CN109563542A - 甲基化dna的扩增方法、dna的甲基化判定方法以及癌症的判定方法 - Google Patents

甲基化dna的扩增方法、dna的甲基化判定方法以及癌症的判定方法 Download PDF

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Abstract

本发明的课题在于提供能够简便地进行甲基化DNA的扩增和使用了该扩增的DNA的甲基化判定以及癌症判定的方法。本发明涉及“甲基化的分析对象区域的扩增方法、分析对象区域的甲基化判定方法、甲基化判定用试剂、癌症的判定方法、获得用于进行癌症的判定的数据的方法、癌症的判定用试剂和用于进行癌症的判定的标志物”。

Description

甲基化DNA的扩增方法、DNA的甲基化判定方法以及癌症的判 定方法
技术领域
本发明涉及甲基化DNA的扩增方法、DNA的甲基化判定方法以及癌症的判定方法。
背景技术
DNA的甲基化是指利用DNA甲基化酶进行的碱基修饰，是在CpG序列的胞嘧啶碱基的5位等附加有甲基的状态。
DNA的甲基化在高等生物中对正常的发育和细胞的分化起到极其重要的作用。
目前，作为对甲基化DNA进行扩增的方法，例如进行了下述方法：(1)使DNA进行亚硫酸氢盐反应，接着进行PCR等核酸扩增反应的方法(专利文献1)；(2)利用甲基化敏感性限制酶和甲基化非敏感性限制酶对DNA进行处理，接着进行PCR等核酸扩增反应的方法(专利文献2)。另外，在专利文献1和专利文献2中，还通过DNA微阵列等对利用扩增甲基化DNA的方法得到的扩增产物进行分析，基于其结果，对DNA是否被甲基化进行判定及分析。
另一方面，还已知DNA的甲基化与癌症化有关。例如，DNA的甲基化模式的差异与癌症或各种疾病有关(非专利文献1、2)；进行了基于DNA的甲基化率来检测癌症的方法等(专利文献3)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2013/089063
专利文献2：WO2009/131223
专利文献3：日本特开2008-283947
非专利文献1：Yu J et al.Cell Res 13：319-33,2003
非专利文献2：Kanai Y et al.Hepatology 29：703-9,1999
发明内容
发明所要解决的课题
但是，专利文献1的扩增甲基化DNA的方法需要进行亚硫酸氢盐反应的步骤。另外，专利文献2的扩增甲基化DNA的方法需要在利用甲基化非敏感性限制酶处理的DNA上连接接头、之后将接头除去的步骤。因此，哪种方法都繁杂，需要大量的时间。
因此，希望开发出能够简便地进行甲基化DNA的扩增、以及使用了该扩增的DNA的甲基化判定和癌症判定的方法。
即，本发明的课题在于提供一种能够简便地进行甲基化DNA的扩增和使用了该扩增的DNA的甲基化判定以及癌症判定的方法。
用于解决课题的手段
本发明是为了解决上述课题而进行的，其由下述构成组成。
[1]一种双链DNA中的甲基化的分析对象区域的扩增方法，其包括下述步骤1和2：
(1)步骤1，利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶对包含分析对象区域的双链DNA进行处理；
(2)步骤2，对步骤1中处理后的双链DNA的分析对象区域进行扩增。
[2]如[1]所述的扩增方法，其中，所述步骤1在利用S1核酸酶进行处理后，利用甲基化敏感性限制酶进行处理。
[3]如[1]所述的扩增方法，其中，所述步骤1在利用甲基化敏感性限制酶进行处理后，利用S1核酸酶进行处理。
[4]如[1]～[3]中任一项所述的扩增方法，其中，在所述步骤1之前，包括利用在分析对象区域内不存在识别序列的限制酶进行处理的片段化步骤。
[5]一种双链DNA中的分析对象区域的甲基化判定方法，其包括下述步骤1～4：
(1)步骤1，利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶对包含分析对象区域的双链DNA进行处理；
(2)步骤2，对步骤1中处理后的双链DNA的分析对象区域进行扩增；
(3)步骤3，确认步骤2中得到的扩增产物的有无；
(4)步骤4，基于步骤3的结果，判定分析对象区域是否被甲基化。
[6]如[5]所述的甲基化判定方法，其中，所述步骤1在利用S1核酸酶进行处理后，利用甲基化敏感性限制酶进行处理。
[7]如[5]所述的甲基化判定方法，其中，所述步骤1在利用甲基化敏感性限制酶进行处理后，利用S1核酸酶进行处理。
[8]如[5]～[7]中任一项所述的甲基化判定方法，其中，在所述步骤1之前，包括利用在分析对象区域内不存在识别序列的限制酶进行处理的片段化步骤。
[9]一种DNA的甲基化判定用试剂，其包含S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶。
[10]一种癌症的判定方法，其包括下述步骤1～4：
(1)步骤1，利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶对包含分析对象区域的双链DNA进行处理；
(2)步骤2，对步骤1中处理后的双链DNA的分析对象区域进行扩增；
(3)步骤3，确认步骤2中得到的扩增产物的有无；
(4)步骤4，基于步骤3的结果，对癌症进行判定。
[11]如[10]所述的癌症的判定方法，其中，所述步骤1在利用S1核酸酶进行处理后，利用甲基化敏感性限制酶进行处理。
[12]如[10]所述的癌症的判定方法，其中，所述步骤1在利用甲基化敏感性限制酶进行处理后，利用S1核酸酶进行处理。
[13]如[10]～[12]中任一项所述的癌症的判定方法，其中，在所述步骤1之前，包括利用在分析对象区域内不存在识别序列的限制酶进行处理的片段化步骤。
[14]如[10]～[13]中任一项所述的癌症的判定方法，其中，分析对象区域为包含序列号1、序列号4或序列号11所表示的碱基序列的碱基序列。
[15]一种获得用于进行癌症的判定的数据的方法，其包括下述步骤1～3：
(1)步骤1，利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶对包含分析对象区域的双链DNA进行处理；
(2)步骤2，对步骤1中处理后的双链DNA的分析对象区域进行扩增；
(3)步骤3，确认步骤2中得到的扩增产物的有无。
[16]一种癌症的判定用试剂，其包含S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶。
[17]一种用于进行癌症的判定的标志物，其通过进行下述步骤1和2而获得：
(1)步骤1，利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶对包含分析对象区域的双链DNA进行处理；
(2)步骤2，对步骤1中处理后的双链DNA的分析对象区域进行扩增。
本发明还包括以下的构成。
[18]一种分析对象区域的甲基化分析(判定)方法，其包括下述步骤1～5：
(1)步骤1，利用S1核酸酶对包含分析对象区域的DNA进行处理；
(2)步骤2，利用甲基化敏感性限制酶对步骤1中处理后的双链DNA进行处理；
(3)步骤3，对步骤2中处理后的双链DNA的分析对象区域进行扩增；
(4)步骤4，确认步骤3中得到的扩增产物的有无；
(5)步骤5，基于步骤4的结果，判定分析对象区域是否被甲基化。
[19]如[18]所述的分析(判定)方法，其中，利用PCR进行步骤3的扩增。
[20]如[18]或[19]所述的分析(判定)方法，其中，利用电泳进行步骤4的扩增产物的确认。
[21]如[18]～[20]中任一项所述的分析(判定)方法，其中，接续在步骤1后，进一步包括对步骤1中处理后的DNA进行纯化的纯化步骤。
[22]如[21]所述的分析(判定)方法，其中，利用柱纯化法进行纯化步骤的纯化。
[23]如[22]所述的分析(判定)方法，其中，在进行纯化步骤之前，进一步包括利用在分析对象区域不存在识别序列的限制酶进行处理的片段化步骤。
[24]一种DNA甲基化分析(判定)用试剂，其包含S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶。
[25]一种癌症的判定方法，其包括下述步骤1～5：
(1)步骤1，利用S1核酸酶对包含分析对象区域的DNA进行处理；
(2)步骤2，利用甲基化敏感性限制酶对步骤1中处理后的双链DNA进行处理；
(3)步骤3，对步骤2中处理后的双链DNA的分析对象区域进行扩增；
(4)步骤4，确认步骤3中得到的扩增产物的有无；
(5)步骤5，基于步骤4的结果，对癌症进行判定。
[26]如[25]所述的判定方法，其中，分析对象区域为启动子区域。
[27]如[25]或[26]所述的判定方法，其中，步骤2的甲基化敏感性限制酶为HapII、HpaII或SacII。
[28]如[25]～[27]中任一项所述的判定方法，其中，步骤3中扩增的核酸是包含序列号1所表示的碱基序列的连续的碱基序列。
[29]如[25]～[28]中任一项所述的判定方法，其中，利用PCR进行步骤3的扩增。
[30]如[29]所述的判定方法，其中，PCR使用由序列号2所表示的碱基序列构成的正向引物和序列号3所表示的反向引物来进行。
[31]如[25]～[30]中任一项所述的判定方法，其中，利用电泳进行步骤4的扩增产物有无的确认。
[32]如[25]～[31]中任一项所述的判定方法，其中，接续在步骤1后，进一步包括对步骤1中处理后的DNA进行纯化的纯化步骤。
[33]如[32]所述的判定方法，其中，利用柱纯化法进行纯化步骤的纯化。
[34]如[33]所述的判定方法，其中，在进行纯化步骤之前，进一步包括利用在分析对象区域不存在识别序列的限制酶进行处理的片段化步骤。
[35]一种获得用于进行癌症的判定的数据的方法，其包括下述步骤1～4：
(1)步骤1，利用S1核酸酶对包含分析对象区域的DNA进行处理；
(2)步骤2，利用甲基化敏感性限制酶对步骤1中处理后的双链DNA进行处理；
(3)步骤3，对步骤2中处理后的双链DNA的分析对象区域进行扩增；
(4)步骤4，确认步骤3中得到的扩增产物的有无。
[36]一种癌症的判定用试剂，其包含S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶。
[37]一种用于进行癌症的判定的标志物，其通过进行下述步骤1～3而获得：
(1)步骤1，利用S1核酸酶对包含分析对象区域的DNA进行处理；
(2)步骤2，利用甲基化敏感性限制酶对步骤1中处理后的双链DNA进行处理；
(3)步骤3，对步骤2中处理后的双链DNA的分析对象区域进行扩增。
发明的效果
根据本发明的扩增方法、甲基化判定方法、癌症的判定方法和获得用于进行癌症的判定的数据的方法，能够简便且以短时间进行甲基化DNA的扩增、DNA的甲基化的判定、癌症的判定和用于进行癌症的判定的数据的获得。
此外，根据本发明的扩增方法、甲基化判定方法、癌症的判定方法和获得用于进行癌症的判定的数据的方法，能够排除PCR等扩增反应时的非特异性扩增产物，因此还能够以良好的精度进行甲基化DNA的扩增、DNA的甲基化的判定、癌症的判定和用于进行癌症的判定的数据的获得。
附图说明
图1是将本发明的扩增方法的流程图分成各种模式示出的图。
图2是将本发明的甲基化判定方法和癌症的判定方法的流程图分成各种模式示出的图。
图3是示出实验例1中的甲基化状态的确认区域以及HapII和HpaII所识别的序列[在人来源的FOXB2基因启动子区域内的由序列号1所表示的碱基序列构成的区域(267碱基对)中，被四边形围起的3个包含CpG序列的序列(CCGG)]的图。
图4是关于实验例1中各种正常细胞和各种癌细胞的碱基序列解读结果，示出作为甲基化状态的确认区域的3个包含CpG序列的序列(CCGG)的胞嘧啶是甲基化胞嘧啶、还是非甲基化胞嘧啶的图。
图5是示出在实施例1和比较例1～3中使用正常细胞(hiPS)对FOXB2基因的PCR扩增产物进行电泳的结果的图。
图6是示出在实施例2中使用各种正常细胞对FOXB2基因的PCR扩增产物进行电泳的结果的图。
图7是示出在实施例2中使用各种癌细胞对FOXB2基因的PCR扩增产物进行电泳的结果的图。
图8是示出在实施例3中使用乳腺癌患者来源的癌细胞对FOXB2基因的PCR扩增产物进行电泳的结果的图。
图9是示出在实施例4中使用犬来源的癌细胞对FOXB2基因的PCR扩增产物进行电泳的结果的图。
图10是示出在人来源的FOXB2基因启动子区域内的由序列号11所表示的碱基序列构成的区域(149碱基对)中HpaII和HapII所识别的序列[被四边形围起的3个包含CpG序列的序列(CCGG)]的图。
图11是示出在实施例5中使用肝癌患者和肺癌患者来源的血浆、利用数字PCR法对GAPDH基因的特定区域进行扩增的结果的图。
图12是示出在实施例5中使用肝癌患者和肺癌患者来源的血浆、利用数字PCR法对FOXB2基因的特定区域进行扩增的结果的图。
图13是示出在实施例6中使用健康人来源的血浆、利用数字PCR法对FOXB2基因和GAPDH基因的特定区域同时进行扩增/检测的结果的图。
图14是示出在实施例7中使用乳腺癌患者来源的血浆、利用数字PCR法对FOXB2基因和GAPDH基因的特定区域同时进行扩增/检测的结果的图。
图15是示出在实施例7中使用大肠癌患者来源的血浆、利用数字PCR法对FOXB2基因和GAPDH基因的特定区域同时进行扩增/检测的结果的图。
图16是示出在实施例7中使用胰腺癌患者来源的血浆、利用数字PCR法对FOXB2基因和GAPDH基因的特定区域同时进行扩增/检测的结果的图。
图17是示出在实施例7中使用胃癌患者来源的血浆、利用数字PCR法对FOXB2基因和GAPDH基因的特定区域同时进行扩增/检测的结果的图。
图18是示出在实施例7中使用抗癌药给药后的肺癌患者来源的血浆、利用数字PCR法对FOXB2基因和GAPDH基因的特定区域同时进行扩增/检测的结果的图。
具体实施方式
<本发明的扩增方法>
本发明的扩增方法的特征在于，包括下述步骤：(1)步骤1，利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶对包含分析对象区域的双链DNA进行处理；(2)步骤2，对步骤1中处理后的双链DNA的分析对象区域进行扩增。
[双链DNA和该DNA的提取]
作为本发明的双链DNA，只要是包含CpG序列(-CG-)的双链DNA则可以为任一种。
本发明的双链DNA从包含该DNA的试样中提取即可，该提取方法基于自身公知的DNA的提取方法进行即可。作为该DNA的提取方法，具体而言，例如可以举出：将试样和包含表面活性剂(胆酸钠、十二烷基硫酸钠等)的处理液混合，对所得到的混合液进行物理处理(搅拌、均质化、超声波粉碎等)，使试样中包含的DNA游离到混合液中，由此提取DNA的方法；使用苯酚/氯仿从试样中提取DNA的方法；柱提取法等。其中，更优选使用苯酚/氯仿从试样中提取DNA的方法或柱提取法。
使用苯酚/氯仿从试样中提取DNA的方法是指下述方法：基于使试样中包含的蛋白质变性的苯酚的性质和促进该作用的氯仿的性质，除去试样中存在的蛋白质，从而提取DNA。具体方法基于自身公知的方法进行即可。
另外，上述DNA提取方法也可以使用市售的试剂盒[例如，Phase Lock Gel(QTB公司制造)等]来进行。
另一方面，柱提取法是指下述方法：将试样添加至内部具备膜等的柱等筒状容器中，利用物质的大小、吸附力、电荷、疏水性等的差异，从试样中提取DNA。具体方法基于自身公知的方法进行即可。
另外，上述DNA提取方法也可以使用市售的试剂盒[例如，QuickGene SP组织DNA提取试剂盒(仓敷纺绩株式会社制造)、MagMAXTM游离DNA分离试剂盒(Thermo FisherScientific公司制造)、Nucleo Spin(商标)Plasma XS(MACHEREY-NAGEL公司制造)等]来进行。
作为上述试样，具体而言，例如可以举出全血、血清、血浆、尿等体液、组织、细胞等。在使用这样的全血、血清、血浆、尿等体液、组织、细胞等作为试样的情况下，能够将利用本发明的扩增方法得到的扩增产物用于DNA的甲基化的判定、DNA的甲基化相关的疾病的判定或/和诊断。
需要说明的是，作为使用上述试样时的本发明的双链DNA，例如可以举出存在于血清、血浆、尿等体液中的循环癌(肿瘤)细胞(Circulating Tumor Cell：CTC)来源的双链DNA、癌(肿瘤)细胞、白细胞等血液细胞、各组织来源的细胞等的死亡所来源的双链DNA[游离DNA(cell free DNA，cfDNA)]或外泌体(Exosome)来源的双链DNA、或存在于组织、细胞、全血、尿等中的细胞来源的双链DNA。
[分析对象区域]
本发明的分析对象区域是本发明的双链DNA中存在的包含CpG序列的连续的特定双链DNA部分，可以为本发明的双链DNA的一部分或全部。
在这样的分析对象区域中，本发明的扩增方法中所扩增的分析对象区域是包含胞嘧啶被甲基化的CpG序列的连续的特定双链DNA部分。
需要说明的是，上述“甲基化”是指利用DNA甲基化酶进行的碱基修饰，是指在胞嘧啶之后接着出现鸟嘌呤的2碱基序列CpG序列的胞嘧啶碱基的5位等附加有甲基的状态。
本发明的分析对象区域的大小(碱基对数)通常为50～1000碱基对，优选50～700碱基对，更优选50～500碱基对。
作为本发明的分析对象区域，具体而言，例如可以举出任意选择的适当基因的启动子区域内的特定区域的DNA，更优选FOXB2基因的启动子区域内的特定区域的DNA，进一步优选人来源的FOXB2基因的启动子区域内的特定区域的DNA或犬来源的FOXB2基因的启动子区域内的特定区域的DNA，特别优选人来源的FOXB2基因的启动子区域内的由序列号1所表示的碱基序列构成的区域(267碱基对)、人来源的FOXB2基因的启动子区域内的由序列号11所表示的碱基序列构成的区域(149碱基对)或犬来源的FOXB2基因的启动子区域内的由序列号4所表示的碱基序列构成的区域(433碱基对)。
[步骤1]
本发明的步骤1是利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶对包含分析对象区域的双链DNA进行处理的步骤。
本发明的步骤1中的S1核酸酶是单链特异性核酸酶的一种，是对单链DNA和双链DNA的单链的区域进行分解的酶。
本发明的步骤1中的S1核酸酶的浓度(单位数)通常相对于1～200ng目标DNA为1～200单位/μL，优选5～190单位/μL，更优选20～180单位/μL。
本发明的步骤1中的利用S1核酸酶的处理通常在10～37℃、优选在15～25℃进行通常5～30分钟、优选10～20分钟的反应即可。
另外，本发明的步骤1中的利用S1核酸酶的处理优选在pH4～5的条件下进行，作为此处使用的缓冲液，例如使用乙酸钠缓冲液等即可。
本发明的步骤1中的甲基化敏感性限制酶是指切割活性根据识别序列中的CpG序列中的胞嘧啶是否被甲基化而受到影响的限制酶。即，甲基化敏感性限制酶是指下述的限制酶：在识别序列具有包含甲基化的胞嘧啶碱基的CpG序列的情况下，无法切断该识别序列，但在识别序列不具有包含甲基化的胞嘧啶碱基的CpG序列的情况下，能够切断该识别序列。
关于本发明的步骤1中的甲基化敏感性限制酶，只要在分析对象区域内存在其所识别的碱基序列，则可以为任意的甲基化敏感性限制酶。即，根据分析对象区域适当选择即可。
作为本发明的步骤1中的甲基化敏感性限制酶，具体而言，例如可以举出AatII、AccI、AccII、AfaI、Aor13HI、Aor51HI、ApaI、ApaLI、BglI、BmgT120I、BspT104I、BssHII、Cfr10I、ClaI、CpoI、EaeI、Eco52I、HaeII、HapII、HpaII、HhaI、MluI、NaeI、NheI、NotI、NruI、NsbI、PmaCI、Psp1406I、PvuI、SacII、SalI、Sau3AI、SmaI、SnaBI、VpaK11BI等。其中，在将人来源的FOXB2基因的启动子区域中由序列号1所表示的碱基序列构成的区域设定为分析对象区域的情况下，优选使用HapII、HpaII或SacII，更优选使用HpaII或HapII。另外，在将人来源的FOXB2基因的启动子区域中由序列号11所表示的碱基序列构成的区域、或犬来源的FOXB2基因的启动子区域中由序列号4所表示的碱基序列构成的区域设定为分析对象区域的情况下，优选使用HapII或HpaII。
本发明的步骤1中的甲基化敏感性限制酶的浓度(单位数)通常相对于1～200ng目标DNA为1～50单位/μL，优选5～50单位/μL，更优选10～50单位/μL。
本发明的步骤1中的利用甲基化敏感性限制酶的处理通常在20～50℃、优选在35～45℃进行通常60～150分钟、优选60～120分钟反应即可。
另外，本发明的步骤1中的利用甲基化敏感性限制酶的处理优选在pH6～8的条件下进行，作为此处使用的缓冲液，例如使用三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液等。
本发明的步骤1中，利用S1核酸酶的处理与利用甲基化敏感性限制酶的处理(i)可以同时进行；(ii)可以在利用S1核酸酶的处理之后，进行利用甲基化敏感性限制酶的处理；或者(iii)可以在利用甲基化敏感性限制酶的处理之后，进行利用S1核酸酶的处理，但由于利用S1核酸酶的处理与利用甲基化敏感性限制酶的处理中优选的pH不同，因而更优选上述(ii)或(iii)，进一步优选(ii)。
此外，在本发明的步骤1中的利用S1核酸酶的处理或/和利用甲基化敏感性限制酶的处理之后，优选对包含分析对象区域的DNA进行纯化，该纯化的详细情况在[纯化步骤]的项中进行详细说明。
另外，在本发明的步骤1之前，优选利用在分析对象区域内不存在识别序列的限制酶进行处理，该限制酶的详细情况在[利用在分析对象区域内不存在识别序列的限制酶进行处理的片段化步骤]的项中进行详细说明。
通过如此进行本发明的步骤1中的利用S1核酸酶的处理，能够特异性地切断因人为操作和内源性现象(DNA-DNA、DNA-RNA杂交体中的环区域)而产生的单链DNA。其结果，在本发明的步骤2(对本发明的步骤1中处理后的双链DNA的分析对象区域进行扩增的步骤)中非特异性扩增产物的生成受到抑制。
另外，通过进行本发明的步骤1中的利用甲基化敏感性限制酶的处理，甲基化的双链DNA的分析对象区域不被切断，未被甲基化的双链DNA的分析对象区域被切断，因此能够特异性地扩增甲基化的双链DNA的分析对象区域。
因此，通过在本发明的步骤1中对包含分析对象区域的DNA进行处理，在本发明的步骤2中，能够特异性且高灵敏度地扩增甲基化的双链DNA的分析对象区域。
[步骤2]
本发明的步骤2是对本发明的步骤1中处理后的双链DNA的分析对象区域进行扩增的步骤。
本发明的步骤2中的扩增产物可以为分析对象区域本身，也可以包含分析对象区域以外的碱基序列(例如，引物等)，作为该扩增产物的大小(碱基对数)，通常为50～1100碱基对，优选50～800碱基对，更优选50～600碱基对。
作为本发明的步骤2中的扩增产物，具体而言，例如可以举出任意选择的适当基因的启动子区域内的特定区域的DNA，更优选FOXB2基因的启动子区域内的特定区域的DNA，进一步优选人来源的FOXB2基因的启动子区域内的特定区域的DNA或犬来源的FOXB2基因的启动子区域内的特定区域的DNA，特别优选人来源的FOXB2基因的启动子区域内的由序列号1所表示的碱基序列构成的区域(267碱基对)、人来源的FOXB2基因的启动子区域内的由序列号11所表示的碱基序列构成的区域(149碱基对)或犬来源的FOXB2基因的启动子区域内的由序列号4所表示的碱基序列构成的区域(433碱基对)。
本发明的步骤2中的对分析对象区域进行扩增的方法没有特别限制，基于自身公知的方法进行即可。作为这样的自身公知的扩增法，具体而言，例如可以举出PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)法、LAMP(Loop-Mediated IsothermalAmplification，环介导等温扩增)法等，更优选PCR法。
上述PCR法使用引物、核酸合成酶、核酸合成底物、缓冲液、必要时的探针等利用公知的方法进行即可。具体而言，例如基于Nucleic Acids Research,1991,Vol.19,3749、BioTechniques,1994,Vol.16,1134-1137或“目的別で選べるPCR実験プロトコール(根据目的选择的PCR实验方案),2011,p.p.56-73,120-131”中记载的方法进行即可。
作为上述PCR法，在将存在于血清、血浆、尿等体液中的CTC来源的DNA的特定区域、cfDNA的特定区域或外泌体(Exosome)来源的DNA的特定区域设定为分析对象区域的情况下，优选数字PCR法。
上述数字PCR法为下述方法：按照使DNA片段为1分子的方式将PCR反应液分割成多个小区划来实施PCR反应，基于检测出扩增产物的小区划的数量来检测、定量靶DNA。数字PCR法例如基于日本特表2014-506465号公报中记载的方法、或Proc.Natl.Acad.Sci.USAVol.96,p.p 9236-9241,August 1999Genetics中记载的方法进行即可。
具体而言，例如，制备包含作为模板的含DNA溶液、由正向引物和反向引物构成的引物对、探针、核酸合成底物、核酸合成酶等的数字PCR用反应液，利用液滴制作装置[例如，QX200液滴发生器(Bio-Rad Laboratories公司制造)、自动化液滴发生器(Bio-RadLaboratories公司制造)等]将该反应液分割成多个液滴(每一个样品分割成1万～3万个)。之后，利用数字PCR装置[例如，Droplet Digital PCR(Bio-Rad Laboratories公司制造)、QuantStudio 3D数字PCR系统(Thermo Fisher Scientific公司制造)等]进行PCR反应即可。
上述PCR法中的由正向引物和反向引物(下文中有时简记为本发明的引物)构成的引物对(下文中有时简记为本发明的引物对)只要按照可扩增本发明的分析对象区域的方式进行设计，则可以为任意的引物对。
作为构成本发明的引物对的引物的大小(碱基数)，通常为10～50碱基，优选10～35碱基，更优选15～35碱基，特别优选20～30碱基。
作为本发明的引物对，具体而言，例如，在将人来源的FOXB2基因的启动子区域中由序列号1所表示的碱基序列构成的区域设定为分析对象区域的情况下，作为正向引物，优选由序列号2所表示的碱基序列构成的引物，作为反向引物，优选由序列号3所表示的碱基序列构成的引物。在将人来源的FOXB2基因的启动子区域中由序列号11所表示的碱基序列构成的区域设定为分析对象区域的情况下，作为正向引物，优选由序列号12所表示的碱基序列构成的引物，作为反向引物，优选由序列号13所表示的碱基序列构成的引物。另外，在将犬来源的FOXB2基因的启动子区域中由序列号4所表示的碱基序列构成的区域设定为分析对象区域的情况下，作为正向引物，优选由序列号5所表示的碱基序列构成的引物，作为反向引物，优选由序列号6所表示的碱基序列构成的引物。
以下，示出构成上述引物对的各引物的碱基序列、名称和利用引物对所扩增的区域。
【表1】
另外，本发明的引物对优选直接使用本发明的引物对，但也可以是由利用标记物质对正向引物或反向引物中的任一者或两者进行了标记的引物构成的引物对。
作为利用标记物质对本发明的引物进行标记的方法，没有特别限制，基于自身公知的方法进行即可。
作为为了利用标记物质对本发明的引物进行标记而使用的标记物质，可以举出荧光物质、放射性同位素、酶和发光物质等公知的标记物质，特别优选荧光物质。
例如，作为荧光物质，可以举出TAMRATM(Sigma Aldrich公司制造)、Alexa555、Alexa647(Invitrogen公司制造)、花青染料系的Cy3、Cy5(Amersham Biosciences公司制造)、荧光素等。
作为放射性同位素，可以举出32P、33P、35S等。
作为酶，可以举出碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等。
作为发光物质，可以举出包含吖啶酯的化学发光试剂等。
作为利用荧光物质对本发明的引物进行标记的方法，例如可以举出基于自身公知的方法将荧光素标记的核苷酸引入引物中的方法。另外，通过将具有连接臂的核苷酸置换到序列的寡核苷酸中的方法(参照Nucleic Acids Res.,1986年、第14卷、p.6115)，也能够利用荧光物质对核苷酸进行标记。例如有下述方法：利用日本特开昭60-500717号公报中公开的合成法，由脱氧尿苷化学合成在5位具有连接臂的尿苷，合成含有该脱氧尿苷的寡核苷酸，接着将荧光物质导入该寡核苷酸链中(日本特开昭60-500717号公报)。
作为利用放射性同位素对本发明的引物进行标记的方法，可以举出：在合成引物时引入利用放射性同位素进行了标记的核苷酸，由此对引物进行标记的方法；在合成引物后利用放射性同位素进行标记的方法；等等。具体而言，可以举出通常使用的随机引物法、切口平移法、利用T4多核苷酸激酶的5’端标记法、利用末端脱氧核苷酸转移酶的3’端标记法等。
作为利用酶对本发明的引物进行标记的方法，可以举出使碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等酶分子与待标记的引物直接进行共价结合等直接标记法。
作为利用发光物质对本发明的引物进行标记的方法，可以举出基于自身公知的方法对核苷酸进行发光标记的方法。
另外，也可以根据“利用了生物素-亲和素反应的检测系统”使上述标记物质与本发明的引物结合，该情况下，基于自身公知的方法进行即可。
上述PCR法中的探针(下文中有时简记为本发明的探针)按照在利用本发明的引物对进行本发明的扩增方法时与被扩增的区域杂交的方式进行设计，只要其5’端被报告荧光色素标记、3’端被猝灭荧光色素标记，则可以为任意的探针。
作为本发明的探针的大小(碱基数)，通常为10～50碱基，优选15～40碱基，更优选20～30碱基。
作为本发明的探针，具体而言，例如在将人来源的FOXB2基因的启动子区域中由序列号11所表示的碱基序列构成的区域设定为分析对象区域的情况下，优选由序列号14所表示的碱基序列构成的探针。
以下示出上述探针的碱基序列和名称。
【表2】
探针 名称 序列号
cacagaatct ctccgcactc cgttc hcf-Probe-fox 14
作为用报告荧光色素标记本发明的探针的5’端、用猝灭荧光色素标记3’端的方法，与利用标记物质对上述本发明的引物对进行标记的方法相同。
作为为了利用报告荧光色素和猝灭荧光色素对本发明的探针进行标记而使用的报告荧光色素，可以举出FAM、HEX、VIC等，作为猝灭荧光色素，可以举出TAMRA、BHQ1、BHQ2等。
需要说明的是，在使用由序列号14所表示的碱基序列构成的探针作为本发明的探针的情况下，作为报告荧光色素优选FAM，作为猝灭荧光色素优选BHQ1。
另外，作为上述PCR法中的核酸合成酶，可以举出Taq DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶等，作为核酸合成底物，可以举出dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dGTTP)等，作为缓冲液，可以举出Tris缓冲液、磷酸缓冲液等，只要是通常在该领域中使用的物质均可。
此外，在上述PCR用反应液中可以包含MgCl2、KCl、(NH4)2SO4等盐、聚乙二醇、Triton(Union Carbide公司制造)、Nohidet(壳牌化学公司制造)、CHAPS(株式会社同仁化学制造)等表面活性剂、ProClin 300(Sigma Aldrich公司制造)等防腐剂、HapII、HpaII、SacII等甲基化敏感性限制酶等。
通过如此进行本发明的步骤2，能够特异性地扩增未被本发明的步骤1中的甲基化敏感性限制酶切断而残存的甲基化的分析对象区域。
[纯化步骤]
本发明的纯化步骤是对DNA进行纯化的步骤。
由此，能够在接下来进行的处理或步骤之前将杂质除去，因而优选进行该纯化步骤。
在进行本发明的纯化步骤的情况下，在本发明的步骤1之后且在本发明的步骤2之前、或/和在后述的[利用在分析对象区域内不存在识别序列的限制酶进行处理的片段化步骤]之后且在本发明的步骤1之前进行该纯化步骤即可。
需要说明的是，作为在本发明的步骤1之后且在本发明的步骤2之前进行该纯化步骤的情况，可以举出下述情况。
(i)在本发明的步骤1中同时进行利用S1核酸酶的处理和利用甲基化敏感性限制酶的处理的情况下，在这些处理之后且在本发明的步骤2之前进行纯化步骤即可。
(ii)在本发明的步骤1中在利用S1核酸酶的处理之后进行利用甲基化敏感性限制酶的处理的情况下，在利用S1核酸酶的处理之后或/和甲基化敏感性限制酶处理之后且在本发明的步骤2之前进行纯化步骤即可，优选至少在利用S1核酸酶的处理之后(且在利用甲基化敏感性限制酶的处理之前)进行纯化步骤。
(iii)在本发明的步骤1中在利用甲基化敏感性限制酶的处理之后进行利用S1核酸酶的处理的情况下，在利用甲基化敏感性限制酶的处理之后或/和利用S1核酸酶的处理之后且在本发明的步骤2之前进行纯化步骤即可，优选在利用甲基化敏感性限制酶的处理之后和利用S1核酸酶的处理之后且在本发明的步骤2之前分别进行纯化步骤。
本发明的步骤1中的利用S1核酸酶的处理与本发明的步骤1中的利用甲基化敏感性限制酶的处理和本发明的步骤2中的优选的pH不同。因此，在上述(ii)的情况下，通过在利用S1核酸酶的处理之后接着实施该纯化步骤，能够在除去杂质的同时调整pH，高效地进行本发明的步骤1中的甲基化敏感性限制酶的反应。
另外，在上述(iii)的情况下，通过在利用甲基化敏感性限制酶的处理和利用S1核酸酶的处理后接着实施该纯化步骤，能够在除去杂质的同时调整pH，能够高效地进行本发明的步骤2。
本发明的纯化步骤只要是通常在该领域中进行的自身公知的纯化方法，则没有特别限制。具体而言，例如可以举出醇沉淀法、柱纯化法等，从能够应用于高通量的方面出发，更优选柱纯化法。
醇沉淀法是指下述方法：利用作为亲水性高分子的DNA的性质，向含DNA溶液中添加醇，使DNA沉淀，由此对DNA进行纯化。在利用醇沉淀法进行纯化的情况下，例如如下进行即可。
即，向10～100μL含DNA溶液中加入50～100μL醇和30～100μL缓冲液，以10000～22000×g离心分离1～30分钟，回收穿柱液，由此得到纯化的DNA。
作为上述醇，可以举出异丙醇、乙醇、丁醇等，更优选异丙醇或乙醇，进一步优选异丙醇。
作为上述缓冲液，可以举出Tris缓冲液、磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液等，更优选Tris缓冲液或磷酸缓冲液，进一步优选Tris缓冲液。需要说明的是，上述缓冲液的浓度、pH只要是通常在该领域中使用的范围即可。
另外，上述纯化方法可以使用市售的试剂盒进行。
柱纯化法是指下述方法：向内部具备硅胶、聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酰胺葡聚糖等填充剂的柱等筒状容器[例如，EconoSpin(GeneDesign Inc.制造)、Mobi Spin S-4000(Molecular Biotechnology公司制造)等]中添加含DNA溶液，利用DNA与填充剂的亲和性的差异对DNA进行纯化。在利用柱纯化法进行纯化的情况下，例如如下进行即可。
即，向10～150μL含DNA溶液中加入200～700μL蛋白变性剂或/和200～700μL缓冲液并混合，例如移至填充有填充剂的柱[例如，EconoSpin(GeneDesign Inc.制造)]中，以10000～22000×g在室温下离心分离1～3分钟，除去管内的溶液。接着，加入500～700μL缓冲液和500～700μL醇，以10000～22000×g在室温下离心分离1～3分钟，除去管内的溶液。进而，以10000～22000×g在室温下离心分离1～10分钟，更换至新的管中，加入20～60μL缓冲液或灭菌水，以10000～22000×g在室温下离心分离1～3分钟，回收穿柱液，由此得到纯化的DNA。
作为上述蛋白变性剂，可以举出盐酸胍、甲酰胺、尿素等，更优选盐酸胍。
作为上述醇，可以举出乙醇、异丙醇、丁醇等，更优选乙醇或异丙醇，进一步优选乙醇。
作为上述缓冲液，可以举出Tris缓冲液、磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液等，更优选Tris缓冲液或磷酸缓冲液，进一步优选Tris缓冲液。需要说明的是，上述缓冲液的浓度、pH为通常在该领域中使用的范围即可。
另外，上述纯化方法可以使用市售的试剂盒进行。
[利用在分析对象区域内不存在识别序列的限制酶进行处理的片段化步骤]
本发明的扩增方法中，优选在从试样中提取出包含分析对象区域的DNA后，进行利用在分析对象区域内不存在识别序列的限制酶进行处理的片段化步骤(下文中有时简记为本发明的片段化步骤)。特别是，在将存在于血清、血浆、尿等体液中的CTC来源的DNA的特定区域、cfDNA的特定区域或外泌体(Exosome)来源的DNA的特定区域设定为分析对象区域的情况下，优选进行该片段化步骤。另外，在进行本发明的片段化步骤的情况下，在进行本发明的步骤1之前进行该片段化步骤即可。
本发明的片段化步骤中的限制酶只要可切断双链DNA且其识别序列不存在于分析对象区域内，则可以为任意的限制酶，根据分析对象区域适当选择即可。此外，本发明的片段化步骤中的限制酶可以根据需要使用两种以上。
上述“其识别序列不存在于分析对象区域内”与“限制酶的识别序列无法切断分析对象区域”或“限制酶不识别分析对象区域中的碱基序列”表示相同含义。
作为本发明的片段化步骤中的限制酶，在将人来源的FOXB2基因的启动子区域中由序列号1所表示的碱基序列构成的区域或犬来源的FOXB2基因的启动子区域中由序列号4所表示的碱基序列构成的区域设定为分析对象区域的情况下，优选使用BamHI或/和HindIII。另外，在将人来源的FOXB2基因的启动子区域中由序列号11所表示的碱基序列构成的区域设定为分析对象区域的情况下，优选使用MboI。
本发明的片段化步骤中的限制酶的浓度(单位数)通常相对于1～200ng目标DNA为0.5～30单位/μL，优选1～25单位/μL。另外，在使用多种限制酶进行处理的情况下，本发明的片段化步骤中的限制酶的浓度(单位数)也与上述相同，分别通常为0.5～30单位/μL，优选1～25单位/μL。
本发明的片段化步骤中的利用限制酶的处理通常在20～50℃、优选在35～40℃进行通常60～150分钟、优选60～120分钟反应即可。
另外，本发明的片段化步骤优选在pH6～8的条件下进行，作为此处使用的缓冲液，例如使用Tris缓冲液等即可。
需要说明的是，如上所述，本发明的片段化步骤与本发明的步骤1中的利用甲基化敏感性限制酶的处理中的优选pH相同。因此，除了本发明的步骤1中的利用甲基敏感性限制酶的处理外，可以与本发明的片段化步骤中的利用限制酶的处理同时进行利用甲基化敏感性限制酶的处理。
通过如此进行本发明的片段化步骤，能够将DNA中的分析对象区域的外侧的DNA片段化，因而能够高效地进行后续进行的步骤的反应。
需要说明的是，在该片段化步骤之后，可以进行上述纯化步骤。
[本发明的扩增方法的具体例]
关于本发明的扩增方法的具体例，以下分成(A)将存在于血清、血浆、尿等体液中的DNA的特定区域设定为分析对象区域的情况、(B)将存在于组织、细胞、全血、尿等中的DNA的特定区域设定为分析对象区域的情况来进行说明。
(A)将存在于血清、血浆、尿等体液中的DNA的特定区域(例如，由序列号11所表示的碱基序列构成的区域)设定为分析对象区域的情况
(1)DNA的提取
例如，利用核酸提取试剂盒[例如，NucleoSpin(商标)Plasma XS(MACHEREY-NAGEL公司制造)或MagMAXTM游离DNA分离试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司制造)]，从试样(例如，血浆)中提取DNA(例如，cfDNA)。
(2)本发明的片段化步骤
向上述(1)中得到的DNA中加入5～15μL本发明的片段化步骤中的缓冲液(例如，Tris缓冲液)和0.5～5μL 0.5～30单位/μL的片段化步骤中的限制酶(例如，MboI)，利用灭菌水制备成50～100μL。需要说明的是，优选包含0.5～5μL 1～50单位/μL的甲基化敏感性限制酶(例如，HapII或HpaII)。
之后，在20～50℃反应60～150分钟，得到本发明的片段化步骤中处理后的溶液。
进而，根据需要，可以将本发明的片段化步骤中处理后的溶液如下付之于本发明的纯化步骤。
即，向上述本发明的片段化步骤中处理后的溶液中加入500～700μL蛋白变性剂(例如，盐酸胍)和500～700μL pH5～8的缓冲液(例如，Tris缓冲液)并混合，例如移至填充有填充剂的柱[例如，EconoSpin(GeneDesign Inc.制造)]中，以10000～22000×g在室温下离心分离1～3分钟，除去管内的溶液。之后，加入500～700μL pH5～8的缓冲液(例如，Tris缓冲液)和500～700μL醇(例如，乙醇)，以10000～22000×g在室温下离心分离1～5分钟，除去管内的溶液。再重复一次该操作，进而以10000～22000×g在室温下离心分离1～5分钟后，更换至新的管中，加入20～60μL灭菌水，以10000～22000×g在室温下离心分离1～3分钟，回收穿柱液。
将上述得到的本发明的片段化步骤中处理后的溶液或穿柱液付之于本发明的步骤1。
(3)本发明的步骤1
(3)-1利用S1核酸酶的处理
向40～60μL上述本发明的片段化步骤中处理过的溶液或穿柱液中加入20～50μL灭菌水、5～15μL本发明的步骤1中的缓冲液(例如，乙酸钠缓冲液)和0.5～1.5μL1～200单位/μL的S1核酸酶，在10～37℃反应10～20分钟，得到本发明的步骤1(利用S1核酸酶的处理)中处理后的溶液。
进而，根据需要，可以将本发明的步骤1(利用S1核酸酶的处理)中处理后的溶液如下付之于本发明的纯化步骤。
即，向上述本发明的步骤1(利用S1核酸酶的处理)中处理后的溶液中加入500～700μL蛋白变性剂(例如，盐酸胍)和500～700μL pH5～8的缓冲液(例如，Tris缓冲液)并混合，例如移至填充有填充剂的柱[例如，EconoSpin(GeneDesign Inc.制造)]中，以10000～22000×g在室温下离心分离1～3分钟，除去管内的溶液。之后，加入500～700μL pH5～8的缓冲液(例如，Tris缓冲液)和500～700μL醇(例如，乙醇)，以10000～22000×g在室温下离心分离1～5分钟，除去管内的溶液。再重复一次该操作后，进一步以10000～22000×g在室温下离心分离1～5分钟后，更换至新的管中，加入20～60μL灭菌水，以10000～22000×g在室温下离心分离1～3分钟，回收穿柱液。
将上述得到的本发明的步骤1(利用S1核酸酶的处理)中处理后的溶液或穿柱液付之于本发明的步骤1(利用甲基化敏感性限制酶的处理)。
(3)-2利用甲基化敏感性限制酶的处理
向40～60μL上述本发明的步骤1(利用S1核酸酶的处理)中处理后的溶液或穿柱液中加入20～50μL灭菌水、5～15μL本发明的步骤1中的缓冲液(例如，Tris缓冲液)和1～5μL1～50单位/μL的甲基化敏感性限制酶(例如，HapII或HpaII)，在20～50℃反应60～150分钟，得到本发明的步骤1(利用甲基化敏感性限制酶的处理)中处理后的溶液。
进而，根据需要，可以将本发明的步骤1(利用甲基化敏感性限制酶的处理)中处理后的溶液如下付之于本发明的纯化步骤。
即，向上述本发明的步骤1(利用甲基化敏感性限制酶的处理)中处理后的溶液中加入500～700μL蛋白变性剂(例如，盐酸胍)和500～700μL pH5～8的缓冲液(例如，Tris缓冲液)并混合，例如移至填充有填充剂的柱[例如，EconoSpin(GeneDesign Inc.制造)]中，以10000～22000×g在室温下离心分离1～3分钟，除去管内的溶液。之后，加入500～700μLpH5～8的缓冲液(例如，Tris缓冲液)和500～700μL醇(例如，乙醇)，以10000～22000×g在室温下离心分离1～5分钟，除去管内的溶液。再重复一次该操作，进一步以10000～22000×g在室温下离心分离1～5分钟后，更换至新的管中，加入20～60μL灭菌水，以10000～22000×g在室温下离心分离1～3分钟，回收穿柱液。
将上述得到的本发明的步骤1(利用甲基化敏感性限制酶的处理)中处理后的溶液或穿柱液付之于本发明的步骤2。
(4)本发明的扩增方法的步骤2
向1～3μL上述本发明的步骤1中处理后的溶液或穿柱液中加入4～6μL灭菌水、5～12μL包含核酸合成底物、核酸合成酶等的数字PCR用试剂[例如，ddPCRTMSupermix forProbes(Bio-Rad Laboratories公司制造)]、0.5～1.5μL 1～20μM的正向引物(例如，hcf-F-fox)、0.5～1.5μL 1～20μM的反向引物(例如，hcf-R-fox)、0.5～1μL 1～10μM的探针(例如，hcf-Probe fox)和0.5～1.5μL 1～50单位/μL的甲基化敏感性限制酶(例如，HapII或HpaII)，制备数字PCR用反应液。接着，将上述数字PCR用反应液设置于核酸扩增装置[例如，热循环仪(Bio-Rad公司制造)]中，在30～40℃温育30～60分钟。之后，利用液滴制作装置[例如，QX 200液滴发生器(Bio-Rad Laboratories公司制造)或自动化液滴发生器(Bio-Rad Laboratories公司制造)]制作液滴。接着，将该液滴分注至微孔板(例如，96孔板)中后，利用核酸扩增装置[例如，热循环仪(Bio-Rad公司制造)]在90～97℃加热5～15分钟，之后以(1)90～95℃下25～30秒、(2)60～65℃下30～90秒作为1个循环，加热30～50个循环，由此能够扩增甲基化的分析对象区域(例如，由序列号11所表示的碱基序列构成的区域)。
(B)将存在于组织、细胞、全血、尿等中的DNA的特定区域(例如，由序列号1所表示的碱基序列构成的区域)设定为分析对象区域的情况
(1)DNA的提取
例如，利用核酸提取试剂盒[例如，QuickGene SP组织DNA提取试剂盒(仓敷纺绩株式会社制造)]，从试样(例如，细胞)中提取DNA(例如，基因组DNA)。
(2)本发明的片段化步骤
向上述(1)中得到的DNA中加入3～7μL本发明的片段化步骤中的缓冲液(例如，Tris缓冲液)和0.5～1.5μL 0.5～25单位/μL的片段化步骤中的限制酶(例如，BamHI或/和HindIII)，用灭菌水制备成30～60μL。之后，在20～50℃反应40～80分钟，得到本发明的片段化步骤中处理后的溶液。
进而，根据需要，可以将本发明的片段化步骤中处理后的溶液如下付之于本发明的纯化步骤。
即，向上述本发明的片段化步骤中处理后的溶液中加入200～300μL蛋白变性剂(例如，盐酸胍)和200～300μL pH5～8的缓冲液(例如，Tris缓冲液)并混合，例如移至填充有填充剂的柱[例如，EconoSpin(GeneDesign Inc.制造)]中，以10000～22000×g在室温下离心分离1～3分钟，除去管内的溶液。之后，加入500～700μL pH5～8的缓冲液(例如，Tris缓冲液)和500～700μL醇(例如，乙醇)，以10000～22000×g在室温下离心分离1～5分钟，更换至新的管中，加入20～40μL缓冲液(例如，Tris缓冲液)，以10000～22000×g在室温下离心分离1～3分钟，回收穿柱液。
将上述得到的本发明的片段化步骤中处理后的溶液或穿柱液付之于本发明的步骤1。
(3)本发明的步骤1
(3)-1利用S1核酸酶的处理
向20～40μL上述本发明的片段化步骤中处理后的溶液或穿柱液中加入15～25μL灭菌水、2～6μL本发明的步骤1中的缓冲液(例如，乙酸钠缓冲液)和0.5～1.5μL1～200单位/μL的S1核酸酶，在10～37℃反应10～20分钟。之后，加入0.5～1.5μL反应停止液(例如，0.5M EDTA)，用25～35μL的缓冲液(例如，Tris缓冲液)溶出，得到本发明的步骤1(利用S1核酸酶的处理)中处理后的溶液。
进而，根据需要，可以将本发明的步骤1中处理后的溶液如下付之于本发明的纯化步骤。
即，向10～20μL上述本发明的步骤1(利用S1核酸酶的处理)中处理后的溶液中加入200～300μL蛋白变性剂(例如，盐酸胍)和200～300μL pH5～8的缓冲液(例如，Tris缓冲液)并混合，例如移至填充有填充剂的柱[例如，EconoSpin(GeneDesign Inc.制造)]中，以10000～22000×g在室温下离心分离1～3分钟，除去管内的溶液。之后，加入500～700μLpH5～8的缓冲液(例如，Tris缓冲液)和500～700μL醇(例如，乙醇)，以10000～22000×g在室温下离心分离1～5分钟，更换至新的管中，加入20～40μL缓冲液(例如，Tris缓冲液)，以10000～22000×g在室温下离心分离1～3分钟，回收穿柱液。
将上述得到的本发明的步骤1(利用S1核酸酶的处理)中处理后的溶液或穿柱液付之于本发明的步骤1(利用甲基化敏感性限制酶的处理)。
(3)-2利用甲基化敏感性限制酶的处理
向20～30μL上述本发明的步骤1(利用S1核酸酶的处理)中处理后的溶液或穿柱液中加入5～15μL灭菌水、2～6μL本发明的步骤1中的缓冲液(例如，Tris缓冲液)和0.5～1.5μL 1～50单位/μL的甲基化敏感性限制酶(例如，HapII、HpaII或SacII)，在20～50℃反应60～150分钟，得到本发明的步骤1(利用甲基化敏感性限制酶的处理)中处理后的溶液。
进而，根据需要，可以将本发明的步骤1(利用甲基化敏感性限制酶的处理)中处理后的溶液如下付之于本发明的纯化步骤。
即，向上述本发明的步骤1(利用甲基化敏感性限制酶的处理)中处理后的溶液中加入200～300μL蛋白变性剂(例如，盐酸胍)和200～300μL pH5～8的缓冲液(例如，Tris缓冲液)并混合，例如移至填充有填充剂的柱[例如，EconoSpin(GeneDesign Inc.制造)]中，以10000～22000×g在室温下离心分离1～3分钟，除去管内的溶液。之后，加入500～700μLpH5～8的缓冲液(例如，Tris缓冲液)和500～700μL醇(例如，乙醇)，以10000～22000×g在室温下离心分离1～5分钟，更换至新的管中，加入20～40μL缓冲液(例如，Tris缓冲液)，以10000～22000×g在室温下离心分离1～3分钟，回收穿柱液。
将上述得到的本发明的步骤1(利用甲基化敏感性限制酶的处理)中处理后的溶液或穿柱液付之于本发明的步骤2。
(4)本发明的步骤2
向0.5～1.5μL上述本发明的步骤1中处理后的溶液或穿柱液中加入15～20μL灭菌水、2～3μL PCR反应用缓冲液(例如，Tris缓冲液)、1.5～2.5μL核酸合成底物、0.1～0.3μL1～10单位/μL的核酸合成酶、0.5～1.5μL 5～15μM的正向引物(例如，h-F-fox)和0.5～1.5μL 5～15μM的反向引物(例如，h-R-fox)，制备PCR用反应液。接着，利用核酸扩增装置[例如，热循环仪(Bio-Rad Laboratories公司制造)]在92～96℃加热1～3分钟后，以(1)92～98℃下2～10秒、(2)65～72℃下10～20秒作为1个循环，加热30～60个循环后，进一步在65～72℃加热50～70秒，由此能够扩增甲基化的分析对象区域(例如，由序列号1所表示的碱基序列构成的区域)。
将本发明的扩增方法的流程图分成各种模式示于图1。作为本发明的扩增方法，可以举出模式1～5的方法，更优选模式1～3，进一步优选模式1或2，特别优选模式1。
<本发明的甲基化判定方法>
本发明的甲基化判定方法基于利用本发明的扩增方法得到的结果来判定分析对象区域是否被甲基化。
即，该甲基化判定方法是在上述本发明的扩增方法之后接着进行扩增产物的确认和判定分析对象区域是否被甲基化的方法，其特征在于，包括：(1)利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶进行处理的步骤1；(2)对步骤1中处理后的双链DNA的分析对象区域进行扩增的步骤2；(3)确认步骤2中得到的扩增产物的有无的步骤3；(4)基于步骤3的结果来判定分析对象区域是否被甲基化的步骤4。
需要说明的是，至获得扩增产物为止的步骤3之前的步骤(步骤1和2)与上述本发明的扩增方法相同，其具体例、优选例等也相同。下面，对步骤3之后进行详细说明。
[步骤3]
本发明的步骤3是确认本发明的步骤2中得到的扩增产物的有无的步骤。即，在本发明的步骤2中，甲基化的分析对象区域被扩增，因而，本发明的步骤3是确认该甲基化的分析对象区域的有无的步骤。
本发明的步骤3中的确认扩增产物的有无的方法只要是通常在该领域中进行的方法，则没有特别限制，基于自身公知的方法进行即可。
具体而言，例如可以举出(a)通过电泳来确认的方法；(b)通过荧光酶标仪来确认的方法；等等。
(a)通过电泳来确认的方法
通过电泳来确认的方法是指通过电泳来分离、确认本发明的步骤2中得到的扩增产物的方法，作为具体方法，可以举出(a-1)标记引物法、(a-2)嵌入剂法、(a-3)标记探针法等。
(a-1)标记引物法
标记引物法是指下述方法：“使用包含利用标记物质对本发明的引物中的至少一者进行了标记的标记引物的引物对，进行本发明的步骤2。接着，通过电泳将所得到的扩增产物分离，对该扩增产物中的标记进行检测，由此确认本发明的步骤2中得到的扩增产物的有无”。
需要说明的是，本说明书中，“对标记进行检测”是指，基于标记物质的性质直接或间接地测定标记物质。
作为标记引物法中的电泳，只要基于依赖于物质的带电强度而以不同速度移动或移动不同距离的方法即可，具体而言，例如可以举出琼脂糖凝胶电泳法、丙烯酰胺凝胶电泳法、毛细管电泳法等，更优选琼脂糖凝胶电泳法或毛细管电泳法。
需要说明的是，上述琼脂糖凝胶电泳法例如基于“バイオ実験イラステッドII遺伝子解析の基礎(生物实验图解II基因分析的基础),2006,p.p.53-56”中记载的方法进行即可。另外，上述毛细管电泳法例如基于WO2007/027495、WO2011/118496、WO2008/075520等中记载的方法进行即可。
(a-2)嵌入剂法
嵌入剂法是指下述方法：“使用本发明的引物对进行本发明的步骤2，通过电泳将所得到的扩增产物分离。接着，利用嵌入剂将该扩增产物染色，对该嵌入剂来源的荧光进行检测，由此确认本发明的步骤2中得到的扩增产物的有无”。
作为嵌入剂法中的电泳，可以举出与(a-1)标记引物法相同的电泳，优选的电泳也相同。
另外，作为嵌入剂法中的嵌入剂，只要是通常在该领域中使用的嵌入剂，则可以为任意的嵌入剂。具体而言，例如可以举出(1)～(5)的嵌入剂以及下述(6)和(7)的嵌入剂类似物质。
可以举出：
(1)乙锭化合物[例如，溴化乙锭、乙锭均二聚物1(EthD-1)、乙锭均二聚物2(EthD-2)、溴化乙锭单叠氮溴(EMA)、二氢乙锭等]、
(2)吖啶色素(例如，吖啶橙等)、
(3)碘化合物(碘化丙啶、碘化己锭等)、花青二聚物系色素[例如，POPO-1、BOBO-1、YOYO-1、TOTO-1、JOJO-1、POPO-3、LOLO-1、BOBO-3、YOYO-3、TOTO-3(均为Molecular Probes公司制造)等]、
(4)花青单体系色素[例如，PO-PRO-1、BO-PRO-1、YO-PRO-1、TO-PRO-1、JO-PRO-1、PO-PRO-3、LO-PRO-1、BO-PRO-3、YO-PRO-3、TO-PRO-3、TO-PRO-5(均为Molecular Probes公司制造)等]、
(5)SYTOX系色素[例如，SYBR金、SYBR绿I、SYBR绿II、SYTOX绿、SYTOX蓝、SYTOX橙(均为Molecular Probes公司制造)等]、GelRed系色素[例如，GelRed核酸凝胶染色液(和光纯药工业株式会社制造)等]、
(6)与DNA双螺旋的小沟结合的物质[例如，4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI：Molecular Probes公司制造)等]、
(7)与腺嘌呤-胸腺嘧啶(A-T)序列特异性地结合的物质[例如，五水合物(双苯酰亚胺)(Hoechst 33258：Molecular Probes公司制造)、三盐酸盐(Hoechst 33342：Molecular Probes公司制造)、双苯酰亚胺色素(Hoechst 34580：Molecular Probes公司制造)等]。其中，更优选SYTOX系色素[例如，SYBR金、SYBR绿I、SYBR绿II、SYTOX绿、SYTOX蓝、SYTOX橙(均为Molecular Probes公司制造)等]、GelRed系色素[例如，GelRed核酸凝胶染色液(和光纯药工业株式会社制造)等]，特别优选GelRed系色素[例如，GelRed核酸凝胶染色液(和光纯药工业株式会社制造)等]。
(a-3)标记探针法
标记探针法是指下述方法：“使用本发明的引物对进行本发明的步骤2，通过电泳将所得到的扩增产物分离。接着，对该扩增产物进行热处理，由此形成单链。接着，使利用标记物质进行了标记的、具有与该扩增产物的碱基序列互补的碱基序列的探针进行杂交，由此得到杂交体，对该杂交体中的标记进行检测，由此确认本发明的步骤2中得到的扩增产物的有无”。
作为标记探针中的电泳，可以举出与(a-1)标记引物法相同的电泳，优选的电泳也相同。
(b)通过荧光酶标仪来检测的方法
通过荧光酶标仪来检测的方法是指下述方法：“进行使用本发明的引物对和探针的本发明的步骤2，之后，利用荧光酶标仪对各液滴来源的荧光进行检测，由此确认本发明的步骤2中得到的扩增产物的有无”。
作为通过荧光酶标仪来检测的方法中的荧光酶标仪，使用数字PCR装置附带的荧光酶标仪[例如，QX200Droplet Reader(Bio-Rad Laboratories公司制造)等]即可。
通过如此进行本发明的步骤3，能够确认甲基化的分析对象区域是否被扩增。
[步骤4]
本发明的甲基化判定方法的步骤4是基于本发明的步骤3的结果来判定分析对象区域是否被甲基化的步骤。
即，本发明的分析对象区域是否被甲基化的判定基于本发明的步骤2中所扩增的扩增产物的有无的确认结果来进行。在分析对象区域被甲基化的情况下，在本发明的步骤2中，该分析对象区域被扩增，因而得到扩增产物。另一方面，在分析对象区域未被甲基化的情况下，在本发明的步骤2中，该分析对象区域未被扩增，因而未得到扩增产物。这是由本发明的步骤1中的甲基化敏感性限制酶的性质决定的。
即，在分析对象区域被甲基化的情况下，即使利用甲基化敏感性限制酶进行处理，分析对象区域也不被切断，因而，在本发明的步骤2的扩增反应中分析对象区域被扩增，在本发明的步骤3中确认到扩增产物。
另一方面，在分析对象区域未被甲基化的情况下，分析对象区域被甲基化敏感性限制酶切断，因而，在本发明的步骤2中分析对象区域不被扩增，在本发明的步骤3中未确认到扩增产物。
因此，在本发明的步骤3中进行(a)通过电泳来确认的方法的情况下，(i)在确认到扩增产物的情况下，可以判定该分析对象区域被甲基化，(ii)在未确认到扩增产物的情况下，可以判定该分析对象区域未被甲基化。
另一方面，在本发明的步骤3中进行(b)通过荧光酶标仪来确认的方法的情况下，(i)在确认到至少1个发出超过预先设定的阈值的荧光的液滴的情况下，可以判定该分析对象区域被甲基化，(ii)在未确认到发出超过预先设定的阈值的荧光的液滴的情况下，可以判定该分析对象区域未被甲基化。
需要说明的是，关于上述阈值，可以根据上述荧光酶标仪[例如，QX200DropletReader(Bio-Rad Laboratories公司制造)]的阈值设定功能来决定，也可以由对分析对象区域进行扩增的结果来决定。
通过如此进行本发明的甲基化判定方法的步骤4，能够进行分析对象区域是否被甲基化的判定。
另外，本发明的甲基化判定方法通过如上确认扩增产物的有无，能够判定分析对象区域是否被甲基化，因此是非常简便的方法。
[本发明的甲基化判定方法的具体例]
关于本发明的甲基化判定方法的具体例，以下分成(A)将存在于血清、血浆、尿等体液中的DNA的特定区域设定为分析对象区域的情况、(B)将存在于组织、细胞、全血、尿等中的DNA的特定区域设定为分析对象区域的情况来进行说明。
(A)将存在于血清、血浆、尿等体液中的DNA的特定区域(例如，由序列号11所表示的碱基序列构成的区域)设定为分析对象区域的情况
关于(1)DNA的提取、(2)本发明的片段化步骤、(3)本发明的步骤1和(4)本发明的步骤2，如[本发明的扩增方法的具体例]中所说明的那样。
(5)本发明的步骤3
利用荧光酶标仪[例如，QX200Droplet Reader(Bio-Rad Laboratories公司制造)等]，对各液滴中的上述本发明的步骤2中所扩增的扩增产物中的荧光进行检测，由此能够确认上述本发明的步骤2中扩增的扩增产物的有无。
(6)本发明的甲基化判定方法的步骤4
上述本发明的步骤3的扩增产物有无的确认结果，在确认到至少1个发出超过预先设定的阈值的荧光的液滴的情况下，可以判定“该分析对象区域被甲基化”。另一方面，在未确认到发出超过预先设定的阈值的荧光的液滴的情况下，可以判定“该分析对象区域未被甲基化”。
(B)将存在于组织、细胞、全血、尿等中的DNA的特定区域设定为分析对象区域(例如，由序列号1所表示的碱基序列构成的区域)的情况
关于(1)DNA的提取、(2)本发明的片段化步骤、(3)本发明的步骤1和(4)本发明的步骤2，如[本发明的扩增方法的具体例]中所说明的那样。
(5)本发明的步骤3
将上述本发明的步骤2中所扩增的扩增产物与分子量标志物一起付之于0.5～5％的琼脂糖凝胶电泳。接着，利用嵌入剂[例如，GelRed核酸凝胶染色液(和光纯药工业株式会社制造)等]进行染色后，照射UV，对扩增产物进行检测，由此能够确认上述本发明的步骤2中所扩增的扩增产物的有无。
(6)本发明的甲基化判定方法的步骤4
上述本发明的步骤3的扩增产物有无的确认结果，在确认到扩增产物的情况下，可以判定“该分析对象区域被甲基化”。另一方面，在未确认到扩增产物的情况下，可以判定“该分析对象区域未被甲基化”。
将本发明的甲基化判定方法的流程图分成各种模式示于图2。作为本发明的甲基化判定方法，可以举出模式1～5的方法，更优选模式1～3，进一步优选模式1或2，特别优选模式1。
需要说明的是，在进行了本发明的甲基化判定方法后，可以根据需要进行亚硫酸氢盐序列分析、微阵列分析等。由此，不仅可知本发明的分析对象区域是否被甲基化，还可知哪个CpG序列被甲基化。
<本发明的甲基化判定用试剂>
本发明的甲基化判定用试剂的特征在于，包含S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶。
本发明的甲基化判定用试剂中所用的甲基化敏感性限制酶的具体例和优选例如上所述。
此外，也可以加上在该领域中通常使用的下述试剂类中的任意1种而制成本发明的判定用试剂。
a)DNA纯化用的柱[例如，EconoSpin(GeneDesign Inc.制造)等]、
b)PCR等的扩增反应用试剂(例如，1种或多种引物、探针、核酸合成底物、核酸合成酶等)、
c)片段化用的限制酶、
d)核酸扩增产物确认用试剂[例如，琼脂糖凝胶、上样缓冲液、染色用试剂(GelRed系染色液、溴化乙锭等)]、
e)DNA提取用试剂[例如，QuickGene SP组织DNA提取试剂盒(仓敷纺绩株式会社制造)、NucleoSpin(商标)Plasma XS(MACHEREY-NAGEL公司制造)或MagMAXTM游离DNA分离试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司制造)等]。
另外，本发明的甲基化判定用试剂中也可以包含用于实施本发明的甲基化判定方法的说明书等。该“说明书”是指通过文章或图表等实质性地记载了本发明的甲基化判定方法中的特点、原理和操作步骤等的本发明的甲基化判定用试剂的操作说明书、附加文章或小册子(传单)等。
如此利用本发明的甲基化判定用试剂，能够简便、以短时间且高精度地进行本发明的甲基化判定方法。
<本发明的癌症的判定方法>
本发明的癌症的判定方法基于利用本发明的扩增方法得到的结果，对于进行是否为癌症的判定的对象做出癌症的判定。即，该癌症的判定方法是在上述本发明的扩增方法后接着进行确认扩增产物的步骤和判定癌症的步骤的方法，其特征在于，包括：(1)利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶对包含分析对象区域的DNA进行处理的步骤1；(2)对步骤1中处理后的双链DNA的分析对象区域进行扩增的步骤2；(3)确认步骤2中得到的扩增产物的有无的步骤3；(4)基于步骤3的结果对癌症进行判定的步骤4。
需要说明的是，至获得扩增产物为止的步骤3之前的步骤(步骤1～2)与上述本发明的扩增方法相同，其具体例、优选例等也相同。另外，进行扩增产物的确认的步骤3与上述本发明的甲基化判定方法相同，其具体例、优选例等也相同。
[癌症]
本发明的癌症的判定方法所涉及的癌症是指特征在于通过无法控制的细胞分裂和浸润向相邻组织直接增殖或转移等的疾病或疾患。作为通过本发明的判定方法判定的癌症的具体例，可以举出细胞癌、腺癌、淋巴瘤、白血病、肉瘤、间皮瘤、神经瘤、骨肉瘤、生殖细胞瘤、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胃肠癌、膀胱癌、胰腺癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、卵巢癌、黑色素瘤、脑癌、睾丸癌、肾癌、皮肤癌、甲状腺癌、头颈癌、肝癌、食道癌、胃癌、大肠癌、骨髄癌、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤等，更优选肺癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、胃癌或大肠癌。
[步骤4]
本发明的癌症的判定方法的步骤4是基于本发明的步骤3的结果进行癌症的判定的步骤。即，基于本发明的步骤2中所扩增的扩增产物的有无的确认结果来进行。
本发明的癌症的判定方法的步骤4中的癌症的判定使用由本发明的步骤1～3的结果得到的数据来进行。即，对本发明的步骤2中所扩增的目标扩增产物进行检测，在得到检测出该扩增产物的结果时，对于进行是否为癌症的判定的对象做出癌症的判定。
上述进行是否为癌症的判定的对象根据包含分析对象区域的DNA来源的试样来确定。
例如，在包含分析对象区域的DNA来源的试样为组织、细胞等的情况下，进行是否为癌症的判定的对象为该组织、细胞等自身、以及该组织、细胞等所来源的动物。即，在包含分析对象区域的DNA来源的试样为组织、细胞等的情况下，判定该组织、细胞等自身是否癌(化)，进而判定该组织、细胞等所来源的动物是否罹患癌症或该动物中是否存在癌细胞。
另一方面，在包含分析对象区域的DNA来源的试样为全血、血清、血浆、尿等体液的情况下，进行是否为癌症的判定的对象如下所述。
在包含分析对象区域的DNA来自上述全血、血清、血浆、尿等体液中的细胞(白细胞等血液细胞、各组织来源的细胞、CTC等)的情况下，为该细胞自身、以及该细胞所来源的动物。即，在包含分析对象区域的DNA来自全血、血清、血浆、尿等体液中的细胞(白细胞等血液细胞、各组织来源的细胞、CTC等)的情况下，判定该细胞自身是否癌(化)，进而判定该细胞所来源的动物是否罹患癌症或该动物中是否存在癌细胞。
另外，在包含分析对象区域的DNA来自上述血清、血浆、尿等体液中的cfDNA、外泌体(Exosome)等的情况下，进行是否为癌症的判定的对象为上述血清、血浆、尿等体液所来源的动物。即，在包含分析对象区域的DNA来自上述血清、血浆、尿等体液中的cfDNA、外泌体(Exosome)等的情况下，判定上述血清、血浆、尿等体液所来源的动物是否罹患癌症或该动物中是否存在癌细胞。
在进行是否为癌症的判定的对象罹患癌症或该对象中存在癌细胞的情况下，在本发明的步骤2中，该分析对象区域被扩增，因而获得扩增产物。另一方面，在进行是否为癌症的判定的对象未罹患癌症或该对象中不存在癌细胞的情况下，在本发明的步骤2中，该分析对象区域不被扩增，因而未检测出扩增产物。这是由本发明的步骤1中的甲基化敏感性限制酶的性质决定的。
即，在分析对象区域被甲基化的情况下，即使用甲基化敏感性限制酶进行处理，分析对象区域也不被切断，因而，在本发明的步骤2的扩增反应中分析对象区域被扩增，在本发明的步骤3中确认到扩增产物。
另一方面，在分析对象区域未被甲基化的情况下，分析对象区域被甲基化敏感性限制酶切断，因而，在本发明的步骤2中分析对象区域不被扩增，在本发明的步骤3中未确认到扩增产物。
因此，在本发明的步骤3中进行(a)通过电泳来确认的方法的情况下，(i)在确认到扩增产物的情况下，可以判定，进行是否为该分析对象区域来源的癌症的判定的对象罹患癌症或该对象中存在癌细胞，(ii)在未确认到扩增产物的情况下，可以判定，进行是否为该分析对象区域来源的癌症的判定的对象未罹患癌症或该对象中不存在癌细胞。
另一方面，在本发明的步骤3中进行(b)通过荧光酶标仪来确认的方法的情况下，(i)在确认到至少1个发出超过预先设定的阈值的荧光的液滴的情况下，可以判定，进行是否为该分析对象区域来源的癌症的判定的对象罹患癌症或该对象中存在癌细胞，(ii)在未确认到发出超过预先设定的阈值的荧光的液滴的情况下，可以判定，进行是否为该分析对象区域来源的癌症的判定的对象未罹患癌症或该对象中不存在癌细胞。
需要说明的是，关于上述阈值，可以根据上述荧光酶标仪[例如，QX200DropletReader(Bio-Rad Laboratories公司制造)]的阈值设定功能来决定，也可以由对分析对象区域进行扩增的结果来决定。
通过如此进行本发明的癌症的判定方法的步骤4，能够进行癌症的判定。
这样，本发明的癌症的判定方法仅通过确认扩增产物的有无即可，因而是非常简便的方法。
[本发明的癌症的判定方法的具体例]
关于本发明的癌症的判定方法的具体例，以下分成(A)将存在于血清、血浆、尿等体液中的DNA的特定区域设定为分析对象区域的情况、(B)将存在于组织、细胞、全血、尿等中的DNA的特定区域设定为分析对象区域的情况来进行说明。
(A)将存在于血清、血浆、尿等体液中的DNA的特定区域(例如，由序列号11所表示的碱基序列构成的区域)设定为分析对象区域的情况
关于(1)DNA的提取、(2)本发明的片段化步骤、(3)本发明的步骤1和(4)本发明的步骤2，如[本发明的扩增方法的具体例]中所说明的那样。另外，关于(5)本发明的步骤3，如[本发明的甲基化判定方法的具体例]中所说明的那样。
(6)本发明的癌症的判定方法的步骤4
本发明的步骤3的扩增产物有无的确认结果，在确认到至少1个发出超过预先设定的阈值的荧光的液滴的情况下，可以判定“进行是否为该分析对象区域来源的癌症的判定的对象罹患癌症或该对象中存在癌细胞”。另一方面，在未确认到至少1个发出超过预先设定的阈值的荧光的液滴的情况下，可以判定“进行是否为该分析对象区域来源的癌症的判定的对象未罹患癌症或该对象中不存在癌细胞”。
(B)将存在于组织、细胞、全血、尿等中的DNA的特定区域(例如，由序列号1所表示的碱基序列构成的区域)设定为分析对象区域的情况
关于(1)DNA的提取、(2)本发明的片段化步骤、(3)本发明的步骤1和(4)本发明的步骤2，如[本发明的扩增方法的具体例]中所说明的那样。另外，关于(5)本发明的步骤3，如[本发明的甲基化判定方法的具体例]中所说明的那样。
(6)本发明的癌症的判定方法的步骤4
本发明的步骤3的扩增产物有无的确认结果，在确认到扩增产物的情况下，可以判定“进行是否为该分析对象区域来源的癌症的判定的对象罹患癌症或该对象中存在癌细胞”。另一方面，在未确认到扩增产物的情况下，可以判定“进行是否为该分析对象区域来源的癌症的判定的对象未罹患癌症或该对象中不存在癌细胞”。
将本发明的癌症的判定方法的流程图分成各种模式示于图2。作为本发明的癌症的判定方法，可以举出模式1～5的方法，更优选模式1～3，进一步优选模式1或2，特别优选模式1。
<本发明的获得用于进行癌症的判定的数据的方法>
本发明的获得用于进行癌症的判定的数据的方法(下文中有时简记为本发明的获得数据的方法)基于利用本发明的扩增方法得到的结果，获得用于对于进行是否为癌症的判定的对象做出癌症的判定的数据。即，该获得用于进行癌症的判定的数据的方法是在上述本发明的扩增方法后接着进行确认扩增产物的有无的步骤的方法，其特征在于，包括：(1)利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶对包含分析对象区域的DNA进行处理的步骤1；(2)对步骤1中处理后的双链DNA的分析对象区域进行扩增的步骤2；(3)确认步骤2中得到的扩增产物的有无的步骤3。
需要说明的是，至获得扩增产物为止的步骤3之前的步骤(步骤1和2)与上述本发明的扩增方法相同，其具体例、优选例等也相同。另外，进行扩增产物的确认的步骤3与上述本发明的甲基化判定方法相同，其具体例、优选例等也相同。
<本发明的癌症的判定用试剂>
本发明的癌症的判定用试剂(下文中有时简记为本发明的癌症的判定用试剂)的特征在于，包含S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶。
本发明的癌症的判定用试剂中使用的甲基化敏感性限制酶的具体例和优选例如如上所述。
此外，也可以加上该领域中通常使用的下述试剂类中的任意1种以上而制成本发明的判定用试剂。
a)DNA纯化用的柱[例如，EconoSpin(GeneDesign Inc.制造)等]、
b)PCR等的扩增反应用试剂(例如，1种或2种以上的引物、探针、核酸合成底物、核酸合成酶等)、
c)片段化用的限制酶、
d)核酸扩增产物确认用试剂[例如，琼脂糖凝胶、上样缓冲液、染色用试剂(GelRed系染色液、溴化乙锭等)]、
e)DNA提取用试剂[例如，QuickGene SP组织DNA提取试剂盒(仓敷纺绩株式会社制造)、NucleoSpin(商标)Plasma XS(MACHEREY-NAGEL公司制造)或MagMAXTM游离DNA分离试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司制造)等]。
另外，本发明的癌症的判定用试剂中也可以包含用于实施本发明的癌症的判定方法的说明书等。该“说明书”是指通过文章或图表等实质性地记载了本发明的癌症的判定方法中的特点、原理和操作步骤等的本发明的癌症的判定用试剂的操作说明书、附加文章或小册子(传单)等。
如此利用本发明的癌症的判定用试剂，能够简便、短时间且高精度地进行本发明的癌症的判定方法。
<本发明的用于进行癌症的判定的标志物>
本发明的用于进行癌症的判定的标志物(下文中有时简记为本发明的标志物)是通过进行本发明的扩增方法而得到的扩增产物，是能够对于根据该标志物(扩增产物)的有无来进行是否为分析对象区域来源的癌症的判定的对象做出癌症的判定的标志物。即，其是通过进行(1)利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶对包含分析对象区域的DNA进行处理的步骤1、(2)对步骤1中处理后的双链DNA的分析对象区域进行扩增的步骤2而获得的标志物。
需要说明的是，至获得扩增产物为止的步骤3之前的步骤(步骤1和2)与上述本发明的扩增方法相同，其具体例、优选例等也相同。另外，关于癌症和进行是否为癌症的判定的对象，与本发明的癌症的判定方法相同，其具体例、优选例等也相同。
<检测本发明的标志物的方法>
检测本发明的标志物的方法利用自身公知的方法对本发明的标志物进行检测，优选利用本发明的步骤3中说明的方法进行检测。
通过如此使用本发明的标志物，能够简便、短时间且高精度地进行本发明的癌症的判定方法。
下面，通过实施例等详细说明本发明，但本发明不受这些实施例等的任何限定。
实施例
实验例1各种正常细胞和各种癌细胞来源的DNA的甲基化状态的确认
对于下述各种正常细胞和各种癌细胞来源的DNA，利用亚硫酸氢盐序列分析进行了甲基化状态的确认。
(1)条件的设定
如下设定了试样和甲基化状态的确认区域。
·试样
人诱导性多能干细胞(hiPS)：正常细胞
正常成纤维细胞(HDF)：正常细胞
胶质母细胞瘤细胞(U251-MG-P1)：癌细胞
乳腺癌细胞(MCF-7)：癌细胞
前列腺癌细胞(LNCap clone FGC)：癌细胞
髄性白血病细胞(HL60)：癌细胞
·甲基化状态的确认区域
在人来源的FOXB2基因启动子区域内的由序列号1所表示的碱基序列构成的区域(267碱基对)内存在的、图3中所示的由四边形围起的3个包含CpG序列的序列(CCGG)
(2)基因组DNA的提取
使用QuickGene SP组织DNA提取试剂盒(仓敷纺绩株式会社制造)，由上述各种细胞分别提取出基因组DNA。
(3)亚硫酸氢盐反应
将400ng上述(2)中得到的基因组DNA分别溶解于10μL的蒸馏水中。之后，使用Episight亚硫酸氢盐转化试剂盒(和光纯药工业株式会社制造)，依照试剂盒所记载的方法对该溶液分别进行亚硫酸氢盐反应。
(4)PCR扩增反应
在上述(3)中得到的含有亚硫酸氢盐反应产物的溶液1μL中分别加入17.3μL蒸馏水、2.5μL Blend Taq用10×缓冲液(东洋纺株式会社制造)、2μL 2mM dNTPs(东洋纺株式会社制造)、0.2μL 2.5单位/μL的Blend Taq-Plus(东洋纺株式会社制造)、1μL 10μM的正向引物[GGAATTAGTGGGGGCAGCCAGGCCCCAGG(序列号7)]和1μL 10μM的反向引物[CCCAAAAACTACCCTTACCAAACTAATC(序列号8)]并混合，将其作为PCR用反应液。
接着，将上述PCR用反应液分别设置于热循环仪(Bio-Rad Laboratories公司制造)中，以下述反应条件进行PCR扩增反应。
※反应条件
94℃2分钟
↓
以94℃10秒→55℃10秒→72℃20秒为1个循环，进行36个循环
↓
72℃2分钟
(5)PCR扩增产物的克隆
利用1.5％琼脂糖凝胶，对上述(4)中得到的PCR扩增产物分别进行电泳。电泳后，用GelRed核酸凝胶染色液(和光纯药工业株式会社制造)进行染色，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司制造)分别回收PCR扩增产物。
(6)用于对PCR扩增产物附加限制酶识别位点的PCR扩增反应
在上述(5)中得到的含PCR扩增产物的溶液1μL中分别加入17.3μL蒸馏水、2.5μLBlend Taq用10×缓冲液(东洋纺株式会社制造)、2μL 2mM的dNTPs(东洋纺株式会社制造)、0.2μL 2.5单位/μL的Blend Taq-Plus(东洋纺株式会社制造)、1μL 10μM的正向引物和1μL10μM的反向引物并混合，将其作为PCR用反应液。
需要说明的是，上述正向引物是对上述(4)的正向引物附加限制酶(HindIII)识别位点(序列中的下划线部分)而成的引物，由下述碱基序列构成。上述反向引物是对上述(4)的反向引物附加限制酶(BamHI)识别位点(序列中的下划线部分)而成的引物，由下述碱基序列构成。
正向引物：TTACCATAAGCTTGGAATTAGTGGGGGCAGCCAGGCCCCAGG(序列号9)
反向引物：TAATTAAGGATCCCCCAAAAACTACCCTTACCAAACTAATC(序列号10)
接着，将上述PCR用反应液分别设置于热循环仪(Bio-Rad Laboratories公司制造)中，以下述反应条件进行PCR扩增反应。
※反应条件
94℃2分钟
↓
以94℃10秒→55℃10秒→72℃20秒为1个循环，进行12个循环
↓
72℃2分钟
接着，向含PCR扩增产物的溶液25μL中分别加入5μL 6×双色上样缓冲液(NIPPONGENE公司制造)并混合，利用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳。电泳后，利用GelRed核酸凝胶染色液(和光纯药工业株式会社制造)进行染色，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司制造)分别回收PCR扩增产物。
(7)限制酶处理
在上述(6)中得到的含PCR扩增产物的溶液43μL中分别混合5μL 10×B缓冲液(NIPPON GENE公司制造)、1μL 20单位/μL的HindIII(NIPPON GENE公司制造)、1μL20单位/μL的BamHI(NIPPON GENE公司制造)后，在37℃反应1小时。同样地向500ng pUC19(NIPPONGENE公司制造)中加入蒸馏水，制备成43μL，加入1μL 20单位/μL的HindIII(NIPPON GENE公司制造)、1μL 20单位/μL的BamHI(NIPPON GENE公司制造)后，在37℃反应1小时。接着，分别加入250μL 5.5M的盐酸胍(和光纯药工业株式会社制造)并混合，之后移至EconoSpin(GeneDesign Inc.制造)中，以12000×g在室温下离心分离1分钟，将管内的溶液除去。接着，分别加入500μL 2mM Tris-HCl pH7.5(NIPPON GENE公司制造)，以12000×g在室温下离心分离1分钟，将管内的溶液除去。进而，以12000×g在室温下离心分离1分钟后，更换至新的管中，分别加入25μL 2mM Tris-HCl pH8.0(NIPPON GENE公司制造)，以12000×g在室温下离心分离1分钟，由此回收利用限制酶(HindIII和BamHI)处理后的各PCR扩增产物和pUC19。
(8)转化
向上述(7)中得到的含PCR扩增产物的溶液1μL中分别加入1μL利用限制酶进行了处理的pUC19、2μL DNA连接试剂盒Mighty Mix(宝生物公司制造)并混合，在16℃反应1小时。接着，将全部量4μL分别转化至ECOSTM感受态E.coli DH5α(NIPPON GENE公司制造)中，涂抹至添加有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上。之后，将菌落在添加有氨苄青霉素的LB培养基中于37℃培养16小时。之后，使用质粒试剂盒SII(仓敷纺绩株式会社制造)，分别提取质粒。接着，使用所得到的质粒，通过宝生物公司的测序委托服务解读碱基序列。
将其结果示于图4。
图4是关于正常细胞(hiPS、HDF)、癌细胞(U251-MG-P1、MCF-7、LNCaP clone FGC、HL60)的碱基序列解读结果，示出作为甲基化状态的确认区域的3个包含CpG序列的序列(CCGG)的胞嘧啶为甲基化胞嘧啶或非甲基化胞嘧啶中的哪一种的图。另外，图4中的圆圈1～圆圈3对应于图3中的圆圈1～圆圈3。
需要说明的是，图4中的○表示CpG序列的胞嘧啶为非甲基化胞嘧啶，●表示CpG序列的胞嘧啶为甲基化胞嘧啶。
由图4的结果可知，正常细胞(hiPS、HDF)来源的作为甲基化状态的确认区域的3个包含CpG序列的序列(CCGG)的胞嘧啶为非甲基化胞嘧啶，癌细胞(U251-MG-P1、MCF-7、LNCaPclone FGC、HL60)来源的作为甲基化状态的确认区域的3个包含CpG序列的序列(CCGG)的胞嘧啶为甲基化胞嘧啶。
实施例1和比较例1～3
为了验证本发明的步骤1中的S1核酸酶的效果，在下述条件下进行了本发明的扩增方法以及甲基化判定方法和癌症的判定方法。
·实施例1：进行了利用单链特异性核酸酶(S1核酸酶)进行处理的步骤的情况
·比较例1：进行了利用单链特异性核酸酶(绿豆核酸酶)进行处理的步骤的情况
·比较例2：进行了利用单链特异性核酸酶(核酸外切酶I)进行处理的步骤的情况
·比较例3：未进行利用单链特异性核酸酶进行处理的步骤的情况
实施例1
(1)条件的设定
如下设定了试样和分析对象区域。
·试样
人诱导性多能干细胞(hiPS)：正常细胞
·分析对象区域
人来源的FOXB2基因的启动子区域中由序列号1所表示的碱基序列构成的区域(267碱基对)
(2)基因组DNA的提取
利用QuickGene SP组织DNA提取试剂盒(仓敷纺绩株式会社制造)，根据其实物说明书提取出hiPS来源的基因组DNA。
(3)利用限制酶(BamHI和HindIII)的片段化处理和柱纯化
向(2)中得到的基因组DNA 150ng中加入5μL 10×B缓冲液(NIPPON GENE公司制造)、1μL 20单位/μL的BamHI(NIPPON GENE公司制造)和1μL 20单位/μL的HindIII(NIPPONGENE公司制造)，用灭菌水制备成总量为50μL。之后，在37℃反应1小时。接着，加入250μL5.5M的盐酸胍(和光纯药工业株式会社制造)并混合，之后移至EconoSpin(GeneDesignInc.制造)中，以20000×g在室温下离心分离3分钟，将管内的溶液除去。接着，加入600μL2mM Tris-HCl pH7.5(NIPPON GENE公司制造)和600μL 80％乙醇(和光纯药工业株式会社制造)，以12000×g在室温下离心分离1分钟，将管内的溶液除去。进而，以12000×g在室温下离心分离5分钟后，更换至新的管中，加入30μL 2mM Tris-HCl pH8.0(NIPPON GENE公司制造)，以12000×g在室温下离心分离1分钟，由此得到利用限制酶(BamHI和HindIII)进行了处理的基因组DNA。
(4)利用单链特异性核酸酶(S1核酸酶)的处理和柱纯化
向(3)中得到的含基因组DNA的Tris-HCl溶液25μL中加入4μL 10×S1核酸酶缓冲液(宝生物公司制造)和1μL 180单位/μL的S1核酸酶(宝生物公司制造)，用灭菌水制备成总量为40μL。之后，在23℃反应15分钟后，加入1μL 0.5M的EDTA。接着，加入200μL 5.5M的盐酸胍(和光纯药工业株式会社制造)和200μL 20mM Tris-HCl pH6.6(和光纯药工业株式会社制造)并混合后，移至EconoSpin(GeneDesign Inc.制造)中，以20000×g在室温下离心分离3分钟，将管内的溶液除去。接着，加入600μL 2mM Tris-HCl pH7.5(NIPPON GENE公司制造)、600μL 80％乙醇(和光纯药工业株式会社制造)，以12000×g在室温下离心分离1分钟，将管内的溶液除去。进而，以12000×g在室温下离心分离5分钟后，更换至新的管中，加入30μL 2mM Tris-HCl pH8.0(NIPPON GENE公司制造)，以12000×g在室温下离心分离1分钟，由此得到利用单链特异性核酸酶(S1核酸酶)进行了处理的基因组DNA。
(5)利用甲基化敏感性限制酶(HapII)的处理和柱纯化
向(4)中得到的含基因组DNA的Tris-HCl溶液25μL中加入4μL 10×L缓冲液(宝生物公司制造)和1μL 25单位/μL的HapII(宝生物公司制造)，用灭菌水制备成总量为40μL。之后，在37℃反应2小时。接着，加入200μL 5.5M的盐酸胍(和光纯药工业株式会社制造)和200μL 20mM Tris-HCl pH6.6(和光纯药工业株式会社制造)并混合后，移至EconoSpin(GeneDesign Inc.制造)中，以20000×g在室温下离心分离3分钟，将管内的溶液除去。接着，加入600μL 2mM Tris-HCl pH7.5(NIPPON GENE公司制造)和600μL 80％乙醇(和光纯药工业株式会社制造)，以12000×g在室温下离心分离1分钟，将管内的溶液除去。进而，以12000×g在室温下离心分离5分钟后，更换至新的管中，加入30μL 2mM Tris-HCl pH8.0(NIPPON GENE公司制造)，以12000×g在室温下离心分离1分钟，由此得到利用甲基化敏感性限制酶(HapII)进行了处理的基因组DNA。
需要说明的是，HapII和HpaII所识别的序列是图3所表示的人细胞来源的基因组DNA的FOXB2基因的启动子区域内的由序列号1所表示的碱基序列构成的区域(267碱基对)中被四边形围起的3个包含CpG序列的序列(CCGG)。
(6)PCR扩增反应
向(5)中得到的含基因组DNA的Tris-HCl溶液1μL中加入2.5μL Blend Taq用10×缓冲液(东洋纺株式会社制造)、2μL 2mM的dNTPs(东洋纺株式会社制造)、0.2μL 2.5单位/μL的Blend Taq-Plus(东洋纺株式会社制造)、1μL 10μM的正向引物(h-F-Fox)和1μL 10μM的反向引物(h-R-Fox)，用灭菌水制备成25μL，将其作为PCR用反应液。
需要说明的是，利用上述引物得到的扩增产物的大小(碱基对数)为267碱基对(序列号1)。
另外，作为模板，使用(3)中得到的DNA，除此以外与上述同样地制备PCR用反应液，将其作为对照。
将上述PCR用反应液分别设置于热循环仪(Bio-Rad Laboratories公司制造)中，以下述反应条件进行PCR扩增反应。
※反应条件
94℃2分钟
↓
以94℃4秒→68℃15秒为1个循环，进行50个循环
↓
68℃1分钟
(7)电泳
向(6)中得到的含扩增产物的溶液25μL中分别加入5μL 6×双色上样缓冲液(NIPPON GENE公司制造)并混合，之后利用2％琼脂糖凝胶对该混合物进行电泳。电泳后，利用GelRed核酸凝胶染色液(和光纯药工业株式会社制造)进行染色，通过UV照射装置分别确认了扩增产物。将其结果示于图5(泳道1和2)。
比较例1
作为实施例1中的单链特异性核酸酶，代替S1核酸酶而使用绿豆核酸酶(宝生物公司制造)，除此以外，通过与上述实施例1同样的方法进行扩增产物的确认。将其结果示于图5(泳道3和4)。
比较例2
作为实施例2中的单链特异性核酸酶，代替S1核酸酶而使用核酸外切酶I(宝生物公司制造)，除此以外，通过与上述实施例2同样的方法进行扩增产物的确认。将其结果示于图5(泳道5和6)。
比较例3
不进行实施例1中的(4)利用单链特异性核酸酶的处理，除此以外，通过与实施例1同样的方法进行扩增产物的确认。将其结果示于图5(泳道7和8)。
另外，将图5的各泳道中的试样、单链特异性核酸酶、甲基化敏感性限制酶和扩增产物的有无归纳于下述表3。
【表3】
由图5的结果可知，在使用S1核酸酶作为单链特异性核酸酶、利用甲基化敏感性限制酶对hiPS进行处理、使用本发明的引物对进行PCR扩增反应的情况下(泳道2)，未得到目标扩增产物[由序列号1所表示的碱基序列构成的区域(267碱基对)]、即分析对象区域。
因此，hiPS的分析对象区域被甲基化敏感性限制酶切断，可以判定为非甲基化状态。即，可以判定分析对象区域来源的hiPS为正常细胞。
另一方面，可知：在使用绿豆核酸酶作为单链特异性核酸酶的情况下(泳道4)、使用核酸外切酶I作为单链特异性核酸酶的情况下(泳道6)、以及未进行利用单链特异性核酸酶进行处理的步骤的情况下(泳道8)，利用甲基化敏感性限制酶对hiPS进行处理并使用本发明的引物对进行PCR扩增反应时，得到目标扩增产物[由序列号1所表示的碱基序列构成的区域(267碱基对)]、即与分析对象区域相同大小的扩增产物。
但是，在比较例1～3中，虽然用了与实施例1相同的正常hiPS来源的基因组DNA作为模板，但得到了扩增产物，由此认为该扩增产物是人为地或内源性地存在的单链DNA成为模板而扩增的非特异性扩增产物。
因此可知，通过利用S1核酸酶对试样(DNA)进行处理、即通过进行本发明的步骤1，可抑制可能造成假阳性的非特异性扩增产物的扩增，能够简便、高精度地进行甲基化的分析对象区域的扩增以及甲基化的判定和癌症的判定。
实施例2各种正常细胞和各种癌细胞的FOXB2基因的分析
使用下述正常细胞和癌细胞作为实施例1中的试样，除此以外，通过与实施例1同样的方法进行扩增产物的确认。将其结果分别示于图6(正常细胞)和图7(癌细胞)。
·正常细胞
正常成纤维细胞(HDF)
正常成纤维细胞(CCD-8Lu)
正常成纤维细胞(WI-38)
HIV和HBV阴性血清(正常全血)
人诱导性多能干细胞(hiPS)
全胚胎细胞(HE23)
·癌细胞
神经母细胞瘤细胞(IMR-32)
胶质母细胞瘤细胞(U251-MG-P1)
子宫肌瘤细胞(HeLa)
肝癌细胞(HepG2)
结肠腺癌细胞(WiDr)
非小细胞肺癌细胞(NCI-H460)
胰腺癌细胞(CFPAC-1)
卵巢畸胎瘤细胞(PA-1)
乳腺癌细胞(MCF-7)
前列腺癌细胞(LNCaP clone FGC)
T淋巴性白血病细胞(Jurkat)
髄性白血病细胞(HL-60)
另外，将图6的各泳道中的试样、甲基化敏感性限制酶和扩增产物的有无归纳于下述表4，将图7的各泳道中的试样、甲基化敏感性限制酶和扩增产物的有无归纳于下述表5。
【表4】
【表5】
由图6的结果可知，在使用各种正常细胞的情况下(泳道2、4、6、8、10和12)，均未确认到目标扩增产物[由序列号1所表示的碱基序列构成的区域(267碱基对)]，未得到分析对象区域。
即，分析对象区域被甲基化敏感性限制酶切断，可以判定为非甲基化状态。因此，由该结果可以判定，分析对象区域来源的各种正常细胞为正常细胞。
由图7的结果可知，在使用各种癌细胞的情况下(泳道2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24)，均确认到目标扩增产物[由序列号1所表示的碱基序列构成的区域(267碱基对)]，得到了分析对象区域。
即，分析对象区域未被甲基化敏感性限制酶切断，可以判定为甲基化状态。因此，由该结果可以判定，分析对象区域来源的各种癌细胞为癌细胞。
由以上可知，根据本发明，能够简便、高精度地进行甲基化的分析对象区域的扩增以及甲基化的判定和癌症的判定。
实施例3乳腺癌患者来源的癌细胞的FOXB2基因的分析
作为实施例1中的试样，使用2名乳腺癌患者[乳腺癌患者1(IIIA期)和乳腺癌患者2(II期)]来源的癌细胞和该癌细胞附近的正常细胞，除此以外，通过与实施例1同样的方法进行扩增产物的确认。将其结果示于图8。
另外，将图8的各泳道中的试样、甲基化敏感性限制酶和扩增产物的有无归纳于下述表6。
【表6】
由图8的结果可知，在使用乳腺癌患者1和乳腺癌患者2来源的癌细胞的情况下(泳道4和8)，均确认到目标扩增产物[由序列号1所表示的碱基序列构成的区域(267碱基对)]，得到了分析对象区域。
即，分析对象区域未被甲基化敏感性限制酶切断，可以判定为甲基化状态。因此，由该结果可以判定，分析对象区域来源的各种癌细胞为癌细胞。
另一方面，可知：在使用各种正常细胞的情况下(泳道2和6)，均未确认到目标扩增产物[由序列号1所表示的碱基序列构成的区域(267碱基对)]，未得到分析对象区域。
即，分析对象区域被甲基化敏感性限制酶切断，可以判定为非甲基化状态。因此，由该结果可以判定，分析对象区域来源的癌细胞附近的各种正常细胞为正常细胞。
由以上可知，即使是实际的临床样本，也能够进行甲基化的分析对象区域的扩增以及甲基化的判定和癌症的判定。
此外还可知，即使是癌细胞附近的正常细胞，也能够在不产生假阳性的情况下进行甲基化的分析对象区域的扩增以及甲基化的判定和基于此的癌症的判定。
实施例4犬来源的癌细胞的FOXB2基因的分析
作为实施例1中的试样，使用犬来源的癌细胞[MDCK细胞(无转移能力的良性癌细胞)、肺癌细胞和肝癌细胞]，将分析对象区域设定为犬来源的FoxB2基因的启动子区域中由序列号4所表示的碱基序列构成的区域(433碱基对)，并且使用d-F-Fox和d-R-Fox作为本发明的引物对，除此以外，通过与实施例1同样的方法进行扩增产物的确认。
需要说明的是，利用本发明的引物对(d-F-Fox和d-R-Fox)所扩增的区域为由序列号4所表示的碱基序列构成的区域(433碱基对)。
将其结果示于图9。
另外，将图9的各泳道中的细胞和甲基化敏感性限制酶归纳于下述表7。
【表7】
由图9的结果可知，在使用MDCK细胞(无转移能力的良性癌细胞)的情况下(泳道2)，均未确认到目标扩增产物[由序列号4所表示的碱基序列构成的区域(433碱基对)]，未得到分析对象区域。
即，分析对象区域被甲基化敏感性限制酶切断，可以判定为非甲基化状态。因此，由该结果可以判定，分析对象区域来源的MDCK细胞(无转移能力的良性癌细胞)为正常细胞。
另一方面，可知：在使用肺癌细胞和肝癌细胞的情况下(泳道4和6)，均确认到目标扩增产物[由序列号1所表示的碱基序列构成的区域(433碱基对)]，得到了分析对象区域。
即，分析对象区域未被甲基化敏感性限制酶切断，可以判定为甲基化状态。因此，由该结果可以判定，分析对象区域来源的肺癌细胞和肝癌细胞为癌细胞。
由以上可知，根据本发明，即使是犬来源的细胞，也能够进行甲基化的分析对象区域的扩增以及甲基化的判定和癌症的判定。另外还可知，即使是无转移能力的良性癌细胞，也能够判定为正常细胞。
此外，暗示了能够将本发明的甲基化的分析对象区域的扩增方法以及甲基化的判定方法和癌症的判定方法应用于犬等动物的癌症筛检的可能性。
实施例5使用了癌症患者来源的血浆的FoxB2基因的分析
如上所述，cfDNA是指由癌(肿瘤)细胞、白细胞等血液细胞、各组织来源的细胞等的死亡所来源的DNA，其存在于血液或尿等体液中。另外，据报道癌症患者中的cfDNA的量较健康人多。
因此，代替使用内窥镜或针来采集癌(肿瘤)组织的现有的活组织检查(Biopsy)，使用血液或尿等体液的癌(肿瘤)的筛检(液体活检)受到关注。
因此，对于能否将本发明的方法应用于液体活检进行了验证。
(1)条件的设定
如下设定了试样和分析对象区域。
·试样
肝癌患者来源的血浆
肺癌患者来源的血浆
·分析对象区域
人来源的FOXB2基因的启动子区域中由序列号11所表示的碱基序列构成的区域(149碱基对)
(2)cfDNA的提取
利用NucleoSpin(商标)Plasma XS(MACHEREY-NAGEL公司制造)，根据其实物说明书分别提取出cfDNA。
(3)利用限制酶(MboI)的片段化处理、利用甲基化敏感性限制酶(HpaII)的处理和柱纯化
向(2)中得到的cfDNA中分别加入10μL 10×CutSmart缓冲液(NEB公司制造)、1μL25单位/μL的MboI(NEB公司制造)和3μL 50单位/μL的HpaII(NEB公司制造)，用灭菌水使总量为100μL。之后，在37℃反应1小时30分钟。接着，分别加入500μL 5.5M的盐酸胍(和光纯药工业株式会社制造)和500μL 20mM Tris-HCl pH7.0(NIPPON GENE公司制造)并混合后，移至EconoSpin(GeneDesign Inc.制造)中，以13000×g在室温下离心2分钟，将管内的溶液除去。接着，分别加入600μL 2mM Tris-HCl pH7.5(NIPPON GENE公司制造)和600μL 80％乙醇(和光纯药工业株式会社制造)，以13000×g在室温下离心分离1分钟，将管内的溶液除去。再重复一次该操作，进而以13000×g在室温下离心分离3分钟后，分别更换至新的管中，分别添加50μL灭菌水，以13000×g在室温下离心分离1分钟，由此分别得到利用限制酶(MboI)和甲基化敏感性限制酶(HpaII)进行了处理的cfDNA。
(4)利用S1核酸酶的处理和柱纯化
向(3)中得到的含cfDNA的灭菌水50μL中分别加入10μL 10×S1核酸酶缓冲液(宝生物公司制造)、1μL 180单位/μL的S1核酸酶，用灭菌水制备成100μL。之后，在23℃反应15分钟。接着，分别加入500μL 5.5M的盐酸胍(和光纯药工业株式会社制造)和500μL 20mMTris-HCl pH7.0(NIPPON GENE公司制造)并混合后，移至EconoSpin(GeneDesign Inc.制造)中，以13000×g在室温下离心2分钟，将管内的溶液除去。接着，分别加入600μL 2mMTris-HCl pH7.5(NIPPON GENE公司制造)和600μL80％乙醇(和光纯药工业株式会社制造)，以13000×g在室温下离心分离1分钟，将管内的溶液除去。再重复一次该操作，进而以13000×g在室温下离心分离3分钟后，更换至新的管中，分别添加50μL灭菌水，以13000×g在室温下离心分离1分钟，由此分别得到利用S1核酸酶进行了处理的cfDNA。
(5)利用甲基化敏感性限制酶(HpaII)的处理和柱纯化
向(4)中得到的含cfDNA的灭菌水50μL中分别加入10μL 10×CutSmart缓冲液(NEB公司制造)和3μL 50单位/μL的HpaII，用灭菌水制备成总量为100μL。之后，在37℃反应1小时30分钟。接着，分别加入500μL 5.5M的盐酸胍(和光纯药工业株式会社制造)和500μL20mM Tris-HCl pH7.0(NIPPON GENE公司制造)并混合后，移至EconoSpin(GeneDesignInc.制造)中，以13000×g在室温下离心2分钟，将管内的溶液除去。接着，分别加入600μL2mM Tris-HCl pH7.5(NIPPON GENE公司制造)和600μL80％乙醇(和光纯药工业株式会社制造)，以13000×g在室温下离心分离1分钟，将管内的溶液除去。再重复一次该操作，进而以13000×g在室温下离心分离3分钟后，分别更换至新的管中，添加50μL灭菌水，以13000×g在室温下离心分离1分钟，由此分别得到利用甲基化敏感性限制酶(HpaII)进行了处理的cfDNA。
需要说明的是，HpaII和HapII所识别的序列为图10所表示的人来源的FOXB2基因的启动子区域内的由序列号11所表示的碱基序列构成的区域(149碱基对)中被四边形围起的3个包含CpG序列的序列(CCGG)。
(6)利用数字PCR法的扩增反应
向(5)中得到的含cfDNA的灭菌水3μL中分别加入11μL ddPCRTM探针用Supermix(Bio-Rad Laboratories公司制造)、0.8μL 50单位/μL的HapII(宝生物公司制造)、1μL 20μM的正向引物(hcf-F-fox)、1μL 20μM的反向引物(hcf-R-fox)和1μL 10μM的探针[hcf-Probe-fox(5’端用FAM标记、3’端用BHQ1标记)]，用灭菌水制备成总量为22μL，将其作为数字PCR用反应液。之后，将上述反应液分别设置于热循环仪(Bio-Rad Laboratories公司制造)中，在37℃反应40分钟。接着，利用自动化液滴发生器制作液滴，将该液滴分注至96孔板中后，利用热循环仪(Bio-Rad Laboratories公司制造)以下述反应条件进行利用数字PCR法的扩增反应。
※反应条件
95℃10分钟
↓
以94℃30秒→62℃1分钟为1个循环，进行40个循环
↓
98℃10分钟
另外，选择GAPDH基因作为内源性对照，对于GAPDH基因的特定区域[由序列号15所表示的碱基序列构成的区域(149碱基对)]，也使用相同的试样(样本)进行分析。GAPDH基因的分析中所用的正向引物、反向引物和探针的碱基序列如下所述。
需要说明的是，关于其他实验条件，除了未在数字PCR用反应液中添加HapII以外，与上述相同。
正向引物：gaagcttgtcatcaatggaaatccc(序列号16)
反向引物：gggacaggaccatattgagggacac(序列号17)
探针(5’端用FAM标记、3’端用BHQ1标记)：caactaggatggtgtggctcccttg(序列号18)
(7)利用荧光酶标仪的扩增产物的确认
利用QX200Droplet Reader(Bio-Rad Laboratories公司制造)，对含有(6)中扩增的扩增产物的各液滴来源的荧光进行检测，由此进行扩增产物的确认。
需要说明的是，关于GAPDH基因的分析使用1个试样(样本)，对于每1试样(样本)进行1次分析。另外，关于FOXB2基因的分析使用1个试样(样本)，对于每1试样(样本)进行2次分析。
将GAPDH基因的分析结果示于图11，将FOXB2基因的分析结果示于图12。
关于作为阳性或阴性的判定基准的阈值，对于GAPDH基因，以GAPDH基因的扩增结果为参考，设定为荧光强度8000。另外，对于FOXB2基因，以FOXB2基因的扩增结果为参考，设定为荧光强度8000。即，在存在至少1个荧光强度超过8000的液滴的情况下，判定为阳性(获得了目标扩增产物)，在不存在荧光强度超过8000的液滴的情况下，判定为阴性(未获得目标扩增产物)。
另外，将图11和图12中的试样、分析对象区域、阳性液滴数、阴性液滴数、总液滴数和阈值分别归纳于表8和表9。
【表8】
【表9】
根据图11和表8的结果，在使用肝癌患者来源的血浆的情况下，能够确认到发出超过阈值的荧光的阳性液滴(253个)，因而可知目标扩增产物[GAPDH基因的特定区域：由序列号15所表示的碱基序列构成的区域(149碱基对)]被扩增。
另外，在使用肺癌患者来源的血浆的情况下，也能够确认到发出超过阈值的荧光的阳性液滴(22个)，因而可知目标扩增产物[GAPDH基因的特定区域：由序列号15所表示的碱基序列构成的区域(149碱基对)]被扩增。
由以上表明，试样(肝癌患者来源的血浆和肺癌患者来源的血浆)中存在cfDNA。
根据图12和表9的结果，在使用肝癌患者来源的血浆的情况下，能够确认到发出超过阈值的荧光的阳性液滴(第1次：5个、第2次：4个)，因而可知得到了目标扩增产物[FOXB2基因的特定区域：由序列号11所表示的碱基序列构成的区域(149碱基对)]。
另外，在使用肺癌患者来源的血浆的情况下，也能够确认到发出超过阈值的荧光的阳性液滴(第1次：1个)，因而可知得到了目标扩增产物[FOXB2基因的特定区域：由序列号11所表示的碱基序列构成的区域(149碱基对)]。
即，分析对象区域未被甲基化敏感性限制酶切断，可以判定为甲基化状态。另外，可以判定血浆来源的对象(肝癌患者和肺癌患者)罹患癌症或该对象(肝癌患者和肺癌患者)中存在癌细胞。
由以上可知，在使用癌症患者来源的血浆作为试样的情况下，也能够进行甲基化的分析对象区域的扩增以及使用了该扩增的甲基化的判定和癌症的判定。
因此，暗示了能够将本发明的甲基化的分析对象区域的扩增方法以及甲基化判定方法和癌症的判定方法应用于液体活检的可能性。
实施例6使用了健康人来源的血浆的FOXB2基因的分析(FOXB2基因与GAPDH基因的 同时扩增/检测)
在假设为实际的临床现场的情况下，从检查的迅速性的方面出发，优选能够同时对靶基因和作为内源性对照所选择的基因进行扩增/检测。
因此，对于能否将本发明的方法应用于靶基因和作为内源性对照所选择的基因的同时扩增/检测进行了验证。
使用健康人来源的血浆作为实施例5中的试样，如下所述设定阈值，并且使用下述的数字PCR用反应液，除此以外，通过与实施例5同样的方法进行扩增产物的确认。需要说明的是，实验使用4个试样(样本)，对于每1试样(样本)分别实施4次实验。
将其结果示于图13(A、B)。
·阈值
对于FOXB2基因，以FOXB2基因的扩增结果为参考，设定为荧光强度8000。另外，对于GAPDH基因，以GAPDH基因的扩增结果为参考，设定为荧光强度4000。
·数字PCR用反应液
向利用甲基化敏感性限制酶进行了处理的3μL cfDNA中加入1μL 20μM的正向引物(hcf-F-fox)、1μL 20μM的反向引物(hcf-R-fox)、0.6μL 10μM的探针[hcf-Probe-fox(5’端用FAM标记、3’端用BHQ1标记)]、1μL 20μM的正向引物(序列号16所表示的碱基序列)、1μL20μM的反向引物(序列号17所表示的碱基序列)、0.6μL 10μM的探针[序列号18所表示的碱基序列(5’端用HEX标记、3’端用BHQ1标记)]、11μL ddPCRTM探针用Supermix(Bio-RadLaboratories公司制造)和0.6μL 50单位/μL的HpaII(NEB公司制造)，用灭菌水制备成总量为22μL。
另外，将图13的A和B中的试样、分析对象区域、阳性液滴数、阴性液滴数、总液滴数和阈值分别归纳于表10和11。
【表10】
【表11】
根据图13的A和表10的结果，在使用健康人来源的血浆的情况下，4个样本(试样)全部无法确认到发出超过阈值的荧光的阳性液滴，因而可知目标扩增产物[FOXB2基因的特定区域：由序列号11所表示的碱基序列构成的区域(149碱基对)]未被扩增。
根据图13的B和表11的结果，在使用健康人来源的血浆的情况下，4个样本(试样)全部确认到发出超过阈值的荧光的阳性液滴，因而可知目标扩增产物[GAPDH基因的特定区域：由序列号15所表示的碱基序列构成的区域(149碱基对)]被扩增。
即，分析对象区域被甲基化敏感性限制酶切断，可以判定不是甲基化状态。另外，可以判定血浆来源的对象(健康人)未罹患癌症或该对象(健康人)中不存在癌细胞。
实施例7使用了各种癌症患者来源的血浆的FOXB2基因的分析(FOXB2基因与GAPDH 基因的同时扩增/检测)
使用下述物质作为实施例6中的试样并且如下所述设定阈值，除此以外，通过与实施例6同样的方法进行扩增产物的确认。需要说明的是，实验分别使用1个试样(样本)，对于每1试样(样本)分别进行4次实验。将其结果分别示于图14～18。
·阈值
对于FOXB2基因，以FOXB2基因的扩增结果为参考，设定为荧光强度8000。另外，对于GAPDH基因，以GAPDH基因的扩增结果为参考，设定为荧光强度4000。
·试样
乳腺癌患者来源的血浆
大肠癌患者来源的血浆
胰腺癌患者来源的血浆
胃癌患者来源的血浆
抗癌药给药后的肺癌患者来源的血浆
另外，将图14～18中的试样、分析对象区域、阳性液滴数、阴性液滴数、总液滴数和阈值分别归纳于表12～16。
【表12】
【表13】
【表14】
【表15】
【表16】
根据图14的A和表12的结果，在使用乳腺癌患者来源的血浆的情况下，能够确认到发出超过阈值的荧光的阳性液滴(第1次：1个、第2次：1个)，因而可知得到了目标扩增产物[FOXB2基因的特定区域：由序列号11所表示的碱基序列构成的区域(149碱基对)]。
另外，根据图14的B和表12的结果，在使用乳腺癌患者来源的血浆的情况下，能够确认到发出超过阈值的荧光的阳性液滴(第1次：91个、第2次：129个、第3次：93个、第4次：147个)，因而可知得到了目标扩增产物[GAPDH基因的特定区域：由序列号15所表示的碱基序列构成的区域(149碱基对)]。
即，分析对象区域未被甲基化敏感性限制酶切断，可以判定为甲基化状态。另外，可以判定血浆来源的对象(乳腺癌患者)罹患癌症或该对象(乳腺癌患者)中存在癌细胞。
根据图15的A和表13的结果，在使用大肠癌患者来源的血浆的情况下，能够确认到发出超过阈值的荧光的阳性液滴(第1次：10个、第2次：9个、第3次：2个、第4次：10个)，因而可知得到了目标扩增产物[FOXB2基因的特定区域：由序列号11所表示的碱基序列构成的区域(149碱基对)]。
另外，根据图15的B和表13的结果，在使用大肠癌患者来源的血浆的情况下，能够确认到发出超过阈值的荧光的阳性液滴(第1次：94个、第2次：126个、第3次：93个、第4次：74个)，因而可知得到了目标扩增产物[GAPDH基因的特定区域：由序列号15所表示的碱基序列构成的区域(149碱基对)]。
即，分析对象区域未被甲基化敏感性限制酶切断，可以判定为甲基化状态。另外，可以判定血浆来源的对象(大肠癌患者)罹患癌症或该对象(大肠癌患者)中存在癌细胞。
根据图16的A和表14的结果，在使用胰腺癌患者来源的血浆的情况下，能够确认到发出超过阈值的荧光的阳性液滴(第2次：1个、第3次：2个、第4次：1个)，因而可知得到了目标扩增产物[FOXB2基因的特定区域：由序列号11所表示的碱基序列构成的区域(149碱基对)]。
另外，根据图16的B和表14的结果，在使用胰腺癌患者来源的血浆的情况下，能够确认到发出超过阈值的荧光的阳性液滴(第1次：65个、第2次：76个、第3次：81个、第4次：86个)，因而可知得到了目标扩增产物[GAPDH基因的特定区域：由序列号15所表示的碱基序列构成的区域(149碱基对)]。
即，分析对象区域未被甲基化敏感性限制酶切断，可以判定为甲基化状态。另外，可以判定血浆来源的对象(胰腺癌患者)罹患癌症或该对象(胰腺癌患者)中存在癌细胞。
根据图17的A和表15的结果，在使用胃癌患者来源的血浆的情况下，能够确认到发出超过阈值的荧光的阳性液滴(第1次：10个、第2次：9个、第3次：18个、第4次：13个)，因而可知得到了目标扩增产物[FOXB2基因的特定区域：由序列号11所表示的碱基序列构成的区域(149碱基对)]。
另外，根据图17的B和表15的结果，在使用胃癌患者来源的血浆的情况下，能够确认到发出超过阈值的荧光的阳性液滴(第1次：97个、第2次：101个、第3次：112个、第4次：139个)，因而可知得到了目标扩增产物[GAPDH基因的特定区域：由序列号15所表示的碱基序列构成的区域(149碱基对)]。
即，分析对象区域未被甲基化敏感性限制酶切断，可以判定为甲基化状态。另外，可以判定血浆来源的对象(胃癌患者)罹患癌症或该对象(胃癌患者)中存在癌细胞。
根据图18的A和表16的结果，在使用抗癌药给药后的肺癌患者来源的血浆的情况下，能够确认到发出超过阈值的荧光的阳性液滴(第2次：1个、第3次：1个)，因而可知得到了目标扩增产物[FOXB2基因的特定区域：由序列号11所表示的碱基序列构成的区域(149碱基对)]。
另外，根据图18的B和表16的结果，在使用抗癌药给药后的肺癌患者来源的血浆的情况下，能够确认到发出超过阈值的荧光的阳性液滴(第1次：85个、第2次：82个、第3次：62个、第4次：92个)，因而可知得到了目标扩增产物[GAPDH基因的特定区域：由序列号15所表示的碱基序列构成的区域(149碱基对)]。
即，分析对象区域未被甲基化敏感性限制酶切断，可以判定为甲基化状态。另外，可以判定血浆来源的对象(抗癌药给药后的肺癌患者)罹患癌症或该对象(抗癌药给药后的肺癌患者)中存在癌细胞。
由实施例6和7可知，根据本发明的方法，即使是靶基因和作为内源性对照所选择的基因的同时扩增/检测，也能够进行甲基化的分析对象区域的扩增以及甲基化的判定和癌症的判定。
因此，大大暗示了在实际的临床现场中能够应用本发明的方法的可能性。
另外，根据实施例8的图18，即使在使用了抗癌药给药后的癌症患者来源的血浆的情况下，也得到了目标扩增产物，因而暗示了能够将本发明用于抗癌药给药、放射性照射、手术预后等的经过观察的可能性。
工业实用性
根据本发明的扩增方法、甲基化判定方法、癌症的判定方法和获得用于进行癌症的判定的数据的方法，能够简便、短时间且高精度地进行甲基化的DNA的扩增、DNA的甲基化的判定、癌症的判定和用于进行癌症判定的数据的获得。
序列表
<110> 和光纯药工业株式会社(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
<120> 甲基化DNA的扩增方法、DNA的甲基化判定方法以及癌症的判定方法(Amplification Method for Methylation DNA, Determination Method
for Methylation DNA and Determination Method for Cancer)
<130> 2055PCT
<150> JP2016-171550
<151> 2016-09-02
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 267
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 1
caaggtcgga gacaccaggc aattcggaga aggcaggaga gagaagcaga gagggcctgg 60
agggcgagag ggcaaagtgg cgggactgga ggggccgagt gggaattagt gggggcagcc 120
aggccccagg aacggagtgc ggagagattc tgtggtccag tgcgggccgg agggcggtgg 180
aggagccggg ggcgatgccg cggccgggga agagctcgta cagcgaccaa aaaccgccct 240
actcttacat ctcgctgacc gccatgg 267
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 2
caaggtcgga gacaccaggc aattc 25
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 3
ccatggcggt cagcgagatg taag 24
<210> 4
<211> 433
<212> DNA
<213> 犬(Canis familiaris)
<400> 4
gagctccctt ctcctgacct cgcctctccg ctccaggacc accacggctg cggcgcgggc 60
cggctcggcg cccgagcggg gggcagcctc cgggcgcggc cagcctcgcc tccccggccc 120
tccaggagcg cgagcgccga ctcggacttg aagcgccggg gtcccgcctg tccagtcctt 180
cctcgccgcc cgctgggcct gggcttccct cggaccgaga gaaagcaaga gaggaggccg 240
ggagggaaca cggccctgcg gagcacgcct cggccgccgg ctccagcgcg cggtctcgga 300
ccacctgggg gagccgcgcg gagggcgcgg ggggcgcggg ggcacctggc gcgccccgtc 360
ctccactcgg cgcgcgggtc ggccaccgtc gggcgcacgc tgcgagcggc cgagagcgga 420
gctggccgga gag 433
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 5
gagctccctt ctcctgacct cg 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 6
ctctccggcc agctccgctc tc 22
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 7
ggaattagtg ggggcagcca ggccccagg 29
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 8
cccaaaaact acccttacca aactaatc 28
<210> 9
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 9
ttaccataag cttggaatta gtgggggcag ccaggcccca gg 42
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 10
taattaagga tcccccaaaa actaccctta ccaaactaatc 41
<210> 11
<211> 149
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 11
ctggaggggc cgagtgggaa ttagtggggg cagccaggcc ccaggaacgg agtgcggaga 60
gattctgtgg tccagtgcgg gccggagggc ggtggaggag ccgggggcga tgccgcggcc 120
ggggaagagc tcgtacagcg accaaaaac 149
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 12
ctggaggggc cgagtgggaa ttag 24
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 13
gtttttggtc gctgtacgag ctcttc 26
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸探针
<400> 14
cacagaatct ctccgcactc cgttc 25
<210> 15
<211> 149
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 15
gaagcttgtc atcaatggaa atcccatcac catcttccag gagtgagtgg aagacagaat 60
ggaagaaatg tgctttgggg aggcaactag gatggtgtgg ctcccttggg tatatggtaa 120
ccttgtgtcc ctcaatatgg tcctgtccc 149
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 16
gaagcttgtc atcaatggaa atccc 25
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 17
gggacaggac catattgagg gacac 25
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸探针
<400> 18
caactaggat ggtgtggctc ccttg 25

Claims (17)

1.一种双链DNA中的甲基化的分析对象区域的扩增方法，其包括下述步骤1和2：
(1)步骤1，利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶对包含分析对象区域的双链DNA进行处理；
(2)步骤2，对步骤1中处理后的双链DNA的分析对象区域进行扩增。
2.如权利要求1所述的扩增方法，其中，所述步骤1在利用S1核酸酶进行处理后，利用甲基化敏感性限制酶进行处理。
3.如权利要求1所述的扩增方法，其中，所述步骤1在利用甲基化敏感性限制酶进行处理后，利用S1核酸酶进行处理。
4.如权利要求1所述的扩增方法，其中，在所述步骤1之前，包括利用在分析对象区域内不存在识别序列的限制酶进行处理的片段化步骤。
5.一种双链DNA中的分析对象区域的甲基化判定方法，其包括下述步骤1～4：
(1)步骤1，利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶对包含分析对象区域的双链DNA进行处理；
(2)步骤2，对步骤1中处理后的双链DNA的分析对象区域进行扩增；
(3)步骤3，确认步骤2中得到的扩增产物的有无；
(4)步骤4，基于步骤3的结果，判定分析对象区域是否被甲基化。
6.如权利要求5所述的甲基化判定方法，其中，所述步骤1在利用S1核酸酶进行处理后，利用甲基化敏感性限制酶进行处理。
7.如权利要求5所述的甲基化判定方法，其中，所述步骤1在利用甲基化敏感性限制酶进行处理后，利用S1核酸酶进行处理。
8.如权利要求5所述的甲基化判定方法，其中，在所述步骤1之前，包括利用在分析对象区域内不存在识别序列的限制酶进行处理的片段化步骤。
9.一种DNA的甲基化判定用试剂，其包含S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶。
10.一种癌症的判定方法，其包括下述步骤1～4：
(1)步骤1，利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶对包含分析对象区域的双链DNA进行处理；
(2)步骤2，对步骤1中处理后的双链DNA的分析对象区域进行扩增；
(3)步骤3，确认步骤2中得到的扩增产物的有无；
(4)步骤4，基于步骤3的结果，对癌症进行判定。
11.如权利要求10所述的癌症的判定方法，其中，所述步骤1在利用S1核酸酶进行处理后，利用甲基化敏感性限制酶进行处理。
12.如权利要求10所述的癌症的判定方法，其中，所述步骤1在利用甲基化敏感性限制酶进行处理后，利用S1核酸酶进行处理。
13.如权利要求10所述的癌症的判定方法，其中，在所述步骤1之前，包括利用在分析对象区域内不存在识别序列的限制酶进行处理的片段化步骤。
14.如权利要求10所述的癌症的判定方法，其中，分析对象区域为包含序列号1、序列号4或序列号11所表示的碱基序列的碱基序列。
15.一种获得用于进行癌症的判定的数据的方法，其包括下述步骤1～3：
(1)步骤1，利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶对包含分析对象区域的双链DNA进行处理；
(2)步骤2，对步骤1中处理后的双链DNA的分析对象区域进行扩增；
(3)步骤3，确认步骤2中得到的扩增产物的有无。
16.一种癌症的判定用试剂，其包含S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶。
17.一种用于进行癌症的判定的标志物，其通过进行下述步骤1和2而获得：
(1)步骤1，利用S1核酸酶和甲基化敏感性限制酶对包含分析对象区域的双链DNA进行处理；
(2)步骤2，对步骤1中处理后的双链DNA的分析对象区域进行扩增。
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