JP5206059B2 - メチル化されたdnaの含量を測定する方法 - Google Patents
メチル化されたdnaの含量を測定する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5206059B2 JP5206059B2 JP2008077966A JP2008077966A JP5206059B2 JP 5206059 B2 JP5206059 B2 JP 5206059B2 JP 2008077966 A JP2008077966 A JP 2008077966A JP 2008077966 A JP2008077966 A JP 2008077966A JP 5206059 B2 JP5206059 B2 JP 5206059B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- stranded
- base sequence
- region
- stranded dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/154—Methylation markers
Description
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、簡便にメチル化されたDNAを定量又は検出する方法を提供することを目的とする。
[発明1]
生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの含量を測定する方法であって、
(1)生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料をメチル化感受性制限酵素による消化処理を行う第一工程、
(2)第一工程で得られた消化処理が行われたDNA試料から目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)を取得し、該一本鎖DNA(正鎖)と、該一本鎖DNAの3’末端の一部(但し、前記の目的とするDNA領域を含まない。)に対して相補性のある塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させることにより、前記一本鎖DNAを選択する第二工程、
(3)第二工程で選択された一本鎖DNAを鋳型として、前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、該プライマーを1回伸長させることにより、前記一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第三工程、及び、
(4)下記の各本工程の前工程として、第三工程で得られた伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離する工程(前工程)を有し、且つ、本工程として
(a)生成した一本鎖状態であるDNA(正鎖)と前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチド(負鎖)とを結合させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを選択する第A1工程と、
第A1工程で選択された一本鎖状態であるDNAを鋳型として、前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、該プライマーを1回伸長させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第A2工程と、を有する第A工程(本工程)と、
(b)生成した一本鎖状態であるDNA(負鎖)を鋳型として、前記一本鎖状態であるDNA(負鎖)が有する塩基配列の部分塩基配列(負鎖)であって、且つ、前記目的とするDNA領域の塩基配列(正鎖)に対して相補性のある塩基配列(負鎖)の3’末端より更に3’末端側に位置する部分塩基配列(負鎖)に対して相補性のある塩基配列(正鎖)を有するプライマー(リバース用プライマー)を伸長プライマーとして、該伸長プライマーを1回伸長させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第B工程(本工程)とを有し、
更に前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する第四工程、
を有することを特徴とする方法。
[発明2]
第二工程において目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)と、該一本鎖DNAの3’末端の一部(但し、前記目的とするDNA領域を含まない。)に対して相補性のある塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させる際に、二価陽イオンを含有する反応系中で結合させる発明1に記載の方法。
[発明3]
二価陽イオンがマグネシウムイオンである発明2に記載の方法。
[発明4]
第四工程の前工程の前操作段階において、
前記目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)の3’末端の一部(但し、前記目的とするDNA領域を含まない。)に対して相補性のある塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド(負鎖)を反応系内に添加する工程(追加前工程)を追加的に有し、且つ、
第四工程の各本工程として、下記の1つの工程を更に追加的に有する方法。
(c)(i)生成した一本鎖状態であるDNA(正鎖)と、前記追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド(負鎖)とを結合させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを選択する第C1工程と、
(ii)第C1工程で選択された一本鎖状態であるDNAを鋳型として、前記一本鎖オリゴヌクレオチド(負鎖)をプライマーとして、該プライマーを1回伸長させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第C2工程とを有する第C工程(本工程)
[発明5]
第四工程の前工程の後操作段階において、
前記目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)の3’末端の一部(但し、前記目的とするDNA領域を含まない。)に対して相補性のある塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド(負鎖)を反応系内に添加する工程(追加前工程)を追加的に有し、且つ、
第三工程及び前記追加前工程を経て得られた未消化物である伸長形成された二本鎖DNA(前記メチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のCpG対を含まない伸長形成された二本鎖DNA)を一本鎖状態に一旦分離する工程(追加再前工程)を有し、且つ、
第四工程の各本工程として、下記の1つの工程を更に追加的に有する方法。
(c)(i)生成した一本鎖状態であるDNA(正鎖)と、前記追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド(負鎖)とを結合させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを選択する第C1工程と、
(ii)第C1工程で選択された一本鎖状態であるDNAを鋳型として、前記一本鎖オリゴヌクレオチド(負鎖)をプライマーとして、該プライマーを1回伸長させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第C2工程とを有する第C工程(本工程)
[発明6]
発明1〜5のいずれか一に記載の方法の工程として、下記の2つの工程を更に追加的に有するメチル化割合の測定方法。
(5)発明1〜5のいずれか一に記載の方法の第一工程を行うことなく、発明1〜5のいずれか一に記載の方法における第二工程から第四工程を行うことにより、前記目的とするDNA領域のDNA(メチル化されたDNA及びメチルされていないDNAの総量)を検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する第五工程、及び、
(6)発明1〜5のいずれか一に記載の第四工程により定量されたDNAの量と、第五工程により定量されたDNAの量とを比較することにより得られる差異に基づき前記目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの割合を算出する第六工程
[発明7]
生物由来検体が、哺乳動物の血清又は血漿である発明1〜6のいずれか一に記載の方法。
[発明8]
生物由来検体が、哺乳動物の血液又は体液である発明1〜6のいずれか一に記載の方法。
[発明9]
生物由来検体が、細胞溶解液又は組織溶解液である発明1〜6のいずれか一に記載の方法。
[発明10]
生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料が、該ゲノムDNAが有する目的とするDNA領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるDNA試料である発明1〜9のいずれか一に記載の方法。
[発明11]
生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料が、予め精製されてなるDNA試料である発明1〜10のいずれか一に記載の方法。
[発明12]
メチル化感受性制限酵素による消化処理が、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)と、メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドとを混合することにより、該メチル化感受性制限酵素の認識部位が保護されてなる一本鎖DNAを生成させる第一(A)工程と、
第一(A)工程で選択された一本鎖DNAをメチル化感受性制限酵素で消化処理する第一(B)工程とからなる消化処理である発明1〜11のいずれか一に記載の方法。
[発明13]
メチル化感受性制限酵素が、生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域の中に認識切断部位を有する制限酵素である発明1〜12のいずれか一に記載の方法。
[発明14]
メチル化感受性制限酵素が、HpaII又はHhaIである発明1〜13のいずれか一に記載の方法。
[発明15]
生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの含量を測定する方法であって、
(1)生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料をメチル化感受性制限酵素による消化処理を行う第一工程、
(2)第一工程で得られた消化処理が行われたDNA試料から目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)を取得し、該一本鎖DNA(正鎖)と、該一本鎖DNAの一部に対して相補性のある塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させることにより、前記の一本鎖DNAを選択する第二工程、
(3)第二工程で選択された一本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離する工程を有し、生成した一本鎖状態であるDNA(正鎖)を鋳型として、前記目的とするDNA領域の塩基配列(正鎖)の3’末端より更に3’末端側に位置する部分塩基配列(正鎖)に対して相補性のある塩基配列(負鎖)を有するフォーワード用プライマーを伸長プライマーとして、該プライマーを1回伸長させることにより、前記一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第三工程、及び、
(4)下記各本工程の前工程として、第三工程で得られた伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離する工程(前工程)を有し、且つ、本工程として
(a)生成した一本鎖状態であるDNA(正鎖)と前記フォーワード用プライマー(負鎖)とを結合させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを選択する第A1工程と、第A1工程で選択された一本鎖状態であるDNAを鋳型として、前記フォーワード用プライマーを伸長プライマーとして、該プライマーを1回伸長させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第A2工程とを有する第A工程(本工程)と、
(b)生成した一本鎖状態であるDNA(負鎖)を鋳型として、前記一本鎖状態であるDNA(負鎖)が有する塩基配列の部分塩基配列(負鎖)であって、且つ、前記目的とするDNA領域の塩基配列(正鎖)に対して相補性のある塩基配列(負鎖)の3’末端より更に3’末端側に位置する部分塩基配列(負鎖)、に対して相補性のある塩基配列(正鎖)を有するリバース用プライマーを伸長プライマーとして、該伸長プライマーを1回伸長させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第B工程(本工程)とを有し、
更に第四工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する第四工程、
を有することを特徴とする方法。
[発明16]
一本鎖固定化オリゴヌクレオチドが、5’或いは3’末端が固定化されてなる一本鎖固定化オリゴヌクレオチドである発明15に記載の方法。
[発明17]
第二工程において目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)と、該一本鎖DNAの3’末端の一部(但し、前記目的とするDNA領域を含まない。)に対して相補性のある塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させる際に、二価陽イオンを含有する反応系中で結合させる発明15又は16に記載の方法。
[発明18]
発明15又は16に記載の方法の工程として、下記の2つの工程を更に追加的に有するメチル化割合の測定方法。
(5)発明15又は16に記載の方法の第一工程を行うことなく、発明1〜5のいずれか一に記載の方法における第二工程から第四工程を行うことにより、前記目的とするDNA領域のDNA(メチル化されたDNA及びメチルされていないDNAの総量)を検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する第五工程、及び、
(6)発明15又は16に記載の第四工程により定量されたDNAの量と、第五工程により定量されたDNAの量とを比較することにより得られる差異に基づき前記目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの割合を算出する第六工程
[発明19]
生物由来検体が、哺乳動物の血清又は血漿である発明15又は16に記載の方法。
[発明20]
生物由来検体が、哺乳動物の血液又は体液である発明15又は16に記載の方法。
[発明21]
生物由来検体が、細胞溶解液又は組織溶解液である発明15又は16に記載の方法。
[発明22]
生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料が、該ゲノムDNAが有する目的とするDNA領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるDNA試料である発明15又は16に記載の方法。
[発明23]
生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料が、予め精製されてなるDNA試料である発明15又は16に記載の方法。
[発明24]
メチル化感受性制限酵素による消化処理が、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)と、メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドとを混合することにより、該メチル化感受性制限酵素の認識部位が保護されてなる一本鎖DNAを生成させる第一(A)工程と、
第一(A)工程で選択された一本鎖DNAをメチル化感受性制限酵素で消化処理する第一(B)工程とからなる消化処理である発明15又は16に記載の方法。
[発明25]
メチル化感受性制限酵素が、生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域の中に認識切断部位を有する制限酵素である発明15又は16に記載の方法。
[発明26]
メチル化感受性制限酵素が、HpaII又はHhaIである発明15又は16に記載の方法。
本発明における「生物由来検体」としては、例えば、細胞溶解液、組織溶解液(ここでの組織とは、血液、リンパ節等を含む広義の意味である。)若しくは、哺乳動物においては、血漿、血清、リンパ液等の体液、体分泌物(尿や乳汁等)等の生体試料及びこれら生体試料から抽出して得られたゲノムDNAを挙げることができる。前記生物由来検体中には、例えば、微生物やウイルスを含んでいる可能性がある。従って、本発明における「ゲノムDNA」とは、生物由来検体自身のゲノムDNAに留まらず、生物由来検体中に含まれる微生物やウイルスのゲノムDNAをも含んだものである。哺乳動物由来の検体が血液である場合には、定期健康診断や簡便な検査等での本発明の利用が期待できる。
ゲノムDNAを哺乳動物由来の検体から得るには、例えば、市販のDNA抽出用キット等を用いてDNAを抽出すればよい。因みに、血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体として、その中に含まれる遊離DNA(胃癌細胞等の癌細胞由来のDNAが含まれる)を分析すると、血球由来のDNAを避けて胃癌細胞等の癌細胞由来のDNAを解析することができ、胃癌細胞等の癌細胞、それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
尚、前記ゲノムDNA由来のDNA試料は、所定の方法により予め精製されてなるDNA試料であってもよい。
「CpG対」とは、CpGで示される塩基配列と、これに相補するCpGが結合してなる二本鎖オリゴヌクレオチドを意味するものである。
「目的とするDNA領域(に対して相補性である塩基配列)を含む一本鎖DNA」とは、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAとの結合体(二本鎖)を形成するために必要な塩基配列、即ち、目的とするDNA領域の塩基配列の一部に相補的な塩基配列を含む塩基配列であることを意味し、「相補的塩基配列」と表現することもある。また、相補的塩基配列は、「相補的」と表現することもある。
「メチル化感受性制限酵素」とは、例えば、メチル化されたシトシンを含む認識配列を消化せず、メチル化されていないシトシンを含む認識配列のみを消化することのできる制限酵素等を意味する。即ち、メチル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されているDNAの場合には、該メチル化感受性制限酵素を該DNAに作用させても、該DNAは切断されない。これに対して、メチル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されていないDNAの場合には、該メチル化感受性制限酵素を該DNAに作用させれば、該DNAは切断される。このようなメチル化感受性酵素の具体的な例としては、例えば、HpaII、BstUI、NarI、SacII、HhaI等を挙げることができる。尚、前記メチル化感受性制限酵素は、すでにGruenbaumらにより明らかにされている(Nucleic Acid Research, 9、 2509-2515)。
この場合、「マスキング用オリゴヌクレオチド」とは、メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、一本鎖DNA中の目的とするDNA領域に含まれる数箇所あるメチル化感受性制限酵素の認識配列のうち、少なくとも1箇所(全ての個所でも良い)と相補的に結合することで二本鎖を形成し(即ち、前記箇所を二本鎖状態にして)、二本鎖DNAのみを基質とするメチル化感受性制限酵素でも前記箇所を消化できるように、また、試料が一本鎖DNAである場合、一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素(一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素は二本鎖DNAも消化でき、その消化効率は、二本鎖DNAに対する方が一本鎖DNAに対するよりも高い)での前記箇所の消化効率を向上させることができるようにするためのオリゴヌクレオチドであり、且つ、目的とする領域のDNAを含む一本鎖DNAと一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとの二本鎖の形成を阻害しないオリゴヌクレオチドを意味する。また、該マスキング用オリゴヌクレオチドは、後述のリバース用プライマー(正鎖)を伸長プライマーとして、該マスキング用オリゴヌクレオチド(負鎖)を鋳型として、伸長プライマーを伸長させる反応に利用できないオリゴヌクレオチドでなければならない。尚、塩基長としては、8〜200塩基長が望ましい。
ゲノムDNA由来のDNA試料に混合させるマスキング用オリゴヌクレオチドは、1種類でもよく複数種類でも良い。複数種類を用いると、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAのメチル化感受性制限酵素の認識部位の多くが二本鎖状態になり、メチル化感受性制限酵素での、後述の「DNAの切れ残し」を最小限に抑えることができる。マスキング用オリゴヌクレオチドは、例えば、目的とするDNA領域に含まれる数箇所あるメチル化感受性制限酵素の認識配列のうち、メチル化している場合には消化せずにメチル化していない場合には消化したい箇所(例えば、疾患患者検体では100%メチル化されており、健常者検体では100%メチル化されていない箇所等)に応じて設計し、これを使用することが特に有用である。
本固定化オリゴヌクレオチドは、生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料から、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)を選択するために用いられる。本固定化オリゴヌクレオチドは、5〜50塩基長であることが好ましい。
本固定化オリゴヌクレオチドの5’末端側は、担体と固定化され得るものであり、一方その3’末端側は、後述する第三工程及び第A2工程により5’末端から3’末端に向かって進行する一回伸長反応が可能なようにフリーな状態であってもよい。
または、本固定化オリゴヌクレオチドは、5’或いは3’末端が担体と固定化されてもよい。
このような構造を得るには、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)の3’末端の一部(但し、前記目的とするDNA領域を含まない。)に対して相補性である塩基配列を有するオリゴヌクレオチド(以下、本オリゴヌクレオチドと記すこともある。)の5’末端を通常の遺伝子工学的な操作方法又は市販のキット・装置等に従い、担体に固定すればよい(固相への結合)。具体的には例えば、本オリゴヌクレオチドの5’末端をビオチン化した後、得られたビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体(例えば、ストレプトアビジンで被覆したPCRチューブ、ストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズ等)に固定する方法を挙げることができる。
また、本オリゴヌクレオチドの5’末端側に、アミノ基、アルデヒド基、チオール基等の活性官能基を有する分子を共有結合させた後、これを表面がシランカップリング剤等で活性化させたガラス、シリカ若しくは耐熱性プラスチック製の支持体に、例えば、トリグリセリドを5個直列に連結したもの等のスペーサー、クロスリンカー等を介して共有結合させる方法も挙げられる。またさらに、ガラス若しくはシリコン製の支持体の上で直接、本オリゴヌクレオチドの5’末端側から化学合成させる方法も挙げられる。
(a)まず、生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料に、アニーリングバッファー及びビオチン化オリゴヌクレオチド(該一本鎖DNA(正鎖)と本固定化オリゴヌクレオチドとの結合後の段階で、本固定化オリゴヌクレオチドと担体との結合により固定化されるものであるために、現段階では遊離状態にあるもの)を添加することにより、混合物を得る。次いで、得られた混合物を、生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料に存在する目的とするDNA領域を含む二本鎖DNAを一本鎖にするために、95℃で数分間加熱する。その後、ビオチン化オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、ビオチン化オリゴヌクレオチドのTm値の約10〜20℃低い温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温する。
(b)その後、室温に戻す。
(c)ストレプトアビジンで被覆した支持体に、上記(b)で得られた混合物を添加し、さらに、これを37℃で数分間保温することにより、ビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体に固定する。
因みに、前述の如く、上記(a)〜(c)では、前記目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)と、ビオチン化オリゴヌクレオチドとの結合を、ビオチン化オリゴヌクレオチドとストレプトアビジンで被覆した支持体との固定よりも前段階で実施しているが、この順番は、どちらが先でも構わない。即ち、例えば、ストレプトアビジンで被覆した支持体に固定化されたビオチン化オリゴヌクレオチドに、生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料を添加することにより混合物を得て、得られた混合物を生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料に存在する目的とするDNA領域を含む二本鎖DNAを一本鎖にするために、95℃で数分間加熱し、その後ビオチン化オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、ビオチン化オリゴヌクレオチドのTm値の約10〜20℃低い温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温してもよい。
(d)このようにしてビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体に固定した後、残溶液の除去及び洗浄(DNA精製)を行う。
より具体的には例えば、ストレプトアビジンで被覆したPCRチューブを使用する場合には、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、これに生物由来検体の容量と略等量のTEバッファーを添加し、その後該TEバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。またストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズを使用する場合には、磁石によりビーズを固定した後、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、生物由来検体の容量と略等量のTEバッファーを添加し、その後該TEバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。
次いで、このような操作を数回実施することにより、残溶液の除去及び洗浄(DNA精製)を行う。
該操作は、固定化されていないDNA、又は、後述の制限酵素で消化された溶液中に浮遊しているDNA、を反応溶液から取り除くため、重要である。これら操作が不十分であれば、反応溶液中に浮遊しているDNAが鋳型となり、増幅反応で予期せぬ増幅産物が得られることとなる。支持体と生物由来検体中DNAとの非特異的結合を避けるためには、目的領域とはまったく異なる塩基配列を有するDNA(例えば、ヒトの生物由来検体の場合は、ラットDNA等)を大量に生物由来検体に添加し、上記の操作を実施すればよい。
第二工程で選択された前記目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAに、滅菌超純水を17.85μL、最適な10×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2)を3μL、2mM dNTPを3μL、5N ベタインを6μL加え、次いで該混合物にAmpliTaq(DNAポリメラーゼの1種:5U/μL)を0.15μL加えて液量を30μLとし、37℃で2時間インキュベーションする。その後、インキュベーションされた溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、これに生物由来検体の容量と略等量のTEバッファーを添加し、該TEバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。
より具体的には例えば、ストレプトアビジンで被覆したPCRチューブを使用する場合には、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、これに生物由来検体の容量と略等量のTEバッファーを添加し、その後該TEバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。またストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズを使用する場合には、磁石によりビーズを固定した後、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、生物由来検体の容量と略等量のTEバッファーを添加し、その後該TEバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。次いで、このような操作を数回実施することにより、残溶液の除去及び洗浄(DNA精製)を行う。
この場合の方法としては、具体的に例えば、二本鎖DNAを一本鎖にするために、95℃で数分間加熱すればよい。さらに、フォーワード用プライマーを添加した後、フォーワード用プライマーのTm値の約10〜20℃低い温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温し、前記の生成した一本鎖状態であるDNA(正鎖)とフォーワード用プライマーとの二本鎖を形成させる。生成した二本鎖DNAの溶液に、最適な10×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2)を3μL、2mM dNTPを3μL、5N ベタインを6μL加え、次いで当該混合物にAmpliTaq(DNAポリメラーゼの1種:5U/μL)を0.15μL加え、滅菌超純水を加えて液量を30μLとし、37℃で2時間インキュベーションする。
なお、第三工程は、第四工程と独立に実施しても良いし、第四工程で実施されるPCR反応と連続して実施しても構わない。
(a)生成した一本鎖状態であるDNA(正鎖)と前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチド(負鎖)とを結合させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを選択する第A1工程と、第A1工程で選択された一本鎖状態であるDNAを鋳型として、前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、該プライマーを1回伸長させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第A2工程とを有する第A工程(本工程)と、
(b)生成した一本鎖状態であるDNA(負鎖)を鋳型として、前記一本鎖状態であるDNA(負鎖)が有する塩基配列の部分塩基配列(負鎖)であって、且つ、前記目的とするDNA領域の塩基配列(正鎖)に対して相補性である塩基配列(負鎖)の3’末端よりさらに3’末端側に位置する部分塩基配列(負鎖)、に対して相補性である塩基配列(正鎖)を有する伸長プライマー(リバース用プライマー)を伸長プライマーとして、該伸長プライマーを1回伸長させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第B工程(本工程)とを有し、
さらに第四工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する。
その後、本工程として、
(i)生成した一本鎖状態であるDNA(正鎖)を、前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチド(負鎖)にアニーリングさせるために、前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチド(負鎖)のTm値の約10〜20℃低い温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温する。
(ii)その後、室温に戻す。(第A工程における第A1工程)
(iii)上記(i)で選択された一本鎖状態であるDNAを鋳型として、前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、該プライマーを1回伸長させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる(即ち、第A工程における第A2工程)。具体的には例えば、後述の説明や前述の本発明の第二工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよい。
(iv)生成した一本鎖状態であるDNA(負鎖)を鋳型として、前記一本鎖状態であるDNA(負鎖)が有する塩基配列の部分塩基配列(負鎖)であって、且つ、前記目的とするDNA領域の塩基配列(正鎖)に対して相補性である塩基配列(負鎖)の3’末端よりさらに3’末端側に位置する部分塩基配列(負鎖)、に対して相補性である塩基配列(正鎖)を有する伸長プライマー(リバース用プライマー))を伸長プライマー(リバース用プライマー)として、該伸長プライマーを1回伸長させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる(即ち、第B工程)。具体的には例えば、上記(iii)と同様に、後述の説明や前述の本発明の第二工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよい。
(v)さらに第四工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すこと(例えば、第A工程及び第B工程)により、前記目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する。具体的には例えば、上記と同様に、後述の説明や前述の本発明の第四工程における前工程、第A工程及び第B工程での操作方法等に準じて実施すればよい。
目的とするDNA領域(即ち、目的領域)は、GCリッチな塩基配列が多いため、時に、ベタイン、DMSO等を適量加えて反応を実施してもよい。反応条件としては、例えば、前記ような反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて30秒間次いで55〜65℃にて30秒間さらに72℃にて30秒間を1サイクルとする保温を30〜40サイクル行う条件があげられる。かかるPCRを行った後、得られた増幅産物を検出する。例えば、予め標識されたプライマーを使用した場合には、先と同様の洗浄・精製操作を実施後、固定化された蛍光標識体の量を測定することができる。また、標識されていない通常のプライマーを用いたPCRを実施した場合は、金コロイド粒子、蛍光等で標識したプローブ等をアニーリングさせ、目的領域に結合した該プローブの量を測定することにより検出することができる。また、増幅産物の量をより精度よく求めるには、例えば、リアルタイムPCR法を用いればよい。リアルタイムPCR法とは、PCRをリアルタイムでモニターし、得られたモニター結果をカイネティックス分析する方法であり、例えば、遺伝子量に関して2倍程度のほんのわずかな差異をも検出できる高精度の定量PCR法として知られる方法である。該リアルタイムPCR法には、例えば、鋳型依存性核酸ポリメラーゼプローブ等のプローブを用いる方法、サイバーグリーン等のインターカレーターを用いる方法等を挙げることができる。リアルタイムPCR法のための装置及びキットは市販されるものを利用してもよい。以上の如く、検出については特に限定されることはなく、これまでに周知のあらゆる方法による検出が可能である。これら方法では、反応容器を移し換えることなく検出までの操作が可能となる。
即ち、
本発明の第四工程の前工程の前操作段階において、
前記目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)の3’末端の一部(但し、前記目的とするDNA領域を含まない。)に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド(負鎖)を反応系内に添加する工程(追加前工程)を追加的に有し、且つ、
本発明の第四工程の各本工程として、下記の1つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法。
(c)(i)生成した一本鎖状態であるDNA(正鎖)と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド(負鎖)とを結合させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを選択する第C1工程と、
(ii)第C1工程で選択された一本鎖状態であるDNAを鋳型として、前記一本鎖オリゴヌクレオチド(負鎖)をプライマーとして、該プライマーを1回伸長させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第C2工程とを有する第C工程(本工程)
本発明の第四工程の前工程の後操作段階において、
前記目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)の3’末端の一部(但し、前記目的とするDNA領域を含まない。)に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド(負鎖)を反応系内に添加する工程(追加前工程)を追加的に有し、且つ、第三工程及び上記の追加前工程を経て得られた未消化物である伸長形成された二本鎖DNA(前記メチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のCpG対を含まない伸長形成された二本鎖DNA)を一本鎖状態に一旦分離する工程(追加再前工程)を有し、且つ、
本発明の第四工程の各本工程として、下記の1つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法(以下、本発明メチル化割合測定方法と記すこともある。)
(c)(i)生成した一本鎖状態であるDNA(正鎖)と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド(負鎖)とを結合させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを選択する第C1工程と、
(ii)第C1工程で選択された一本鎖状態であるDNAを鋳型として、前記一本鎖オリゴヌクレオチド(負鎖)をプライマーとして、該プライマーを1回伸長させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第C2工程とを有する第C工程(本工程)
また、第B工程における「生成した一本鎖状態であるDNA(負鎖)」とは、第1回目の第四工程の操作及び第2回目以降の第四工程の繰り返し操作の両操作において「生成した『固定の』一本鎖状態であるDNA(正鎖)」を意味する。但し、第四工程がさらに追加的にC工程を有する場合には、第1回目の第四工程の操作において「生成した『固定の』一本鎖状態であるDNA(正鎖)」を意味し、一方、第2回目以降の第四工程の繰り返し操作において「生成した『固定の』一本鎖状態であるDNA(正鎖)」と「生成した『遊離の』一本鎖状態であるDNA(正鎖)」との両者を意味することになる。
尚、第四工程がさらに追加的にC工程を有する場合にも同様である。
(5)本発明(前記変法を含む)の第一工程及び第二工程を行った後、本発明(前記変法を含む)の第三工程を行うことなく、本発明(前記変法を含む)の第四工程を行うことにより、前記目的とするDNA領域のDNA(メチル化されたDNA及びメチルされていないDNAの総量)を検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する第五工程、及び、
(6)本発明(前記変法を含む)の第四工程により定量されたDNAの量と、第五工程により定量されたDNAの量とを比較することにより得られる差異に基づき前記目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの割合を算出する第六工程
各種疾患(例えば、癌)においてDNAのメチル化異常が起こることが知られており、このDNAメチル化異常を検出することにより、各種疾患の度合いを測定することが可能と考えられている。例えば、疾患由来の生物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおいて100%メチル化されているDNA領域があり、そのDNA領域について本発明又は本発明メチル化割合測定方法を実施すれば、測定されるメチル化されたDNAの量は多くなり、例えば、疾患由来の生物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおいて100%メチル化されていないDNA領域があり、そのDNA領域について本発明又は本発明メチル化割合測定方法を実施すれば、測定されるメチル化されたDNAの量はほぼ0に近い値となるであろう。また、例えば、健常者の生物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおいてメチル化割合が低く且つ疾患患者の生物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおいてメチル化割合が高いDNA領域があり、そのDNA領域について、本発明又は本発明メチル化割合測定方法を実施すれば、健常者の場合にはメチル化されたDNAの量は0に近い値を示し、一方、疾患患者の場合には健常者の場合における値よりも有意に高い値を示すため、この値の差異に基づき、「疾患の度合い」を判定することができる。ここでの「疾患の度合い」とは、一般に該分野において使用される意味と同様であって、具体的には、例えば、生物由来検体が細胞である場合には該細胞の悪性度を意味し、また例えば、生物由来検体が組織である場合には該組織における疾患細胞の存在量等を意味している。さらに、生物由来検体が血漿・血清である場合にはその個体が疾患を有する確率を意味している。従って、本発明又は本発明メチル化割合測定方法は、メチル化異常を調べることにより、各種疾患を診断することを可能にする。
配列番号17で示される塩基配列からなるHpaIIの認識配列がメチル化されているメチル化オリゴヌクレオチドGPR−2079−2176/98mer-M(7)、及び、配列番号2で示される塩基配列からなるHpaIIの認識配列がメチル化されていないアンメチル化オリゴヌクレオチドGPR−2079−2176/98mer-UMを合成して、夫々につき0.001pmol/10μL TEバッファー溶液を調製した。
Nはメチル化シトシンを示す。
GPR7-2079-2176/98mer-M(7):
5’- GTTGGCCACTGCGGAGTCGNGCNGGGTGGCNGGCCGCACCTACAGNGCCGNGNGNGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3’ (配列番号17)
<HpaIIの認識配列がメチル化されていないアンメチル化オリゴヌクレオチド>
GPR7-2079-2176/98mer-UM:
5’- GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCGGCCGCACCTACAGCGCCGCGCGCGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3’ (配列番号18)
MA:5’- GCCACCCGGCGCGA -3’ (配列番号19)
Bio-GPR7-2176R:5’- GCACGACGAGTGTGACGATC -3’ (配列番号20)
次いで、前記PCRチューブから溶液を除去した後、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO・7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加し、該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した。
PF1:5’-GTTGGCCACTGCGGAGTCG-3’ (配列番号21)
PR1:5’-GCACGACGAGTGTGACGATC-3’ (配列番号22)
GPR7-2079-2176:5’- GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCGGCCGCACCTACAGCGCCGCGCGCGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3’ (配列番号23)
PCRを行った後、2%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった。
配列番号17
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号18
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号19
実験のために設計されたマスキング用オリゴヌクレオチド
配列番号20
支持体への固定化のために設計されたビオチン標識オリゴヌクレオチド
配列番号21
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号22
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号23
目的とするDNA領域(GPR7-2079-2176、メチル化シトシンもCで表す)からなるオリゴヌクレオチド
Claims (23)
- 生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの含量を測定する方法であって、
(1)生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料が一本鎖DNA(正鎖)であって、該一本鎖DNA(正鎖)と、メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドとを混合することにより、該メチル化感受性制限酵素の認識部位が保護されてなる二本鎖DNAを生成させる第一(A)工程と、
第一(A)工程で生成された二本鎖DNAをメチル化感受性制限酵素で消化処理する第一(B)工程とからなる第一工程、
(2)第一工程で得られた消化処理が行われた二本鎖DNAから目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)を取得し、該一本鎖DNA(正鎖)と、該一本鎖DNAの3’末端の一部(但し、前記の目的とするDNA領域を含まない。)に対して相補性のある塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させることにより、前記一本鎖DNAを選択する第二工程、
(3)第二工程で選択された一本鎖DNAを鋳型として、前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、該プライマーを1回伸長させることにより、前記の一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第三工程、及び、
(4)第三工程で得られた伸長形成された二本鎖DNAから、前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチド(負鎖)と、前記目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)に対して相補性のある塩基配列の部分塩基配列(負鎖)であって、且つ、前記目的とするDNA領域の塩基配列(正鎖)に対して相補性のある塩基配列(負鎖)の3’末端より更に3’末端側に位置する部分塩基配列(負鎖)に対して相補性のある塩基配列(正鎖)を有するリバース用プライマーとをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、前記目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する第四工程、
を有することを特徴とする方法。 - 第二工程において目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)と、該一本鎖DNAの3’末端の一部(但し、前記の目的とするDNA領域を含まない。)に対して相補性のある塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させる際に、二価陽イオンを含有する反応系中で結合させる請求項1に記載の方法。
- 二価陽イオンがマグネシウムイオンである請求項2に記載の方法。
- 第四工程において、
前記目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)の3’末端の一部(但し、前記の目的とするDNA領域を含まない。)に対して相補性のある塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド(負鎖)をプライマーとして反応系内に追加的に添加しポリメラーゼ連鎖反応を行う工程を追加的に有する請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。 - 請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法の工程として、下記の2つの工程を更に追加的に有するメチル化割合の測定方法。
(5)請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法の第一工程を行うことなく、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法における第二工程から第四工程を行うことにより、前記目的とするDNA領域のDNA(メチル化されたDNA及びメチルされていないDNAの総量)を検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する第五工程、及び、
(6)請求項1〜4のいずれか一項に記載の第四工程により定量されたDNAの量と、第五工程により定量されたDNAの量とを比較することにより得られる差異に基づき前記目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの割合を算出する第六工程 - 生物由来検体が、哺乳動物の血清又は血漿である請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 生物由来検体が、哺乳動物の血液又は体液である請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 生物由来検体が、細胞溶解液又は組織溶解液である請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料が、
(i)該ゲノムDNAが有する目的とするDNA領域を認識切断部位としない制限酵素で予め二本鎖DNAを消化処理する工程、及び、
(ii)消化処理された二本鎖DNAを一本鎖DNAに解離する工程、
により得られた一本鎖DNAである請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。 - 生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料が、予め精製されてなるDNA試料である請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- メチル化感受性制限酵素が、生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域の中に認識切断部位を有する制限酵素である請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- メチル化感受性制限酵素が、HpaII又はHhaIである請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの含量を測定する方法であって、
(1)生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料が一本鎖DNA(正鎖)であって、該一本鎖DNA(正鎖)と、メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドとを混合することにより、該メチル化感受性制限酵素の認識部位が保護されてなる二本鎖DNAを生成させる第一(A)工程と、
第一(A)工程で生成された二本鎖DNAをメチル化感受性制限酵素で消化処理する第一(B)工程とからなる第一工程、
(2)第一工程で得られた消化処理が行われた二本鎖DNAから目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)を取得し、該一本鎖DNA(正鎖)と、該一本鎖DNAの一部に対して相補性のある塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させることにより、前記の一本鎖DNAを選択する第二工程、
(3)第二工程で選択された一本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離する工程を有し、生成した一本鎖状態であるDNA(正鎖)を鋳型として、前記目的とするDNA領域の塩基配列(正鎖)の3’末端より更に3’末端側に位置する部分塩基配列(正鎖)に対して相補性のある塩基配列(負鎖)を有するフォーワード用プライマーを伸長プライマーとして、該プライマーを1回伸長させることにより、前記の一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第三工程、及び、
(4)第三工程で得られた伸長形成された二本鎖DNAから、前記フォーワード用プライマー(負鎖)と、前記目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)に対して相補性のある塩基配列の部分塩基配列(負鎖)であって、且つ、前記目的とするDNA領域の塩基配列(正鎖)に対して相補性のある塩基配列(負鎖)の3’末端より更に3’末端側に位置する部分塩基配列(負鎖)、に対して相補性のある塩基配列(正鎖)を有するリバース用プライマーとをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、前記の目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する第四工程、
を有することを特徴とする方法。 - 一本鎖固定化オリゴヌクレオチドが、5’或いは3’末端が固定化されてなる一本鎖固定化オリゴヌクレオチドである請求項13に記載の方法。
- 第二工程において目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)と、該一本鎖DNAの3’末端の一部(但し、前記の目的とするDNA領域を含まない。)に対して相補性のある塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させる際に、二価陽イオンを含有する反応系中で結合させる請求項13又は14に記載の方法。
- 請求項13又は14に記載の方法の工程として、下記の2つの工程を更に追加的に有するメチル化割合の測定方法。
(5)請求項13又は14に記載の方法の第一工程を行うことなく、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法における第二工程から第四工程を行うことにより、前記目的とするDNA領域のDNA(メチル化されたDNA及びメチルされていないDNAの総量)を検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する第五工程、及び、
(6)請求項13又は14に記載の第四工程により定量されたDNAの量と、第五工程により定量されたDNAの量とを比較することにより得られる差異に基づき前記目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの割合を算出する第六工程 - 生物由来検体が、哺乳動物の血清又は血漿である請求項13又は14に記載の方法。
- 生物由来検体が、哺乳動物の血液又は体液である請求項13又は14に記載の方法。
- 生物由来検体が、細胞溶解液又は組織溶解液である請求項13又は14に記載の方法。
- 生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料が、
(i)該ゲノムDNAが有する目的とするDNA領域を認識切断部位としない制限酵素で予め二本鎖DNAを消化処理する工程、及び、
(ii)消化処理された二本鎖DNAを一本鎖DNAに解離する工程、
により得られた一本鎖DNAである請求項13又は14に記載の方法。 - 生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料が、予め精製されてなるDNA試料である請求項13又は14に記載の方法。
- メチル化感受性制限酵素が、生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域の中に認識切断部位を有する制限酵素である請求項13又は14に記載の方法。
- メチル化感受性制限酵素が、HpaII又はHhaIである請求項13又は14に記載の方法。
Priority Applications (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008077966A JP5206059B2 (ja) | 2008-03-25 | 2008-03-25 | メチル化されたdnaの含量を測定する方法 |
PCT/JP2009/056782 WO2009119890A1 (ja) | 2008-03-25 | 2009-03-25 | Dnaメチル化測定方法 |
US12/934,428 US20110086356A1 (en) | 2008-03-25 | 2009-03-25 | Method for measuring dna methylation |
EP09724943A EP2272974A4 (en) | 2008-03-25 | 2009-03-25 | DETERMINATION METHOD FOR DNA METHYLATION |
KR1020107023673A KR20100130222A (ko) | 2008-03-25 | 2009-03-25 | Dna 메틸화 측정 방법 |
CN2009801182625A CN102037139A (zh) | 2008-03-25 | 2009-03-25 | Dna甲基化测定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008077966A JP5206059B2 (ja) | 2008-03-25 | 2008-03-25 | メチル化されたdnaの含量を測定する方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009225759A JP2009225759A (ja) | 2009-10-08 |
JP5206059B2 true JP5206059B2 (ja) | 2013-06-12 |
Family
ID=41114070
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008077966A Expired - Fee Related JP5206059B2 (ja) | 2008-03-25 | 2008-03-25 | メチル化されたdnaの含量を測定する方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20110086356A1 (ja) |
EP (1) | EP2272974A4 (ja) |
JP (1) | JP5206059B2 (ja) |
KR (1) | KR20100130222A (ja) |
CN (1) | CN102037139A (ja) |
WO (1) | WO2009119890A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103160937B (zh) * | 2011-12-15 | 2015-02-18 | 深圳华大基因科技服务有限公司 | 对高等植物复杂基因组基因进行富集建库和snp分析的方法 |
CN104611410A (zh) * | 2013-11-04 | 2015-05-13 | 北京贝瑞和康生物技术有限公司 | 一种无创癌症检测方法及其试剂盒 |
EP3508588A4 (en) * | 2016-09-02 | 2020-05-27 | Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation | METHOD FOR AMPLIFYING METHYLATED DNA, METHOD FOR DETERMINING DNA METHYLATION, AND METHOD FOR DETERMINING THE APPEARANCE OF CANCER |
CN109234388B (zh) * | 2017-07-04 | 2021-09-14 | 深圳华大生命科学研究院 | 用于dna高甲基化区域富集的试剂、富集方法及应用 |
CN110468179B (zh) * | 2018-05-10 | 2021-03-05 | 北京大学 | 选择性扩增核酸序列的方法 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004504829A (ja) * | 2000-08-02 | 2004-02-19 | アプレラ コーポレイション | 二本鎖核酸の一方の鎖を単離するための方法 |
ATE380883T1 (de) * | 2000-10-24 | 2007-12-15 | Univ Leland Stanford Junior | Direkte multiplex charakterisierung von genomischer dna |
WO2003027259A2 (en) * | 2001-09-26 | 2003-04-03 | Epigenx Pharmaceuticals, Inc. | Assays for dna methylation changes |
US20030148284A1 (en) * | 2001-12-17 | 2003-08-07 | Vision Todd J. | Solid phase detection of nucleic acid molecules |
US7906288B2 (en) * | 2006-01-04 | 2011-03-15 | The Johns Hopkins University | Compare-MS: method rapid, sensitive and accurate detection of DNA methylation |
JP4940940B2 (ja) * | 2006-12-25 | 2012-05-30 | 住友化学株式会社 | Dnaメチル化測定方法 |
JP4940939B2 (ja) * | 2006-12-25 | 2012-05-30 | 住友化学株式会社 | Dnaメチル化測定方法 |
JP5151167B2 (ja) * | 2007-01-31 | 2013-02-27 | 住友化学株式会社 | Dnaメチル化測定方法 |
-
2008
- 2008-03-25 JP JP2008077966A patent/JP5206059B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-03-25 US US12/934,428 patent/US20110086356A1/en not_active Abandoned
- 2009-03-25 CN CN2009801182625A patent/CN102037139A/zh active Pending
- 2009-03-25 KR KR1020107023673A patent/KR20100130222A/ko not_active Application Discontinuation
- 2009-03-25 WO PCT/JP2009/056782 patent/WO2009119890A1/ja active Application Filing
- 2009-03-25 EP EP09724943A patent/EP2272974A4/en not_active Withdrawn
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20110086356A1 (en) | 2011-04-14 |
WO2009119890A1 (ja) | 2009-10-01 |
KR20100130222A (ko) | 2010-12-10 |
EP2272974A4 (en) | 2011-06-29 |
EP2272974A1 (en) | 2011-01-12 |
CN102037139A (zh) | 2011-04-27 |
JP2009225759A (ja) | 2009-10-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7100680B2 (ja) | ゲノム適用および治療適用のための、核酸分子のクローン複製および増幅のためのシステムおよび方法 | |
JP5266828B2 (ja) | メチル化されたdnaの含量を測定する方法 | |
JP5206059B2 (ja) | メチル化されたdnaの含量を測定する方法 | |
Deng et al. | Microfluidic epigenomic mapping technologies for precision medicine | |
JP4924014B2 (ja) | Dnaメチル化測定方法 | |
JP5151167B2 (ja) | Dnaメチル化測定方法 | |
JP5303981B2 (ja) | Dnaメチル化測定方法 | |
JP5277681B2 (ja) | Dnaメチル化測定方法 | |
JP4940939B2 (ja) | Dnaメチル化測定方法 | |
JP4940940B2 (ja) | Dnaメチル化測定方法 | |
CN114381498A (zh) | 一种基于协同原位组装G-四链体DNAzyme纳米线的化学发光传感器及其应用 | |
KR101683086B1 (ko) | 유전자의 발현량 및 메틸화 프로필을 활용한 돼지의 산자수 예측방법 | |
CN114787385A (zh) | 用于检测核酸修饰的方法和系统 | |
JP5116939B2 (ja) | 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法 | |
WO2013047910A1 (ja) | 癌化度評価方法 | |
JP5151709B2 (ja) | Dnaを定量又は検出する方法 | |
WO2005026354A1 (ja) | 癌化度評価方法 | |
JP2005087048A (ja) | 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20101025 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120710 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120910 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20121113 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20121225 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130122 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130204 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20160301 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20160301 Year of fee payment: 3 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |