹細胞に由来するDNA（100μg）を、制限酵素A、制限酵素B、エキソヌクレアーゼIII、一本鎖特異的ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素により処理し、本発明に係るプライマー対を用いてPCR増幅反応を行った場合（レーン2）、何れも目的の増幅産物［ヒト由来のFOXB2遺伝子の特定領域（267塩基対、配列番号1）］は確認されず、標的領域は得られていないことが分かった。
　従って、標的領域はメチル化感受性制限酵素により切断されており、「標的領域はメチル化されていない。」と判定することができた。また、「試料（ヒト人工多能性幹細胞）は、正常細胞である。」と判定することもできた。
　一方、大腸癌細胞に由来するDNA（3μg）をメチル化感受性制限酵素により処理し、本発明に係るプライマー対を用いてPCR増幅反応を行った場合（レーン4）、目的の増幅産物［ヒト由来のFOXB2遺伝子のうちの特定領域（267塩基対、配列番号1）］は確認され、標的領域は得られていることが分かった。
　従って、標的領域はメチル化感受性制限酵素により切断されておらず、「標的領域はメチル化されている。」と判定することができた。また、「試料（大腸癌細胞）は、癌細胞である。」と判定することもできた。
　実施例1の結果より、本発明の方法によれば、試料（細胞）が癌細胞であるか否かの判定を簡便且つ精度よく行えることが分かった。
実施例2　ヒト正常全血におけるFOXB2遺伝子の解析
　試料、試料に由来する鋳型DNA量及び標的領域を表6の通りに設定し、実施例1と同様の方法により、増幅産物の確認を行った。その結果を図5に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
　図5の結果より、ヒト正常全血由来のDNA（60.5μg）を、制限酵素A、制限酵素B、エキソヌクレアーゼIII、一本鎖特異的ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素により処理し、本発明に係るプライマー対を用いてPCR増幅反応を行った場合（レーン2）、目的の増幅産物［ヒト由来のFOXB2遺伝子のうちの特定領域（267塩基対、配列番号1）］は確認されず、標的領域は得られていないことが分かる。
　従って、標的領域はメチル化感受性制限酵素により切断されており、「標的領域はメチル化されていない。」と判定することができた。また、「試料（ヒト正常全血）中に癌細胞は存在しない。」又は「試料（ヒト正常全血）に由来する対象（ヒト）は癌に罹患していない。」と判定することもできた。
実施例3　癌患者全血及びヒト正常全血におけるFOXB2遺伝子の解析
　膵臓癌患者（ステージIV）全血及びヒト正常全血に由来するDNAについて、FOXB2遺伝子の解析を行った。
（1）条件の設定
　実施例3に用いた試料、当該試料に由来する鋳型DNA量及び標的領域は表7に示す通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
（2）DNAの抽出
　NucleoSpin（商標） Plasma XS（マッハライ・ナーゲル（株）製）により、その現品説明書に従って、膵臓癌患者由来の全血及びヒト正常全血よりDNA 2μgをそれぞれ抽出した。
（3）制限酵素A（PstI）及び制限酵素B（BamHI及びHindIII）による処理並びに精製
　（2）で得たDNAそれぞれに、10×CutSmart Buffer（NEB（株）製） 10μL、100ユニット/μL PstI（NEB（株）製） １μL、100ユニット/μL BamHI（NEB（株）製） 1μL及び100ユニット/μL HindIII（NEB（株）製） 1μLを加え、滅菌水で全量100μLにした。その後、37℃で2時間反応させた。次いで、5.5M グアニジン塩酸塩（富士フイルム和光純薬（株）製） 500μL及び20mM Tris－HCL pH7.0（（株）ニッポンジーン製） 500μLをそれぞれ加えて混合した後、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）に移し、13000×g、室温で2分間遠心し、チューブ内の溶液を除去した。次いで、2mM Tris－HCL pH7.5（（株）ニッポンジーン製） 600μL及び80％エタノール（富士フイルム和光純薬（株）製） 600μLをそれぞれ加え、13000×g、室温で1分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。更に、13000×g、室温で3分間遠心分離した後、それぞれ新しいチューブに交換し、滅菌水 50μLをそれぞれ添加し、13000×g、室温で1分間遠心分離することにより、制限酵素A（PstI）及び制限酵素B（BamHI及びHindIII）により処理したDNAをそれぞれ得た。
（4）エキソヌクレアーゼIIIによる処理及び精製
　上記（3）で得たDNA含有Tris－HCL溶液 50μLに、10×エキソヌクレアーゼIIIバッファー（タカラバイオ（株）製） 10μL及び200ユニット／μLのエキソヌクレアーゼIII（タカラバイオ（株）製） 1μLを加え、滅菌水で100μLに調製した。その後、23℃で1時間反応させた後、0.5M EDTA（（株）ニッポンジーン製） 1μLをそれぞれ加えた。
　次いで、5.5M グアニジン塩酸塩（富士フイルム和光純薬（株）製） 500μL及び20mM Tris－HCL（pH7.0）（（株）ニッポンジーン製） 500μLをそれぞれ加えて混合した後、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）に移し、3000×g、室温で2分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。その後、2mM Tris－HCL（pH7.5）（（株）ニッポンジーン製） 600μL及び80％ エタノール（富士フイルム和光純薬（株）製） 600μLをそれぞれ加え、13000×g、室温で1分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。更に、13000×g、室温で5分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、滅菌水 50μLをそれぞれ加え、13000×g、室温で1分間遠心分離することにより、エキソヌクレアーゼIIIにより処理したDNAをそれぞれ得た。
（5）一本鎖特異的ヌクレアーゼ（S1ヌクレアーゼ）による処理並びに精製
　上記（3）で得たDNA含有滅菌水 50μLそれぞれに、10×S1ヌクレアーゼバッファー（タカラバイオ（株）製） 10μL及び180ユニット/μLのS1ヌクレアーゼ 1μLを加え、滅菌水で100μLに調製した。その後、23℃で15分間反応させた。
　次いで、5.5M グアニジン塩酸塩（富士フイルム和光純薬（株）製） 500μL及び20mM Tris－HCL（pH7.0）（（株）ニッポンジーン製） 500μLをそれぞれ加えて混合した後、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）に移し、3000×g、室温で2分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。その後、2mM Tris－HCL（pH7.5）（（株）ニッポンジーン製） 600μL及び80％　エタノール（富士フイルム和光純薬（株）製） 600μLをそれぞれ加え、13000×g、室温で1分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。更に、13000×g、室温で5分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、滅菌水 50μLを加え、13000×g、室温で1分間遠心分離することにより、一本鎖特異的ヌクレアーゼ（S1ヌクレアーゼ）により処理したDNAをそれぞれ得た。
（6）メチル化感受性制限酵素（HpaII及びAciI）による処理並びに精製
　上記（5）で得たDNA含有滅菌水 50μLそれぞれに、10×CutSmart Bufferバッファー（NEB（株）製） 10μL、50ユニット/μL HpaII（NEB（株）製） 1μL及び10ユニット/μL AciI（NEB（株）製）を加え、滅菌水で100μLに調製した。その後、37℃で1時間反応させた。
　次いで、5.5M グアニジン塩酸塩（富士フイルム和光純薬（株）製） 500μL及び20mM Tris－HCL（pH7.0）（（株）ニッポンジーン製） 500μLをそれぞれ加えて混合した後、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）に移し、3000×g、室温で2分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。その後、2mM Tris－HCL（pH7.5）（（株）ニッポンジーン製） 600μL及び80％　エタノール（富士フイルム和光純薬（株）製） 600μLをそれぞれ加え、13000×g、室温で5分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。更に、12000×g、室温で5分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、滅菌水 50μLをそれぞれ加え、13000×g、室温で1分間遠心分離することにより、メチル化感受性制限酵素（HpaII及びAciI）により処理したDNAをそれぞれ得た。
　尚、HpaIIが認識する配列は、図2で表されるヒト由来のFOXB2遺伝子プロモーター領域内の配列番号2で表される塩基配列からなる領域（149塩基対）のうち、四角で囲まれた3つ（丸1、丸2及び丸3）の、CpG配列を含む配列（CCGG）である。
　また、AciIが認識する配列は、図2で表されるヒト由来のFOXB2遺伝子プロモーター領域内の配列番号2で表される塩基配列からなる領域（149塩基対）のうち、四角で囲まれた4つ（丸4、丸5、丸6及び丸7）の、CpG配列を含む配列（5’-CCGC-3’, 3’-GGCG-5’）である。
（7）増幅反応
　上記（6）で得たDNA含有滅菌水　3μLに、20μM フォワードプライマー（h149-f-fox） 1μL、20μM リバースプライマー（h149-r-fox） 1μL、10μM プローブ[h149-p-fox（5’末端をFAM、3’末端をBHQ1で標識）] 0.6μL、20μM フォワードプライマー（配列番号16で表される塩基配列Genbank Accession No. NG_007073、7259-7283）1μL、20μM リバースプライマー（配列番号17で表される塩基配列：Genbank Accession No. NG_007073、7383-7407） 1μL、10μM プローブ［配列番号18で表される塩基配列（5’末端をHEX、3’末端をBHQ1で標識）：Genbank Accession No. NG_007073、7342-7366］ 0.6μM、ddPCR（登録商標）Supermix for Probes（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製） 11μL及び50ユニット/μL HpaII 0.3μLを加え、滅菌水で全量22μLに調製し、これをデジタルPCR用反応液とした。その後、上記デジタルPCR用反応液をサーマルサイクラー（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）にセットし、37℃で30分間反応させた。次いで、Automated Droplet Generator（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）にてドロップレットを作成し、このドロップレットを96ウェルプレートに分注した後、サーマルサイクラー（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）にて下記反応条件でデジタルPCR法による増幅反応を行った。
下記反応条件でPCRを行った。
※反応条件
95℃　10分間
↓
94℃　30秒間→62℃　1分間を1サイクルとして40サイクル
↓
98℃　10分間
　尚、上記配列番号16及び17で表される塩基配列からなるプライマー、並びに配列番号18で表される塩基配列からなるプローブは、内在性コントロールとして選択したGAPDH遺伝子の特定領域（配列番号19：Genbank Accession No. NG_007073、7259-7407）を増幅するためのものである。
（8）蛍光リーダーによる増幅産物の確認
　上記(7)で得た増幅産物を含有する各ドロップレット由来の蛍光を、QX200 Droplet Reader（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）にて検出することにより、増幅産物の確認を行った。
　FOXB2遺伝子の解析結果を図6のAに、GAPDH遺伝子の解析結果を図6のBにそれぞれ示す。
　尚、図6のA及びBにおける縦軸は蛍光強度を、横軸はドロップレット数を示す。
　また、陽性又は陰性の判定の基準となる閾値については、FOXB2遺伝子の解析については、FOXB2遺伝子の解析結果より、蛍光強度8000とした。また、GAPDH遺伝子の解析については、GAPDH遺伝子の解析結果より、蛍光強度4000とした。
　従って、FOXB2遺伝子の解析については、蛍光強度8000を超えるドロップレットが少なくとも1つあった場合、陽性（目的の増幅産物が得られた）と判定し、蛍光強度8000を超えるドロップレットが存在しなかった場合、陰性（目的の増幅産物が得られなかった）と判定した。また、GAPDH遺伝子の解析については、蛍光強度4000を超えるドロップレットが少なくとも1つあった場合、陽性（目的の増幅産物が得られた）と判定し、蛍光強度4000を超えるドロップレットが存在しなかった場合、陰性（目的の増幅産物が得られなかった）と判定した。
　図６における試料、標的領域、陽性ドロップレット数、陰性ドロップレット数、総ドロップレット数及び閾値について、表8並びに表9に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
　図6のA及び表8より、膵臓癌患者由来の全血を用いた場合、閾値を超える蛍光を発する陽性ドロップレットが確認できたことから、目的の増幅産物［FOXB2遺伝子の特定領域：配列番号2で表される塩基配列からなる領域（149塩基対）］が得られていることが分かった。
　また、ヒト正常全血を用いた場合、閾値を超える蛍光を発する陽性ドロップレットが確認できたことから、目的の増幅産物[FOXB2遺伝子の特定領域：配列番号2で表される塩基配列からなる領域（149塩基対）]が得られていないことが分かった。
　図6のB及び表9より、膵臓癌患者由来の全血及びヒト正常全血を用いた場合、閾値を超える蛍光を発する陽性ドロップレットが確認できたことから、目的の増幅産物［GAPDH遺伝子の特定領域：配列番号19で表される塩基配列からなる領域（149塩基対）］が得られていることが分かった。
　従って、膵臓癌患者由来の全血については、標的領域はメチル化感受性制限酵素により切断されておらず、「標的領域はメチル化されている。」と判定することができた。また、「試料（膵臓癌患者由来の全血）に由来する対象（膵臓癌患者）は、癌に罹患している又は当該対象（膵臓癌患者）中に癌細胞が存在している」と判定することもできた。
　一方、ヒト正常全血については、標的領域はメチル化感受性制限酵素により切断されており、「標的領域はメチル化されていない。」と判定することができた。また、「試料（ヒト正常全血）に由来する対象（ヒト）は、癌に罹患していない又は当該対象（ヒト）中に癌細胞が存在していない」と判定することもできた。
　実施例2及び3の結果より、本発明の方法によれば、試料における癌細胞の有無の判定、試料に由来する対象が癌に罹患しているか否かの判定等を精度よく行えることが分かった。
　本発明の標的領域の精製方法、標的領域の検出方法及び癌の判定方法によれば、標的領域の精製及び検出並びに癌の判定を簡便、短時間且つ精度よく行うことができる。

Claims (10)

  1. 下記工程１～３を含む、二本鎖ＤＮＡ中の標的領域の精製方法：
    （１）（ａ）末端に３’突出を生じさせる制限酵素Ａを１種以上及び（ｂ）末端に５’突出を生じさせる制限酵素Ｂを１種以上用いて、標的領域を有する二本鎖ＤＮＡから、（ｉ）標的領域を有しその両端が３’突出である、３’突出標的二本鎖ＤＮＡ断片並びに、（ｉｉ）標的領域を有さずその両端が５’突出である、５’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片又は／及び（ｉｉｉ）標的領域を有さずその両端がそれぞれ５’突出及び３’突出である、５’／３’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片を生じさせる工程１、ここで、当該制限酵素Ａは当該標的領域中の塩基配列を切断せず、当該制限酵素Ｂは当該３’突出標的二本鎖ＤＮＡ断片中の塩基配列を切断しないものである、
    （２）前記工程１で生じた、（ｉ）３’突出標的二本鎖ＤＮＡ断片並びに、（ｉｉ）５’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片又は／及び（ｉｉｉ）５’／３’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片を、エキソヌクレアーゼＩＩＩで処理することにより、（ｉｉ）５’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片又は／及び（ｉｉｉ）５’／３’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片から、それぞれ（ｉｖ）標的領域を有さない一本鎖ＤＮＡ断片を生じさせる工程２、
    （３）前記工程２で生じた、（ｉｖ）標的領域を有さない一本鎖ＤＮＡ断片及び（ｉ）３’突出標的二本鎖ＤＮＡ断片を、一本鎖特異的ヌクレアーゼで処理することにより、（ｉ）３’突出標的二本鎖ＤＮＡ断片から、（ｖ）標的領域を有しその両端が平滑である、平滑標的二本鎖ＤＮＡ断片を生じさせる工程３。
  2. 前記工程１において、制限酵素Ａ及び制限酵素Ｂを同時に用いる、請求項１に記載の精製方法。
  3. 下記工程１～５を含む、二本鎖ＤＮＡ中の標的領域の検出方法：
    （１）（ａ）末端に３’突出を生じさせる制限酵素Ａを１種以上及び（ｂ）末端に５’突出を生じさせる制限酵素Ｂを１種以上用いて、標的領域を有する二本鎖ＤＮＡから、（ｉ）標的領域を有しその両端が３’突出である、３’突出標的二本鎖ＤＮＡ断片並びに、（ｉｉ）標的領域を有さずその両端が５’突出である、５’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片］又は／及び（ｉｉｉ）標的領域を有さずその両端がそれぞれ５’突出及び３’突出である、５’／３’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片を生じさせる工程１、ここで、当該制限酵素Ａは当該標的領域中の塩基配列を切断せず、当該制限酵素Ｂは当該３’突出標的二本鎖ＤＮＡ断片中の塩基配列を切断しないものである、
    （２）前記工程１で生じた、（ｉ）３’突出標的二本鎖ＤＮＡ断片並びに、（ｉｉ）５’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片又は／及び（ｉｉｉ）５’／３’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片を、エキソヌクレアーゼＩＩＩで処理することにより、（ｉｉ）５’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片又は／及び（ｉｉｉ）５’／３’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片から、それぞれ（ｉｖ）標的領域を有さない一本鎖ＤＮＡ断片を生じさせる工程２、
    （３）前記工程２で生じた、（ｉｖ）標的領域を有さない一本鎖ＤＮＡ断片及び（ｉ）３’突出標的二本鎖ＤＮＡ断片を、一本鎖特異的ヌクレアーゼで処理することにより、（ｉ）３’突出標的二本鎖ＤＮＡ断片から、（ｖ）標的領域を有しその両端が平滑である、平滑標的二本鎖ＤＮＡ断片を生じさせる工程３、
    （４）前記工程３で生じた、（ｖ）平滑標的二本鎖ＤＮＡ断片中の標的領域を増幅処理に付す工程４、
    （５）前記工程４で生じた、増幅産物の有無を確認する工程５。
  4. 前記工程１において、制限酵素Ａ及び制限酵素Ｂを同時に用いる、請求項３に記載の検出方法。
  5. 下記工程１～７を含む、癌の判定方法：
    （１）（ａ）末端に３’突出を生じさせる制限酵素Ａを１種以上及び（ｂ）末端に５’突出を生じさせる制限酵素Ｂを１種以上用いて、標的領域を有する二本鎖ＤＮＡから、（ｉ）標的領域を有しその両端が３’突出である、３’突出標的二本鎖ＤＮＡ断片並びに、（ｉｉ）標的領域を有さずその両端が５’突出である、５’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片又は／及び（ｉｉｉ）標的領域を有さずその両端がそれぞれ５’突出及び３’突出である、５’／３’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片を生じさせる工程１、ここで、当該制限酵素Ａは当該標的領域中の塩基配列を切断せず、当該制限酵素Ｂは当該３’突出標的二本鎖ＤＮＡ断片中の塩基配列を切断しないものである、
    （２）前記工程１で生じた、（ｉ）３’突出標的二本鎖ＤＮＡ断片並びに、（ｉｉ）５’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片又は／及び（ｉｉｉ）５’／３’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片を、エキソヌクレアーゼＩＩＩで処理することにより、（ｉｉ）５’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片又は／及び（ｉｉｉ）５’／３’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片から、それぞれ（ｉｖ）標的領域を有さない一本鎖ＤＮＡ断片を生じさせる工程２、
    （３）前記工程２で生じた、（ｉｖ）標的領域を有さない一本鎖ＤＮＡ断片及び（ｉ）３’突出標的二本鎖ＤＮＡ断片を、一本鎖特異的ヌクレアーゼで処理することにより、（ｉ）３’突出標的二本鎖ＤＮＡ断片から、（ｖ）標的領域を有しその両端が平滑である、平滑標的二本鎖ＤＮＡ断片を生じさせる工程３、
    （４）前記工程３で生じた、（ｖ）平滑標的二本鎖ＤＮＡ断片を、メチル化感受性制限酵素で処理する工程４、
    （５）前記工程４で処理された、（ｖ）平滑標的二本鎖ＤＮＡ断片中の標的領域を増幅処理に付す工程５、
    （６）前記工程５で生じた、増幅産物の有無を確認する工程６、
    （７）前記工程６の確認結果に基づいて、癌を判定する工程７。
  6. 前記工程１において、制限酵素Ａ及び制限酵素Ｂを同時に用いる、請求項５に記載の判定方法。
  7. 前記標的領域が配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列を含む塩基配列である、請求項５に記載の判定方法。
  8. 前記工程１の制限酵素ＡがＰｓｔＩであって、制限酵素ＢがＭｂｏＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ又はＨｉｎｄＩＩＩである、請求項７に記載の判定方法。
  9. 前記工程３の一本鎖特異的ヌクレアーゼが、Ｓ１ヌクレアーゼである、請求項７に記載の判定方法。
  10. 前記工程４のメチル化感受性制限酵素が、ＨａｐＩＩ、ＨｐａＩＩ、ＳａｃＩＩ、ＢｓｔｕＩ、ＡｃｉＩ又はＦａｕＩである、請求項７に記載の判定方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4843003A (en) * 1984-02-17 1989-06-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Process for producing shortened target DNA fragments usable in sequencing large DNA segments
JP2002522091A (ja) * 1998-08-17 2002-07-23 フィロス インク． ３’非翻訳領域を欠損する核酸を生成して細胞ｒｎａ蛋白質融合体形成を最適化する方法
WO2018043724A1 (ja) * 2016-09-02 2018-03-08 和光純薬工業株式会社 メチル化されたｄｎａの増幅方法、ｄｎａのメチル化判定方法並びに癌の判定方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4843003A (en) * 1984-02-17 1989-06-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Process for producing shortened target DNA fragments usable in sequencing large DNA segments
JP2002522091A (ja) * 1998-08-17 2002-07-23 フィロス インク． ３’非翻訳領域を欠損する核酸を生成して細胞ｒｎａ蛋白質融合体形成を最適化する方法
WO2018043724A1 (ja) * 2016-09-02 2018-03-08 和光純薬工業株式会社 メチル化されたｄｎａの増幅方法、ｄｎａのメチル化判定方法並びに癌の判定方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HENIKOFF, S.: "Unidirectional digestion with exonuclease III in DNA sequence analysis", METH. ENZYMOL., vol. 155, 1987, pages 156 - 165, ISSN: 0076-6879 *

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