KR20240005282A - Crispr/cas 기반의 핵산 검출용 키트 및 이에 기초한 핵산 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
본 명세서에서는 핵산 추출 튜브, 및 핵산 반응 조성물을 포함하고, 상기 핵산 추출 튜브는, 시료를 수용하도록 구성된 바디부, 및 상기 바디부의 내벽부 상에 배치되는 양이온성 고분자 물질로 이루어진 양전하층을 포함하고, 상기 핵산 반응 조성물은, Cas9 단백질, 및 표적 DNA에 특이적으로 결합하는 표적화 서열을 포함하는 dsRNA(dual guide RNA) 또는 sgRNA(single chain guide RNA)를 포함하는, CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트 및 이에 기초한 핵산 검출 방법이 제공된다.
Description
본 발명은 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트 및 이를 이용한 핵산 검출 방법에 관한 것이다.
암은 여전히 전세계적으로 높은 사망원인이나, 조기에 발견할 경우, 사망률이 감소됨에 따라, 암의 조기 진단에 대한 중요성이 부각되고 있다. 나아가, 조기 진단 뿐만 아니라 치료 과정에서 암의 상태 및 재발 가능성을 확인할 수 있는 암의 진단 또한 암 치료에 있어 중요할 수 있다.
현재 이러한 암 진단의 표준방법으로 생체에서 조직 일부를 채취하 여 현미경으로 검사하는 조직생체검사(tissue biopsy, 조직 생검)가 수행되고 있다. 그러나, 조직생체검사는 내시경이나 바늘 등의 외과용 수술도구를 이용하여 침습적으로 수행되기 때문에, 환자에게 고통 및 부담이 가중될 수 있으며, 의사에 게도 위험 부담이 크다. 또한, 종양(암)의 위치, 크기 및 환자의 상태에 따라 조직생체검사를 시행할 수 없을 수 있어, 진단 자체가 제한적으로 수행되어 왔다.
이에, 전술한 조직생체검사의 단점을 극복하기 위할 수 있는, 액체 생체 검사(liquid biopsy, 액체 생검)가 주목을 받고 있다. 액체 생검은 종양으로 부터 혈액 내로 방출된 세포, DNA 및 RNA 등을 체액을 통하여 검사하는 방법으로서, 간편하고 빠르게 비침습적으로 검사할 수 있다. 특히, 액체 생검은 종양 세포 특유의 바이오 마커를 분석함으로써, 위양성(false positive) 판명 가능 성도 낮으며, 발생 및 전이 등의 다양한 암의 상태 또한 관찰이 가능하다.
한편, 액체-생체검사와 관련하여, 종양으로부터 혈류로 방출되어, 체내 혈액 내 존재하는 세포 유리 DNA(cell-free DNA, cfDNA)에 대한 연구가 활발 히 진행되고 있다. 혈액, 혈장 또는 소변 등의 다양한 생물학적 시료에서 유래된 cfDNA를 분리하고 검출하는 기술이 발전함에 따라, 액체 생체 검사가 암 위험군 환자의 모니터링에 있어서 보다 효과적이고 신뢰할 수 있는 도구가 될 것이다.
현재까지 다양한 연구에서, 진행성 췌장암, 폐암, 난소 암, 대장암, 방광암, 위 식도암, 유방암, 흑색종, 간세포 암, 전립선 암 및 두경부 암을 포함하는 다양한 암을 가진 환자의 50% 이상 암 유래 cfDNA 즉, 순환 종양 핵산 (circulating tumor DNA, ctDNA)이 확인되었다. 나아가, 전이성 대장암 환자를 대 상으로 한 유전자 임상 진단에서 KRAS 유전자 변이 검출에 대한 cfDNA의 민감도는 87.2%였고, 특이도는 99.2%였다.
이와 같은 연구들은 cfDNA 및 ctDNA 분석을 통한 암 진단의 가능성을 보여줌으로써, cfDNA 내 암 유래 유전자인 ctDNA는 차세대 바이오 마커로 각광받고 있다. 이에, 액체 생검에서 ctDNA를 통한 다양한 암의 진단이 시도되고 있다.
한편, 액체 생검에서의 표적 DNA의 측정은 분자 진단법이 이용되고 있다. 보다 구체적으로, 분자진단법으로 병원균 및 생검 내의 DNA를 검출하는 방법으로 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)이 이용되며, PCR은 단일 수준의 유전자분석을 통하여 다른 체외 진단 법들에 비해 높은 재현성, 고감도 및 신속성 등의 특징을 보이고 있다. 그러나, 표적 DNA를 시료로부터 검출하기 위하여 세포에서 DNA를 추출, 농축 및 정제 등의 복잡한 전처리 기술이 필수적으로 선행되어야 한다. 나아가, 이러한 검출 과정에서 페놀, 클로로포름, 구아니디늄 티오시아네이트 등과 같은 용매를 이용하여 세포의 DNA를 용해시킨다. 이러한 용매들은 독성 화학 물질이므로, 시험자의 안전을 위한 숙련된 기술이 요구된다.
이에, 액체 생검을 포함하는 다양한 시료에 대한 표적 DNA 측정에 있어, 종래의 분자진단법에서는 보다 간편하고 용이한 전처리 기술 및 이와 연계된 PCR의 개발에 대한 요구가 높아지고 있다.
발명의 배경이 되는 기술은 본 발명에 대한 이해를 보다 용이하게 하기 위해 작성되었다. 발명의 배경이 되는 기술에 기재된 사항들이 선행기술로 존재한다고 인정하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
종래의 핵산 추출에서 원심 분리기를 이용하는 스핀 컬럼(spin column) 방식의 전처리 키트가 많이 이용되고 있으나, 키트를 이용하더라도 다양한 시약 및 소모품이 요구되며, 원심 분리 및 기타 장비등을 이용해야 한다. 따라서, 스핀 컬럼 방식은 장소 및 전문성이 요구되는 대한 한계가 있다.
이에, 상기의 문제점들을 보완하기위해 Lab-on-a-chip 상에서 전처리 및 진단을 한번에 구현하고자 하는 다양한 시도들이 이루어지고 있다. 그러나, PCR을 위해서 제작한 칩에 맞춘 열순환 장비를 추가로 제작해야 한다는 점과 상용화된 분자진단 장비들과 호환성 및 범용성이 떨어지는 한계가 있다.
한편, 본 발명의 발명자들은, 상기와 같은 핵산 추출의 한계를 극복하기 위해, 보다 간편하여 누구나 다룰 수 있으며, 신속하게 핵산을 검출할 수 있는 방법의 필요성에 대하여 인지할 수 있었다.
이에, 본 발명의 발명자들은 여러 장비가 요구되는 PCR 전처리 과정을 특별한 장비 없이도 한번에 수행할 수 있으며, 종래의 PCR 장치에 호환가능한 핵산 추출 튜브 및 이를 이용한 핵산 검출 방법에 대하여 연구 개발하였다.
그 결과, 본 발명의 발명자들은, 양이온성 고분자 물질을 PCR 튜브에 코팅하였을 경우, PCR 튜브 내에서 시료의 핵산이 포획되어 간편히 PCR에 대한 전처리 과정이 수행될 수 있다는 것을 발견하기에 이르렀다.
보다 구체적으로, 본 발명의 발명자들은 양이온성 고분자 물질이 기상 증착 공정에 의하여 PCR 튜브 내의 표면 상에 균일하게 증착된 경우, 독성 용매를 사용하거나 원심 분리와 같은 특별한 과정이 없이도 시료 내의 핵산을 포획할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명의 발명자들은 유전자 가위(RNA-guided CRISPR, clustered regularly interspaced short palindrome repeats) 즉, 뉴클레아제 Cas 단백질에 기반한 유전체 교정(genome editing)을 주목하였다. 유전자 가위 기술은, 표적 넛-아웃 전사 활성화 및 가이드 RNA(single guide RNA, sgRNA)를 이용하여, 특정 DNA 부위를 절단하여 사용하는 편집 기술을 의미하며, 줄기세포 또는 체세포에서 유전병의 원인이 되는 돌연 변이의 교정, 항암 세포 치료제와 같이 다양한 분야에서 활용될 수 있다.
이때, 특정 DNA를 절단할 때 이용되는 Cas 단백질(Cas9 뉴클레아제)는 가이드 RNA의 서열에 의해 특정된 DNA 표적 서열을 인식하여 절단한다. 이러한 Cas9 뉴클레아제 및 가이드 RNA를 포함하는 유전자 가위를 이용한 방법은, 전술한 바와 같이 특정 유전자를 편집하고자 하는 목적으로 이용되어 왔다.
그러나, 본 발명의 발명자들은 유전자 가위를 이용한 방법에서 특히, Cas9 뉴클레아제 및 가이드 RNA가 표적 유전자 부위를 정확하게 인식하여 이를, 절단할 수 있다는 것에 더욱 주목하였고, 이를 앞서 전술한 핵산 추출 튜브와 함께 유전자 증폭에 이용할 경우, 측정하고자 하는 표적 유전자를 보다 효과적으로 검출할 수 있다는 것을 인지하였다.
보다 구체적으로, 본 발명의 발명자들은 핵산 추출 튜브를 통하여 genomic DNA를 추출 및 포획한 뒤, 포획된 상태에서 Cas9 뉴클레아제 및 가이드 RNA를 통하여 표적 유전자 또는 유전자 부위를 절단하여, 절단된 표적 유전자 또는 유전자 부위만을 증폭할 경우, 보다 높은 감도로 이를 측정할 수 있다는 것을 발견하였다.
이에, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 시료를 수용하도록 구성된 바디부의 내벽부 상에 배치되는 양이온성 고분자 물질로 이루어진 양전하층을 포함하는 핵산 추출 튜브와 Cas9 뉴클레아제 및 가이드 RNA를 포함하는 핵산 반응 조성물을 포함함으로써, 종래의 방법보다 향상된 검출력을 가지는 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트 및 이에 기초한 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
전술한 바와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 핵산 추출 튜브, 및
핵산 반응 조성물을 포함하고, 상기 핵산 추출 튜브는, 시료를 수용하도록 구성된 바디부, 및 상기 바디부의 내벽부 상에 배치되는 양이온성 고분자 물질로 이루어진 양전하층을 포함하고, 상기 핵산 반응 조성물은, Cas9 단백질, 및 표적 DNA에 특이적으로 결합하는 표적화 서열을 포함하는 dsRNA(dual guide RNA) 또는 sgRNA(single chain guide RNA)를 포함하는, CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 특징에 따르면, 키트는, aM 수준의 검출 한계(LOD)를 가질 수 있다.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 양전하층의 두께는, 1 내지 1000nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 양이온성 고분자 물질은, 폴리(2-디메틸아미노메틸 스티렌)(pDMAMS), 폴리-2-다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트(pDMAEMA), 폴리-1-비닐피롤리돈(p1-VP), 폴리 다이에틸아미노에틸아크릴레이트(pDEAEA), 및 폴리 다이에틸아미노에틸메타크릴레이트(pDEAMA) 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는, 폴리(2-디메틸아미노메틸 스티렌)(pDMAMS)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 양이온성 고분자 물질은, 측쇄 말단에 양전하의 질소가 튜브의 내부로 향하여 배치될 수 있다,
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 튜브는, 폴리프로필렌(polypropylene, PP), 폴리에틸렌 (polyethylene, PE), 폴리염화비닐(polyvinyl chloride, PVC), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 폴리에스테르(polyester), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리에틸렌테레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET), 폴리우레탄(polyurethane, PU), 실리콘, 유리, 세라믹 및 테플론 중 적어도 하나의 소재로 이루질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, Cas9 단백질은, Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9), Streptococcus thermophilus Cas9(StCas9), Streptococcus pasteurianus (SpaCas9), Campylobacter jejuni Cas9(CjCas9), Staphylococcus aureus (SaCas9), Francisella novicida Cas9 (FnCas9), Neisseria cinerea Cas9 (NcCas9), Neisseria meningitis Cas9 (NmCas9), Prevotella 및 Francisella 1(Cpf1) 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 핵산 반응 조성물은, 라이트업 앱타머(light-up aptamer)를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 라이드업 앱타머는, 말라카이트 그린(malachite green) 앱타머, 스피니치2(spinach2) 앱타머, 베이비 스피니치(baby spinach) 앱타머, m베이비 스피니치(mbaby spinach) 앱타머, 브로콜리(broccoli) 앱타머, 망고(mango) 앱타머, BFR(Blue Fluorescent RNA) 앱타머, 및 술포로다민 B(sulforhodamine B) 앱타머 중 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, dsRNA 및 sgRNA는, 서열번호 1 내지 4 중 적어도 하나의 연속적인 뉴클레오티드와 동일하거나 상보적인 핵산 서열을 포함할 수 있다.
전술한 바와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 핵산을 포함하는 시료를 용해 완충액(lysis buffer)과 함께 핵산 추출 튜브에 넣어 혼합하는 단계; 상기 핵산 추출 튜브 내의 부유물을 제거하는 단계; 부유물이 제거된 상기 핵산 추출 튜브에 세척 버퍼를 첨가하여 세척하는 단계; 세척된 상기 핵산 추출 튜브에 핵산 반응 조성물을 투입하여 인큐베이션(incubation)하는 단계; 인큐베이션이 수행된 상기 핵산 추출 튜브 내의 시료에 대한 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및 상기 증폭반응이 완료된 상기 핵산 추출 튜브 내의 시료를 인-시튜(in situ)로 검출하는 단계를 포함하고, 상기 핵산 추출 튜브는, 시료를 수용하도록 구성된 바디부, 및 상기 바디부의 내벽부 상에 배치되는 양이온성 고분자 물질로 이루어진 양전하층을 포함하고, 상기 핵산 반응 조성물은, Cas9 단백질, 및 표적 DNA에 특이적으로 결합하는 표적화 서열을 포함하는 dsRNA(dual guide RNA) 또는 sgRNA(single chain guide RNA)를 포함하는, CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 특징에 따르면, 시료는, 조직, 혈액, 소변, 흉수, 분변, 객담, 복강액, 모유, 뇌척수액, 침, 림프액 및 기관 세척액으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 혼합하는 단계는, 상기 시료를 상기 용해 완충액과 혼합하여 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 핵산 반응 조성물은, 라이트업 앱타머(light-up aptamer)를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 라이드업 앱타머는, 말라카이트 그린(malachite green) 앱타머, 스피니치2(spinach2) 앱타머, 베이비 스피니치(baby spinach) 앱타머, m베이비 스피니치(mbaby spinach) 앱타머, 브로콜리(broccoli) 앱타머, 망고(mango) 앱타머, BFR(Blue Fluorescent RNA) 앱타머, 및 술포로다민 B(sulforhodamine B) 앱타머 중 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, sRNA 및 sgRNA는, 서열번호 1 내지 4 중 적어도 하나의 연속적인 뉴클레오티드와 동일하거나 상보적인 핵산 서열을 포함하는 dsRNA 및 sgRNA이다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 인큐베이션하는 단계는, 25 내지 40 ℃에서 5 내지 10분동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 예를 들어, 실온 즉, 25 ℃ 이하에서 수행될 경우, 시간적 요소가 증가되어, 10 내지 30분 동안 수행될 수도 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 양전하층의 두께는, 1 내지 1000nm일 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 양이온성 고분자 물질은, 폴리(2-디메틸아미노메틸 스티렌)(pDMAMS), 폴리-2-다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트(pDMAEMA), 폴리-1-비닐피롤리돈(p1-VP), 폴리 다이에틸아미노에틸아크릴레이트(pDEAEA), 및 폴리 다이에틸아미노에틸메타크릴레이트(pDEAMA) 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것에 불과하므로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
본 발명은, 특정 고분자를 PCR 전용 튜브의 표면에 균일하게 증착시켜 핵산을 추출하기 위한 튜브 및 이를 이용하는 방법으로서, 시료에 대한 핵산을 추출 및 정제하는 종래의 방법에 비하여 보다 안전할 수 있다.
나아가, 핵산 추출 과정의 단계가 종래의 추출 방법에 비하여 줄어듦으로써 비전문가 손쉽게 핵산을 추출할 수 있으며, 사람 개개인 별 핸들링에 의한 실험적 오차를 줄일 수 있는 효과가 있다.
더 나아가, 원심 분리 및 볼텍싱 등과 같은 실험 과정이 요구되지 않음에 따라, 어느곳에서나 핵산 추출이 가능하여 실시간 현장진단 및 환경 모니터링 등과 같은 다양한 분야에서 보다 빠르게 진단될 수 있다.
보다 구체적으로, 기존 전처리에 15분 내지 40분에 더하여 별도 PCR에 1시간이 소요되었던 것에 비하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 튜브를 이용하면, 전처리에 10분에 더하여, 증폭반응에 별도 1시간이 소요된다.
관련하여, 일반 전처리 키트를 이용하는 것과 비교시 비슷한 공정시간 및 효율을 보이지만, 공정 과정이 대폭 감소하여 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 튜브를 이용하면 보다 간편하고 용이하게 PCR을 수행할 수 있다.
또한, 본 발명은 유전자 절단 및 편집에 사용되는 Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 이용하여, 측정하고자 하는 표적 유전자 및 유전자 부위를 정확하게 포획 및 절단함으로써, 표적 유전자만을 고농도로 증폭시킬 수 있으며, 이에 따라, 종래의 분석 방법으로는 검출할 수 없었던, 표적 유전자를 손쉽게 검출할 수 있다.
즉, 본 발명은 극미량을 포함되어 있는 표적 유전자를 보다 효과적으로 증폭시킬 수 있음에 따라, 민감도, 특이도 및 정확도가 향상되어 시료 내에 존재하는 매우 낮은 농도의 돌연변이 및 바이오 마커까지도 정확하게 검출할 수 있다.
이에, 본 발명은 종래의 분석 및 진단 방법보다 우월한 임상적 진단 효과를 가짐에 따라, 약물 선택 및 암 진단 등과 같은 바이오 마커 분석에 있어, 최적 표준(gold standard)로 사용될 수 있다.
더욱이, 본 발명은 액체 생검을 이용함에 따라, 비침습적으로 돌연변이 및 바이오 마커를 검출할 수 있다.
이에, 본 발명을 통하여 질병 초기의 정확한 진단이 가능하며, 나아가 약물 치료의 모니터링을 통한 약물 내성 확인 및 치료 효과 확인을 할 수 있다.
본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.
도 1a은 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 튜브의 단면도이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 튜브의 제조 방법을 도시한 개략도이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 반응 조성물에 대한 개략도이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 반응 조성물에서 라이트업 앱타머에 대한 개략도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출 방법에 대한 순서도이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출 방법과 종래의 핵산 추출 방법에 대한 비교 개략도이다,
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출 방법에서의 핵산 추출 및 포획 과정을 예시적으로 도시한 개략도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출 방법에서의 핵산 반응 조성물의 반응 과정을 예시적으로 도시한 개략도이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트에서 핵산 추출 튜브의 양전하층 형성에 대한 분광법 검증 결과이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트에서 핵산 추출 튜브의 양전하층의 DNA 포획력 검증 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트에서 핵산 추출 튜브의 유전자 포획 효율에 대한 검증 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트의 구성 요소에 대한 검증 결과이다.
도 9a 내지 9c는 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법에서 가열 여부에 따른 핵산 증폭 단계에 대한 검증 결과들이다.
도 10a는 시료에 따른 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법의 형광 강도에 대한 결과이다.
도 10b는 시료에 따른 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법의 분석 감도에 대한 결과이다.
도 11은 시료에 따른 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법의 특이성 검증 결과이다.
도 12a 내지 12c는 유방암 PIK3CA 유전자 돌연변이에 기초한 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트 및 이에 기초한 핵산 검출 방법에 검증 결과들이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 튜브의 제조 방법을 도시한 개략도이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 반응 조성물에 대한 개략도이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 반응 조성물에서 라이트업 앱타머에 대한 개략도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출 방법에 대한 순서도이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출 방법과 종래의 핵산 추출 방법에 대한 비교 개략도이다,
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출 방법에서의 핵산 추출 및 포획 과정을 예시적으로 도시한 개략도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출 방법에서의 핵산 반응 조성물의 반응 과정을 예시적으로 도시한 개략도이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트에서 핵산 추출 튜브의 양전하층 형성에 대한 분광법 검증 결과이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트에서 핵산 추출 튜브의 양전하층의 DNA 포획력 검증 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트에서 핵산 추출 튜브의 유전자 포획 효율에 대한 검증 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트의 구성 요소에 대한 검증 결과이다.
도 9a 내지 9c는 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법에서 가열 여부에 따른 핵산 증폭 단계에 대한 검증 결과들이다.
도 10a는 시료에 따른 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법의 형광 강도에 대한 결과이다.
도 10b는 시료에 따른 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법의 분석 감도에 대한 결과이다.
도 11은 시료에 따른 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법의 특이성 검증 결과이다.
도 12a 내지 12c는 유방암 PIK3CA 유전자 돌연변이에 기초한 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트 및 이에 기초한 핵산 검출 방법에 검증 결과들이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.
본 발명의 실시예를 설명하기 위한 도면에 개시된 형상, 크기, 비율, 각도, 개수 등은 예시적인 것이므로 본 발명이 도시된 사항에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다. 본 명세서 상에서 언급된 '포함한다', '갖는다', '이루어진다' 등이 사용되는 경우, '~만'이 사용되지 않는 이상 다른 부분이 추가될 수 있다. 구성요소를 단수로 표현한 경우에 특별히 명시적인 기재 사항이 없는 한 복수를 포함하는 경우를 포함한다.
구성요소를 해석함에 있어서, 별도의 명시적 기재가 없더라도 오차 범위를 포함하는 것으로 해석한다.
본 발명의 여러 실시예들의 각각 특징들이 부분적으로 또는 전체적으로 서로 결합 또는 조합 가능하며, 당업자가 충분히 이해할 수 있듯이 기술적으로 다양한 연동 및 구동이 가능하며, 각 실시예들이 서로에 대하여 독립적으로 실시 가능할 수도 있고 연관 관계로 함께 실시 가능할 수도 있다.
본 명세서의 해석의 명확함을 위해, 이하에서는 본 명세서에서 사용되는 용어들을 정의하기로 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 핵산 "은 유기 염기(사이토신, 티미딘 및 우라실과 같은 치환된 피리미딘이거나, 아덴 및 구아닌과 같은 치환된 퓨린)에 연결된 당으로 이루어지는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 의미할 수 있다. 보다 구체적으로, 핵산은 리보핵산(RNA), 디옥시리보핵산(DNA), 메틸포스포네이트 핵산, S-올리고, c-DNA, miRNA 및 앱타머(aptamer) 등을 포함할 수 있으며, 천연적으로 발생하거나 인공적으로 합성된 것 모두를 포함할 수 있다. 그러나, 바람직하게는 RNA 및 DNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 가이드(guide) RNA "는 유전체 편집을 통해 표적 핵산을 인식하여 표적 핵산을 절단, 삽입 또는 연결시키는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 그러나, 본 발명에서는 표적 DNA에 특이적인 RNA일 수 있다. 보다 구체적으로, 가이드 RNA는 세포 내로 전달된 선형 이중가닥 DNA의 전사를 통해 발현되어 표적 유전자 서열을 인식하고 Cas 9 단백질과 복합체를 형성할 수 있고 Cas 9 단백질을 표적 DNA에 가져오는 RNA이다. 가이드 RNA는 표적 핵산에 상보적인 서열을 포함할 수 있으며, 표적 핵산에서 PAM의 5' 방향 또는 3' 방향으로 연속적인 2 내지 24 뉴클레오티드(예, 20 nt 내외)(이하, 'nt'라 함)의 뉴클레오티드 서열과 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 가이드 RNA의 길이는 10 nt 내지 100 nt, 10 nt 내지 90 nt, 10 nt 내지 80 nt, 10 nt 내지 70 nt, 10 nt 내 지 60 nt, 10 nt 내지 50 nt, 15 nt 내지 50 nt, 20 nt 내지 50 nt, 25 nt 내지 50 nt, 30 nt 내지 50 nt, 35 nt 내지 50 nt, 40 nt 내지 50 nt, 또는 45 nt 내지 50 nt일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 표적 유전자서열 "은 표적 유전자 또는 핵산 내에 존재하는 뉴클레오타이드로, 구체적으로는 표적 유전자 또는 핵산 내에 표적 영역의 일부 뉴클레오타이드 서열이며, 이때 “표적 영역”은 표적 유전 자 또는 핵산 내에 가이드 핵산-에디터 단백질에 의해 변형 또는 절단될 수 있는 부위이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " PAM 서열(sequence) "은 목표 서열 옆에 위치하는 3bp 크기의 서열로서 CRISPR-Cas 복합체가 인식하는 타겟 서열을 의 미하며, CRISPR-Cas 복합체는 PAM 서열을 인식한 후 특정 위치를 절단하게 된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 세포 유리 유전자(cell-free DNA, cfDNA) "은 종양 세포 또는 일반 세포에서 유래하여 환자의 혈액, 혈장 또는 소변 등의 생물학적 시료에서 발견될 수 있는 암 세포 또는 일반 세포 유래 유전자를 의미하며, 괴사, 세포 사멸 또는 비뇨기관의 정상세포 및/또는 암세포에서 활성화되어, 다양한 세포 생리학적 과정을 통해 소변, 혈액 등으로 방출된다. 소변, 뇌척수액 (cerebrospinal fluid; CSF), 혈장, 혈액, 또는 체액은 쉽게 얻을 수 있는 시료이므로, 반복적인 샘플링을 통해 대량의 단순하고 비-침습적인 검체의 수집이 가능하다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 순환 종양 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)는 종양이나 순환종양세포로부터 apoptosis, necrosis, autophagy 등의 과정을 통하여 혈류로 유입되는 DNA로서, cfDNA의 일부를 차지하며, tumor suppressor gene이나 oncogenes에서 종양 특이적 변이(tumor specific alterations)를 보이고, 초위성체 불안정성(micfosatellite instability), DNA hypermethylation의 특징을 가질 수 있다. ctDNA는 종양의 유형 및 진행 정도에 따라 염기 서열이 달라질 수 있으며, 같은 종양이라도 환자마다 변이가 다르게 나타날 수 있다. 이에, ctDNA는 암의 진단, 예후 예측, 치료 경과 모니터링, 재발 여부 확인, tumor burden의 모니터링, 표적 치료를 위한 바이오마커로서 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " CRISPR/Cas 시스템 "은 유전자 또는 핵산에 상보적인 서열을 가지는 가이드 RNA(gRNA)와 표적하는 유전자 또는 핵산을 절단할 수 있는 뉴클레아제인 CRISPR 효소로 구성되며, gRNA와 CRISPR 효소는 CRISPR 복합체를 형성하고, 형성된 CRISPR 복합체에 의해 표적하는 유전자 또는 핵산을 절단 또는 변형시킨다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " Cas 9 단백질 "은 CRISPR/Cas 시스템에서 필수적인 단백질 요소를 의미하고, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(trans-activating crRNA, tracrRNA)로 불리는 두 RNA와 복합체를 형성할 때, 활성 엔도뉴클레아제를 형성한다. Cas9 단백질 유전자 및 단백질의 정보는 국립생명공학정보센터(national center for biotechnology information, NCBI)의 GenBank에서 구할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 용해 완충액 (lysis buffer) "은 25 ℃에서 약 6 내지 9 pH값을 유지할 수 있는 용액을 의미할 수 있다. 보다 구체적으로, 완충액은 전형적으로 효소 활성의 기능과 조화되고, 생물학적 분자의 정상적인 생리적 및 생화학적 기능을 유지할 수 있도록 생리학적으로 조화가능한(physiologically compatible) 완충액을 의미할 수 있다. 용해 완충액은 염이나 pH 버퍼 등을 사용하지 않고 정제수가 이용될 수 있다. 이하에서 설명되는 용해 완충액은 모두 정제수만이 사용되었다. 그러나 이에 제한되지 않고, 용해 완충액에 사용될 수 있는 성분으로는 4- (2- 하이드록시에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, HEPES), 3-(N-모르폴리노)-프로판설폰산(3-morpholino propanesulfonic acid, MOPS), N-트리스-(히드록시메틸)-메틸글리신산(N-Tris-(Hydroxymethyl)-Methyl Glycine, Tricine), 트리스-(히드록시메틸)-메틸아민산(tris-(hydroxymethyl)-aminomethane, Tris), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산)( piperazine-N,N′acid), PIPES), 아세테이트 및 포스페이트 함유 버퍼(K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4 및 NaH2PO4) 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 나아가, 용해 완충액은 프로테나아제 K, 트립신, 키모트립신, 엘라스타아제 및 스트렙토그리신 등과 같이 핵산 추출을 위하여 사용되는 프로테아제를 더 포함할 수 있다. 또한, 용해 완충액 내 버퍼 성분의 농도는 3 내지 30 mM 범위 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 프라이머 (primer) "는 상보적 스트랜드의 합성이 폴리머라아제에 의하여 촉매화되는 조건 하에 있는 경우, 상보적 스트랜드를 따라 핵산의 합성 또는 복제 초기 지점으로 작용할 수 있는 합성 또는 천연 올리고뉴클레오티드를 의미할 수 있다. 보다 구체적으로, 프라이머는 단일가닥의 올 리고뉴클레오티드 중 하나로, 리보뉴클레오티드도 포함할 수 있으며 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오티드 일 수 있다. 프라이머는 주형(template)의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중가닥 구조를 형성한다. 본 발명에서 프라이머는 NGS 시퀀싱 아답터 서열에 혼성화(hybridization) 또는 어닐링(annealing)될 수 있다. 어닐링(annealing)은 주형 핵산에 올리고뉴클레오티드 또는 핵산이 병치 (apposition)되는 것을 의미하며, 병치는 중합효소(polymerase)가 뉴클레오티드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다. 혼성화(hybridization)는 2개의 단일가닥 핵산이 상보적인 염기서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 프라이머는 주형에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 삽입 염료 (intercalating dye) "는 증폭 과정에서 핵산, 특히 DNA 이중 스트랜드의 주된 홈(major groove)에 결합하는 성질을 갖는 염료를 의미할 수 있으며, 증폭이 완료된 후 삽입 염료의 형광 검출에 따른 강도(intensity)를 측정함으로써 증폭 정도를 확인할 수 있다. 이때, 삽입 염료로는 STYBR green, Pico green, Hoechst 시리즈, BOBO, TOTO, YOYO, JOJO, POPO, LOLO, PO-PRO, BO-PRO, YO-PRO, TO-PRO, JO-PRO, LO- PRO 및 SYTO 시리즈 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 프로브 (probe) "는 실시간 PCR(real-time PCR) 등의 전기 화학적 검출 방식에서 이용되는 전자 방출능을 갖는 인터칼레이터(intercalator)를 의미할 수 있다. 이때, 인터칼레이터는 이중 스트랜드의 핵산에 끼어들 수 있는 임의의 물질로서, 스트렙마이신 설페이트, 젠타마이신 설페이트, 다우노루비신 하이드로크로라이신, 노갈라마이신, 독소루비신, 헤다마이신, 미토산트론, 틸로론, 퀴나크린 및 아크리딘오렌지 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
이와 관련하여, 프로브 즉, TaqMan 프로브 등의 형광을 이용한 검출 방법은 5'-말단은 형광체(FAM, JOE, TET, HEX, VIC 등)로, 3'-말단은 소광제(TAMRA, DABCYL, ROX, BHQ 등)로 수식한 올리고뉴클레오타이드를 증폭 용액에 첨가하는 방법이다. TaqMan 프로브는 어닐링 단계에서는 주형 핵산에 특이적으로 혼성화되지만 프로브 상의 소광제에 의하여 형광 발색이 억제된다. 연장 반응 시, Taq DNA 중합효소가 갖는 5' →3' 핵산말단분해효소 (exonuclease)의 활성으로 주형에 혼성화된 TaqMan 프로브가 분해됨에 따라 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 소광제에 의한 억제가 해제되어 형광을 나타낸다.
나아가, 프로브는 증폭 용액에 첨가하여 사용되는데, 증폭에 앞서 첨가할 경우에는 프라이머가 핵산과 결합함에 있어서 프로브와 경쟁적 관계를 형성할 수 있다. 보다 구체적으로, 프로브와 표적 핵산의 혼성화에 의하여 비특이적(non-specific) 결합이 증가할 수 있다. 따라서 과량으로 사용할 경우에는 증폭 반응의 저해제로 작용될 수 있다. 반면, 프로브의 양이 일정 수준 미만인 경우에는 증폭된핵산에 비하여 불충분한 형광특성으로 인하여 원하는 검출 효과를 기대하기 어렵게 된다. 결국, 증폭 방식을 고려하여 프로브의 사용량, 기타 반응 조건을 실험적으로 적절히 조절하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 문제 가능성을 해소하기 위하여, 예를 들면, 증폭 반응 시간을 증가시킴으로써 프로브 첨가가 증폭 반응에 미치는 영향을 억제하면서 프로브의 최대 한계 사용량을 증가시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 형광 (fluorescence) "은 전자기적 여기에 의하여 짧은 시간 동안 생성되는 발광 타입을 의미할 수 있다. 보다 구체적으로, 형광은 특정 물질이 짧은 파장에서 광 에너지를 흡수한 후에 보다 긴 파장에서 광 에너지를 방출할 때 생성되는 현상을 의미할 수 있으며, 흡수와 방출 간의 시간 길이는 통상적으로 비교적 짧은데, 예를 들어 약 10-9 내지 10-8 초 범위 내의 수준일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR) "은 가열 및 냉각이 교대로 이루어지는 사이클 프로세스에 의하여 하나의 최초 주형으로부터 다량의 동일한 DNA 스트랜드가 형성되는 반응을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 증폭 (amplification) "은 주형(template)으로서 핵산 분자 중 적어도 하나를 이용하여 핵산 분자에 대한 복수의 복제물 또는 핵산 분자에 상보적인 복수의 복제물을 형성하는 것을 의미할 수 있으며, 역전사(reverse transcription) 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 멀 티플렉스(multiplex) PCR, 실시간(real-time) PCR, 어셈블리(Assembly) PCR, 퓨전 (Fusion) PCR, 리가아제 연쇄 반응(Ligase chain reaction; LCR) 및 ddPCR(Droplet-digital PCR) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 고정 (immobilization) "은 임의의 물질 또는 생활성제가 튜브의 벽면에 공유적 또는 비공유적으로 직접 또는 간접 방식에 의하여 부착되는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 기재 "는 표면 위에 특정 물질이 부착(고정), 코팅(도포) 및 증착 가능한 표면을 제공할 수 있는 구조 또는 구조물을 의미할 수 있으며, 바람직하게는 시료를 수용할 수 있는 튜브 형태의 구조물을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 양이온성 폴리머 "는 수용액 상의 적정 pH에서 양성자화 성질을 가지는 폴리머 및 고체상에서 양성자 성질을 가지는 폴리머를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 상에 " 및 " 위에 "라는 표현은, 상대적인 위치 개념을 언급하기 위하여 사용되는 것을 의미할 수 있다. 따라서, 언급된 층에 다른 구성 요소 또는 층이 직접적으로 존재하는 경우뿐 만 아니라, 그 사이에 다른층(중간층) 및 다른 구성요소가 개재되거나 존재할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 진단 "은 병리 상태의 또는 특징을 확 인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 암(종양)의 종류, 발병 여부 및 발병 원인을 확인하는 것을 의미할 수 있으며, 나아가, 표적 유전자 즉, 바이오마커의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 종양의 치료 전략, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 특정 질병 또는 질환에 대한 한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 개체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함할 수 있다.
CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트
이하에서는, 도 1a 내지 2b를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트에 대하여 구체적으로 설명하도록 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트는 핵산 추출 튜브 및 핵산 반응 조성물을 포함할 수 있다.
이때, 핵산 추출 튜브는 도 1a 및 1b를 참조하여 설명하고, 핵산 반응 조성물은 도 2a 및 2b를 참조하여 설명하도록 한다.
먼저, 도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 튜브의 단면도이다.
도 1a를 참조하면, 핵산 추출 튜브(100)은 핵산을 포함하는 시료 내의 핵산을 측정하기 위한 구조물로서, 시료를 수용할 수 있는 바디부(110), 일정한 바디부의 개구부를 개폐하는 캡(120) 및 바디부의 내벽부(130) 상에 배치되는 양이온성 고분자 물질로 이루어진 양전하층(140)을 포함한다. 이때, 바디부(110) 및 캡(120)은 연결부(150)로 인하여 연결된 것으로 도시되지만, 이에 제한되지 않고, 연결부(150)를 포함하지 않으며, 연결부(150)에 의하여 바디부(110) 및 캡(120)이 연결되지 않고 각각 존재하는 형태 또한 포함할 수 있다.
핵산 추출 튜브(100)를 구성하는 소재는, 폴리프로필렌(polypropylene, PP), 폴리에틸렌 (polyethylene, PE), 폴리염화비닐(polyvinyl chloride, PVC), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 폴리에스테르(polyester), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리에틸렌테레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET), 폴리우레탄(polyurethane, PU), 실리콘, 유리, 세라믹 및 테플론 중 적어도 하나의 소재로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이때, 플라스틱에 의한 습기 흡수가 문제가 되지 않을 경우, 바람직하게 구성되는 플라스틱류는 ABS, 아세탈(acetal), 아크릴섬유(acrylic), 아크릴로니트릴(acrylonitrile), 셀룰로오스 아세테이트(cellulose acetate), 에틸 셀룰로오스(ethyl cellulose), 알킬비닐 알코올(alkylvinylalcohol), 폴리아릴에테르에톤(polyaryletherketone), 폴리에테르에테르케톤(polyetheretherketone), 폴리에테르케톤(polyetherketone), 멜라민 포름알데히드(melamine formaldehyde), 페놀 포름알데히드(phenolic formaldehyde), 폴리아미드(polyamide, 예를 들면: 나일론6, 나일론 66, 나일론 12), 폴리아미드-이미드(polyamide-imide), 폴리디시클로펜타디엔(polydicyclopentadiene), 폴리에테르-이미드(polyether-imide), 폴리에테르술폰(polyethersulfone), 폴리이미드(polyimide), 폴리페닐렌옥사이드(polyphenyleneoxide), 폴리프탈아미드(polyphthalamide), 메틸메타크릴레이트(methylmethacrylate), 폴리우레탄(polyurethan), 폴리설폰(polysulfone), 폴리에테르설폰(polyethersulfone) 및 비닐 포말(vinyl formal)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 습기 흡수가 문제가 될 경우, 바람직하게 구성되는 플라스틱류는 폴리스틸렌(polystyrene), 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리부타디엔(polybutadiene), 폴리부틸렌(polybutylene), 에폭시(epoxy), 테플론(Teflon), PAN(peroxyacetylnitrate), PET(polyethylene terephthalate), PTFE(polytetrafluoroethylene), 클로로-플루오로에틸렌(chloro-fluoroethylene), 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene fluoride), 액정 중합체(liquid crystal polymer), 폴리에스테르(polyester), LDPE(low-density polyethylene), HDPE(high density polyethylene), 폴리메틸펜틴(polymethylpentene), 폴리페닐렌 설파이드(polyphenylene sulfide), 폴리올페핀(polyolefin), PVC(polyvinyl chloride) 및 염소화 PVC를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
핵산 추출 튜브(100)가 수용할 수 있는 시료의 용적은, 1 내지 50,000㎕의 범위 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 사용자의 목적에 따라 다양한 크기로 형성되어 보다 다양한 범위를 가질 수 있다.
핵산 추출 튜브(100)의 바디부(110)는 다양한 형태로 형성될 수 있다. 보다 구체적으로, 도 1a에서는 하부의 모양이 반 고깔모양으로 도시되어 있지만, 이에 제한되지 것은 아니며, 사용자의 목적에 따라 하부의 모양이 원호형 및 사각형 등 다양한 형태로 형성될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 튜브(100)는 다양한 형태, 용적 및 모양을 갖는 바디부(110)를 포함함으로써, 사용자의 목적에 따라 적합한 튜브를 제공할 수 있다.
나아가, 핵산 추출 튜브(100)의 양전하층(140)은 내벽부(130) 상에 배치될 수 있다. 보다 구체적으로, 양전하층(140)은 고분자 반복 단위의 측쇄 말단에 양전하의 질소를 갖는 1차 아민, 2차 아민, 또는 3차 아민을 함유하는 양이온성 고분자 물질로 이루어질 수 있다. 이때, 양전하의 질소를 갖는 3차 아민을 함유하는 고분자의 핵산에 대한 고정능이 보다 우수하기 때문에, 바람직하게, 양전하층(140)은 고분자 반복 단위의 측쇄 말단에 양전하의 질소(141)를 갖는 3차 아민을 함유하는 양이온성 고분자 물질로 이루어질 수 있다. 이러한, 양이온성 고분자로는, 폴리-2-다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트(pDMAEMA), 폴리(2-디메틸아미노메틸 스티렌) (pDMAMS), 폴리-1-비닐피롤리돈(p1-VP), 폴리 다이에틸아미노에틸아크릴레이트 (pDEAEA), 및 폴리 다이에틸아미노에틸메타크릴레이트(pDEAMA) 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이때, 양전하층(140)을 이루는 양이온성 고분자 물질로는 바람직하게, 폴리(2-디메틸아미노메틸 스티렌)(pDMAMS)일 수 있다. pDMAMS는 측쇄 상에 3차 아민기를 함유하고 있으며, pH 8.5 미만에서 양성자화가 된다. 이와 같은, 양이온성 고분자 물질은 양전하의 질소 원자를 포함하고, 측쇄 말단에 양전하의 질소(141)가 핵산 추출 튜브(100)의 내부(160)로 향하여 배치된다. 이에, 핵산 추출 튜브(100)의 내벽부(130)는 양전하(+)를 띄게 된다.
나아가, 양전하층(140)의 두께는, 증착 시간에 따라 변화할 수 있으며, 약 1 내지 1,000 nm, 바람직하게는 약 10 내지 500 nm, 보다 바람직하게는 약 100 내지 300 nm 범위일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 튜브(100)는 측쇄 말단에 양전하의 질소를 포함하는 양이온성 고분자 물질로 이루어진 양전하층을 포함함으로써, 전하 상호작용을 이용하여 음전하(-)의 표적 물질을 고정 및 포획할 수 있는 튜브를 제공할 수 있다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 튜브의 제조 방법을 도시한 개략도이다.
도 1b를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 튜브의 제조 과정이 도시된다. 보다 구체적으로, 핵산 추출 튜브(100)에 양이온성 고분자 물질인 아민 작용성 중합체가 기상 증착 공정에 의하여, 핵산 추출 튜브(100)의 내벽부(130)에 증착될 수 있다. 또한, 증착된 양이온성 고분자 물질에 포함된 측쇄 말단에 양전하의 질소(141)은 핵산 추출 튜브(100)의 내부로 향하여 배치될 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 핵산 추출 튜브(100)는 1개의 바디부(110)를 가진 형태로 도시되었으나, 이에 제한되는 것은 아니며 사용자의 용도에 따라 다양하게 구현될 수 있다. 예를 들어, 복수의 바디부(110)가 일렬로 연결되어 있는 형태의 스트립 튜브(200) 및 복수의 바디부(110)가 플레이트 형태로 연결되어 있는 플레이트 튜브(300) 등 다양한 형태의 튜브를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 핵산 추출 튜브에 양이온성 고분자 물질을 증착시키는 기상 증착 공정은 일반적으로 기체화된 소스를 기재의 표면에 코팅 또는 부착하는 공정을 의미할 수 있다. 이러한, 기상 증착 공정은 고순도의 코팅층 형성, 계면 특성의 제어 용이성 등과 같은 장점을 제공할 수 있다.
예를 들어, 고분자 코팅을 위하여 화학 기상 증착법이 (chemical vapor deposition, CVD) 적용될 수 있다. 고분자의 코팅 또는 부착을 위한 화학 기상 증착법은 액상 유기 합성 반응을 기상 반응 공정에 적용한 것으로서, 기화된 모너머가 기상 반응기 내에서 활성화되어 고분자 중합반응이 이루어짐에 따라, 기재 표면 상에 고분자 코팅층이 형성될 수 있다. 이에, 고분자 중합반응 및 코팅 층의 부착이 하나의 공정에서 동시에 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시예에 따른 핵산 추출 튜브(100)는 기상 증착 공정, 즉, 화학 기상 증착 공정을 이용하여 양이온성 고분자 물질로 이루어진 양전하층이 형성될 수 있다.
이때, 화학 기상 증착 공정은 일반적으로 진공 분위기 하에서 가스 상 반응물의 화학적 반응을 이용하여 필름 또는 파우더 형태의 고상 물질을 형성하는 원리가 이용된다. 화학 기상 증착 공정은 종래의 용액-기반의 표면 코팅 기술보다 기재 또는 기판의 마이크로 스케일 및 나노 스케일 구조를 완전히 보전할 수 있고, 유기 용매로 인하여 발생되는 각종 손상을 방지할 수 있고, 복잡한 기하학적 형상을 갖는 기재에 대하여도 균일하게 코팅할 수 있으며, 코팅 두께를 용이하게 조절할 수 있는 장점을 갖는다. 특히, 화학 기상 증착 공정은 다양한 형상 및 재질의 기재에 대하여 적용될 수 있으며, 비교적 저온(예를 들면, 약 200℃ 이하, 바람직하게는 100℃ 이하, 더 바람직하게는 50℃ 이하의 온도)에서 수행이 가능하다.
이러한, 화학 기상 증착 공정으로는 플라즈마 화학 증착법(plasma enhanced chemical vapor deposition, PECVD) 및 개시제를 이용한 화학 기상 증착법(initiated chemical vapor deposition, iCVD) 등이 이용될 수 있다.
개시제를 이용한 화학 기상 증착법은 자유 라디칼을 이용한 연쇄 중합 반응을 이용하며, 개시제 및 모노머를 기화하여 기상에서 고분자 반응이 이루어지게 함으로써, 고분자 코팅을 기재 표면에 부착하는 공정이다. 이때, 개시제 및 모노머에 의한 연쇄 중합 반응은 단순히 혼합 상태에서 일어나지 않고, 고온에 의하여 일어날 수 있다. 보다 구체적으로, 먼저, 연쇄 중합 반응은 기상 반응기 내에 위치한 필라멘트에 의하여 고온이 발생하고, 발생한 고온으로 의하여 개시제가 분화되면서 자유 라디칼이 생성되고, 생성된 자유 라디칼에 의하여 모노머가 활성되어 일어난다.
나아가, 고분자 중합 반응에 사용되는 구동력은 오직 필라멘트의 고온뿐이며, 이러한 필라멘트의 온도에서는 모노머에 대한 화학적 손상이 없기 때문에, 고분자 코팅 층 역시 모노머가 갖고 있는 다양한 관능성 그룹을 그대로 유지한 채, 고분자 코팅 층으로 전환시킬 수 있다.
다만, 전술한 플라즈마 화학 증착법의 경우, 높은 에너지 유입으로 인하여 분자 및 가교 정도가 높은 고분자 코팅 구조가 형성될 수 있고, 경우에 따라서는 공정 중에 원하는 관능기가 아닌 비특이적 관능기가 생성될 가능성이 있다. 따라서, 화학 기상 증착 공정 중 개시제를 이용한 화학 기상 증착법을 적용하는 것이 보다 유리할 수 있다. 이에 바람직하게는, 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 튜브(100)의 양이온성 고분자 물질로 이루어지는 양전하층은 개시제를 이용한 화학 기상 증착법에 의하여 형성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 전술한 방법과 같은 다양한 화학 기상 증착법에 의하여 형성될 수 있다.
그 다음, 도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 반응 조성물에 대한 개략도이다.
도 2a를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트는 핵산 반응 조성물을 포함할 수 있으며, 핵산 반응 조성물은 CRISPR/Cas 시스템에 기초함에 따라, 표적 유전자 또는 핵산에 상보적인 서열을 가지는 가이드 RNA 즉, 표적 DNA에 특이적으로 결합하는 표적화 서열을 포함하는 dsRNA(dual guide RNA) 또는 sgRNA(single chain guide RNA)와 표적하는 유전자 또는 핵산을 절단할 수 있는 뉴클레아제인 CRISPR 효소 즉, Cas9 단백질을 포함할 수 있다.
이때, 가이드(guide) RNA는 유전체 편집을 통해 표적 핵산을 인식하여 표적 핵산을 절단, 삽입 또는 연결시키는 폴리뉴클레오티드를 의미할 수 있으며, 표적 DNA에 특이적인 RNA일 수 있다. 보다 구체적으로, 가이드 RNA는 세포 내로 전달된 선형 이중가닥 DNA의 전사를 통해 발현되어 표적 유전자 서열을 인식하고 Cas 9 단백질과 복합체를 형성할 수 있고 Cas 9 단백질을 표적 DNA에 가져오는 RNA이다. 가이드 RNA는 표적 핵산에 상보적인 서열을 포함할 수 있으며, 표적 핵산에서 PAM의 5' 방향 또는 3' 방향으로 연속적인 2 내지 24 뉴클레오티드(예, 20 nt 내외)(이하, 'nt'라 함)의 뉴클레오티드 서열과 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
즉, 가이드 RNA는 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 guide sequence 즉, crRNA(target specific) 영역을 포함할 수 있다. 한편, 본 발명에서 이용된 가이드 RNA crRNA 및 tracrRNA 영역을 포함하는 2-파트 가이드 RNA이며, 이들은 링커 루프 서열에 의해 연결될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이때, PAM 서열(sequence)은 표적 DNA 서열 옆에 위치하는 3bp 크기의 서열로서 CRISPR-Cas 복합체가 인식하는 타겟 서열을 의미하며, CRISPR-Cas 복합체는 PAM 서열을 인식한 후 특정 위치를 절단하게 된다.
나아가, 가이드 RNA의 길이는 10 nt 내지 100 nt, 10 nt 내지 90 nt, 10 nt 내지 80 nt, 10 nt 내지 70 nt, 10 nt 내 지 60 nt, 10 nt 내지 50 nt, 15 nt 내지 50 nt, 20 nt 내지 50 nt, 25 nt 내지 50 nt, 30 nt 내지 50 nt, 35 nt 내지 50 nt, 40 nt 내지 50 nt, 또는 45 nt 내지 50 nt일 수 있다.
이에, 전술한 바와 같이 측정하고자 하는 표적 DNA 서열 및 이의 PAM 서열에 기초하여, 목적에 따라 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 가이드 RNA의 서열을 자유롭게 설계할 수 있다.
그러나, 바람직한 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트에서 이용되는 가이드 RNA는 하기의 서열번호 1 내지 4 중 적어도 하나의 연속적인 뉴클레오티드와 동일하거나 상보적인 핵산 서열을 포함하는 dsRNA 및 sgRNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
서열번호 1의 가이드 RNA : AUG GCU GGU GUG GGC UCC CC (5'→3')
서열번호 2의 가이드 RNA : CCA GGA GGC GGG AGA CAU AU (5'→3')
서열번호 3의 가이드 RNA : UAA AAC UGA GCA AGA GGC UU (5'→3')
서열번호 4의 가이드 RNA : CAA AUG AAU GAU GCA CGU CA (5'→3')
그 다음, Cas 9 단백질은 CRISPR/Cas 시스템에서 필수적인 단백질 요소를 의미하고, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(trans-activating crRNA, tracrRNA)로 불리는 두 RNA와 복합체를 형성할 때, 활성 엔도뉴클레아제를 형성한다. Cas9 단백질 유전자 및 단백질의 정보는 국립생명공학정보센터(national center for biotechnology information, NCBI)의 GenBank에서 구할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9), Streptococcus thermophilus Cas9(StCas9), Streptococcus pasteurianus (SpaCas9), Campylobacter jejuni Cas9(CjCas9), Staphylococcus aureus (SaCas9), Francisella novicida Cas9 (FnCas9), Neisseria cinerea Cas9 (NcCas9), Neisseria meningitis Cas9 (NmCas9), Prevotella 및 Francisella 1(Cpf1) 중 적어도 하나일 수 있다.
한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트에서 핵산 반응 조성물은 전술한 Cas9 단백질 및 가이드 RNA(dsRNA 또는 sgRNA)뿐만 아니라, 라이트업 앱타머(light-up aptamer)를 더 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 도 2b를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 반응 조성물에서 라이트업 앱타머에 대한 개략도이다.
일반적으로 종래의 유전자 증폭에서는 SYBR Green1과 같은 염색 염료(dye)가 사용되어 왔다. 이러한 종래의 염료는 표적 DNA 사이 즉, dsDNA에 층간 삽입(Intercalation)된다. 이에, 엑스파(EXPAR) 반응 후에 생성되는 산물(EXPAR product)뿐만 아니라, 표적 DNA(target genomic DNA)에도 염료가 결합할 수 있음에 따라, 높은 백그라운드 신호(Background signal)를 가지는 한계가 있다.
이에, 본 발명에서는 이러한 실험적 오차를 배제하고자 라이트업 앱타머가 이용될 수 있다. 라이트업 앱타머의 경우, 표적 서열에 연결되어 생성될 수 있다. 즉, 라이트업 앱타머는 표적 DNA가 증폭되어 새로 생성될 경우에만 발현되어, 형광 신호를 발생시킬 수 있다. 이에, 라이트업 앱타머는 실험적 오차 즉, 노이즈 비율을 낮추어, 유전자 증폭 산물의 측정에 있어 높은 정확성 및 감도를 제공할 수 있다.
결국, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트에서 핵산 반응 조성물은 Cas9 단백질 및 가이드 RNA과 더불어, 라이트업 앱타머를 포함함에 따라, 보다 정확하게 표적 DNA를 측정할 수 있다.
CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출 방법
이하에서는 도 3 내지 5를 참조하여, 전술한 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출 키트에 기초한 핵산 검출 방법에 대하여 구체적을 설명하도록 한다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출 방법에 대한 순서도이다. 이때, 설명의 편의를 위하여, 도 4a 내지 5를 참조하여 설명하도록 한다.
도 3을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출 방법은 핵산을 포함하는 시료를 용해액(lysis solution)과 함께 핵산 추출 튜브에 넣어 혼합하는 단계(S310), 핵산 추출 튜브 내의 부유물을 제거하는 단계(S320), 부유물이 제거된 핵산 추출 튜브에 세척 버퍼를 첨가하여 세척하는 단계(S330), 세척된 핵산 추출 튜브에 핵산 반응 조성물을 투입하여 인큐베이션(incubation)하는 단계(S340), 인큐베이션이 수행된 핵산 추출 튜브 내의 시료에 대한 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계(S350) 및 PCR이 완료된 핵산 추출 튜브 내의 시료를 인-시튜(in situ)로 검출하는 단계(S350)를 포함할 수 있다. 이때, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법은 앞서 전술된 도 1a 내지 2b의 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트가 이용되었으며, 보다 구체적으로, 핵산 추출 튜브는 전술한 도 1a 및 1b의 핵산 추출 튜브를 의미하며, 핵산 반응 조성물은 전술한 도 2a 및 2b의 핵산 반응 조성물을 의미할 수 있다.
이러한, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출 방법은 하나의 튜브 내에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 도 4a를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출 방법과 종래의 핵산 추출 방법에 대한 비교 개략도가 도시된다.
종래의 핵산 추출 방법은 아무 기능이 없는 PCR 튜브를 이용함에 따라, 각각의 단계에 다양한 조성물 및 장치가 필요하였다. 보다 구체적으로, 종래의 핵산 추출 방법은 용해액 및 볼텍서(vortexer)를 이용하여 세포를 용해(lyse)시키고, 필터를 이용하여 용해된 세포 내 DNA가 필터 내에 포획 또는 결합(bind)되도록 여과시키고, 여과 과정에서의 오염을 배제하고 순수한 DNA만을 포획하도록 여러 차례 세척(wash)과정을 수행하고, 필터 내에 포획 또는 결합한 DNA를 포집하기 위하여 원심분리하는 과정을 포함할 수 있다.
그러나, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출 방법은 양전하층(아민기를 포함하는 pDMAMS)을 포함하는 핵산 추출 튜브를 이용함에 따라, 종래의 핵산 추출 방법과 달리 별도의 조성물 및 장치 없이, 하나의 튜브 내에서 간단하게 추출, 포획 및 세척 단계가 수행될 수 있다.
보다 구체적으로, 도 4b를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출 방법에서의 핵산 추출 및 포획 과정을 예시적으로 도시한 개략도가 도시된다. 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출 방법은 먼저, 핵산(411)을 포함하는 시료(410)를 용해 완충액(420)과 함께 핵산 추출 튜브(100)에 투입하여, 직접적으로 핵산(411)을 추출할 수 있다.
이때, 시료(410)는 함께 투입되는 용해 완충액(420)에 의하여 핵산이 방출되도록 용해(lysis)될 수 있다. 시료(410)가 용해 완충액(420)에 의하여 용해되는 과정은 효소의 종류 등이 고려되어, 약 30 내지 95 ℃의 범위, 바람직하게는 약 55 내지 72 ℃의 온도 범위에서 적어도 10분 동안의 인큐베이팅(incubating)되며 수행될 수 있다. 이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출 방법은 시료를 용해 완충액과 혼합하여 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
더욱이, 시료(410)는 전술한 용해 완충액(420)과의 배양이 아니더라도, 핵산 추출 튜브(100) 내 양전하층(140)에 의해서도 세포막이 파열되어, 시료(410) 내 핵산(411)이 방출될 수 있다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출 방법에서 사용되는 양전하층(140)을 포함하는 핵산 추출 튜브(100)를 이용함에 따라, 장시간의 배양 단계가 수행되지 않더라도, 시료로부터 핵산을 추출할 수 있으며, 이에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출 방법은 배양 단계에서 요구되는 다양한 실험적 기기 및 재료들이 요구되지 않는다.
이와 동시에, 방출된 핵산(411)은 핵산 추출 튜브(100) 내 양전하층(140)에 포획되어, 고정될 수 있다. 보다 구체적으로, 핵산(411)은 음전하(-)를 띄는 산소원자를 가진 인산 (phosphate)로 구성되어 있어, 핵산의 인산-당 주쇄는 전체적으로 음전하(-)를 갖는다. 이에, 측쇄 말단에 양전하의 질소(141)를 가진 양이온성 고분자 물질로 이루어진 양전하층(140)에 핵산이 접촉할 경우, 전하 상호작용(charge interaction)에 의하여 서로 바인딩되어, 핵산(411)이 핵산 추출 튜브(100)의 양전하층(140)에 포획될 수 있다. 이때, 핵산(411)이 포획되는 과정은 약 10 내지 40 ℃의 범위, 바람직하게는 약 20 내지 30 ℃의 온도 범위에서 적어도 5 내지 10분 동안의 조건에서 인큐베이팅되는 단계가 포함될 수 있다. 즉, 상온에서 진행될 수 있음에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출 방법의 핵산 추출 과정은 현장 진단과 같은 상온의 환경에서 수행될 수 있다.
나아가, 전하상호작용으로 포획된 핵산(412)은 양전하층(140) 상에 고정되어, 이후 세척(washing)하는 단계에 의해 유실되지 않는다.
이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출 방법은 핵산 추출 튜브 내의 부유물을 제거하고(S320), 부유물이 제거된 핵산 추출 튜브에 핵산 반응 조성물을 투입하여 인큐베이션(S330)하는 단계가 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, 핵산(411) 추출 및 포획 완료된 핵산 추출 튜브(100) 내의 부유물 즉, 세포막, 세포 소기관, 세포 파편 및 세포의 핵 산이 용해된 용해액(430)이 제거되고, 세척 완충액(440)을 첨가하여 남은 부유물들이 제거된다.
결국, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출 방법은 전술한 바와 같이, 핵산 추출 튜브를 이용함에 따라, 종래의 핵산 추출 방법과 달리 별도의 조성물 및 장치 없이, 하나의 튜브 내에서 간단하게 추출, 포획 및 세척 단계가 수행될 수 있다.
다시, 도 3을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출 방법은 증폭반응 또한, 전술한 추출, 포획 및 세척(S310 내지 S330)하는 단계에서 이용된 하나의 동일 핵산 추출 튜브에서 수행될 수 있으며, 세척하는 단계(S330) 이후에도, 동일한 핵산 추출 튜브에서 세척된 핵산 추출 튜브에 핵산 반응 조성물을 투입하여 인큐베이션(incubation)하는 단계(S340) 내지 증폭반응이 완료된 핵산 추출 튜브 내의 시료를 인-시튜(in-situ)로 검출하는 단계가 수행될 수 있다.
이때, 핵산 반응 조성물은 Cas9 단백질, 및 표적 DNA에 특이적으로 결합하는 표적화 서열을 포함하는 dsRNA(dual guide RNA) 또는 sgRNA(single chain guide RNA)를 포함하는 조성물일 수 있으며, 더욱이 본 발명의 핵산 반응 조성물은 전술한, Cas9 단백질 및 가이드 RNA 뿐만 아니라, PCR 혼합제를 더 포함할 수 있으며, PCR 혼합제에는 프라이머, 삽입 염료, 프로브, dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP의 혼합물인 dNTP 및 역전사효소 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이때, 삽입 염료의 첨가량은 각 제품의 특성 등이 고려되어 약 0.1 내지 20 μM 중량 %의 범위, 바람직하게는 약 1 내지 5 μM 중량 %의 범위 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 반응 조성물은 삽입 염료로서, 라이트업 앱타머가 대안적으로 사용될 수 있으며, 이에 따라, 라이트업 앱타머(light-up aptamer)를 더 포함할 수 있다.
즉, 본 발명의 핵산 반응 조성물은 하기의 표 1과 같은 조성물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
| CRISPR-EXPAR reaction | guide RNA |
| Cas9 | |
| 10X NEBuffer | |
| DW | |
| DNA Polymerization | dNTP |
| Klenow (exo-) DNA polymerase | |
| 10X NEBuffer | |
| T7 Template | |
| Transcription | malachite green chloride |
| T7 RNA Polymerase | |
| T7 RNA Polymerase | |
| 20X Enhancer solution | |
| DTT | |
| 10X MgCl2 | |
| 5X Transcription buffer |
보다 구체적으로, 도 5를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출 방법에서의 핵산 반응 조성물의 반응 과정을 예시적으로 도시한 개략도가 도시된다. 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출 방법에서는 Cas9 단백질, 및 표적 DNA에 특이적으로 결합하는 표적화 서열을 포함하는 가이드 RNA(dsRNA 또는 sgRNA)를 포함하는 핵산 반응 조성물을 이용함에 따라, 핵산 내 표적 유전자 부위를 보다 효율적으로 증폭할 수 있다. 먼저, 본 발명의 핵산 반응 조성물의 가이드 RNA는 핵산 추출 튜브 상에 포획되어 있는 핵산, 바람직하게는 핵산 내의 표적 부위를 인식하여 Cas9 단백질을 표적 부위로 이동시키고, 표적 부위로 이동된 Cas9 단백질은 가이드 RNA의 서열에 의하여, 표적 부위만을 절단할 수 있다(CRISPR/Cas9 cleavage). 이때, Cas9 단백질에 의하여 절단된 짧은 표적 부위는 핵산 추출 튜브 표면으로부터 방출된다. 결과적으로 핵산 추출 튜브의 표면에 포집된 RNA의 표적 부위가 Cas9 단백질에 의해 잘려짐과 동시에 방출됨으로 추가적인 용출 단계를 수행하지 않고도 핵산 증폭 반응을 진행할 수 있다.
그 다음, 방출된 표적 부위의 짧은 단편은 30 내지 60 ℃의 등온 증폭 환경(condition)에서도 변성(denaturation)이 진행되기 때문에 추가적인 온도 변화 없이 등온에서 변성 및 핵산 증폭 반응이 개시될 수 있다. 즉, 본 발명의 핵산 검출 방법은 CRISPR/Cas9 시스템에 의하여, 표적 부위가 잘려짐과 동시에 핵산 반응 조성물 내로 방출됨에 따라, 추가적인 핵산 용출 단계가 필요하지 않으며, 방출된 짧은 표적 부위는 증폭반응 온도에서도 변성 반응(두 가닥으로 해리)이 일어나기 때문에 일반적인 변성 반응에서 요구되는 고온 환경 없이 30 내지 60 ℃의 환경(condition)의 등온 증폭이 가능하다.
보다 구체적으로, 방출된 표적 부위를 포함하는 짧은 단편은 반응온도(37℃에서 DNA 호흡(breathing)을 통해 염기쌍이 일시적으로 떨어지는 변성(denaturation) 과정이 수행될 수 있으며, 떨어진 각각의 단일 염기 서열 즉, ssDNA(single stranded DNA)는 T7 주형(T7 Template)에 결합되고, DNA 및 RNA 중합효소의 활성에 의하여 확장 및 T7 RNA의 전사가 촉진되는 중합(polymerization)과정이 수행될 수 있다.
즉, 방출된 표적 부위를 포함하는 짧은 단편(a')은 T7 프로모터 서열(T7')의 3' 말단에 있는 상보적인 영역에 어닐링(annealed)되고, DNA 중합효소에 의해 확장되어, T7 프로모터를 포함하는 이중 가닥 DNA(T7 dsDNA)으로 중합될 수 있으며, 이때, 본 발명의 핵산 반응 조성물은 삽입 염료로서, 라이트업 앱타머인 말라카이트 그린 앱타머가 이용됨에 따라, 이의 서열이 포함될 수 있다.
이에, T7 주형은 방출된 표적 부위를 포함하는 짧은 단편 (ssDNA target fragment, a′, T7 프로모터 서열(T7') 및 형광 신호를 위한 라이트업 앱타머 서열 즉, 말라카이트 그린 앱타머 안티센스 영역(Malachite green aptamer antisense region, MGA')에 상보적인 표적 결합 부위를 포함할 수 있다.
나아가, T7 RNA 중합효소의 활성에 의하여 전사(transcription) 반응이 촉진되어, 많은 수의 RNA MGA 가닥인 라이트업 앱타머가 생성될 수 있으며, 이에 따라, 측정하고자 하는 표적 서열을 포함한 경우, 라이트업 앱타머에 의하여 형광 신호가 생성될 수 있다.
나아가, 시료로부터 방출된 핵산이 표적 서열을 포함하지 않는 경우, 본 발명의 핵산 반응 조성물의 Cas9 및 가이드 RNA로부터 표적 부위를 방출하지 않음에 따라, 핵산 증폭 단계가 수행되지 않고, 핵산 추출 튜브 상에 고정만 되어 있을 수 있다.
결국, 본 발명은 측정하고자 하는 표적 부위만을 증폭시킬 수 있음에 따라, 보다 정확하게 표적 서열의 존재 유무를 측정할 수 있다.
다시, 도 3을 참조하면, 결국 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출 방법은 혼합하는 단계(S310)부터 인-시튜로 검출하는 단계(S360)까지 부가적인 별도의 장치 없이 모두 하나의 핵산 추출 튜브 내에서 수행될 수 있음에 따라, 종래의 수많은 전처리 과정이 필요하였던 핵산 추출 방법보다 간편하게 이용될 수 있다.
한편, 인큐베이션이 수행된 핵산 추출 튜브 내의 시료에 대한 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계(S350)에서 증폭 반응을 위한 PCR은, 어셈블리-PCR, 비대칭(asymmertric) PCR, 디지털 PCR, 종점(endpoint) PCR, 인 버스(inverse) PCR, 메틸화-특이성 PCR, 정성(qualitative) PCR, 정량화(quantitative) PCR, 실시간(realtime) PCR 및 RT(reverse transcription)- PCR 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
나아가, PCR이 완료된 핵산 추출 튜브 내의 시료를 인-시튜(in situ)로 검출하는 단계(S360)에서 인-시튜 검출은 증폭 생성물로부터 유래된 형광의 측정을 의미할 수 있으며, 형광의 유무 및 강도를 고려하여 표적 핵산의 존재 여부 및 농도를 분석할 수 있다. 이때, 형광 측정에 이용될 수 있는 검출 수단은 공초점 현미경(confocal microscope), 형광 현미경(fluorescence microscope), 형광계 (fluorometer), 형광 스캐너(fluorescence scanner), 플로우사이토메터(flow cytometer), QuantaMaster PTI, sepctrofluorimeter(PTI), 및 SPEX fluorolog 3(ISA) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트 및 이에 기초한 검출 방법의 검증
이하에서는 도 6a 내지 12c을 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트 및 이에 기초한 검출 방법에 대한 검증 결과에 대하여 구체적으로 설명하도록 한다.
도 6a를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트에서 핵산 추출 튜브의 양전하층 형성에 대한 분광법 검증 결과가 도시된다. 이때, 도 6a의 (a)는 FTIR 분광법(Alpha, Bruker Optics)에 의하여 측정되었으며, 도 6a의 (b) 및 (c)는 고해상도 XPS 분광법(High resolution X-ray photoelectron spectroscopy, K-Alpha+ ThermoFisher Scientific Inc.)에 의하여 측정되었으며, 이러한 분광법의 측정은 곡선의 튜브 형태에서는 측정되기 어려움에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트에서 핵산 추출 튜브와 동일한 소재의 필름 기판을 이용하여 수행되었다.
먼저, 도 6a의 (a)를 참조하면, 단량체(monomer)의 경우, 중합체(polymer)와 달리 C=C 결합에 해당하는 905, 1030, 1450, 1629 및 3085 cm-1에서의 피크가 없는 것으로 나타난다.
즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 튜브는 iCVD를 통한 양전하층 형성 과정을 통하여, DMAMS 단량체의 비닐기(vinyl group)가 완전히 소모되며, 자유 라디칼 중합이 성공적으로 완료된 것(중합체 형성)을 의미할 수 있다.
반면에, 3차 아민기(tertiary amine group)에 해당하는 2764 cm-1에서의 피크는 단량체 및 중합체 모두 유지되는 것으로 나타나며, 이는 중합체를 형성한 이후에도 단량체의 아민기가 유지된다는 것을 의미할 수 있다.
즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 튜브의 iCVD를 통한 양전하층 형성 과정에서 DMAMS 단량체는 아민기가 유지되며 중합체로 중합되어, 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 튜브가 아민기를 통하여 양전하를 띌 수 있다.
이에, 도 6a의 (b)를 참조하면, pDMAMS 층이 형성된 기판은 3차 아민기(N1s)에 해당하는 397.4 Ev에서 피크가 형성된 것으로 나타나며, DNA가 포획된 후, 398.9 Ev에서 N+의 새로운 피크가 형성된 것으로 나타난다.
즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 튜브는 3차 아민기를 포함하는 양전하층이 성공적으로 형성되었음을 의미할 수 있다.
나아가, pDMAMS 층이 형성된 기판은 인산염(phosphate, P2p)에 해당하는 피크 또한, 전술한 3차 아민기에 해당하는 피크와 동일한 위치에 형성된 것으로 나타나며, 이는, 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 튜브의 3차 아민기를 포함하는 양전하층에 DNA에 존재한다는 것을 의미할 수 있다.
즉, 음전하의 인산기를 포함하는 DNA는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 튜브의 양전하층에 정전기적 상호작용을 통하여 포획될 수 있다.
도 6b를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트에서 핵산 추출 튜브의 양전하층의 DNA 포획력 검증 결과가 도시된다. 이때, 도 6b의 (a)는 Zeta Potential/Particle size Analyzer (ELS-Z2, Otsukael, Japan)를 이용하여 측정되었으며, 6b의 (b)는 ultraviolet-visible (UV-vis) spectrometer (UV-3600, SHIMADZU, Japan)를 이용하여 측정되었으며, 이러한 측정은 곡선의 튜브 형태에서는 측정되기 어려움에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트에서 핵산 추출 튜브와 동일한 소재의 필름 기판을 이용하여 수행되었다.
먼저, 도 6b의 (a)를 참조하면, pDMAMS 층이 형성된 기판은 -31.4mV에서 36.0mV의 제타 전위 이동을 가지는 것으로 나타나며, NaCl 수용액에서 이는 pDMAMS 층이 형성된 기판의 표면에 많은 양의 양성자가 발생하였음을 의미할 수 있다.
나아가, 도 6b의 (b)를 참조하면, pDMAMS 층이 형성된 기판은 일반적으로 실험용 튜브에 사용되는 폴리프로필렌(polypropylene, PP) 필름 기판과 동일하게 300 nm 이상의 영역에서 파장을 가지지 않은 것으로 나타난다. 즉, pDMAMS 층이 형성된 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트에서 핵산 추출 튜브는 400 nm 내지 700 nm에 해당하는 가시광선 영역에서 흡수 피크를 가지지 않음에 따라, 증폭반응 결과 확인에 이용되는 형광 신호 판독에 대한 간섭을 가지지 않는다.
이에, 도 6b의 (c)를 참조하면, pDMAMS 층이 형성된 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트에서 핵산 추출 튜브(all-in -one tube)는 pDMAMS 층이 형성되지 않은 일반 튜브(Bare tube)와 육안으로 차이가 없는 것으로 나타나며, 이는 가시광선 영역에서 우수한 광학적 투명도를 가지며, 형광 간섭없이 핵산 증폭에 대한 결과를 확인할 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트에서 핵산 추출 튜브의 유전자 포획 효율에 대한 검증 결과이다. 이때, 본 발명의 핵산 추출 튜브 상에 포획되는 유전자의 정량을 위하여, QIAamp genomic DNA kit (Hilden, Germany)를 이용하여 H1781 세포의 gDNA(genomic DNA)를 추출하였으며, 추출된 gDNA의 농도는 NanoDrop 1000 spectrophotometer (ThermoFisher Scientific, MA, USA)를 이용하여 측정하였다. 나아가, 1, 2, 10, 20 및 50 ng/μL의 gDNA는 100 ng/μL의 gDNA를 희석하여 정량되었으며, 본 발명의 핵산 추출 튜브내에 3 μL씩 분주된 뒤, 약 60분 간의 인큐베이션을 통하여 핵산 출출 튜브 상에 포획되었다. 포획 gDNA 양의 정량은 인큐베이션 이후, 포획되지 않은 gDNA를 회수하여, 이의 농도(증폭 및 형광 측정)를 측정한 뒤, 투입 gDNA에서 회수 gDNA의 감소량을 감가하여 계산되었다.
본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트에서 핵산 추출 튜브는 모든 농도에서 70 % 이상의 포획 효율(capture efficiency)을 가지는 것으로 나타나며, 이는 본 발명의 핵산 추출 튜브가 투입 gDNA 양과 상관없이 효율적으로 핵산 추출 튜브 상에 포획할 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트의 구성 요소에 대한 검증 결과가 도시된다. 이때, 검증을 위하여 인간 비소세포성 폐암에 대한 HER2 유전자 내 9bp의 삽입 돌연변이(mutation)가 표적 모델로 선택되었으며, 이에 대한 구체적인 서열은 하기의 표 2 내에 개시(굵은 글씨)되어 있으며, 이의 서열에 기초하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트 내의 가이드 RNA가 설계되어 이용되었으며, 이에 대한 구체적은 서열(서열번호 1 및 서열번호 2)은 하기의 표 2에 개시된 바와 같다. [PO4]는 3'말단 인산기(phosphate group)의 변형을 의미한다. 나아가, 이러한 실험 조건은 이하에서 설명될 도 9a 내지 11에서도 동일할 수 있다.
| Target | Name | Sequence(5'→3') |
| HER2 | Target DNA (HER2 MT) |
GCA TAC GTG ATG GCT GGT GTG GGC TCC CCT GGC TCC CC (a)A TAT GTC TCC CGC CTC CTG GGC ATC TGC CTG ACA TCC ACA |
| Non-target DNA (HER2 WT) | GCA TAC GTG ATG GCT GGT GTG GGC TCC CCA TAT GTC TCC CGC CTC CTG GGC ATC TGC CTG ACA TCC ACA | |
| crRNA 1 for HER2 MT |
AUG GCU GGU GUG GGC UCC CC | |
| crRNA 2 for HER2 MT |
CCA GGA GGC GGG AGA CAU AU | |
| T7 template for HER2 MT | GGA TCC ATT CGT TAC CTG GCT CTC GCC AGT CGG GAT CC(b)T CTC CCT ATA GTG AGT CGT ATT (c) ATA TGG GGA GCC AGG G(d) [PO4](e) | |
| FP for PCR and RPA | CTG GCG CTT TTG GCA | |
| RP for PCR and RPA | GGT CCT GGG AGC CCA |
먼저, 도 8의 (a)를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트에 대한 조성물에서 표적 gDNA(target), 가이드 RNA 및 Cas9 단백질(Cas9), DNA 중합효소(DNA POL.), RNA 중합효소(RNA POL.) 및 라이트업 앱타머(MG)가 모두 존재할 경우(positive)에만, MGA가 생성되어 형광 신호가 발현된 것으로 나타난다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트에 대한 조성물에서 각각의 구성요소가 모두 필수적임을 의미할 수 있다.나아가, 도 8의 (b)를 참조하면, 표적 돌연변이를 포함하는 긴 단편(long fragment)의 경우, 가이드 RNA 및 Cas9 단백질(Cas9)을 포함한 경우(w/ Cas9)에만 형광 신호가 발현되는 것으로 나타나며, 가이드 RNA 및 Cas9 단백질(Cas9)을 포함하지 않거나(w/o Cas9) 절단 기능이 없는 dCas9(w/ dCAS9)를 포함한 경우에는 형광 신호가 발현되지 않는 것으로 나타난다.
또한, 짧은 단편(short fragment)의 경우, RNA 및 Cas9 단백질(Cas9)의 유무와 상관없이 모두 형광 신호가 발현되는 것으로 나타난다.
즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법은 표적 부위가 CRISPR 시스템에 의하여, 짧은 단편으로 방출된 경우에만 진단될 수 있다.
보다 구체적으로, 시료로부터 방출되어 본 발명의 핵산 추출 튜브 상에 포획된 핵산은 측정하고자 하는 표적 부위를 포함하지 않은 경우, CRISPR 시스템에 의하여 표적 부위에 대한 단편(short fragment)를 방출하지 않음에 따라, 핵산 증폭 반응이 일어나지 않는다.
그러나, 표적 부위를 포함한 핵산의 경우, CRISPR 시스템에 의하여 표적 부위에 대한 짧은 단편(short fragment)를 방출하여, 핵산 반응 조성물 내에서 자유롭게 존재하며, 증폭 반응이 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, 200 bp 이하의 짧은 단편은 음전하를 띄는 인산염이 부족함에 따라, 본 발명의 핵산 추출 튜브상의 양이온성 고분자 물질과의 정전기적 인력이 충분하지 못하여 핵산 추출 튜브 상에 포획되지 않고, 조성물 내에서 자유롭게 존재할 수 있다.
결국, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법은 표적 부위가 CRISPR 시스템에 의하여, 짧은 단편으로 방출된 경우에만 증폭 반응이 수행되어, 형광 신호가 발현되고, 이에 따라, 검출 및 진단될 수 있으며, 이에 따라, 본 발명의 핵산 검출 방법은 별도의 용출 단계가 필요하지 않음을 의미할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법은 용출 단계가 수행되지 않아도 됨에 따라, 실험적 수행 단계 및 시간을 단순화할 수 있으며, 용출 단계에 의한 시료의 손실이 없음에 따라, 종래의 방법보다 높은 감도로 표적 유전자에 대한 검출이 가능할 수 있다.
이하에서는, 도 9a 내지 9c를 참조하며, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법에서 가열 여부에 따른 핵산 증폭 단계에 대한 검증 결과를 설명하도록 한다. 이때, 양성 대조군 (positive sample) 은 10 ng의 유전자를 포함한 튜브이며 음성 대조군 (negative sample) 은 표적 유전자가 없는 튜브이다. 나아가, 가열 여부에 따른 핵산 증폭 성능을 비교하기 위해 일반적으로 널리 쓰이는 중합 효소 연쇄반응 (Polymerase chain reaction, PCR)과 등온 증폭기술인 재조합효소-중합효소 증폭법(recombinase polymerase amplification, RPA)과 비교하였다.
먼저, 도 9a를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법은 가열 여부(w/o heat 및 w/ heat) 상관없이 모두, 형광 신호를 발현한 것으로 나타난다. 즉, 측정하고자 하는 표적 부위는 CRISPR 시스템에 의하여, 짧은 단편으로 핵산 반응 조성물 내에 방출됨에 따라, 핵산 반응 조성물 내에서 짧은 단편으로 자유롭게 존재할 수 있으며, 이에, 가열 여부에 상관없이 DNA 호흡에 의하여 이중 가닥이 분리되어 증폭 반응이 수행될 수 있다.
또한, 이때의 유전자를 포함하는 양성 대조군(positive)의 형광 발현 강도(intensity)는 가열여부 상관없이 모두 30,000 이상인 것으로 나타난다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법은 가열 여부에 상관없이 강한 형광 발현이 가능함에 따라, 정확한 진단이 가능할 수 있다.
그 다음, 도 9b를 참조하면, 일반적인 PCR 증폭의 경우, 본 발명의 핵산 추출 튜브는 가열된 경우(w/ heat)에만 형광 신호가 발현된 것으로 나타난다.
또한, 이때의 형광 발현 강도의 경우, 약 20,000 이하로, 본 발명의 방법보다 발현 강도가 낮은 것으로 나타난다.
그 다음, 도 9c를 참조하면, 종래의 등온 증폭 방법인 RPA도 PCR 증폭과 마찬가지로, 가열된 경우(w/ heat)에만, 형광 신호가 발현된 것으로 나타난다. 즉, 일정 온도 이상의 환경에서만, 튜브 표면의 표적 부위를 포함하는 핵산이 분리되어, 합성 및 증폭 과정이 수행된다는 것을 의미할 수 있다.
또한, 이때의 형광 발현 강도의 경우, 약 12,000 이하로, 본 발명의 방법보다 발현 강도가 낮은 것으로 나타난다.
즉, 종래의 PCR 방법 및 등온 증폭 방법(RPA)은 용출 단계가 필수적으로 수행되어야 한다. 그러나, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법은 CRISPR/Cas9 시스템에 의하여, 표적 부위가 방출됨에 따라, 이의 방출을 위한 용출 단계가 포함되지 않을 수 있으며, 나아가, 용출 단계를 위한 가열 단계 또한 요구되지 않는다.
이하에서는, 도 10a 내지 11을 참조하여, 시료에 따른 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법의 검증 결과에 대하여 설명하도록 한다. 이때, 측정하고자 하는 표적 돌연변이 gDNA가 세포 용해물(cell lysate), 혈장, 소변 등의 다양한 생물학적 시료에 포함되도록 임상 시료를 제작하였으며, 이를 이용하여 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 검출 방법과 종래의 일반적인 PCR 전처리 과정인 Spin-down assay(QIAamp genomic DNA kit, Dneasy Blood & Tissue kits, and QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Germany))을 비교하였다.
먼저, 도 10a를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법은 시료 종류에 상관없이, 종래의 핵산 검출 방법(Qiagen kit)보다 높은 형광 강도(intensity)를 가지는 것으로 나타나며, 형광 신호의 잡음 비율(signal-to-noise ratio)을 나타내는 F/F0 또한, 본 발명의 핵산 검출 방법이 더 높은 것으로 나타난다.
즉, 본 발명의 핵산 검출 방법은 종래의 스핀-다운 방법보다 우수한 핵산 검출 능력을 가진다는 것을 의미할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 핵산 검출 방법은 종래의 스핀-다운 방법에서 이용되는 페놀 및 카오트로픽 기반의 용해 완충액(chaotropic reagent-based lysis buffer) 등의 시약이 이용되지 않음에 따라, 핵산에 대한 분해가 최소화될 수 있다. 이에, 본 발명은 실험적 오차 및 오류가 최소화됨에 따라, 종래의 방법보다 높은 검출 효율을 가질 수 있다.
그 다음, 도 10b를 참조하면, 시료에 따른 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법의 분석 감도에 대한 결과가 도시되며, 세포 용해물(cell lysate)의 경우, 1 aM 내지 1nM의 측정 범위(dynamic range)를 가지고, 0.92 aM의 검출 한계(Limit of Detection, LOD)를 가지는 것으로 나타난다.
또한, 혈장(plasma)의 경우, 100 aM 내지 1nM의 측정 범위(dynamic range)를 가지고, 94.6 aM의 검출 한계(Limit of Detection, LOD)를 가지는 것으로 나타난다.
또한, 소변(urine)의 경우, 10 aM 내지 1nM의 측정 범위(dynamic range)를 가지고, 7.7 aM의 검출 한계(Limit of Detection, LOD)를 가지는 것으로 나타난다.
나아가, 세포 용해물, 혈장 및 소변 시료 모두 1 aM 내지 1 nM의 범위에서 우수한 선형 관계(excellent linear relationship)를 가지는 것으로 나타난다.
즉, 본 발명의 핵산 검출 방법은 시료의 종류에 상관없이 기존의 핵산 검출 방법보다 약 400배 이상의 높은 검출 감도를 가지는 것으로 나타나며, 이는 라이트업 앱타머에 기초한 형광 신호 시스템이 형광 신호를 크게 향상시킬 수 있다는 것을 의미할 수 있다. 나아가, 본 발명의 핵산 검출 방법은 전처리 방법 및 용출 단계 등의 실험적 오차 및 시료의 유실을 유발시킬 수 있는 단계를 포함하지 않음에 따라, 보다 높은 효율로 표적 핵산을 추출 및 포집하여, 검출 감도를 향상시킬 수 있다.
도 11은 시료에 따른 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법의 특이성 검증 결과이다. 이때, 특이성 검증은, H1781, Hela, MCF7, 및 A549의 세포주에 기초하여 수행되었으며, 표적 유전자는 HER2 돌연변이로서, 비소세포성 폐암 세포주인 H1781 세포주에만 포함되어 있다.
도 11을 참조하면, 본 발명의 핵산 검출 방법은 시료의 종류에 상관없이 표적 돌연변이를 포함하는 H1781에서만 5000 a.u. 이상의 높은 형광 강도를 가지는 것으로 나타난다. 즉, 본 발명의 핵산 검출 방법은 CRISPR/Cas9 시스템에 기초함에 따라, 측정하고자 하는 표적 부위에 대하여 높은 인식 능력 즉, 특이성을 가질 수 있다.
한편, 전술한 도 7 내지 도 11은 비소세포성 폐암에 대한 HER2 유전자 내 9bp의 삽입 돌연변이(mutation)에 기초하였으나, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법은 이에 제한되지 않고, 다양한 표적 부위에 대하여 검출 및 진단이 가능할 수 있다.
보다 구체적으로 도 12a 내지 12c를 참조하면, 유방암 PIK3CA 유전자 돌연변이에 기초한 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트 및 이에 기초한 핵산 검출 방법에 검증 결과가 도시된다. 이때, 유방암에 대한 PIK3CA 유전자에 대한 H1047R 돌연변이가 표적 모델로 선택되었으며, 이에 대한 구체적은 서열은 하기의 표 3내에 개시되어 있으며, 이의 서열에 기초하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트 내의 가이드 RNA가 설계되어 이용되었으며, 이에 대한 구체적인 서열(서열번호 3 및 서열번호 4)은 하기의 표 3에 개시된 바와 같다. [PO4]는 3'말단 인산기(phosphate group)의 변형을 의미한다.
| Target | Name | Sequence (5'→3') |
| PIK3CA | Target DNA (PIK3CA MT) |
AGA TAA AAC TGA GCA AGA GGC TTT GGA GTA TTT CAT GAA ACA AAT GAA TGA TGC ACG(a) TCA TGG TGG CTG |
| Non-target DNA (PIK3CA WT) |
AGA TAA AAC TGA GCA AGA GGC TTT GGA GTA TTT CAT GAA ACA AAT GAA TGA TGC ACA TCA TGG TGG CTG | |
| crRNA 1 for PIK3CA MT |
UAA AAC UGA GCA AGA GGC UU | |
| crRNA 2 for PIK3CA MT |
CAA AUG AAU GAU GCA CGU CA | |
| T7 template for PIK3CA MT | GGA TCC ATT CGT TAC CTG GCT CTC GCC AGT CGG GAT CC(b)T CTC CCT ATA GTG AGT CGT ATT (c) ACG TGC ATC ATT CAT TTG TTT CAT GAA ATA CTC CAA AG (d) [PO4](e) |
먼저, 도 12a의 (a)를 참조하면, 이하에서 설명될 본 발명의 핵산 검출 방법은 HCC 1954 세포주가 이식된 유방암 동물 모델로부터 조직이 추출되어 이용되었다.도 12a의 (b)를 참조하면, 유방암 PIK3CA 유전자 돌연변이에 기초한 본 발명의 핵산 검출 방법 역시, 본 발명의 핵산 검출용 키트에 대한 조성물에서 표적 gDNA(target), 가이드 RNA 및 Cas9 단백질(Cas9), DNA 중합효소(DNA POL.), RNA 중합효소(RNA POL.) 및 라이트업 앱타머(MG)가 모두 존재할 경우(positive)에만, MGA가 생성되어 형광 신호가 발현된 것으로 나타난다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트에 대한 조성물에서 각각의 구성요소가 모두 필수적임을 의미할 수 있다.
나아가, 도 12b를 참조하면, 유방암 PIK3CA 유전자 돌연변이에 기초한 본 발명의 핵산 검출 방법은 1 aM 내지 1nM의 측정 범위(dynamic range)를 가지고, 0.55 aM의 검출 한계(Limit of Detection, LOD)를 가지는 것으로 나타난다.
또한, 1 aM 내지 1 nM의 범위에서 우수한 선형 관계(excellent linear relationship)를 가지는 것으로 나타난다.
즉, 본 발명의 핵산 검출 방법은 표적 유전자의 종류에 상관없이, 높은 검출 감도를 가질 수 있으며, 다양한 표적 유전자에 대하여 적용될 수 있다.
나아가, 도 12c 내지 도 12e를 참조하면, 유방암 동물 모델의 조직 샘플의 종류에 따른, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법에 대한 검증 결과가 도시되며, 이때, 유방암 동물 모델 (HCC 1954 Mouse) 총 10마리 및 대조군으로서 유방암에 걸리지 않은 일반 동물 모델 (Normal mouse) 10마리가 이용되었으며, 각 동물 모델의 소변, 혈장, 종양(유방), 간, 폐, 신장, 및 비장 조직을 무균으로 수확하여, 본 발명의 핵산 검출 방법을 수행하여 이의 형광 신호를 측정하였다.
도 12c를 참조하면, 종양은 유방 부위에만 존재하며, 다른 장기로 전이되지 않았다. 또한, 유방암을 포함하지 않는 일반 동물 모델(normal mouse)의 시료에서는 형광 신호가 전혀 측정되지 않는 것으로 나타난다.
도 12d를 참조하면, 유방암 동물 모델에 대한 혈장 및 소변 시료에서 4000 a.u. 이상의 높은 형광 강도를 가지는 것으로 나타난다.
도 12e를 참조하면, 유방암 동물 모델의 소변에서 추출한 엑소좀 내에서 검출된 표적 유전자는 약 7000 a.u. 정도의 형광 강도로 검출되는 것으로 나타난다. 대조군인 일반 동물 모델에서는 상대적으로 낮은 형광 강도로 나타났다. 이때, 유방암 동물 모델 10마리의 소변과 일반 동물 모델 10마리의 소변은 각각 하나로 병합되어 측정되었다. 즉, 유방암 동물 모델은 다른 장기로 종양이 전이되지 않았음에 따라, 유방 조직 및 액체 시료 (혈장 및 소변)에서 표적 유전자 돌연변이를 측정할 수 있으며, 액체 시료 내 표적 유전자 돌연변이를 포함하는 핵산의 경우, 유방 조직의 종양으로부터 유래됨에 따라, 본 발명의 핵산 검출 방법은 액체 생검 내 ctDNA에 있어, 보다 높은 검출 능력을 가질 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
나아가, 본 발명의 핵산 검출용 키트 및 핵산 검출 방법은 측정하고자 하는 표적 부위의 서열이 존재할 경우, 이에 기초하여 가이드 RNA를 설계할 수 있음에 따라, 특정 시료 및 유전자에 한정되지 않고 다양한 표적 유전자를 측정 및 진단할 수 있다.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시 예들을 더욱 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 반드시 이러한 실시 예로 국한되는 것은 아니고, 본 발명의 기술사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 변형 실시될 수 있다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시 예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시 예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
100 : 핵산 추출 튜브
110 : 바디부
120 : 캡
130 : 내벽부
140 : 양전하층
141 : 측쇄 말단에 양전하의 질소
160 : 핵산 추출 튜브의 내부
200 : 스트립 튜브
300 : 플레이트 튜브
410 : 시료
411 : 핵산
420 : 용해 완충액
430 : 용해액
440 : 세척 완충액
110 : 바디부
120 : 캡
130 : 내벽부
140 : 양전하층
141 : 측쇄 말단에 양전하의 질소
160 : 핵산 추출 튜브의 내부
200 : 스트립 튜브
300 : 플레이트 튜브
410 : 시료
411 : 핵산
420 : 용해 완충액
430 : 용해액
440 : 세척 완충액
Claims (20)
- 핵산 추출 튜브, 및
핵산 반응 조성물을 포함하고,
상기 핵산 추출 튜브는,
시료를 수용하도록 구성된 바디부, 및
상기 바디부의 내벽부 상에 배치되는 양이온성 고분자 물질로 이루어진 양전하층을 포함하고,
상기 핵산 반응 조성물은,
Cas9 단백질, 및
표적 DNA에 특이적으로 결합하는 표적화 서열을 포함하는 dsRNA(dual guide RNA) 또는 sgRNA(single chain guide RNA)를 포함하는, CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트. - 제 1항에 있어서,
상기 키트는,
100 aM 까지의 검출 한계(LOD)를 가지는, CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트. - 제 1항에 있어서,
상기 양전하층의 두께는,
1 내지 1000nm인, CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트. - 제 1항에 있어서,
상기 양이온성 고분자 물질은,
폴리(2-디메틸아미노메틸 스티렌)(pDMAMS), 폴리-2-다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트(pDMAEMA), 폴리-1-비닐피롤리돈(p1-VP), 폴리 다이에틸아미노에틸아크릴레이트(pDEAEA), 및 폴리 다이에틸아미노에틸메타크릴레이트(pDEAMA) 중 적어도 하나를 포함하는, CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트. - 제 4항에 있어서,
상기 양이온성 고분자 물질은,
측쇄 말단에 양전하의 질소가 튜브의 내부로 향하여 배치된, CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트. - 제 4항에 있어서,
상기 양이온성 고분자 물질은,
상기 폴리(2-디메틸아미노메틸 스티렌)(pDMAMS)인, CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트. - 제 1항에 있어서,
상기 튜브는,
폴리프로필렌(polypropylene, PP), 폴리에틸렌 (polyethylene, PE), 폴리염화비닐(polyvinyl chloride, PVC), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 폴리에스테르(polyester), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리에틸렌테레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET), 폴리우레탄(polyurethane, PU), 실리콘, 유리, 세라믹 및 테플론 중 적어도 하나의 소재로 이루어진, CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트. - 제 1항에 있어서,
상기 Cas9 단백질은,
Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9), Streptococcus thermophilus Cas9(StCas9), Streptococcus pasteurianus (SpaCas9), Campylobacter jejuni Cas9(CjCas9), Staphylococcus aureus (SaCas9), Francisella novicida Cas9 (FnCas9), Neisseria cinerea Cas9 (NcCas9), Neisseria meningitis Cas9 (NmCas9), Prevotella 및 Francisella 1(Cpf1) 중 적어도 하나를 포함하는, CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트. - 제 1항에 있어서,
상기 핵산 반응 조성물은,
라이트업 앱타머(light-up aptamer)를 더 포함하는, CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트. - 제 9항에 있어서,
상기 라이드업 앱타머는,
말라카이트 그린(malachite green) 앱타머, 스피니치2(spinach2) 앱타머, 베이비 스피니치(baby spinach) 앱타머, m베이비 스피니치(mbaby spinach) 앱타머, 브로콜리(broccoli) 앱타머, 망고(mango) 앱타머, BFR(Blue Fluorescent RNA) 앱타머, 및 술포로다민 B(sulforhodamine B) 앱타머 중 하나를 포함하는, CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트. - 제 1항에 있어서,
상기 dsRNA 및 sgRNA는,
서열번호 1 내지 4 중 적어도 하나의 연속적인 뉴클레오티드와 동일하거나 상보적인 핵산 서열을 포함하는 dsRNA 및 sgRNA인, CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트. - 핵산을 포함하는 시료를 용해 완충액(lysis buffer)과 함께 핵산 추출 튜브에 넣어 혼합하는 단계;
상기 핵산 추출 튜브 내의 부유물을 제거하는 단계;
부유물이 제거된 상기 핵산 추출 튜브에 세척 버퍼를 첨가하여 세척하는 단계;
세척된 상기 핵산 추출 튜브에 핵산 반응 조성물을 투입하여 인큐베이션(incubation)하는 단계;
인큐베이션이 수행된 상기 핵산 추출 튜브 내의 시료에 대한 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및
상기 PCR이 완료된 상기 핵산 추출 튜브 내의 시료를 인-시튜(in situ)로 검출하는 단계를 포함하고,
상기 핵산 추출 튜브는,
시료를 수용하도록 구성된 바디부, 및
상기 바디부의 내벽부 상에 배치되는 양이온성 고분자 물질로 이루어진 양전하층을 포함하고,
상기 핵산 반응 조성물은,
Cas9 단백질, 및
표적 DNA에 특이적으로 결합하는 표적화 서열을 포함하는 dsRNA(dual guide RNA) 또는 sgRNA(single chain guide RNA)를 포함하는, CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법. - 제 12항에 있어서,
상기 시료는,
조직, 혈액, 소변, 흉수, 분변, 객담, 복강액, 모유, 뇌척수액, 침, 림프액 및 기관 세척액으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 포함하는, CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법 - 제 12항에 있어서,
상기 혼합하는 단계는,
상기 시료를 상기 용해 완충액과 혼합하여 배양하는 단계를 더 포함하는, CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법. - 제 12항에 있어서,
상기 핵산 반응 조성물은,
라이트업 앱타머(light-up aptamer)를 더 포함하는, CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법. - 제 15항에 있어서,
상기 라이드업 앱타머는,
말라카이트 그린(malachite green) 앱타머, 스피니치2(spinach2) 앱타머, 베이비 스피니치(baby spinach) 앱타머, m베이비 스피니치(mbaby spinach) 앱타머, 브로콜리(broccoli) 앱타머, 망고(mango) 앱타머, BFR(Blue Fluorescent RNA) 앱타머, 및 술포로다민 B(sulforhodamine B) 앱타머 중 하나를 포함하는, CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법. - 제 12항에 있어서,
상기 dsRNA 및 sgRNA는,
서열번호 1 내지 4 중 적어도 하나의 연속적인 뉴클레오티드와 동일하거나 상보적인 핵산 서열을 포함하는 dsRNA 및 sgRNA인, CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법. - 제 12항에 있어서,
상기 인큐베이션하는 단계는,
25 내지 40 ℃에서 5 내지 10분동안 수행되는, CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법. - 제 12항에 있어서,
상기 양전하층의 두께는,
1 내지 1000nm인, CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법. - 제 12항에 있어서,
상기 양이온성 고분자 물질은,
폴리(2-디메틸아미노메틸 스티렌)(pDMAMS), 폴리-2-다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트(pDMAEMA), 폴리-1-비닐피롤리돈(p1-VP), 폴리 다이에틸아미노에틸아크릴레이트(pDEAEA), 및 폴리 다이에틸아미노에틸메타크릴레이트(pDEAMA) 중 적어도 하나를 포함하는, CRISPR/Cas9 기반의 핵산 검출용 키트를 이용한 핵산 검출 방법.
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| KR1020220082014A KR20240005282A (ko) | 2022-07-04 | 2022-07-04 | Crispr/cas 기반의 핵산 검출용 키트 및 이에 기초한 핵산 검출 방법 |
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