CN102037139A

CN102037139A - Dna甲基化测定方法

Info

Publication number: CN102037139A
Application number: CN2009801182625A
Authority: CN
Inventors: 冨原祥隆; 佐藤日出夫; 樽井弘和
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 2008-03-25
Filing date: 2009-03-25
Publication date: 2011-04-27
Also published as: JP2009225759A; US20110086356A1; EP2272974A4; KR20100130222A; EP2272974A1; JP5206059B2; WO2009119890A1

Abstract

本发明涉及对生物来源标本所含基因组DNA中的目标DNA区域中被甲基化了的DNA的含量进行测定的方法等。

Description

DNA甲基化测定方法

技术领域

本发明涉及对生物来源标本所含的基因组DNA中目标DNA区域中的被甲基化了的DNA含量进行测定的方法。

背景技术

作为用于评价生物来源标本所含基因组DNA中目标DNA区域中的DNA的甲基化状态的方法，例如，有测定在基因组DNA中目标DNA区域中的被甲基化了的DNA的含量的方法(例如，参照Nucleic Acids Res.1994 Aug 11；22(15)：2990-7、和Proc Natl Acad Sci U S A.1997 Mar 18；94(6)：2284-9)。在该测定方法中，首先需要从基因组DNA来源的DNA试样中提取含有目标DNA区域的DNA，提取操作十分繁杂。

另外，作为测定被提取的DNA的目标区域中的被甲基化了的DNA含量的方法，已知有以下的方法，例如(1)使用亚硫酸盐等修饰该DNA之后，将其供于DNA聚合酶引起的DNA合成的链反应(Polymerase Chain Reaction(聚合酶链反应)；以下有时记为PCR)，从而将目标区域扩增的方法；(2)使用甲基化敏感性限制酶将该DNA消化后，将其供于PCR，从而使目标区域扩增的方法。这些方法的任一种中，用于甲基化的检测的DNA的修饰以及其后的生成物的精制、用于PCR的反应系的制备、DNA扩增的确认等中均需要耗时。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种简便测定生物来源标本所含的基因组DNA中目标DNA区域中的被甲基化了的DNA含量的方法。

即，本发明提供以下方案。

[发明1]

一种测定方法，其是对生物来源标本所含基因组DNA中目标DNA区域中的被甲基化了的DNA含量进行测定的方法，具有以下工序：

(1)第一工序，其中，对生物来源标本所含基因组DNA来源的DNA试样，进行利用甲基化敏感性限制酶的消化处理，

(2)第二工序，其中，从由第一工序获得的经消化处理了的DNA试样获取含有目标DNA区域的单链DNA(正链)，使该单链DNA(正链)与单链固定化寡核苷酸碱基配对，从而选择上述单链DNA，上述单链固定化寡核苷酸具有对该单链DNA的3’末端的一部分(不含上述目标DNA区域)有互补性的碱基序列，

(3)第三工序，其中，将由第二工序选择的单链DNA作为模板，将上述单链固定化寡核苷酸作为引物，使该引物1次延伸，从而使上述单链DNA延伸形成双链DNA，以及，

(4)第四工序，其中，作为下述各本步骤的前步骤，具有将由第三工序获得的延伸形成的双链DNA暂时分离成单链状态的步骤(前步骤)，并且，作为本步骤，具有第A步骤(本步骤)和第B步骤(本步骤)，

(a)第A步骤，其具有：通过使生成的为单链状态的DNA(正链)与上述单链固定化寡核苷酸(负链)碱基配对，从而选择上述为单链状态的DNA的第A1步骤；和将在第A1步骤选择的为单链状态的DNA为模板，将上述单链固定化寡核苷酸作为引物，通过使该引物1次延伸，从而使上述为单链状态的DNA延伸形成双链DNA的第A2步骤，

(b)第B步骤，其中，将生成的为单链状态的DNA(负链)作为模板，将具有下述碱基序列(正链)的引物(反向引物)作为延伸引物，使该延伸引物1次延伸，从而使上述为单链状态的DNA延伸形成双链DNA，所述碱基序列(正链)是对上述为单链状态的DNA(负链)所具有的碱基序列的部分碱基序列(负链)具有互补性的碱基序列(正链)，上述为单链状态的DNA(负链)所具有的碱基序列的部分碱基序列(负链)与对上述目标DNA区域的碱基序列(正链)有互补性的碱基序列(负链)的3’末端相比更靠近3’末端侧，

进而，将由上述各本步骤获得的延伸形成了的双链DNA暂时分离成单链状态后，进行反复操作，从而将上述目标DNA区域中的被甲基化了的DNA扩增到可以检测的量，将扩增了的DNA的量定量。

[发明2]

根据发明1所述的方法，其中，在第二工序中使含有目标DNA区域的单链DNA(正链)与具有对该单链DNA的3’末端的一部分(不含上述目标DNA区域)有互补性的碱基序列的单链固定化寡核苷酸碱基配对时，在含有二价阳离子的反应系中使碱基配对。

[发明3]

根据发明2所述的方法，其中，二价阳离子为镁离子。

[发明4]

一种测定方法，其中，在第四工序的前步骤之前，

追加有：向反应系内添加具有对上述含有目标DNA区域的单链DNA(正链)的3’末端的一部分(不含上述目标DNA区域)有互补性的碱基序列、且为游离状态的单链寡核苷酸(负链)的追加前步骤，并且，

作为第四工序的各本步骤，还追加有下述的1个步骤，

(c)第C步骤(本步骤)，其具有：

(i)通过使生成的为单链状态的DNA(正链)与在上述追加前步骤中被添加到反应系内的单链寡核苷酸(负链)碱基配对，从而选择上述为单链状态的DNA的第C1步骤，以及，

(ii)将由第C1步骤选择的为单链状态的DNA作为模板，将上述单链寡核苷酸(负链)作为引物，使该引物1次延伸，从而使上述为单链状态的DNA延伸形成双链DNA的第C2步骤。

[发明5]

一种测定方法，其中，在第四工序的前步骤之后，

追加有：向反应系内添加具有对上述含有目标DNA区域的单链DNA(正链)的3’末端的一部分(不含上述目标DNA区域)有互补性的碱基序列、且为游离状态的单链寡核苷酸(负链)的步骤(追加前步骤)，并且，

具有：将经历第三工序及上述追加前步骤而得的作为未消化物的延伸形成的双链DNA(在上述甲基化敏感性限制酶的识别位点不含非甲基状态的CpG对的延伸形成的双链DNA)暂时分离成单链状态的步骤(追加再前步骤)，并且，

作为第四工序的各本步骤，追加有下述的1个步骤，

(c)第C步骤(本步骤)，其具有：

(i)通过使生成的为单链状态的DNA(正链)与在上述追加前步骤中被添加到了反应系内的单链寡核苷酸(负链)碱基配对，从而选择上述为单链状态的DNA的第C1步骤，

(ii)将在第C1步骤选择的为单链状态的DNA作为模板，将上述单链寡核苷酸(负链)作为引物，使该引物1次延伸，从而使上述为单链状态的DNA延伸形成双链DNA的第C2步骤。

[发明6]

一种甲基化比例的测定方法，其中，作为发明1～5中任一项所述方法的工序，还追加有下述2个工序，

(5)不进行发明1～5中任一项所述方法的第一工序，而进行发明1～5中任一项所述方法中的第二工序到第四工序，从而将上述目标DNA区域的DNA(被甲基化了的DNA及未被甲基化的DNA的总量)扩增到能够检测的量，再将经扩增了的DNA的量定量的第五工序，以及，

(6)基于将利用发明1～5中任一项所述的第四工序定量了的DNA的量与利用第五工序定量了的DNA的量比较而得的差异，计算上述目标DNA区域中被甲基化了的DNA的比例的第六工序。

[发明7]

根据发明1～6中任一项所述的方法，其中，生物来源标本为哺乳动物的血清或血浆。

[发明8]

根据发明1～6中任一项所述的方法，其中，生物来源标本为哺乳动物的血液或体液。

[发明9]

根据发明1～6中任一项所述的方法，其中，生物来源标本为细胞溶解液或组织溶解液。

[发明10]

根据发明1～9中任一项所述的方法，其中，生物来源标本所含基因组DNA来源的DNA试样为被限制酶事先消化处理而成的DNA试样，所述限制酶不以该基因组DNA具有的目标DNA区域为识别剪切位点。

[发明11]

根据发明1～10中任一项所述的方法，其中，生物来源标本所含基因组DNA来源的DNA试样为事先被精制而成的DNA试样。

[发明12]

根据发明1～11中任一项所述的方法，利用甲基化敏感性限制酶的消化处理包括如下工序：

第一(A)工序，其中，通过将含有目标DNA区域的单链DNA(正链)与掩蔽用寡核苷酸混合，从而生成甲基化敏感性限制酶的识别位点被保护而得的单链DNA；上述掩蔽用寡核苷酸含有与该甲基化敏感性限制酶的识别位点的碱基序列相互补的碱基序列，以及，

第一(B)工序，其中，将由第一(A)工序选择的单链DNA用甲基化敏感性限制酶消化处理。

[发明13]

根据发明1～12中任一项所述的方法，其中，甲基化敏感性限制酶是在生物来源标本所含基因组DNA具有的目标DNA区域中具有识别剪切位点的限制酶。

[发明14]

根据发明1～13中任一项所述的方法，其中，甲基化敏感性限制酶为HpaII或HhaI。

[发明15]

一种测定方法，其是对生物来源标本所含基因组DNA具有的目标DNA区域中被甲基化了的DNA的含量进行测定的方法，其具有以下工序：

(1)第一工序，其中，对生物来源标本所含基因组DNA来源的DNA试样进行利用甲基化敏感性限制酶的消化处理，

(2)第二工序，其中，从由第一工序所得的经消化处理了的DNA试样中获得含有目标DNA区域的单链DNA(正链)，使该单链DNA(正链)与具有对该单链DNA的一部分有互补性的碱基序列的单链固定化寡核苷酸碱基配对，从而选择上述的单链DNA，

(3)第三工序，其中，具有将由第二工序选择的单链DNA暂时分离成单链状态的步骤，将生成的为单链状态的DNA(正链)作为模板，将具有下述碱基序列(负链)的正向引物作为延伸引物，使该引物1次延伸，从而使上述单链DNA延伸形成双链DNA，所述碱基序列(负链)是对与上述目标DNA区域的碱基序列(正链)的3’末端相比更靠近3’末端侧的部分碱基序列(正链)有互补性的碱基序列(负链)，以及，

(4)第四工序，其中，作为下述各本步骤的前步骤，具有将在第三工序得到的延伸形成的双链DNA暂时分离成单链状态的步骤(前步骤)，并且，作为本步骤，具有第A步骤(本步骤)和第B步骤(本步骤)，

(a)第A步骤(本步骤)，其具有，通过使生成的为单链状态的DNA(正链)与上述正向引物(负链)碱基配对，从而选择上述为单链状态的DNA的第A1步骤；以及，将在第A1步骤选择的为单链状态的DNA作为模板，将上述正向引物为延伸引物，使该引物1次延伸，从而使上述为单链状态的DNA延伸形成双链DNA的第A2步骤，

(b)第B步骤(本步骤)，其中，将生成的为单链状态的DNA(负链)作为模板，将具有下述碱基序列(正链)的反向引物作为延伸引物，使该延伸引物1次延伸，从而使上述为单链状态的DNA延伸形成双链DNA，所述碱基序列(正链)是对上述为单链状态的DNA(负链)所具有的碱基序列的部分碱基序列(负链)具有互补性的碱基序列(正链)，上述为单链状态的DNA(负链)所具有的碱基序列的部分碱基序列(负链)与对上述目标DNA区域的碱基序列(正链)有互补性的碱基序列(负链)的3’末端相比更靠近3’末端侧，

进而，将由上述各本步骤得到的延伸形成的双链DNA暂时分离成单链状态后，重复第四工序的各本步骤，从而将上述目标DNA区域中被甲基化了的DNA扩增至可以检测的量，将扩增后的DNA的量定量。

[发明16]

根据发明15所述的方法，其中，单链固定化寡核苷酸为5’或3’末端被固定化而得的单链固定化寡核苷酸。

[发明17]

根据发明15或16所述的方法，其中，在第二工序中使含有目标DNA区域的单链DNA(正链)与具有对该单链DNA的3’末端的一部分有互补性的碱基序列的单链固定化寡核苷酸碱基配对时，在含有二价阳离子的反应系中使碱基配对，所述单链DNA的3’末端的一部分不含上述目标DNA区域。

[发明18]

一种甲基化比例的测定方法，其中，作为发明15或16中记载的方法，还追加具有下述两个工序，

(5)不进行发明15或16所记载的方法的第一工序，而进行发明1～5中任一项所述方法中的第二工序至第四工序，从而，将上述目标DNA区域的DNA(被甲基化了的DNA及未被甲基化的DNA的总量)扩增至可以检测的量，再将经扩增了的DNA的量定量的第五工序，以及，

(6)基于将利用发明15或16所记载的第四工序定量了的DNA的量与利用第五工序定量了的DNA的量比较而得的差异，计算出上述目标DNA区域中被甲基化了的DNA的比例的第六工序。

[发明19]

根据发明15或16所述的方法，其中，生物来源标本为哺乳动物的血清或血浆。

[发明20]

根据发明15或16所述的方法，其中，生物来源标本为哺乳动物的血液或体液。

[发明21]

根据发明15或16所述的方法，其中，生物来源标本为细胞溶解液或组织溶解液。

[发明22]

根据发明15或16所述的方法，其中，生物来源标本中所含的基因组DNA来源的DNA试样为被限制酶事先消化处理而成的DNA试样，所述限制酶不以该基因组DNA具有的目标DNA区域为识别剪切位点。

[发明23]

根据发明15或16所述的方法，其中，生物来源标本所含基因组DNA来源的DNA试样为事先被精制而成的DNA试样。

[发明24]

根据发明15或16所述的方法，其中，利用甲基化敏感性限制酶的消化处理包括：

[发明25]

根据发明15或16所述的方法，其中，甲基化敏感性限制酶是在生物来源标本所含基因组DNA具有的目标DNA区域中具有识别剪切位点的限制酶。

[发明26]

根据发明15或16所述的方法，其中，甲基化敏感性限制酶为HpaII或HhaI。

附图说明

图1是表示在实施例中对制备的样品进行“A(未处理)”、“B(HpaII处理)”或“C(掩蔽用寡核苷酸添加+HpaII处理)”的任一种处理，利用PCR将含有序列编号7所示碱基序列的区域中的DNA扩增，再将所得的扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳的结果的图。

图中从最左边的泳道开始，显示HpaII的识别序列被甲基化的甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-M(7)(M)经“A”处理了的样品、HpaII的识别序列没有被甲基化的非甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-UM(U)经“A”处理了的样品、HpaII的识别序列被甲基化的甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-M(7)(M)经“B”处理了的样品、HpaII的识别序列没有被甲基化的非甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-UM(U)经“B”处理了的样品、HpaII的识别序列被甲基化的甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-M(7)(M)经“C”处理了的样品、及HpaII的识别序列没有被甲基化的非甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-UM(U)经“C”处理了的样品的结果。

具体实施方式

作为本发明中的“生物来源标本”，例如可以举出细胞溶解液、组织溶解液(这里的组织是指包括血液、淋巴结等广义意思)，或就哺乳动物而言，可以举出血浆、血清、淋巴液等体液，体分泌物(尿、乳汁等)等生物体试样及从这些生物体试样提取得到的基因组DNA。另外，作为该生物来源标本，例如也可以包括微生物、病毒等来源的试样，此时，本发明中的“基因组DNA”不限于生物来源标本本身的基因组DNA，而且也包括生物来源标本所含的微生物、病毒的基因组DNA。在哺乳动物来源的标本为血液的情况下，可以期待在定期健康诊断、简便的检查等中利用本发明。

为了从哺乳动物来源的标本得到基因组DNA，例如使用市售的DNA提取用试剂盒等提取DNA即可。在使用血液作为标本的情况下，按照常用的方法从血液制备血浆或血清，将所制备的血浆或血清作为标本，对其中所含的游离DNA(包括胃癌细胞等癌细胞来源的DNA)进行分析时，可以避开血细胞来源的DNA对胃癌细胞等癌细胞来源的DNA进行解析，可以使检测胃癌细胞等癌细胞、含有其的组织等的灵敏度提高。

上述基因组DNA来源的DNA试样，可以是预先由规定的方法纯化而成的DNA试样。

通常，构成基因(基因组DNA)的碱基有4种。在这些碱基当中，已知所谓仅是胞嘧啶被甲基化的现象，这样的DNA的甲基化修饰限于由5’-CG-3’表示的碱基序列(C表示胞嘧啶，G表示鸟嘌呤。以下，也会将该碱基序列记为“CpG”)中的胞嘧啶。就胞嘧啶而言，被甲基化的部位是其5位。在细胞分裂之前进行DNA复制时，复制后马上成为仅是模板链的“CpG”中的胞嘧啶被甲基化的状态，在甲基转移酶的作用下立即将新生链的“CpG”中的胞嘧啶也甲基化。因此，DNA的甲基化后的状态在DNA复制后也被直接传给新的2组DNA。本发明中的“甲基化后的DNA”是指通过这样的甲基化修饰而生成的DNA。

本发明中的“CpG对”是指由CpG表示的碱基序列和与其互补的CpG进行碱基配对而成的双链寡核苷酸。

本发明中的“目标DNA区域”(以下也记为目标区域)是要调查该区域中所含的胞嘧啶有无甲基化的DNA区域，具有至少1种甲基化敏感性限制酶的识别位点。例如可以举出含有在赖氨酰氧化酶、HRAS样阻抑因子、bA305P22.2.1、γ-细丝蛋白、HAND1、RIKEN 2210016F16的同系物、FLJ32130、PPARG血管生成素相关蛋白、凝血调节蛋白、p53-应答基因2、微纤维蛋白2、神经丝蛋白3、解聚素及金属蛋白酶结构域23、G-蛋白偶联受体7、G-蛋白偶联生长抑素及血管紧张素样肽受体、溶质载体蛋白家族6神经递质转运蛋白去甲肾上腺素成员2等有用蛋白质基因的启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的CpG所示碱基序列中的一个以上的胞嘧啶的DNA的区域等。

具体而言，例如在有用蛋白质基因为赖氨酰氧化酶基因的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的赖氨酰氧化酶基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出用序列编号1表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AF270645记载的碱基序列的碱基编号16001～18661所示的碱基序列)。就序列编号1所示的碱基序列而言，对人来源的赖氨酰氧化酶蛋白质的氨基末端的蛋氨酸进行编码的ATG密码子，用碱基编号2031～2033表示，上述外显子1的碱基序列用碱基编号1957～2661表示，在序列编号1所示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，特别是序列编号1所示的碱基序列中在CpG密集存在的区域中存在的CpG中的胞嘧啶，例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胃癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号1表示的碱基序列中用碱基编号1539、1560、1574、1600、1623、1635、1644、1654、1661、1682、1686、1696、1717、1767、1774、1783、1785、1787、1795等表示的胞嘧啶。

另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为HRAS样阻抑因子基因的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的HRAS样阻抑因子基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出用序列编号2表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AC068162记载的碱基序列的碱基编号172001～173953表示的碱基序列)。就序列编号2表示的碱基序列而言，人来源的HRAS样阻抑因子基因的外显子1的碱基序列用碱基编号1743～1953表示。在序列编号2表示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，特别是序列编号2表示的碱基序列中在CpG密集存在的区域中存在的CpG中的胞嘧啶，例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胃癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号2表示的碱基序列中用碱基编号1316、1341、1357、1359、1362、1374、1390、1399、1405、1409、1414、1416、1422、1428、1434、1449、1451、1454、1463、1469、1477、1479、1483、1488、1492、1494、1496、1498、1504、1510、1513、1518、1520等表示的胞嘧啶。

另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为bA305P22.2.1基因的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的bA305P22.2.1基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号3表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AL121673记载的碱基序列的碱基编号13001～13889表示的碱基序列)。就序列编号3表示的碱基序列而言，对人来源的bA305P22.2.1蛋白质的氨基末端的蛋氨酸进行编码的ATG密码子，用碱基编号849～851表示，上述外显子1的碱基序列用碱基编号663～889表示。在序列编号3表示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，特别是序列编号3表示的碱基序列中在CpG密集存在的区域中存在的CpG中的胞嘧啶，例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胃癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号3表示的碱基序列中用碱基编号329、335、337、351、363、373、405、424、427、446、465、472、486等表示的胞嘧啶。

另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为γ-细丝蛋白基因的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的γ-细丝蛋白基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号4表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AC074373记载的碱基序列的碱基编号63528～64390表示的碱基序列的互补序列)。就序列编号4表示的碱基序列而言，对人来源的γ-细丝蛋白质的氨基末端的蛋氨酸进行编码的ATG密码子，用碱基编号572～574表示，上述外显子1的碱基序列用碱基编号463～863表示。在序列编号4表示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，特别是序列编号4表示的碱基序列中在CpG密集存在的区域中存在的CpG中的胞嘧啶，例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胃癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号4表示的碱基序列中用碱基编号329、333、337、350、353、360、363、370、379、382、384、409、414、419、426、432、434、445、449、459、472、474、486、490、503、505等表示的胞嘧啶。

另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为HAND1基因的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的HAND1基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号5表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AC026688记载的碱基序列的碱基编号24303～26500表示的碱基序列的互补序列)。就序列编号5表示的碱基序列而言，对人来源的HAND1蛋白质的氨基末端的蛋氨酸进行编码的ATG密码子，用碱基编号1656～1658表示，上述外显子1的碱基序列用碱基编号1400～2198表示。在序列编号5表示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，特别是序列编号5表示的碱基序列中在CpG密集存在的区域中存在的CpG中的胞嘧啶，例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胃癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号5表示的碱基序列中用碱基编号1153、1160、1178、1187、1193、1218、1232、1266、1272、1292、1305、1307、1316、1356、1377、1399、1401、1422、1434等表示的胞嘧啶。

另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为RIKEN 2210016F16基因的同系物的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的RIKEN 2210016F16基因的同系物的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号6表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AL354733记载的碱基序列的碱基编号157056～159000表示的碱基序列的互补碱基序列)。就序列编号6表示的碱基序列而言，人来源的RIKEN 2210016F16基因的同系物的外显子1的碱基序列用碱基编号1392～1945表示。在序列编号6表示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，特别是序列编号6表示的碱基序列中在CpG密集存在的区域中存在的CpG中的胞嘧啶，例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胃癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号6表示的碱基序列中用碱基编号1172、1175、1180、1183、1189、1204、1209、1267、1271、1278、1281、1313、1319、1332、1334、1338、1346、1352、1358、1366、1378、1392、1402、1433、1436、1438等表示的胞嘧啶。

另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为FLJ32130基因的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的FLJ32130基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号7表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AC002310记载的碱基序列的碱基编号1～2379表示的碱基序列的互补碱基序列)。就序列编号7表示的碱基序列而言，对人来源的FLJ32130蛋白质的氨基酸末端的蛋氨酸进行编码的ATG密码子，用碱基编号2136～2138表示，认为是上述外显子1的碱基序列用碱基编号2136～2379表示。在序列编号7表示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，特别是序列编号7表示的碱基序列中在CpG密集存在的区域中存在的CpG中的胞嘧啶，例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胃癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号7表示的碱基序列中用碱基编号1714、1716、1749、1753、1762、1795、1814、1894、1911、1915、1925、1940、1955、1968等表示的胞嘧啶。

另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为PPARG血管生成素相关蛋白基因的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的PPARG血管生成素相关蛋白基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号8表示的碱基序列。就序列编号8表示的碱基序列而言，对人来源的PPARG血管生成素相关蛋白质的氨基末端的蛋氨酸进行编码的ATG密码子，用碱基编号717～719表示，上述外显子1的5’侧部分的碱基序列用碱基编号1957～2661表示。在序列编号8表示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，特别是序列编号8表示的碱基序列中在CpG密集存在的区域中存在的CpG中的胞嘧啶，例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胃癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号8表示的碱基序列中用碱基编号35、43、51、54、75、85、107、127、129、143、184、194、223、227、236、251、258等表示的胞嘧啶。

另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为凝血调节蛋白基因的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的凝血调节蛋白基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号9表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AF495471记载的碱基序列的碱基编号1～6096表示的碱基序列)。就序列编号9表示的碱基序列而言，对人来源的凝血调节蛋白质的氨基末端的蛋氨酸进行编码的ATG密码子，用碱基编号2590～2592表示，上述外显子1的碱基序列用碱基编号2048～6096表示。在序列编号9表示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，特别是序列编号9表示的碱基序列中在CpG密集存在的区域中存在的CpG中的胞嘧啶，例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胃癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号9表示的碱基序列中用碱基编号1539、1551、1571、1579、1581、1585、1595、1598、1601、1621、1632、1638、1645、1648、1665、1667、1680、1698、1710、1724、1726、1756等表示的胞嘧啶。

另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为p53-应答基因2基因的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的p53-应答基因2基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号10表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AC009471记载的碱基序列的碱基编号113501～116000表示的碱基序列的互补序列。)。就序列编号10表示的碱基序列而言，人来源的p53-应答基因2基因的外显子1的碱基序列用碱基编号1558～1808表示。在序列编号10表示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，例如表示胰腺癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胰腺癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号10表示的碱基序列中用碱基编号1282、1284、1301、1308、1315、1319、1349、1351、1357、1361、1365、1378、1383等表示的胞嘧啶。

另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为微纤维蛋白2基因的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的微纤维蛋白2基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号11表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AC113387记载的碱基序列的碱基编号118801～121000表示的碱基序列的互补序列)。就序列编号11表示的碱基序列而言，人来源的微纤维蛋白2基因的外显子1的碱基序列用碱基编号1091～1345表示。在序列编号11表示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，例如表示胰腺癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胰腺癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号11表示的碱基序列中用碱基编号679、687、690、699、746、773、777、783、795、799、812、823、830、834、843等表示的胞嘧啶。

另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为神经丝蛋白3基因的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的神经丝蛋白3基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号12表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AF106564记载的碱基序列的碱基编号28001～30000表示的碱基序列的互补序列)。就序列编号12表示的碱基序列而言，人来源的神经丝蛋白3基因的外显子1的碱基序列用碱基编号614～1694表示。在序列编号12表示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，例如表示胰腺癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胰腺癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号12表示的碱基序列中用碱基编号428、432、443、451、471、475、482、491、499、503、506、514、519、532、541、544、546、563、566、572、580等表示的胞嘧啶。

另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为解聚素及金属蛋白酶结构域23基因的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的解聚素及金属蛋白酶结构域23基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号13表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AC009225记载的碱基序列的碱基编号21001～23300表示的碱基序列)。就序列编号13表示的碱基序列而言，人来源的解聚素及金属蛋白酶结构域23基因的外显子1的碱基序列，用碱基编号1194～1630表示。在序列编号13表示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，例如表示胰腺癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胰腺癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号13表示的碱基序列中用碱基编号998、1003、1007、1011、1016、1018、1020、1026、1028、1031、1035、1041、1043、1045、1051、1053、1056、1060、1066、1068、1070、1073、1093、1096、1106、1112、1120、1124、1126等表示的胞嘧啶。

另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为G蛋白偶联受体7基因的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的G蛋白偶联受体7基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号14表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AC009800记载的碱基序列的碱基编号75001～78000表示的碱基序列)。就序列编号14表示的碱基序列而言，人来源的G蛋白偶联受体7基因的外显子1的碱基序列，用碱基编号1666～2652表示。在序列编号14表示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，例如表示胰腺癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胰腺癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号14表示的碱基序列中用碱基编号1480、1482、1485、1496、1513、1526、1542、1560、1564、1568、1570、1580、1590、1603、1613、1620等表示的胞嘧啶。

另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为G-蛋白偶联生长抑素及血管紧张素样肽受体基因的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的G-蛋白偶联生长抑素及血管紧张素样肽受体基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号15表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AC008971记载的碱基序列的碱基编号57001～60000表示的碱基序列的互补序列)。就序列编号15表示的碱基序列而言，人来源的G-蛋白偶联生长抑素及血管紧张素样肽受体基因的外显子1的碱基序列，用碱基编号776～2632表示。在序列编号15表示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，例如表示胰腺癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胰腺癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号15表示的碱基序列中用碱基编号470、472、490、497、504、506、509、514、522、540、543、552、566、582、597、610、612等表示的胞嘧啶。

另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为溶质载体家族6神经递质转运蛋白去甲肾上腺素成员2基因的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的溶质载体家族6神经递质转运蛋白去甲肾上腺素成员2基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号16表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AC026802记载的碱基序列的碱基编号78801～81000表示的碱基序列的互补序列)。就序列编号16表示的碱基序列而言，人来源的溶质载体家族6神经递质转运蛋白去甲肾上腺素成员2基因的外显子1的碱基序列，用碱基编号1479～1804表示。在序列编号16表示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，例如表示胰腺癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胰腺癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号16表示的碱基序列中用碱基编号1002、1010、1019、1021、1051、1056、1061、1063、1080、1099、1110、1139、1141、1164、1169、1184等表示的胞嘧啶。

本发明中的“(扩增至可以检测出目标DNA区域中被甲基化的DNA的量)扩增的DNA的量”，是指生物来源标本中所含的基因组DNA中的目标区域中的被甲基化了的DNA的扩增后的量本身，即，在本发明的第四工序中求出的量。例如，在生物来源标本是1mL的血清的情况下，是指根据血清1mL中所含的上述被甲基化了的DNA而扩增的DNA的量。

本发明中的“甲基化比例”是指用生物来源标本所含基因组DNA中目标DNA区域中被甲基化了的DNA的扩增后的量与没有被甲基化的DNA的扩增后的合计量，来除被甲基化了的DNA的扩增后的量而得的数值。

第一工序中，对生物来源标本所含基因组DNA来源的DNA试样进行利用甲基化敏感性限制酶的消化处理。

“甲基化敏感性限制酶”例如是指不消化包含被甲基化了的胞嘧啶的识别序列，而仅消化包含未被甲基化的胞嘧啶的识别序列的限制酶等。即，在是甲基化敏感性限制酶原本能够识别的识别序列中所含的胞嘧啶已被甲基化的DNA的情况下，即便使该甲基化敏感性限制酶作用于该DNA，该DNA也不会被切断。与此相对，在是甲基化敏感性限制酶原本能够识别的识别序列中所含的胞嘧啶未被甲基化的DNA的情况下，只要使该甲基化敏感性限制酶作用于该DNA作用，该DNA就被切断。作为这样的甲基化敏感性酶的具体的例，例如可以举出HpaII、BstUI、NarI、SacII、HhaI等。另外，上述的甲基化敏感性限制酶已经被Gruenbaum等明确(Nucleic Acid Research，9、2509-2515)。

作为调查有无利用甲基化敏感性限制酶的消化的方法，具体而言，例如可以举出如下的方法，即以上述DNA为模板，使用可以对识别序列中含有作为解析对象的胞嘧啶的DNA进行扩增的引物对，进行PCR，来调查DNA有无扩增(扩增产物)的方法。在作为解析对象的胞嘧啶被甲基化的情况下，得到扩增产物。另一方面，在作为解析对象的胞嘧啶未被甲基化的情况下，不能得到扩增产物。如此，通过对扩增后的DNA的量进行比较，可以测定成为解析对象的胞嘧啶的甲基化比例。即，如果生物来源标本中所含的基因组DNA被甲基化，则通过所谓上述的甲基化敏感性限制酶不切断被甲基化了的DNA的特性，可以区分在上述的生物来源标本中所含的基因组DNA中的上述的甲基化敏感性限制酶的识别位点中存在的CpG对中的胞嘧啶是否被甲基化。换而言之，如果在生物来源标本中所含的基因组DNA中的上述的甲基化敏感性限制酶识别位点中存在的至少一个CpG对中的胞嘧啶未被甲基化，则若用上述的甲基化敏感性限制酶对具有该识别位点的DNA进行消化处理，则被该甲基化敏感性限制酶切断。另外，如果在生物来源标本中所含的基因组DNA中的上述的甲基化敏感性限制酶的识别位点中存在的全部CpG对中的胞嘧啶已被甲基化，则具有该识别位点的DNA不会被该甲基化敏感性限制酶切断。因此，在实施了消化处理之后，如后所述，通过实施使用了可以对上述目标DNA区域进行扩增的一对引物的PCR，如果在生物来源标本中所含的基因组DNA中的上述限制酶的识别位点中存在的至少一个CpG对中的胞嘧啶未被甲基化，则不会得到PCR的扩增产物，另一方面，如果在生物来源标本中所含的基因组DNA中的上述甲基化敏感性限制酶识别位点中存在的全部CpG对中的胞嘧啶已被甲基化，则会得到PCR的扩增产物。

第一工序具体而言，例如在生物来源标本中所含的基因组DNA是哺乳类来源的基因组DNA的情况下，如下所述实施即可。在哺乳类来源的基因组DNA中分别添加最合适的10×缓冲液(330mM Tris-乙酸酯pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM二硫苏糖醇)3μL、1mg/mL BSA水溶液3μL、甲基化敏感性限制酶HpaII或HhaI(10U/μL)等各1.5μL，接着向该混合物中加入灭菌超纯水，使液量为30μL，在37℃下孵育1小时～3小时即可。

利用甲基化敏感性限制酶的消化处理可以是包括如下工序的消化处理：通过将含有目标DNA区域的单链DNA(正链)和，含有与甲基化敏感性限制酶的识别位点的碱基序列相互补的碱基序列的掩蔽用寡核苷酸混合，从而生成该甲基化敏感性限制酶的识别位点被保护而成的单链DNA的第一(A)工序，以及将由第一(A)工序选择的单链DNA用甲基化敏感性限制酶消化处理的第一(B)工序。

在此，“掩蔽用寡核苷酸”是指，含有与甲基化敏感性限制酶的识别位点的碱基序列相互补的碱基序列的寡核苷酸，是如下的寡核苷酸，通过与单链DNA中的目标DNA区域中所含的多个位点的甲基化敏感性限制酶的识别序列当中的至少1个位点(也可以是全部位点)互补的碱基配对，由此形成双链(即，上述位点为双链状态)，即便是仅以双链DNA为基质的甲基化敏感性限制酶也可以将上述位点消化，另外，在试样为单链DNA的情况下，可以提高利用能够消化单链DNA的甲基化敏感性限制酶(能够消化单链DNA的甲基化敏感性限制酶也能够消化双链DNA，就其消化效率而言，针对双链DNA的消化效率高于针对单链DNA的消化效率)的上述位点的消化效率，而且是不阻碍含有目标区域的DNA的单链DNA与单链固定化寡核苷酸之间的双链形成的寡核苷酸。另外，该掩蔽用寡核苷酸必须是在后述的将反向引物(正链)作为延伸引物、将该掩蔽用寡核苷酸(负链)作为模板、使延伸引物延伸的反应中不能利用的寡核苷酸。另外，作为碱基长度优选为8～200碱基长。

在基因组DNA来源的DNA试样中混合的掩蔽用寡核苷酸，可以是1种，也可以是多种。如果使用多种，含有目标DNA区域的单链DNA的甲基化敏感性限制酶的识别位点的大部分成为双链状态，可以将利用甲基化敏感性限制酶的、后述的“剩余未切的DNA”抑制在最小限。掩蔽用寡核苷酸，例如对应于目标DNA区域中所含的多个位点的甲基化敏感性限制酶的识别序列当中在甲基化的情况下未消化、而在未甲基化的情况下想要消化的位点(例如，疾病患者标本中被100％甲基化、健康人标本中100％未被甲基化的位点等)来设计，使用其是特别有用的。

另外，作为第一工序中利用甲基化敏感性限制酶的消化处理的令人担心之处，可以举出对无法完全消化含有未被甲基化的胞嘧啶的识别序列(所谓“剩余未切的DNA”)的担心。在这样的担心成为问题的情况下，只要大量存在甲基化敏感性限制酶的识别部位，可以将“剩余未切的DNA”抑制在最小限，因此认为作为目标DNA区域，具有甲基化敏感性限制酶的识别部位一个以上，其识别位点越多越好。

在本发明或后述的甲基化比例测定方法中，作为“生物来源标本中所含的基因组DNA来源的DNA试样”的优选方式之一，可举出预先用不将该基因组DNA所具有的目标DNA区域作为识别切断部位的限制酶实施消化处理而成的DNA试样。这里，在用固定化寡核苷酸选择生物来源标本中所含的基因组DNA的消化物的情况下，更容易选择短的模板DNA，另外，即便在用PCR对目标区域进行扩增的情况下，也认为模板DNA越短越好，所以可以将不以目标DNA区域为识别切断部位的限制酶直接用于生物来源标本中所含的基因组DNA来源的DNA试样而进行消化处理。另外，作为利用不以目标DNA区域为识别切断部位的限制酶实施消化处理的方法，使用一般的限制酶处理法即可。之所以这些为优选实施方式，是因为通过预先用如上所述的限制酶对生物来源标本本身进行消化处理，可以高精度地要求甲基化量。该方法对于消除如上所述的“剩余未切的DNA”是有用的。

作为利用甲基化敏感性限制酶消化生物来源标本中所含的基因组DNA来源的试样的方法，在生物来源标本是基因组DNA自身的情况下，是与上述方法相同的方法即可，在生物来源标本是组织溶解液、细胞溶解液等的情况下，基于与上述方法相同的方法，使用大量过剩的甲基化敏感性限制酶、例如相当于25ng的DNA量为500倍量(10U)或其以上的甲基化敏感性限制酶实施消化处理即可。基因组DNA基本上作为双链DNA存在。因此，就本操作而言，不仅可以使用能消化单链的甲基化敏感性限制酶(例如HhaI)，还可以使用能消化双链DNA的甲基化敏感性限制酶(例如HpaII、BstUI、NarI、SacII、HhaI等)。

第二工序中，从由第一工序所得的经消化处理了的DNA试样获得含有目标DNA区域的单链DNA(正链)，使该单链DNA(正链)与具有对该单链DNA的3’末端的一部分(不含上述目标DNA区域)有互补性的碱基序列的单链固定化寡核苷酸碱基配对，从而选择上述单链DNA。

“单链固定化寡核苷酸”是具有对含有目标DNA区域的单链DNA(正链)的3’末端的一部分(不含有上述目标DNA区域)有互补性的碱基序列的单链固定化寡核苷酸(以下，也记为该固定化寡核苷酸)。

该固定化寡核苷酸用于从生物来源标本所含基因组DNA来源的DNA试样中，选择含有目标DNA区域的单链DNA(正链)。该固定化寡核苷酸优选为5～50碱基长。

该固定化寡核苷酸的5’末端侧可以是被固定化到载体而得的，另一方面，其3’末端侧也可以保持自由状态以能够通过后述的第三工序及第A2步骤来进行从5’末端向3’末端进展的一次延伸反应。

另外，该固定化寡核苷酸也可以是5’或3’末端被固定化到载体。

“被固定化到载体而得到的”是指，在选择含有上述目标DNA区域的单链DNA(正链)时，该固定化寡核苷酸被固定化到载体即可，可以是(1)在该单链DNA(正链)与该固定化寡核苷酸之间碱基配对之前，通过该固定化寡核苷酸与载体之间的结合，而被固定化的，或者(2)在该单链DNA(正链)与该固定化寡核苷酸之间碱基配对后，通过该固定化寡核苷酸与载体之间的结合，而被固定化的。

得到该结构的过程中，根据通常的基因工程学的操作方法或市售的试剂盒·装置，将具有对含有目标DNA区域的单链DNA(正链)的3’末端的一部分(不含上述目标DNA区域)有互补性的碱基序列的寡核苷酸(以下，有时也记为该寡核苷酸)的5’末端固定到载体即可(向固相的结合)。具体而言，可例举如将该寡核苷酸的5’末端生物素化之后，将所得的生物素化寡核苷酸固定到被抗生蛋白链菌素覆盖了的支持体(例如，被抗生蛋白链菌素覆盖了的PCR管、被抗生蛋白链菌素覆盖了的磁珠等)的方法。

另外，还可例如如下的方法：使具有氨基、醛基、巯基等活性官能基的分子共价结合到该寡核苷酸的5’末端侧之后，通过例如5个甘油三酯连续连接后的物质等间隔物、交联物等，将其共价结合到表面被硅烷偶联剂等活性化了的玻璃、二氧化硅或耐热性塑料制支持体的方法。或者，在玻璃或硅制支持体上直接从该寡核苷酸的5’末端侧开始使之化学合成的方法。

第二工序具体而言，例如当该固定化寡核苷酸为生物素化寡核苷酸时，

(a)首先，通过在生物来源标本所含基因组DNA来源的DNA试样中，添加退火缓冲液及生物素化寡核苷酸(为了在该单链DNA(正链)与该固定化寡核苷酸碱基配对之后通过该固定化寡核苷酸与载体之间的结合成为被固定化的，在现阶段为游离状态)，从而得到混合物。接着，为了使生物来源标本所含基因组DNA来源的DNA试样中存在的、含有目标DNA区域的双链DNA成为单链，将所得的混合物在95℃加热数分钟。之后，为了形成与生物素化寡核苷酸的双链，将其迅速冷却至比生物素化寡核苷酸的Tm值低约10～20℃的温度，并在该温度保持数分钟。

(b)之后，返回至室温。

(c)向被抗生蛋白链菌素覆盖了的支持体添加上述(b)中所得的混合物，再将其在37℃保温数分钟，从而将生物素化寡核苷酸固定到被抗生蛋白链菌素覆盖了的支持体。

如上所述，上述(a)～(c)中，虽然在生物素化寡核苷酸与被抗生蛋白链菌素覆盖了的支持体之间的固定之间，实施了上述含有目标DNA区域的单链DNA(正链)与生物素化寡核苷酸之间的碱基配对，然而，其顺序哪个先哪个后均可。即，例如，通过向固定化至被抗生蛋白链菌素覆盖了的支持体的生物素化寡核苷酸，添加生物来源标本所含基因组DNA来源的DNA试样，从而得到混合物，为了使生物来源标本所含基因组DNA来源的DNA试样中存在的含有目标DNA区域的双链DNA成为单链，将所得的混合物在95℃加热数分钟，为了之后形成与生物素化寡核苷酸的双链，可以将其迅速冷却至比生物素化寡核苷酸的Tm值低约10～20℃的温度，并在该温度保温数分钟。

(d)如此操作将生物素化寡核苷酸固定到被抗生蛋白链菌素覆盖了的支持体之后，进行残留溶液的除去及清洗(DNA精制)。

更具体而言，例如使用被抗生蛋白链菌素覆盖了的PCR管时，首先，通过移液或倾注除去溶液之后，向其中添加与生物来源标本的容量大致等量的TE缓冲液，之后通过移液或倾注除去该TE缓冲液即可。另外，使用被抗生蛋白链菌素覆盖了的磁珠时，利用磁石将小珠固定后，首先通过移液或倾注除去溶液后，添加与生物来源标本的容量大致等量的TE缓冲液，之后通过移液或倾注除去该TE缓冲液即可。

接着，通过将该操作实施数次，进行残留溶液的除去及清洗(DNA精制)。

该操作中，由于将未被固定化的DNA、或被后述的限制酶消化了的在溶液中浮游的DNA从反应溶液中除去，因此是重要的。如果这些操作不充分，则在反应溶液中浮游的DNA成为模板，通过扩增反应得到不希望的扩增产物。为了避免支持体与生物来源标本中的DNA之间的非特异性结合，向生物来源标本中大量添加具有与目标区域完全不同的碱基序列的DNA(例如，人的生物来源标本时，为大鼠DNA等)，再进行上述操作即可。

作为第二工序中的优选方式，可例举如，在使含有目标DNA区域的单链DNA(正链)与具有对该单链DNA的3’末端的一部分(不含上述目标DNA区域)有互补性的碱基序列的单链固定化寡核苷酸碱基配对时，在含有二价阳离子的反应系中使碱基配对。更优选例如二价阳离子为镁离子。在此，“含有二价阳离子的反应系”是指，在用于使上述单链DNA(正链)与上述单链固定化寡核苷酸碱基配对的退火缓冲液中含有二价阳离子这样的反应系，具体可例如，可以以1mM～600mM浓度的含量含有以镁离子为构成要素的盐(例如，MgOAc₂、MgCl₂等)。

在第三工序中，将在第二工序中选择的单链DNA作为模板，将上述单链固定化寡核苷酸作为引物，使该引物1次延伸，从而使上述单链DNA延伸形成双链DNA。此时，为了将该单链DNA作为模板、将上述单链固定化寡核苷酸作为引物、使该引物1次延伸，使用DNA聚合酶来实施延伸反应即可。

第三工序具体而言，例如当该固定化寡核苷酸为生物素化寡核苷酸时，如下进行实施即可。

向在第二工序中选择的上述含有目标DNA区域的单链DNA中，添加灭菌超纯水17.85μL、最适的10×缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mMKCl、15mM MgCl₂)3μL、2mMdNTP 3μL、5N甜菜碱6μL，接着，向该混合物中加入AmpliTaq(DNA聚合酶的1种：5U/μL)0.15μL，使液量为30μL，在37℃孵育2小时。之后，通过移液或倾注除去经孵育了的溶液后，向其中添加与生物来源标本的容量大致等量的TE缓冲液，通过移液或倾注除去该TE缓冲液即可。

更具体而言，例如使用被抗生蛋白链菌素覆盖了的PCR管时，首先通过移液或倾注除去溶液后，向其中加入与生物来源标本的容量大致等量的TE缓冲液，之后，通过移液或倾注除去该TE缓冲液即可。另外，使用被抗生蛋白链菌素覆盖了的磁珠时，利用磁石将小珠固定后，首先，通过移液或倾注除去溶液后，添加与生物来源标本的容量大致等量的TE缓冲液，之后通过移液或倾注除去该TE缓冲液即可。接着，将这样的操作实施数次，从而进行残留溶液的除去和清洗(DNA精制)。

另外，第三工序具有将由第二工序选择的单链DNA从固定化寡核苷酸暂时分离成单链状态的步骤，也可以是将生成的作为单链状态的DNA(正链)作为模板、将具有对较上述目标DNA区域的碱基序列(正链)3’末端更位于3’末端侧的部分碱基序列(正链)有互补性碱基序列(负链)的正向引物作为延伸引物、使该引物1次延伸从而使上述单链DNA延伸形成双链DNA的工序。

作为这种情况的方法，具体而言例如，为了使双链DNA成为单链，在95℃加热数分钟即可。进而，添加正向引物后，将其迅速冷却至比正向引物的Tm值低约10～20℃的温度，在该温度保温数分钟，使上述生成的为单链状态的DNA(正链)与正向引物的双链形成。向生成的双链DNA的溶液中，添加最适的10×缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2)3μL、2mMdNTP 3μL、5N甜菜碱6μL，接着，将该混合物中加入AmpliTaq(DNA聚合酶的1种：5U/μL)0.15μL，加入灭菌超纯水使液量为30μL，在37℃孵育2小时。

另外，第三工序也可以与第四工序独立实施，也可以与第四工序中实施的PCR反应连续实施。

第四工序中，作为下述各本步骤的前步骤，具有将从第三工序获得的经延伸了的双链DNA(在上述甲基化敏感性限制酶的识别位点不含非甲基状态的CpG对的经延伸形成了的双链DNA)暂时分离成单链状态的步骤(前步骤)，并且，作为本步骤，具有第A步骤(本步骤)和第B步骤(本步骤)，

(a)第A步骤具有：通过使生成的为单链状态的DNA(正链)与上述单链固定化寡核苷酸(负链)碱基配对，从而选择上述为单链状态的DNA的第A1步骤，和

将在第A1步骤选择的为单链状态的DNA为模板，将上述单链固定化寡核苷酸作为引物，通过使该引物1次延伸，从而使上述为单链状态的DNA延伸形成双链DNA的第A2步骤，

(b)第B步骤为：将生成的为单链状态的DNA(负链)作为模板，将具有下述碱基序列的延伸引物(反向引物)作为延伸引物，使该延伸引物1次延伸，从而使上述为单链状态的DNA延伸形成双链DNA，所述碱基序列是对上述为单链状态的DNA(负链)所具有的碱基序列的部分碱基序列(负链)具有互补性的碱基序列(正链)，且该部分碱基序列(负链)与对上述目标DNA区域的碱基序列(正链)有互补性的碱基序列(负链)的3’末端相比更靠近3’末端侧。

进而，将由上述各本步骤所得的经延伸形成了的双链DNA暂时分离成单链状态后，反复操作第四工序的各本步骤，从而，将上述目标DNA区域中的被甲基化了的DNA扩增到可以检测的量，将扩增了的DNA的量定量。

第四工序中，首先，作为下述各本步骤的前步骤，将从第三工序获得的作为未消化物的经延伸形成了的双链DNA(在上述甲基化敏感性限制酶识别位点不含非甲基状态的CpG对的经延伸形成了的双链DNA)暂时分离成单链状态。具体而言，例如向从第三工序获得的作为未消化物的经延伸形成了的双链DNA(在上述甲基化敏感性限制酶的识别位点不含非甲基状态的CpG对的经延伸形成了的双链DNA)中，添加退火缓冲液，从而得到混合物。接着，将所得的混合物在95℃加热数分钟。

之后，实施如下的本步骤，

(i)为了使上述单链固定化寡核苷酸(负链)退火，将生成的为单链状态的DNA(正链)迅速冷却至较上述单链固定化寡核苷酸(负链)的Tm值低约10～20℃的温度，在该温度下保持数分钟。

(ii)之后，返回至室温。(第A步骤中的第A1步骤)

(iii)将由上述(i)选择的作为单链状态的DNA作为模板、将上述单链固定化寡核苷酸作为引物、使该引物1次延伸，从而使上述为单链状态的DNA延伸形成双链DNA(即、第A步骤中的第A2步骤)。具体而言，例如依据后述说明、前述本发明的第二工序中的延伸反应中的操作方法等来实施即可。

(iv)将生成的为单链状态的DNA(负链)作为模板，将具有下述碱基序列的延伸引物(反向引物))作为延伸引物(反向引物)，使该延伸引物1次延伸，从而使上述为单链状态的DNA延伸形成双链DNA(即，第B步骤)，所述碱基序列是对上述为单链状态的DNA(负链)所具有的碱基序列的部分碱基序列(负链)具有互补性的碱基序列(正链)，且该部分碱基序列(负链)与对上述目标DNA区域的碱基序列(正链)有互补性的碱基序列(负链)的3’末端相比更靠近3’末端侧。具体而言，例如与上述(iii)同样，依据后述的说明、上述的本发明的第二工序中延伸反应的操作方法等来实施即可。

(v)进一步，将从上述各本步骤获得的延伸形成了的双链DNA暂时分离成单链状态之后，将第四工序的各本步骤重复(例如，第A步骤及第B步骤)，从而，将上述目标DNA区域中被甲基化了的DNA扩增到能够检测的量，将扩增了的DNA的量定量。具体而言，例如，与上述同样，依据后述的说明、上述的本发明的第四工序中的前步骤、第A步骤以及第B步骤中的操作方法等来进行实施。

作为在利用甲基化敏感性限制酶的消化处理之后将目标DNA区域(即、目标区域)扩增的方法，例如可以使用PCR。将目标区域扩增时可以使用固定化寡核苷酸作为单侧的引物，因此通过仅添加另一方面的引物来进行PCR，可以得到扩增产物，该扩增产物也可以被固定化。此时，如果使用事先被荧光等标记的引物并将该标记作为指标，则可以不用进行电泳等繁杂的操作而评价扩增产物的有无。作为PCR反应液，例如如下的反应液：向本发明的第三工序中所得的DNA中混合50μM的引物的溶液0.15μl、2mM dNTP 2.5μl、10×缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mMKCl、20mM MgCl₂、0.01％明胶)2.5μl和AmpliTaqGold(耐热性DNA多聚酶的1种：5U/μl)0.2μl，再向其中添加灭菌超纯水使液量为25μl的反应液。

由于目标DNA区域(即、目标区域)中富GC碱基序列多，因此有时可以适量添加甜菜碱、DMSO等来实施。作为反应条件，例如将上述反应液在95℃保温10分钟之后，将以95℃保持30秒钟、接着在55～65℃保持30秒钟、再接着在72℃保持30秒钟作为1个循环的保温进行30～40次循环的条件。进行所述PCR之后，检测所得扩增产物。例如，使用事先标记了的引物时，实施与先前同样的清洗·精制操作后，可以测定被固定化了的荧光标记体的量。另外，实施使用了没有被标记的通常的引物的PCR时，通过使被胶体金粒子、荧光等标记了的探针等退火，测定结合到目标区域的该探针的量，从而可以检测。另外，为了更高精度地求出扩增产物的量，可以使用例如实时PCR法。实时PCR法是指实时检测PCR、将所得的检测结果进行动态分析的方法，是作为例如能够检测出基因量2倍左右的十分小的差异的高精度定量PCR法而广为人知的方法。该实时PCR法中，可例举如使用模板依存性核酸多聚酶探针等探针的方法、使用SYBR-Green等插入剂的方法等。用于实时PCR法的装置和试剂盒也可以利用市售品。如上所述，对于检测没有特别的限定，可以是利用目前为止公知的所有方法的检测。通过这些方法可以使直到检测的操作中不需要移换反应容器。

进而，通过使用与固定化寡核苷酸为相同碱基序列的生物素化寡核苷酸为单侧引物、或者使用较固定化寡核苷酸而言3’端侧新设计了的生物素化寡核苷酸作为单侧引物，使用其互补侧引物，可以扩增目标区域。此时，如果有被抗生蛋白链菌素覆盖了的支持体，则所得的扩增产物是被固定化了的，例如，利用抗生蛋白链菌素覆盖PCR管实施PCR时，由于在管内被固定，因此如上所述如果使用被标记了的引物，则容易进行扩增产物的检测。首先，当之前的固定化寡核苷酸利用共价结合等固定化时，将PCR所得的含有扩增产物的溶液转移到存在抗生蛋白链菌素覆盖支持体的容器中，可以将扩增产物固定化。检测中，可以如上所述进行实施。扩增目标区域的互补侧的引物必须是可以将具有甲基化敏感性限制酶的1个以上识别位点的目标区域扩增、且不含该识别位点的引物。其理由如下所述。当选择和1次延伸反应所得的双链DNA的固定化寡核苷酸侧的DNA链(新生链)中仅最3’端侧的甲基化敏感性限制酶的识别位点没有被甲基化时，仅该部分被甲基化敏感性限制酶消化。消化后，即使如上所述进行清洗操作，被称为新生链的仅3’端的一部分缺失了的双链DNA仍以被固定化的状态存在。当互补侧的引物包含该最3’端侧的甲基化敏感性限制酶的识别位点时，该引物的3’端侧的数个碱基与新生链的3’端的数个碱基退火，结果有可能通过PCR扩增目标区域。

本发明包括：在第四工序的前步骤之前或之后，追加有如下步骤(追加前步骤)的变更方法：向反应系内添加具有对含有上述目标DNA区域的单链DNA(正链)的3’末端的一部分(不含上述目标DNA区域)具有互补性的碱基序列、且为游离状态的单链寡核苷酸(负链)的步骤。

即，

(变更方法1)

一种方法，其中，在本发明的第四工序的前步骤之前，

追加有如下的步骤(追加前步骤)：向反应系中添加具有对含有上述目标DNA区域的单链DNA(正链)的3’末端的一部分(不含上述目标DNA区域)有互补性的碱基序列、且为游离状态的单链寡核苷酸(负链)的步骤，并且，

作为本发明的第四工序的各本步骤，还追加具有下述的1个步骤：

(c)第C步骤(本步骤)，其具有：

(i)使生成的为单链状态的DNA(正链)与在上述追加前步骤中向反应系内中添加的单链寡核苷酸(负链)碱基配对，从而选择上述为单链状态的DNA的第C1步骤，以及

(变更方法2)

一种方法(以下，也记为本发明甲基化比例测定方法)，其中，在本发明的第四工序的前步骤之后，

追加有如下的步骤(追加前步骤)：向反应系中添加具有对含有上述目标DNA区域的单链DNA(正链)的3’末端的一部分(不含上述目标DNA区域)有互补性的碱基序列、且为游离状态的单链寡核苷酸(负链)，并且具有如下的步骤(追加再前步骤)：将经过第三工序及上述的追加前步骤而得的为未消化物的延伸形成了的双链DNA(在上述甲基化敏感性限制酶的识别位点不含非甲基状态的CpG对的延伸形成了的双链DNA)暂时分离成单链状态的步骤，并且，

作为本发明的第四工序的各本步骤，还追加有下述1个步骤，

(c)第C步骤(本步骤)，其具有：

(i)使生成的为单链状态的DNA(正链)与在上述追加前步骤中向反应系内添加的单链寡核苷酸(负链)碱基配对，从而选择上述为单链状态的DNA的第C1步骤，以及

该变更方法中，通过从外部向反应系中添加“具有对含有上述目标DNA区域的单链DNA(正链)的3’末端的一部分(不含上述目标DNA区域)有互补性的碱基序列、且为游离状态的单链寡核苷酸(负链)”等，可以容易地使第四工序中上述目标DNA区域的扩增效率提高。另外，在追加前步骤中向反应系内添加的单链寡核苷酸(负链)只要是具有对单链DNA的3’末端的一部分(不含上述目标DNA区域)有互补性的碱基序列且5’末端具有与上述单链固定化寡核苷酸相同的碱基序列的为游离状态的单链寡核苷酸，既可以是与上述单链固定化寡核苷酸相同的碱基序列，或者，也可以是短碱基序列，或者，也可以是长序列。当与上述单链固定化寡核苷酸相比为长序列时，必须是不能在将上述反向引物(正链)为延伸引物、将该单链寡核苷酸(负链)作为模板、使延伸引物延伸的反应中利用的为游离状态的单链寡核苷酸。

上述内容示例了扩增目标区域时，使用固定化寡核苷酸作为单侧的引物，仅添加另一方的引物进行PCR的示例，但为了检测目的产物而实施其他方法(例如，可以将PCR所得的各个扩增产物的量进行比较的分析方法)时，如上所述，在将目标区域扩增时，也可以不使用固定化寡核苷酸作为一方(单侧)的引物，而是添加一对引物来实施PCR。进行所述PCR之后，求所得扩增产物的量。

第四工序具有重复工序，例如在第A1步骤中的“生成的为单链状态的DNA(正链)”是指，在第1次的第四工序的操作以及第2次之后的第四工序的反复操作这两操作中“生成的为“游离的”单链状态的DNA(正链)”。

另外，第B步骤中“生成的为单链状态的DNA(负链)”是指在第1次的第四工序的操作和第2次之后的第四工序的反复操作这两操作中“生成的为“固定的”单链状态的DNA(正链)”。当第四工序还具有追加的C工序时，是指在第1次的第四工序的操作中“生成的为“固定的”单链状态的DNA(正链)”，另一方面，是指第2次之后的第四工序的反复操作中“生成的为“固定的”单链状态的DNA(正链)”与“生成的为“游离的”单链状态的DNA(正链)”这两者。

另外，由第四工序的各本步骤而得“经延伸形成了的双链DNA”是指，在第A步骤的情况下，第1次的第四工序的操作中“在上述甲基化敏感性限制酶的识别位点不含非甲基状态的CpG对的经延伸形成了的双链DNA”，另一方面，是指，在第2次之后的第四工序的反复操作中“在上述甲基化敏感性限制酶的识别位点不含非甲基状态的CpG对的经延伸形成了的双链DNA”与“在上述甲基化敏感性限制酶的识别位点含有非甲基状态的CpG对的经延伸形成了的双链DNA”两者的意思。在第B步骤的情况中是指，第1次的第四工序的操作和第2次之后的第四工序的反复操作这两操作中“在上述甲基化敏感性限制酶的识别位点全部是非甲基状态的CpG对的经延伸形成了的双链DNA”。

另外，在第四工序中还追加具有C工序的情况也同样。

另外，在第四工序中还追加具有C工序时，第C1步骤中的“生成的为单链状态的DNA(正链)”是指在第1次的第四工序的操作及第2次之后的第四工序的反复操作的两操作中“生成的为“游离的”单链状态的DNA(正链)”。

另外，本发明还包括甲基化比例的测定方法(即，本发明甲基化比例测定方法)，其中，作为本发明的工序，还追加有下述2个工序。

(5)第五工序：在进行了本发明(包括上述变更方法)的第一工序及第二工序之后，不进行本发明(包括上述变更方法)的第三工序，而进行本发明(包括上述变更方法)的第四工序，从而将上述目标DNA区域的DNA(甲基化了的DNA及未被甲基化了的DNA的总量)扩增到可以检测的量，将经扩增了的DNA的量定量，以及，

(6)第六工序：基于将由本发明(包括上述变更方法)的第四工序定量了的DNA的量与由第五工序定量了的DNA的量比较而得到的差异，计算出上述目标DNA区域中被甲基化了的DNA的比例。

该甲基化比例测定方法在以下的情况中利用即可。

已知在各种病患(例如癌)中，引起DNA的甲基化异常，认为，通过检测该DNA甲基化异常，有可能测定各种病患的程度。例如在病患来源的生物来源标本中所含的基因组DNA中，有被100％甲基化了的DNA区域，如对该DNA区域实施本发明或本发明甲基化比例测定方法，则测定的被甲基化了的DNA的量多，例如，病患来源的生物来源标本中所含的基因组DNA中，有没有被100％甲基化的DNA区域，如对该DNA区域实施本发明或本发明甲基化比例测定方法，则测定的被甲基化了的DNA的量要成为接近几乎为零的值。另外，例如，在正常者的生物来源标本所含的基因组DNA中有甲基化比例低的DNA区域，且在疾患患者的生物来源标本所含的基因组DNA中有甲基化比例高的DNA区域，如对该DNA区域实施本发明或本发明甲基化比例测定方法，则对于正常者的情况，被甲基化了的DNA的量显示接近零的值，另一方面，对于来自疾患患者的情况，其显示与正常者的值相比有统计学意义的高值，因此基于该值的差异，可以判定“疾患的程度”。在此“疾患的程度”与一般在该领域中使用的意思相同，具体而言，例如对于生物来源标本为细胞时，是指该细胞的恶性程度，另外，例如生物来源标本为组织时，是指该组织中疾患细胞的存在量等。另外，生物来源标本为血浆·血清时，是指该个体患有病患的概率。因此，本发明或本发明甲基化比例测定方法可以通过考察甲基化异常，诊断各种病患。

该本发明或本发明甲基化比例测定方法中，用于目标区域的被甲基化了的DNA量的测定、甲基化比例的测定的各种方法中所可以使用的限制酶、引物或探针作为检测用试剂盒的试剂有用。本发明也提供了包括这些限制酶、引物或探针等作为试剂的检测用试剂盒、将这些引物或探针等在载体上固定化而得的检测用芯片，本发明或本发明甲基化比例测定方法的权利范围也包括以利用该方法的实质性原理而得的上述检测用试剂盒、检测用芯片之类的方式的使用。

实施例

以下通过实施例更详细地说明本发明，但本发明不限于此。

实施例1

合成由序列编号17所示碱基序列形成的HpaII的识别序列被甲基化的甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-M(7)，以及由序列编号2所示碱基序列形成的HpaII的识别序列没有被甲基化的非甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-UM，对于各自分别制备0.001pmol/10μL TE缓冲液溶液。

<HpaII的识别序列被甲基化的甲基化寡核苷酸>

N表示甲基化胞嘧啶。

GPR7-2079-2176/98mer-M(7)：

5’-GTTGGCCACTGCGGAGTCGNGCNGGGTGGCNGGCCGCACCTACAGNGCCGNGNGNGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC-3’(序列编号17)

<HpaII的识别序列没有被甲基化的非甲基化寡核苷酸>

GPR7-2079-2176/98mer-UM：

5’-GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCGGCCGCACCTACAGCGCCGCGCGCGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC-3’(序列编号18)

A组(未处理组)：向上述制备的寡核苷酸溶液中加入5μL与HpaII及HhaI最适的10×缓冲液(330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM二硫苏糖醇)和10×BSA(牛血清白蛋白1mg/ml)5μL，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为50μL。

B组(利用HpaII的消化处理组)：向上述制备的寡核苷酸溶液中，加入HpaII 12U、与HpaII和HhaI最适的10×缓冲液(330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM二硫苏糖醇)5μL以及10×BSA(牛血清白蛋白1mg/ml)5μL，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为50μL。

C组(利用掩蔽用寡核苷酸添加+HpaII的消化处理组)：向上述制备的寡核苷酸溶液中，加入HpaII 12U、与HpaII和HhaI最适的10×缓冲液(330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM二硫苏糖醇)5μL以及10×BSA(牛血清白蛋白1mg/ml)5μL，由序列编号19所示碱基序列形成的掩蔽用寡核苷酸MA 5pmol，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为50μL。

<掩蔽用寡核苷酸>

MA：5’-GCCACCCGGCGCGA-3’(序列编号19)

将各反应液在37℃中，孵育18.5小时。

另外，合成由序列编号20所示碱基序列形成的5’末端生物素标记寡核苷酸Bio-GPR7-2176R，制备0.1μM TE缓冲液溶液。

<5’末端生物素标记寡核苷酸>

Bio-GPR7-2176R：5’-GCACGACGAGTGTGACGATC-3’(序列编号20)

向所得甲基化寡核苷酸或非甲基化寡核苷酸的各消化处理溶液分别为50μL的各3瓶中添加5’末端生物素标记寡核苷酸溶液1μL，在95℃加热5分钟。之后迅速冷却至50℃，并在该温度下保温5分钟。接着，将它们在37℃保温5分钟之后，返回至室温。

接着，向被抗生蛋白链菌素覆盖了的PCR管中，添加如上所述操作制备的混合物，再将它们在37℃保温5分钟。

接着，从上述PCR管中除去溶液之后，添加100μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20的磷酸缓冲液(1mM KH₂PO₄、3mM Na₂HPO·7H₂O、154mM NaCl pH7.4)]，再通过移液除去该缓冲液。将该操作再重复2次。

接着，向上述的PCR管中，加入由序列编号21所示碱基序列形成的引物的溶液及由序列编号22所示碱基序列形成的引物的溶液(PF1及PR1)，使用下述的反应条件进行PCR，从而将目标DNA区域(GPR7-2079-2176、序列编号23，也将甲基化胞嘧啶用C表示)中的被甲基化了的DNA扩增。

<为PCR而设计的寡核苷酸引物>

PF1：5’-GTTGGCCACTGCGGAGTCG-3’(序列编号21)

PR1：5’-GCACGACGAGTGTGACGATC-3’(序列编号22)

<目标DNA区域>

GPR7-2079-2176：5’-GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCGGCCGCACCTACAGCGCCGCGCGCGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC-3’(序列编号23)

作为PCR的反应液，使用如下的反应液：向为模板的DNA中，混合为制备由序列编号21所示碱基序列形成的引物及由序列编号22所示碱基序列形成的引物3μM而制备的溶液各5μL、各2mM d NTP 5μL、缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl₂、0.01％明胶)5μL、耐热性DNA聚合酶(AmpliTaq Gold)5U/μL 0.25μL以及5N甜菜碱水溶液10μL，再向其中加入灭菌超纯水使液量为50μL的反应液。将该反应液在95℃中保持10分钟后，将在95℃中为30秒钟、接着在59℃为30秒钟、再在72℃为45秒钟作为1个循环的保温进行31次循环，在这样的条件下进行PCR。

进行PCR之后，通过2％琼脂糖凝胶电泳确认了DNA的扩增。将其结果示于图1。在A处理组(未处理组)与B处理组(HpaII处理组)中，在HpaII的识别序列被甲基化的甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-M(7)(M)和HpaII的识别序列没有被甲基化的非甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-UM(U)中均观察到DNA的扩增，得到该扩增产物(目标DNA区域：GPR7-2079-2176)。C处理组(利用掩蔽用寡核苷酸添加+HpaII的消化处理组)的情况中，在HpaII的识别序列被甲基化的甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-M(7)(M)中，确认了DNA的扩增，得到了该扩增产物(目标DNA区域：GPR7-2079-2176)，但HpaII的识别序列没有被甲基化的非甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-UM(U)中，没有确认DNA的扩增，没有得到该扩增产物。

通过上述确认了，可以选择含有上述目标DNA区域的单链DNA，并且通过添加掩蔽用寡核苷酸、使用甲基化敏感性限制酶，不需将上述目标DNA区域中没有甲基化的DNA扩增，就可以仅将被甲基化了的DNA扩增到可以检测的量。

产业上的利用可能性

通过本发明，可以简单地提供定量或检测被甲基化了的DNA的方法等。

序列表文本

序列编号17

为实验设计的甲基化寡核苷酸

序列编号18

为实验设计的非甲基化寡核苷酸

序列编号19

为实验设计的寡核苷酸

序列编号20

为固定设计的生物素标记寡核苷酸

序列编号21

为PCR设计的寡核苷酸引物

序列编号22

为PCR设计的寡核苷酸引物

序列编号23

包括目标DNA区域的寡核苷酸(GPR7-2079-2176、也将甲基化胞嘧啶用C表示)

Claims

1.一种测定方法，其是对生物来源标本所含基因组DNA中目标DNA区域中的被甲基化了的DNA含量进行测定的方法，具有以下工序：

(2)第二工序，其中，从由第一工序获得的经消化处理了的DNA试样获取含有目标DNA区域的单链DNA(正链)，使该单链DNA(正链)与单链固定化寡核苷酸碱基配对，从而选择上述单链DNA，上述单链固定化寡核苷酸具有对该单链DNA的3’末端的一部分有互补性的碱基序列，该单链DNA的3’末端的一部分不含上述目标DNA区域，

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在第二工序中使含有目标DNA区域的单链DNA(正链)与具有对该单链DNA的3’末端的一部分有互补性的碱基序列的单链固定化寡核苷酸碱基配对时，在含有二价阳离子的反应系中使碱基配对，上述单链DNA的3’末端的一部分不含上述目标DNA区域。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，二价阳离子为镁离子。

4.一种测定方法，其中，在第四工序的前步骤之前，

追加有：向反应系内添加具有对上述含有目标DNA区域的单链DNA(正链)的3’末端的一部分有互补性的碱基序列、且为游离状态的单链寡核苷酸(负链)的追加前步骤，其中，上述单链DNA(正链)的3’末端的一部分不含上述目标DNA区域，并且，

作为第四工序的各本步骤，还追加有下述的1个步骤，

(c)第C步骤(本步骤)，其具有：

5.一种测定方法，其中，在第四工序的前步骤之后，

追加有：向反应系内添加具有对上述含有目标DNA区域的单链DNA(正链)的3’末端的一部分有互补性的碱基序列、且为游离状态的单链寡核苷酸(负链)的追加前步骤，其中，单链DNA(正链)的3’末端的一部分不含上述目标DNA区域，并且，

具有：将经历第三工序及上述追加前步骤而得的作为未消化物的延伸形成的双链DNA暂时分离成单链状态的追加再前步骤，其中，所述双链DNA为在上述甲基化敏感性限制酶的识别位点不含非甲基状态的CpG对的延伸形成的双链DNA，并且，

作为第四工序的各本步骤，追加有下述的1个步骤，

(c)第C步骤(本步骤)，其具有：

6.一种甲基化比例的测定方法，其中，作为权利要求1～5中任一项所述方法的工序，还追加有下述2个工序，

(5)不进行权利要求1～5中任一项所述方法的第一工序，而进行权利要求1～5中任一项所述方法中的第二工序到第四工序，从而将上述目标DNA区域的DNA扩增到能够检测的量，再将经扩增了的DNA的量定量的第五工序，其中，上述目标DNA区域的DNA是被甲基化了的DNA及未被甲基化的DNA的总量，以及，

(6)基于将利用权利要求1～5中任一项所述的第四工序定量了的DNA的量与利用第五工序定量了的DNA的量比较而得的差异，计算上述目标DNA区域中被甲基化了的DNA的比例的第六工序。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，生物来源标本为哺乳动物的血清或血浆。

8.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，生物来源标本为哺乳动物的血液或体液。

9.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，生物来源标本为细胞溶解液或组织溶解液。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，生物来源标本所含基因组DNA来源的DNA试样为被限制酶事先消化处理而成的DNA试样，所述限制酶不以该基因组DNA具有的目标DNA区域为识别剪切位点。

11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，生物来源标本所含基因组DNA来源的DNA试样为事先被精制而成的DNA试样。

12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，利用甲基化敏感性限制酶的消化处理包括如下工序：

13.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，甲基化敏感性限制酶是在生物来源标本所含基因组DNA具有的目标DNA区域中具有识别剪切位点的限制酶。

14.根据权利要求1～13中任一项所述的方法，其中，甲基化敏感性限制酶为HpaII或HhaI。

15.一种测定方法，其是对生物来源标本所含基因组DNA具有的目标DNA区域中被甲基化了的DNA的含量进行测定的方法，其具有以下工序：

16.根据权利要求15所述的方法，其中，单链固定化寡核苷酸为5’或3’末端被固定化而得的单链固定化寡核苷酸。

17.根据权利要求15或16所述的方法，其中，在第二工序中使含有目标DNA区域的单链DNA(正链)与具有对该单链DNA的3’末端的一部分有互补性的碱基序列的单链固定化寡核苷酸碱基配对时，在含有二价阳离子的反应系中使碱基配对，所述单链DNA的3’末端的一部分不含上述目标DNA区域。

18.一种甲基化比例的测定方法，其中，作为权利要求15或16中记载的方法，还追加具有下述两个工序，

(5)不进行权利要求15或16所记载的方法的第一工序，而进行权利要求1～5中任一项所述方法中的第二工序至第四工序，从而，将上述目标DNA区域的DNA扩增至可以检测的量，再将经扩增了的DNA的量定量的第五工序，其中，上述目标DNA区域的DNA是被甲基化了的DNA及未被甲基化的DNA的总量，以及，

(6)基于将利用权利要求15或16所记载的第四工序定量了的DNA的量与利用第五工序定量了的DNA的量比较而得的差异，计算出上述目标DNA区域中被甲基化了的DNA的比例的第六工序。

19.根据权利要求15或16所述的方法，其中，生物来源标本为哺乳动物的血清或血浆。

20.根据权利要求15或16所述的方法，其中，生物来源标本为哺乳动物的血液或体液。

21.根据权利要求15或16所述的方法，其中，生物来源标本为细胞溶解液或组织溶解液。

22.根据权利要求15或16所述的方法，其中，生物来源标本中所含的基因组DNA来源的DNA试样为被限制酶事先消化处理而成的DNA试样，所述限制酶不以该基因组DNA具有的目标DNA区域为识别剪切位点。

23.根据权利要求15或16所述的方法，其中，生物来源标本所含基因组DNA来源的DNA试样为事先被精制而成的DNA试样。

24.根据权利要求15或16所述的方法，其中，利用甲基化敏感性限制酶的消化处理包括：

25.根据权利要求15或16所述的方法，其中，甲基化敏感性限制酶是在生物来源标本所含基因组DNA具有的目标DNA区域中具有识别剪切位点的限制酶。

26.根据权利要求15或16所述的方法，其中，甲基化敏感性限制酶为HpaII或HhaI。