CN102105586A - 定量或检测dna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及将标本中含有的具有目标DNA区域的DNA定量或检测的方法等。

Description

定量或检测DNA的方法
技术领域
本发明涉及对具有目标DNA区域的DNA进行定量或检测的方法等。
背景技术
作为对标本中所含的具有目标DNA区域的DNA进行定量或检测的方法，例如有：从标本提取DNA之后，通过利用DNA聚合酶的DNA合成的链反应(Polymerase Chain Reaction；以下有时记为PCR)，从而将具有目标DNA区域的DNA扩增的检测方法；使标本中的DNA所具有的目标DNA区域与荧光标记了的寡核苷酸杂交的检测方法等(例如，参考J.Cataract.Refract.Surg.，2007；33(4)：635-641、Environ.Mol.Mutagen.，1991；18(4)：259-262)。
发明内容
本发明的目的在于提供对具有目标DNA区域的DNA简便进行定量或检测的方法。
即，本发明提供以下技术方案：
[发明1]
一种方法(以下，有时记为本发明方法)，其是对标本中所含的具有目标DNA区域的DNA进行定量或检测的方法，其特征在于，具有以下工序：
(1)从标本制备要检测的目标DNA区域的DNA的第一工序；
(2)用DNA甲基化酶对由第一工序制备的DNA进行处理的第二工序；
(3)从经第二工序处理了的DNA制备单链甲基化DNA，使该单链甲基化DNA与检测寡核苷酸结合，得到被测DNA复合体的第三工序；
(4)使由第三工序得到的被测DNA复合体与固定化甲基化DNA抗体相结合，得到检测复合体的第四工序；以及，
(5)对由第四工序所得的检测复合体中所含检测寡核苷酸，利用其识别功能进行定量或检测，从而对上述单链DNA中的具有目标DNA区域的DNA进行定量或检测的第五工序。
[发明2]
根据发明1所述的方法，其中，第三工序中，在得到被测DNA复合体时，添加反向寡核苷酸(counter oligonucleotide)。
[发明3]
根据发明1或2所述的方法，其中，固定化甲基化DNA抗体为甲基胞嘧啶抗体。
[发明4]
根据发明1～3中任一项所述的方法，其中，DNA甲基化酶为胞嘧啶甲基化酶或SssI甲基化酶。
[发明5]
根据发明1～4中任一项所述的方法，其中，标本中所含的具有目标DNA区域的DNA为从RNA通过逆转录酶而生成的DNA中的具有目标DNA区域的DNA。
[发明6]
根据发明1～5中任一项所述的方法，其中，标本为下述任一种生物来源的标本，
(a)哺乳动物来源的血液、体液、粪尿、体分泌物、细胞溶解液或组织溶解液、
(b)从选自哺乳动物来源的血液、体液、粪尿、体分泌物、细胞溶解液及组织溶解液的一种中提取的DNA、
(c)将从选自哺乳动物来源的组织、细胞、组织溶解液及细胞溶解液的一种中提取的RNA作为模板而制得的DNA、
(e)从细菌、真菌或病毒提取的DNA、或
(f)将从细菌、真菌或病毒提取的RNA作为模板而制得的DNA。
[发明7]
根据发明1～6中任一项所述的方法，其中，由第一工序得到的上述具有目标DNA区域的DNA为事先用不以目标DNA区域为识别剪切位点的限制性酶消化处理而得的DNA、合成寡核苷酸、或精制而成的DNA。
[发明8]
根据发明1～7中任一项所述的方法，检测寡核苷酸的识别功能是以下任一种的识别功能。
(a)FITC的荧光检测、或
(b)利用FITC抗体的检测
[发明9]
根据发明1～8所述的任一项所述的方法，其中，检测寡核苷酸包括人基因组中的重复序列、重复基因或假基因的碱基序列或者能够与其一部分相互补结合的碱基序列。
[发明10]
根据发明9所述的方法，其中，人基因组中的重复序列为LINE或SINE。
[发明11]
根据发明1～10中任一项所述的方法，其中，检测寡核苷酸包括能够与以下所示任一种碱基序列相互补结合的碱基序列。
(1)序列编号37所示的碱基序列或与其有80％以上序列一致性(sequence identity)的碱基序列、
(2)序列编号37所示碱基序列的互补序列或与其有80％以上序列一致性的碱基序列、
(3)序列编号39所示的碱基序列或与其有80％以上序列一致性的碱基序列、或
(4)序列编号39所示碱基序列的互补序列或与其有80％以上序列一致性的碱基序列。
[发明12]
根据发明1～10中任一项所述的方法，其中，检测寡核苷酸包括以下所示的任一种的碱基序列。
(1)序列编号38所示的碱基序列或与其有80％以上序列一致性的碱基序列、
(2)序列编号38所示碱基序列的互补序列或与其有80％以上序列一致性的碱基序列、
(3)序列编号40所示的碱基序列或与其有80％以上序列一致性的碱基序列、或
(4)序列编号40所示碱基序列的互补序列或与其有80％以上序列一致性的碱基序列
[发明13]
根据发明1～12中任一项所述的方法，其中，第一工序中，在用于从标本制备DNA的DNA提取操作中所使用的溶液中的钠盐的浓度为100mM以上1000mM以下。
[发明14]
根据发明1～12中任一项所述的方法，其中，第一工序中，在用于从标本制备DNA的DNA提取操作中所使用的溶液中的钠盐的浓度为100mM以上200mM以下。
[发明15]
一种方法，其是筛选癌患者来源标本的方法，其中，包括以下工序：
通过发明1～14中任一项所述的方法使用被检者来源的标本而定量或检测的DNA的定量结果或检测结果，与通过相同方法使用健康者来源标本而定量或检测的DNA的定量结果或检测结果之间的差异如有显著性意义，则将被检者来源标本评价为癌患者来源标本，根据该评价结果来指定癌患者来源标本。
[发明16]
根据发明15所述的方法，其中，标本为哺乳动物来源的血清。
[发明17]
根据发明15～16中任一项所述的方法，其中，具有目标DNA区域的DNA为哺乳动物来源血清中的具有目标DNA区域的游离DNA。
附图说明
图1是显示实施例1中使用生物素标记甲基胞嘧啶抗体0.5μg/mL及5’末端FITC标记寡核苷酸F1而实施结果的示图。从右开始分别依次对溶液A(10ng/10μL TE缓冲液)、溶液B(1ng/10μL TE缓冲液)、溶液C(0.1ng/10μL TE缓冲液)、溶液D(0ng/10μL TE缓冲液(阴性对照液))，显示利用吸光度(450nm)测得DNA量的值。
图2是显示在实施例2中使用生物素标记甲基胞嘧啶抗体0.5μg/mL及5’末端FITC标记寡核苷酸F1进行实施后的结果的示图。从右开始分别依次对溶液MA(10ng each/20μL TE缓冲液)、溶液MB(1ng each/20μL TE缓冲液)、溶液MC(0.1ng each/20μL TE缓冲液)、溶液MD(0ng each/20μL TE缓冲液(阴性对照液))，显示利用吸光度(450nm)测定的DNA量的值。
图3是显示在实施例3中使用生物素标记甲基胞嘧啶抗体0.5μg/mL及5’末端FITC标记寡核苷酸F2进行实施后的结果的示图。从右开始分别依次对溶液MA(10ng each/20μL TE缓冲液)、溶液MB(1ng each/20μL TE缓冲液)、溶液MC(0.1ng each/20μL TE缓冲液)、溶液MD(0ng each/20μL TE缓冲液(阴性对照液))，显示利用吸光度(450nm)测定的DNA量的值。
图4是显示在实施例4中使用生物素标记甲基胞嘧啶抗体0.5μg/mL及5’末端FITC标记寡核苷酸F1及F2进行实施后的结果的示图。从右开始分别依次对溶液MA(10ng each/20μL TE缓冲液)、溶液MB(1ng each/20μL TE缓冲液)、溶液MC(0.1ng each/20μL TE缓冲液)、溶液MD(0ng each/20μL TE缓冲液(阴性对照液))，显示利用吸光度(450nm))测定的DNA量的值。
图5是显示在实施例5中使用生物素标记甲基胞嘧啶抗体0.5μg/mL及5’末端FITC标记寡核苷酸F3进行实施后的结果的示图。从右开始分别依次对溶液A(10ng/10μL TE缓冲液)、溶液B(1ng/10μL TE缓冲液)、溶液C(0.1ng/10μL TE缓冲液)、溶液D(0ng/10μL TE缓冲液(阴性对照液))，显示利用吸光度(450nm)测定的DNA量的值。
图6是显示在实施例6中使用生物素标记甲基胞嘧啶抗体0.5μg/mL及5’末端FITC标记寡核苷酸F3进行实施后的结果的示图。从右开始分别依次对溶液MA(10ng each/20μL TE缓冲液)、溶液MB(1ng each/20μL TE缓冲液)、溶液MC(0ng each/20μL TE缓冲液(阴性对照液))，显示利用吸光度(450nm)测定的DNA量的值。
图7是显示在实施例7中使用生物素标记甲基胞嘧啶抗体0.5μg/mL及5’末端FITC标记寡核苷酸F3及F4进行实施后的结果的示图。从右开始分别依次对溶液MA(10ng each/20μL TE缓冲液)、溶液MB(1ng each/20μL TE缓冲液)、溶液MC(0ng each/20μL TE缓冲液(阴性对照液))，显示利用吸光度(450nm)测定的DNA量的值。
图8是显示在实施例8中使用生物素标记甲基胞嘧啶抗体0.5μg/mL及5’末端FITC标记寡核苷酸F5进行实施后的结果的示图。从右开始分别依次对溶液A(100ng/5μL TE缓冲液)、溶液B(10ng/5μL TE缓冲液)、溶液C(1ng/5μL TE缓冲液)、溶液D(0ng/5μL TE缓冲液(阴性对照液))，显示利用吸光度(450nm)测定的DNA量的值。
图9是显示在实施例9中使用生物素标记甲基胞嘧啶抗体0.5μg/mL及5’末端FITC标记寡核苷酸F6进行实施后的结果的示图。从右开始分别依次对溶液A(100ng/5μL TE缓冲液)、溶液B(10ng/5μL TE缓冲液)、溶液C(1ng/5μL TE缓冲液)、溶液D(0ng/5μL TE缓冲液(阴性对照液))，显示利用吸光度(450nm)测定的DNA量的值。
图10是显示在实施例10中使用生物素标记甲基胞嘧啶抗体0.5μg/mL及5’末端FITC标记寡核苷酸F3进行实施后的结果的示图。从右开始分别依次对溶液A(10ng/10μL TE缓冲液)、溶液B(1ng/10μL TE缓冲液)、溶液C(0.1ng/10μL TE缓冲液)、溶液D(0ng/10μL TE缓冲液(阴性对照液))，显示利用吸光度(450nm)测定的DNA量的值。
图11是显示在实施例11中使用生物素标记甲基胞嘧啶抗体0.5μg/mL及5’末端FITC标记寡核苷酸F3进行实施后的结果的示图。从右开始分别依次对溶液MA(10ng each/20μL TE缓冲液)、溶液MB(1ng each/20μL TE缓冲液)、溶液MC(0ng each/20μL TE缓冲液(阴性对照液))，显示利用吸光度(450nm)测定的DNA量的值。
图12是显示在实施例12中使用生物素标记甲基胞嘧啶抗体0.5μg/mL及5’末端FITC标记寡核苷酸F4进行实施后的结果的示图。从右开始分别依次对溶液MA(10ng each/20μL TE缓冲液)、溶液MB(1ng each/20μL TE缓冲液)、溶液MC(0ng each/20μL TE缓冲液(阴性对照液))，显示利用吸光度(450nm)测定的DNA量的值。
图13是显示在实施例13中使用生物素标记甲基胞嘧啶抗体0.5μg/mL及5’末端FITC标记寡核苷酸F3及F4进行实施后的结果的示图。从右开始法分别依次对溶液MA(10ng each/20μL TE缓冲液)、溶液MB(1ng each/20μL TE缓冲液)、溶液MC(0ng each/20μL TE缓冲液(阴性对照液))，显示利用吸光度(450nm)测定的DNA量的值。
图14是显示在实施例14中使用生物素标记甲基胞嘧啶抗体0.5μg/mL及5’末端FITC标记寡核苷酸F5进行实施后的结果的示图。从右开始分别依次对溶液A(100ng/5μL TE缓冲液)、溶液B(10ng/5μL TE缓冲液)、溶液C(1ng/5μL TE缓冲液)、溶液D(0ng/5μL TE缓冲液(阴性对照液))，显示利用吸光度(450nm)测定的DNA量的值。
图15是显示在实施例15中使用生物素标记甲基胞嘧啶抗体0.5μg/mL及5’末端FITC标记寡核苷酸F6进行实施后的结果的示图。从右开始分别依次对溶液A(100ng/5μL TE缓冲液)、溶液B(10ng/5μL TE缓冲液)、溶液C(1ng/5μL TE缓冲液)、溶液D(0ng/5μL TE缓冲液(阴性对照液))，显示利用吸光度(450nm)测定的DNA量的值。
图16是显示在实施例16中没有进行处理1而使用生物素标记甲基胞嘧啶抗体和5’末端FITC标记寡核苷酸F6来实施DNA的检测后的结果的示图。从右开始分别依次对溶液A(10ng/10μL大鼠血清溶液)、溶液B(1ng/10μL大鼠血清溶液)、溶液C(0.1ng/10μL大鼠血清溶液)、溶液D(大鼠血清(阴性对照液))，显示利用吸光度(450nm)测定的DNA量的值。
图17是显示在实施例16中没有进行处理2而使用生物素标记甲基胞嘧啶抗体和5’末端FITC标记寡核苷酸F6来实施DNA的检测后的结果的示图。从右开始分别依次对溶液A(10ng/10μL大鼠血清溶液)、溶液B(1ng/10μL大鼠血清溶液)、溶液C(0.1ng/10μL大鼠血清溶液)、溶液D(大鼠血清(阴性对照液))，显示利用吸光度(450nm)测定的DNA量的值。
图18是显示在实施例17中使用生物素标记甲基胞嘧啶抗体和5’末端FITC标记寡核苷酸F6来实施DNA的检测后的结果的示图。从右开始分别依次对溶液A(4ng/40μL人血清溶液)、溶液B(2ng/40μL人血清溶液)、溶液C(1ng/40μL人血清溶液)、溶液D(人血清(阴性对照液))，显示利用吸光度(450nm)测定的DNA量的值。
图19是显示将在实施例18中使用生物素标记甲基胞嘧啶抗体和5’末端FITC标记寡核苷酸F6检测的结果与利用实时PCR定量了的结果相比较的示图。图中，将检测结果示于纵轴，将利用实时PCR的定量结果示于横轴，进行绘图。另外，图中的直线显示回归直线(粗线)以及标准误差范围(细线)。
图20是显示将在实施例18中对57岁以下的人血清样品使用生物素标记甲基胞嘧啶抗体和5’末端FITC标记寡核苷酸F6检测的DNA的结果分为癌患者和健康者绘制的图，分别对其显示平均值和标准偏差。
具体实施方式
本发明方法中的“标本”，可例举如(a)哺乳动物来源的血液、体液、粪尿、体分泌物、细胞溶解液或组织溶解液、(b)从选自哺乳动物来源的血液、体液、粪尿、体分泌物、细胞溶解液及组织溶解液的任一种中提取的DNA、(c)将从选自哺乳动物来源的组织、细胞、组织溶解液及细胞溶解液的任一种中提取的RNA作为模板制得的DNA、(e)从细菌、真菌或病毒提取的DNA、(f)将从细菌、真菌或病毒提取的RNA作为模板制得的DNA等。上述组织是指包括血液、淋巴结等广泛的含义。
“哺乳动物”是被分类为动物界脊索动物门脊椎动物亚门哺乳纲(Mammalia)的动物，具体可例举如人、猴、狨、豚鼠、大鼠、小鼠、牛、绵羊、犬、猫等。
“体液”是指在构成个体的细胞间存在的液体，具体可例举如血浆和间质液，在大多数情况下，起到维持个体的恒定性的功能。更具体可例举如淋巴液、组织液(组织间液、细胞间液、间质液)、体腔液、浆膜腔液、胸水、腹水、心包液、脑脊髓液(髓液)、关节液(滑液)、眼房水(房水)、脑脊髓液等。
“体分泌物”是指来自外分泌腺的分泌液，具体可例举如唾液、胃液、胆汁、胰液、肠液、汗、泪、鼻涕、精液、阴道分泌液、羊水、乳汁等。
在标本为人的血液、体液或体分泌物等时，可以利用在人的定期健康诊断中的临床检查用中所采用的试料。
作为“细胞溶解液”，可例举如将利用细胞培养用板等培养而得的细胞例如细胞株、原代培养细胞、或血细胞等破碎而得的包括细胞内液的溶解液。作为将细胞破碎的方法，可例举如利用超声波的方法、使用表面活性剂的方法、使用碱溶液的方法等。为了将细胞溶解，也可以利用市售的试剂盒等。
例如，利用10cm板培养细胞直到融合后，弃去培养液，向该板中加入0.6mL的RIPA缓冲液(1×TBS，1％诺乃洗涤剂(nonidet)P-40，0.5％脱氧胆酸钠(sodium deoxysholate)，0.1％SDS，0.004％叠氮化钠(sodium azide))。在4℃将板缓慢摇动15分钟后，利用刮具等将该板上的粘附细胞剥离，将该板上的液体转移到微型管中。添加该液体的1/10容量的10mg/mL PMSF之后，将该管在冰上放置30-60分钟之后，在4℃以10000×g离心10分钟，取得上清液作为细胞溶解液。
作为“组织溶解液”可例举如通过将从哺乳动物等动物采取的组织中的细胞破坏而取得的包括细胞内液的溶解液。
具体而言，测定从动物取得的组织的重量后，使用剃刀等将该组织剪切成小片。如使用冷冻组织时，需要切成更小的小片。剪切后，以每1g组织为3mL的比率，添加冰冷RIPA缓冲液，在4℃进行均质加工。在此，也可以向RIPA缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂等，例如，也可以添加RIPA缓冲液的1/10容量的10mg/mL PMSF。在均质中，使用超声波破碎器、加压型细胞破碎装置。在均质的操作中，以将均质液恒定地维持在4℃，抑制发热的方式进行。将均质液转移到微型管，在4℃以10000×g离心10分钟，取得上清液作为组织溶解液。
作为本发明方法中的“标本”，可例举如从食品、河川、土壤或一般市售制品采取的试料、表面附着物等，可以包括真菌、细菌、病毒等微生物、它们的核酸。
对于作为标本而使用的DNA，可例举如可以从上述生体试料、上述微生物提取的基因组DNA、基因组DNA来源的DNA断片或RNA等。从哺乳动物来源的试料获得基因组DNA的过程中，可以使用例如市售的DNA提取用试剂盒等。另外，为了从RNA获得DNA，可以使用市售的cDNA制造试剂盒等逆转录酶。另外，作为标本，也可以使用人工合成的DNA。
本发明方法中“目标DNA区域”(以下，有时也记为目标区域)是指，在标本中所含的DNA中，希望通过本发明方法来检测或定量的DNA区域。当标本为DNA时，目标DNA区域以DNA上的碱基序列表示。当标本为RNA时，目标DNA区域以从RNA用逆转录酶制得的DNA上的碱基序列表示，是与RNA上的成为检测对象的规定碱基序列相互补的碱基序列。本发明方法中，将胞嘧啶甲基化进行检测或定量时，目标区域优选包含富有胞嘧啶或后述CpG的区域。
第一工序为从标本中制备要检测目标DNA区域的DNA的工序。
作为由第一工序制备的DNA，可例举如用不以该DNA具有的目标DNA区域为识别剪切位点的限制性酶事先消化处理了的DNA试料、事先精制了的DNA试料、血液中的游离DNA、微生物基因组来源的DNA、及从标本中的RNA利用逆转录酶制得的DNA等。作为由第一工序制备的DNA，也可例举为根据标本的基因信息设计而人工合成了的DNA。
将血液作为标本使用时，根据通常的方法从血液制备血浆或血清，将制备的血浆或血清作为标本，分析其中含有的游离DNA(含有胃癌细胞等癌细胞来源的DNA)，则可以避开血细胞来源的DNA而分析胃癌细胞等癌细胞来源的DNA，可以使检测胃癌细胞等癌细胞、含有其的组织等的灵敏度提高。
作为在第一工序中制备的DNA，可例举如革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌等细菌、真菌、病毒、病原性原虫等微生物等来源的DNA、从该微生物等来源RNA通过逆转录酶而获得的DNA。例如，从生殖器支原体(Mycoplasma genitalium)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、布氏疏螺旋体B31(Borrelia burgdorferi B31)、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、幽门螺杆菌J99(Helicobacter pylori J99)、幽门螺杆菌26695、流感嗜血杆菌Rd(Haemophilus influenzae Rd)、结核分支杆菌H37Rv(Mycobacterium tuberculosis H37Rv)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、侵肺军团菌(Legionella pneumophila)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、大肠杆菌(Escherichia coli)、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、空肠弯曲杆菌空肠亚种(Campylobacter jejuni subsp.Jejuni)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、蜡状芽孢杆菌(Bacillusu cereus)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、结肠耶氏菌(Yersinia enterocolitica)、假结核耶氏菌(Yersinia pseudotuberuculosis)、红色毛癣菌(Trichophyton ruburum)、须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)、白色念珠菌(Candida albicans)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、烟曲霉菌(Aspergi llus fumigatus)、卡市肺包子虫(Pneumocystis carinii)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、细胞巨化病毒(Cytomegalovirus)、人疱疹病毒5(human herpesvirus 5)、埃巴病毒(Epstein-Barr virus)、人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus)、人乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus)、肠病毒(Enterovirus)、诺如病毒(Norovirus)、流感病毒(Influenza Virus)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、小球隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)的基因组DNA或从RNA通过逆转录酶制备的DNA可以利用到标本中的感染症治病菌、或食品中的食中毒治病菌等的检测中。
在制备基因组DNA中，例如，当标本为哺乳动物来源的试料时，可以使用市售的DNA提取用试剂盒(Genfind v2 Kit(贝克曼库尔特公司制)、FastPure DNA试剂盒(宝生物株式会社制))等。
标本为真菌等微生物时，可以通过“Methods in Yeast Genetics”(Cold Spring Harbor Laboratory Press)记载的一般的酵母基因组的制备方法来制备基因组DNA，标本为大肠菌之类的原核生物时，可以使用“Molecular Cloning-A Laboratory Manual-”(Cold Spring Harbor Laboratory Press)中记载的一般的微生物基因组制备方法等。
另外，标本为食品试料时，也可以将微生物等从食品分离后来制备DNA，也可以同时获取食品中所含的微生物以外的基因组DNA和微生物来源的基因组。另外，当标本为哺乳动物来源的组织、目标DNA区域为病毒来源的DNA时，也可以使用市售的RNA提取用试剂盒(ISOGEN(311-02501)(日本基因公司制)、或者FastRNA Pro Green Kit(船越公司制)、FastRNA Pro Blue Kit(船越公司制)、FastRNA Pro Red Kit(船越公司制)等)等从组织中提取RNA，利用逆转录酶来获得DNA。另外，当标本为哺乳动物来源的标本时，也可以提取病毒粒子之后再提取病毒的DNA，或者也可以提取病毒粒子之后，使用市售的试剂盒(QuickGene RNA tissue kit S II、富士胶片公司制)等提取病毒RNA，利用逆转录酶来获得病毒来源的DNA。也可以从病毒感染了的组织提取RNA，再利用逆转录酶获得病毒来源的DNA，也可以从病毒感染了的组织获得DNA，再获得病毒来源的DNA。另外，利用逆转录酶从RNA获得DNA时，可以使用市售的试剂盒(转录物高精度cDNA合成试剂盒(Transcripter high fidelity cDNA synthesis kit)、罗氏诊断公司制)等。
“甲基化DNA”中，构成基因(基因组DNA)的4种碱基的任意种被甲基化。例如，在哺乳动物中已知有5’-CG-3’所示的碱基序列(C表示胞嘧啶，G表示鸟嘌呤。以下，也可以将该碱基序列记为“CpG”)中仅胞嘧啶被甲基化的现象。胞嘧啶的甲基化部位为5位。在细胞分裂之前进行DNA复制时的新生双链DNA中，为母细胞来源的模板链中的“CpG”中仅胞嘧啶为甲基化的状态，在甲基转移酶的作用下立即将新生链的“CpG”中的胞嘧啶也甲基化。该胞嘧啶甲基化将与母细胞来源的DNA链中的包括甲基化了的胞嘧啶的CpG相互补结合的新生DNA链的CpG的胞嘧啶甲基化。因此，母细胞的DNA的甲基化状态在DNA复制后也被直接传给新的2组DNA。本发明中的“CpG对”是指CpG所示的碱基序列和与其相互补的CpG结合而成的双链DNA。
“单链甲基化DNA”是指单链DNA的碱基序列中的5’-CG-3’所示的碱基序列中胞嘧啶的5位被甲基化了的单链DNA。
作为“目标DNA区域”，可例举如赖氨酰氧化酶(Lysyl oxidase)、HRAS样阻抑因子(HRAS-like suppressor)、bA305P22.2.1、γ-细丝蛋白(Gamma filamin)、HAND1、RIKEN2210016F16的同系物(Homologue of RIKEN2210016F16)、FLJ32130、PPARG血管生成素相关蛋白(PPARG angiopoietin-related protein)、凝血调节蛋白(Thrombomodulin)、p53-应答基因2(p53-responsive gene 2)、微纤维蛋白2(Fibrillin2)、神经丝蛋白3(Neurofilament3)、解聚素及金属蛋白酶结构域23(disintegrin and metalloproteinase domain 23)、G-蛋白偶联受体7(G protein-coupled receptor 7)、G-蛋白偶联生长抑素及血管紧张素样肽受体(G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor)、溶质载体蛋白家族6神经递质转运蛋白去甲肾上腺素成员2(Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2)等有用蛋白质基因的启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)等，可以优选例举在这些碱基序列中存在的含有一个以上CpG的DNA区域。本发明方法中，也可以分别检测或定量“目标DNA区域”的甲基化后的DNA，但如果例如在1个检测系中，检测更多的“目标DNA区域”的甲基化了的DNA，则可以相应地提高定量精度及检测灵敏度。
具体而言，例如有用蛋白质基因为赖氨酰氧化酶基因时，作为在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的含有一个以上CpG的碱基序列，可以举出含有人来源的赖氨酰氧化酶基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出用序列编号1表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AF270645记载的碱基序列的碱基编号16001～18661所示的碱基序列)。就序列编号1所示的碱基序列而言，对人来源的赖氨酰氧化酶蛋白质的氨基末端的蛋氨酸进行编码的ATG密码子，用碱基编号2031～2033表示，上述外显子1的碱基序列用碱基编号1957～2661表示。
另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为HRAS样阻抑因子基因的情况下，作为在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的含有一个以上CpG的碱基序列，可以举出含有人来源的HRAS样阻抑因子基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出用序列编号2表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AC068162记载的碱基序列的碱基编号172001～173953表示的碱基序列)。就序列编号2表示的碱基序列而言，人来源的HRAS样阻抑因子基因的外显子1的碱基序列用碱基编号1743～1953表示。
另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为bA305P22.2.1基因的情况下，作为在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的含有一个以上CpG的碱基序列，可以举出含有人来源的bA305P22.2.1基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号3表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AL121673记载的碱基序列的碱基编号13001～13889表示的碱基序列)。就序列编号3表示的碱基序列而言，对人来源的bA305P22.2.1蛋白质的氨基末端的蛋氨酸进行编码的ATG密码子，用碱基编号849～851表示，上述外显子1的碱基序列用碱基编号663～889表示。
另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为γ-细丝蛋白基因的情况下，作为在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的含有一个以上CpG的碱基序列，可以举出含有人来源的γ-细丝蛋白基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号4表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AC074373记载的碱基序列的碱基编号63528～64390表示的碱基序列的互补序列)。就序列编号4表示的碱基序列而言，对人来源的γ-细丝蛋白质的氨基末端的蛋氨酸进行编码的ATG密码子，用碱基编号572～574表示，上述外显子1的碱基序列用碱基编号463～863表示。
另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为HAND1基因的情况下，作为在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的含有一个以上CpG的碱基序列，可以举出含有人来源的HAND1基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号5表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AC026688记载的碱基序列的碱基编号24303～26500表示的碱基序列的互补序列)。就序列编号5表示的碱基序列而言，对人来源的HAND1蛋白质的氨基末端的蛋氨酸进行编码的ATG密码子，用碱基编号1656～1658表示，上述外显子1的碱基序列用碱基编号1400～2198表示。
另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为RIKEN2210016F16基因的同系物的情况下，作为在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的含有一个以上CpG的碱基序列，可以举出含有人来源的RIKEN2210016F16基因的同系物的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号6表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AL354733记载的碱基序列的碱基编号157056～159000表示的碱基序列的互补碱基序列)。就序列编号6表示的碱基序列而言，人来源的RIKEN2210016F16蛋白质的同系物的外显子1的碱基序列用碱基编号1392～1945表示。
另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为FLJ32130基因的情况下，作为在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的含有一个以上CpG的碱基序列，可以举出含有人来源的FLJ32130基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号7表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AC002310记载的碱基序列的碱基编号1～2379表示的碱基序列的互补碱基序列)。就序列编号7表示的碱基序列而言，对人来源的FLJ32130蛋白质的氨基酸末端的蛋氨酸进行编码的ATG密码子，用碱基编号2136～2138表示，认为是上述外显子1的碱基序列用碱基编号2136～2379表示。
另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为PPARG血管生成素相关蛋白基因的情况下，作为在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的含有一个以上CpG的碱基序列，可以举出含有人来源的PPARG血管生成素相关蛋白基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号8表示的碱基序列。就序列编号8表示的碱基序列而言，对人来源的PPARG血管生成素相关蛋白质的氨基末端的蛋氨酸进行编码的ATG密码子，用碱基编号717～719表示，上述外显子1的5’侧部分的碱基序列用碱基编号1957～2661表示。
另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为凝血调节蛋白基因的情况下，作为在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的含有一个以上CpG的碱基序列，可以举出含有人来源的凝血调节蛋白基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号9表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AF495471记载的碱基序列的碱基编号1～6096表示的碱基序列)。就序列编号9表示的碱基序列而言，对人来源的凝血调节蛋白质的氨基末端的蛋氨酸进行编码的ATG密码子，用碱基编号2590～2592表示，上述外显子1的碱基序列用碱基编号2048～6096表示。
另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为p53-应答基因2基因的情况下，作为在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的含有一个以上CpG的碱基序列，可以举出含有人来源的p53-应答基因2基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号10表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AC009471记载的碱基序列的碱基编号113501～116000表示的碱基序列的互补序列。)。就序列编号10表示的碱基序列而言，人来源的p53-应答基因2基因的外显子1的碱基序列用碱基编号1558～1808表示。
另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为微纤维蛋白2基因的情况下，作为在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的含有一个以上CpG的碱基序列，可以举出含有人来源的微纤维蛋白2基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号11表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AC113387记载的碱基序列的碱基编号118801～121000表示的碱基序列的互补序列)。就序列编号11表示的碱基序列而言，人来源的微纤维蛋白2基因的外显子1的碱基序列用碱基编号1091～1345表示。
另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为神经丝蛋白3基因的情况下，作为在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的含有一个以上CpG的碱基序列，可以举出含有人来源的神经丝蛋白3基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号12表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AF106564记载的碱基序列的碱基编号28001～30000表示的碱基序列的互补序列)。就序列编号12表示的碱基序列而言，人来源的神经丝蛋白3基因的外显子1的碱基序列用碱基编号614～1694表示。
另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为解聚素及金属蛋白酶结构域23基因的情况下，作为在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的含有一个以上CpG的碱基序列，可以举出含有人来源的解聚素及金属蛋白酶结构域23基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号13表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AC009225记载的碱基序列的碱基编号21001～23300表示的碱基序列)。就序列编号13表示的碱基序列而言，人来源的解聚素及金属蛋白酶结构域23基因的外显子1的碱基序列，用碱基编号1194～1630表示。
另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为G蛋白偶联受体7基因的情况下，作为在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的含有一个以上CpG的碱基序列，可以举出含有人来源的G蛋白偶联受体7基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号14表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AC009800记载的碱基序列的碱基编号75001～78000表示的碱基序列)。就序列编号14表示的碱基序列而言，人来源的G蛋白偶联受体7基因的外显子1的碱基序列，用碱基编号1666～2652表示。
另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为G-蛋白偶联生长抑素及血管紧张素样肽受体基因的情况下，作为在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的含有一个以上CpG的碱基序列，可以举出含有人来源的G-蛋白偶联生长抑素及血管紧张素样肽受体基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号15表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AC008971记载的碱基序列的碱基编号57001～60000表示的碱基序列的互补序列)。就序列编号15表示的碱基序列而言，人来源的G-蛋白偶联生长抑素及血管紧张素样肽受体基因的外显子1的碱基序列，用碱基编号776～2632表示。
另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为溶质载体家族6神经递质转运蛋白去甲肾上腺素成员2基因的情况下，作为在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的含有一个以上CpG的碱基序列，可以举出含有人来源的溶质载体家族6神经递质转运蛋白去甲肾上腺素成员2基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号16表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AC026802记载的碱基序列的碱基编号78801～81000表示的碱基序列的互补序列)。就序列编号16表示的碱基序列而言，人来源的溶质载体家族6神经递质转运蛋白去甲肾上腺素成员2基因的外显子1的碱基序列，用碱基编号1479～1804表示。
第二工序是用DNA甲基化酶对由第一工序制备的DNA进行处理的工序。
“DNA甲基化酶”是指将DNA中的碱基甲基化的酶，以从哺乳动物细胞、细菌等分离了多种DNA甲基化酶。DNA甲基化酶根据基质的碱基的种类，被分为腺嘌呤甲基化酶、胞嘧啶甲基化酶等多个种类。胞嘧啶甲基化酶是识别DNA碱基序列中的特定序列，并将该序列附近的胞嘧啶甲基化的酶，已知根据识别的碱基序列不同而不同的胞嘧啶甲基化酶。
在被称为制限修饰体系的原始免疫系中有大量由DNA甲基化酶催化的DNA的甲基化反应。限制修饰体系是指通过细菌中发挥功能的基因组全体定期甲基化而不会被识别特定序列的限制酶(限制内切酶)消化，进而利用通过限制酶消化外来DNA(特别优选噬菌体)的功能，防御微生物基因组免受噬菌体感染的系统。在基因组的甲基化中发挥功能的酶，已知将胞嘧啶或腺嘌呤甲基化，大多数情况下是将嘌呤残基的6位的氮(N6)、或5位的碳(C5)甲基化。作为这样的酶当中将胞嘧啶的C5甲基化的胞嘧啶甲基化酶，已知有SssI(M.SssI)甲基化酶、AluI甲基化酶、HhaI甲基化酶、HpaII甲基化酶、MspI甲基化酶、HaeIII甲基化酶等。另外，这些将胞嘧啶的C5位甲基化的酶所识别的碱基序列不同，对CpG进行识别的胞嘧啶甲基化酶仅为SssI。
作为人基因组中的DNA的甲基化反应，作为外遗传(产生不依赖于基因序列的基因表达的多样性的机制)，已知CpG的胞嘧啶的5位(C5)的甲基化，作为这样的胞嘧啶甲基化酶，已知有DNA甲基转移酶。作为DNA甲基转移酶，已知有DnmtI甲基转移酶。
在人细胞中，由于CpG序列的胞嘧啶的C5位被甲基化，所以在人为的将基因组甲基化的情况下，通过使用SssI，可以将与人细胞内的甲基化相同序列(CpG)的、相同胞嘧啶的、相同位置甲基化。
为了通过胞嘧啶甲基化酶将DNA甲基化，具体而言，例如向DNA试样中分别添加最适的10×缓冲液(NEBuffer2(NEB公司制))5μL、S-腺苷甲硫氨酸(3.2mM，NEB公司制)0.5μl、胞嘧啶甲基化酶SssI(NEB公司制)0.5μL，接着，向该混合物中加入灭菌超纯水，使液量为50μL，在37℃下孵育30分钟。第二工序中的甲基化是为了通过使目标DNA区域与甲基化DNA抗体结合从而结合到支持体而实施的，因此如果提取的DNA试料的目标DNA区域被甲基化，则没有必要实施第二工序。
第二工序中，当构成经DNA甲基化酶修饰了的甲基化DNA的甲基化碱基与后述的检测寡核苷酸所具有的甲基化碱基不同时，该检测寡核苷酸上的甲基化碱基可以作为识别功能而被利用。例如，当检测寡核苷酸为6-甲基腺嘌呤，经第二工序胞嘧啶可以被修饰成5-甲基胞嘧啶时，作为检测寡核苷酸的识别功能，利用6-甲基腺嘌呤抗体，向支持体的固定可以使用甲基胞嘧啶抗体。具体而言，第二工序中被SssI甲基化酶修饰时，向支持体的固定可以使用甲基胞嘧啶抗体。即，当检测寡核苷酸具有甲基腺嘌呤且利用甲基腺嘌呤抗体检出检测寡核苷酸时，不会检出具有目标DNA区域的DNA的甲基胞嘧啶，而仅检出检测寡核苷酸的甲基腺嘌呤。
第三工序是从由第二工序获得的经DNA甲基化酶处理后的DNA制备单链甲基化DNA，且使具有目标DNA区域的单链甲基化DNA与检测寡核苷酸结合而取得被测DNA复合体的工序。
本发明方法中的“检测寡核苷酸”是指如下的寡核苷酸，即，构成寡核苷酸的核苷酸的碱基具有用于检测或定量该检测寡核苷酸的识别功能，并具有作为用于通过互补性与具有目标DNA区域的DNA相结合的碱基序列的检测用粘附序列。
另外，本发明中的“检测寡核苷酸”也可来自后述的人基因组中的重复序列、重复基因或假基因的碱基序列或可以与其一部分互补结合的碱基序列。具体可例如，序列编号38、40所示的碱基序列或具有它们的互补序列的碱基序列等。
检测用粘附序列是为了形成与含有目标DNA区域的单链DNA的结合体(双链)而必要的碱基序列，也就是，含有通过互补碱基配对可以与目标DNA区域的碱基序列的一部分结合的序列的碱基序列，或含有与比目标DNA区域的5’末端更靠近5’末端侧DNA区域的碱基序列的一部分相互补的碱基序列的碱基序列，或者含有与比目标DNA区域的3’末端更靠近3’末端侧的碱基序列的一部份相互补的碱基序列的碱基序列，另外，且优选不抑制甲基化DNA抗体与目标DNA区域中被甲基化了的DNA相结合。
“不抑制甲基化DNA抗体与目标DNA区域中被甲基化了的DNA相结合”是指，在甲基化DNA抗体与被甲基化了的单链DNA结合所需的占有空间内，不会发生该寡核苷酸与上述单链DNA的互补结合。即，认为，在甲基化DNA抗体与被甲基化了的碱基(胞嘧啶)的结合中，不仅仅是直接结合的被甲基化了的碱基(胞嘧啶)，而且被甲基化了的碱基(胞嘧啶)所存在的周边空间也被占有。检测用粘附序列，只要针对在甲基化DNA抗体与被甲基化了的DNA结合时所需要的占有空间而言，是不与上述单链DNA互补结合的碱基序列即可。在上述单链DNA上结合的检测用粘附序列没有必要是1种，只要不抑制甲基化DNA抗体的结合，可以使用2种以上。如果使用该寡核苷酸，就可以使定量精度及检测灵敏度提高。
第三工序中的“取得具有目标DNA区域的单链甲基化DNA，使该单链甲基化DNA与检测寡核苷酸结合而得到被测DNA复合体”是指，形成被甲基化了的具有目标DNA区域的DNA(以下，有时记为单链甲基化DNA)与检测寡核苷酸相互补结合而成的被测DNA复合体。具体而言，将上述第二工序中被DNA甲基化酶甲基化了的单链甲基化DNA用Tris-HCl缓冲液(10mM)制备成1ng/μL的溶液，将可以与该单链甲基化DNA互补结合的检测寡核苷酸用Tris-HCl缓冲液(10mM)制备成0.02μM的溶液，将各寡核苷酸溶液与缓冲液(330mM Tris-醋酸盐pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM二硫苏糖醇)10μL、100mM MgCl2溶液10μL、1mg/mL BSA溶液10μL混合，再向该混合物中添加灭菌超纯水使液量为100μL。之后，在95℃加热10分钟，而后迅速冷却至70℃并保温10分钟，再之后冷却至50℃并保温10分钟，再于37℃保温10分钟后返回至室温，从而促进单链甲基化DNA与检测寡核苷酸的被测DNA复合体的形成即可。
“互补结合”是指通过基于碱基之间的氢键的碱基配对而形成双链DNA。例如，形成构成DNA的双链中各单链DNA的碱基，通过嘌呤和嘧啶的碱基配对形成双链，更具体而言，通过多个连续的、基于胸腺嘧啶和腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶的氢键的碱基结合而形成双链DNA。也将通过互补性进行结合称为“互补结合”。“互补结合”也写成“互补的结合”、“互补的碱基配对”、“通过互补性结合”或“通过互补性的结合(基于互补(碱基配对)的结合)”。还将可以互补结合的碱基序列相互写成“具有互补性”、或“为互补性“。人工制作的寡核苷酸中所含的肌苷与胞嘧啶、或腺嘌呤、或胸腺嘧啶通过氢键的结合也包括在互补结合中。
在本发明方法中，在单链甲基化DNA与检测寡核苷酸“通过互补性进行结合”的情况下，也包括构成检测寡核苷酸的检测用粘附序列的碱基序列的一部分未与单链甲基化DNA形成碱基配对的情况。例如，构成检测用粘附序列的碱基当中至少75％、优选80％以上的碱基与单链甲基化DNA形成碱基配对，且也包括与被测寡核苷酸有至少75％以上、优选80％以上的同源性的寡核苷酸和检测用粘附序列可以结合的情况。
本发明方法的第三工序中，作为使单链甲基化DNA与检测寡核苷酸的被测DNA复合体形成时的优选方式，可列举如添加反向寡核苷酸等。
反向寡核苷酸是将含有与目标DNA区域相同的碱基序列的聚核苷酸分割成短的寡核苷酸后得到的核苷酸。其中，“短”是指10～100个碱基、更优选20～50个碱基的长度。另外，反向寡核苷酸未设计在检测寡核苷酸与单链甲基化DNA相结合的碱基序列上。反向寡核苷酸与目标DNA区域相比，大量过剩添加，目的在于，在目标DNA区域为正链时，使目标DNA区域(正链)成为单链之后，在使其与后述的固定化甲基化DNA抗体结合时，防止目标DNA区域的互补链(负链)和目标DNA区域(正链)通过互补性再结合。这是因为，在使甲基化了的目标DNA区域与甲基化DNA抗体结合，测定目标DNA的量或与其有相关关系的指标值时，被甲基化了的目标区域为单链时更容易与甲基化DNA抗体结合。另外，反向寡核苷酸与目标DNA区域相比，优选添加至少10倍、通常为100倍以上的量。
第一工序中制备的DNA试料中的目标DNA区域为单链DNA时，即使没有为了进行第三工序中的“制备单链甲基化DNA”而进行特别的作业，也可以得到单链甲基化DNA作为DNA试料。具体而言，作为DNA试料，可列举如利用逆转录酶从RNA合成的单链DNA、在由病毒提取的DNA中从以单链DNA作为基因组的病毒获得的单链DNA。另外，当第一工序中制备的DNA试料中的目标DNA区域为双链DNA时，为了进行第三工序中的“制备单链甲基化DNA”，进行用于将双链DNA成为单链的操作即可。此时，具体而言，在95℃加热数分钟，再骤冷至4℃以下即可。
检测寡核苷酸中的“检测用粘附序列”是指含有与目标DNA区域所具有的碱基序列相互补的碱基序列的寡核苷酸，是与能和检测用粘附序列配对的目标DNA区域的碱基序列有75％以上、优选90％以上同源性的序列。另外，检测用粘附序列为不抑制后述的固定化甲基化DNA抗体与被测DNA复合体的结合的序列即可。另外，“检测用粘附序列”被设定为具有与目标DNA区域或目标DNA区域附近结合的碱基序列，可以在后述的第四工序中形成检测复合体即可。另外，检测用粘附序列在后述的同一重复序列中(目标DNA区域中)可以设计一个，也可设计两个以上。设计两个以上时，多个检测用粘附序列与后述的特定粘附序列不相互抑制与单链甲基化DNA的结合即可。
第四工序是使由第三工序获得的被测DNA复合体与固定化甲基化DNA抗体结合而获得检测复合体的工序。
“固定化甲基化DNA抗体”是将以DNA中的被甲基化了的碱基作为抗原而结合的甲基化DNA抗体固定化到“支持体”后而得的。作为抗体，优选具有识别单链DNA中的5位被甲基化了的胞嘧啶并结合的性质的抗体即可，更优选为甲基胞嘧啶抗体。另外，即使为市售的甲基化DNA抗体，只要为可以特异性识别本说明书中记载的甲基化状态的DNA并特异性结合的抗体即可。
作为“支持体”只要是甲基化DNA抗体可以结合的支持体，对其材质和形状就没有限制。例如，形状适于使用目的即可，可以举出管状、试验板状、滤器状、盘状、珠状等。另外，作为材质，可以是通常的免疫测定法用支持体用的材料，例如可以是聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚砜、聚丙烯腈、尼龙等合成树脂，或向上述合成树脂中导入了磺基、氨基等反应性官能团得到的材料。另外，还可以是玻璃、多糖类或其衍生物(纤维素、硝基纤维素等)、硅胶、多孔性陶瓷、金属氧化物等。
“支持体”也可以为微粒，另外，微粒可以与支持体一样结合在检测寡核苷酸中。作为微粒，可列举如乳胶珠、金胶体(金纳米粒)等。
在支持体和检测寡核苷酸中，如果结合有相同种类的微粒，则作为支持体的微粒和与检测寡核苷酸结合的微粒同时结合到具有目标DNA区域的被甲基化了的DNA上，微粒之间有可能发生凝集。即是指，通过固定化甲基化DNA抗体、检测寡核苷酸、被甲基化了的单链DNA结合而形成检测复合体，作为支持体的微粒和与检测寡核苷酸结合的微粒成为凝集体。这时，如微粒为乳胶珠，则凝集体有可能通过浊度的变化而被检测。另外，如微粒为金胶体(金纳米粒)，则凝集体有可能通过色调变化(从粉色到紫色)而被检测。
当具有一个目标DNA区域的DNA上同时结合多个在支持体固定化了的甲基化DNA抗体时，通过将具有目标DNA区域的DNA上的多个甲基化DNA与固定化到微粒上的甲基化DNA抗体结合，可以检测微粒的凝集。例如，支持体为乳胶珠时，微粒的凝集体可以通过浊度的变化而被检出。另外，支持体为金胶体(金纳米粒)时，微粒的凝集体可以通过色调变化(从粉色到紫色)而被检出。另外，此时，即使不添加检测寡核苷酸而进行实施，也可以得到与添加检测寡核苷酸的情况相同的检测结果。
通过微粒的凝集体检测的量成为与直到第二工序的被甲基化了的DNA的总和相关的值。当第一工序中获得的DNA为组织中的细胞中含有的DNA时，由于组织中的细胞中含有的DNA的甲基化程度因组织的不同而不同，因此，在第二工序中所得的DNA的甲基化程度包括组织中的细胞中的甲基化程度，和第二工序被甲基化了的程度两者。即，第二工序中不实施DNA甲基化酶处理时通过微粒的凝集体检测的量成为与组织中的细胞中的甲基化程度相关的值。
“甲基化DNA抗体”是指以DNA中甲基化后的碱基为抗原而结合的抗体。具体可以举出甲基胞嘧啶抗体，可以举出具有识别单链DNA中的5位被甲基化后的胞嘧啶并结合的性质的抗体。只要是可以特异性识别本说明书中记载的甲基化状态的DNA并特异性结合的抗体，也可以利用市售的甲基化DNA抗体。甲基化DNA抗体可以将甲基化后的碱基、甲基化DNA等作为抗原并利用普通的方法作成。具体而言，为了作成甲基胞嘧啶抗体，通过从以5-甲基胞苷、5-甲基胞嘧啶、或含有5-甲基胞嘧啶的DNA等为抗原而制作的抗体中，以对DNA中的甲基胞嘧啶的特异结合为指标而选出。如果考虑该固定化甲基化DNA抗体的性质(在1个甲基化后的碱基(胞嘧啶)上结合1个抗体)，作为目标DNA区域，选出多个甲基化后的碱基(胞嘧啶)即CpG存在的区域，由此可以期待定量精度及检测灵敏度的提高。
作为使动物接触抗原而得到的抗体，有作为对动物施以抗原免疫而得到的、IgG部分的抗体(多克隆抗体)的方法、生产单克隆的抗体(单克隆抗体)等。本发明中优选能够特异性识别甲基化DNA、或甲基胞嘧啶的抗体，所以优选利用单克隆抗体。
作为制作单克隆抗体的方法，可以举出利用细胞融合法的方法。例如，细胞融合法通过使免疫后的小鼠来源的脾细胞(B细胞)和骨髓瘤细胞发生细胞融合而制作杂交瘤，选出杂交瘤生产的抗体，制作甲基胞嘧啶抗体(单克隆抗体)。在利用细胞融合法制作单克隆抗体的情况下，没有必要精制抗原，例如将5-甲基胞苷、5-甲基胞嘧啶、或含有5-甲基胞嘧啶的DNA等的混合物作为抗原，可以给用于免疫的动物使用。作为给药方法，将5-甲基胞苷、5-甲基胞嘧啶、或含有5-甲基胞嘧啶的DNA等直接对产生抗体的小鼠使用。在难以产生抗体的情况下，可以使抗原与支持体结合进行免疫。另外，通过将佐剂溶液(例如混合液体石蜡和Aracel A并混合结核菌的死菌作为佐剂得到的溶液)和抗原充分混合而使用，或将抗原掺入脂质体使其免疫，由此可以提高抗原的免疫性。或者，有等量添加含有抗原的溶液和佐剂溶液，充分成为乳液状之后，向小鼠的皮下或腹腔内注射的方法；在与明矾水充分混合之后，以百日咳死菌为佐剂并添加的方法。另外，也可以在经最初的免疫之后经过合适的期间后，对小鼠的腹腔内或静胍内追加免疫。另外，在抗原量少的情况下，可以将抗原悬浮的溶液直接注入小鼠脾脏进行免疫。自最终免疫起数日后摘除脾脏并剥离脂肪组织之后，制作脾细胞悬浮液。使该脾细胞和例如HGPRT缺失骨髓瘤细胞发生细胞融合而制作杂交瘤。作为细胞融合剂，只要是可以将脾细胞(B细胞)和骨髓瘤细胞有效融合的方法即可，例如可以举出使用仙台病毒(HVJ)、聚乙二醇(PEG)的方法等。另外，可以利用使用高电压脉冲的方法进行细胞融合。在细胞融合操作之后，用HAT培养基进行培养，选择脾细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂交瘤的克隆，等待细胞发育直到可以筛选。用于选择生产目标抗体的杂交瘤的抗体的检测法、抗体效价的测定法，可以利用抗原抗体反应体系。具体而言，在针对可溶性抗原的抗体测定法中，可以举出放射性同位素免疫定量法(RIA)、酶免疫定量法(ELISA)等。
如果在单链DNA中存在的CpG有至少一处被甲基化，则可以与抗甲基化抗体结合。因此，本发明的方法中的“甲基化后”是指在DNA中存在的CpG至少一处被甲基化的DNA，并非仅指在DNA中存在的CpG全部被甲基化的DNA。
第四工序中的“检测复合体”是指第三工序中获得的被测DNA复合体与固定化甲基化DNA抗体结合后的复合体。甲基化DNA抗体被作为固定化至支持体的抗体来使用，因此，甲基化DNA抗体可以最终以形成目标DNA区域中含有被甲基化了的DNA的单链DNA与检测寡核苷酸的被测DNA复合体的状态，固定化到支持体即可，
(1)可以是，在被测DNA复合体与甲基化DNA抗体结合前的阶段，甲基化DNA抗体被固定化到支持体，或者
(2)也可以是，在被测DNA复合体与甲基化DNA抗体结合后的阶段，甲基化DNA抗体被固定到支持体。
为了将甲基化DNA抗体固定到支持体，具体而言，可以例举将甲基化DNA抗体生物素化而得的生物素化甲基化DNA抗体固定在用抗生蛋白链菌素覆盖的支持体(例如，用抗生蛋白链菌素覆盖的PCR管、用抗生蛋白链菌素覆盖的磁珠、用抗生蛋白链菌素覆盖一部分的色谱条等)的方法。
另外，使甲基化DNA抗体与具有氨基、硫醇基、醛基等活性官能团的分子共价结合之后，使其与表面被硅烷偶联剂等活化后的玻璃、多糖类衍生物、硅胶、或上述合成树脂等、或耐热性塑料制的支持体共价结合的方法。另外，共价结合例如可以举出通过将5个甘油三酯串联连结而成的间隔区、交联剂等使甲基化DNA抗体与上述具有活性官能团的分子共价结合即可。另外甲基化DNA抗体也可以直接固定化到支持体，另外，可以将对甲基化DNA抗体的抗体(二次抗体)固定化到支持体，再使二次抗体与甲基化抗体结合，从而固定到支持体即可。
第四工序的“使被测DNA复合体与固定化甲基化DNA抗体结合而获得检测复合体”是指，使第三工序中获得的被测DNA复合体中所含的单链甲基化DNA与固定化甲基化DNA抗体相结合，从而固定化到支持体。例如，“在被测DNA复合体与甲基化DNA抗体的结合前的阶段，将甲基化DNA抗体固定化到支持体”时，具体可例如，作为可以固定化到支持体的甲基化DNA抗体，使用“被生物素标记了的生物素化甲基化DNA抗体”，标本来源的DNA试料为生物来源标本来源标本中所含基因组来源的DNA试料时，可以如下实施。
(a)将生物素化甲基化DNA抗体添加到适量(例如，4μg/mL溶液，100μL/孔)抗生物素蛋白覆盖板中，之后，在室温下静置例如约2小时，从而，促进生物素化甲基化DNA抗体与抗生物蛋白链菌素的固定化。之后，进行残留溶液的除去和清洗。以例如300μL/孔的比例，添加清洗缓冲液(例如，含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4))，除去溶液。将该清洗操作重复数次，在孔上残留固定化至支持体的生物素化甲基胞嘧啶抗体。
(b)标本来源的DNA试料是在生物来源标本来源标本中所含的基因组来源的DNA试料中，添加NEBuffer2(NEB公司制)5μL、S-腺苷甲硫氨酸(3.2mM，NEB公司制)0.5μl、胞嘧啶甲基化酶SssI(NEB公司制)各0.5μL，接着，向该混合物中添加灭菌超纯水使液量为50μL，再在37℃孵育30分钟之后，再混合使双链DNA分离而得的甲基化单链DNA、检测寡核苷酸和退火缓冲液(例如，33mM Tris-醋酸盐pH 7.9、66mM KOAc、10mM MgOAc2、0.5mM二硫苏糖醇)，在95℃加热例如数分钟。之后，为了形成含有目标DNA区域的单链DNA与检测寡核苷酸的结合体，迅速降低到比检测寡核苷酸的Tm值低约10～20℃的温度，在该温度下保温例如数分钟，之后返回至室温(在该阶段形成的结合体除了目标DNA区域中含有被甲基化了的DNA的甲基化单链DNA与检测寡核苷酸的结合体之外，还包括目标DNA区域中不含被甲基化了的DNA的单链DNA与检测寡核苷酸的结合体)。
(c)将形成的甲基化单链DNA与检测寡核苷酸的结合体添加到固定化有生物素化甲基化DNA抗体的抗生物素蛋白覆盖板，之后，在室温下静置3小时，促进生物素化甲基化DNA抗体、上述甲基化单链DNA中在目标DNA区域含有被甲基化了的DNA的甲基化单链DNA与检测寡核苷酸的复合体的形成(复合体的形成)(在该阶段，如果含有目标DNA区域的DNA试料没有被甲基化，则单链DNA与检测寡核苷酸的结合体没有形成与甲基化DNA抗体的复合体)。之后，进行残留溶液的除去及清洗。例如以300μL/孔的比例，添加清洗缓冲液(例如，含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4))，除去溶液。通过将该清洗操作重复数次，将复合体残留到孔上(复合体到分离)。
作为(b)中使用的退火缓冲液，只要是适于使检测寡核苷酸、含有目标DNA区域的甲基化单链DNA结合即可，不限于上述退火缓冲液。如果使用以1～600mM的浓度溶解有二价离子优选镁离子的溶液，即可以使结合的稳定性增加。
关于(a)及(c)中的清洗操作，是从反应溶液除去在溶液中悬浮的未被固定化的甲基化DNA抗体、没有与甲基化DNA抗体结合的在溶液中悬浮的未被甲基化的单链DNA、以及没有形成与检测寡核苷酸的结合体的目标DNA区域以外的甲基化单链DNA等，所以比较重要。另外，清洗缓冲液只要适于除去上述的游离的甲基化DNA抗体、在溶液中悬浮的甲基化单链DNA等即可，不限于上述清洗缓冲液，可以是DELFIA缓冲液(PerkinElmer公司制、Tris-HCl pH 7.8with Tween 80)、TE缓冲液等。
上述(a)～(c)中，将上述的目标DNA区域甲基化而得的甲基化单链DNA与检测寡核苷酸的结合后，使生物素化甲基化DNA抗体结合到生成的结合体，形成复合体，但不限于该顺序。即，可以是，使上述的含有目标DNA区域的甲基化单链DNA与生物素化甲基化DNA抗体结合后，再使生成的结合体与检测寡核苷酸结合，形成复合体。例如，向被固定化到用抗生蛋白链菌素覆盖的支持体的生物素化甲基化DNA抗体中，添加基因组来源的DNA试料、NEBuffer2(NEB公司制)5μL、S-腺苷甲硫氨酸(3.2mM，NEB公司制)0.5μl、胞嘧啶甲基化酶SssI(NEB公司制)各0.5μL，接着，向该混合物中添加灭菌超纯水使液量为50μL，在37℃孵育30分钟之后，添加从双链DNA分离而得的甲基化单链DNA，由此，形成被固定化至支持体的生物素化甲基化DNA抗体与该甲基化单链DNA的结合体(在该阶段形成的结合体除了在目标DNA区域中包括被甲基化了的DNA的甲基化单链DNA与甲基化抗体的结合体之外，还包括在目标DNA区域以外被甲基化了的甲基化单链DNA与甲基化抗体的结合体)。之后，向其中添加检测寡核苷酸，形成与上述结合体中具有在目标DNA区域含有被甲基化了的DNA的甲基化单链DNA的结合体的复合体，也可以分离(在该阶段，目标DNA区域以外区域中含有被甲基化了的DNA的甲基化单链DNA与甲基化抗体的结合体没有形成复合体)。
可以使用色谱条来进行上述(a)～(c)的操作。此时，具体如下实施。例如，首先，将适量的生物素化甲基化DNA抗体通过用抗生物蛋白链菌素覆盖一部分的色谱条展开。通过该操作，生物素化甲基化DNA抗体被固定化到用抗生物蛋白链菌素覆盖的部分。接着，将(b)所得的上述甲基化单链DNA与检测寡核苷酸的结合体(在该阶段形成的结合体，除了在目标DNA区域中含有被甲基化了的DNA的甲基化单链DNA与检测寡核苷酸的结合体之外，还包括目标DNA区域中不包括被甲基化了的DNA的单链DNA与检测寡核苷酸的结合体)用上述的色谱条展开。通过这些操作，添加基因组DNA来源的DNA试料、NEBuffer2(NEB公司制)5μL、S-腺苷甲硫氨酸(3.2mM，NEB公司制)0.5μl、胞嘧啶甲基化酶SssI(NEB公司制)各0.5μL，接着，向该混合物中添加灭菌超纯水使液量为50μL，在37℃中孵育30分钟后，含有将双链DNA分解而得到的甲基化单链DNA、检测寡核苷酸和生物素化甲基化DNA抗体的复合体被固定化到用抗生蛋白链菌素覆盖的部分(复合体的形成，向支持体的固定)(在该阶段，目标DNA区域中不含有被甲基化了的DNA的单链DNA与检测寡核苷酸的结合体没有形成复合体)。对于用于复合体形成的操作的顺序，不限于该操作的顺序。也可以是例如，形成含有目标DNA区域中包括被甲基化了的DNA的单链DNA、检测寡核苷酸和生物素化甲基化DNA抗体的复合体后，将其用色谱条展开，在用抗生蛋白链菌素覆盖的部分固化定该复合体。在这些操作中，利用色谱条将溶液展开可以将不需要的成分除去，因此可以省略清洗操作。也可以在各操作间实施清洗操作(利用清洗缓冲液(例如，含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)的色谱条的展开)。
第五工序是通过对第四工序所得的检测复合体中所含的检测寡核苷酸利用其识别功能进行定量或检测，而将上述单链DNA中的具有目标DNA区域的DNA定量或检测的工序。
在此所谓的“检测”是指通过检测寡核苷酸的识别功能，来判断直到第二工序的被甲基化的DNA的甲基化程度是否为一定程度以上。即，通常是指通过后述的识别功能而得到有意义的值。
另外，“定量”是指第五工序中所要求的利用识别功能检测的量的数值化。即，是指得到与第一工序获得的具有目标DNA区域的DNA与第二工序中通过DNA甲基化酶处理而被甲基化了的甲基化DNA的总和量相关的值。例如，作为后述的识别功能而对甲基化DNA抗体或该寡核苷酸的量进行定量的值是与标本中的目标DNA区域的DNA的量相关的值，例如标本为1mL的血清时，是指获得在血清1mL中所含的目标区域的DNA的、由第一工序获得的具有目标DNA区域的DNA和第二工序中通过DNA甲基化酶处理而被甲基化了的甲基化DNA的总量相关的值。
第五工序中的“识别功能”是可以对检测寡核苷酸检测或定量的功能。只要该识别功能是检测寡核苷酸所具有的功能即可，可列举如，基于检测寡核苷酸的标记的识别功能、通过与检测寡核苷酸结合的检测分子而向检测寡核苷酸赋予的识别功能。具体而言，可列举如对检测寡核苷酸完成了在其5’末端或3’末端的铕标记、金胶体标记、乳胶珠标记、放射性同位素标记、荧光物质(FITC等)标记、辣根过氧化物酶(HRP)标记、碱性磷酸酶标记等的检测寡核苷酸的荧光·发色等的特性。
为了铕的检测，添加促进溶液(Enhancement Solution)(PerkinElmer公司制)并进行混合，在室温下静置约45分钟后，用荧光检测器测定荧光(激发340nm/荧光612nm)即可。另外，检测寡核苷酸为甲基化寡核苷酸时，作为检测分子，具体而言，可列举如甲基化DNA抗体、锇络合物(J.Am.Chem.Soc.，2007；129：5612-5620)等。甲基化寡核苷酸是指，构成寡核苷酸的核苷酸的碱基的至少一个被甲基化的寡核苷酸，更具体而言，是指包含5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤等的寡核苷酸。进而，检测寡核苷酸被FITC标记时，作为检测分子可列举如FITC抗体。
当检测分子为甲基化DNA抗体时，只要是使抗体结合可以定量或检测的功能，就可以赋予抗体识别功能。但是，不能使用与固定化甲基化DNA抗体有基质交差性的甲基化DNA抗体。例如，固定化甲基化DNA抗体使用甲基胞嘧啶抗体时，不能使用可以与甲基胞嘧啶结合的甲基化DNA抗体。具体而言，有铕标记、金胶体标记、乳胶珠标记、放射性同位素标记、荧光物质(FITC等)标记、辣根过氧化物酶(HRP)标记、碱性磷酸酶标记、生物素标记等标记发生荧光·发色等的功能。另外，作为对作为这些检测分子的抗体赋予识别功能的方法，可列举如，可以使直接识别功能结合到作为检测分子的抗体，也可以使具有识别功能的二次抗体或三次抗体结合到作为检测分子的抗体。具体而言，荧光物质标记的抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体、碱性磷酸酶标记的抗体、生物素标记的抗体、铕标记的抗体是市售的，因此可以作为二次抗体或三次抗体使用。另外，也可以是结合了可以通过酶循环法检测的基质的抗体。作为这些功能的定量或检测方法，例如可列举如利用放射线检测器、分光光度计等仪器的测定，或肉眼观察等。例如，作为通过其识别功能检测或定量检测寡核苷酸的情况，具体而言当作为可以检测或定量的功能而使用附加了铕的二次抗体时，使检测复合体结合二次抗体后，添加混合促进溶液(PerkinElmer公司制)，在室温下静置约45分钟。之后用荧光检测器测定荧光(激发340nm/荧光612nm)即可。
当使检测寡核苷酸上的甲基化DNA与甲基化DNA抗体(与固定化甲基化DNA抗体具有不同的基质特异性的甲基化DNA抗体)结合，利用其功能进行检测或定量时，具体而言，例如当将抗体自身的特性作为功能使用时，可以进行如下的操作。使复合体与甲基化DNA抗体结合后，添加对甲基化DNA抗体的二次抗体(例如，Eu-N1标记小鼠IgG抗体：PerkinElmer公司制)，在室温下静置约1小时，促进二次抗体向复合体的结合。之后，添加促进溶液(PerkinElmer公司制)并进行混合，在室温下静置例如45分钟。之后，通过用荧光检测器测定荧光(激发340nm/荧光612nm)而进行检测或定量。
当将与检测寡核苷酸上的甲基化DNA结合的甲基化DNA抗体用FITC标记时，作为二次抗体也可以使用使FITC结合了的抗体。此时，也可以通过公知的方法，测定FITC的荧光，进行检测或定量，也可以将抗FITC抗体作为二次抗体来进行检测或定量。进而，使检测寡核苷酸直接结合FITC时，可以将FITC作为识别功能而利用，也可以通过辣根过氧化物酶(HRP)标记了的FITC抗体、碱性磷酸酶标记了的FITC抗体、生物素标记了的FITC抗体、铕标记了的FITC抗体等，赋予标记功能。具体而言，作为检测寡核苷酸，将FITC标记的寡核苷酸作为检测寡核苷酸使用时，向被固定化到包括该检测寡核苷酸的支持体的检测复合体中，添加辣根过氧化物酶(HRP)标记了的抗体(例如，HRP标记FITC抗体(Jackson Immuno Research Laboratories公司制)，在室温下静置约1小时～2小时，促进FITC抗体向检测复合体的结合。之后，清洗除去FITC抗体溶液，添加、混合合适的基质(例如，Substrate Reagent Pack #DY999：R&D SYSTEMS公司制)。在室温下静置约5～60分钟后，添加停止溶液(2N H2SO4水溶液)使辣根过氧化物酶(HRP)的反应停止，在反应停止后30分钟以内进行450nm的吸光度即可。
当甲基化DNA抗体的固定化中没有利用生物素时，可以将生物素化检测寡核苷酸用于检测或定量。检测或定量生物素化了的检测寡核苷酸时，例如，将HRP标记抗生物蛋白链菌素添加、混合到被固定化了的检测复合体中，形成生物素化检测寡核苷酸与HRP标记抗生物蛋白链菌素的结合体，并将其分离后，通过公知的方法测定HRP的活性，从而可以检测或定量生物素化甲基化DNA抗体。
作为识别功能，可以是利用在酶循环法等高灵敏度检测法中使用的基质等的识别功能。具体而言，将结合了在酶循环法中所用酶的抗体作为检测分子，使之与检测复合体结合即可，另外，本发明方法中作为赋予检测分子的识别功能不限于上述记载的方法。
“检测分子”只要具有检测或定量检测寡核苷酸的性质即可。另外，检测分子也可以是识别检测寡核苷酸的检测序列的检测分子，也可以事先与检测寡核苷酸结合。即，检测分子具有与检测寡核苷酸特异性结合的性质，并且具有作为在定量或检测中利用的功能·特性的“识别功能”，或者被赋予了识别功能而得到的分子。具体而言，当检测序列为甲基化寡核苷酸时，检测分子是可以与该甲基化寡核苷酸结合并检测该甲基化寡核苷酸的分子即可，是与该甲基化寡核苷酸特异性结合并显示识别功能的分子即可。(但是，不能使用与固定化甲基化DNA抗体有基质交差性的甲基化DNA抗体。例如，固定化甲基化DNA抗体使用甲基胞嘧啶抗体时，不能将甲基胞嘧啶抗体作为检测分子)。另外，例如检测分子也可以是甲基化DNA抗体。但是，不能使用与固定化甲基化DNA抗体有基质交差性的甲基化DNA抗体。例如，当固定化甲基化DNA抗体使用甲基胞嘧啶抗体时，不能利用甲基胞嘧啶抗体作为检测分子。另外，当检测序列为检测分子本身时，为了对检测寡核苷酸进行检测，也可以不添加新的检测分子，通过检测掺入到检测寡核苷酸的检测分子，可以进行该检测寡核苷酸的检测。
作为对血液、尿等生物体试样中所含的微量物质进行定量或检测的方法，广泛使用的是免疫学测定方法。在该方法当中，使用了色谱法的所谓免疫色谱法法操作简单，检验所需的时间也短，所以当前在大多数情况下广泛用于例如医院的临床检查、研究室的检验试验等。另外，近年来使用如下的所谓杂交色谱法，即，使标记过的DNA(基因)在色谱条上展开，使用能够捕捉目标DNA(基因)的探针进行杂交，由此检测出目标DNA(基因)。该方法也由于操作简便，检验所需的时间也短，所以当前在大多数情况下开始广泛用于例如医院的临床检查、研究室的检验试验等。本发明方法在概念上可以是混合了上述的免疫色谱法和杂交色谱法的方法。在本发明方法中，关于复合体的形成及复合体的获得，其顺序没有特别限定，可以为各种方法。具体而言，例如，如下所示加以实施即可。
方法1：向刚结束第二工序的试料中添加具有识别功能的检测寡核苷酸，使含有目标DNA区域的被甲基化了的单链DNA与具有识别功能的检测寡核苷酸形成结合体(在该阶段形成的结合体除了在目标DNA区域中包含被甲基化了的DNA的单链DNA与检测寡核苷酸的结合体之外，还包括在目标DNA区域不含被甲基化了的DNA的单链DNA与检测寡核苷酸的结合体)，接着，添加生物素化甲基化抗体，使在目标DNA区域含有被甲基化了的DNA的单链DNA、具有识别功能的检测寡核苷酸与生物素化甲基化DNA抗体结合而得的复合体形成。将所得的试料滴加(导入)到色谱条的导入部时，上述复合体通过毛细管现象在展开部移动，被预先用抗生蛋白链菌素覆盖的部分捕捉。随后，利用其识别功能对所得复合体中含有的检测寡核苷酸进行定量或检测，由此可以对具有目标DNA区域的DNA进行定量或检测。
方法2：向刚结束第二工序的试料中，添加生物素化甲基化DNA抗体，使具有被甲基化了的胞嘧啶的甲基化后的单链DNA(其中，存在包括目标DNA区域的单链DNA和目标之外的单链DNA)与生物素化甲基化DNA抗体的结合体形成(在该阶段形成的结合体除在目标DNA区域含有被甲基化了的DNA的单链DNA与甲基化抗体的结合体之外，还包括目标DNA区域以外的被甲基化了的单链DNA与甲基化抗体的结合体)。将所得的试料滴加(导入)到色谱条的导入部时，上述结合体通过毛细管现象在展开部移动，被预先用抗生蛋白链菌素覆盖的部分捕捉(在该阶段形成的结合体除了在目标DNA区域含有被甲基化了的DNA的单链DNA与甲基化抗体的结合体之外，还包括目标DNA区域以外的被甲基化了的单链DNA与甲基化抗体的结合体)。之后，将具有识别功能的检测寡核苷酸滴加(导入)到导入部时，在展开部移动，仅与结合体中包含目标DNA区域的被甲基化了的单链DNA相结合，形成在目标DNA区域含有被甲基化了的DNA的单链DNA、具有识别功能的检测寡核苷酸与生物素化甲基化DNA抗体结合而成的复合体。利用其识别功能对所得复合体中含有的检测寡核苷酸进行定量或检测，由此可以对具有目标DNA区域的DNA进行定量或检测。
方法3：在将生物素化甲基化DNA抗体滴加(导入)到色谱条的导入部时，上述甲基化DNA抗体通过毛细管现象在展开部移动，被预先用抗生蛋白链菌素覆盖的部分捕捉。接着，将刚结束第二工序的试料滴加(导入)到导入部时，在展开部移动，在已被捕捉的甲基化DNA抗体中，具有被甲基化了的胞嘧啶的单链DNA被捕捉作为结合体(在该阶段形成的结合体除了在目标DNA区域含有被甲基化了的DNA的单链DNA与甲基化抗体的结合体之外，还包括目标DNA区域以外的被甲基化了的单链DNA与甲基化抗体的结合体)。之后，将具有识别功能的检测寡核苷酸滴加(导入)到导入部，则在展开部移动，仅与结合体中含有目标DNA区域的被甲基化了的单链DNA相结合，形成在目标DNA区域含有被甲基化了的DNA的单链DNA、具有识别功能的检测寡核苷酸与生物素化甲基化DNA抗体结合而得的检测复合体。利用其识别功能对所得复合体中含有的检测寡核苷酸进行定量或检测，由此可以对具有目标DNA区域的DNA进行定量或检测。
方法4：将生物素化甲基化DNA抗体滴加(导入)到色谱条的导入部时，上述甲基化DNA抗体通过毛细管现象在展开部移动，被预先用抗生蛋白链菌素覆盖的部分捕捉。向刚结束第二工序的试料中添加具有识别功能的检测寡核苷酸，形成作为含有目标DNA区域的被甲基化了的单链DNA与具有识别功能的检测寡核苷酸的结合体的被测DNA复合体。接着，将所得的结合体滴加(导入)到导入部，则在展开部移动，结合体中仅仅是目标DNA区域含有被甲基化了的DNA的单链DNA结合到已经捕捉的甲基化DNA抗体，形成在目标DNA区域含有被甲基化了的DNA的单链DNA、具有识别功能的检测寡核苷酸与生物素化甲基化DNA抗体结合而成的检测复合体。利用其识别功能对所得复合体中含有的检测寡核苷酸进行定量或检测，由此可以对具有目标DNA区域的DNA进行定量或检测。
也可以使目标DNA区域中存在多个检测部位(使用可以与分别不同的目标DNA区域互补结合的检测寡核苷酸)，依次对各目标DNA区域进行检测或定量，另外，为了与多个目标DNA区域形成复合体，而使用可以同时检测基因组中的重复序列、重复基因或多个不同的基因的、可以与多个目标DNA区域互补结合的检测寡核苷酸，也可以使检测灵明度大幅提高。再者，即使在一个目标区域中，设计多个检测寡核苷酸，将其在支持体侧或检测侧使用，也可以使检测灵敏度显著提高。
作为实施形成检测寡核苷酸、生物素化甲基化抗体、目标DNA区域中被甲基化了的单链DNA的复合体，并使其结合到支持体的过程的方法，不限于上述的方法1～方法4，也可以为使用免疫抗体法的方法。例如，ELISA法中，由于使用了与色谱条法相同的原理，因此可以按照方法1～4中记载的顺序，实施形成复合体并使其结合到支持体的过程。
这些在本发明方法中可以使用的DNA甲基化酶、检测寡核苷酸或甲基化DNA抗体作为检测用试剂盒的试剂有用。本发明方法提供了含有这些DNA甲基化酶、特定寡核苷酸或甲基化DNA抗体等作为试剂的检测用试剂盒，也提供了将该寡核苷酸或甲基化DNA抗体等固定化到支持体上而成到检测用试剂盒，本发明方法的权利要求的范围也包括利用该方法的实质原理而成的以上述检测用试剂盒、检测用芯片的方式的使用。
通常在对活检样品、食品中是否含有病原性微生物进行检查的情况下，针对各微生物抗原进行基于免疫法的检查，由此来考察有无该病原性微生物，或鉴定该病原性微生物。但是，该免疫法中使用的抗体的制作并不容易，进而为了检测多个病原性微生物，有必要制作针对各病原性微生物的抗原的抗体。通过使用本发明方法，可以在不制作这些繁琐的抗体的情况下对病原性微生物实施简易检查。另外，在本发明方法中，可以同时检查不同的病原性微生物的碱基序列，可以同时检测出一个标本中所含的数种病原性微生物。具体而言，已知有单核细胞增生利斯特氏菌、肠沙门氏菌、空肠弯曲杆菌空肠亚种、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、蜡状芽孢杆菌、肉毒梭菌、结肠耶氏菌、假结核耶氏菌、产气荚膜梭菌等食物中的毒菌，尚不知晓同时检测其中的数种食物中毒菌的技术。但是，通过使用本发明方法，可以同时检测数种食物中毒菌的碱基序列。另外，作为检测对象的碱基序列，在通过特定寡核苷酸选择CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列：Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)区域那样在基因组中多见的碱基序列的情况下，能以比检测一个基因组中的一个基因更高的灵敏度检测出。这样的技术在感染症的诊断、食物中毒菌的迅速检测中也是有用的。另外，本发明方法也可以用于通过检测环境中的微生物的基因组进行产业上有用的菌的鉴定，土壤、河川、湖沼的沉积物等的微生物群的简易调查。可以确认环境中的微生物当中例如詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、嗜热碱甲烷杆菌deltaH(Methanobacterium thermoautotrophicum deltaH)、超嗜热菌(Aquifex aeolicus)、超嗜热古菌OT3(Pyrococcus horikoshii OT3)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、海栖热袍菌MSB8(Thermotoga maritime MSB8)、嗜热古菌K1(Aeropyrum pernix K1)、地中海富盐菌(Haloferax mediterranei)的生存。另外，还可以用于硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens)这样可以在工业上利用的细菌、唾液链球菌(Streptococcus thermophilus)这样可以用于发酵的微生物的检测、鉴定。
本发明方法中的目标DNA区域为微生物来源的碱基序列时，是指从标本中提取的基因组DNA或DNA断片、获知由从标本中提取的RNA利用逆转录酶形成DNA的碱基序列。因此作为可以与检测寡核苷酸互补结合的碱基序列，只要选择与该微生物特异的区域即可。例如，本发明中的目标DNA区域为微生物的碱基序列时，为了从标本中选择性提取目标DNA区域，将微生物基因组DNA、或由从标本中提取的RNA利用逆转录酶而得的DNA等的碱基序列中、位于目标DNA区域附近的微生物特有的碱基序列作为与特定寡核苷酸特异结合的碱基序列即可。
例如，作为用于检测微生物中的基因组的目标DNA区域和检测寡核苷酸互补结合的区域，具体而言，可以是与基因库检索号No.NC_001139等所示的酵母染色体VII的碱基编号271743-272083相当的区域(序列编号29)、像基因库检索号No.NC_001139等所示的酵母染色体VII的碱基编号384569-384685(序列编号34)那样不对基因进行编码的碱基序列。另外，以各种病原性微生物共同的特征基因的、在病原性微生物间保存的碱基序列为检测对象，可以提供同时检测多个病原性微生物的方法，因此是有用的。具体而言，mce-family基因(结核杆菌：Micobacterium tuber culosis)、13号染色体上的tRNA-Tyr碱基序列(新型隐球菌)、几丁质合成酶活化剂(Chs3)，是烟曲霉菌及新萨托菌(Neosartorya)属特有的碱基序列，所以可以用于通过检验在从人的痰、肺的活检样品中提取的DNA中是否含有这些微生物来源的DNA来检验微生物所致的感染症。另外，actA(单核细胞增生利斯特氏菌)、pyrG(NC_002163、空肠弯曲杆菌空肠亚种)是等食物中毒菌特有的共同的基因，这些基因可以用于检验食物中毒的微生物。另外，thrA具有肠沙门氏菌、结肠耶氏菌、大肠埃希氏菌中保存的序列，也可以通过一个基因对多个微生物进行检测。
可以检索数据库上公开的碱基序列当中微生物特有的碱基序列，探索微生物特有的碱基序列。例如，只要是在PubMed等公开数据库上的碱基序列，就可以通过常规的手续获得，所获得的碱基序列可以通过进行基于常规手续的Blast检索来研究是否是特有的碱基序列。需要说明的是，特有的碱基序列是指检测对象中的碱基序列不具有与成为检测对象的微生物的基因组碱基序列以外的生物来源的碱基序列示出同源性的碱基序列。
特别是在标本为人活检样品的情况下，重要的是设计不与人基因互补结合的特定寡核苷酸。另外，同样在标本是食品的情况下，重要的是设计不与食品中所含的检测对象以外的生物来源的碱基序列互补结合的特定寡核苷酸。
为了检测血液中的游离DNA，只要是与游离DNA的量相关的区域即可，在以游离DNA的定量或检测为目的的情况下，优选基因组中的相同序列特别重复数次以上的所谓重复序列，更优选简单重复序列(串联重复序列、或称为串联重复)、散在重复序列。
简单重复序列的特征在于，相同序列在相同方向上相邻存在，已知有卫星DNA、小卫星、微卫星、着丝粒、端粒、动粒、核糖体集团基因之类的一系列碱基序列等。
散在重复序列的特征在于，相同序列不相邻而散在，认为是反转录转座子来源的DNA。散在重复序列根据碱基序列的长度分类成SINE(Short Interspersed Repetitive Element：短链散在重复序列)和LINE(Long Interspersed Elements：长链散在重复序列)，作为人的碱基序列，Alu序列、LINE-1序列分别作为代表性的重复序列而被周知。另外，还已知有从RNA、蛋白质反转录的失活的加工后的假基因、通过基因重复而扩增的基因序列。
重复基因是指一个基因组上存在多个具有高同源性的基因的情况，在大多数情况下，是在一个基因附近串联排列而存在的碱基序列。需要说明的是，假基因也多是重复基因之一。
作为重复序列的具体例，例如，作为含有比较短的碱基序列的重复，已知有(A)n、(T)n、(GA)n、(CA)n、(TAA)n、(GGA)n、(CAGC)n、(CATA)n、(GAAA)n、(TATG)n、(TTTG)n、(TTTA)n、(TTTC)n、(TAAA)n、(TTCA)n、(TATAA)n、(TCTCC)n、(TTTCC)n、(TTTAA)n、(TTTTC)n、(TTTTA)n、(TTTTG)n、(CAAAA)n、(CACCC)n、(TATATG)n、(CATATA)n、(TCTCTG)n、(AGGGGG)n、(CCCCCA)n、(TGGGGG)n(n是指重复数量)等序列，作为转录因子来源的序列，hAT组可以举出MER1-Charlie、Zaphod，Tc-1组可以举出MER2-Tigger、Tc-1、Mariner。除此之外，具体还已知有Tigger1、Tigger2a、Tigger5、Charlie4a、Charlie7等。这些序列通常是短且简单的碱基序列，难以设定后述的特定粘附序列和检测用粘附序列，只要具有本发明方法中的、可以设定为后述的特定粘附序列及检测用粘附序列的设定对象的序列，就可以用于本发明的方法，并不需要作为本发明方法的对象而将其排除。另外，卫星DNA、小卫星、微卫星等是被分类为简单重复序列的重复序列
另外，作为基因中有多拷贝的序列，除了作为存在于着丝粒的序列的ALR6、作为snRNA的U2、U6、以及像tRNA、rRNA那样已知通常在基因组中有多拷贝的基因之外，还可以举出通过基因重复在基因组中有存在多拷贝的基因等。
再者，关于逆转录病毒、末端具有LTR(长末端重复序列：Lomg terminal repeat)的反转录转座子、MaLRs(哺乳类显性LTR-反转录转座子：Mammalian apparent LTR-Retrotransposons)之类的认为是病毒来源的内源序列、逆转录病毒来源的LTR，已知在一个基因组中存在多个。
例如，作为逆转录病毒来源的LTR，具体而言，已知有LTR1、LTR1B、LTR5、LTR7、LTR8、LTR16A1、LTR16A1、LTR16C、LTR26、LTR26E、MER48、MLT2CB等亚家族。另外，反转录转座子来源的LTR被分类成ERV、ERVK、ERVL的各种类，具体而言，可以举出LTR8A、LTR28、MER21B、MER83、MER31B、MER49、MER66B、HERVH、ERVL、LTR16A1、LTR33A、LTR50、LTR52、MLT2A1、MLT2E、MER11C、MER11C等亚家族。进而，MaLRs是指与典型的反转录转座子一样在其序列的两端含有LTR但夹在LTR之间的内部序列是非来源于逆转录病毒的序列的DNA因子。例如可以举出MLT1A1、MLT1A2、MLT1B、MLT1C、MLT1D、MLT1F、MLT1G、MLT1H、MLT1J、MLT1K、MLT1I、MLT2CB、MSTA、MSTA-int、MSTB、THE1A、THE1B、THE1B-internal、THE1等亚家族。
散在重复序列的特征在于，相同序列不相邻而是散在，认为来源于反转录转座子。另外，散在重复序列根据其长度被分类成SINE(Short Interspersed Repetitive Element：短链散在重复序列)和LINE(Long In terspersed Elements：长链散在重复序列)。SINE当中大部分是属于Alu家族的序列。作为特征，具有7SL RNA的3’侧的序列或5’侧的序列，且具有夹在称为左单体(Left-monomer)和右单体(Right-monomer)的区域之间AT-Rich区域。作为Alu家族的亚家族，可以举出Alu、AluJb、AluJo、AluSc、AluSg、AluSp、AluSq、AluSx、AluY，进而可以举出FAM(Fossil Alu Monomer)、具有FAM序列的FLAM(Free Left Alu Monomer)和FRAM(Free Right Alu Monomer)。作为Alu家族以外的SINE，已知有MIR、及Ther/MIR3，作为亚家族，已知有MIR、MIR3。除此之外，作为其他生物种的Alu家族的亚家族，已知有B1、B2、B4、PB1、PB1D等。作为LINE，报告有LINE1～Line23的亚家族，但已知LINE-1、LINE2、LINE3广泛存在于基因组。需要说明的是，关于LINE-1，例如已知有L1M1、L1M2、L1M3、L1M3d、L1M4、L1M4c、L1MA2、L1MA7、L1MA8、L1MA9、L1MB1、L1MB1、L1MB3、L1MB4、L1MB5、L1MB6、L1MB7、L1MCa、L1MCb、L1MC2、L1MC3、L1MC4、L1MC4a、L1MC5、L1MDa、L1ME、L1MEc、L1MEd、L1MEg、L1ME1、L1ME2、L1ME3、L1ME3A、L1ME3B、L1ME4a、L1PB3、L1P4、L1PA2、L1PA3、L1PA4、L1PA5、L1PA6、L1PA7、L1PA10、L1PA12、L1PA13、L1PA14、L1PA16、L1PB1、L1PB3、L1PB4、L1PREC2、HAL1的亚家族，作为LINE-2，已知有L2、L2c的亚家族。需要说明的是，例如，对于Alu家族或Alu的亚家族共同的序列、LINE-1家族或LINE-1的亚家族共同的序列，只要能够设定后述的特定粘附序列及检测用粘附序列，一个基因组中可以设定多个检测对象，所以可以使基因组的检测的灵敏度更高。
作为目标DNA区域，具体而言，例如可以举出LINE-1的部分序列(序列编号37)、Alu的部分序列(序列编号39所示的碱基序列)或与它们示出同源性的碱基序列等。
例如在想要对某区域中的重复序列进行调查时，难以在PubMed等通常的序列检索的数据库中进行检索，使用Repbase(http://www.girinst.org/repbase/)、RepeatMasker(http://www.repeatmasker.org/)等数据库即可。只要能够设定本发明方法的特定粘附序列和检测用粘附序列，就可以提高检测灵敏度。进而，对这些重复序列进行测定，例如可以作为血液中的游离DNA量的替代标志进行处理，在注意到生物种特异性的重复序列的情况下，可以用于生物种的确定等。
在本发明方法中，只要对重复序列进行测定，就可以同时测定一个基因组中存在的多个碱基序列。例如与序列编号37所示的碱基序列具有80％以上的序列一致性的碱基序列在人基因组中有约280拷贝；与序列编号39所示的碱基序列具有80％以上的同源性的碱基序列在人基因组中有约820拷贝。因此，只要可以在各碱基序列中设定检测用粘附序列和特定粘附序列，那么与在1个基因组中仅对一种序列设定检测用粘附序列和特定粘附序列的情况相比，理论上可以将1个基因组的检测灵敏度提高280～820倍。
“重复基因”是指通过基因重复使基因组中的特定基因或基因片段加倍而产生的基因或基因片段。基因重复是指含有基因的DNA的某区域重复的现象。作为发生基因重复的原因，有基因重组的异常、反转录转座子的转移、染色体全体的重复等。例如是指1个基因被复制而插入到基因组DNA，有向不同的染色体位置插入的情况和向原始基因的附近插入的情况。通过向原始基因附近的插入，将被拷贝的基因排列的场所称为串联重复，将通过基因重复作成的基因的组称为基因族(或基因家族)。
“假基因”是指具有DNA的序列当中假设已对基因产物(特别是蛋白质)进行编码之类的特征性的碱基序列但当前功能丧失的基因。认为会有具有原始功能的序列发生了突变的结果。例如，有通过突变而产生终止密码子从而蛋白质的肽链缩短而不能发挥作为蛋白质的功能的情况、通过一个碱基置换等突变使正常转录所需的调节序列丧失功能的情况等。假基因多是原始正常基因分开残留的情况，也有单独成为假基因的情况。
假基因可以根据基因序列的特征分成3类。有插入到通过反转录转座子的逆转录酶从mRNA作成的DNA基因组的情况(加工型假基因)、在基因组内原始基因序列发生重复且其拷贝当中的一部分因突变等而功能丧失成为假基因的情况(重复假基因或非加工型假基因)、及基因组内的基因会因(没有重复基因而是单基因情况)丧失功能而成为假基因的情况。
当前，在作为假基因而被周知的基因中，作为被转录的例子、具有基因功能的例子(是否应被称为假基因尚未确定)被周知，本发明方法中的“假基因”，并非指基因功能的有无或是否可以转录，而是指上述的“加工型假基因”和“重复假基因(非加工型假基因)”。
具有目标DNA区域的DNA为基因组中的重复序列时，重复序列为具有同源性的一群碱基序列，因此具有目标DNA区域的DNA与检测用粘附序列的互补碱基配对中，全部的碱基序列有可能不与具有目标DNA区域的DNA碱基配对。具体而言，作为LINE序列，对序列编号37具有80％以上同源性的碱基序列在基因组中为约280拷贝、作为SINE(Alu)序列，对序列编号39具有80％以上同源性的碱基序列在基因组中可见约820拷贝。但是，在这些基因组中可见的具有同源性的碱基序列相对于序列编号37及序列编号39含有一个碱基至数个碱基不同。
在本发明方法的第一工序中，优选通过存在高浓度钠盐的体系从标本提取DNA。具体而言，作为用于在本发明方法的第一工序中从标本中获得DNA的DNA提取操作所使用的溶液(例如缓冲液)中的钠盐浓度，至少为50mM以上，优选为100mM以上。更具体而言，为50mM以上1000mM以下，优选100mM以上1000mM以下，更优选100mM以上200mM以下。另外，只要是含有钠离子的盐，可以是含有NaCl、NaCO3、Na2SO4等的任意盐，优选NaCl。
本发明是选出癌症患者来源的标本的方法，包括如下的工序：通过发明1～13中任一项记载的方法对被检者来源的标本进行定量或检测得到的DNA的定量结果或检测结果、与利用相同方法对健康者来源的标本进行定量或检测得到的DNA的定量结果或检测结果之间的差异如有显著性意义，则将被检者来源的标本作为癌症患者来源的标本进行评价，根据该评价的结果来鉴定癌症患者来源的标本的工序。作为该发明的优选实施方式，可以举出标本是哺乳动物来源的血清的发明，另外还可以举出，具有目标DNA区域的DNA是哺乳动物来源的血清中的具有目标DNA区域的游离DNA的发明。只要利用这些发明，就可以通过血液检查简单确定癌症患者。
在这里，“癌症患者”是指癌症发病的被检者，作为癌，包括肺癌(非小细胞肺癌、小细胞肺癌)、食道癌、胃癌、十二指肠癌、大肠癌、直肠癌、肝癌(肝细胞癌、胆管细胞癌)、胆囊癌、胆管癌、胰癌、结肠癌、肛门癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、外阴癌、阴道癌、前列腺癌、肾癌、尿道癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、睾丸癌、上颌窦癌、舌癌、(鼻、口、下)咽癌、喉癌、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病、恶性淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、甲状腺癌、脑癌、骨肉瘤、皮肤癌(基底细胞癌、鳞状上皮细胞癌)等在人及哺乳类的脏器发生的实体癌和在人及哺乳类的血液发病的非实体癌的任意癌。
实施例
以下通过实施例更详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
使用市售生物素化试剂盒(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所制)，根据商品目录中记载的方法，将市售的甲基胞嘧啶抗体(Aviva Systems Biology公司制)生物素标记。使所得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体成为0.25μg/μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液而冷藏保存。
制备合成而得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体的0.5μg/mL0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液，将其以各100μL的比例添加到被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条(Perkin Elmer公司制)，在室温下放置约1小时，将其固定化至孔中。之后，用移液去除溶液，添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过倾析去除该缓冲液。将该操作再重复2次(以上，相当于本发明方法中使用的固定化甲基化DNA抗体的制备)。
对购自克隆技术(Clontech)公司的人血液来源基因组DNA，使用以下的序列编号17及序列编号18所示的为PCR而设计的寡核苷酸引物(PF1及PR1)和反应条件，进行PCR，从而将作为供试样品使用的DNA片断(X、序列编号19、相当于基因库检索号No.NT_029419等所示的碱基编号25687390-25687775的区域)扩增。
<为PCR而设计寡核苷酸引物>
PF1：5’-CTCAGCACCCAGGCGGCC-3’(序列编号17)
PR1：5’-CTGGCCAAACTGGAGATCGC-3’(序列编号18)
<DNA片断>
X：5’- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTG T C A TGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGT GA TG TC CCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTG
作为PCR的反应液，使用如下的反应液，即，混合成为模板的基因组DNA10ng、5μM的上述引物溶液各3μl、each 2mM dNTP 5μl、10×缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％明胶)5μl、耐热性DNA聚合酶(AmpliTaqGold)5U/μl 0.25μl，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl而得的反应液。将该反应液在95℃保温10分钟后，再以将95℃下30秒钟接着在61℃下30秒钟进而在72℃下45秒钟为1个循环的保温进行40个循环的条件下进行PCR。
之后，利用2％琼脂糖凝胶电泳确认扩增，通过Wizard SVGel/PCR Kit(PROMEGA公司)，精制DNA片断X。
关于DNA片段X，以下的溶液分别制备了双份。
溶液A：DNA片断X 10ng/10μL TE缓冲液
溶液B：DNA片断X 1ng/10μL TE缓冲液
溶液C：DNA片断X 0.1ng/10μL TE缓冲液
溶液D：TE缓冲液(阴性对照液)
将所得的各溶液10μL、SssI甲基化酶(NEB公司制)0.5μl、10x NEBuffer2(NEB公司制)5μl和3.2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0.5μl混合，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl而制备反应液。将该反应液在37℃孵育30分钟(以上，相当于本发明方法的第一工序)。
合成含有可以与含有序列编号20所示目标DNA区域的寡核苷酸X’互补性结合的序列编号21所示的碱基序列的5’末端FITC标记寡核苷酸F1，制备0.02μM的Tris-HCl缓冲液(10mM)溶液。
<含有目标DNA区域的寡核苷酸>
X’：5’-CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG-3’(序列编号20)
<5’末端FITC标记寡核苷酸>
F1：5’-CTGGCCAAACTGGAGAT-3’(序列编号21)
对所得到的各反应液，进行以下的处理。
向PCR管中添加上述制备的反应液40μL、上述的5’末端FITC标记寡核苷酸溶液10μL、缓冲液(330mM Tris-醋酸盐pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM二硫苏糖醇)10μL、100mM MgCl2溶液10μL和1mg/mL BSA溶液10μL，再向该混合物中添加灭菌超纯水，使液量为100μL，进行混合。之后，将该PCR管在95℃加热10分钟，迅速冷却至70℃并在该温度下保温10分钟。接着，冷却至50℃并保温10分钟，再于37℃保温10分钟后返回至室温，促进了5’末端FITC标记寡核苷酸与DNA片断的结合体的形成(以上，相当于本发明方法的第二工序)。
向固定化有上述生物素标记甲基胞嘧啶抗体的被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条中，添加上述制备的DNA片断的反应液100μL，在室温下放置1小时。之后，通过移液除去溶液，添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过移液除去该缓冲液。将该操作再重复两次(以上，相当于本发明方法的第三工序)。
之后，以100μL的比例向各孔中添加HRP标记FITC抗体溶液[Jacks on ImmunoResearch Laboratories公司制、0.005μg/100μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]后，在室温放置1小时。放置后，向各孔中添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过倾析除去该缓冲液。将该操作再重复2次。
向各孔中以100μL的比例添加、混合基质(R&D公司制、#DY999)，开始反应。在室温放置约15分钟，向各孔中以50μL的比例添加停止溶液(2N H2SO4水溶液)，停止反应。在反应停止后30分钟以内测定450nm的吸光度(以上，相当于本发明方法的第四工序)。将其结果示于图1。溶液A、溶液B及溶液C中，与溶液D相比，可见吸光度的增加。另外，其强度依赖于DNA片断的浓度而增加。在本实验中可知，形成、选择了甲基胞嘧啶抗体、被甲基化了的DNA片断与固定化了的5’末端生物素标记寡核苷酸的复合体，通过其功能对复合体中的FITC进行定量·检测，可以进行DNA片断的检测·定量。
实施例2
使用市售生物素化试剂盒(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所制)，按照商品目录中记载的方法，将市售的甲基胞嘧啶抗体(Aviva Systems Biology公司制)生物素标记。使所得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体成为0.25μg/μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液而冷藏保存。
制备合成而得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体的0.5μg/mL0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液，将其以各100μL的比例添加到被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条(Perkin Elmer公司制)，在室温下放置约1小时，将其固定化至孔中。之后，通过移液除去溶液，添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过倾析除去该缓冲液。将该操作再重复2次(以上，相当于本发明方法中使用的固定化甲基化DNA抗体的制备)。
对购自克隆技术(Clontech)公司的人血液来源基因组DNA，使用以下的序列编号17及序列编号18所示的为PCR而设计的寡核苷酸引物(PF1及PR1)和反应条件，进行PCR，从而将作为供试样品使用的DNA片断(X、序列编号19、相当于基因库检索号No.NT_029419等所示的碱基编号25687390-25687775的区域)扩增。
<为PCR而设计的寡核苷酸引物>
PF1：5’-CTCAGCACCCAGGCGGCC-3’(序列编号17)
PR1：5’-CTGGCCAAACTGGAGATCGC-3’(序列编号18)
<DNA片断>
X：5’-CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG-3’(序列编号19)
作为PCR的反应液，使用如下的反应液，即，混合成为模板的基因组DNA 10ng、5μM的上述引物溶液各3μl、each 2mM dNTP 5μl、10×缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％明胶)5μl和耐热性DNA聚合酶(AmpliTaqGold)5U/μl 0.25μl，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl而得的反应液。将该反应液在95℃保温10分钟后，再以将95℃下30秒钟接着在61℃下30秒钟进而在72℃下45秒钟为1个循环的保温进行40个循环的条件进行PCR。
进行PCR之后，利用2％琼脂糖凝胶电泳确认扩增，通过Wizard SVGel/PCR Kit(PROMEGA公司)，精制DNA片断X。
关于DNA片断X，制备以下的溶液。
溶液A：DNA片断X 10ng/10μL TE缓冲液
溶液B：DNA片断X 1ng/10μL TE缓冲液
溶液C：DNA片断X 0.1ng/10μL TE缓冲液
溶液D：TE缓冲液(阴性对照液)
另外，对购自克隆技术(Clontech)公司的人血液来源基因组DNA，使用以下的序列编号22及序列编号23所示的为PCR而设计的寡核苷酸引物(PF2及PR2)和反应条件，进行PCR，从而将作为供试样品使用的DNA片断(Y、序列编号24、与基因库检索号No.AC009800等所示的碱基编号76606-76726相当的区域)扩增。
<为PCR而设计的寡核苷酸引物>
PF2：5’-TGAGCTCCGTAGGGCGTCC-3’(序列编号22)
PR2：5’-GCGCCGGGTCCGGGCCC-3’(序列编号23)
<DNA片断>
Y：5’-GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA-3’(序列编号24)
作为PCR的反应液，使用如下的反应液，即，混合成为模板的基因组DNA 10ng、5μM的上述引物溶液各3μl、each 2mM dNTP 5μl、10×缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％明胶)5μl和耐热性DNA聚合酶(AmpliTaqGold)5U/μl 0.25μl，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl而得的反应液。将该反应液在95℃保温10分钟后，再以将95℃下30秒钟接着在60℃下30秒钟进而在72℃下45秒钟为1个循环的保温进行50个循环的条件下进行PCR。
进行PCR之后，利用2％琼脂糖凝胶电泳确认扩增，通过Wizard SVGel/PCR Kit(PROMEGA公司)，精制DNA片断Y。
关于DNA片断Y，制备以下的溶液。
溶液A：DNA片断Y 10ng/10μL TE缓冲液
溶液B：DNA片断Y 1ng/10μL TE缓冲液
溶液C：DNA片断Y 0.1ng/10μL TE缓冲液
溶液D：TE缓冲液(阴性对照液)
分别将上述制备的DNA片断X的溶液A与DNA片断Y的溶液A，DNA片断X的溶液B与DNA片断Y的溶液B，DNA片断X的溶液C与DNA片断Y的溶液C，DNA片断X的溶液D与DNA片断Y的溶液D混合，制备以下所示的DNA片断混合溶液MA～MD各两份。
溶液MA：10ng/20μL TE缓冲液
溶液MB：1ng/20μL TE缓冲液
溶液MC：0.1ng/20μL TE缓冲液
溶液MD：TE缓冲液(阴性对照液)
将所得的各溶液20μL、SssI甲基化酶(NEB公司制)0.5μl、10x NEBuffer2(NEB公司制)5μl和3.2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0.5μl混合，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl，制备反应液。将该反应液在37℃孵育30分钟(以上，相当于本发明方法的第一工序)。
合成含有可以与含有序列编号20所示目标DNA区域的寡核苷酸X’互补性结合的序列编号21所示的碱基序列的5’末端FITC标记寡核苷酸F1，制备0.02μM的Tris-HCl缓冲液(10mM)溶液。
<含有目标DNA区域的寡核苷酸>
X’：5’-CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG-3’(序列编号20)
<5’末端FITC标记寡核苷酸>
F1：5’-CTGGCCAAACTGGAGAT-3’(序列编号21)
对所得到的各反应液，进行以下的处理。
向PCR管中添加上述制备的反应液40μL、上述的5’末端FITC标记寡核苷酸溶液10μL、缓冲液(330mM Tris-醋酸盐pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM二硫苏糖醇)10μL、100mM MgCl2溶液10μL和1mg/mL BSA溶液10μL，再向该混合物中添加灭菌超纯水，使液量为100μL，进行混合。之后，将该PCR管在95℃加热10分钟，迅速冷却至70℃并在该温度下保温10分钟。接着，冷却至50℃并保温10分钟，再于37℃保温10分钟后返回至室温，促进了5’末端FITC标记寡核苷酸与DNA片断的结合体的形成(以上，相当于本发明方法的第二工序)。
向固定化有上述生物素标记甲基胞嘧啶抗体的被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条中，添加上述制备的DNA片断的反应液100μL，在室温下放置1小时。之后，通过移液除去溶液，添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过移液除去该缓冲液。将该操作再重复2次(以上，相当于本发明方法的第三工序)。
之后，向各孔中以100μL的比例，添加HRP标记FITC抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories公司制、0.005μg/100μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]后，在室温放置1小时。放置后，向各孔添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过倾析除去该缓冲液。将该操作再重复2次。
向各孔中以100μL的比例添加、混合基质(R&D公司制、#DY999)，开始反应。
在室温放置约30分钟，向各孔中以50μL的比例添加停止溶液(2N H2SO4水溶液)，停止反应。在反应停止后30分钟以内测定450nm的吸光度。(以上，相当于本发明方法的第四工序)
将其结果示于图2。溶液MA、溶液MB及溶液MC中，与溶液MD相比，可见吸光度的增加。另外其强度依赖于DNA片断的浓度而增加。
本实验中可知，形成、选择了甲基胞嘧啶抗体、被甲基化了的DNA片断和固定化的5’末端生物素标记寡核苷酸的复合体，通过其功能对复合体中的FITC进行定量、检测，可以进行DNA片断的检测·定量。
实施例3
使用市售生物素化试剂盒(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所制)，按照商品目录中记载的方法，将市售的甲基胞嘧啶抗体(Aviva Systems Biology公司制)生物素标记。使所得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体成为0.25μg/μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液而冷藏保存。
制备合成而得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体的0.5μg/mL0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液，将其以各100μL的比例添加到被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条(Perkin Elmer公司制)，在室温下放置约1小时，将其固定化至孔中。之后，通过移液除去溶液，添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过倾析除去该缓冲液。将该操作再重复2次(以上，相当于本发明方法中使用的固定化甲基化DNA抗体的制备)。
对购自克隆技术(Clontech)公司的人血液来源基因组DNA，使用以下的序列编号17及序列编号18所示的为PCR而设计的寡核苷酸引物(PF1及PR1)和反应条件进行PCR，从而将作为供试样品使用的DNA片断(X、序列编号19、相当于基因库检索号No.NT_029419等所示的碱基编号25687390-25687775的区域)扩增。
<为PCR而设计的寡核苷酸引物>
PF1：5’-CTCAGCACCCAGGCGGCC-3’(序列编号17)
PR1：5’-CTGGCCAAACTGGAGATCGC-3’(序列编号18)
<DNA片断>
X：5’-CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG-3’(序列编号19)
作为PCR的反应液，使用如下的反应液，即，混合成为模板的基因组DNA 10ng、5μM的上述引物溶液各3μl、each 2mM dNTP 5μl、10×缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％明胶)5μl和耐热性DNA聚合酶(AmpliTaqGold)5U/μl 0.25μl，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl而得的反应液。将该反应液在95℃保温10分钟后，再以将95℃下30秒钟接着在61℃下30秒钟进而在72℃下45秒钟为1个循环的保温进行40个循环的条件下进行PCR。
进行PCR之后，利用2％琼脂糖凝胶电泳确认扩增，通过Wizard SVGel/PCR Kit(PROMEGA公司)精制DNA片断X。
关于DNA片断X，制备以下的溶液。
溶液A：DNA片断X 10ng/10μL TE缓冲液
溶液B：DNA片断X 1ng/10μL TE缓冲液
溶液C：DNA片断X 0.1ng/10μL TE缓冲液
溶液D：TE缓冲液(阴性对照液)
另外，对购自克隆技术(Clontech)公司的人血液来源基因组DNA，使用以下的序列编号22及序列编号23所示的为PCR而设计的寡核苷酸引物(PF2及PR2)及反应条件进行PCR，从而将作为供试样品的DNA片断(Y、序列编号24、与基因库检索号No.AC009800等所示的碱基编号76606-76726相当的区域)扩增。
<为PCR而设计的寡核苷酸引物>
PF2：5’-TGAGCTCCGTAGGGCGTCC-3’(序列编号22)
PR2：5’-GCGCCGGGTCCGGGCCC-3’(序列编号23)
<DNA片断>
Y：5’-GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA-3’(序列编号24)
作为PCR的反应液，使用如下的反应液，即，混合成为模板的基因组DNA 10ng、5μM的上述引物溶液各3μl、each 2mM dNTP 5μl、10×缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％明胶)5μl和耐热性DNA聚合酶(AmpliTaqGold)5U/μl 0.25μl，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl而得的反应液。将该反应液在95℃保温10分钟后，再以将95℃下30秒钟接着在60℃下30秒钟进而在72℃下45秒钟为1个循环的保温进行50个循环的条件下进行PCR。
进行PCR后，利用2％琼脂糖凝胶电泳确认扩增，通过Wizard SVGel/PCR Kit(PROMEGA公司)精制DNA片断Y。
关于DNA片断Y，制备以下的溶液。
溶液A：DNA片断Y 10ng/10μL TE缓冲液
溶液B：DNA片断Y 1ng/10μL TE缓冲液
溶液C：DNA片断Y 0.1ng/10μL TE缓冲液
溶液D：TE缓冲液(阴性对照液)
分别将上述制备的DNA片断X的溶液A与DNA片断Y的溶液A，DNA片断X的溶液B与DNA片断Y的溶液B，DNA片断X的溶液C与DNA片断Y的溶液C，DNA片断X的溶液D与DNA片断Y的溶液D混合，制备以下所示的DNA片断混合溶液MA～MD各2份。
溶液MA：10ng/20μL TE缓冲液
溶液MB：1ng/20μL TE缓冲液
溶液MC：0.1ng/20μL TE缓冲液
溶液MD：TE缓冲液(阴性对照液)
将所得的各溶液20μL、SssI甲基化酶(NEB公司制)0.5μl、10x NEBuffer2(NEB公司制)5μl与3.2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0.5μl混合，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl，制备反应液。将该反应液在37℃孵育30分钟(以上，相当于本发明方法的第一工序)。
合成含有可以与含有序列编号25所示目标DNA区域的寡核苷酸Y’互补性结合的序列编号26所示的碱基序列的5’末端FITC标记寡核苷酸F2，制备0.02μM的Tris-HCl缓冲液(10mM)溶液。
<含有目标DNA区域的寡核苷酸>
Y’：5’-GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA-3’(序列编号25)
<5’末端FITC标记寡核苷酸>
F2：5’-GACAACGCCTCGTTCTCGG-3’(序列编号26)
对所得到的各反应液，进行以下的处理。
向PCR管中添加上述制备的反应液40μL、上述的5’末端FITC标记寡核苷酸溶液10μL、缓冲液(330mM Tris-醋酸盐pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM二硫苏糖醇)10μL、100mM MgCl2溶液10μL和1mg/mL BSA溶液10μL，再向该混合物中添加灭菌超纯水，使液量为100μL，进行混合。之后，将该PCR管在95℃加热10分钟，迅速冷却至70℃并在该温度下保温10分钟。接着，冷却至50℃并保温10分钟，再于37℃保温10分钟后返回至室温，促进了5’末端FITC标记寡核苷酸与DNA片断的结合体的形成(以上，相当于本发明方法的第二工序)。
向固定化有上述生物素标记甲基胞嘧啶抗体的被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条中，添加上述制备的DNA片断的反应液100μL，在室温下放置1小时。之后，通过移液除去溶液，添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过移液除去该缓冲液。将该操作再重复2次(以上，相当于本发明方法的第三工序)。
之后，向各孔中以100μL的比例添加HRP标记FITC抗体溶液[Jacks on ImmunoResearch Laboratories公司制、0.005μg/100μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]后，在室温放置1小时。放置后，向各孔中添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过倾析除去该缓冲液。将该操作再重复2次。
向各孔中以100μL的比例添加、混合基质(R&D公司制、#DY999)，开始反应。
在室温下放置约30分钟，向各孔中以50μL的比例添加停止溶液(2N H2SO4水溶液)，将反应停止。在反应停止后30分钟以内测定450nm的吸光度。(以上，相当于本发明方法的第四工序)
将结果示于图3。溶液MA及溶液MB中与溶液MD相比较，可见吸光度的增加。另外，其强度依赖于DNA片断的浓度而增加。
本实验中可知，形成、选择了甲基胞嘧啶抗体、被甲基化了的DNA片断和固定化的5’末端生物素标记寡核苷酸的复合体，通过其功能对复合体中的FITC进行定量·检测，可以进行DNA片断的检测·定量。
实施例4
使用市售生物素化试剂盒(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所制)，按照商品目录中记载的方法，将市售的甲基胞嘧啶抗体(Aviva Systems Biology公司制)生物素标记。将所得生物素标记甲基胞嘧啶抗体作为0.25μg/μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液而冷藏保存。
制备合成而得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体的0.5μg/mL0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液，将其以各100μL的比例添加到被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条(Perkin Elmer公司制)，在室温下放置约1小时，将其固定化至孔中。之后，通过移液除去溶液，添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过倾析除去该缓冲液。将该操作再重复2次(以上，相当于本发明方法中使用的固定化甲基化DNA抗体的制备)。
对购自克隆技术(Clontech)公司的人血液来源基因组DNA，使用以下的序列编号17及序列编号18所示的为PCR而设计的寡核苷酸引物(PF1及PR1)和反应条件，进行PCR，从而将作为供试样品使用的DNA片断(X、序列编号19、相当于基因库检索号No.NT_029419等所示的碱基编号25687390-25687775的区域)扩增。
<为PCR而设计的寡核苷酸引物>
PF1：5’-CTCAGCACCCAGGCGGCC-3’(序列编号17)
PR1：5’-CTGGCCAAACTGGAGATCGC-3’(序列编号18)
<DNA片断>
X：5’-CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG-3’(序列编号19)
作为PCR的反应液，使用如下的反应液，即，混合成为模板的基因组DNA 10ng、5μM的上述引物溶液各3μl、each 2mM dNTP 5μl、10×缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％明胶)5μl和耐热性DNA聚合酶(AmpliTaqGold)5U/μl 0.25μl，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl而得的反应液。将该反应液在95℃保温10分钟后，再以将95℃下30秒钟接着在61℃下30秒钟进而在72℃下45秒钟为1个循环的保温进行40个循环的条件进行PCR。
进行PCR后，利用2％琼脂糖凝胶电泳确认扩增，通过Wizard SVGel/PCR Kit(PROMEGA公司)精制DNA片断X。
关于DNA片断X，制备以下的溶液。
溶液A：DNA片断X 10ng/10μL TE缓冲液
溶液B：DNA片断X 1ng/10μL TE缓冲液
溶液C：DNA片断X 0.1ng/10μL TE缓冲液
溶液D：TE缓冲液(阴性对照液)
另外，对购自克隆技术(Clontech)公司的人血液来源基因组DNA，使用以下的序列编号22及序列编号23所示的为PCR而设计的寡核苷酸引物(PF2及PR2)和反应条件进行PCR，从而将作为供试样品使用的DNA片断(Y、序列编号24、与基因库检索号No.AC009800等所示的碱基编号76606-76726相当的区域)扩增。
<为PCR而设计的寡核苷酸引物>
PF2：5’-TGAGCTCCGTAGGGCGTCC-3’(序列编号22)
PR2：5’-GCGCCGGGTCCGGGCCC-3’(序列编号23)
<DNA片断>
Y：5’-GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA-3’(序列编号24)
作为PCR的反应液，使用如下的反应液，即，混合成为模板的基因组DNA 10ng、5μM的上述引物溶液各3μl、each 2mM dNTP 5μl、10×缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％明胶)5μl和耐热性DNA聚合酶(AmpliTaqGold)5U/μl 0.25μl，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl而成的反应液。将该反应液在95℃保温10分钟后，再以将95℃下30秒钟接着在60℃下30秒钟进而在72℃下45秒钟为1个循环的保温进行50个循环的条件下进行PCR。
进行PCR之后，利用2％琼脂糖凝胶电泳确认扩增，通过Wizard SVGel/PCR Kit(PROMEGA公司)精制DNA片断Y。
关于DNA片断Y，制备以下的溶液。
溶液A：DNA片断Y 10ng/10μL TE缓冲液
溶液B：DNA片断Y 1ng/10μL TE缓冲液
溶液C：DNA片断Y 0.1ng/10μL TE缓冲液
溶液D：TE缓冲液(阴性对照液)
分别将上述制备的DNA片断X的溶液A与DNA片断Y的溶液A，DNA片断X的溶液B与DNA片断Y的溶液B，DNA片断X的溶液C与DNA片断Y的溶液C、DNA片断X的溶液D与DNA片断Y的溶液D混合，制备以下所示的DNA片断混合溶液MA～MD各两份。
溶液MA：10ng/20μL TE缓冲液
溶液MB：1ng/20μL TE缓冲液
溶液MC：0.1ng/20μL TE缓冲液
溶液MD：TE缓冲液(阴性对照液)
将所得的各溶液10μL、SssI甲基化酶(NEB公司制)0.5μl、10x NEBuffer2(NEB公司制)5μl和3.2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0.5μl混合，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl，制备反应液。将该反应液在37℃孵育30分钟(以上，相当于本发明方法的第一工序)。
合成含有可以与含有序列编号20所示的目标DNA区域的寡核苷酸X’互补性结合的序列编号21所示的碱基序列的5’末端FITC标记寡核苷酸F1，另外，合成含有可以与含有序列编号25所示的目标DNA区域的寡核苷酸Y’互补性结合的序列编号26所示的碱基序列的5’末端FITC标记寡核苷酸F2，制备各浓度为0.02μM的Tris-HCl缓冲液(10mM)溶液。
<含有目标DNA区域的寡核苷酸>
X’：5’-CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG-3’(序列编号20)
Y’：5’-GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA-3’(序列编号25)
<5’末端FITC标记寡核苷酸>
F1：5’-CTGGCCAAACTGGAGAT-3’(序列编号21)
F2：5’-GACAACGCCTCGTTCTCGG-3’(序列编号26)
对所得到的各反应液，进行以下的处理。
向PCR管中，添加上述制备的反应液40μL、上述的5’末端FITC标记寡核苷酸溶液10μL、缓冲液(330mM Tris-醋酸盐pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM二硫苏糖醇)10μL、100mM MgCl2溶液10μL和1mg/mL BSA溶液10μL，再向该混合物中添加灭菌超纯水，使液量为100μL，进行混合。之后，将该PCR管在95℃加热10分钟，迅速冷却至70℃并在该温度下保温10分钟。接着，冷却至50℃并保温10分钟，再于37℃保温10分钟后返回至室温，促进了5’末端FITC标记寡核苷酸与DNA片断的结合体的形成(以上，相当于本发明方法的第二工序)。
向固定化有上述生物素标记甲基胞嘧啶抗体的被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条中，添加上述制备的DNA片断的反应液100μL，在室温下放置1小时。之后，通过移液除去溶液，添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过移液除去该缓冲液。将该操作再重复2次(以上，相当于本发明方法的第三工序)。
之后，向各孔以100μL的比例添加HRP标记FITC抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories公司制、0.005μg/100μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]后，在室温放置1小时。放置后，向各孔添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过倾析除去该缓冲液。将该操作再重复2次。
向各孔中以100μL的比例添加、混合基质(R&D公司制、#DY999)，开始反应。
在室温下放置约30分钟，向各孔中以50μL的比例添加停止溶液(2N H2SO4水溶液)，停止反应。在反应停止后30分钟以内测定450nm的吸光度。(以上，相当于本发明方法的第四工序)
将其结果示于图4。在溶液MA、溶液MB及溶液MC中，与溶液MD相比，可见吸光度的增加。另外，其强度依赖于DNA片断的浓度而增加。
本实验中可知，形成、选择了甲基胞嘧啶抗体、被甲基化了的DNA片断和固定化的5’末端生物素标记寡核苷酸的复合体，通过其功能对复合体中的FITC进行定量·检测，可以进行DNA片断的检测·定量。
实施例5
使用市售生物素化试剂盒(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所制)，按照商品目录中记载的方法，将市售的甲基胞嘧啶抗体(Aviva Systems Biology公司制)生物素标记。使所得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体成为0.25μg/μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液而冷藏保存。
制备合成而得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体的0.5μg/mL0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液，将其以各100μL的比例添加到被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条(Perkin Elmer公司制)，在室温下放置约1小时，将其固定化至孔中。之后，通过移液除去溶液，添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过倾析除去该缓冲液。将该操作再重复2次(以上，相当于本发明方法中使用的固定化甲基化DNA抗体的制备)。
用YPD培养基(1％酵母提取物、2％胨、2％葡萄糖，pH 5.6-6.0)培养面包酵母酵母株X2180-1A，直到浊度为OD600 0.6-1.0，以10000×g离心10分钟，制备1x 107的酵母细胞。使用Methods in Yeast Genetics(酵母遗传学方法)(冷泉港实验室)中记载的常规的酵母基因组的制备法，从所制备的酵母细胞获得酵母基因组。
使所制备的酵母细胞在缓冲液A(1M山梨醇、0.1M EDTA、pH 7.4)中悬浮，添加0.1％2-巯基乙醇(终浓度14mM)及100U消解酶(10mg/ml)，30℃下边搅拌边孵育1小时直至溶液透明。以550xg离心10分钟，回收原生质体后，使其在缓冲液B(50mM Tris-HCl、pH 7.4、20mM EDTA)中悬浮，之后添加十二烷基硫酸钠并使其为1％(w/v)，然后在65℃下孵育30分钟。接着，添加体积比2/5量的5M CH3COOK，进行混合，30分钟冰冷后，以15000xg离心30分钟，回收上清。向所回收的上清中添加体积比1/10量的3M CH3COONa和等量的异丙醇，充分混合，以15000xg在4℃下离心30分钟得到沉淀，用70％乙醇冲洗所得到的沉淀并进行回收。使沉淀干燥，然后溶解于1ml的TE缓冲液(10mM Tris-HCl、pH 8.0、1mM EDTA)，添加RNase A(Sigma公司制)并使其为40μg/ml，在37℃下孵育1小时，接着，向混合液添加蛋白酶K(Sigma公司制)使其为500μg/ml，添加十二烷基硫酸钠使其为1％(w/v)后，在55℃下将其振荡约16小时。在振荡结束后，对该混合物进行苯酚[用1M Tris-HCl(pH 8.0)饱和]/氯仿提取处理。回收水层，向其中添加NaCl并使其为0.5N，然后对其进行乙醇沉淀处理，回收所生成的沉淀。用70％乙醇冲洗所回收的沉淀，由此得到了基因组DNA。
使用以下的序列编号27及序列编号28所示的为PCR而设计的寡核苷酸引物(PF3及PR3)和反应条件，进行PCR，由此从得到的酵母基因组DNA扩增作为供试样品使用的DNA片断(S、序列编号29、与基因库检索号No.NC_001139等所示酵母染色体VII的碱基编号271743-272083相当的区域)。
<为PCR而设计的寡核苷酸引物>
PF3：5’-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3’(序列编号27)
PR3：5’-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3’(序列编号28)
<DNA片断>
S：5’-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3’(序列编号29)
作为PCR的反应液，使用如下的反应液，即，混合成为模板的基因组DNA 10ng、5μM的上述引物溶液各3μl、each 2mM dNTP 5μl、10×缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％明胶)5μl和耐热性DNA聚合酶(AmpliTaqGold)5U/μl 0.25μl，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl而得的反应液。将该反应液在95℃保温10分钟后，再以将95℃下20秒钟接着在58℃下30秒钟进而在72℃下30秒钟为1个循环的保温进行40个循环的条件下进行PCR。
进行PCR后，利用2％琼脂糖凝胶电泳确认扩增，通过Wizard SVGel/PCR Kit(PROMEGA公司)精制DNA片断S。
关于DNA片断S，分别制备以下溶液各两份。
溶液A：DNA片断S 10ng/20μL TE缓冲液
溶液B：DNA片断S 1ng/20μL TE缓冲液
溶液C：DNA片断S 0.1ng/20μL TE缓冲液
溶液D：TE缓冲液(阴性对照液)
将所得的各溶液20μL、SssI甲基化酶(NEB公司制)0.5μl、10x NEBuffer2(NEB公司制)5μl和3.2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0.5μl混合，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl，制备反应液。将该反应液在37℃孵育30分钟(以上，相当于本发明方法的第一工序)。
合成含有可以与含有序列编号30所示的目标DNA区域的寡核苷酸S’互补性结合的序列编号31所示的碱基序列的5’末端FITC标记寡核苷酸F3，制备0.02μM的Tris-HCl缓冲液(10mM)。
<含有目标DNA区域的寡核苷酸>
S’：5’-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3’(序列编号30)
<5’末端FITC标记寡核苷酸>
F3：5’-CTGGCCAAACTGGAGAT-3’(序列编号31)
对所得到的各反应液，进行以下的处理。
向PCR管中，添加上述制备的反应液40μL、上述的5’末端FITC标记寡核苷酸溶液10μL、缓冲液(330mM Tris-醋酸盐pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM二硫苏糖醇)10μL、100mM MgCl2溶液10μL和1mg/mL BSA溶液10μL，再向该混合物中添加灭菌超纯水，使液量为100μL，进行混合。之后，将该PCR管在95℃加热10分钟，迅速冷却至70℃并在该温度下保温10分钟。接着，冷却至50℃并保温10分钟，再于37℃保温10分钟后返回至室温，促进了5’末端FITC标记寡核苷酸与DNA片断的结合体的形成(以上，相当于本发明方法的第二工序)。
向固定化有上述生物素标记甲基胞嘧啶抗体的被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条中，添加上述制备的DNA片断的反应液100μL，在室温下放置1小时。之后，通过移液除去溶液，添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过移液除去该缓冲液。将该操作再重复2次(以上，相当于本发明方法的第三工序)。
之后，向各孔中以100μL的比例添加HRP标记FITC抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories公司制、0.005μg/100μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]后，在室温放置1小时。放置后，向各孔添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过倾析除去该缓冲液。将该操作再重复2次。
向各孔中以100μL的比例添加、混合基质(R&D公司制、#DY999)，开始反应。
在室温下放置约30分钟，向各孔中以50μL的比例添加停止溶液(2N H2SO4水溶液)，停止反应。在反应停止后30分钟以内测定450nm的吸光度。(以上，相当于本发明方法的第四工序)
将其结果示于图5。溶液A、溶液B及溶液C中，与溶液D相比，可见吸光度的增加。另外，其强度依赖于DNA片断的浓度而增加。
本实验中可知，形成、选择了甲基胞嘧啶抗体、被甲基化了的DNA片断和固定化的5’末端生物素标记寡核苷酸的复合体，通过其功能对复合体中的FITC进行定量·检测，可以进行DNA片断的检测·定量。
实施例6
使用市售生物素化试剂盒(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所制)，按照商品目录中记载的方法，将市售的甲基胞嘧啶抗体(Aviva Systems Biology公司制)生物素标记。使所得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体成为0.25μg/μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液而冷藏保存。
制备合成而得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体的0.5μg/mL0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液，将其以各100μL的比例添加到被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条(Perkin Elmer公司制)，在室温下放置约1小时，将其固定化至孔中。之后，通过移液除去溶液，添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过倾析除去该缓冲液。将该操作再重复2次(以上，相当于本发明方法中使用的固定化甲基化DNA抗体的制备)。
用YPD培养基(1％酵母提取物、2％胨、2％葡萄糖，pH 5.6-6.0)培养面包酵母株X2180-1A，直到浊度为OD600 0.6-1.0，以10000×g离心10分钟，制备1x107的酵母细胞。使用Methods in Yeast Genetics(酵母遗传学方法)(冷泉港实验室)中记载的常规的酵母基因组的制备法，从所制备的酵母细胞获得酵母基因组。
使所制备的酵母细胞在缓冲液A(1M山梨醇、0.1M EDTA、pH 7.4)中悬浮，添加0.1％2-巯基乙醇(终浓度14mM)及100U消解酶(10mg/ml)，30℃下边搅拌边孵育1小时直至溶液透明。以550xg离心10分钟，回收原生质体后，使其在缓冲液B(50mM Tris-HCl、pH 7.4、20mM EDTA)中悬浮，之后添加十二烷基硫酸钠并使其为1％(w/v)，然后在65℃下孵育30分钟。接着，添加体积比2/5量的5M CH3COOK，进行混合，30分钟冰冷后，以15000xg离心30分钟，回收上清。向所回收的上清中添加体积比1/10量的3M CH3COONa和等量的异丙醇，充分混合，以15000xg在4℃下离心30分钟得到沉淀，用70％乙醇冲洗所得到的沉淀并进行回收。使沉淀干燥，然后溶解于1ml的TE缓冲液(10mM Tris-HCl、pH8.0、1mM EDTA)，添加RNase A(Sigma公司制)并使其为40μg/ml，在37℃下孵育1小时，接着，向混合液添加蛋白酶K(Sigma公司制)使其为500μg/ml，添加十二烷基硫酸钠使其为1％(w/v)后，在55℃下将其振荡约16小时。在振荡结束后，对该混合物进行苯酚[用1M Tris-HCl(pH 8.0)饱和]/氯仿提取处理。回收水层，向其中添加NaCl并使其为0.5N，然后对其进行乙醇沉淀处理，回收所生成的沉淀。用70％乙醇冲洗所回收的沉淀，由此得到了基因组DNA。
使用以下的序列编号27及序列编号28所示的为PCR而设计的寡核苷酸引物(PF3及PR3)和反应条件，进行PCR，由此从得到的酵母基因组DNA扩增作为供试样品使用的DNA片断(S、序列编号29、与基因库检索号No.NC_001139等所示酵母染色体VII的碱基编号271743-272083相当的区域)。
<为PCR而设计的寡核苷酸引物>
PF3：5’-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3’(序列编号27)
PR3：5’-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3’(序列编号28)
<DNA片断>
S：5’-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3’(序列编号29)
作为PCR的反应液，使用如下的反应液，即，混合成为模板的基因组DNA 10ng、5μM的上述引物溶液各3μl、each 2mM dNTP 5μl、10×缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％明胶)5μl和耐热性DNA聚合酶(AmpliTaqGold)5U/μl 0.25μl，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl而得的反应液。将该反应液在95℃保温10分钟后，再以将95℃下20秒钟接着在58℃下30秒钟进而在72℃下30秒钟为1个循环的保温进行40个循环的条件下进行PCR。
进行PCR后，利用2％琼脂糖凝胶电泳确认扩增，通过Wizard SVGel/PCR Kit(PROMEGA公司)精制DNA片断S。
关于DNA片断S，制备以下的溶液。
溶液A：DNA片断S 10ng/10μL TE缓冲液
溶液B：DNA片断S 1ng/10μL TE缓冲液
溶液C：TE缓冲液(阴性对照液)
另外，使用以下的序列编号32及序列编号33所示的为PCR而设计的寡核苷酸引物(PF4及PR4)和反应条件，进行PCR，由此从得到的酵母基因组DNA扩增作为供试样品使用的DNA片断(T、序列编号34、与基因库检索号No.NC_001139等所示的酵母染色体VII的碱基编号384569-384685相当的区域)。
<为PCR而设计的寡核苷酸引物>
PF4：5’-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3’(序列编号32)
PR4：5’-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3’(序列编号33)
<DNA片断>
T：5’-GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3’(序列编号34)
作为PCR的反应液，使用如下的反应液，即，混合成为模板的基因组DNA 10ng、5μM的上述引物溶液各3μl、each 2mM dNTP 5μl、10×缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％明胶)5μl和耐热性DNA聚合酶(AmpliTaqGold)5U/μl 0.25μl，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl而得的反应液。将该反应液在95℃保温10分钟后，再以将95℃下20秒钟接着在58℃下30秒钟进而在72℃下30秒钟为1个循环的保温进行40个循环的条件下进行PCR。
进行PCR后，利用2％琼脂糖凝胶电泳确认扩增，通过Wizard SVGel/PCR Kit(PROMEGA公司)精制DNA片断T。
关于DNA片断T，制备以下的溶液。
溶液A：DNA片断T 10ng/10μL TE缓冲液
溶液B：DNA片断T 1ng/10μL TE缓冲液
溶液C：TE缓冲液(阴性对照液)
分别将上述制备的DNA片断S的溶液A与DNA片断T的溶液A，DNA片断S的溶液B与DNA片断T的溶液B、DNA片断S的溶液C与DNA片断T的溶液C混合，制备以下所示的DNA片断混合溶液MA～MC各两份。
溶液MA：10ng/20μL TE缓冲液
溶液MB：1ng/20μL TE缓冲液
溶液MC：TE缓冲液(阴性对照液)
将所得的各溶液20μL、SssI甲基化酶(NEB公司制)0.5μl、10x NEBuffer2(NEB公司制)5μl和3.2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0.5μl混合，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl，制备反应液。将该反应液在37℃孵育30分钟(以上，相当于本发明方法的第一工序)。
合成含有可以与含有序列编号30所示的目标DNA区域的寡核苷酸S’互补性结合的序列编号31所示的碱基序列的5’末端FITC标记寡核苷酸F3，制备0.02μM的Tris-HCl缓冲液(10mM)溶液。
<含有目标DNA区域的寡核苷酸>
S’：5’-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3’(序列编号30)
<5’末端FITC标记寡核苷酸>
F3：5’-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3’(序列编号31)
对所得到的各反应液，进行以下的处理。
向PCR管中，添加上述制备的反应液40μL、上述的5’末端FITC标记寡核苷酸溶液10μL、缓冲液(330mM Tris-醋酸盐pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM二硫苏糖醇)10μL、100mM MgCl2溶液10μL和1mg/mL BSA溶液10μL，再向该混合物中添加灭菌超纯水，使液量为100μL，进行混合。之后，将该PCR管在95℃加热10分钟，迅速冷却至70℃并在该温度下保温10分钟。接着，冷却至50℃并保温10分钟，再于37℃保温10分钟后返回至室温，促进了5’末端FITC标记寡核苷酸与DNA片断的结合体的形成(以上，相当于本发明方法的第二工序)。
向固定化有上述生物素标记甲基胞嘧啶抗体的被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条中，添加上述制备的DNA片断的反应液100μL，在室温下放置1小时。之后，通过移液除去溶液，添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过移液除去该缓冲液。将该操作再重复2次(以上，相当于本发明方法的第三工序)。
之后，向各孔中以100μL的比例添加HRP标记FITC抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories公司制、0.005μg/100μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]后，在室温放置1小时。放置后，向各孔添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过倾析除去该缓冲液。将该操作再重复2次。
向各孔中以100μL的比例添加、混合基质(R&D公司制、#DY999)，开始反应。
在室温下放置约60分钟，向各孔中以50μL的比例，添加停止溶液(2N H2SO4水溶液)，停止反应。在反应停止后30分钟以内测定450nm的吸光度。(以上，相当于本发明方法的第四工序)
将结果示于图6。溶液MA及溶液MB中，与溶液MC相比，可见吸光度的增加。另外，其强度依赖于DNA片断的浓度而增加。
本实验中可知，形成、选择了甲基胞嘧啶抗体、被甲基化了的DNA片断和固定化的5’末端生物素标记寡核苷酸的复合体，通过其功能对复合体中的FITC进行定量·检测，可以进行DNA片断的检测·定量。
实施例7
使用市售生物素化试剂盒(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所制)，按照商品目录中记载的方法，将市售的甲基胞嘧啶抗体(Aviva Systems Biology公司制)生物素标记。使所得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体成为0.25μg/μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液而冷藏保存。
制备合成而得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体的0.5μg/mL0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液，将其以各100μL的比例添加到被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条(Perkin Elmer公司制)，在室温下放置约1小时，将其固定化至孔中。之后，通过移液除去溶液，添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过倾析除去该缓冲液。将该操作再重复2次(以上，相当于本发明方法中使用的固定化甲基化DNA抗体的制备)。
用YPD培养基(1％酵母提取物、2％胨、2％葡萄糖，pH 5.6-6.0)培养面包酵母株X2180-1A，直到浊度为OD600 0.6-1.0，以10000×g离心10分钟，制备1x107的酵母细胞。使用Methods in Yeast Genetics(酵母遗传学方法)(冷泉港实验室)中记载的常规的酵母基因组的制备法，从所制备的酵母细胞获得酵母基因组。
使所制备的酵母细胞在缓冲液A(1M山梨醇、0.1M EDTA、pH 7.4)中悬浮，添加0.1％2-巯基乙醇(终浓度14mM)及100U消解酶(10mg/ml)，30℃下边搅拌边孵育1小时直至溶液透明。以550xg离心10分钟，回收原生质体后，使其在缓冲液B(50mM Tris-HCl、pH 7.4、20mM EDTA)中悬浮，之后添加十二烷基硫酸钠并使其为1％(w/v)，然后在65℃下孵育30分钟。接着，添加体积比2/5量的5M CH3COOK，进行混合，30分钟冰冷后，以15000xg离心30分钟，回收上清。向所回收的上清中添加体积比1/10量的3M CH3COONa和等量的异丙醇，充分混合，以15000xg在4℃下离心30分钟得到沉淀，用70％乙醇冲洗所得到的沉淀并进行回收。使沉淀干燥，然后溶解于1ml的TE缓冲液(10mM Tris-HCl、pH8.0、1mM EDTA)，添加RNase A(Sigma公司制)并使其为40μg/ml，在37℃下孵育1小时，接着，向混合液添加蛋白酶K(Sigma公司制)使其为500μg/ml，添加十二烷基硫酸钠使其为1％(w/v)后，在55℃下将其振荡约16小时。在振荡结束后，对该混合物进行苯酚[用1M Tris-HCl(pH 8.0)饱和]/氯仿提取处理。回收水层，向其中添加NaCl并使其为0.5N，然后对其进行乙醇沉淀处理，回收所生成的沉淀。用70％乙醇冲洗所回收的沉淀，由此得到了基因组DNA。
使用以下的序列编号27及序列编号28所示的为PCR而设计的寡核苷酸引物(PF3及PR3)和反应条件，进行PCR，由此从所得的酵母基因组DNA扩增作为供试样品使用的DNA片断(S、序列编号29、与基因库检索号No.NC_001139等所示酵母染色体VII的碱基编号271743-272083相当的区域)。
<为PCR而设计的寡核苷酸引物>
PF3：5’-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3’(序列编号27)
PR3：5’-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3’(序列编号28)
<DNA片断>
S：5’-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3’(序列编号29)
作为PCR的反应液，使用如下的反应液，即，混合成为模板的基因组DNA 10ng、5μM的上述引物溶液各3μl、each 2mM dNTP 5μl、10×缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％明胶)5μl和耐热性DNA聚合酶(AmpliTaqGold)5U/μl 0.25μl，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl而得的反应液。将该反应液在95℃保温10分钟后，再以将95℃下20秒钟接着在58℃下30秒钟进而在72℃下30秒钟为1个循环的保温进行40个循环的条件下进行PCR。
进行PCR后，利用2％琼脂糖凝胶电泳确认扩增，通过Wizard SVGel/PCR Kit(PROMEGA公司)精制DNA片断S。
关于DNA片断S，制备以下的溶液。
溶液A：DNA片断S 10ng/10μL TE缓冲液
溶液B：DNA片断S 1ng/10μL TE缓冲液
溶液C：TE缓冲液(阴性对照液)
另外，使用以下的序列编号32及序列编号33所示的为PCR而设计的寡核苷酸引物(PF4及PR4)和反应条件，进行PCR，由此从所得的酵母基因组DNA扩增作为供试样品使用的DNA片断(T、序列编号34、与基因库检索号No.NC_001139等所示的酵母染色体VII的碱基编号384569-384685相当的区域)。
<为PCR而设计的寡核苷酸引物>
PF4：5’-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3’(序列编号32)
PR4：5’-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3’(序列编号33)
<DNA片断>
T：5’-GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3’(序列编号34)
作为PCR的反应液，使用如下的反应液，即，混合成为模板的基因组DNA 10ng、5μM的上述引物溶液各3μl、each 2mM dNTP 5μl、10×缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％明胶)5μl和耐热性DNA聚合酶(AmpliTaqGold)5U/μl 0.25μl，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl而得的反应液。将该反应液在95℃保温10分钟后，再以将95℃下20秒钟接着在58℃下30秒钟进而在72℃下30秒钟为1个循环的保温进行40个循环的条件下进行PCR。
进行PCR后，利用2％琼脂糖凝胶电泳确认扩增，通过Wizard SVGel/PCR Kit(PROMEGA公司)精制DNA片断T。
关于DNA片断T，制备以下的溶液。
溶液A：DNA片断T 10ng/10μL TE缓冲液
溶液B：DNA片断T 1ng/10μL TE缓冲液
溶液C：TE缓冲液(阴性对照液)
分别将上述制备的DNA片断S的溶液A与DNA片断T的溶液A，DNA片断S的溶液B和DNA片断T的溶液B，DNA片断S的溶液C和DNA片断T的溶液C混合，制备以下所示DNA片断混合溶液MA～MC各两份。
溶液MA：10ng/20μL TE缓冲液
溶液MB：1ng/20μL TE缓冲液
溶液MC：TE缓冲液(阴性对照液)
将所得的各溶液20μL、SssI甲基化酶(NEB公司制)0.5μl、10x NEBuffer2(NEB公司制)5μl和3.2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0.5μl混合，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl，制备反应液。将该反应液在37℃孵育30分钟(以上，相当于本发明方法的第一工序)。
合成含有可以与含有序列编号30所示的目标DNA区域的寡核苷酸S’互补性结合的序列编号31所示的碱基序列的5’末端FITC标记寡核苷酸F3，另外，合成含有可以与含有序列编号35所示的目标DNA区域的寡核苷酸T’互补性结合的序列编号36所示的碱基序列的5’末端FITC标记寡核苷酸F4，制备各浓度为0.02μM的Tris-HCl缓冲液(10mM)溶液。
<含有目标DNA区域的寡核苷酸>
S’：5’-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3’(序列编号30)
T’：5’-GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3’(序列编号35)
<5’末端FITC标记寡核苷酸>
F3：5’-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3’(序列编号31)
F4：5’-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3’(序列编号36)
对所得到的各反应液，进行以下的处理。
向PCR管中，添加上述制备的反应液40μL、上述的5’末端FITC标记寡核苷酸溶液10μL、缓冲液(330mM Tris-醋酸盐pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM二硫苏糖醇)10μL、100mM MgCl2溶液10μL和1mg/mL BSA溶液10μL，再向该混合物中添加灭菌超纯水，使液量为100μL，进行混合。之后，将该PCR管在95℃加热10分钟，迅速冷却至70℃并在该温度下保温10分钟。接着，冷却至50℃并保温10分钟，再于37℃保温10分钟后返回至室温，促进了5’末端FITC标记寡核苷酸与DNA片断的结合体的形成(以上，相当于本发明方法的第二工序)。
向固定化有上述生物素标记甲基胞嘧啶抗体的被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条中，添加上述制备的DNA片断的反应液100μL，在室温下放置1小时。之后，通过移液除去溶液，添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过移液除去该缓冲液。将该操作再重复2次(以上，相当于本发明方法的第三工序)。
之后，向各孔中，以100μL的比例添加HRP标记FITC抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories公司制、0.005μg/100μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]后，在室温放置1小时。放置后，向各孔中添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过倾析除去该缓冲液。将该操作再重复2次。
向各孔中以100μL的比例添加、混合基质(R&D公司制、#DY999)，开始反应。
在室温下放置约60分钟，向各孔中以50μL的比例，添加停止溶液(2N H2SO4水溶液)，停止反应。在反应停止后30分钟以内测定450nm的吸光度。(以上，相当于本发明方法的第四工序)
将其结果示于图7。溶液MA及溶液MB中，与溶液MC相比，可见吸光度的增加。另外，其强度依赖于DNA片断的浓度而增加。
本实验中可知，形成、选择了甲基胞嘧啶抗体、被甲基化了的DNA片断和固定化的5’末端生物素标记寡核苷酸的复合体，通过其功能对复合体中的FITC进行定量·检测，可以进行DNA片断的检测·定量。
实施例8
使用市售生物素化试剂盒(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所制)，按照商品目录中记载的方法，将市售的甲基胞嘧啶抗体(Aviva Systems Biology公司制)生物素标记。使所得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体成为0.25μg/μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液而冷藏保存。
制备合成而得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体的0.5μg/mL0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液，将其以各100μL的比例添加到被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条(Perkin Elmer公司制)，在室温下放置约1小时，将其固定化至孔中。之后，通过移液除去溶液，添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过倾析除去该缓冲液。将该操作再重复2次(以上，相当于本发明方法中使用的固定化甲基化DNA抗体的制备)。
对购自克隆技术(Clontech)公司的人血液来源基因组DNA，制备如下的溶液各两份。
溶液A：人血液来源基因组DNA 100ng/5μL TE缓冲液
溶液B：人血液来源基因组DNA 10ng/5μL TE缓冲液
溶液C：人血液来源基因组DNA 1ng/5μL TE缓冲液
溶液D：TE缓冲液(阴性对照液)
将上述制备的各溶液5μL、限制性酶X spI 10U、对X spI最适的10x缓冲液(200mM Tris-HCl pH 8.5、100mM MgCl2、10mM二硫苏糖醇、1000mM KCl)2μl混合，向其中添加灭菌超纯水使液量为20μl，制备反应液。将该反应液在37℃孵育1小时。
将得到的各反应液20μL、SssI甲基化酶(NEB公司制)0.5μl、10x NEBuffer2(NEB公司制)5μl和3.2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0.5μl混合，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl，制备反应液。将该反应液在37℃孵育30分钟(以上，相当于本发明方法的第一工序)。
合成含有可以与含有在作为人转座子而周知的LINE1区域设计的序列编号37所示的目标DNA区域的寡核苷酸Z(与基因库检索号No.M80340等所示的碱基编号115-386相当的区域)互补性结合的序列编号38所示的碱基序列的5’末端FITC标记寡核苷酸F5，制备0.02μM的Tris-HCl缓冲液(10mM)溶液。
<含有目标DNA区域的寡核苷酸>
Z：5’-TAGGGAGTGCCAGACAGTGGGCGCAGGCCAGTGTGTGTGCGCACCGTGCGCGAGCCGAAGCAGGGCGAGGCATTGCCTCACCTGGGAAGCGCAAGGGGTCAGGGAGTTCCCTTTCTGAGTCAAAGAAAGGGGTGACGGTCGCACCTGGAAAATCGGGTCACTCCCACCCGAATATTGCGCTTTTCAGACCGGCTTAAGAAACGGCGCACCACGAGACTATATCCCACACCTGGCTCGGAGGGTCCTACGCCCACGGAATCTCGCTGATTGC-3’(序列编号37)
<5’末端FITC标记寡核苷酸>
F5：5’-CTGGCCAAACTGGAGAT-3’(序列编号38)
对所得到的各反应液，进行以下的处理。
向PCR管中，添加上述制备的反应液40μL、上述的5’末端FITC标记寡核苷酸溶液10μL、缓冲液(330mM Tris-醋酸盐pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM二硫苏糖醇)10μL、100mM MgCl2溶液10μL和1mg/mL BSA溶液10μL，再向该混合物中添加灭菌超纯水，使液量为100μL，进行混合。之后，将该PCR管在95℃加热10分钟，迅速冷却至70℃并在该温度下保温10分钟。接着，冷却至50℃并保温10分钟，再于37℃保温10分钟后返回至室温，促进了5’末端FITC标记寡核苷酸与DNA片断的结合体的形成(以上，相当于本发明方法的第二工序)。
向固定化有上述生物素标记甲基胞嘧啶抗体的被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条中，添加上述制备的DNA片断的反应液100μL，在室温下放置1小时。之后，通过移液除去溶液，添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过移液除去该缓冲液。将该操作再重复2次(以上，相当于本发明方法的第三工序)。
之后，向各孔中以100μL的比例，添加HRP标记FITC抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories公司制、0.005μg/100μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]后，在室温放置1小时。放置后，向各孔中添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过倾析除去该缓冲液。将该操作再重复2次。
向各孔中以100μL的比例添加、混合基质(R&D公司制、#DY999)，开始反应。
在室温下放置约10分钟，向各孔中，以50μL的比例添加停止溶液(2N H2SO4水溶液)，停止反应。在反应停止后30分钟以内测定450nm的吸光度(以上，相当于本发明方法的第四工序)。
将其结果示于图8。溶液A、溶液B及溶液C中，与溶液D相比，可见吸光度的增加。另外，其强度依赖基因组DNA的浓度而增加。
本实验中可见，形成、选择了甲基胞嘧啶抗体、被甲基化了的DNA片断和固定化的5’末端生物素标记寡核苷酸的复合体，通过其功能对复合体中的FITC进行定量·检测，可以进行DNA片断的检测·定量，可以进行基因组DNA的检测·定量。
实施例9
使用市售生物素化试剂盒(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所制)，按照商品目录中记载的方法，将市售的甲基胞嘧啶抗体(Aviva Systems Biology公司制)生物素标记。使所得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体成为0.25μg/μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液而冷藏保存。
制备合成而得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体的0.5μg/mL0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液，将其以各100μL的比例添加到被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条(Perkin Elmer公司制)，在室温下放置约1小时，将其固定化至孔中。之后，通过移液除去溶液，添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过倾析除去该缓冲液。将该操作再重复2次(以上，相当于本发明方法中使用的固定化甲基化DNA抗体的制备)。
对购自克隆技术(Clontech)公司的人血液来源基因组DNA，制备以下的溶液各两份。
溶液A：人血液来源基因组DNA 100ng/5μL TE缓冲液
溶液B：人血液来源基因组DNA 10ng/5μL TE缓冲液
溶液C：人血液来源基因组DNA 1ng/5μL TE缓冲液
溶液D：TE缓冲液(阴性对照液)
将上述制备的各溶液5μL、限制性酶MspI 4U、对MspI最适的10x缓冲液(100mM Tris-HCl pH 7.5、100mM MgCl2、10mM二硫苏糖醇、500mM NaCl)2μl混合，向其中添加灭菌超纯水使液量为20μl，制备反应液。将该反应液在37℃孵育1小时。
将所得的各反应液20μL、SssI甲基化酶(NEB公司制)0.5μl、10x NEBuffer2(NEB公司制)5μl和3.2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0.5μl混合，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl，制备反应液。将该反应液在37℃孵育30分钟(以上，相当于本发明方法的第一工序)。
合成含有可以与含有在作为人转座子周知的Alu区域设计的序列编号39所示目标DNA区域的寡核苷酸W(与基因库检索号No.AF458110等所示的碱基编号178-262相当的区域)互补性结合的序列编号40所示的碱基序列的5’末端FITC标记寡核苷酸F6，制备0.02μM的Tris-HCl缓冲液(10mM)溶液。
<含有目标DNA区域的寡核苷酸>
W：5’-CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCC-3’(序列编号39)
<5’末端FITC标记寡核苷酸>
F6：5’-GGATGGTCTCGATCTCCTGAC-3’(序列编号40)
对所得到的各反应液，进行以下的处理。
向PCR管，添加上述制备的反应液40μL、上述的5’末端FITC标记寡核苷酸溶液10μL、缓冲液(330mM Tris-醋酸盐pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM二硫苏糖醇)10μL、100mM MgCl2溶液10μL和1mg/mL BSA溶液10μL，再向该混合物中添加灭菌超纯水，使液量为100μL，进行混合。之后，将该PCR管在95℃加热10分钟，迅速冷却至70℃并在该温度下保温10分钟。接着，冷却至50℃并保温10分钟，再于37℃保温10分钟后返回至室温，促进了5’末端FITC标记寡核苷酸与DNA片断的结合体的形成(以上，相当于本发明方法的第二工序)。
向固定化有上述生物素标记甲基胞嘧啶抗体的被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条中，添加上述制备的DNA片断的反应液100μL，在室温下放置1小时。之后，通过移液除去溶液，添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过移液除去该缓冲液。将该操作再重复2次(以上，相当于本发明方法的第三工序)。
之后，向各孔中以100μL的比例，添加HRP标记FITC抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories公司制、0.005μg/100μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]后，在室温放置1小时。放置后，向各孔添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过倾析除去该缓冲液。将该操作再重复2次。
向各孔中以100μL的比例添加、混合基质(R&D公司制、#DY999)，开始反应。
在室温下放置约8分钟，向各孔中以50μL的比例添加停止溶液(2N H2SO4水溶液)，停止反应。在反应停止后30分钟以内测定450nm的吸光度。(以上，相当于本发明方法的第四工序)
将其结果示于图9。溶液A、溶液B及溶液C中，与溶液D相比，可见吸光度的增加。另外，其强度依赖基因组DNA的浓度而增加。
本实验中可知，形成、选择了甲基胞嘧啶抗体、被甲基化了的DNA片断和固定化的5’末端生物素标记寡核苷酸的复合体，通过其功能对复合体中的FITC进行定量·检测，可以进行DNA片断的检测·定量，可以进行基因组DNA的检测·定量。
实施例10
使用市售生物素化试剂盒(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所制)，按照商品目录中记载的方法，将市售的甲基胞嘧啶抗体(Aviva Systems Biology公司制)生物素标记。使所得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体成为0.25μg/μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液而冷藏保存。
制备合成而得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体的0.5μg/mL0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液，将其以各100μL的比例添加到被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条(Perkin Elmer公司制)，在室温下放置约1小时，将其固定化至孔中。之后，通过移液除去溶液，添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过倾析除去该缓冲液。将该操作再重复2次(以上，相当于本发明方法中使用的固定化甲基化DNA抗体的制备)。
用YPD培养基(1％酵母提取物、2％胨、2％葡萄糖，pH 5.6-6.0)培养面包酵母酵母株X2180-1A，直到浊度为OD600 0.6-1.0，以10000×g离心10分钟，制备1x107的酵母细胞。使用Methods in Yeast Genetics(酵母遗传学方法)(冷泉港实验室)中记载的常规的酵母基因组的制备法，从所制备的酵母细胞获得酵母基因组。
使所制备的酵母细胞在缓冲液A(1M山梨醇、0.1M EDTA、pH 7.4)中悬浮，添加0.1％2-巯基乙醇(终浓度14mM)及100U消解酶(10mg/ml)，30℃下边搅拌边孵育1小时直至溶液透明。以550xg离心10分钟，回收原生质体后，使其在缓冲液B(50mM Tris-HCl、pH 7.4、20mM EDTA)中悬浮，之后添加十二烷基硫酸钠并使其为1％(w/v)，然后在65℃下孵育30分钟。接着，添加体积比2/5量的5M CH3COOK，进行混合，30分钟冰冷后，以15000xg离心30分钟，回收上清。向所回收的上清中添加体积比1/10量的3M CH3COONa和等量的异丙醇，充分混合，以15000xg在4℃下离心30分钟得到沉淀，用70％乙醇冲洗所得到的沉淀并进行回收。使沉淀干燥，然后溶解于1ml的TE缓冲液(10mM Tris-HCl、pH8.0、1mM EDTA)，添加RNase A(Sigma公司制)并使其为40μg/ml，在37℃下孵育1小时，接着，向混合液添加蛋白酶K(Sigma公司制)使其为500μg/ml，添加十二烷基硫酸钠使其为1％(w/v)后，在55℃下将其振荡约16小时。在振荡结束后，对该混合物进行苯酚[用1M Tris-HCl(pH 8.0)饱和]/氯仿提取处理。回收水层，向其中添加NaCl并使其为0.5N，然后对其进行乙醇沉淀处理，回收所生成的沉淀。用70％乙醇冲洗所回收的沉淀，由此得到了基因组DNA。
使用以下的序列编号27及序列编号28所示的为PCR而设计的寡核苷酸引物(PF3及PR3)和反应条件，进行PCR，由此从得到的酵母基因组DNA扩增作为供试样品使用的DNA片断(S、序列编号29、与基因库检索号No.NC_001139等所示酵母染色体VII的碱基编号271743-272083相当的区域)。
<为PCR而设计的寡核苷酸引物>
PF3：5’-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3’(序列编号27)
PR3：5’-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3’(序列编号28)
<DNA片断>
S：5’-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3’(序列编号29)
作为PCR的反应液，使用以下的反应液，即，混合成为模板的基因组DNA 10ng、5μM的上述引物溶液各3μl、each 2mM dNTP 5μl、10×缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％明胶)5μl和耐热性DNA聚合酶(AmpliTaqGold)5U/μl 0.25μl，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl而得的反应液。将该反应液在95℃保温10分钟后，再以将95℃下20秒钟接着在58℃下30秒钟进而在72℃下30秒钟为1个循环的保温进行40个循环的条件下进行PCR。
进行PCR后，利用2％琼脂糖凝胶电泳确认扩增，通过Wizard SVGel/PCR Kit(PROMEGA公司)精制DNA片断S。
关于DNA片断S，分别制备以下溶液各两份。
溶液A：DNA片断S 10ng/20μL TE缓冲液
溶液B：DNA片断S 1ng/20μL TE缓冲液
溶液C：DNA片断S 0.1ng/20μL TE缓冲液
溶液D：TE缓冲液(阴性对照液)
将所得的各溶液20μL、SssI甲基化酶(NEB公司制)0.5μl、10x NEBuffer2(NEB公司制)5μl、3.2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0.5μl混合，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl，制备反应液。将该反应液在37℃孵育30分钟(以上，相当于本发明方法的第一工序)。
合成含有可以与含有序列编号30所示目标DNA区域的寡核苷酸S’互补性结合的序列编号31所示的碱基序列的5’末端FITC标记寡核苷酸F3，制备0.02μM的Tris-HCl缓冲液(10mM)。
<含有目标DNA区域的寡核苷酸>
S’：5’-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3’(序列编号30)
<5’末端FITC标记寡核苷酸>
F3：5’-CTGGCCAAACTGGAGAT-3’(序列编号31)
另外，合成含有可以与含有序列编号30所示目标DNA区域的寡核苷酸S’的负链互补性结合的、序列编号41、序列编号42、序列编号43、序列编号44、序列编号45、序列编号46、序列编号47、序列编号48、序列编号49及序列编号50所示的碱基序列的反向寡核苷酸C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9及C10，制备各浓度为0.01μM的TE缓冲液。
<反向寡核苷酸>
C1：5’-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3’(序列编号41)
C2：5’-GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA-3’(序列编号42)
C3：5’-CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC-3’(序列编号43)
C4：5’-ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT-3’(序列编号44)
C5：5’-GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT-3’(序列编号45)
C6：5’-TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC-3’(序列编号46)
C7：5’-ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT-3’(序列编号47)
C8：5’-TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG-3’(序列编号48)
C9：5’-ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG-3’(序列编号49)
C10：5’-CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC-3’(序列编号50)
对所得到的各反应液，进行以下的处理。
向PCR管中，添加上述制备的反应液40μL、上述的5’末端FITC标记寡核苷酸溶液10μL、上述的反向寡核苷酸溶液10μL、缓冲液(330mM Tris-醋酸盐pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM二硫苏糖醇)10μL、100mM MgCl2溶液10μL和1mg/mL BSA溶液10μL，再向该混合物中添加灭菌超纯水，使液量为100μL，进行混合。之后，将该PCR管在95℃加热10分钟，迅速冷却至70℃并在该温度下保温10分钟。接着，冷却至50℃并保温10分钟，再于37℃保温10分钟后返回至室温，促进了5’末端FITC标记寡核苷酸与DNA片断的结合体的形成(以上，相当于本发明方法的第二工序)。
向固定化有上述生物素标记甲基胞嘧啶抗体的被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条中，添加上述制备的DNA片断的反应液100μL，在室温下放置1小时。之后，通过移液除去溶液，添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过移液除去该缓冲液。将该操作再重复2次(以上，相当于本发明方法的第三工序)。
之后，向各孔中以100μL的比例，添加HRP标记FITC抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories公司制、0.005μg/100μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]后，在室温放置1小时。放置后，向各孔添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过倾析除去该缓冲液。将该操作再重复2次。
向各孔中以100μL的比例添加、混合基质(R&D公司制、#DY999)，开始反应。
在室温下放置约30分钟，向各孔中以50μL的比例添加停止溶液(2N H2SO4水溶液)，停止反应。在反应停止后30分钟以内测定450nm的吸光度。(以上，相当于本发明方法的第四工序)
将其结果示于图10。溶液A、溶液B及溶液C中，与溶液D相比，可见吸光度的增加。另外，其强度依赖于DNA片断的浓度而增加。
本实验中可知，形成、选择了甲基胞嘧啶抗体、被甲基化了的DNA片断和固定化的5’末端生物素标记寡核苷酸的复合体，通过其功能对复合体中的FITC进行定量·检测，可以进行DNA片断的检测·定量。
实施例11
使用市售生物素化试剂盒(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所制)，按照商品目录中记载的方法，将市售的甲基胞嘧啶抗体(Aviva Systems Biology公司制)生物素标记。使所得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体成为0.25μg/μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液而冷藏保存。
制备合成而得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体的0.5μg/mL0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液，将其以各100μL的比例添加到被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条(Perkin Elmer公司制)，在室温下放置约1小时，将其固定化至孔中。之后，通过移液除去溶液，添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过倾析除去该缓冲液。将该操作再重复2次(以上，相当于本发明方法中使用的固定化甲基化DNA抗体的制备)。
用YPD培养基(1％酵母提取物、2％胨、2％葡萄糖，pH 5.6-6.0)培养面包酵母株X2180-1A，直到浊度为OD600 0.6-1.0，以10000×g离心10分钟，制备1x107的酵母细胞。使用Methods in Yeast Genetics(酵母遗传学方法)(冷泉港实验室)中记载的常规的酵母基因组的制备法，从所制备的酵母细胞获得酵母基因组。
使所制备的酵母细胞在缓冲液A(1M山梨醇、0.1M EDTA、pH 7.4)中悬浮，添加0.1％2-巯基乙醇(终浓度14mM)及100U消解酶(10mg/ml)，30℃下边搅拌边孵育1小时直至溶液透明。以550xg离心10分钟，回收原生质体后，使其在缓冲液B(50mM Tris-HCl、pH 7.4、20mM EDTA)中悬浮，之后添加十二烷基硫酸钠并使其为1％(w/v)，然后在65℃下孵育30分钟。接着，添加体积比2/5量的5M CH3COOK，进行混合，30分钟冰冷后，以15000xg离心30分钟，回收上清。向所回收的上清中添加体积比1/10量的3M CH3COONa和等量的异丙醇，充分混合，以15000xg在4℃下离心30分钟得到沉淀，用70％乙醇冲洗所得到的沉淀并进行回收。使沉淀干燥，然后溶解于1ml的TE缓冲液(10mM Tris-HCl、pH8.0、1mM EDTA)，添加RNase A(Sigma公司制)并使其为40μg/ml，在37℃下孵育1小时，接着，向混合液添加蛋白酶K(Sigma公司制)使其为500μg/ml，添加十二烷基硫酸钠使其为1％(w/v)后，在55℃下将其振荡约16小时。在振荡结束后，对该混合物进行苯酚[用1M Tris-HCl(pH 8.0)饱和]/氯仿提取处理。回收水层，向其中添加NaCl并使其为0.5N，然后对其进行乙醇沉淀处理，回收所生成的沉淀。用70％乙醇冲洗所回收的沉淀，由此得到了基因组DNA。
使用以下的序列编号27及序列编号28所示的为PCR而设计的寡核苷酸引物(PF3及PR3)和反应条件，进行PCR，由此从得到的酵母基因组DNA扩增作为供试样品使用的DNA片断(S、序列编号29、与基因库检索号No.NC_001139等所示酵母染色体VII的碱基编号271743-272083相当的区域)。
<为PCR而设计的寡核苷酸引物>
PF3：5’-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3’(序列编号27)
PR3：5’-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3’(序列编号28)
<DNA片断>
S：5’-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3’(序列编号29)
作为PCR的反应液，使用如下的反应液，即，混合成为模板的基因组DNA 10ng、5μM的上述引物溶液各3μl、each 2mM dNTP 5μl、10×缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％明胶)5μl和耐热性DNA聚合酶(Ampl iTaqGold)5U/μl 0.25μl，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl而得的反应液。将该反应液在95℃保温10分钟后，再以将95℃下20秒钟接着在58℃下30秒钟进而在72℃下30秒钟为1个循环的保温进行40个循环的条件下进行PCR。
进行PCR后，利用2％琼脂糖凝胶电泳确认扩增，通过Wizard SVGel/PCR Kit(PROMEGA公司)精制DNA片断S。
关于DNA片断S，制备以下的溶液。
溶液A：DNA片断S 10ng/10μL TE缓冲液
溶液B：DNA片断S 1ng/10μL TE缓冲液
溶液C：TE缓冲液(阴性对照液)
另外，使用以下的序列编号32及序列编号33所示的为PCR而设计的寡核苷酸引物(PF4及PR4)和反应条件进行PCR，由此从所得的酵母基因组DNA扩增作为供试样品使用的DNA片断(T、序列编号34、与基因库检索号No.NC_001139等所示的酵母染色体VII的碱基编号384569-384685相当的区域)。
<为PCR而设计的寡核苷酸引物>
PF4：5’-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3’(序列编号32)
PR4：5’-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3’(序列编号33)
<DNA片断>
T：5’-GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3’(序列编号34)
作为PCR的反应液，使用以下的反应液，即，混合成为模板的基因组DNA 10ng、5μM的上述引物溶液各3μl、each 2mM dNTP 5μl、10×缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％明胶)5μl、耐热性DNA聚合酶(Ampl iTaqGold)5U/μl 0.25μl，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl而得的反应液。将该反应液在95℃保温10分钟后，再以将95℃下20秒钟接着在58℃下30秒钟进而在72℃下30秒钟为1个循环的保温进行40个循环的条件下进行PCR。
进行PCR后，利用2％琼脂糖凝胶电泳确认扩增，通过Wizard SVGel/PCR Kit(PROMEGA公司)精制DNA片断T。
关于DNA片断T，制备以下的溶液。
溶液A：DNA片断T 10ng/10μL TE缓冲液
溶液B：DNA片断T 1ng/10μL TE缓冲液
溶液C：TE缓冲液(阴性对照液)
分别将上述制备的DNA片断S的溶液A与DNA片断T的溶液A，DNA片断S的溶液B与DNA片断T的溶液B，DNA片断S的溶液C与DNA片断T的溶液C混合，制备以下所示的DNA片断混合溶液MA～MC各两份。
溶液MA：10ng/20μL TE缓冲液
溶液MB：1ng/20μL TE缓冲液
溶液MC：TE缓冲液(阴性对照液)
将所得的各溶液20μL、SssI甲基化酶(NEB公司制)0.5μl、10x NEBuffer2(NEB公司制)5μl和3.2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0.5μl混合，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl，制备反应液。将该反应液在37℃孵育30分钟(以上，相当于本发明方法的第一工序)。
合成含有可以与含有序列编号30所示目标DNA区域的寡核苷酸S’互补性结合的序列编号31所示的碱基序列的5’末端FITC标记寡核苷酸F3，制备0.02μM的Tris-HCl缓冲液(10mM)溶液。
<含有目标DNA区域的寡核苷酸>
S’：5’-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3’(序列编号30)
<5’末端FITC标记寡核苷酸>
F3：5’-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3’(序列编号31)
另外，合成含有可以与含有序列编号30所示目标DNA区域的寡核苷酸S’的负链互补性结合的、序列编号41、序列编号42、序列编号43、序列编号44、序列编号45、序列编号46、序列编号47、序列编号48、序列编号49及序列编号50所示的碱基序列的反向寡核苷酸C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9及C10，制备各浓度为0.01μM的TE缓冲液。
<反向寡核苷酸>
C1：5’-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3’(序列编号41)
C2：5’-GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA-3’(序列编号42)
C3：5’-CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC-3’(序列编号43)
C4：5’-ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT-3’(序列编号44)
C5：5’-GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT-3’(序列编号45)
C6：5’-TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC-3’(序列编号46)
C7：5’-ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT-3’(序列编号47)
C8：5’-TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG-3’(序列编号48)
C9：5’-ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG-3’(序列编号49)
C10：5’-CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC-3’(序列编号50)
对所得到的各反应液，进行以下的处理。
向PCR管中，添加上述制备的反应液40μL、上述的5’末端FITC标记寡核苷酸溶液10μL、上述的反向寡核苷酸溶液10μL、缓冲液(330mM Tris-醋酸盐pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM二硫苏糖醇)10μL、100mM MgCl2溶液10μL和1mg/mL BSA溶液10μL，再向该混合物中添加灭菌超纯水，使液量为100μL，进行混合。之后，将该PCR管在95℃加热10分钟，迅速冷却至70℃并在该温度下保温10分钟。接着，冷却至50℃并保温10分钟，再于37℃保温10分钟后返回至室温，促进了5’末端FITC标记寡核苷酸与DNA片断的结合体的形成(以上，相当于本发明方法的第二工序)。
向固定化有上述生物素标记甲基胞嘧啶抗体的被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条中，添加上述制备的DNA片断的反应液100μL，在室温下放置1小时。之后，通过移液除去溶液，添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过移液除去该缓冲液。将该操作再重复2次(以上，相当于本发明方法的第三工序)。
之后，向各孔中以100μL的比例添加HRP标记FITC抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories公司制、0.005μg/100μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]后，在室温放置1小时。放置后，向各孔添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过倾析除去该缓冲液。将该操作再重复2次。
向各孔中以100μL的比例添加、混合基质(R&D公司制、#DY999)，开始反应。
在室温下放置约60分钟，向各孔中以50μL的比例添加停止溶液(2N H2SO4水溶液)，停止反应。反应停止后30分钟以内测定450nm的吸光度。(以上，相当于本发明方法的第四工序)
将其结果示于图11。溶液MA及溶液MB中，与溶液MC相比，可见吸光度的增加。另外，其强度依赖于DNA片断的浓度而增加。
本实验中可知，形成、选择了甲基胞嘧啶抗体、被甲基化了的DNA片断和固定化的5’末端生物素标记寡核苷酸的复合体，通过其功能对复合体中的FITC进行定量·检测，可以进行DNA片断的检测·定量。
实施例12
使用市售生物素化试剂盒(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所制)，按照商品目录中记载的方法，将市售的甲基胞嘧啶抗体(Aviva Systems Biology公司制)生物素标记。使所得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体成为0.25μg/μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液而冷藏保存。
制备合成而得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体的0.5μg/mL0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液，将其以各100μL的比例添加到被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条(Perkin Elmer公司制)，在室温下放置约1小时，将其固定化至孔中。之后，通过移液除去溶液，添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过倾析除去该缓冲液。将该操作再重复2次(以上，相当于本发明方法中使用的固定化甲基化DNA抗体的制备)。
用YPD培养基(1％酵母提取物、2％胨、2％葡萄糖，pH 5.6-6.0)培养面包酵母酵母株X2180-1A，直到浊度为OD600 0.6-1.0，以10000×g离心10分钟，制备1x107的酵母细胞。使用Methods in Yeast Genetics(酵母遗传学方法)(冷泉港实验室)中记载的常规的酵母基因组的制备法，从所制备的酵母细胞获得酵母基因组。
使所制备的酵母细胞在缓冲液A(1M山梨醇、0.1M EDTA、pH 7.4)中悬浮，添加0.1％2-巯基乙醇(终浓度14mM)及100U消解酶(10mg/ml)，30℃下边搅拌边孵育1小时直至溶液透明。以550xg离心10分钟，回收原生质体后，使其在缓冲液B(50mM Tris-HCl、pH 7.4、20mM EDTA)中悬浮，之后添加十二烷基硫酸钠并使其为1％(w/v)，然后在65℃下孵育30分钟。接着，添加体积比2/5量的5M CH3COOK，进行混合，30分钟冰冷后，以15000xg离心30分钟，回收上清。向所回收的上清中添加体积比1/10量的3M CH3COONa和等量的异丙醇，充分混合，以15000xg在4℃下离心30分钟得到沉淀，用70％乙醇冲洗所得到的沉淀并进行回收。使沉淀干燥，然后溶解于1ml的TE缓冲液(10mM Tris-HCl、pH8.0、1mM EDTA)，添加RNase A(Sigma公司制)并使其为40μg/ml，在37℃下孵育1小时，接着，向混合液添加蛋白酶K(Sigma公司制)使其为500μg/ml，添加十二烷基硫酸钠使其为1％(w/v)后，在55℃下将其振荡约16小时。在振荡结束后，对该混合物进行苯酚[用1M Tris-HCl(pH 8.0)饱和]/氯仿提取处理。回收水层，向其中添加NaCl并使其为0.5N，然后对其进行乙醇沉淀处理，回收所生成的沉淀。用70％乙醇冲洗所回收的沉淀，由此得到了基因组DNA。
使用以下的序列编号27及序列编号28所示的为PCR而设计的寡核苷酸引物(PF3及PR3)和反应条件，进行PCR，由此从所得的酵母基因组DNA扩增作为供试样品使用的DNA片断(S、序列编号29、与基因库检索号No.NC_001139等所示酵母染色体VII的碱基编号271743-272083相当的区域)。
<为PCR而设计的寡核苷酸引物>
PF3：5’-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3’(序列编号27)
PR3：5’-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3’(序列编号28)
<DNA片断>
S：5’-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3’(序列编号29)
作为PCR的反应液，使用如下的反应液，即，混合成为模板的基因组DNA 10ng、5μM的上述引物溶液各3μl、each 2mM dNTP 5μl、10×缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％明胶)5μl和耐热性DNA聚合酶(Ampl iTaqGold)5U/μl 0.25μl，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl而得的反应液。将该反应液在95℃保温10分钟后，再以将95℃下20秒钟接着在58℃下30秒钟进而在72℃下30秒钟为1个循环的保温进行40个循环的条件下进行PCR。
进行PCR后，利用2％琼脂糖凝胶电泳确认扩增，通过Wizard SVGel/PCR Kit(PROMEGA公司)精制DNA片断S。
关于DNA片断S，制备以下的溶液。
溶液A：DNA片断S 10ng/10μL TE缓冲液
溶液B：DNA片断S 1ng/10μL TE缓冲液
溶液C：DNA片断S TE缓冲液(阴性对照液)
另外，使用以下的序列编号32及序列编号33所示的为PCR而设计的寡核苷酸引物(PF4及PR4)和反应条件，进行PCR，由此从所得的酵母基因组DNA扩增作为供试样品使用的DNA片断(T、序列编号34、与基因库检索号No.NC_001139等所示的酵母染色体VII的碱基编号384569-384685相当的区域)。
<为PCR而设计的寡核苷酸引物>
PF4：5’-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3’(序列编号32)
PR4：5’-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3’(序列编号33)
<DNA片断>
T：5’-GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3’(序列编号34)
作为PCR的反应液，使用如下的反应液，即，混合成为模板的基因组DNA 10ng、5μM的上述引物溶液各3μl、each 2mM dNTP 5μl、10×缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％明胶)5μl和耐热性DNA聚合酶(Ampl iTaqGold)5U/μl 0.25μl，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl而得的反应液。将该反应液在95℃保温10分钟后，再以将95℃下20秒钟接着在58℃下30秒钟进而在72℃下30秒钟为1个循环的保温进行40个循环的条件下进行PCR。
进行PCR后，利用2％琼脂糖凝胶电泳确认扩增，通过Wizard SVGel/PCR Kit(PROMEGA公司)精制DNA片断T。
关于DNA片断T，制备以下的溶液。
溶液A：DNA片断T 10ng/10μL TE缓冲液
溶液B：DNA片断T 1ng/10μL TE缓冲液
溶液C：TE缓冲液(阴性对照液)
分别将上述制备的DNA片断S的溶液A与DNA片断T的溶液A，DNA片断S的溶液B与DNA片断T的溶液B，DNA片断S的溶液C与DNA片断T的溶液C混合，制备以下所示的DNA片断混合溶液MA～MC各两份。
溶液MA：10ng/20μL TE缓冲液
溶液MB：1ng/20μL TE缓冲液
溶液MC：TE缓冲液(阴性对照液)
将所得的各溶液20μL、SssI甲基化酶(NEB公司制)0.5μl、10x NEBuffer2(NEB公司制)5μl、3.2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0.5μl混合，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl，制备反应液。将该反应液在37℃孵育30分钟(以上，相当于本发明方法的第一工序)。
合成含有可以与含有序列编号35所示的目标DNA区域的寡核苷酸T’互补性结合的序列编号36所示的碱基序列的5’末端FITC标记寡核苷酸F4，制备0.02μM的Tris-HCl缓冲液(10mM)溶液。
<含有目标DNA区域的寡核苷酸>
T’：5’-GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3’(序列编号35)
<5’末端FITC标记寡核苷酸>
F4：5’-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3’(序列编号36)
另外，合成含有可以与含有序列编号35所示的目标DNA区域的寡核苷酸T’的负链互补性结合的、序列编号51、序列编号52、序列编号53、及序列编号54所示的碱基序列的反向寡核苷酸C11、C12、C13及C14，制备各浓度为0.01μM的TE缓冲液。
<反向寡核苷酸>
C11：5’-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3’(序列编号51)
C12：5’-AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT-3’(序列编号52)
C13：5’-ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT-3’(序列编号53)
C14：5’-CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC-3’(序列编号54)
对所得到的各反应液，进行以下的处理。
向PCR管中，添加上述制备的反应液40μL、上述的5’末端FITC标记寡核苷酸溶液10μL、上述的反向寡核苷酸溶液10μL、缓冲液(330mM Tris-醋酸盐pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM二硫苏糖醇)10μL、100mM MgCl2溶液10μL和1mg/mL BSA溶液10μL，再向该混合物中添加灭菌超纯水，使液量为100μL，进行混合。之后，将该PCR管在95℃加热10分钟，迅速冷却至70℃并在该温度下保温10分钟。接着，冷却至50℃并保温10分钟，再于37℃保温10分钟后返回至室温，促进了5’末端FITC标记寡核苷酸与DNA片断的结合体的形成(以上，相当于本发明方法的第二工序)。
向固定化有上述生物素标记甲基胞嘧啶抗体的被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条中，添加上述制备的DNA片断的反应液100μL，在室温下放置1小时。之后，通过移液除去溶液，添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过移液除去该缓冲液。将该操作再重复2次(以上，相当于本发明方法的第三工序)。
之后，在各孔中以100μL的比例添加HRP标记FITC抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories公司制、0.005μg/100μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]后，在室温放置1小时。放置后，向各孔中添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过倾析除去该缓冲液。将该操作再重复2次。
向各孔中以100μL的比例添加、混合基质(R&D公司制、#DY999)，开始反应。
在室温下放置约60分钟，向各孔中以50μL的比例，添加停止溶液(2N H2SO4水溶液)，停止反应。反应停止后30分钟以内测定450nm的吸光度。(以上，相当于本发明方法的第四工序)
将结果示于图12。溶液MA及溶液MB中，与溶液MC相比，可见吸光度的增加。另外，其强度依赖于DNA片断的浓度而增加。
本实验中可知，形成、选择了甲基胞嘧啶抗体、被甲基化了的DNA片断和固定化的5’末端生物素标记寡核苷酸的复合体，通过其功能对复合体中的FITC进行定量·检测，可以进行DNA片断的检测·定量。
实施例13
使用市售生物素化试剂盒(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所制)，按照商品目录中记载的方法，将市售的甲基胞嘧啶抗体(Aviva Systems Biology公司制)生物素标记。使所得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体成为0.25μg/μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液而冷藏保存。
制备合成而得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体的0.5μg/mL0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液，将其以各100μL的比例添加到被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条(Perkin Elmer公司制)，在室温下放置约1小时，将其固定化至孔中。之后，通过移液除去溶液，添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过倾析除去该缓冲液。将该操作再重复2次(以上，相当于本发明方法中使用的固定化甲基化DNA抗体的制备)。
用YPD培养基(1％酵母提取物、2％胨、2％葡萄糖，pH 5.6-6.0)培养面包酵母株X2180-1A，直到浊度为OD600 0.6-1.0，以10000×g离心10分钟，制备1x107的酵母细胞。使用Methods in Yeast Genetics(酵母遗传学方法)(冷泉港实验室)中记载的常规的酵母基因组的制备法，从所制备的酵母细胞获得酵母基因组。
使所制备的酵母细胞在缓冲液A(1M山梨醇、0.1M EDTA、pH 7.4)中悬浮，添加0.1％2-巯基乙醇(终浓度14mM)及100U消解酶(10mg/ml)，30℃下边搅拌边孵育1小时直至溶液透明。以550xg离心10分钟，回收原生质体后，使其在缓冲液B(50mM Tris-HCl、pH 7.4、20mM EDTA)中悬浮，之后添加十二烷基硫酸钠并使其为1％(w/v)，然后在65℃下孵育30分钟。接着，添加体积比2/5量的5M CH3COOK，进行混合，30分钟冰冷后，以15000xg离心30分钟，回收上清。向所回收的上清中添加体积比1/10量的3M CH3COONa和等量的异丙醇，充分混合，以15000xg在4℃下离心30分钟得到沉淀，用70％乙醇冲洗所得到的沉淀并进行回收。使沉淀干燥，然后溶解于1ml的TE缓冲液(10mM Tris-HCl、pH8.0、1mM EDTA)，添加RNase A(Sigma公司制)并使其为40μg/ml，在37℃下孵育1小时，接着，向混合液添加蛋白酶K(Sigma公司制)使其为500μg/ml，添加十二烷基硫酸钠使其为1％(w/v)后，在55℃下将其振荡约16小时。在振荡结束后，对该混合物进行苯酚[用1M Tris-HCl(pH 8.0)饱和]/氯仿提取处理。回收水层，向其中添加NaCl并使其为0.5N，然后对其进行乙醇沉淀处理，回收所生成的沉淀。用70％乙醇冲洗所回收的沉淀，由此得到了基因组DNA。
使用以下的序列编号27及序列编号28所示的为PCR而设计的寡核苷酸引物(PF3及PR3)和反应条件，进行PCR，由此从所得的酵母基因组DNA扩增作为供试样品使用的DNA片断(S、序列编号29、与基因库检索号No.NC_001139等所示酵母染色体VII的碱基编号271743-272083相当的区域)。
<为PCR而设计的寡核苷酸引物>
PF3：5’-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3’(序列编号27)
PR3：5’-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3’(序列编号28)
<DNA片断>
S：5’-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3’(序列编号29)
作为PCR的反应液，使用如下的反应液，即，混合成为模板的基因组DNA 10ng、5μM的上述引物溶液各3μl、each 2mM dNTP 5μl、10×缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％明胶)5μl、耐热性DNA聚合酶(AmpliTaqGold)5U/μl 0.25μl，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl而得的反应液。将该反应液在95℃保温10分钟后，再以将95℃下20秒钟接着在58℃下30秒钟进而在72℃下30秒钟为1个循环的保温进行40个循环的条件下进行PCR。
进行PCR后，利用2％琼脂糖凝胶电泳确认扩增，通过Wizard SVGel/PCR Kit(PROMEGA公司)精制DNA片断S。
关于DNA片断S，制备以下的溶液。
溶液A：DNA片断S 10ng/10μL TE缓冲液
溶液B：DNA片断S 1ng/10μL TE缓冲液
溶液C：TE缓冲液(阴性对照液)
另外，使用能够以下的序列编号32及序列编号33所示的为PCR而设计的寡核苷酸引物(PF4及PR4)和反应条件进行PCR，由此从所得的酵母基因组DNA扩增作为供试样品使用的DNA片断(T、序列编号34、与基因库检索号No.NC_001139等所示的酵母染色体VII的碱基编号384569-384685相当的区域)。
<为PCR而设计的寡核苷酸引物>
PF4：5’-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3’(序列编号32)
PR4：5’-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3’(序列编号33)
<DNA片断>
T：5’-GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3’(序列编号34)
作为PCR的反应液，使用如下的反应液，即，混合成为模板的基因组DNA 10ng、5μM的上述引物溶液各3μl、each 2mM dNTP 5μl、10×缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％明胶)5μl和耐热性DNA聚合酶(AmpliTaqGold)5U/μl 0.25μl，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl而得的反应液。将该反应液在95℃保温10分钟后，再以将95℃下20秒钟接着在58℃下30秒钟进而在72℃下30秒钟为1个循环的保温进行40个循环的条件下进行PCR。
进行PCR后，利用2％琼脂糖凝胶电泳确认扩增，通过Wizard SVGel/PCR Kit(PROMEGA公司)精制DNA片断T。
关于DNA片断T，制备以下的溶液。
溶液A：DNA片断T 10ng/10μL TE缓冲液
溶液B：DNA片断T 1ng/10μL TE缓冲液
溶液C：TE缓冲液(阴性对照液)
分别将上述制备的DNA片断S的溶液A与DNA片断T的溶液A，DNA片断S的溶液B与DNA片断T的溶液B，DNA片断S的溶液C与DNA片断T的溶液C分别混合，制备以下所示的DNA片断混合溶液MA～MC各两份。
溶液MA：10ng/20μL TE缓冲液
溶液MB：1ng/20μL TE缓冲液
溶液MC：TE缓冲液(阴性对照液)
将所得的各溶液20μL、SssI甲基化酶(NEB公司制)0.5μl、10x NEBuffer2(NEB公司制)5μl和3.2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0.5μl混合，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl，制备反应液。将该反应液在37℃孵育30分钟(以上，相当于本发明方法的第一工序)。
合成含有可以与含有序列编号30所示目标DNA区域的寡核苷酸S’互补性结合的序列编号31所示的碱基序列的5’末端FITC标记寡核苷酸F3，另外，合成含有可以与含有序列编号35所示目标DNA区域的寡核苷酸T’互补性结合的序列编号36所示的碱基序列的5’末端FITC标记寡核苷酸F4，制备各浓度为0.02μM的Tris-HCl缓冲液(10mM)溶液。
<含有目标DNA区域的寡核苷酸>
S’：5’-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3’(序列编号30)
T’：5’-GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3’(序列编号35)
<5’末端FITC标记寡核苷酸>
F3：5’-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3’(序列编号31)
F4：5’-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3’(序列编号36)
另外，合成含有可以与含有序列编号30所示目标DNA区域的寡核苷酸S’的负链互补性结合的、序列编号41、序列编号42、序列编号43、序列编号44、序列编号45、序列编号46、序列编号47、序列编号48、序列编号49及序列编号50所示的碱基序列的反向寡核苷酸C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9及C10，另外，合成含有可以与含有序列编号35所示目标DNA区域的寡核苷酸T’的负链互补性结合的、序列编号51、序列编号52、序列编号53及序列编号54所示的碱基序列的反向寡核苷酸C11、C12、C13及C14，制备各浓度为0.01μM的TE缓冲液。
<含有目标DNA区域的寡核苷酸>
S’：5’-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3’(序列编号30)
T’：5’-GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3’(序列编号35)
<反向寡核苷酸>
C1：5’-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3’(序列编号41)
C2：5’-GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA-3’(序列编号42)
C3：5’-CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC-3’(序列编号43)
C4：5’-ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT-3’(序列编号44)
C5：5’-GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT-3’(序列编号45)
C6：5’-TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC-3’(序列编号46)
C7：5’-ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT-3’(序列编号47)
C8：5’-TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG-3’(序列编号48)
C9：5’-ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG-3’(序列编号49)
C10：5’-CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC-3’(序列编号50)
C11：5’-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3’(序列编号51)
C12：5’-AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT-3’(序列编号52)
C13：5’-ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT-3’(序列编号53)
C14：5’-CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC-3’(序列编号54)
对所得到的各反应液，进行以下的处理。
向PCR管中，添加上述制备的反应液40μL、上述的5’末端FITC标记寡核苷酸溶液10μL、上述的反向寡核苷酸溶液10μL、缓冲液(330mM Tris-醋酸盐pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM二硫苏糖醇)10μL、100mM MgCl2溶液10μL和1mg/mL BSA溶液10μL，再向该混合物中添加灭菌超纯水，使液量为100μL，进行混合。之后，将该PCR管在95℃加热10分钟，迅速冷却至70℃并在该温度下保温10分钟。接着，冷却至50℃并保温10分钟，再于37℃保温10分钟后返回至室温，促进了5’末端FITC标记寡核苷酸与DNA片断的结合体的形成(以上，相当于本发明方法的第二工序)。
向固定化有上述生物素标记甲基胞嘧啶抗体的被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条中，添加上述制备的DNA片断的反应液100μL，在室温下放置1小时。之后，通过移液除去溶液，添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过移液除去该缓冲液。将该操作再重复2次(以上，相当于本发明方法的第三工序)。
之后，向各孔中以100μL的比例添加HRP标记FITC抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories公司制、0.005μg/100μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]后，在室温放置1小时。放置后，将各孔添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过倾析除去该缓冲液。将该操作再重复2次。
向各孔中以100μL的比例添加、混合基质(R&D公司制、#DY999)，开始反应。
在室温下放置约60分钟，向各孔中以50μL的比例添加停止溶液(2N H2SO4水溶液)，停止反应。在反应停止后30分钟以内测定450nm的吸光度。(以上，相当于本发明方法的第四工序)
将其结果示于图13。溶液MA及溶液MB中，与溶液MC相比，可见吸光度的增加。另外，其强度依赖于DNA片断的浓度而增加。
本实验中可知，形成、选择了甲基胞嘧啶抗体、被甲基化了的DNA片断和固定化的5’末端生物素标记寡核苷酸的复合体，通过其功能对复合体中的FITC进行定量·检测，可以进行DNA片断的检测·定量。
实施例14
使用市售生物素化试剂盒(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所制)，按照商品目录中记载的方法，将市售的甲基胞嘧啶抗体(Aviva Systems Biology公司制)生物素标记。使所得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体成为0.25μg/μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液而冷藏保存。
制备合成而得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体的0.5μg/mL0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液，将其以各100μL的比例添加到被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条(Perkin Elmer公司制)，在室温下放置约1小时，将其固定化至孔中。之后，通过移液除去溶液，添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过倾析除去该缓冲液。将该操作再重复2次(以上，相当于本发明方法中使用的固定化甲基化DNA抗体的制备)。
对购自克隆技术(Clontech)公司的人血液来源基因组DNA，制备以下的溶液各两份。
溶液A：人血液来源基因组DNA 100ng/5μL TE缓冲液
溶液B：人血液来源基因组DNA 10ng/5μL TE缓冲液
溶液C：人血液来源基因组DNA 1ng/5μL TE缓冲液
溶液D：TE缓冲液(阴性对照液)
将上述制备的各溶液5μL、限制性酶X spI 10U、对X spI最适的10x缓冲液(200mM Tris-HCl pH 8.5、100mM MgCl2、10mM二硫苏糖醇、1000mM KCl)2μl混合，向其中添加灭菌超纯水使液量为20μl，制备反应液。将该反应液在37℃孵育1小时。
将所得的各反应液20μL、SssI甲基化酶(NEB公司制)0.5μl、10x NEBuffer2(NEB公司制)5μl和3.2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0.5μl混合，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl，制备反应液。将该反应液在37℃孵育30分钟(以上，相当于本发明方法的第一工序)。
合成含有可以与含有在作为人转座子周知的LINE1区域设计的序列编号37所示的目标DNA区域的寡核苷酸Z(与基因库检索号No.M80340等所示的碱基编号115-386相当的区域)互补性结合的序列编号38所示的碱基序列的5’末端FITC标记寡核苷酸F5，制备0.02μM的Tris-HCl缓冲液(10mM)溶液。
<含有目标DNA区域的寡核苷酸>
Z：5’-TAGGGAGTGCCAGACAGTGGGCGCAGGCCAGTGTGTGTGCGCACCGTGCGCGAGCCGAAGCAGGGCGAGGCATTGCCTCACCTGGGAAGCGCAAGGGGTCAGGGAGTTCCCTTTCTGAGTCAAAGAAAGGGGTGACGGTCGCACCTGGAAAATCGGGTCACTCCCACCCGAATATTGCGCTTTTCAGACCGGCTTAAGAAACGGCGCACCACGAGACTATATCCCACACCTGGCTCGGAGGGTCCTACGCCCACGGAATCTCGCTGATTGC-3’(序列编号37)
<5’末端FITC标记寡核苷酸>
F5：5’-ATAGTCTCGTGGTGCGCCGT-3’(序列编号38)
另外，合成含有可以与含有序列编号39所示目标DNA区域的寡核苷酸W的负链互补性结合的序列编号55、序列编号56、序列编号57、序列编号58及序列编号59所示的碱基序列的反向寡核苷酸C15、C16、C17、C18及C19，制备各浓度为0.01μM的TE缓冲液。
<含有目标DNA区域的寡核苷酸>
Z：5’-TAGGGAGTGCCAGACAGTGGGCGCAGGCCAGTGTGTGTGCGCACCGTGCGCGAGCCGAAGCAGGGCGAGGCATTGCCTCACCTGGGAAGCGCAAGGGGTCAGGGAGTTCCCTTTCTGAGTCAAAGAAAGGGGTGACGGTCGCACCTGGAAAATCGGGTCACTCCCACCCGAATATTGCGCTTTTCAGACCGGCTTAAGAAACGGCGCACCACGAGACTATATCCCACACCTGGCTCGGAGGGTCCTACGCCCACGGAATCTCGCTGATTGC-3’(序列编号37)
<反向寡核苷酸>
C15：5’-CAGTGTGTGTGCGCACCGTGCGCGAGCCGA-3’(序列编号55)
C16：5’-GGCGAGGCATTGCCTCACCTGGGAAGCGCA-3’(序列编号56)
C17：5’-GGTGACGGTCGCACCTGGAAAATCGGGTCA-3’(序列编号57)
C18：5’-ACCCGAATATTGCGCTTTTCAGACCGGCTT-3’(序列编号58)
C19：5’-TCGGAGGGTCCTACGCCCACGGAATCTCGC-3’(序列编号59)
对所得到的各反应液，进行以下的处理。
向PCR管中，添加上述制备的反应液40μL、上述的5’末端FITC标记寡核苷酸溶液10μL、上述的反向寡核苷酸溶液10μL、缓冲液(330mM Tris-醋酸盐pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM二硫苏糖醇)10μL、100mM MgCl2溶液10μL和1mg/mL BSA溶液10μL，再向该混合物中添加灭菌超纯水，使液量为100μL，进行混合。之后，将该PCR管在95℃加热10分钟，迅速冷却至70℃并在该温度下保温10分钟。接着，冷却至50℃并保温10分钟，再于37℃保温10分钟后返回至室温，促进了5’末端FITC标记寡核苷酸与DNA片断的结合体的形成(以上，相当于本发明方法的第二工序)。
向固定化有上述生物素标记甲基胞嘧啶抗体的被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条中，添加上述制备的DNA片断的反应液100μL，在室温下放置1小时。之后，通过移液除去溶液，添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过移液除去该缓冲液。将该操作再重复2次(以上，相当于本发明方法的第三工序)。
之后，向各孔中以100μL的比例，添加HRP标记FITC抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories公司制、0.005μg/100μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]后，在室温放置1小时。放置后，向各孔添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过倾析除去该缓冲液。将该操作再重复2次。
向各孔中以100μL的比例添加、混合基质(R&D公司制、#DY999)，开始反应。
在室温下放置约9分钟，向各孔中以50μL的比例，添加停止溶液(2N H2SO4水溶液)，停止反应。在反应停止后30分钟以内测定450nm的吸光度。(以上，相当于本发明方法的第四工序)
将其结果示于图14。溶液A、溶液B及溶液C中，与溶液D相比，可见吸光度的增加。另外，其强度依赖基因组DNA的浓度而增加。
本实验中可知，形成、选择了甲基胞嘧啶抗体、被甲基化了的DNA片断和固定化的5’末端生物素标记寡核苷酸的复合体，通过其功能对复合体中的FITC进行定量·检测，可以进行DNA片断的检测·定量，可以进行基因组DNA的检测·定量。
实施例15
使用市售生物素化试剂盒(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所制)，按照商品目录中记载的方法，将市售的甲基胞嘧啶抗体(Aviva Systems Biology公司制)生物素标记。使所得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体成为0.25μg/μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液而冷藏保存。
制备合成而得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体的0.5μg/mL0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液，将其以各100μL的比例添加到被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条(Perkin Elmer公司制)，在室温下放置约1小时，将其固定化至孔中。之后，通过移液除去溶液，添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过倾析除去该缓冲液。将该操作再重复2次(以上，相当于本发明方法中使用的固定化甲基化DNA抗体的制备)。
对购自克隆技术(Clontech)公司的人血液来源基因组DNA，制备以下的溶液各两份。
溶液A：人血液来源基因组DNA 100ng/5μL TE缓冲液
溶液B：人血液来源基因组DNA 10ng/5μL TE缓冲液
溶液C：人血液来源基因组DNA 1ng/5μL TE缓冲液
溶液D：TE缓冲液(阴性对照液)
将上述制备的各溶液5μL、限制性酶MspI 4U、对MspI最适的10x缓冲液(100mM Tris-HCl pH 7.5、100mM MgCl2、10mM二硫苏糖醇、500mM NaCl)2μl混合，向其中添加灭菌超纯水使液量为20μl，制备反应液。将该反应液在37℃孵育1小时。
将所得的各反应液20μL、SssI甲基化酶(NEB公司制)0.5μl、10x NEBuffer2(NEB公司制)5μl和3.2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0.5μl，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μl，制备反应液。将该反应液在37℃孵育30分钟(以上，相当于本发明方法的第一工序)。
合成含有可以与含有在作为人转座子周知的Alu区域设计的序列编号39所示的目标DNA区域的寡核苷酸W(与基因库检索号No.AF458110等所示的碱基编号178-262相当的区域)互补性结合的序列编号40所示的碱基序列的5’末端FITC标记寡核苷酸F6，制备0.02μM的Tris-HCl缓冲液(10mM)溶液。
<含有目标DNA区域的寡核苷酸>
W：5’-CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCC-3’(序列编号39)
<5’末端FITC标记寡核苷酸>
F6：5’-GGATGGTCTCGATCTCCTGAC-3’(序列编号40)
另外，合成含有可以与含有序列编号39所示目标DNA区域的寡核苷酸W的负链互补性结合的序列编号60及序列编号61所示的碱基序列的反向寡核苷酸C20及C21，制备各浓度为0.01μM的TE缓冲液。
<含有目标DNA区域的寡核苷酸>
W：-CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCC-3’(序列编号39)
<反向寡核苷酸>
C20：5’-CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCA-3’(序列编号60)
C21：5’-TTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAG-3’(序列编号61)
对所得到的各反应液，进行以下的处理。
向PCR管中，添加上述制备的反应液40μL、上述的5’末端FITC标记寡核苷酸溶液10μL、上述的反向寡核苷酸溶液10μL、缓冲液(330mM Tris-醋酸盐pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM二硫苏糖醇)10μL、100mM MgCl2溶液10μL和1mg/mL BSA溶液10μL，再向该混合物中添加灭菌超纯水，使液量为100μL，进行混合。之后，将该PCR管在95℃加热10分钟，迅速冷却至70℃并在该温度下保温10分钟。接着，冷却至50℃并保温10分钟，再于37℃保温10分钟后返回至室温，促进了5’末端FITC标记寡核苷酸与DNA片断的结合体的形成(以上，相当于本发明方法的第二工序)。
向固定化有上述生物素标记甲基胞嘧啶抗体的被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条中，添加上述制备的DNA片断的反应液100μL，在室温下放置1小时。之后，通过移液除去溶液，添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过移液除去该缓冲液。将该操作再重复2次(以上，相当于本发明方法的第三工序)。
之后，向各孔中以100μL的比例，添加HRP标记FITC抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories公司制、0.005μg/100μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]后，在室温放置1小时。放置后，向各孔中添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]后，通过倾析除去该缓冲液。将该操作再重复2次。
向各孔中以100μL的比例添加、混合基质(R&D公司制、#DY999)，开始反应。
在室温下放置约8分钟，向各孔中以50μL的比例，添加停止溶液(2N H2SO4水溶液)，停止反应。在反应停止后30分钟以内测定450nm的吸光度。(以上，相当于本发明方法的第四工序)
将结果示于图15。溶液A、溶液B及溶液C中，与溶液D相比，可见吸光度的增加。另外，其强度依赖基因组DNA的浓度而增加。
本实验中可知，形成、选择了甲基胞嘧啶抗体、被甲基化了的DNA片断和固定化的5’末端生物素标记寡核苷酸的复合体，通过其功能对复合体中的FITC进行定量·检测，可以进行DNA片断的检测·定量，可以进行基因组DNA的检测·定量。
实施例16
作为血清样品，如下所示分别制备人血液来源基因组DNA(Human Genomic DNA、#636401、克隆技术(Clontech)公司)的TE缓冲液和从大鼠(Wistar Hannover)收集的血清的混合液各4份。
血清样品A：人血液来源基因组DNA 10ng/10μL TE缓冲溶液+大鼠血清10μL
血清样品B：人血液来源基因组DNA 1ng/10μL TE缓冲溶液+大鼠血清10μL
血清样品C：人血液来源基因组DNA 0.1ng/10μL TE缓冲溶液+大鼠血清10μL
血清样品D：人血液来源基因组DNA 0ng/10μL TE缓冲溶液+大鼠血清10μL(阴性对照液)
关于上述制备的血清样品A～D，分别进行以下的处理1或处理2各2份。
处理1：
混合血清样品20μL和缓冲液(500mM Tris-HCl(pH 7.5)，100mM MgCl2，10mM DTT，1000mM NaCl)4μL，进而向该混合物中添加灭菌超纯水，使其液量40μL，进行了混合。随后，将该PCR管在95℃下保温10分钟，在4℃下保温10分钟之后，恢复至室温。以9100×g离心10分钟，然后回收上清。
处理2：
混合血清样品20μL和缓冲液(330mM Tris-醋酸盐(pH 7.9)，100mM Mg(OAc)2，5mM DTT，660mM KOAc)4μL，进而向该混合物中添加灭菌超纯水，使液量为40μL，进行了混合。随后，将该PCR管在95℃下保温10分钟，在4℃下保温10分钟之后，恢复至室温。以9100×g离心10分钟，然后回收上清。
混合通过上述的处理1或处理2制备的各溶液20μL、限制酶MspI 2U、最适于MspI的10x缓冲液(100mM Tris-HCl pH 7.5、100mMMgCl2、10mM二硫苏糖醇、500mM NaCl)5μL，向其中添加灭菌超纯水，使液量为50μL而制备了反应液。将该反应液在37℃下孵育1小时。
混合通过上述的酶处理得到的溶液30μL、SssI甲基化酶(NEB公司制)0.5μL、10xNEBuffer2(NEB公司制)5μL、和3.2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0.5μL，向其中添加灭菌超纯水，使液量为50μL而制备了反应液。将该反应液在37℃下孵育30分钟。
作为用于获得含有在作为人转座子而周知的Alu区域设计的、序列编号39所示的碱基序列的目标DNA区域(W、序列编号39、与基因库检索号No.AF458110所示的碱基编号178-262相当的区域)的特定寡核苷酸，合成含有与目标DNA区域W的正链互补性结合的、序列编号40所示的碱基序列的5’末端FITC标记寡核苷酸F1，制备了0.02μM的Tris-HCl缓冲液(10mM)溶液。
<目标DNA区域>
W：5’-CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCC-3’(序列编号39)
<5’末端FITC标记寡核苷酸>
F1：5’-GGATGGTCTCGATCTCCTGAC-3’(序列编号40)
添加上述得到的反应液50μL、5’末端FITC标记寡核苷酸溶液10μL、缓冲液(330mM Tris-醋酸盐pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM二硫苏糖醇)10μL、100mM MgCl2溶液10μL和1mg/mL BSA溶液10μL，再向该混合物中添加灭菌超纯水，使液量为100μL，进行混合。之后，为了使目标DNA区域与5’末端FITC标记寡核苷酸的双链形成，将该PCR管在95℃保温10分钟，迅速冷却至70℃，在该温度下保温10分钟。接着，冷却至50℃保温10分钟，再于37℃保温10分钟，之后返回至室温。
使用市售生物素化试剂盒(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所制)，根据规程中记载的方法，将市售的甲基胞嘧啶抗体(Aviva Systems Biology公司制)生物素标记。使所得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体成为0.25μg/μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH 7.4)溶液而冷藏保存。
向经上述的热处理而得的反应液100μL中，添加将上述的生物素标记甲基胞嘧啶抗体溶液稀释5倍(0.05μg/μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH 7.4)溶液)后的溶液1μL，在室温下放置1小时，形成含有目标DNA区域、5’末端FITC标记寡核苷酸和生物素标记甲基胞嘧啶抗体的检测复合体。
将上述所得的反应液转移到被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条(StreptaWell、#11645692001、罗氏公司)，在室温下放置约60分钟，通过生物素-抗生物蛋白链菌素结合，在8孔条固定化含有目标DNA区域、5’末端FITC标记寡核苷酸和生物素标记甲基胞嘧啶抗体的检测复合体。之后，通过倾析去除溶液，用清洗缓冲液[0.05％Tween20含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4·7H2O、154mM NaCl pH 7.4)]以200μL清洗各孔3次。
之后，向各孔中以100μL的比例，添加HRP标记FITC抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories公司制、0.005μg/100μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH 7.4)溶液]后，在室温放置1小时。放置后，向各孔添加200μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH 7.4)]后，通过倾析除去该缓冲液。将该操作再重复2次。
向各孔中以100μL的比例，添加、混合基质(R&D公司制、#DY999)，开始反应。
在室温下放置约30分钟，向各孔中以50μL的比例添加停止溶液(2N H2SO4水溶液)，停止反应。在反应停止后30分钟以内测定450nm的吸光度，对所得的测定值算出双份的平均值。
将其结果示于图16和图17。处理1中，就人血液来源基因组DNA的溶液A(10ng)、溶液B(1ng)和溶液C(0.1ng)而言，与溶液D(0ng：对照溶液)相比，吸光度依赖于浓度而增加(图16)。另一方面，处理2中，就人血液来源基因组DNA的溶液A(10ng)而言，与溶液D(0ng：对照溶液)相比，吸光度增加，但溶液B(1ng)和溶液C(0.1ng)中，未见吸光度的增加(图17)。
本实验中显示了，形成、选择了固定化的生物素标记甲基胞嘧啶抗体与被甲基化了的DNA片断与5’末端FITC标记寡核苷酸的复合体，通过其功能对复合体中的FITC进行定量·检测，可以灵敏度良好地检测、定量血清中人基因组DNA。另外，与处理2相比，处理1中血清中人基因组DNA被灵敏度良好地检测出。
实施例17
作为血清样品，如下所示制备人血液来源基因组DNA(Human Genomic DNA、#636401、克隆技术(Clontech)公司)的TE缓冲液和从KOHJIN生物公司购得的人血清(不同个体的人血清)的混合液各双份。
血清样品A：人血液来源基因组DNA 4ng/10μL TE缓冲溶液+人血清40μL
血清样品B：人血液来源基因组DNA 2ng/10μL TE缓冲溶液+人血清40μL
血清样品C：人血液来源基因组DNA 1ng/10μL TE缓冲溶液+人血清40μL
血清样品D：人血液来源基因组DNA 0ng/10μL TE缓冲溶液+人血清40μL(阴性对照液)
关于上述制备的血清样品A～D，进行如下的处理各双份。
向PCR管中添加血清样品50μL、缓冲液(500mM Tris-HCl(pH 7.5)，100mM MgCl2，10mM DTT，1000mM NaCl)20μL，再向该混合物中添加灭菌超纯水，使液量为100μL，进行混合。之后，将该PCR管在95℃保温10分钟，冷却至4℃后，返回至室温。接着以9100×g离心10分钟后，回收上清20μL。
将经上述的处理制备的溶液20μL、限制性酶MspI 2U、与MspI最适的10x缓冲液(100mM Tris-HCl pH 7.5、100mM MgCl2、10mM二硫苏糖醇、500mM NaCl)5μL混合，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μL，制备反应液。将该反应液在37℃孵育1小时。
将经上述的酶处理而得的溶液30μL、SssI甲基化酶(NEB公司制)0.5μL、10x NEBuffer2(NEB公司制)5μL和3.2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0.5μL混合，向其中加入灭菌超纯水使液量为50μL，制备反应液。将该反应液在37℃孵育30分钟。
合成含有可以与含有在作为人转座子周知的Alu区域设计的目标DNA区域(W、序列编号39、与基因库检索号No.AF458110所示的碱基编号178-262相当的区域)互补性结合的序列编号40所示的碱基序列的5’末端FITC标记寡核苷酸F1，制备0.02μM的Tris-HCl缓冲液(10mM)溶液。
<目标DNA区域>
W：5’-CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCC-3’(序列编号39)
<5’末端FITC标记寡核苷酸>
F6：5’-GGATGGTCTCGATCTCCTGAC-3’(序列编号40)
添加上述所得的反应液50μL、5’末端FITC标记寡核苷酸溶液10μL、缓冲液(330mM Tris-醋酸盐pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM二硫苏糖醇)10μL、100mM MgCl2溶液10μL和1mg/mL BSA溶液10μL，再向该混合物中添加灭菌超纯水使液量为100μL，进行混合。之后，为了形成目标DNA区域与5’末端FITC标记寡核苷酸的双链，将该PCR管在95℃保温10分钟，迅速冷却至70℃，在该温度下保温10分钟。接着，冷却至50℃保温10分钟，再于37℃保温10分钟后，返回至室温。
使用市售生物素化试剂盒(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所制)，根据规程中记载的方法，将市售的甲基胞嘧啶抗体(Aviva Systems Biology公司制)生物素标记。使所得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体成为0.25μg/μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH 7.4)溶液而冷藏保存。
向经上述的热处理所得的反应液100μL中添加将上述的生物素标记甲基胞嘧啶抗体溶液稀释5倍(0.05μg/μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH 7.4)溶液)后的溶液1μL，在室温下放置1小时，使含有目标DNA区域、5’末端FITC标记寡核苷酸和生物素标记甲基胞嘧啶抗体的检测复合体形成。
将上述所得的反应液转移到被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条(StreptaWell、#11645692001、罗氏公司)，在室温下放置1小时，通过生物素-抗生物蛋白链菌素结合，在8孔条固定化含有目标DNA区域、5’末端FITC标记寡核苷酸和生物素标记甲基胞嘧啶抗体的检测复合体。之后，通过移液去除溶液，将各孔以清洗缓冲液[0.05％Tween20含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4·7H2O、154mM NaCl pH 7.4)]200μL清洗3次。
之后，向各孔中以100μL的比例，添加HRP标记FITC抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories公司制、0.005μg/100μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH 7.4)溶液]后，在室温放置1小时。放置后，通过移液去除溶液，将各孔以清洗缓冲液[0.05％Tween20含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4·7H2O、154mM NaCl pH 7.4)]200μL清洗3次。
向各孔中以100μL的比例，添加、混合基质(R&D公司制、#DY999)，开始反应。
在室温下放置20分钟，向各孔中以50μL的比例添加停止溶液(2NH2SO4水溶液)，停止反应。在反应停止后30分钟以内测定450nm的吸光度。
将其结果示于图18。人血液来源基因组DNA的溶液A(4ng)、溶液B(2ng)和溶液C(1ng)中，与溶液D(0ng：对照溶液)相比较，吸光度依赖于浓度而增加。
本实验中可知，使用本次发明的方法而提取的DNA样品，形成含有目标DNA区域、5’末端FITC标记寡核苷酸和生物素标记甲基胞嘧啶抗体的检测复合体，借助生物素-抗生物蛋白链菌素结合进行固定化而进行选择，利用其功能检测复合体中的FITC，从而可以进行人血清中人基因组DNA的检测·定量。
实施例18
作为血清样品，使用以下所示的人血清。
从KOHJIN生物公司购得的人血清(不同个体的人血清)
Lot No.：
N51438(健康者)
N51439(健康者)
N51441(健康者)
从ProMedDx公司购得的人血清(不同个体的人血清)
Lot No.：
11171268(健康者、56岁、男性)
11171292(健康者、62岁、男性)
11171297(健康者、67岁、男性)
11202510(健康者、67岁、女性)
11202522(健康者、64岁、女性)
11202527(健康者、52岁、女性)
11202615(健康者、75岁、女性)
11202618(健康者、78岁、女性)
10958886(健康者、56岁、男性)
10958979(健康者、39岁、男性)
10958980(健康者、45岁、男性)
10960268(健康者、37岁、男性)
10960272(健康者、50岁、男性)
10960276(健康者、30岁、男性)
10960285(健康者、39岁、男性)
11003457(健康者、38岁、男性)
11003479(健康者、51岁、男性)
11003480(健康者、48岁、男性)
11324997(健康者、59岁、男性)
11325001(健康者、61岁、男性)
10325022(健康者、61岁、男性)
10870623(乳腺癌患者、33岁、女性)
10929521(乳腺癌患者、55岁、女性)
10989644(乳腺癌患者、45岁、女性)
11209430(乳腺癌患者、80岁、女性)
10929514(乳腺癌患者、57岁、女性)
10843055(乳腺癌患者、59岁、女性)
10984680(乳腺癌患者、64岁、女性)
10840414(肺癌患者、54岁、女性)
10929506(肺癌患者、55岁、男性)
11091955(肺癌患者、76岁、女性)
11103346(肺癌患者、66岁、女性)
11142322(肺癌患者、62岁、女性)
11152564(肺癌患者、67岁、男性)
11152571(肺癌患者、67岁、男性)
11153198(肺癌患者、69岁、女性)
11209435(肺癌患者、61岁、男性)
11230621(肺癌患者、71岁、女性)
11153192(肺癌患者、59岁、男性)
10715942(肺癌患者、64岁、男性)
10840422(肺癌患者、78岁、女性)
10935547(前列腺癌患者、83岁、男性)
11000243(前列腺癌患者、78岁、男性)
11071226(前列腺癌患者、84岁、男性)
关于上述的血清样品，进行以下的处理各双份。
处理1：
向PCR管中添加血清样品40μL、缓冲液(500mM Tris-HCl(pH 7.5)，100mM MgCl2，10mM DTT，1000mM NaCl)20μL，再向该混合物中添加灭菌超纯水使液量为100μL，进行混合。之后，将该PCR管在95℃保温10分钟，冷却到4℃后，返回至室温。接着，以9100×g离心10分钟后回收上清20μL。
将经上述的处理制备的溶液20μL、限制性酶MspI2U、与MspI最适的10x缓冲液(100mM Tris-HCl pH 7.5、100mM MgCl2、10mM二硫苏糖醇、500mM NaCl)5μL混合，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μL，制备反应液。将该反应液在37℃孵育1小时。
将经上述的酶处理而得的溶液30μL、SssI甲基化酶(NEB公司制)0.5μL、10x NEBuffer2(NEB公司制)5μL、3.2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0.5μL混合，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μL，制备反应液。将该反应液在37℃孵育30分钟。
合成含有可以与含有在作为人转座子周知的Alu区域设计的目标DNA区域(W、序列编号39、与基因库检索号No.AF458110所示的碱基编号178-262相当的区域)互补性结合的序列编号40所示的碱基序列的5’末端FITC标记寡核苷酸F6，制备0.02μL的Tris-HCl缓冲液(10mM)溶液。
<目标DNA区域>
W：5’-CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCC-3’(序列编号39)
<5’末端FITC标记寡核苷酸>
F6：5’-GGATGGTCTCGATCTCCTGAC-3’(序列编号40)
添加上述所得的反应液50μL、5’末端FITC标记寡核苷酸溶液10μL、缓冲液(330mM Tris-醋酸盐pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM二硫苏糖醇)10μL、100mM MgCl2溶液10μL和1mg/mL BSA溶液10μL，在向该混合物中添加灭菌超纯水使液量为100μL，进行混合。之后，为了形成目标DNA区域与5’末端FITC标记寡核苷酸的双链，在95℃保温10分钟，在迅速冷却至70℃，在该温度下保温10分钟。接着，冷却至50℃并保温10分钟，再于37℃保温10分钟后，返回至室温。
使用市售生物素化试剂盒(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所制)，根据规程中记载的方法，将市售的甲基胞嘧啶抗体(Aviva Systems Biology公司制)生物素标记。使所得的生物素标记甲基胞嘧啶抗体成为0.25μg/μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH 7.4)溶液而冷藏保存。
向经上述的热处理而得的反应液100μL中，添加将上述的生物素标记甲基胞嘧啶抗体溶液稀释5倍(0.05μg/μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH 7.4)溶液)后的溶液1μL，在室温下放置1小时，使含有目标DNA区域与5’末端FITC标记寡核苷酸和生物素标记甲基胞嘧啶抗体的检测复合体形成。
将上述而得的反应液转移到被抗生蛋白链菌素覆盖的8孔条(StreptaWell、#11645692001、罗氏公司)，在室温下放置1小时，通过生物素-抗生物蛋白链菌素结合，在8孔条固定化含有目标DNA区域、5’末端FITC标记寡核苷酸和生物素标记甲基胞嘧啶抗体的检测复合体。之后，通过移液去除溶液，将各孔以清洗缓冲液[0.05％Tween20含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4·7H2O、154mM NaCl pH 7.4)]200μL清洗3次。
之后，向各孔中以100μL的比例添加HRP标记FITC抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories公司制、0.005μg/100μL 0.1％BSA含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH 7.4)溶液]后，在室温放置1小时。放置后，通过移液去除溶液，将各孔以清洗缓冲液[0.05％Tween20含有磷酸缓冲液(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4·7H2O、154mM NaCl pH 7.4)]200μL清洗3次。
向各孔中以100μL的比例，添加、混合基质(R&D公司制、#DY999)，开始反应。
再室温下放置25分钟，向各孔中以50μL的比例添加停止溶液(2NH2SO4水溶液)，停止反应。在反应停止后30分钟以内测定450nm的吸光度，对所得的测定值算出双份的平均值。
另一方面，通过实时PCR对经上述的酶处理(MspI处理)所得的溶液中的DNA进行定量。
作为浓度测定用标准样品，如下所示制备了MspI处理人基因组DNA溶液。制备人血液来源基因组DNA(Human Genomic DNA、#636401、克隆技术(Clontech)公司)的TE缓冲液的5ng/μL TE缓冲液，将该溶液20μL、限制性酶MspI 2U、与MspI最适的10x缓冲液(100mM Tris-HCl pH 7.5、100mM MgCl2、10mM二硫苏糖醇、500mM NaCl)5μL混合，向其中添加灭菌超纯水使液量为50μL而对各处理制备了反应液，将该反应液在37℃孵育1小时，对于得到的反应液，通过基于TE缓冲液的稀释，制备了10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、1、10ng/5μL的溶液。
扩增在作为人转座子而周知的Alu区域设计的目标DNA区域(W、序列编号39、与基因库检索号No.AF458110所示碱基编号178-262相当的区域)，为了通过实时PCR进行定量，设计含有序列编号62所示的碱基序列的的正向引物(F)和含有序列编号63所示的碱基序列的反向引物(R)。
<目标DNA区域>
W：5’-CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCC-3’(序列编号39)
<正向引物>
F：5’-GGTGGCTCACGCCTGTAATC-3’(序列编号62)
<反向引物>
R：5’-GGATGGTCTCGATCTCCTGAC-3’(序列编号63)
作为PCR的反应液，使用如下的反应液，即，混合成为模板的上述制备的MspI处理人基因组DNA溶液5μL或上述制备的浓度测定用标准样品、含有序列编号62和序列编号63所示的碱基序列的引物的5μM溶液各1.5μL、SYBRGreen I(龙沙公司)0.1x量、each 2mM dNTP 2.5μL、10xPCR缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％明胶)2.5μL和耐热性DNA聚合酶(AmpliTaq Gold，5U/μL，ABI公司)0.125μL，向其中添加灭菌超纯水使液量为25μL而得的反应液。实时PCR使用Mx3005P(Stratagene公司)进行实施。将该该反应液在95℃保温10分钟后，再通过以在95℃下30秒钟、在61℃下30秒钟、在72℃45秒钟为1个循环而进行40个循环，从而将目标DNA区域扩增。通过该实时PCR的结果，定量血清样品中的DNA。
将其结果示于图19和图20。通将利用本方法而得的测定值与通过实时PCR而定量了的值进行比较，结果显示有相关性(相关系数：R＝0.62)(图19)。另外，将对57岁以下的人血清样品的定量结果，在癌症患者和健康者之间进行比较，结果显示，与健康者相比较，癌症患者中的血清中DNA浓度上升(图20)。
在本实验中可知，形成、选择了甲基胞嘧啶抗体、被甲基化了的DNA片断和5’末端生物素标记寡核苷酸的复合体，通过其功能检测复合体中的甲基胞嘧啶抗体，从而可以灵敏度良好地对人血清中游离DNA进行检测·定量。另外显示，57岁以下的癌症患者和健康者中，血清中DNA浓度不同，进而通过本方法可以更加简单地检测出其差。
产业上利用的可能性
通过本发明，可以提供能对具有目标DNA区域的DNA简便进行定量或检测的方法。另外，可以提供使用被检者来源的标本(优选血清)，并根据对该标本的结果和健康者来源的标本的结果加以比较，来选出癌症患者来源的标本的方法等。
序列表文本
序列编号17～63
设计的寡核苷酸
Figure IPA00001307659900011
Figure IPA00001307659900031
Figure IPA00001307659900051
Figure IPA00001307659900061
Figure IPA00001307659900081
Figure IPA00001307659900091
Figure IPA00001307659900101
Figure IPA00001307659900111
Figure IPA00001307659900121
Figure IPA00001307659900161
Figure IPA00001307659900181
Figure IPA00001307659900191
Figure IPA00001307659900201
Figure IPA00001307659900211
Figure IPA00001307659900221
Figure IPA00001307659900231
Figure IPA00001307659900241
Figure IPA00001307659900251
Figure IPA00001307659900261
Figure IPA00001307659900271
Figure IPA00001307659900281
Figure IPA00001307659900291
Figure IPA00001307659900301

Claims (17)

1.一种方法，其是对标本中所含的具有目标DNA区域的DNA进行定量或检测的方法，其特征在于，具有以下工序：
(1)从标本制备要检测目标DNA区域的DNA的第一工序；
(2)用DNA甲基化酶对由第一工序制备的DNA进行处理的第二工序；
(3)从经第二工序处理了的DNA制备单链甲基化DNA，使该单链甲基化DNA与检测寡核苷酸结合，得到被测DNA复合体的第三工序；
(4)使由第三工序得到的被测DNA复合体与固定化甲基化DNA抗体相结合，得到检测复合体的第四工序；以及，
(5)对由第四工序得到的检测复合体中所含的检测寡核苷酸，利用其识别功能进行定量或检测，从而对上述单链DNA中的具有目标DNA区域的DNA进行定量或检测的第五工序。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在由第三工序得到被测DNA复合体时，添加反向寡核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，固定化甲基化DNA抗体为甲基胞嘧啶抗体。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，DNA甲基化酶为胞嘧啶甲基化酶或SssI甲基化酶。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，标本中所含的具有目标DNA区域的DNA为从RNA通过逆转录酶而生成的DNA中的具有目标DNA区域的DNA。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，标本为下述任一种生物来源的标本：
(a)哺乳动物来源的血液、体液、粪尿、体分泌物、细胞溶解液或组织溶解液、
(b)从选自哺乳动物来源的血液、体液、粪尿、体分泌物、细胞溶解液及组织溶解液的一种中提取的DNA、
(c)将从选自哺乳动物来源的组织、细胞、组织溶解液及细胞溶解液的一种中提取的RNA作为模板而制得的DNA、
(e)从细菌、真菌或病毒提取的DNA、或
(f)将从细菌、真菌或病毒提取的RNA作为模板而制得的DNA。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，由第一工序得到的上述具有目标DNA区域的DNA为事先用不以目标DNA区域为识别剪切位点的限制性酶消化处理而得的DNA、合成寡核苷酸、或精制而成的DNA。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，检测寡核苷酸的识别功能是以下任一种的识别功能：
(a)FITC的荧光检测、或
(b)利用FITC抗体的检测。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，检测寡核苷酸包括人基因组中的重复序列、重复基因或假基因的碱基序列或者能够与其一部分相互补结合的碱基序列。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，人基因组中的重复序列为LINE或SINE。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，检测寡核苷酸包括能够与以下所示任一种碱基序列相互补结合的碱基序列：
(1)序列编号37所示的碱基序列或与其有80％以上序列一致性的碱基序列、
(2)序列编号37所示碱基序列的互补序列或与其有80％以上序列一致性的碱基序列、
(3)序列编号39所示的碱基序列或与其有80％以上序列一致性的碱基序列、或
(4)序列编号39所示碱基序列的互补序列或与其有80％以上序列一致性的碱基序列。
12.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，检测寡核苷酸包括以下所示的任一种的碱基序列：
(1)序列编号38所示的碱基序列或与其有80％以上序列一致性的碱基序列、
(2)序列编号38所示碱基序列的互补序列或与其有80％以上序列一致性的碱基序列、
(3)序列编号40所示的碱基序列或与其有80％以上序列一致性的碱基序列、或
(4)序列编号40所示碱基序列的互补序列或与其有80％以上序列一致性的碱基序列。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，第一工序中，在用于从标本制备DNA的DNA提取操作中所使用的溶液中的钠盐的浓度为100mM以上1000mM以下。
14.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，第一工序中，在用于从标本制备DNA的DNA提取操作中所使用的溶液中的钠盐的浓度为100mM以上200mM以下。
15.一种方法，其是筛选癌患者来源标本的方法，其中，包括以下工序：
通过权利要求1～14中任一项所述的方法使用被检者来源的标本而定量或检测的DNA的定量结果或检测结果，与通过相同方法使用健康者来源标本而定量或检测的DNA的定量结果或检测结果之间的差异如有显著性意义，则将被检者来源标本评价为癌患者来源标本，根据该评价结果来鉴定癌患者来源标本。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，标本为哺乳动物来源的血清。
17.根据权利要求15～16中任一项所述的方法，其中，具有目标DNA区域的DNA为哺乳动物来源血清中的具有目标DNA区域的游离DNA。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105223346A (zh) * 2014-06-16 2016-01-06 北京雅康博生物科技有限公司 检测dna甲基化的方法和试剂盒
CN106795562A (zh) * 2014-07-18 2017-05-31 香港中文大学 Dna混合物中的组织甲基化模式分析
US11435339B2 (en) 2016-11-30 2022-09-06 The Chinese University Of Hong Kong Analysis of cell-free DNA in urine

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130115616A1 (en) * 2010-07-15 2013-05-09 Hitachi Chemical Research Center, Inc. Detection of nucleic acids by agglutination
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
WO2014204578A1 (en) 2013-06-21 2014-12-24 The General Hospital Corporation Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing
KR20230157540A (ko) 2013-03-15 2023-11-16 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 Rna-안내 게놈 편집을 위해 특이성을 증가시키기 위한 절단된 안내 rna(tru-grnas)의 이용
US9662649B2 (en) 2013-05-06 2017-05-30 Hitachi Chemical Company America, Ltd. Devices and methods for capturing target molecules
CN106459995B (zh) 2013-11-07 2020-02-21 爱迪塔斯医药有限公司 使用统治型gRNA的CRISPR相关方法和组合物
WO2015108177A1 (ja) 2014-01-20 2015-07-23 富士レビオ株式会社 ガイドプローブを用いた修飾核酸塩基の測定方法およびそのためのキット
US10266895B2 (en) 2014-11-05 2019-04-23 Hitachi Chemical Company Ltd. Exosomes and microvesicles in intestinal luminal fluids and stool and use of same for the assessment of inflammatory bowel disease
US9926546B2 (en) 2015-08-28 2018-03-27 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
US9512446B1 (en) 2015-08-28 2016-12-06 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
WO2017040520A1 (en) 2015-08-31 2017-03-09 Hitachi Chemical Co., Ltd. Molecular methods for assessing urothelial disease
WO2020165361A1 (en) * 2019-02-14 2020-08-20 Vib Vzw Retrotransposon biomarkers

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002101353A2 (en) * 2001-06-08 2002-12-19 U.S. Genomics, Inc. Methods and products for analyzing nucleic acids based on methylation status
JP3854943B2 (ja) * 2003-05-23 2006-12-06 独立行政法人科学技術振興機構 Ｄｎａメチル化率の測定方法
JP4688792B2 (ja) * 2004-02-20 2011-05-25 独立行政法人科学技術振興機構 Ｄｎａメチル化分析用ｄｎａアレイ及びその製造方法並びにｄｎａメチル化分析方法
EP1693468A1 (en) * 2005-02-16 2006-08-23 Epigenomics AG Method for determining the methylation pattern of a polynucleic acid
US20080124735A1 (en) * 2006-10-16 2008-05-29 Matthias Schuster Method for detection of one or more CpG positions

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105223346A (zh) * 2014-06-16 2016-01-06 北京雅康博生物科技有限公司 检测dna甲基化的方法和试剂盒
CN106795562A (zh) * 2014-07-18 2017-05-31 香港中文大学 Dna混合物中的组织甲基化模式分析
US11062789B2 (en) 2014-07-18 2021-07-13 The Chinese University Of Hong Kong Methylation pattern analysis of tissues in a DNA mixture
CN106795562B (zh) * 2014-07-18 2022-03-25 香港中文大学 Dna混合物中的组织甲基化模式分析
US11984195B2 (en) 2014-07-18 2024-05-14 The Chinese University Of Hong Kong Methylation pattern analysis of tissues in a DNA mixture
US11435339B2 (en) 2016-11-30 2022-09-06 The Chinese University Of Hong Kong Analysis of cell-free DNA in urine

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