CN102037140A - Dna甲基化测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及对生物来源标本中所含的基因组DNA中的目标DNA区域中甲基化后的DNA的含量对进行测定的方法等。

Description

DNA甲基化测定方法

技术领域

本发明涉及对生物来源标本所含的基因组DNA中的目标DNA区域中甲基化后的DNA的含量进行测定的方法等。

背景技术

作为用于对生物来源标本中所含的基因组DNA中的目标DNA区域中DNA的甲基化状态进行评价的方法，例如有对基因组DNA中的目标DNA区域中甲基化后的DNA的含量进行测定的方法(例如参照Nucleic Acids Res(核酸研究).1994 Aug 11；22(15)：2990-7、及Proc Natl Acad Sci U S A.1997Mar 18；94(6)：2284-9)。在该测定方法中，首先，需要从基因组DNA来源的DNA试样中提取包含目标DNA区域的DNA，提取操作繁杂。

另外，作为对所提取的DNA的目标区域中甲基化后的DNA的含量进行测定的方法，例如已知有(1)在使用亚硫酸盐等修饰该DNA之后供于利用DNA聚合酶的DNA合成的链反应(Polymerase Chain Reaction(聚合酶链式反应)；以下也会记为PCR。)，由此对目标区域进行扩增的方法；(2)使用甲基化敏感性限制酶将该DNA消化之后，供于PCR，由此对目标区域进行扩增的方法等。这些方法均在用于检测甲基化的DNA的修饰及随后的产物的纯化、用于PCR的反应体系的制备、DNA的扩增的确认等方面耗费工夫。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种对生物来源标本所含的基因组DNA中的目标DNA区域中的被甲基化了的DNA的含量进行简便测定的方法等。

即，本发明提供如下所示的发明。

[发明1]

一种对生物来源标本所含的基因组DNA中的目标DNA区域中的被甲基化了的DNA的含量进行测定的方法，其具有：

(1)第一工序，对生物来源标本所含的基因组DNA来源的DNA试样实施利用甲基化敏感性限制酶的消化处理；

(2)第二工序，从在第一工序中得到的经过消化处理的DNA试样取得甲基化后的单链DNA，使该单链DNA和固定化甲基化DNA抗体结合而选择单链DNA；及

(3)第三工序，具有前步骤和本步骤，作为下述的各本步骤的前步骤，具有：将由第二工序选择的单链DNA从固定化固定化甲基化DNA抗体分离而成为单链状态的DNA(正链)的步骤(第一前步骤)；

使用在第一前步骤中成为单链状态的基因组来源的DNA(正链)，并使用延伸引物(正向引物)作为延伸引物，使该延伸引物延伸一次，由此使包含目标DNA区域的单链DNA(正链)延伸形成为双链DNA的工序(第二前步骤)，所述延伸引物(正向引物)中有相对于单链状态的DNA(正链)所具有的碱基序列的部分碱基序列(正链)具有互补性的碱基序列(负链)，该部分碱基序列(正链)与上述目标DNA区域的碱基序列(正链)的3’末端相比更靠近3’末端侧；和

将在第二前步骤中延伸形成了的双链DNA，暂时分离成包含目标DNA区域的单链DNA(正链)和包含相对于目标DNA区域具有互补性的碱基序列的单链DNA(负链)的工序(第三前步骤)；

并且，作为本步骤，具有：

(a)第A步骤(本步骤)，其以生成的包含目标DNA区域的单链DNA(正链)为模板，将上述正向引物用作延伸引物，使该延伸引物延伸一次，由此使上述的包含目标DNA区域的单链DNA延伸形成为双链DNA；和

(b)第B步骤(本步骤)，其以包含相对于已生成的目标DNA区域具有互补性的碱基序列的单链DNA(负链)为模板，以延伸引物(反向引物)为延伸引物，使该延伸引物延伸一次，由此使上述的包含目标DNA区域的单链DNA延伸形成为双链DNA，所述延伸引物(反向引物)中有相对于包含与上述目标DNA区域具有互补性的碱基序列的单链DNA(负链)所具有的碱基序列的部分碱基序列(负链)具有互补性的碱基序列(正链)，该部分碱基序列(负链)与相对于上述目标DNA区域的碱基序列(正链)具有互补性的碱基序列(负链)的3’末端相比更靠近3’末端侧；

进而在将由上述各本步骤得到的经延伸形成的双链DNA暂时分离成单链状态之后反复进行第三工序的各本步骤，由此对上述目标DNA区域中甲基化后的DNA进行扩增直至达到可以检测的量，对被扩增的DNA的量进行定量。

[发明2]

就发明1记载的方法而言，固定化固定化甲基化DNA抗体是甲基胞嘧啶抗体。

[发明3]

就发明1或2记载的方法而言，生物来源标本为哺乳动物的血液、体液、血清、血浆、细胞溶解液或组织溶解液。

[发明4]

就发明1～3中任意发明记载的方法而言，生物来源标本中所含的基因组DNA来源的DNA试样，是预先用不将该基因组DNA所具有的目标DNA区域作为识别切断部位的限制酶实施消化处理而成的DNA试样、或预先纯化而成的DNA试样。

[发明5]

就发明1～4中任意发明记载的方法而言，第一工序具有：

通过混合含有目标DNA区域的单链DNA(正链)、和含有与甲基化敏感性限制酶的识别部位的碱基序列互补的碱基序列的蔽光(masking)用寡核苷酸，选择该甲基化敏感性限制酶的识别部位被保护而成的单链DNA的第一(A)步骤、和

用甲基化敏感性限制酶对由第一(A)步骤选择的单链DNA进行消化处理的第一(A)步骤。

[发明6]

就发明1～5中任意发明记载的方法而言，甲基化敏感性限制酶是在生物来源标本中所含的基因组DNA所具有的目标DNA区域中具有识别切断部位的限制酶、或HhaI。

[发明7]

就发明1～6中任意发明记载的方法而言，不进行第一工序中利用甲基化敏感性限制酶的消化处理而进行第二工序。

[发明8]

就发明1～7中任意发明记载的方法而言，第二工序具有：

将在第一工序中得到的经过消化处理的DNA试样中所含的甲基化后的双链DNA分离成甲基化后的单链DNA的第二(A)步骤、和

使在第二(A)步骤中得到的甲基化单链DNA和固定化甲基化DNA抗体结合的第二(B)步骤；

在利用第二(A)步骤将甲基化后的双链DNA分离成甲基化单链DNA时，添加反向寡核苷酸。

附图说明

图1是表示在实施例1中用PCR从所制备的样品扩增含有用序列编号23表示的碱基序列的区域中甲基化后的DNA，对得到的扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳得到的结果的图。

图中从最左的道起示出以下的标记物和样品的结果，即DNA标记物“MK”、HpaII的识别序列被甲基化的部分甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-M(7)溶液被实施了“A”处理的样品“M”、HpaII的识别序列的一部分未被甲基化的部分甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-HM(5)溶液被实施了“A”处理的样品“H”、未甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-UM溶液的被实施了“A”处理的样品“U”、HpaII的识别序列被甲基化的部分甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-M(7)溶液的被实施了“B”处理的样品“M”、HpaII的识别序列的一部分未被甲基化的部分甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-HM(5)溶液的被实施了“B”处理的样品“H”、未甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-UM溶液的被实施了“B”处理的样品“U”、HpaII的识别序列被甲基化的部分甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-M(7)溶液的被实施了“C”处理的样品“M”、HpaII的识别序列的一部分未被甲基化的部分甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-HM(5)溶液的被实施了“C”处理的样品“H”、未甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-UM溶液的被实施了“C”处理的样品“U”。

图2是表示在实施例2中用PCR从所制备的样品扩增含有用序列编号28表示的碱基序列的目标DNA区域中甲基化后的DNA，对得到的扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳得到的结果的图。图中从最左的道起示出如下的标记物和溶液的结果，即DNA标记物“MK”、甲基化后的DNA片段MX的溶液“MD”(阴性对照)、未被甲基化的DNA片段X的溶液“D”(阴性对照)、甲基化后的DNA片段MX的溶液“MC”、未被甲基化的DNA片段X的溶液“C”、甲基化后的DNA片段MX的溶液“MB”、未被甲基化的DNA片段X的溶液“B”、甲基化后的DNA片段MX的溶液“MA”、未被甲基化的DNA片段X的溶液“A”。

图3是表示在实施例3中用PCR从所制备的样品扩增含有用序列编号45表示的碱基序列的目标DNA区域中甲基化后的DNA，对得到的扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳得到的结果的图。图中从最左的道起示出如下的标记物和溶液的结果，即DNA标记物“MK”、甲基化后的DNA片段MY的溶液“MD”(负对照)、未被甲基化的DNA片段Y的溶液“D”(负对照)、甲基化后的DNA片段MY的溶液“MC”、未被甲基化的DNA片段Y的溶液“C”、甲基化后的DNA片段MY的溶液“MB”、未被甲基化的DNA片段Y的溶液“B”、甲基化后的DNA片段MY的溶液“MA”、未被甲基化的DNA片段Y的溶液“A”。

图4是表示在实施例4中用PCR从所制备的样品扩增含有用序列编号53表示的碱基序列的目标DNA区域中甲基化后的DNA，对得到的扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳得到的结果的图。图中从最左的道起示出如下的标记物和溶液的结果，即DNA标记物“MK”、甲基化后的DNA片段MT的溶液“MD”(阴性对照)、未被甲基化的DNA片段T的溶液“D”(阴性对照)、甲基化后的DNA片段MT的溶液“MC”、未被甲基化的DNA片段T的溶液“C”、甲基化后的DNA片段MT的溶液“MB”、未被甲基化的DNA片段T的溶液“B”、甲基化后的DNA片段MT的溶液“MA”、未被甲基化的DNA片段T的溶液“A”。

图5是表示在实施例5中用PCR从所制备的样品扩增含有用序列编号53表示的碱基序列的目标DNA区域中甲基化后的DNA，对得到的扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳得到的结果的图。图中从最左的道起示出如下的标记物和溶液的结果，即DNA标记物“MK”、甲基化酵母基因组DNA的溶液“MD”(阴性对照)、未被甲基化的酵母基因组DNA的溶液“D”(阴性对照)、甲基化酵母基因组DNA的溶液“MC”、未被甲基化的酵母基因组DNA的溶液“C”、甲基化酵母基因组DNA的溶液“MB”、未被甲基化的酵母基因组DNA的溶液“B”、甲基化酵母基因组DNA的溶液“MA”、未被甲基化的酵母基因组DNA的溶液“A”。

具体实施方式

作为本发明中的“生物来源标本”，例如可以举出细胞溶解液、组织溶解液(这里的组织是指包括血液、淋巴结等广义意思。)，或就哺乳动物而言，可以举出血浆、血清、淋巴液等体液，体分泌物(尿、乳汁等)等的生物体试样及从这些生物体试样提取得到的基因组DNA。另外，作为该生物来源标本，例如也可以举出微生物、病毒等来源的试样，此时，本发明中的“基因组DNA”是指微生物、病毒的基因组DNA。在哺乳动物来源的标本为血液的情况下，可以期待在定期健康诊断、简便的检查等中利用本发明。

为了从哺乳动物来源的标本得到基因组DNA，例如使用市售的DNA提取用试剂盒等提取DNA即可。

在使用血液作为标本的情况下，按照常用的方法从血液制备血浆或血清，将所制备的血浆或血清作为标本，对其中所含的游离DNA(包括胃癌细胞等癌细胞来源的DNA)进行分析时，可以避开血细胞来源的DNA对胃癌细胞等癌细胞来源的DNA进行解析，可以使检测胃癌细胞等癌细胞、含有其的组织等的灵敏度提高。

上述基因组DNA来源的DNA试样，可以是预先用不将该基因组DNA所具有的后述目标DNA区域作为识别切断部位的限制酶实施消化处理而成的DNA试样，或可以是预先由规定的方法纯化而成的DNA试样。

通常，构成基因(基因组DNA)的碱基有4种。在这些碱基当中，已知所谓仅是胞嘧啶被甲基化的现象，这样的DNA的甲基化修饰限于由5’-CG-3’表示的碱基序列(C表示胞嘧啶，G表示鸟嘌呤。以下，也会将该碱基序列记为“CpG”。)中的胞嘧啶。就胞嘧啶而言，被甲基化的部位是其5位。在细胞分裂之前进行DNA复制时，复制后马上成为仅是模板链的“CpG”中的胞嘧啶被甲基化的状态，在甲基转移酶的作用下立即将新生链的“CpG”中的胞嘧啶甲基化。因此，DNA的甲基化后的状态在DNA复制后也被直接传给新的2组DNA。本发明中的“甲基化后的DNA”是指通过这样的甲基化修饰而生成的DNA。

本发明中的“CpG对”是指由CpG表示的碱基序列和与其互补的CpG进行碱基配对而成的双链寡核苷酸。

本发明中的“目标DNA区域”(以下也记为目标区域)，是要调查该区域中所含的胞嘧啶有无甲基化的DNA区域，具有至少1种甲基化敏感性限制酶的识别部位。例如可以举出含有在赖氨酰氧化酶、HRAS样阻抑因子、bA305P22.2.1、γ-细丝蛋白、HAND1、RIKEN 2210016F16的同系物、FLJ32130、PPARG血管生成素相关蛋白、凝血调节蛋白、p53-应答基因2、微纤维蛋白2、神经丝蛋白3、解聚素及金属蛋白酶结构域23、G-蛋白偶联受体7、G-蛋白偶联生长抑素及血管紧张素样肽受体、溶质载体蛋白家族6神经递质转运蛋白去甲肾上腺素成员2等有用蛋白质基因的启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的CpG所示碱基序列中的一个以上的胞嘧啶的DNA的区域等。

具体而言，例如在有用蛋白质基因为赖氨酰氧化酶基因的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的赖氨酰氧化酶基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出用序列编号1表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AF270645记载的碱基序列的碱基编号16001～18661所示的碱基序列)。就序列编号1所示的碱基序列而言，对人来源的赖氨酰氧化酶蛋白质的氨基末端的蛋氨酸进行编码的ATG密码子，用碱基编号2031～2033表示，上述外显子1的碱基序列用碱基编号1957～2661表示，在序列编号1所示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，特别是序列编号1所示的碱基序列中在CpG密集存在的区域中存在的CpG中的胞嘧啶，例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胃癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号1表示的碱基序列中用碱基编号1539、1560、1574、1600、1623、1635、1644、1654、1661、1682、1686、1696、1717、1767、1774、1783、1785、1787、1795等表示的胞嘧啶。

另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为HRAS样阻抑因子基因的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的HRAS样阻抑因子基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出用序列编号2表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AC068162记载的碱基序列的碱基编号172001～173953表示的碱基序列。)。就序列编号2表示的碱基序列而言，人来源的HRAS样阻抑因子基因的外显子1的碱基序列用碱基编号1743～1953表示。在序列编号2表示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，特别是序列编号2表示的碱基序列中在CpG密集存在的区域中存在的CpG中的胞嘧啶，例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胃癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号2表示的碱基序列中用碱基编号1316、1341、1357、1359、1362、1374、1390、1399、1405、1409、1414、1416、1422、1428、1434、1449、1451、1454、1463、1469、1477、1479、1483、1488、1492、1494、1496、1498、1504、1510、1513、1518、1520等表示的胞嘧啶。

另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为bA305P22.2.1基因的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的bA305P22.2.1基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号3表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AL121673记载的碱基序列的碱基编号13001～13889表示的碱基序列。)。就序列编号3表示的碱基序列而言，对人来源的bA305P22.2.1蛋白质的氨基末端的蛋氨酸进行编码的ATG密码子，用碱基编号849～851表示，上述外显子1的碱基序列用碱基编号663～889表示。在序列编号3表示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，特别是序列编号3表示的碱基序列中在CpG密集存在的区域中存在的CpG中的胞嘧啶，例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胃癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号3表示的碱基序列中用碱基编号329、335、337、351、363、373、405、424、427、446、465、472、486等表示的胞嘧啶。

另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为γ-细丝蛋白基因的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的γ-细丝蛋白基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号4表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AC074373记载的碱基序列的碱基编号63528～64390表示的碱基序列的互补序列)。就序列编号4表示的碱基序列而言，对人来源的γ-细丝蛋白质的氨基末端的蛋氨酸进行编码的ATG密码子，用碱基编号572～574表示，上述外显子1的碱基序列用碱基编号463～863表示。在序列编号4表示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，特别是序列编号4表示的碱基序列中在CpG密集存在的区域中存在的CpG中的胞嘧啶，例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胃癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号4表示的碱基序列中用碱基编号329、333、337、350、353、360、363、370、379、382、384、409、414、419、426、432、434、445、449、459、472、474、486、490、503、505等表示的胞嘧啶。

另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为HAND1基因的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的HAND1基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号5表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AC026688记载的碱基序列的碱基编号24303～26500表示的碱基序列的互补序列)。就序列编号5表示的碱基序列而言，对人来源的HAND1蛋白质的氨基末端的蛋氨酸进行编码的ATG密码子，用碱基编号1656～1658表示，上述外显子1的碱基序列用碱基编号1400～2198表示。在序列编号5表示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，特别是序列编号5表示的碱基序列中在CpG密集存在的区域中存在的CpG中的胞嘧啶，例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胃癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号5表示的碱基序列中用碱基编号1153、1160、1178、1187、1193、1218、1232、1266、1272、1292、1305、1307、1316、1356、1377、1399、1401、1422、1434等表示的胞嘧啶。

另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为RIKEN 2210016F16基因的同系物的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的RIKEN 2210016F16基因的同系物的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号6表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AL354733记载的碱基序列的碱基编号157056～159000表示的碱基序列的互补碱基序列。)。就序列编号6表示的碱基序列而言，人来源的RIKEN 2210016F16基因的同系物的外显子1的碱基序列用碱基编号1392～1945表示。在序列编号6表示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，特别是序列编号6表示的碱基序列中在CpG密集存在的区域中存在的CpG中的胞嘧啶，例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胃癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号6表示的碱基序列中用碱基编号1172、1175、1180、1183、1189、1204、1209、1267、1271、1278、1281、1313、1319、1332、1334、1338、1346、1352、1358、1366、1378、1392、1402、1433、1436、1438等表示的胞嘧啶。

另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为FLJ32130基因的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的FLJ32130基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号7表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AC002310记载的碱基序列的碱基编号1～2379表示的碱基序列的互补碱基序列)。就序列编号7表示的碱基序列而言，对人来源的FLJ32130蛋白质的氨基酸末端的蛋氨酸进行编码的ATG密码子，用碱基编号2136～2138表示，认为是上述外显子1的碱基序列用碱基编号2136～2379表示。在序列编号7表示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，特别是序列编号7表示的碱基序列中在CpG密集存在的区域中存在的CpG中的胞嘧啶，例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胃癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号7表示的碱基序列中用碱基编号1714、1716、1749、1753、1762、1795、1814、1894、1911、1915、1925、1940、1955、1968等表示的胞嘧啶。

另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为PPARG血管生成素相关蛋白基因的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的PPARG血管生成素相关蛋白基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号8表示的碱基序列。就序列编号8表示的碱基序列而言，对人来源的PPARG血管生成素相关蛋白质的氨基末端的蛋氨酸进行编码的ATG密码子，用碱基编号717～719表示，上述外显子1的5’侧部分的碱基序列用碱基编号1957～2661表示。在序列编号8表示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，特别是序列编号8表示的碱基序列中在CpG密集存在的区域中存在的CpG中的胞嘧啶，例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胃癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号8表示的碱基序列中用碱基编号35、43、51、54、75、85、107、127、129、143、184、194、223、227、236、251、258等表示的胞嘧啶。

另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为凝血调节蛋白基因的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的凝血调节蛋白基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号9表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AF495471记载的碱基序列的碱基编号1～6096表示的碱基序列)。就序列编号9表示的碱基序列而言，对人来源的凝血调节蛋白质的氨基末端的蛋氨酸进行编码的ATG密码子，用碱基编号2590～2592表示，上述外显子1的碱基序列用碱基编号2048～6096表示。在序列编号9表示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，特别是序列编号9表示的碱基序列中在CpG密集存在的区域中存在的CpG中的胞嘧啶，例如表示胃癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胃癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号9表示的碱基序列中用碱基编号1539、1551、1571、1579、1581、1585、1595、1598、1601、1621、1632、1638、1645、1648、1665、1667、1680、1698、1710、1724、1726、1756等表示的胞嘧啶。

另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为p53-应答基因2基因的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的p53-应答基因2基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号10表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AC009471记载的碱基序列的碱基编号113501～116000表示的碱基序列的互补序列。)。就序列编号10表示的碱基序列而言，人来源的p53-应答基因2基因的外显子1的碱基序列用碱基编号1558～1808表示。在序列编号10表示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，例如表示胰腺癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胰腺癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号10表示的碱基序列中用碱基编号1282、1284、1301、1308、1315、1319、1349、1351、1357、1361、1365、1378、1383等表示的胞嘧啶。

另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为微纤维蛋白2基因的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的微纤维蛋白2基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号11表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AC113387记载的碱基序列的碱基编号118801～121000表示的碱基序列的互补序列)。就序列编号11表示的碱基序列而言，人来源的微纤维蛋白2基因的外显子1的碱基序列用碱基编号1091～1345表示。在序列编号11表示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，例如表示胰腺癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胰腺癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号11表示的碱基序列中用碱基编号679、687、690、699、746、773、777、783、795、799、812、823、830、834、843等表示的胞嘧啶。

另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为神经丝蛋白3基因的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的神经丝蛋白3基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号12表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AF106564记载的碱基序列的碱基编号28001～30000表示的碱基序列的互补序列)。就序列编号12表示的碱基序列而言，人来源的神经丝蛋白3基因的外显子1的碱基序列用碱基编号614～1694表示。在序列编号12表示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，例如表示胰腺癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胰腺癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号12表示的碱基序列中用碱基编号428、432、443、451、471、475、482、491、499、503、506、514、519、532、541、544、546、563、566、572、580等表示的胞嘧啶。

另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为解聚素及金属蛋白酶结构域23基因的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的解聚素及金属蛋白酶结构域23基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号13表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AC009225记载的碱基序列的碱基编号21001～23300表示的碱基序列)。就序列编号13表示的碱基序列而言，人来源的解聚素及金属蛋白酶结构域23基因的外显子1的碱基序列，用碱基编号1194～1630表示。在序列编号13表示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，例如表示胰腺癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胰腺癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号13表示的碱基序列中用碱基编号998、1003、1007、1011、1016、1018、1020、1026、1028、1031、1035、1041、1043、1045、1051、1053、1056、1060、1066、1068、1070、1073、1093、1096、1106、1112、1120、1124、1126等表示的胞嘧啶。

另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为G蛋白偶联受体7基因的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的G蛋白偶联受体7基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号14表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AC009800记载的碱基序列的碱基编号75001～78000表示的碱基序列)。就序列编号14表示的碱基序列而言，人来源的G蛋白偶联受体7基因的外显子1的碱基序列，用碱基编号1666～2652表示。在序列编号14表示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，例如表示胰腺癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胰腺癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号14表示的碱基序列中用碱基编号1480、1482、1485、1496、1513、1526、1542、1560、1564、1568、1570、1580、1590、1603、1613、1620等表示的胞嘧啶。

另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为G-蛋白偶联生长抑素及血管紧张素样肽受体基因的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的G-蛋白偶联生长抑素及血管紧张素样肽受体基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号15表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AC008971记载的碱基序列的碱基编号57001～60000表示的碱基序列的互补序列)。就序列编号15表示的碱基序列而言，人来源的G-蛋白偶联生长抑素及血管紧张素样肽受体基因的外显子1的碱基序列，用碱基编号776～2632表示。在序列编号15表示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，例如表示胰腺癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胰腺癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号15表示的碱基序列中用碱基编号470、472、490、497、504、506、509、514、522、540、543、552、566、582、597、610、612等表示的胞嘧啶。

另外，具体而言，例如在有用蛋白质基因为溶质载体家族6神经递质转运蛋白去甲肾上腺素成员2基因的情况下，作为含有在其启动子区域、非翻译区域或翻译区域(编码区域)的碱基序列中存在的、用CpG表示的碱基序列一个以上的碱基序列，可以举出含有人来源的溶质载体家族6神经递质转运蛋白去甲肾上腺素成员2基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以举出序列编号16表示的碱基序列(相当于基因库检索号No.AC026802记载的碱基序列的碱基编号78801～81000表示的碱基序列的互补序列。)。就序列编号16表示的碱基序列而言，人来源的溶质载体家族6神经递质转运蛋白去甲肾上腺素成员2基因的外显子1的碱基序列，用碱基编号1479～1804表示。在序列编号16表示的碱基序列中存在的用CpG表示的碱基序列中的胞嘧啶，例如表示胰腺癌细胞等癌细胞中甲基化频度高(即高甲基化状态(hypermethylation))。进一步更具体而言，作为胰腺癌细胞中甲基化频度高的胞嘧啶，例如可以举出序列编号16表示的碱基序列中用碱基编号1002、1010、1019、1021、1051、1056、1061、1063、1080、1099、1110、1139、1141、1164、1169、1184等表示的胞嘧啶。

“甲基化DNA抗体”是指以DNA中甲基化后的碱基为抗原而结合的抗体。具体是甲基胞嘧啶抗体，可以举出具有识别单链DNA中的5位被甲基化后的胞嘧啶并结合的性质的抗体。另外，即便是市售的甲基化DNA抗体，只要是特异性识别本专利记载的甲基化状态的DNA并能特异性结合的抗体即可。

甲基化DNA抗体可以将甲基化后的碱基、甲基化DNA等作为抗原并利用普通的方法作成。具体而言，为了作成甲基胞嘧啶抗体，通过从以5-甲基胞苷、5-甲基胞嘧啶、或含有5-甲基胞嘧啶的DNA等为抗原而制作的抗体，以对DNA中的甲基胞嘧啶的特异结合为指标而选出，由此可以。

有作为对动物施以抗原免疫而得到的抗体，在用纯化后的抗原进行了免疫之后，利用IgG组分的抗体(多克隆抗体)的方法；利用生产单克隆的抗体(单克隆抗体)的方法。本专利中优选能够特异性识别甲基化DNA、或甲基胞嘧啶的抗体，所以优选利用单克隆抗体。

作为制作单克隆抗体的方法，可以举出利用细胞融合法的方法。例如，细胞融合法通过使免疫后的小鼠来源的脾细胞(B细胞)和骨髓瘤细胞发生细胞融合而制作杂交瘤，选出杂交瘤生产的抗体，可以制作甲基胞嘧啶抗体(单克隆抗体)。在利用细胞融合法制作单克隆抗体的情况下，没有必要纯化抗原，例如将5-甲基胞苷、5-甲基胞嘧啶、或含有5-甲基胞嘧啶的DNA等的混合物作为抗原，可以给用于免疫的动物使用。作为给药方法，将5-甲基胞苷、5-甲基胞嘧啶、或含有5-甲基胞嘧啶的DNA等直接对产生抗体的小鼠使用。在难以产生抗体的情况下，可以使抗原与支持体结合进行免疫。另外，通过将佐剂溶液(例如混合液体石蜡和Aracel A并混合结核菌的死菌作为佐剂得到的溶液)和抗原充分混合，参入脂质体使其免疫，由此可以提高抗原的免疫性。或者，有等量添加含有抗原的溶液和佐剂溶液，充分成为乳液状之后，向小鼠的皮下或腹腔内注射的方法；在与明矾水充分混合之后，以百日咳死菌为佐剂并添加的方法。另外，也可以在经最初的免疫之后经过合适的期间后，对小鼠的腹腔内或静脈内追加免疫。另外，在抗原量少的情况下，可以将抗原悬浮的溶液直接注入小鼠脾脏进行免疫。

自最终免疫起数日后摘除脾脏并剥离脂肪组织之后，制作脾细胞悬浮液。使该脾细胞和例如HGPRT缺失骨髓瘤细胞发生细胞融合而制作杂交瘤。作为细胞融合剤，只要是可以将脾细胞(B细胞)和骨髓瘤细胞有效融合的方法即可，例如可以举出使用仙台病毒(HVJ)、聚乙二醇(PEG)的方法等。另外，可以利用使用高电压脉冲的方法进行细胞融合。

在细胞融合操作之后，用HAT培养基进行培养，选择脾细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂交瘤的克隆，等待细胞发育直到可以筛选。就用于选择生产目标抗体的杂交瘤的抗体的检测法、抗体效价的测定法，可以利用抗原抗体反应体系。具体而言，在针对可溶性抗原的抗体测定法中，可以举出放射性同位素免疫定量法(RIA)、酶免疫定量法(ELISA)等。

如果在单链DNA中存在的CpG有一处以上被甲基化，则可以与抗甲基化抗体结合。因此，本发明中的“甲基化后的单链DNA”是指在单链DNA中存在的CpG一处以上被甲基化的单链DNA，并非仅指在单链DNA中存在的CpG全部被甲基化的单链DNA。

本发明中的“(扩增至可以检测出目标DNA区域中被甲基化的DNA的量)扩增的DNA的量”，是指生物来源标本中所含的基因组DNA中的目标区域中的甲基化后的DNA的扩增后的量本身，即，在本发明的后述的第三工序中求出的量。例如，在生物来源标本是1mL的血清的情况下，是指根据血清1mL中所含的上述甲基化后的DNA而扩增的DNA的量。

在第一工序中，对生物来源标本中所含的基因组DNA来源的DNA试样实施利用甲基化敏感性限制酶的消化处理。

“甲基化敏感性限制酶”例如是指不消化包含甲基化后的胞嘧啶的识别序列，而仅消化包含未被甲基化的胞嘧啶的识别序列的限制酶等。即，在是甲基化敏感性限制酶原本能够识别的识别序列中所含的胞嘧啶已被甲基化的DNA的情况下，即便使该甲基化敏感性限制酶作用于该DNA，该DNA也不会被切断。与此相对，在是甲基化敏感性限制酶原本能够识别的识别序列中所含的胞嘧啶未被甲基化的DNA的情况下，只要使该甲基化敏感性限制酶作用于该DNA作用，该DNA就被切断。作为这样的甲基化敏感性酶的具体的例，例如可以举出在生物来源标本中所含的基因组DNA所具有的目标DNA区域中具有识别切断部位的限制酶即HpaII、BstUI、NarI、SacII、HhaI等。另外，上述的甲基化敏感性限制酶已经被Gruenbaum等明确(Nucleic Acid Research，9、2509-2515)。

作为调查有无利用甲基化敏感性限制酶的消化的方法，具体而言，例如可以举出如下的方法，即以上述DNA为模板，使用可以对识别序列中含有作为解析对象的胞嘧啶的DNA进行扩增的引物对，进行PCR，来调查DNA有无扩增(扩增产物)的方法。在作为解析对象的胞嘧啶被甲基化的情况下，得到扩增产物。另一方面，在作为解析对象的胞嘧啶未被甲基化的情况下，未得到扩增产物。如此，通过对扩增后的DNA的量进行比较，可以测定成为解析对象的胞嘧啶的甲基化比例。

即，如果生物来源标本中所含的基因组DNA被甲基化，则通过所谓上述的甲基化敏感性限制酶不切断甲基化状态的DNA的特性，可以区分在上述的生物来源标本中所含的基因组DNA中的上述的甲基化敏感性限制酶的识别部位中存在的CpG对中的胞嘧啶是否被甲基化。即，通过用上述的甲基化敏感性限制酶进行消化处理，如果在生物来源标本中所含的基因组DNA中的上述的甲基化敏感性限制酶识别部位中存在的至少一个CpG对中的胞嘧啶未被甲基化，则被该甲基化敏感性限制酶切断。另外，如果在生物来源标本中所含的基因组DNA中的上述的甲基化敏感性限制酶的识别部位中存在的全部CpG对中的胞嘧啶已被甲基化，则不会被该甲基化敏感性限制酶切断。因此，在实施了消化处理之后，如后所述，通过实施使用了可以对上述目标DNA区域进行扩增的一对引物的PCR，如果在生物来源标本中所含的基因组DNA中的上述限制酶的识别部位中存在的至少一个CpG对中的胞嘧啶未被甲基化，则不会得到PCR的扩增产物，另一方面，如果在生物来源标本中所含的基因组DNA中的上述甲基化敏感性限制酶识别部位中存在的全部CpG对中的胞嘧啶已被甲基化，则会得到PCR的扩增产物。

具体而言，第一工序例如在生物来源标本中所含的基因组DNA是哺乳类来源的基因组DNA的情况下，如下所述实施即可。在哺乳类来源的基因组DNA中分别添加最合适的10×缓冲液(330mM Tris-乙酸酯pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM二硫苏糖醇)3μL、1mg/mL BSA水溶液3μL、甲基化敏感性限制酶HpaII或HhaI(10U/μL)等各1.5μL，接着向该混合物中加入灭菌超纯水，使液量为30μL，在37℃下孵育1小时～3小时即可。

另外，作为第一工序中的、甲基化敏感性限制酶处理的优选实施方式，可以举出添加掩蔽用寡核苷酸的方法。具体而言，可以由下述的步骤构成，即通过混合含有目标DNA区域的单链DNA(正链)、和含有与甲基化敏感性限制酶的识别部位的碱基序列互补的碱基序列的掩蔽用寡核苷酸，从而选择该甲基化敏感性限制酶的识别部位被保护而成的单链DNA的第一(A)步骤；和将在第一(A)步骤中选择的单链DNA用甲基化敏感性限制酶实施消化处理的第一(B)步骤。具体而言，例如在用于实施甲基化敏感性限制酶处理的溶液中添加掩蔽用寡核苷酸即可。

通过经过该第一(A)步骤和第一(A)步骤，即便生物来源标本中所含的基因组DNA来源的DNA试样为单链DNA，也可以由仅以双链DNA为基质的甲基化敏感性限制酶进行消化。另外，可以连续实施第一(A)步骤和第一(A)步骤，还可以同时实施。

“掩蔽用寡核苷酸”是指含有与甲基化敏感性限制酶的识别部位的碱基序列互补的碱基序列的寡核苷酸，通过与单链DNA中的目标DNA区域中所含的多个位点的甲基化敏感性限制酶的识别序列当中的至少1个位点(也可以是全部位点)互补的碱基配对，由此形成双链(即，上述位点为双链状态)，即便是仅以双链DNA为基质的甲基化敏感性限制酶也可以将上述位点消化，另外，在试样为单链DNA的情况下，可以提高利用能够消化单链DNA的甲基化敏感性限制酶(能够消化单链DNA的甲基化敏感性限制酶也能够消化双链DNA，就其消化效率而言，针对双链DNA的消化效率高于针对单链DNA的消化效率)的上述位点的消化效率，并且，是不会抑制含有目标区域的DNA的单链DNA和单链固定化寡核苷酸形成双链的寡核苷酸。另外，该掩蔽用寡核苷酸必须是无法用于以后述的反向引物(正链)为延伸引物、以该掩蔽用寡核苷酸(负链)为模板而使延伸引物延伸的反应的寡核苷酸。另外，作为碱基长，优选8～200的碱基长。

在基因组DNA来源的DNA试样中混合的掩蔽用寡核苷酸，可以是1种，也可以是多种。如果使用多种，含有目标DNA区域的单链DNA的甲基化敏感性限制酶的识别部位的大部分成为双链状态，可以将利用甲基化敏感性限制酶的、后述的“剩余未切的DNA”抑制在最小限。掩蔽用寡核苷酸，例如对应于目标DNA区域中所含的多个位点的甲基化敏感性限制酶的识别序列当中在甲基化的情况下未消化、而在未甲基化的情况下想要消化的位点(例如，疾病患者标本中被100％甲基化、健康人标本中100％未被甲基化的位点等)设计，使用其是特别有用的。

另外，作为第一工序中利用甲基化敏感性限制酶的消化处理的令人担心之处，可以举出对无法完全消化含有未被甲基化的胞嘧啶的识别序列(所谓“剩余未切的DNA”)的担心。在这样的担心成为问题的情况下，只要大量存在甲基化敏感性限制酶的识别部位，可以将“剩余未切的DNA”抑制在最小限，作为目标DNA区域，具有甲基化敏感性限制酶的识别部位一个以上，认为其识别部位越多越好。

另外，作为“生物来源标本中所含的基因组DNA来源的DNA试样”的优选方式之一，可举出预先用不将该基因组DNA所具有的目标DNA区域作为识别切断部位的限制酶实施消化处理而成的DNA试样。这里，在用固定化寡核苷酸选择生物来源标本中所含的基因组DNA的消化物的情况下，更容易选择短的模板DNA，另外，即便在用PCR对目标区域进行扩增的情况下，也认为模板DNA越短越好，所以可以将不以目标DNA区域为识别切断部位的限制酶直接用于生物来源标本中所含的基因组DNA来源的DNA试样而进行消化处理。另外，作为利用不以目标DNA区域为识别切断部位的限制酶实施消化处理的方法，使用一般的限制酶处理法即可。

之所以这些为优选实施方式，是因为通过预先用如上所述的限制酶对生物来源标本本身进行消化处理，可以高精度地要求甲基化量。该方法对于消除如上所述的“剩余未切的DNA”是有用的。

作为利用甲基化敏感性限制酶消化生物来源标本中所含的基因组DNA来源的试样的方法，在生物来源标本是基因组DNA自身的情况下，是与上述方法相同的方法即可，在生物来源标本是组织溶解液、细胞溶解液等的情况下，基于与上述方法相同的方法，使用大量过剩的甲基化敏感性限制酶、例如相当于25ng的DNA量为500倍量(10U)或其以上的甲基化敏感性限制酶实施消化处理即可。

基因组DNA基本上作为双链DNA存在。因此，就本操作而言，不仅可以使用能消化单链的甲基化敏感性限制酶(例如HhaI)，还可以使用能消化双链DNA的甲基化敏感性限制酶(例如HpaII、BstUI、NarI、SacII、HhaI等)。

另外，作为第一工序的实施方式，可以举出不实施利用能消化单链DNA的甲基化敏感性限制酶的消化处理而实施第二工序的实施方式等。在目标DNA区域没有被能消化单链DNA的甲基化敏感性限制酶切断的碱基序列的情况下，可以不实施第一工序而实施第二工序。

在本发明测定方法的第二工序中，从在第一工序中得到的经过消化处理的DNA试样取得甲基化后的单链DNA，使该单链DNA与固定化甲基化DNA抗体结合而选择单链DNA。另外，第二工序可以具有：将在第一工序中得到的经过消化处理的DNA试样中所含的甲基化后的双链DNA分离成甲基化后的单链DNA的第二(A)步骤；和使在第二(A)步骤中得到的甲基化单链DNA和固定化甲基化DNA抗体结合的第二(B)步骤。

就本发明测定方法的第二(A)步骤而言，在“将在第一工序中得到的经过消化处理的DNA试样中所含的甲基化后的双链DNA分离成甲基化后的单链DNA”时，进行用于使双链DNA为单链DNA的一般操作即可。具体而言，将生物来源标本中所含的基因组DNA来源的DNA试样溶于适量的超纯水中，在95℃下加热10分钟，在冰中骤冷即可。

就第二(B)步骤而言，从在第一工序中得到的DNA，通过使甲基化后的单链DNA与固定化甲基化DNA抗体结合而对其进行选择。固定化甲基化DNA抗体，用于从生物来源标本中所含的基因组DNA来源的DNA试样中选择甲基化后的单链DNA。另外，固定化甲基化DNA抗体可以被支持体固定化即可，“可被支持体固定化”是指可以将固定化甲基化DNA抗体直接或间接固定于支持体。为了如此进行固定，将固定化甲基化DNA抗体按照通常的基因工程的操作方法或市售的试剂盒·装置等固定在支持体上即可(对固相的结合)。具体而言，可以举出在用抗生蛋白链菌素被覆后的支持体(例如用抗生蛋白链菌素被覆后的PCR管、用抗生蛋白链菌素被覆后的磁性珠等)固定将固定化甲基化DNA抗体生物素化而得到的生物素化固定化甲基化DNA抗体的方法。

另外，还有如下的方法，即在使固定化甲基化DNA抗体于具有氨基、硫醇基、醛基等活性官能团的分子共价结合之后，使其与表面被硅烷偶联剂等活化后的玻璃、多糖类衍生物、硅胶、或上述合成樹脂等、或耐热性塑料制的支持体共价结合的方法。另外，共价结合例如可以举出通过将5个甘油三酯串联连结而成的间隔区、交联剂等而共价结合的方法。

进而，可以将固定化甲基化DNA抗体直接固定于支持体上，另外还可以将针对固定化甲基化DNA抗体的抗体(二次抗体)固定在支持体上，通过使二次抗体与甲基化抗体结合而固定在支持体上。

另外，在选择上述的含有目标DNA区域的单链DNA(正链)时，将本固定化固定化甲基化DNA抗体固定在支持体即可，(1)可以在使该单链DNA(正链)和本固定化固定化甲基化DNA抗体结合之前，通过本固定化固定化甲基化DNA抗体和支持体的结合来固定化，另外，(2)可以在使该单链DNA(正链)和本固定化固定化甲基化DNA抗体结合之后，通过本固定化固定化甲基化DNA抗体和支持体的结合来固定化。

在第二(B)步骤中，在“通过使甲基化后的单链DNA与固定化固定化甲基化DNA抗体结合来选择上述的单链DNA”时，具体而言，例如作为固定化固定化甲基化DNA抗体，使用“经生物素标记的生物素化甲基胞嘧啶抗体”，如下所述实施即可。

(a)将生物素化甲基胞嘧啶抗体适量(例如0.1μg/50μL)添加到抗生物素蛋白被覆PCR管中，然后在室温静置约1小时，促进生物素化甲基胞嘧啶抗体和抗生蛋白链菌素的固定化。随后，进行残留溶液的除去及清洗。以100μL/管的比例添加清洗缓冲液[例如，含0.05％ Tween20的磷酸缓冲液(1mM KH₂PO₄、3mM Na₂HPO 7H₂O、154mM NaCl pH7.4)]，除去溶液。多次反复实施该清洗操作，将被支持体固定的生物素化甲基胞嘧啶抗体残留在PCR管内。

(b)将生物来源标本中所含的基因组DNA来源的双链DNA与缓冲液(例如，33mM Tris-乙酸酯pH 7.9、66mM KOAc、10mM MgOAc₂、0.5mM二硫苏糖醇)混合，在95℃下加热数分钟。随后，迅速冷却至约0～4℃的温度，在该温度下保温数分钟，形成单链DNA。随后，恢复至室温。

(c)将所形成的上述单链DNA添加到固定有生物素化甲基胞嘧啶抗体的抗生物素蛋白被覆PCR管中，随后，在室温下静置约1小时，促进生物素化甲基胞嘧啶抗体与上述单链DNA中被甲基化的单链DNA的结合(结合体的形成)(在该阶段，至少含有未被甲基化的DNA区域的单链DNA不形成结合体)。随后，进行残留溶液的除去及清洗。以100μL/管的比例添加清洗缓冲液[例如，含0.05％Tween20的磷酸缓冲液(1mMKH₂PO₄、3mM Na₂HPO 7H₂O、154mM NaCl pH7.4)]，除去溶液。多次反复实施该清洗操作，使结合体残留在PCR管内(结合体的选择)。

作为(b)中使用的缓冲液，适于将生物试样来源的基因组DNA来源的双链DNA分离成单链DNA即可，并不限于上述缓冲液。

(a)及(c)中的清洗操作，是从反应溶液除去在溶液中悬浮的未被固定化的固定化甲基化DNA抗体、未与固定化甲基化DNA抗体结合而是在溶液中悬浮的未被甲基化的单链DNA、或在被后述的限制酶消化的溶液中悬浮的DNA等，所以很重要。另外，清洗缓冲液适合除去上述游离的固定化甲基化DNA抗体、在溶液中悬浮的单链DNA等即可，并不限于上述清洗缓冲液，可以是DELFIA缓冲液(PerkinElmer公司制、Tris-HClpH 7.8with Tween 80)、TE缓冲液等。

另外，在第二(A)步骤中，作为分离甲基化后的单链DNA时的优选实施方式，可以举出添加反向寡核苷酸等。反向寡核苷酸是将与目标DNA区域相同的碱基序列分割成短的寡核苷酸后得到的核苷酸。通常设计成10～100个碱基、更优选20～50个碱基的长度。另外，反向寡核苷酸未设计在正向引物或反向引物与目标DNA区域互补性地碱基配对的碱基序列上。反向寡核苷酸与基因组DNA相比，大量过剩添加，目的在于，在使目标DNA区域成为单链(正链)之后，在使其与固定化甲基化DNA抗体结合时，防止目标DNA区域的互补链(负链)和目标DNA区域的单链(正链)互补性地再结合。这是因为，在使目标DNA区域与甲基化DNA抗体结合，测定DNA的甲基化频度或与其有相关关系的指标值时，目标区域为单链时更容易与甲基化DNA抗体结合。另外，反向寡核苷酸与目标DNA区域相比，优选添加至少10倍、通常为100倍以上的量。

“分离甲基化后的单链DNA时添加反向寡核苷酸”，具体而言，为了从生物来源标本中所含的基因组DNA来源的DNA试样中选择甲基化后的单链DNA，将生物来源生物来源标本中所含的基因组DNA来源的DNA试样与反向寡核苷酸混合，形成目标DNA区域的互补链和反向寡核苷酸的双链即可。例如，将上述DNA试样、上述反向寡核苷酸添加到缓冲液(330mM Tris-乙酸酯pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM二硫苏糖醇)5μL、100mM的MgCl₂溶液5μL、1mg/mL的BSA溶液5μL中，进而向该混合物中添加灭菌超纯水，使液量为50μL，混合，在95℃下加热10分钟，迅速冷却至70℃，在该温度下保温10分钟，接着，冷却至50℃，保温10分钟，进而在37℃下保温10分钟，然后恢复至室温即可。

在第三工序中，具有前步骤和本步骤，作为下述的各本步骤的前步骤，具有：将由第二工序选择的单链DNA从固定化固定化甲基化DNA抗体分离而成为单链状态的DNA(正链)的工序(第一前步骤)；

使用在第一前步骤中成为单链状态的基因组来源的DNA(正链)，并使用延伸引物(正向引物)作为延伸引物，使该延伸引物延伸一次，由此使游离的单链DNA(正链)延伸形成为双链DNA的工序(第二前步骤)，所述延伸引物(正向引物)中有相对于单链状态的DNA(正链)所具有的碱基序列的部分碱基序列(正链)具有互补性的碱基序列(负链)，该部分碱基序列(正链)与上述目标DNA区域的碱基序列(正链)的3’末端相比更靠近3’末端侧；和

将在第二前步骤中延伸形成的双链DNA，暂时分离成包含目标DNA区域的单链DNA(正链)和包含相对于目标DNA区域具有互补性的碱基序列的单链DNA(负链)的工序(第三前步骤)；并且，作为本步骤，具有：

(a)第A步骤(本步骤)，其以生成的包含目标DNA区域的单链DNA(正链)为模板，将上述正向引物用作延伸引物，使该延伸引物延伸一次，由此使上述的包含目标DNA区域的单链DNA延伸形成为双链DNA；和

(b)第B步骤(本步骤)，其以包含相对于已生成的目标DNA区域具有互补性的碱基序列的单链DNA(负链)为模板，以延伸引物(反向引物)为延伸引物，使该延伸引物延伸一次，由此使上述的包含目标DNA区域的单链DNA延伸形成为双链DNA，所述延伸引物(反向引物)中有相对于包含与上述目标DNA区域具有互补性的碱基序列的单链DNA(负链)所具有的碱基序列的部分碱基序列(负链)具有互补性的碱基序列(正链)，该部分碱基序列(负链)与相对于上述目标DNA区域的碱基序列(正链)具有互补性的碱基序列(负链)的3’末端相比更靠近3’末端侧；

进而在将由上述各本步骤得到的经延伸形成的双链DNA暂时分离成单链状态之后反复进行第三工序的各本步骤，由此对上述目标DNA区域中甲基化后的DNA进行扩增直至达到可以检测的量，对被扩增的DNA的量进行定量。

在第三工序中，首先，作为下述的各本步骤的前步骤中的第一前步骤，将由第二工序选择的单链DNA从固定化固定化甲基化DNA抗体暂时分离，成为单链状态的DNA。具体而言，例如通过在由第二工序选择的单链DNA中添加退火缓冲液，得到混合物。接着，将得到的混合物在95℃下加热数分钟，由此得到单链状态的DNA(正链)。随后，在第二前步骤中，具体而言，例如将在第一前步骤中得到的单链状态的DNA(正链)和正向引物添加到灭菌超纯水17.85μL、最合适的缓冲液(例如，100mMTris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl₂)3μL、2mM dNTP3μL、5N甜菜碱6μL中，接着向该混合物中添加AmpliTaq(DNA聚合酶的1种：5U/μL)0.15μL，使液量为30μL，在得到的溶液中进行混合，在37℃下孵育约2小时，使含有目标DNA区域的单链DNA(正链)延伸形成为双链DNA。关于第三前步骤，具体而言，例如通过向利用第二前步骤延伸形成的双链DNA中添加退火缓冲液，而得到混合物，在95℃下对得到的混合物加热数分钟，由此暂时分离成含有目标DNA区域的单链DNA。

随后，作为本步骤，

(i)为了使上述的正向引物退火成生成含有目标DNA区域的单链DNA(正链)，例如，迅速冷却至比上述的正向引物的Tm值低约0～20℃的温度，在该温度下保温数分钟。

(ii)随后恢复至室温。

(iii)以在上述(i)退火后的上述单链状态的DNA为模板，以上述正向引物为延伸引物，使该引物延伸一次，由此使含有相对于上述目标DNA区域具有互补性的碱基序列的单链DNA延伸形成为双链DNA(即第A步骤)。具体而言，例如，按照后述的说明、前述的本发明的第二前步骤中的延伸反应涉及的操作方法等实施即可。

(iv)以生成的含有相对于目标DNA区域具有互补性的碱基序列的单链DNA(负链)为模板，使用延伸引物(反向引物)作为延伸引物，使该延伸引物延伸一次，由此使上述单链状态的DNA延伸形成双链DNA(即第B步骤)，所述延伸引物(反向引物)中有相对于包含上述目标DNA区域的单链DNA(负链)所具有的碱基序列的部分碱基序列(负链)具有互补性的碱基序列(正链)，该部分碱基序列(负链)与相对于上述目标DNA区域的碱基序列(正链)具有互补性的碱基序列(负链)的3’末端相比更靠近3’末端侧。具体而言，例如与上述(iii)的A工序一样，按照第二前步骤中的延伸反应的操作方法等实施即可。

(v)进而在将由上述各本步骤得到的经延伸形成的双链DNA暂时分离成单链状态之后反复进行第三工序的各本步骤(例如第A步骤及第B步骤)，由此对上述目标DNA区域中甲基化后的DNA进行扩增直至达到可以检测的量，对被扩增的DNA的量进行定量。

关于第三工序，具体而言，也可以将从第一前步骤开始至本步骤的反应作为一个PCR反应来实施。另外，也可以从第一前步骤至第三前步骤分别作为独立的反应来实施，仅将本步骤作为PCR反应来实施。

作为使所选择的单链DNA中所含的目标DNA区域(即目标区域)扩增的方法，例如可以使用PCR。在对目标区域进行扩增时，如果使用预先用荧光等标记的引物并以该标记为指标，可以不实施电泳等繁琐的操作来评价有无扩增产物。作为PCR反应液，例如可以举出如下的反应液，即在由本发明的第二工序得到的DNA中混合50μM的引物的溶液0.15μl、2mM dNTP2.5μl、10×缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、20mMMgCl₂、0.01％明胶)2.5μl、AmpliTaq Gold(耐热性DNA聚合酶的一种：5U/μl)0.2μl，向其中添加灭菌超纯水，使其液量为25μl后得到反应液。

目标DNA区域(即目标区域)，由于富GC碱基序列多，有时可以适量添加甜菜碱、DMSO等来实施反应。作为反应条件，例如可以举出将如上所述的反应液在95℃下保温10分钟之后、将以在95℃下30秒钟接着在55～65℃下30秒钟进而在72℃下30秒钟为1个循环的保温进行30～40个循环的条件。在进行了该PCR之后，对得到的扩增产物进行检测。例如在使用了预先标记的引物的情况下，实施与先前一样的清洗·纯化操作后，可以通过荧光标记体的量的测定来评价PCR反应中的扩增量。另外，在实施了使用未被标记的通常引物的PCR的情况下，使经金胶体粒子、荧光等标记后的探针等退火，测定与目标区域结合后的该探针的量，由此可以检测出。另外，为了以更高的精度求出扩增产物的量，例如使用实时PCR法即可。实时PCR法是指实时地监控PCR并对得到的监控结果进行动态分析的方法，例如是作为甚至可以检测出是基因量2倍左右细微差异的高精度定量PCR法而被众所周知的方法。作为该实时PCR法，例如可以举出使用模板依赖性核酸聚合酶探针等探针的方法、使用SYBR-Green等嵌入剂(intercalator)的方法等。实时PCR法中使用的装置及试剂盒可以利用市售的装置及试剂盒。如上所述，对检测没有特别限定，可以利用迄今为止周知的所有方法进行检测。在这些方法中，在不更换反应容器的情况下进行检测的操作是可能的。

本发明在如下所述的情况下利用即可。

关于各种疾病(例如癌)，已知会发生DNA的甲基化异常，通过检测该DNA甲基化异常，认为可以测定各种疾病的严重程度。

例如，疾病来源的生物来源标本中所含的基因组DNA中有100％被甲基化的DNA区域，关于该DNA区域，只要实施本发明，则甲基化后的DNA的量增多，例如，疾病来源的生物来源标本中所含的基因组DNA中有100％未被甲基化的DNA区域，关于该DNA区域，只要实施本发明，则甲基化后的DNA的量会成为大致接近0的值。另外，例如，就健康人的生物来源标本中所含的基因组DNA而言，有低甲基化状态(hypomethylation)的DNA区域，并且，就疾病患者的生物来源标本中所含的基因组DNA而言，有高甲基化状态(hypermethylation)的DNA区域，关于该DNA区域，只要实施本发明，则在健康人的情况下，甲基化后的DNA的量示出接近0的值，另一方面，在疾病患者的情况下，与健康人的情况下的值相比示出有显著差异的高值，根据该值的差异，可以判断“疾病的严重程度”。这里的“疾病的严重程度”，通常与该领域所使用的意思相同，具体而言，例如在生物来源标本是细胞的情况下，是指该细胞的恶性度，另外，例如在生物来源标本是组织的情况下，是指该组织中疾病细胞的存在量等。进而，在生物来源标本是血浆、血清的情况下，是指该个体患有疾病的概率。因此，本发明通过调查甲基化异常使各种疾病诊断成为可能。

可以在这样的本发明中的、用于测定目标区域的甲基化后的DNA量的各种方法中使用的限制酶、引物或探针，作为检测用试剂盒的试剂是有用的。本发明也提供含有这些限制酶、引物或探针等作为试剂的检测用试剂盒、将这些引物或探针等固定在支持体上而成的检测用芯片，本发明或本发明甲基化比例测定方法的请求保护的范围，也包括使用利用该方法的实质原理而成的如上所述的检测用试剂盒、检测用芯片之类的形态。

实施例

以下利用实施例详细说明本发明，但本发明并不限于这些。

实施例1

使用市售生物素化试剂盒(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所制)，按照目录中记载的方法对市售的甲基胞嘧啶抗体(Aviva Systems Biology公司制)进行生物素标记。使得到的生物素标记甲基胞嘧啶抗体成为溶液[抗体约0.1μg/100μL的含0.1％BSA的磷酸缓冲液(1mM KH₂PO₄、3mM Na₂HPO 7H₂O、154mM NaCl pH7.4)溶液]，进行冷藏保存。

向抗生蛋白链菌素被覆后PCR管(计9根)中以各50μL的比例添加经合成得到的生物素标记甲基胞嘧啶抗体溶液，室温下放置约1小时，在PCR管中进行固定化。随后，通过移液除去溶液，添加了100μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20的磷酸缓冲液(1mM KH₂PO₄、3mM Na₂HPO 7H₂O、154mM NaCl pH7.4)]之后，通过移液除去了该缓冲液。进而反复进行该操作2次(以上，相当于本发明中使用的固定化甲基化DNA抗体的制备)。

合成含有序列编号17表示的碱基序列且HpaII的识别序列被甲基化的部分甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-M(7)、含有序列编号18表示的碱基序列且HpaII的识别序列的一部分未被甲基化的部分甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-HM(5)、含有序列编号19表示的碱基序列的未甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-UM，分别将它们制备成0.001pmol/10μLTE缓冲溶液。

<HpaII的识别序列被甲基化的部分甲基化寡核苷酸>

N表示5-甲基胞嘧啶。

GPR7-2079-2176/98mer-M(7)：

5’-

GTTGGCCACTGCGGAGTCGNGCNGGGTGGCNGGCCGCACCTACAGNGCCGNGNGNGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC-3’(序列编号17)

<HpaII的识别序列未被甲基化的部分甲基化寡核苷酸>

N表示5-甲基胞嘧啶。

GPR7-2079-2176/98mer-HM(5)：

5’-

GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCNGGCCGCACCTACAGNGCCGNGNGNGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC-3’(序列编号18)

<未甲基化寡核苷酸>GPR7-2079-2176/98mer-UM：

    5’-

GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCGGCCGCACCTACAGCGCCGCGCGCGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC-3’(序列编号19)

关于得到的各溶液(对各溶液分别制备各3根)，实施了以下的A处理、B处理或C处理施(分别制备各1根)。

A处理组(无处理组)：向上述制备的样品中，添加缓冲液(330mM Tris-乙酸酯pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM二硫苏糖醇)5μL、和BSA(牛血清白蛋白(Bovine serum albumin)1mg/mL)5μL，进而向该混合物中添加灭菌超纯水，使液量为50μL。

B处理组(HpaII处理组)：向上述制备的样品中，添加缓冲液(330mM Tris-乙酸酯pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM二硫苏糖醇)5μL、BSA(牛血清白蛋白1mg/mL)5μL、和HpaII10U，进而向该混合物中添加灭菌超纯水，使液量为50μL。

C组(添加掩蔽用寡核苷酸+HpaII处理组)：向上述中制备的样品中，添加缓冲液(330mM Tris-乙酸酯pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM二硫苏糖醇)5μL、BSA(牛血清白蛋白1mg/ml)5μL、和HpaII10U，还添加5pmol含有序列编号20表示的碱基序列的寡核苷酸MA作为掩蔽用寡核苷酸，进而向该该混合物添加灭菌超纯水，使液量为50μL。

<掩蔽用寡核苷酸>

MA：5’-GCCACCCGGCGCGA-3’(序列编号20)

在37℃下将各反应液孵育1晚。(以上相当于本发明的第一工序)

向上述的生物素标记甲基胞嘧啶抗体被固定化的抗生蛋白链菌素被覆后PCR管中，添加上述制备的寡核苷酸反应液50μL，室温下放置1小时。随后，通过移液除去溶液，添加了100μL的清洗缓冲液[含0.05％ Tween20的磷酸缓冲液(1mM KH₂PO₄、3mM Na₂HPO 7H₂O、154mM NaCl pH7.4)]之后，通过移液除去该缓冲液。进而反复进行该操作两次(以上相当于本发明的第二工序)。

接着，在上述的PCR管中，使用含有序列编号21表示的碱基序列的引物及含有序列编号22表示的碱基序列的引物的各溶液(PF1及PR1)及下述的反应条件，进行PCR，由此对目标DNA区域(GPR7-2079-2176、序列编号23、甲基胞嘧啶也用C表示)中的甲基化后的DNA进行扩增。

<引物>

PF1：5’-GTTGGCCACTGCGGAGTCG-3’(序列编号21)

PR1：5’-GCACGACGAGTGTGACGATC-3’(序列编号22)

<目标DNA区域>

GPR7-2079-2176：5′-

GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCGGCCGCACCTACAGCGCCGCGCGCGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC-3’(序列编号23)

作为PCR的反应液，使用如下的反应液，即在成为模板的DNA中，混合制备成3μM的含有序列编号21表示的碱基序列的引物的溶液及含有序列编号22表示的碱基序列的引物的溶液各5μL、2mM dNTP各5μL、缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl₂、0.01％明胶)5μL、耐热性DNA聚合酶(AmpliTaq Gold)5U/μL 0.25μL、5N甜菜碱水溶液10μL，向其中添加灭菌超纯水，使液量为50μL而得到的反应液。将该反应液在95℃下保温10分钟后，在将以95℃下30秒钟接着59℃下30秒钟进而在72℃下45秒钟为1个循环的保温进行25个循环的条件下，进行PCR。

在进行了PCR之后，通过2％琼脂糖凝胶电泳来确认DNA的扩增(以上相当于本发明的第三工序。)。将其结果示于图1。在A处理组(无处理组)的情况下，就HpaII的识别序列被甲基化的部分甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-M(7)、和HpaII的识别序列的一部分未被甲基化的部分甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-HM(5)而言，DNA的扩增得到确认，得到了其扩增产物(目标DNA区域：GPR7-2079-2176)。就未甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-UM而言，DNA的扩增未得到确认，未得到其扩增产物。在B处理组(HpaII处理组)的情况下，也是与A处理组相同的结果。在C处理组(添加掩蔽用寡核苷酸+HpaII处理组)的情况下，就HpaII的识别序列被甲基化的部分甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-M(7)而言，DNA的扩增得到确认，得到了其扩增产物(目标DNA区域：GPR7-2079-2176)，但就HpaII的识别序列的一部分未被甲基化的部分甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-HM(5)、及未甲基化寡核苷酸GPR7-2079-2176/98mer-UM而言，DNA的扩增未得到确认，未得到其扩增产物。

由上述可以确认下述事项，即通过固定化后的甲基胞嘧啶抗体，可以选择使用含有甲基化后的目标DNA区域的单链DNA，另外，通过添加/混合掩蔽用寡核苷酸并用甲基化敏感性限制酶进行处理，可以消化由掩蔽用寡核苷酸保护的甲基化敏感性限制酶识别部位未被甲基化的目标DNA区域，并且，在不对上述目标DNA区域中的未被甲基化的DNA进行扩增情况下，仅将甲基化后的DNA扩增至可以检测出的量，可以对扩增后的DNA的量进行定量。

实施例2

使用市售生物素化试剂盒(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所制)，按照目录中记载的方法对市售的甲基胞嘧啶抗体(Aviva Systems Biology公司制)进行生物素标记。使得到的生物素标记甲基胞嘧啶抗体成为溶液[抗体约0.25μg/μL的含0.1％BSA的磷酸缓冲液(1mM KH₂PO₄、3mM Na₂HPO 7H₂O、154mM NaCl pH7.4)溶液]，进行冷藏保存。

向抗生蛋白链菌素被覆后PCR管(计8根)中，以各50μL的比例添加经合成得到的生物素标记甲基胞嘧啶抗体的0.1μg/50μL溶液，室温下放置约1小时，在PCR管中固定化。随后，通过移液除去溶液，添加了100μL的清洗缓冲液[含0.05％ Tween20的磷酸缓冲液(1mM KH₂PO₄、3mM Na₂HPO 7H₂O、154mM NaCl pH7.4)]之后，通过移液除去该缓冲液。进而反复进行该操作2次(以上相当于本发明测定方法中使用的固定化甲基化DNA抗体的制备)。

关于从Clontech公司购入的人血液来源基因组DNA，使用序列编号24表示的寡核苷酸引物及序列编号25表示的寡核苷酸引物(PF2及PR2)及以下的反应条件，进行PCR，由此对用作检测样品的DNA片段(与X、序列编号26、基因库检索号No.NT_029419等所示的碱基编号25687390-25687775相当的区域)进行扩增。

<为PCR设计的寡核苷酸引物>

PF2：5’-CTCAGCACCCAGGCGGCC-3’(序列编号24)

PR2：5’-CTGGCCAAACTGGAGATCGC-3’(序列编号25)

<DNA片段>

X：5’-

CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG-3’(序列编号26)

作为PCR的反应液，混合成为模板的基因组DNA5ng、制备成5μM的寡核苷酸引物溶液各3μl、2mM dNTP各5μl、10×缓冲液(100mM Tris-HClpH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl₂、0.01％明胶)5μl、耐热性DNA聚合酶(AmpliTaq Gold、ABI公司制)5U/μl0.25μl，向其中添加灭菌超纯水，使液量为50μl。将该反应液在95℃下保温10分钟后，在将以95℃下30秒钟接着61℃下30秒钟进而72℃下45秒钟为1个循环的保温进行40个循环的条件下，进行PCR。

在进行了PCR之后，通过1.5％琼脂糖凝胶电泳来确认扩增，通过Wizard SV Gel/PCR Kit(试剂盒)(PROMEGA公司)纯化了DNA片段X。

关于得到的DNA片段溶液的一部分，混合SssI甲基化酶(NEB公司制)1μl、10xNEBuffer2(NEB公司制)10μl、S-腺苷甲硫氨酸(3.2mM，NEB公司制)1μl，向其中添加灭菌超纯水，使液量为100μl而制备反应液。将该反应液在37℃下孵育15～30分钟，进而追加S-腺苷甲硫氨酸(3.2mM，NEB公司制)1μl，在37℃下孵育15～30分钟。利用Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA公司)对其进行纯化。进而反复进行这些的操作5次，得到了甲基化后的DNA片段(MX、序列编号27)。

<DNA片段>(N表示5-甲基胞嘧啶)

MX：5’-

CTCAGCACCCAGGNGGCNGNGATCATGAGGNGNGAGNGGNGNGNGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGNGGGTGGCACACNGNGATGTAGNGGTNGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCNGANGCAAACATGCNGAACACCTGCAGGTGCTTCACCANGNGGCACAGCCAGTNGGGGCNGNGGAAGNGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGNGGCAGCACCTGGAAGAATGCCANGGCCAGGTNGGCCAGGCTGAGGTGTNGGATGAAGAGGTGCATGNGGGANGTCTTGNGNGGNGTCNGGTGCAGAGCCAGCAGTANGCTGCTGTTGCCCAGCANGGCCACNGNGAAAGTCACNGCCAGCANGGNGATCTCCAGTTTGGCCAG-3’(序列编号27)

对于得到的DNA片段X，制备以下的溶液。

溶液A：100pg/5μL TE溶液

溶液B：10pg/5μL TE溶液

溶液C：1pg/5μL TE溶液

溶液D：TE溶液(阴性对照液)

对于得到的DNA片段MX，制备以下的溶液。

溶液MA：100pg/5μL TE溶液

溶液MB：10pg/5μL TE溶液

溶液MC：1pg/5μL TE溶液

溶液MD：TE溶液(阴性对照液)

对于上述的DNA片段X的溶液及甲基化后的DNA片段MX的溶液，分别实施以下的处理。

向上述制备的DNA片段溶液5μL中，添加缓冲液(330mM Tris-乙酸酯pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM二硫苏糖醇)2μL、BSA(牛血清白蛋白1mg/ml)2μL、和甲基化敏感性限制酶HpaII 12U，进而向该混合物中添加灭菌超纯水，使液量为20μL而得到各混合液，将得到的各混合液在37℃下孵育3小时(以上相当于本发明测定方法的第一工序)。

合成含有分别由序列编号29～序列编号40表示的碱基序列的反向寡核苷酸C1～C12，该反向寡核苷酸C1～C12所含的碱基序列可以以互补的方式分别与含有序列编号28表示的碱基序列的目标DNA区域X’的负链进行碱基配对，制备各自的浓度为0.01μM的TE缓冲溶液。

<目标DNA区域>

X’：5’-

CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG-3’(序列编号28)

<反向寡核苷酸>

C1：5’-GCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCG-3’(序列编号29)

C2：5’-GCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACG-3’(序列编号30)

C3：5’-CGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGA-3’(序列编号31)

C4：5’-AGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATG-3’(序列编号32)

C5：5’-ACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCC-3’(序列编号33)

C6：5’-TAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGC-3’(序列编号34)

C7：5’-CGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGG-3’(序列编号35)

C8：5’-ATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACG-3’(序列编号36)

C9：5’-ATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAAC-3’(序列编号37)

C10：5’-TGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTC-3’(序列编号38)

C11：5’-CGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGG-3’(序列编号39)

C12：5’-CAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGG-3’(序列编号40)

向上述的反应液中，添加所制备的反向寡核苷酸溶液10μL、缓冲液(330mM Tris-乙酸酯pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM二硫苏糖醇)5μL、100mM的MgCl₂溶液5μL、1mg/mL的BSA溶液5μL添加，进而向该混合物中添加灭菌超纯水，使液量为50μL，进行混合。随后，将该PCR管在95℃下加热10分钟，迅速冷却至70℃，在该温度下保温10分钟。接着，冷却至50℃并保温10分钟，进而在37℃下保温10分钟后，恢复至室温(以上相当于本发明测定方法的第二工序)。

向上述的生物素标记甲基胞嘧啶抗体被固定化的抗生蛋白链菌素被覆后PCR管中，添加上述制备的DNA片段的反应液50μL，室温下放置30分钟。随后，通过移液除去溶液，添加了100μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20的磷酸缓冲液(1mM KH₂PO₄、3mM Na₂HPO 7H₂O、154mM NaCl pH7.4)]之后，通过移液除去该缓冲液。进而反复进行该操作2次(以上相当于本发明测定方法的第三工序)。

接着，在上述的PCR管中，使用分别含有由序列编号24及序列编号25分别表示的碱基序列的寡核苷酸引物PF2及PR2的各溶液、及下述的反应条件，进行PCR，由此对含有序列编号28表示的碱基序列的目标DNA区域X’中的甲基化后的DNA进行了扩增。

<为PCR设计的寡核苷酸引物>

PF2：5’-CTCAGCACCCAGGCGGCC-3’(序列编号24)

PR2：5’-CTGGCCAAACTGGAGATCGC-3’(序列编号25)

<目标DNA区域>

X’：5’-

CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG-3’(序列编号28)

作为PCR的反应液，使用如下的反应液，即在成为模板的DNA中，混合制备成5μM的寡核苷酸引物溶液各3μL、2mM dNTP各5μL、缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl₂、0.01％明胶)5μL、耐热性DNA聚合酶(AmpliTaq Gold、ABI公司制)5U/μL 0.25μL，向其中添加灭菌超纯水，使液量为50μL。该反应液在95℃下保温10分钟后，在将以95℃下20秒钟接着61℃下30秒钟进而72℃下30秒钟为1个循环的保温进行25个循环的条件下，进行PCR。

在进行了PCR之后，通过1.5％琼脂糖凝胶电泳来确认DNA的扩增(以上相当于本发明测定方法的第四工序。)。其结果示于图2。就甲基化后的DNA片段MX的溶液MA、MB及MC而言，扩增得到确认，得到了其扩增产物。就阴性对照溶液MD而言，DNA的扩增未得到确认，未得到其扩增产物。就未被甲基化的DNA片段X的溶液A、B、C及D而言，DNA的扩增未被确认，未得到其扩增产物。

综上可以确认下述事项，即通过固定化后的甲基胞嘧啶抗体，可以选择含有甲基化后的目标DNA区域的DNA，另外，将甲基化后的DNA扩增至可以检测出的量，可以以更高的灵敏度检测扩增后的DNA。

实施例3

使用市售生物素化试剂盒(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所制)，按照目录记载的方法对市售的甲基胞嘧啶抗体(Aviva Systems Biology公司制)进行生物素标记。使得到的生物素标记甲基胞嘧啶抗体为溶液[抗体约0.25μg/μL的含0.1％BSA的磷酸缓冲液(1mM KH₂PO₄、3mM Na₂HPO 7H₂O、154mM NaCl pH7.4)溶液]，进行冷藏保存。

向抗生蛋白链菌素被覆后PCR管(计8根)中，以各50μL的比例添加经合成得到的生物素标记甲基胞嘧啶抗体的0.1μg/50μL溶液，室温下放置约1小时，在PCR管中固定化。随后，通过移液除去溶液，添加了100μL的清洗缓冲液[0.05％ Tween20含有磷酸缓冲液(1mM KH₂PO₄、3mM Na₂HPO 7H₂O、154mM NaCl pH7.4)]之后，通过移液除去该缓冲液。进而反复进行该操作2次(以上相当于本发明测定方法中使用的固定化甲基化DNA抗体的制备)。

对于从Clontech公司购入的人血液来源基因组DNA，使用分别由序列编号41及序列编号42表示的寡核苷酸引物(PF3及PR3)及以下的反应条件，进行PCR，由此对用作检测样品的DNA片段(与Y、序列编号43、基因库检索号No.ac009800等所示的碱基编号76606-76726相当的区域)进行了扩增。

<为PCR设计的寡核苷酸引物>

PF3：5’-TGAGCTCCGTAGGGCGTCC-3’(序列编号41)

PR3：5’-GCGCCGGGTCCGGGCCC-3’(序列编号42)

<DNA片段>

Y：5’-

GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA-3’(序列编号43)

作为PCR的反应液，使用如下的反应液，即混合成为模板的基因组DNA5ng、制备成5μM的寡核苷酸引物溶液各3μl、2mM dNTP各5μl、10×缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl₂、0.01％明胶)5μl、耐热性DNA聚合酶(AmpliTaq Gold、ABI公司制)5U/μl 0.25μl，向其中添加灭菌超纯水，使液量为50μl而得到。将该反应液在95℃下保温10分钟后，在将以95℃下30秒钟接着60℃下30秒钟进而72℃下45秒钟为1个循环的保温进行50个循环的条件下，进行PCR。

在进行了PCR之后，通过1.5％琼脂糖凝胶电泳来确认DNA的扩增，通过Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA公司)将DNA片段Y纯化。

关于得到的DNA片段溶液的一部分，混合SssI甲基化酶(NEB公司制)1μl、10xNEBuffer2(NEB公司制)10μl、和S-腺苷甲硫氨酸(3.2mM，NEB公司制)1μl，向其中添加灭菌超纯水，使液量为100μl而制备反应液。将该反应液在37℃下孵育15-30分钟，进而追加S-腺苷甲硫氨酸(3.2mM，NEB公司制)1μl，在37℃下孵育15-30分钟。通过Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA公司)对其进行纯化。进而反复进行该操作5次，得到了甲基化后的DNA片段(MY、序列编号44)。

<DNA片段>(N表示5-甲基胞嘧啶)

MY：5’-

GNGCNGGGTCNGGGCCNGATGNGTTGGNGGGCCAGGGCTCNGAGAANGAGGNGTTGTCCATCTCAANGAGGGCAGAGGAGCNGGNGACCTGGNGTCCCCCAAGGANGCCCTANGGAGCTCA-3’(序列编号44)

关于得到的DNA片段Y，制备以下的溶液。

溶液A：100pg/5μL TE溶液

溶液B：10pg/5μL TE溶液

溶液C：1pg/5μL TE溶液

溶液D：TE溶液(阴性对照液)

关于得到的DNA片段MY，制备以下的溶液。

溶液MA：100pg/5μL TE溶液

溶液MB：10pg/5μL TE溶液

溶液MC：1pg/5μL TE溶液

溶液MD：TE溶液(阴性对照液)

对于上述的DNA片段Y的溶液及甲基化后的DNA片段MY的溶液，分别实施以下的处理。

向上述制备的DNA片段溶液5μL中，添加缓冲液(330mM Tris-乙酸酯pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM二硫苏糖醇)2μL、BSA(牛血清白蛋白1mg/ml)2μL、和甲基化敏感性限制酶HpaII  12U，进而向该混合物添加灭菌超纯水，使液量为20μL得到各混合液，将该各混合液在37℃下孵育3小时(以上相当于本发明测定方法的第一工序)。

合成含有分别由序列编号46、碱基序列47及序列编号48表示的碱基序列的反向寡核苷酸C13、C14、及C15，该反向寡核苷酸C13、C14、及C15所含的碱基序列能够以互补的方式与含有序列编号45表示的碱基序列的目标DNA区域Y’的负链进行碱基配对，制备成各自的浓度为0.01μM的TE缓冲溶液。

<目标DNA区域>

Y’：5’-

GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA-3’(序列编号45)

<反向寡核苷酸>

C13：5’-GCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA-3’(序列编号46)

C14：5’-CTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTG-3’(序列编号47)

C15：5’-CGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGG-3’(序列编号48)

在上述的反应液中，添加制备后的反向寡核苷酸溶液10μL、缓冲液(330mM Tris-乙酸酯pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM二硫苏糖醇)5μL、100mM的MgCl₂溶液5μL、和1mg/mL的BSA溶液5μL，进而向该混合物添加灭菌超纯水，使液量为50μL，进行混合。随后，将该PCR管在95℃下加热10分钟，迅速冷却至70℃，在该温度下保温10分钟。接着，冷却至50℃并保温10分钟，进而在37℃下保温10分钟后，恢复至室温(以上相当于本发明测定方法的第二工序)。

向上述的生物素标记甲基胞嘧啶抗体被固定化的抗生蛋白链菌素被覆后PCR管中，添加上述制备的DNA片段的反应液50μL，室温下放置30分钟。随后，通过移液除去溶液，添加了100μL的清洗缓冲液[含0.05％ Tween20的磷酸缓冲液(1mM KH₂PO₄、3mM Na₂HPO 7H₂O、154mM NaCl pH7.4)]之后，通过移液除去该缓冲液。进而反复进行该操作2次(以上相当于本发明测定方法的第三工序)。

接着，在上述的PCR管中，使用含有分别由序列编号41及序列编号42表示的碱基序列的寡核苷酸引物PF3及PR3的各溶液、及下述的反应条件，进行PCR，由此对含有序列编号45表示的碱基序列的目标DNA区域Y’中的甲基化后的DNA进行了扩增。

<为PCR设计的寡核苷酸引物>

PF3：5’-TGAGCTCCGTAGGGCGTCC-3’(序列编号41)

PR3：5’-GCGCCGGGTCCGGGCCC-3’(序列编号42)

<目标DNA区域>

Y’：5’-

GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA-3’(序列编号45)

作为PCR的反应液，使用如下的反应液，即在成为模板的DNA中，混合制备成5μM的寡核苷酸引物溶液各3μL、2mM dNTP各5μL、缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl₂、0.01％明胶)5μL、和耐热性DNA聚合酶(AmpliTaq Gold、ABI公司制)5U/μL0.25μL，向其中添加灭菌超纯水，使液量为50μL而得到反应液。将该反应液在95℃下保温10分钟后，在将以95℃下20秒钟接着60℃下30秒钟进而72℃下30秒钟为1个循环的保温进行25个循环的条件下，进行PCR。

在进行了PCR之后，通过1.5％琼脂糖凝胶电泳来确认DNA的扩增(以上相当于本发明测定方法的第三工序。)。其结果示于图3。就甲基化后的DNA片段MY的溶液MA、MB及MC而言，扩增得到确认。就阴性对照溶液MD而言，DNA的扩增未得到确认。就未被甲基化的DNA片段Y的溶液A、B、C及D而言，DNA的扩增未得到确认。

综上可以确认下述事项，即通过固定化后的甲基胞嘧啶抗体，可以选择含有甲基化后的目标DNA区域的DNA，另外，将甲基化后的DNA扩增至可以检测出的量，可以以更高的灵敏度检测出扩增后的DNA。

实施例4

使用市售生物素化试剂盒(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所制)，按照目录记载的方法对市售的甲基胞嘧啶抗体(Aviva SystemsBiology公司制)进行生物素标记。使得到的生物素标记甲基胞嘧啶抗体为溶液[抗体约0.25μg/μL的含0.1％BSA的磷酸缓冲液(1mM KH₂PO₄、3mM Na₂HPO 7H₂O、154mM NaCl pH7.4)溶液]，进行冷藏保存。

向抗生蛋白链菌素被覆后PCR管(计8根)中，以各50μL的比例添加经合成得到的生物素标记甲基胞嘧啶抗体的0.1μg/50μL溶液，室温下放置约1小时，在PCR管中固定化。随后，通过移液除去溶液，添加了100μL的清洗缓冲液[含0.05％ Tween20的磷酸缓冲液(1mM KH₂PO₄、3mM Na₂HPO 7H₂O、154mM NaCl pH7.4)]之后，通过移液除去该缓冲液。进而反复进行该操作2次(以上相当于本发明测定方法中使用的固定化甲基化DNA抗体的制备)。

用YPD培养基(1％酵母提取物、2％胨、2％葡萄糖，pH 5.6-6.0)培养面包酵母酵母株X2180-1A，直至浊度为OD₆₀₀ 0.6-1.0，以10000g离心10分钟，制备1x10⁷的酵母细胞。使用Methods in Yeast Genetics(酵母遗传学方法)(Cold Spring Harbor Laboratory)中记载的常规的酵母基因组的制备法，从所制备的酵母细胞获得酵母基因组。

使所制备的酵母细胞在缓冲液A(1M山梨醇、0.1M EDTA、pH 7.4)中悬浮，添加0.1％2-巯基乙醇(终浓度14mM)及100U消解酶(10mg/ml)，30℃边搅拌边孵育1小时直至溶液透明。以550g离心10分钟，回收原生质体后，使其在缓冲液B(50mM Tris-HCl、pH 7.4、20mM EDTA)中悬浮，之后添加十二烷基硫酸钠并使其为1％(w/v)，然后在65℃下孵育30分钟。接着，添加体积比2/5量的5M CH₃ COOK，进行混合，30分钟冰冷后，以15000g离心30分钟，回收上清。向所回收的上清中添加体积比1/10量的3M CH₃ COONa和等量的异丙醇，充分混合，以15000g在4℃下离心30分钟得到沉淀，用70％乙醇冲洗所得到的沉淀并进行回收。使沉淀干燥，然后溶解于1ml的TE缓冲液(10mM Tris-HCl、pH 8.0、1mM EDTA)，添加RNase A(Sigma公司制)并使其为40μg/ml，在37℃下孵育1小时，接着，向混合液添加蛋白酶K(Sigma公司制)使其为500μg/ml，添加十二烷基硫酸钠使其为1％(w/v)，在55℃下将其振荡约16小时。在振荡结束后，对该混合物进行苯酚[用1M Tris-HCl(pH 8.0)饱和]/氯仿提取处理。回收水层，向其中添加NaCl并使其0.5N，然后对其进行乙醇沉淀处理，回收所生成的沉淀。用70％乙醇冲洗所回收的沉淀，由此得到了基因组DNA。

使用分别由序列编号49及序列编号50表示的寡核苷酸引物(PF4及PR4)及以下的反应条件，进行PCR，由此从得到的基因组DNA，扩增用作检测样品的DNA片段(与T、序列编号51、基因库检索号No.NC_001139等所的酵母染色体VII的碱基编号384569-384685相当的区域)。

<为PCR设计的寡核苷酸引物>

PF4：5’-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3’(序列编号49)

PR4：5’-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3’(序列编号50)

<DNA片段>

T：5’-

GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3’(序列编号51)

作为PCR的反应液，使用如下的反应液，即混合成为模板的基因组DNA10ng、制备成5μM的寡核苷酸引物溶液各3μl、2mM dNTP各5μL、10×缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl₂、0.01％明胶)5μl、和耐热性DNA聚合酶(AmpliTaq Gold、ABI公司制)5U/μl0.25μl，向其中添加灭菌超纯水，使液量为50μl而得到反应液。将该反应液在95℃下保温10分钟后，在将以95℃下20秒钟接着58℃下30秒钟进而72℃下30秒钟为1个循环的保温进行40个循环的条件下，进行PCR。

在进行了PCR之后，通过1.5％琼脂糖凝胶电泳来确认扩增，通过Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA公司)将DNA片段T纯化。

对于得到的DNA片段溶液的一部分，混合SssI甲基化酶(NEB公司制)1μl、10xNEBuffer2(NEB公司制)10μl、和S-腺苷甲硫氨酸(3.2mM，NEB公司制)1μl，向其中添加灭菌超纯水，使液量为100μl而制备反应液。将该反应液在37℃下孵育15～30分钟，进而追加S-腺苷甲硫氨酸(3.2mM，NEB公司制)1μl，在37℃下孵育15～30分钟。通过Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA公司)对其进行纯化。进而反复进行该操作3次，得到甲基化后的DNA片段(MT、序列编号52)。

<DNA片段>(N表示5-甲基胞嘧啶)

MT：5’-

GGACCTGTGTTTGANGGGTATAACACTAAGTTGNGCAATTTGCTGTATTGNGAAATCNGCCNGGANGATATCACTCTTGAGNGCATGTGCNGTTTCNGAGAANGCCAGATCTGTACT-3’(序列编号52)

对于得到的DNA片段T，制备以下的溶液。

溶液A：100pg/5μL TE溶液

溶液B：10pg/5μL TE溶液

溶液C：1pg/5μL TE溶液

溶液D：TE溶液(阴性对照液)

关于得到的DNA片段MT，制备以下的溶液。

溶液MA：100pg/5μL TE溶液

溶液MB：10pg/5μL TE溶液

溶液MC：1pg/5μLTE溶液

溶液MD：TE溶液(阴性对照液)

对于上述的DNA片段T的溶液及甲基化后的DNA片段MT的溶液，分别实施以下的处理。

向上述制备的DNA片段溶液5μL中，添加缓冲液(330mM Tris-乙酸酯pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM二硫苏糖醇)2μL、BSA(牛血清白蛋白1mg/ml)2μL、和甲基化敏感性限制酶HpaII12U，进而向该混合物添加灭菌超纯水，使液量为20μL得到各混合液，将该各混合液在37℃下孵育3小时(以上相当于本发明测定方法的第一工序)。

合成分别含有由序列编号54～序列编号57分别表示的碱基序列的反向寡核苷酸C16～C19，该反向寡核苷酸C16～C19所含的碱基序列可以以互补的方式与含有序列编号53表示的碱基序列的目标DNA区域T’的负链进行碱基配对，制备成各自的浓度为0.01μM的TE缓冲溶液。

<目标DNA区域>

T’：5’-

GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3’(序列编号53)

<反向寡核苷酸>

C16：5’-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3’(序列编号54)

C17：5’-AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT-3’(序列编号55)

C18：5’-ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT-3’(序列编号56)

C19：5’-CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC-3’(序列编号57)

向上述的反应液中，添加所制备的反向寡核苷酸溶液10μL、缓冲液(330mM Tris-乙酸酯pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM二硫苏糖醇)5μL、100mM的MgCl₂溶液5μL、和1mg/mL的BSA溶液5μL，进而向该混合物添加灭菌超纯水，使液量为50μL，进行混合。随后，将该PCR管在95℃下加热10分钟，迅速冷却至70℃，在该温度下保温10分钟。接着，冷却至50℃并保温10分钟，进而在37℃下保温10分钟后，恢复至室温(以上相当于本发明测定方法的第二工序)。

向上述的生物素标记甲基胞嘧啶抗体被固定化的抗生蛋白链菌素被覆后PCR管中，添加上述制备的DNA片段的反应液50μL，室温下放置30分钟。随后，通过移液除去溶液，添加了100μL的清洗缓冲液[含0.05％Tween20的磷酸缓冲液(1mM KH₂PO₄、3mM Na₂HPO 7H₂O、154mM NaCl pH7.4)]之后，通过移液除去该缓冲液。进而反复进行该操作2次(以上相当于本发明测定方法的第三工序)。

接着，在上述的PCR管中，使用含有分别由序列编号49及序列编号50表示的碱基序列的寡核苷酸引物PF4及PR4的各溶液、及下述的反应条件，进行PCR，由此对含有序列编号53表示的碱基序列的目标DNA区域T’中的甲基化后的DNA进行了扩增。

<为PCR设计的寡核苷酸引物>

PF4：5’-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3’(序列编号49)

PR4：5’-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3’(序列编号50)

<目标DNA区域>

T’：5’-

GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3’(序列编号53)

作为PCR的反应液，使用如下的反应液，即在成为模板的DNA中，混合制备成5μM的寡核苷酸引物溶液各3μL、2mM dNTP各5μL、缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl₂、0.01％明胶)5μL、和耐热性DNA聚合酶(AmpliTaq Gold、ABI公司制)5U/μL0.25μL，向其中添加灭菌超纯水，使液量为50μL而制成反应液。将该反应液在95℃下保温10分钟后，在将以95℃下20秒钟接着58℃下30秒钟进而72℃下30秒钟为1个循环的保温进行28个循环的条件下，进行PCR。

在进行了PCR之后，通过1.5％琼脂糖凝胶电泳来确认DNA的扩增(以上相当于本发明测定方法的第四工序)。其结果示于图4。就甲基化后的DNA片段MT的溶液MA、MB及MC而言，DNA的扩增得到确认，得到了其扩增产物。就阴性对照溶液MD而言，DNA的扩增未得到确认，未得到其扩增产物。就未被甲基化的DNA片段T的溶液A、B、C及D而言，DNA的扩增未得到确认，未得到其扩增产物。

综上可以确认下述事项，即通过固定化后的甲基胞嘧啶抗体，可以选择含有甲基化后的目标DNA区域的DNA，另外，将甲基化后的DNA扩增至可以检测出的量，可以以更高的灵敏度检测出扩增后的DNA。

实施例5

使用市售生物素化试剂盒(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所制)，按照目录记载的方法对市售的甲基胞嘧啶抗体(Aviva Systems Biology公司制)进行生物素标记。使得到的生物素标记甲基胞嘧啶抗体为溶液[抗体约0.25μg/μL的含0.1％BSA的磷酸缓冲液(1mM KH₂PO₄、3mM Na₂HPO 7H₂O、154mM NaCl pH7.4)溶液]，进行冷藏保存。

向抗生蛋白链菌素被覆后PCR管(计8根)中，以各50μL的比例添加经合成得到的生物素标记甲基胞嘧啶抗体的0.1μg/50μL溶液，室温下放置约1小时，在PCR管中固定化。随后，通过移液除去溶液，添加了100μL的清洗缓冲液[含0.05％ Tween20的磷酸缓冲液(1mM KH₂PO₄、3mM Na₂HPO 7H₂O、154mM NaCl pH7.4)]之后，通过移液除去该缓冲液。进而反复进行该操作2次(以上相当于本发明测定方法中使用的固定化甲基化DNA抗体的制备)。

用YPD培养基(1％酵母提取物、2％胨、2％葡萄糖，pH5.6-6.0)培养面包酵母酵母株X2180-1A并使浊度为OD₆₀₀ 0.6-1.0，以10000g离心10分钟，制备1x10⁷的酵母细胞。使用酵母遗传学方法(Cold Spring Harbor Laboratory)中记载的常规的酵母基因组的制备法，从所制备的酵母细胞获得酵母基因组。

使所制备的酵母细胞在缓冲液A(1M山梨醇、0.1M EDTA、pH 7.4)中悬浮，添加0.1％ 2-巯基乙醇(终浓度14mM)及100U消解酶(10mg/ml)，30℃下边搅拌边孵育1小时直至溶液透明。以550g离心10分钟，回收原生质体后，使其在缓冲液B(50mM Tris-HCl、pH 7.4、20mM EDTA)中悬浮，之后添加十二烷基硫酸钠使其为1％(w/v)，在65℃下孵育30分钟。接着，添加体积比2/5量的5M CH₃ COOK并进行混合，再30分钟冰冷后、以15000g离心30分钟，回收上清。向所回收的上清中添加体积比1/10量的3M CH₃ COONa和等量的异丙醇，充分混合，以15000g在4℃下离心30分钟得到沉淀，用70％乙醇冲洗所得到的沉淀并进行回收。使沉淀干燥，然后使其溶解于1ml的TE缓冲液(10mM Tris-HCl、pH 8.0、1mM EDTA)，添加RNase A(Sigma公司制)使其为40μg/ml，在37℃下孵育1小时，接着，向混合液中添加蛋白酶K(Sigma公司制)使其为500μg/ml，添加十二烷基硫酸钠使其为1％(w/v)，55℃下将其振荡约16小时。在振荡结束后，对该混合物进行苯酚[用1M Tris-HCl(pH 8.0)饱和]/氯仿提取处理。回收水层，向其中添加NaCl使其为0.5N，然后对其进行乙醇沉淀处理，回收所生成的沉淀。用70％乙醇冲洗所回收的沉淀，得到了基因组DNA。

关于得到的酵母基因组DNA的一部分，混合SssI甲基化酶(NEB公司制)1μl、10xNEBuffer2(NEB公司制)10μl、和S-腺苷甲硫氨酸(3.2mM，NEB公司制)1μl，向其中添加灭菌超纯水，使液量为100μl而制备反应液。将该反应液在37℃下孵育15～30分钟，进而追加S-腺苷甲硫氨酸(3.2mM，NEB公司制)1μl，在37℃下孵育15～30分钟。通过Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA公司)对其进行纯化。进而反复进行该操作3次，得到了甲基化酵母基因组DNA。

关于得到的酵母基因组DNA，制备以下的溶液。

溶液A：10ng/5μL TE溶液

溶液B：1ng/5μL TE溶液

溶液C：0.1ng/5μL TE溶液

溶液D：TE溶液(阴性对照液)

关于得到的甲基化酵母基因组DNA，制备以下的溶液。

溶液MA：10ng/5μL TE溶液

溶液MB：1ng/5μLTE溶液

溶液MC：0.1ng/5μL TE溶液

溶液MD：TE溶液(阴性对照液)

对于上述的酵母基因组DNA的溶液及甲基化酵母基因组DNA的溶液，分别实施以下的处理。

在PCR管中，混合上述制备后的基因组DNA溶液5μL、限制酶XspI5U、和最合适XspI的10x缓冲液(200mM Tris-HCl pH 8.5、100mM MgCl₂、10mM二硫苏糖醇、1000mM KCl)1μl，向其中添加灭菌超纯水，使液量为10μl制备反应液。将该反应液在37℃下孵育1小时。

进而向上述的反应液中添加缓冲液(330mM Tris-乙酸酯pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM二硫苏糖醇)2μL、BSA(牛血清白蛋白1mg/ml)2μL、和甲基化敏感性限制酶HpaII  12U，进而向该混合物添加灭菌超纯水，使液量为20μL得到各混合液，将该各混合液在37℃下孵育3小时(以上相当于本发明测定方法的第一工序)。

合成分别含有分别由序列编号54～序列编号57及序列编号59～序列编号62表示的碱基序列的反向寡核苷酸C16～C23，该反向寡核苷酸C16～C23所含的碱基序列可以以互补的方式与含有序列编号58表示的碱基序列的DNA片段T’(与基因库检索号No.NC_001139等所示的酵母染色体VII的碱基编号384523-384766相当的区域)的负链进行碱基配对，制备各自的浓度为0.01μM的TE缓冲溶液。

<DNA片段>

T’：5’-

TAGGAAATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCCTATTATTAGAGGGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACTGCGATCGCACACGAGGAGACACAGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGACAAATGAACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC-3’(序列编号58)

<反向寡核苷酸>

C16：5’-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3’(序列编号54)

C17：5’-AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT-3’(序列编号55)

C18：5’-ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT-3’(序列编号56)

C19：5’-CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC-3’(序列编号57)

C20：5’-AATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCC-3’(序列编号59)

C21：5’-GCGATCGCACACGAGGAGACA-3’(序列编号60)

C22：5’-AGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGAC-3’(序列编号61)

C23：5’-AAATGAACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC-3’(序列编号62)

对于上述的酵母基因组DNA及甲基化酵母基因组DNA各自的反应液，实施以下的处理。

向上述的反应液中，添加制备后的反向寡核苷酸溶液10μL、缓冲液(330mM Tris-乙酸酯pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM二硫苏糖醇)5μL、100mM的MgCl₂溶液5μL、和1mg/mL的BSA溶液5μL，进而向该混合物添加灭菌超纯水，使液量为50μL，进行混合。随后，将该PCR管在95℃下加热10分钟，迅速冷却至70℃，在该温度下保温10分钟。接着，冷却至50℃并保温10分钟，进而在37℃下保温10分钟后，恢复至室温(以上相当于本发明测定方法的第二工序)。

向上述的生物素标记甲基胞嘧啶抗体被固定化的抗生蛋白链菌素被覆后PCR管中，添加上述制备的DNA片段的反应液50μL，室温下放置30分钟。随后，通过移液除去溶液，添加了100μL的清洗缓冲液[0.05％ Tween20含有磷酸缓冲液(1mM KH₂PO₄、3mM Na₂HPO 7H₂O、154mM NaCl pH7.4)]之后，通过移液除去该缓冲液。进而反复进行该操作2次(以上相当于本发明测定方法的第三工序)。

接着，在上述的PCR管中，使用含有分别由序列编号49及序列编号50表示的碱基序列的寡核苷酸引物PF4及PR4的各溶液、及下述的反应条件，进行PCR，由此对含有序列编号53表示的碱基序列的目标DNA区域T’中的甲基化后的DNA进行了扩增。

<为PCR设计的寡核苷酸引物>

PF4：5’-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3’(序列编号49)

PR4：5’-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3’(序列编号50)

<目标DNA区域>

T’：5’-

GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3’(序列编号53)

作为PCR的反应液，使用如下的反应液，即在成为模板的DNA中，混合制备成5μM的寡核苷酸引物溶液各3μL、2mM dNTP各5μL、缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl₂、0.01％明胶)5μL、和耐热性DNA聚合酶(AmpliTaq Gold、ABI公司制)5U/μL0.25μL，向其中添加灭菌超纯水，使液量为50μL而成反应液。将该反应液在95℃下保温10分钟后，在将以95℃下20秒钟接着58℃下30秒钟进而72℃下30秒钟为1个循环的保温进行31个循环的条件下，进行PCR。

在进行了PCR之后，通过1.5％琼脂糖凝胶电泳来确认DNA的扩增(以上相当于本发明测定方法的第四工序)。其结果示于图5。就甲基化酵母基因组DNA的溶液MA、MB及MC而言，DNA的扩增得到确认。就阴性对照溶液MD而言，DNA的扩增未得到确认。就未被甲基化的酵母基因组DNA的溶液A、B、C及D而言，DNA的扩增未得到确认。

综上可以确认下述事项，即通过固定化后的甲基胞嘧啶抗体，可以选择含有甲基化后的目标DNA区域的DNA，另外，将甲基化后的DNA扩增至可以检测出的量，可以以更高的灵敏度检测出扩增后的DNA。

产业上的可利用性

通过本发明，可以提供对生物来源标本中所含的基因组DNA中的目标DNA区域中被甲基化的DNA的含量进行简便测定的方法等。

序列表文本

序列编号17

由目标DNA区域构成的经设计的寡核苷酸(GPR7-2079-2176)

序列编号18

由目标DNA区域构成的经设计的寡核苷酸(GPR7-2079-2176)

序列编号19

由目标DNA区域构成的经设计的寡核苷酸(GPR7-2079-2176)

序列编号20

为实验设计的寡核苷酸

序列编号21

为PCR设计的寡核苷酸引物

序列编号22

为PCR设计的寡核苷酸引物

序列编号23

由目标DNA区域构成的经设计的寡核苷酸(GPR7-2079-2176)

序列编号24

为实验设计的寡核苷酸引物

序列编号25

为实验设计的寡核苷酸引物

序列编号26

由目标DNA区域构成的经扩增的寡核苷酸(基因库检索号No.NT_02941925687390-25687775人)

序列编号27

由目标DNA区域构成的经设计的寡核苷酸(基因库检索号No.NT_02941925687390-25687775人)，n＝m5c

序列编号28

由目标DNA区域构成的经设计的寡核苷酸(基因库检索号No.NT_02941925687390-25687775人)

序列编号29

为作成目标DNA区域的单链DNA而设计的反向寡核苷酸

序列编号30

为作成目标DNA区域的单链DNA而设计的反向寡核苷酸

序列编号31

为作成目标DNA区域的单链DNA而设计的反向寡核苷酸

序列编号32

为作成目标DNA区域的单链DNA而设计的反向寡核苷酸

序列编号33

为作成目标DNA区域的单链DNA而设计的反向寡核苷酸

序列编号34

为作成目标DNA区域的单链DNA而设计的反向寡核苷酸

序列编号35

为作成目标DNA区域的单链DNA而设计的反向寡核苷酸

序列编号36

为作成目标DNA区域的单链DNA而设计的反向寡核苷酸

序列编号37

为作成目标DNA区域的单链DNA而设计的反向寡核苷酸

序列编号38

为作成目标DNA区域的单链DNA而设计的反向寡核苷酸

序列编号39

为作成目标DNA区域的单链DNA而设计的反向寡核苷酸

序列编号40

为作成目标DNA区域的单链DNA而设计的反向寡核苷酸

序列编号41

为实验设计的寡核苷酸引物

序列编号42

为实验设计的寡核苷酸引物

序列编号43

由目标DNA区域构成的经扩增的寡核苷酸(基因库检索号No.AC009800 76606-76726人)

序列编号44

由目标DNA区域构成的经设计的寡核苷酸(基因库检索号No.AC009800 76606-76726人)n＝m5c

序列编号45

由目标DNA区域构成的经设计的寡核苷酸(基因库检索号No.AC009800 76606-76726人)

序列编号46

为作成目标DNA区域的单链DNA而设计的反向寡核苷酸

序列编号47

为作成目标DNA区域的单链DNA而设计的反向寡核苷酸

序列编号48

为作成目标DNA区域的单链DNA而设计的反向寡核苷酸

序列编号49

为PCR设计的寡核苷酸引物

序列编号50

为PCR设计的寡核苷酸引物

序列编号51

由目标DNA区域构成的经扩增的寡核苷酸(基因库检索号No.NC001139 384569-384685酿酒酵母染色体VII)

序列编号52

由目标DNA区域构成的经设计的寡核苷酸(基因库检索号No.NC001139 384569-384685酿酒酵母染色体VII)n＝m5c

序列编号53

由目标DNA区域构成的经设计的寡核苷酸(基因库检索号No.NC001139 384569-384685酿酒酵母染色体VII)

序列编号54

为作成目标DNA区域的单链DNA而设计的反向寡核苷酸

序列编号55

为作成目标DNA区域的单链DNA而设计的反向寡核苷酸

序列编号56

为作成目标DNA区域的单链DNA而设计的反向寡核苷酸

序列编号57

为作成目标DNA区域的单链DNA而设计的反向寡核苷酸

序列编号58

为PCR设计的寡核苷酸引物

序列编号59

为作成目标DNA区域的单链DNA而设计的反向寡核苷酸

序列编号60

为作成目标DNA区域的单链DNA而设计的反向寡核苷酸

序列编号61

为作成目标DNA区域的单链DNA而设计的反向寡核苷酸

序列编号62

为作成目标DNA区域的单链DNA而设计的反向寡核苷酸

Claims (8)

1.一种对生物来源标本中所含基因组DNA中的DNA区域的甲基化后的DNA的含量进行测定的方法，其特征在于，具有：

(1)第一工序，对生物来源标本中所含基因组DNA来源的DNA试样实施利用甲基化敏感性限制酶的消化处理；

(2)第二工序，从在第一工序中得到的经过消化处理的DNA试样取得甲基化后的单链DNA，使该单链DNA和固定化甲基化DNA抗体结合而选择单链DNA；及

(3)第三工序，其具有前步骤和本步骤，

作为下述的各本步骤的前步骤，具有：

第一前步骤，将由第二工序选择的单链DNA从固定化甲基化DNA抗体分离而成为单链状态的DNA(正链)；

第二前步骤，使用在第一前步骤中成为单链状态的基因组来源的DNA(正链)，并使用下述延伸引物(正向引物)作为延伸引物，使该延伸引物延伸一次，由此使包含目标DNA区域的单链DNA(正链)延伸形成为双链DNA，所述延伸引物(正向引物)中有相对于单链状态的DNA(正链)所具有的碱基序列的部分碱基序列(正链)具有互补性的碱基序列(负链)，该部分碱基序列(正链)与所述目标DNA区域的碱基序列(正链)的3’末端相比更靠近3’末端侧；和

第三前步骤，其中，将在第二前步骤中延伸形成的双链DNA，暂时分离成包含目标DNA区域的单链DNA(正链)和包含相对于目标DNA区域具有互补性的碱基序列的单链DNA(负链)，

并且，作为本步骤，具有：

(a)第A步骤(本步骤)，其以生成的包含目标DNA区域的单链DNA(正链)为模板，将所述正向引物用作延伸引物，使该延伸引物延伸一次，由此使所述的包含目标DNA区域的单链DNA延伸形成为双链DNA；和

(b)第B步骤(本步骤)，其以包含相对于已生成的目标DNA区域具有互补性的碱基序列的单链DNA(负链)为模板，以下述延伸引物(反向引物)为延伸引物，使该延伸引物延伸一次，由此使所述的包含目标DNA区域的单链DNA延伸形成为双链DNA，所述延伸引物(反向引物)中有相对于包含与所述目标DNA区域具有互补性的碱基序列的单链DNA(负链)所具有的碱基序列的部分碱基序列(负链)具有互补性的碱基序列(正链)，该部分碱基序列(负链)与相对于所述目标DNA区域的碱基序列(正链)具有互补性的碱基序列(负链)的3’末端相比更靠近3’末端侧；

进而在将由所述各本步骤得到的经延伸形成的双链DNA暂时分离成单链状态之后反复进行第三工序的各本步骤，由此对所述目标DNA区域中甲基化后的DNA进行扩增直至达到可以检测的量，对被扩增的DNA的量进行定量。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，

固定化甲基化DNA抗体是甲基胞嘧啶抗体。

3.根据权利要求1或者2所述的方法，其中，

生物来源标本为哺乳动物的血液、体液、血清、血浆、细胞溶解液或组织溶解液。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，

生物来源标本中所含基因组DNA来源的DNA试样，是用不将该基因组DNA所具有的目标DNA区域作为识别切断部位的限制酶预先实施消化处理而成的DNA试样、或预先纯化而成的DNA试样。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，

第一工序具有：

第一(A)步骤，通过将含有目标DNA区域的单链DNA(正链)、和含有与甲基化敏感性限制酶的识别部位的碱基序列互补的碱基序列的掩蔽用寡核苷酸混合，从而选择该甲基化敏感性限制酶的识别部位被保护而成的单链DNA，以及，

第一(B)步骤，用甲基化敏感性限制酶对由第一(A)步骤选择的单链DNA进行消化处理。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，

甲基化敏感性限制酶是在生物来源标本中所含基因组DNA所具有的目标DNA区域中具有识别切断部位的限制酶或HhaI。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，

不进行第一工序中利用甲基化敏感性限制酶的消化处理而进行第二工序。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，

第二工序具有：第二(A)步骤，将在第一工序中得到的经过消化处理的DNA试样中所含的甲基化后的双链DNA分离成甲基化后的单链DNA；以及第二(B)步骤，使在第二(A)步骤中得到的甲基化单链DNA和固定化甲基化DNA抗体结合，

在利用第二(A)步骤将甲基化后的双链DNA分离成甲基化单链DNA时，添加反向寡核苷酸。

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