KR20110053358A - Ｄｎａ를 정량 또는 검출하는 방법 - Google Patents

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요시타카 도미가하라
히데오 사토
히로카즈 다루이
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수미토모 케미칼 컴퍼니 리미티드
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Abstract

본 발명은 검체 중에 포함되는 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA를 정량 또는 검출하는 방법 등에 관한 것이다.

Description

ＤＮＡ를 정량 또는 검출하는 방법{METHOD FOR QUANTIFICATION OR DETECTION OF DNA}
본 발명은 검체 중에 포함되는 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA를 정량 또는 검출하는 방법 등에 관한 것이다.
검체 중에 포함되는 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA를 검출하는 방법으로서는 예를 들면, 검체에 포함되는 생물 유래 게놈 DNA를 추출한 후, DNA폴리머라아제(polymerase)에 의한 DNA합성의 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction; 이하, PCR로 기재하기도 함)에 의하여 DNA를 증폭시켜서 검출하는 방법이나 생물 유래 검체 중의 DNA가 갖는 목적의 DNA영역에 형광 표지한 올리고뉴클레오티드를 혼성화시켜서 검출하는 방법 등이 알려져 있다(예를 들면, J. Cataract. Refract. Surg., 2007;33(4):635-641, Environ. Mol. Mutagen., 1991;18(4):259-262 참조).
본 발명은 검체 중에 포함되는 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA를 간편하게 정량 또는 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은,
[발명 1]
검체 중에 포함되는 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA를 정량 또는 검출하는 방법으로서,
(1) 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA인 피검 올리고뉴클레오티드를 함유하는 검체를 조제하는 제1 공정,
(2) 제1 공정에서 조제된 검체에 함유되는 피검 올리고뉴클레오티드와, 상기 피검 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합하고, 또한, 복수의 식별 기능을 갖는 검출 올리고뉴클레오티드를 혼합시켜서 상기 피검 올리고뉴클레오티드와 상기 검출 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 검출 복합체를 형성시키고, 상기 검출 복합체를 지지체에 고정화시키는 제2 공정 및,
(3) 제2 공정에서 형성한 검출 복합체에 포함되는 검출 올리고뉴클레오티드를 그 식별 기능에 의해 검출함으로써 상기 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA를 정량 또는 검출하는 제3 공정
을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.(이하, 본 발명 방법으로 기재하는 일이 있다.)
[발명 2]
복수의 식별 기능을 갖는 검출 올리고뉴클레오티드가, 복수의 올리고뉴클레오티드가 상보적으로 결합하여 이루어지는 복합 검출 올리고뉴클레오티드 또는 복수의 메틸화 부위를 갖는 메틸화 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 복합 검출 올리고뉴클레오티드인 발명 1에 기재된 방법.
[발명 3]
복합 검출 올리고뉴클레오티드가 메틸화 DNA를 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 발명 2에 기재된 방법.
[발명 4]
복합 검출 올리고뉴클레오티드의 식별 기능이, 결합된 메틸화 DNA항체의 식별 기능인 발명 2 또는 3에 기재된 방법.
[발명 5]
메틸화 DNA가 5―메틸사이토신인 발명 3 또는 4에 기재된 방법.
[발명 6]
메틸화 DNA항체가 메틸사이토신 항체인 발명 4 또는 5에 기재된 방법.
[발명 7]
검체가 하기 중 어느 하나의 생물 유래 검체인 발명 1∼6 중 어느 하나에 기재된 방법.
(a) 포유 동물 유래의 혈액, 체액, 분뇨, 체분비물, 세포 용해액 또는 조직 용해액,
(b) 포유 동물 유래의 혈액, 체액, 분뇨, 체분비물, 세포 용해액 및 조직 용해액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나로부터 추출된 DNA,
(c) 포유 동물 유래의 조직, 세포, 조직 용해액 및 세포 용해액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나로부터 추출된 RNA를 주형으로 하여 제작된 DNA,
(d) 세균, 진균 또는 바이러스로부터 추출된 DNA, 또는,
(e) 세균, 진균 또는 바이러스로부터 추출된 RNA를 주형으로 하여 제작된 DNA.
[발명 8]
발명 2∼7 중 어느 하나에 기재된 방법으로 이용하는 복합 검출 올리고뉴클레오티드를 이용한 검체의 표지 방법.
[발명 9]
발명 2∼7 중 어느 하나에 기재된 방법으로 이용하는 복합 검출 올리고뉴클레오티드와 상기 복합 검출 올리고뉴클레오티드를 표지할 수 있는 시약을 이용한 검체의 표지 방법.
[발명 10]
표지 대상이 DNA 또는 단백질인 발명 8 또는 9에 기재된 방법.
[발명 11]
제2 공정에 있어서, 검출 복합체와 지지체를 피검 올리고뉴클레오티드와 검출 올리고뉴클레오티드의 결합을 저해하지 않고, 또한, 상기 피검 올리고뉴클레오티드에 상보적으로 결합할 수 있는 특정 올리고뉴클레오티드를 통하여 결합시키는 발명 1∼10 중 어느 하나에 기재된 방법.
[발명 12]
목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA가 하기 중 어느 하나의 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA인 발명 1∼11 중 어느 하나에 기재된 방법.
(a) 목적으로 하는 DNA영역을 인식 절단 부위로 하지 않는 제한 효소로 미리 소화 처리되어 이루어지는 DNA
(b) 미리 정제되어 이루어지는 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA
(c) 혈액 중의 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 유리 DNA
(d) 미생물 게놈 유래의 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA, 또는,
(e) RNA로부터 역전사 효소에 의하여 생성된 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA.
[발명 13]
검체 중에 포함되는 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA를 정량 또는 검출하는 방법으로서,
(1) 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA인 피검 올리고뉴클레오티드를 함유하는 검체를 조제하는 제1 공정,
(2) 제1 공정에서 조제된 검체에 함유되는 피검 올리고뉴클레오티드와, 상기 피검 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합하고, 또한, 메틸화 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 검출 올리고뉴클레오티드를 혼합시켜서 상기 피검 올리고뉴클레오티드와 상기 검출 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 검출 복합체를 형성시키고, 상기 검출 복합체를 지지체에 고정화시키는 제2 공정 및,
(3) 제2 공정에서 형성한 검출 복합체에 포함되는 검출 올리고뉴클레오티드를 그 식별 기능에 의해 검출함으로써 상기 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA를 정량 또는 검출하는 제3 공정
을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
[발명 14]
식별 기능이 메틸화 DNA항체, 메틸사이토신 항체를 이용하는 것을 특징으로 하는 발명 13에 기재된 방법.
등을 제공하는 것이다.
도 1은 실시예 1에 있어서, 컨트롤 1처리(5’말단 FITC화 올리고뉴클레오티드를 사용), 컨트롤 2처리(3’말단 FLC화 올리고뉴클레오티드를 사용), X처리(메틸화 올리고뉴클레오티드(M1)를 사용) 및 Y처리(메틸화 올리고뉴클레오티드(M12)를 사용)를 실시하고, 피검 올리고뉴클레오티드를 검출하는 실험을 실시한 결과를 나타낸 도면이다. 도면 중, B는 피검 올리고뉴클레오티드 농도가 0.001pmol／10μL TE버퍼 용액에 대하여 흡광도를 측정한 값을 나타내고 있다. C는 피검 올리고뉴클레오티드 농도가 0.01pmol DNA／10μL TE버퍼 용액에 대하여 흡광도를 측정한 값을 나타내고 있다.
도 2는 실시예 2에 있어서, X처리(메틸화 올리고뉴클레오티드(M1)를 사용) 및 Y처리(메틸화 올리고뉴클레오티드(M12)를 사용)를 실시하고, 피검 올리고뉴클레오티드를 검출하는 실험을 실시한 결과를 나타낸 도면이다. 도면 중, B는 피검 올리고뉴클레오티드 농도가 0.0001pmol／10μL TE버퍼 용액에 대하여 형광을 측정한 값을 나타내고 있다. C는 피검 올리고뉴클레오티드 농도가 0.001pmol／10μL TE버퍼 용액에 대하여 형광을 측정한 값을 나타내고 있다. D는 피검 올리고뉴클레오티드 농도가 0.01pmol／10μL TE버퍼 용액에 대하여 형광을 측정한 값을 나타내고 있다.
도 3은 실시예 3에 있어서, 처리법 1(제1 올리고뉴클레오티드 만을 사용), 처리법 2(제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드를 사용) 및 처리법 3(제1 올리고뉴클레오티드, 제2 올리고뉴클레오티드 및 제3 올리고뉴클레오티드를 사용)을 실시하고, 피검 올리고뉴클레오티드를 검출하는 실험을 실시한 결과를 나타낸 도면이다. 도면 중, B는 피검 올리고뉴클레오티드 농도가 0.003pmol／10μL TE버퍼 용액에 대하여 형광을 측정한 값을 나타내고 있다. C는 피검 올리고뉴클레오티드 농도가 0.01pmol／10μL TE버퍼 용액에 대하여 형광을 측정한 값을 나타내고 있다. D는 피검 올리고뉴클레오티드 농도가 0.03pmol／10μL TE버퍼 용액에 대하여 형광을 측정한 값을 나타내고 있다.
도 4는 실시예 4에 있어서, 처리법 1(제1 올리고뉴클레오티드 및 제2, 1 올리고뉴클레오티드를 사용), 처리법 2(제1 올리고뉴클레오티드 및 제2, 2 올리고뉴클레오티드를 사용) 및 처리법 3(제1 올리고뉴클레오티드, 제2, 1 올리고뉴클레오티드 및 제2, 2 올리고뉴클레오티드를 사용)을 실시하고, 피검 올리고뉴클레오티드를 검출하는 실험을 실시한 결과를 나타낸 도면이다. 도면 중, B는 피검 올리고뉴클레오티드 농도가 0.003pmol／10μL TE버퍼 용액에 대하여 형광을 측정한 값을 나타내고 있다. C는 피검 올리고뉴클레오티드 농도가 0.01pmol／10μL TE버퍼 용액에 대하여 형광을 측정한 값을 나타내고 있다. D는 피검 올리고뉴클레오티드 농도가 0.03pmol／10μL TE버퍼 용액에 대하여 형광을 측정한 값을 나타내고 있다.
도 5는 실시예 5에 있어서, 처리법 1(제1 올리고뉴클레오티드를 사용) 및 처리법 2(제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드를 사용)를 실시하고, 피검 올리고뉴클레오티드를 검출하는 실험을 실시한 결과를 나타낸 도면이다. 도면 중, B는 피검 올리고뉴클레오티드 농도가 0.003pmol／10μL TE버퍼 용액에 대하여 형광을 측정한 값을 나타내고 있다. C는 피검 올리고뉴클레오티드 농도가 0.01pmol／10μL TE버퍼 용액에 대하여 형광을 측정한 값을 나타내고 있다. D는 피검 올리고뉴클레오티드 농도가 0.03pmol／10μL TE버퍼 용액에 대하여 형광을 측정한 값을 나타내고 있다.
이하에 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명 방법의 제1 공정의 “목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA인 피검 올리고뉴클레오티드를 함유하는 검체를 조제하는”은 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA를 DNA시료로서 조제하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서의 “검체”로서는 예를 들면, 식품, 하천, 토양, 일반 시판 제품의 표면 부착물 등을 들 수 있고, 이와 같은 검체에는 진균, 세균, 바이러스 등의 혼입 미생물이나 핵산이 포함될 수 있다.
식품에 있어서는, 식중독균의 유무의 검사와 원인균의 특정이 중요하며, 통상은 미생물 표면의 항원을 이용한 면역법이 사용된다. 그러나 면역법은 항원을 만들기 위해 다대한 노력을 필요로 하고, 또한, 병원균의 특정이 필요하게 된다. 즉, 미생물 검사에 있어서의 면역법은 미생물종의 특이성을 이용하고 있기 때문에 1회의 검사로 복수 균종을 정리하여 그 유무를 검사하는 것이 어려울 뿐만 아니라, 면역법을 확립할 수 없는 미생물에 대해서는, PCR법 등을 이용하는 등, 검사에는 다대한 노력이 필요하게 된다. 본 발명은 우선, 면역법에 의한 검사가 어려운 경우에도 유전자로부터 검사 방법을 확립할 수 있고, 다음으로, 복수의 미생물을 동시에 검출하는 것이 가능한 검사 방법을 제공할 수 있다. 즉, 본 발명은 비생물 유래 검체 중에 존재하는 진균류, 미생물류, 바이러스 등의 검사에 이용할 수 있다. 또, 본 발명을 이용함으로써 예를 들면, 식품 중의 혼입 미생물이나 바이러스를 검출하는 것이 가능하게 되고, 감염증의 검사나 식품 오염 검사 등에서 이용을 기대할 수 있다.
검체로서는, (a) 포유 동물 유래의 혈액, 체액, 분뇨, 체분비물, 세포 용해액 또는 조직 용해액, (b) 포유 동물 유래의 혈액, 체액, 분뇨, 체분비물, 세포 용해액 및 조직 용해액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나로부터 추출된 DNA, (c) 포유 동물 유래의 조직, 세포, 조직 용해액 및 세포 용해액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나로부터 추출된 RNA를 주형(鑄型)으로 하여 제작된 DNA, (d) 세균, 진균 또는 바이러스로부터 추출된 DNA 및 (e) 세균, 진균 또는 바이러스로부터 추출된 RNA를 주형으로 하여 제작된 DNA 등도 들 수 있다. 또한, 상기 조직이란, 혈액, 임파절 등을 포함하는 광의의 의미이고, 상기 체액으로서는, 혈장, 혈청, 임파액 등을 들 수 있고, 상기 체분비물로서는, 소변이나 젖 등을 들 수 있다.
검체 중에 포함되는 DNA로서는, 상기 생체 시료나 상기 혼입 미생물로부터 추출하여 얻어진 게놈 DNA, 게놈 DNA유래의 DNA단편, 또는 RNA 등을 들 수 있다. 또, 포유 동물 유래의 검체가 인간의 혈액, 체액 또는 체분비물 등인 경우에는, 인간의 정기 건강 진단에 있어서의 임상 검사 등에서 채취한 것을 이용할 수 있다. 혈액을 검체로서 이용하는 경우에는, 혈액으로부터 통상의 방법에 준하여 혈장 또는 혈청을 조제하고, 조제된 혈장 또는 혈청을 검체로 하여, 그 안에 포함되는 유리 DNA(위암 세포 등의 암세포 유래의 DNA가 포함된다)를 분석하면, 혈구 유래의 DNA를 피하여 위암 세포 등의 암세포 유래의 DNA를 해석할 수 있으며, 위암 세포 등의 암세포, 그를 포함하는 조직 등을 검출하는 감도를 향상시킬 수 있다.
게놈 DNA를 포유 동물 유래의 검체로부터 얻는 데는, 예를 들면, 시판하는 DNA추출용 키트 등을 이용하면 좋다. 또, RNA로부터 DNA를 얻기 위해서는, 시판하는 cDNA제작 키트 등의 역전사 효소를 이용하여 RNA로부터 DNA를 합성하는 키트를 이용하면 좋다. 또, 본 발명에 있어서는, 검체로서는, 인공적으로 합성된 DNA이어도 좋다.
본 발명에 있어서의 “포유 동물”이란, 동물계 척삭 동물문 척추 동물 아문 포유강(Mammalia)으로 분류되는 동물이며, 구체적으로는, 인간, 원숭이, 마모셋, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 개, 고양이 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 “체액”이란, 개체를 구성하는 세포 간에 존재하는 액체로서, 혈장과 간질액을 들 수 있으며, 대부분의 경우, 개체의 항상성의 유지 기능을 완수한다. 보다 구체적으로는, 임파액, 조직액(조직 간액, 세포 간액, 간질액), 체강액, 장막강액, 흉수, 복수, 심낭액, 뇌척수액(수액), 관절액(활액), 안방수(방수), 뇌척수액 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 “체분비액”이란, 외분비선으로부터의 분비액이다. 구체적으로는, 타액, 위액, 담즙, 췌액, 장액, 땀, 눈물, 콧물, 정액, 질액, 양수, 젖 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 “세포 용해액”이란, 세포 배양용의 10㎝ 플레이트 등으로 배양한 세포, 즉, 세포주나 초대 배양 세포, 혈구 세포 등을 파괴함으로써 얻어지는 세포 내액을 포함는 용해액이다. 세포막을 파괴하는 방법으로서는, 초음파에 의한 방법, 계면 활성제를 이용하는 방법, 알칼리 용액을 이용하는 방법 등을 들 수 있다. 또한, 세포를 용해하기 위해서는, 여러 가지 키트 등을 이용해도 좋다. 예를 들면 구체적으로는, 10㎝플레이트로 컨플루언트가 되기까지 세포를 배양한 후, 배양액을 버리고 0.6mL의 RIPA버퍼(1x TBS, 1％ nonidet P―40,0.5％ sodium deoxysholate, 0.1％ SDS, 0.004％ sodium azide)를 10㎝플레이트에 첨가한다. 4℃에서 15분간 플레이트를 천천히 흔들고나서 10㎝플레이트 상의 접착 세포를 스크레이퍼 등을 이용하여 벗기고, 플레이트 상의 용해액을 마이크로 튜브로 옮긴다. 용해액의 1／10용량의 10㎎／mL PMSF를 첨가하고나서 빙상에서 30―60분간 방치한다. 4℃에서 10분간 10,000xg로 원심하고, 상청(上淸)을 세포 용해액으로서 취득한다.
본 발명에 있어서의 “조직 용해액”이란, 포유 동물 등의 동물로부터 채취한 조직 중의 세포를 파괴함으로써 취득하는 세포 내액을 포함하는 용해액이다.
보다 구체적으로는, 동물로부터 취득한 조직의 중량을 측정한 후, 면도칼 등을 이용하여 조직을 소편으로 재단한다. 동결 조직을 슬라이스하는 경우에는, 더욱 작은 소편으로 할 필요가 있다. 재단 후, 빙랭 RIPA버퍼(프로테아제 인히비터, 포스파타아제 인히비터 등을 첨가해도 좋고, 예를 들면, RIPA버퍼의 1／10용량의 10㎎／mL PMSF를 첨가해도 좋다)를 조직 1g당 3mL의 비율로 첨가하고, 4℃에서 균질화한다. 균질화에는 소니케이터나 가압형 세포 파쇄 장치를 이용한다. 균질화의 작업에서는 용액을 항상 4℃로 유지하여, 발열을 억제하도록 한다. 균질화액을 마이크로 튜브로 옮기고, 4℃에서 10분간 10,000xg로 원심하고, 상청을 조직 용해액으로서 취득한다.
제1 공정은 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA인 피검 올리고뉴클레오티드를 함유하는 검체를 조제하는 공정이다.
본 발명 방법에 있어서의 “피검 올리고뉴클레오티드”란, 목적으로 하는 DNA영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드이다. 또, 피검 올리고뉴클레오티드는 목적 영역을 포함하는 DNA이어도 좋고, 목적 영역을 포함하는 RNA이어도 좋다. 구체적으로는, 게놈 DNA 중의 목적으로 하는 DNA영역이나 목적으로 하는 RNA(일부이어도 상관없다.)나 RNA를 주형으로 하여 제작된 DNA(일부이어도 상관없다.), 또는 그들을 포함하는 DNA단편이나 RNA단편을 들 수 있다. 또, 본 발명 방법에 있어서의 피검 올리고뉴클레오티드는 인공적으로 합성된 것이어도 좋다.
본 발명에 있어서는 예를 들면, 피검 올리고뉴클레오티드가 세균, 진균, 또는 바이러스로부터 추출된 DNA나 세균, 진균, 또는 바이러스로부터 추출된 RNA 또는 RNA를 주형으로 하여 제작된 DNA 및 그들의 부분 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드인 경우, 피검 올리고뉴클레오티드를 검출하는 것은 식품 중의 미생물 오염이나 감염증의 원인이 되는 미생물 또는 바이러스의 유무 및 그 종류의 추측이 가능하게 되는 지표를 정량 또는 검출한다. 또, 예를 들면, 피검 올리고뉴클레오티드가 혈액 중의 유리 DNA 및 그들의 부분 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 가리키는 경우, 피검 올리고뉴클레오티드를 검출하는 것은 혈액 중의 유리 DNA의 정량에 의해 암의 진행도의 추측이 가능하게 되는 지표를 정량 또는 검출한다. 또, 피검 올리고뉴클레오티드가 조직, 조직 용해액, 세포 용해액 또는 조직 용해액으로부터 추출된 DNA나 RNA, 또는 상기 RNA를 주형으로 하여 제작된 DNA 및 그들의 부분 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 가리키는 경우, 피검 올리고뉴클레오티드를 검출하는 것은 세포에서 기능하고 있는 RNA의 양을 정량하게 되고, RNA의 기능과 관련되는 세포의 기능이나 성질ㆍ상태의 추측이 가능하게 되는 지표를 정량 또는 검출하게 된다. 예를 들면, 조직 용해액으로부터 미생물이나 바이러스 유래의 RNA 또는 DNA가 검출되면, 미생물이나 바이러스의 조직 감염의 추측이 가능하게 된다. 예를 들면, 암에 있어서는, 혈액 중의 게놈 DNA 유래의 유리 DNA가 증가하는 것이 알려져 있으며, 혈중 유리 DNA를 정량 또는 검출하는 것으로 암의 진행 상태(정도)를 추측할 수 있는 지표로 할 수 있다. 이 경우, 피검 올리고뉴클레오티드로서는, 혈액 중의 게놈 DNA유래의 유리 DNA 또는 상기 유리 DNA에 포함되는 목적으로 하는 DNA영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 그들의 부분 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나가 바람직하다.
제1 공정에 있어서의 “목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA인 피검 올리고뉴클레오티드를 함유하는 검체를 조제하는”이란, 검출하고 싶은 목적으로 하는 DNA영역을 포함하는 DNA시료를 피검 올리고뉴클레오티드로서 취득하는 것도 포함한다. 예를 들면, RNA 상의 염기 배열을 검출하고 싶은 경우, 상기 RNA를 주형으로 하여 역전사 효소에 의해 합성된 DNA를, 상기 RNA 상의 검출하고 싶은 염기 배열의 상보적 염기 배열을 목적으로 하는 DNA영역으로서 포함하는 피검 올리고뉴클레오티드로서 취득한다. 또, RNA를 검출하고 싶은 경우에는, “목적으로 하는 영역을 갖는 RNA인 피검 올리고뉴클레오티드를 검체 중으로부터 취득하는”이란, 검출하고 싶은 목적으로 하는 RNA영역을 포함하는 RNA시료를 피검 올리고뉴클레오티드로서 취득하는 것이다.
제1 공정에서 취득되는 피검 올리고뉴클레오티드가 DNA인 경우에는, 상기 피검 올리고뉴클레오티드가 갖는 목적으로 하는 영역을 인식 절단 부위로 하지 않는 제한 효소로 미리 소화 처리되어 있어도 좋고, 또, 미리 정제되어 이루어지는 DNA시료 중에 포함되어 있어도 좋다. 그 밖에, 제1 공정에서 취득되는 DNA로서, 혈액 중의 유리 DNA, 미생물 게놈 유래의 DNA, 검체 중의 RNA로부터 역전사 효소에 의하여 제작된 DNA 등을 들 수 있다. 나아가서는, “목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA”는 합성된 DNA이어도 좋다. 또, 제1 공정에서 취득되는 피검 올리고뉴클레오티드가 RNA로서는, 조직 용해액, 세포 용해액의 유리 RNA, 정제된 RNA, 미생물로부터 취득된 RNA 등을 들 수 있다.
제1 공정에 있어서는, 목적으로 하는 영역의 염기 배열을 포함하는 게놈 DNA를 취득하는 데는, 검체가 포유 동물 유래인 경우에는 예를 들면, 시판하는 DNA추출용 키트(Genfind v2 Kit(베크만ㆍ콜터사제), FastPure DNA Kit(다카라바이오사제)) 등을 이용하여 DNA를 추출하면 좋다. 또는, 검체가 진균과 같은 미생물인 경우, Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory Press)에 기재되어 있는 바와 같은 일반적인 효모 게놈의 조제법 등을 이용하면 좋고, 검체가 대장균과 같은 원핵 생물인 경우, Molecular Cloning -A Laboratory Manual-(Cold Spring Harbor Laboratory Press)에 기재되어 있는 바와 같은 일반적인 미생물 게놈 조제법 등을 이용하면 좋다.
또, 포유 동물 유래의 조직이나 세포주 등의 검체로부터 RNA를 취득하고 싶은 경우에는, 조직이나 세포주 등으로부터 시판하는 RNA추출용 키트(ISOGEN(311-02501) (NIPPON GENE사제), 또는, FastRNA Pro Green Kit(후나코시사제), FastRNA Pro Blue Kit(후나코시사제), FastRNA Pro Red Kit(후나코시사제) 등)를 이용하여 RNA를 추출할 수 있다. RNA를 주형으로 하여 DNA를 합성하기 위해서는, 역전사 효소를 이용하면 좋고, 시판하는 키트(트랜스크립터 하이 피델리티cDNA 합성 키트, 로슈 디아그노스티크사제) 등을 이용할 수 있다. 또, 바이러스 입자를 추출하고나서 바이러스의 DNA를 추출해도 좋다. 또, 시판하는 키트(QuickGene RNA tissue kit SⅡ, 후지 필름사제) 등을 이용하여 바이러스 게놈을 추출해도 좋다. 또는, 바이러스가 감염된 조직으로부터 RNA를 추출하여 역전사 효소에 의해 바이러스 유래의 DNA를 취득해도 좋고, 바이러스가 감염된 조직으로부터 DNA를 취득해도 좋다.
또, 검체가 식품인 경우, 식품으로부터 미생물 등을 분리하고나서 DNA를 취득해도 좋고, 식품에 포함되는 미생물 이외의 예를 들면, 바이러스 등의 게놈 DNA와 미생물 유래의 게놈 DNA를 동시에 취득해도 좋다.
또, 검체가 포유 동물 유래의 조직이고, 목적으로 하는 DNA영역이 바이러스 유래의 DNA인 경우에는 조직 중으로부터 시판하는 RNA추출용 키트(ISOGEN(311-02501) NIPPON GENE사제), 또는, FastRNA Pro Green Kit(후나코시사제), FastRNA Pro Blue Kit(후나코시사제), FastRNA Pro Red Kit(후나코시사제) 등을 이용하여 RNA를 추출하고, 역전사 효소에 의하여 DNA를 취득해도 좋다. 또, 검체가 포유 동물 유래의 검체인 경우, 바이러스 입자를 추출하고나서 바이러스의 DNA를 추출해도 좋고, 또는 바이러스 입자를 추출하고나서 시판하는 키트(QuickGene RNA tissue kit SⅡ, 후지 필름사제) 등을 이용하여 바이러스 RNA를 추출하고, 역전사 효소에 의해 바이러스 유래의 DNA를 취득해도 좋다. 바이러스가 감염된 조직으로부터 RNA를 추출하여 역전사 효소에 의해 바이러스 유래의 DNA를 취득해도 좋고, 바이러스가 감염된 조직으로부터 DNA를 취득하여 바이러스 유래의 DNA를 취득해도 좋다. RNA로부터 역전사 효소에 의해 DNA를 취득하는 경우에는, 시판하는 키트(트랜스크립터 하이 피델리티cDNA 합성 키트, 로슈 디아그노스티크사제) 등을 이용해도 좋다.
본 발명에 있어서의 “목적으로 하는 DNA영역”(이하, 목적 영역으로 기재하는 일도 있다.)이란, 검체 중에 포함되는 DNA 중, 본 발명에 의해 검출 또는 정량하고 싶은 DNA영역이다. 검체가 DNA인 경우의 목적으로 하는 DNA영역이란, DNA의 염기 배열 상의 소정의 염기 배열이며, 검체가 RNA인 경우에는, RNA로부터 역전사 효소에 의해 제작된 DNA 상의 염기 배열로서, RNA 상의 검출 또는 정량 대상이 되는 소정의 염기 배열의 상보적인 염기 배열이다. “목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA”는, 상기 DNA가 갖는 목적으로 하는 DNA영역 내의 염기 배열에 인식 절단 부위를 갖지 않는 제한 효소로 미리 소화 처리되어 이루어지는 DNA이어도 좋고, 또, 미리 정제되어 이루어지는 DNA시료, 혈액 중의 유리 DNA, 미생물 게놈 유래의 DNA, 검체 중의 RNA로부터 역전사 효소에 의하여 합성된 DNA 등이어도 좋다.
“목적으로 하는 DNA영역”은 게놈 중에 복수 나타나는 염기 배열(이하, 반복 배열으로 기재하는 일도 있다.)이어도 좋고, 질환의 지표로 되는 염기 배열이면 더욱 좋다. 예를 들면, 암에 있어서는, 혈액 중의 게놈 DNA유래의 유리 DNA가 증가하는 것이 알려져 있으며, 이 경우, 피검 올리고뉴클레오티드와는 혈액 중의 유리 DNA 중의 반복 배열이나 그 부분 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다. 이들 반복 배열이나 그 부분 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 정량된 값은 암의 진행 정도를 나타내는 지표로 할 수 있다. 또한, 후술하지만, 반복 배열로서는, 단순 반복 배열(종렬 반복 배열 또는 탠덤 리피트라 불린다), 산재 반복 배열, 중복 유전자 또는 위유전자 등이어도 좋다.
본 발명에 있어서의 “목적으로 하는 RNA영역”이란, 하나는 생물 세포 중의 RNA 상의 검출하고 싶은 염기 배열을 의미한다. 생물 유래 검체 중에 포함되는 “목적으로 하는 RNA영역을 갖는 RNA”로서는, 검체로부터 추출된 RNA를 들 수 있고, 구체적으로는, 리보솜RNA, 메신저RNA, 트랜스퍼RNA 및 마이크로RNA 등을 들 수 있다. RNA는 숙주의 게놈으로부터 RNA폴리머라아제에서 전사된 것 뿐만 아니라, RNA를 게놈으로 하는 바이러스의 게놈RNA 등도 포함하는 것으로, RNA이면 무엇이어도 좋다.
본 발명에 있어서의 “목적으로 하는 DNA영역”은 질환 등과 관련된 유전자이어도 좋다. 예를 들면, 암과 관련된 유전자로서는, Lysyl oxidase, HRAS-like suppressor, bA305P22.2.1, Gamma filamin, HAND1, Homologue of RIKEN 2210016F16, FLJ32130, PPARG angiopoietin-related protein, Thrombomodulin, p53-responsive gene 2, Fibrillin2, Neurofilament3, disintegrin and metalloproteinase domain 23, G protein-coupled receptor 7, G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor, Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2 등의 유용 단백질 유전자의 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역) 등을 들 수 있다. 상기 “목적으로 하는 DNA영역”에 있어서 메틸화된 DNA를 개개로 검출 또는 정량해도 좋지만, 예를 들면, 하나의 검출계에 있어서, 보다 많은 상기 “목적으로 하는 DNA영역”을 정량 또는 검출하면, 그만큼 정량 정밀도 및 검출 감도가 향상된다.
구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 Lysyl oxidase유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 하나 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 Lysyl oxidase유전자의 엑손(exon) 1과, 그 5’ 상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, Lysyl oxidase유전자의 염기 배열(Genbank Accession No. AF270645에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 16001∼18661로 나타내어지는 염기 배열에 상당한다.)을 들 수 있다. 본 영역에 있어서는, 인간 유래의 Lysyl oxidase단백질의 아미노 말단의 메티오닌을 코딩하는 ATG코돈(codon)이 염기 번호 18031∼18033에 나타내어져 있으며, 상기 엑손 1의 염기 배열은 염기 번호 17958∼18662에 나타내어져 있다.
또, 구체적으로 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 HRAS-like suppressor유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 하나 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 HRAS-like suppressor유전자의 엑손 1과, 그 5’상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, HRAS-like suppressor유전자의 염기 배열(Genbank Accession No. AC068162에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 172001∼173953으로 나타내어지는 염기 배열에 상당한다.)을 들 수 있다. 본 영역에 있어서는, 인간 유래의 HRAS-like suppressor유전자의 엑손 1의 염기 배열은 염기 번호 173744∼173954에 나타내어져 있다.
또, 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 bA305p22.2.1유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 하나 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 bA305p22.2.1유전자의 엑손 1과, 그 5’ 상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, bA305P22.2.1유전자의 염기배열(Genbank Accession No. AL121673에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 13001∼13889로 나타내어지는 염기 배열에 상당한다.)을 들 수 있다. 본 영역에 있어서는, 인간 유래의 bA305P22.2.1단백질의 아미노 말단의 메티오닌을 코딩하는 ATG코돈이 염기 번호 13850∼13852에 나타내어져 있으며, 상기 엑손 1의 염기 배열은 염기 번호 13664∼13890에 나타내어져 있다.
또, 구체적으로 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 Gamma filamin유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 하나 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 Gamma filamin유전자의 엑손 1과, 그 5’상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, Gamma filamin유전자의 염기 배열(Genbank Accession No. AC074373에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 63528∼64390으로 나타내어지는 염기 배열의 상보적 배열에 상당한다.)을 들 수 있다. 본 영역에 있어서는, 인간 유래의 Gamma filamin단백질의 아미노 말단의 메티오닌을 코딩하는 ATG코돈이 염기 번호 64101∼64103에 나타내어져 있으며, 상기 엑손 1의 염기 배열은 염기 번호 63991∼64391에 나타내어져 있다.
또, 구체적으로 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 HAND1유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 하나 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 HAND1유전자의 엑손 1과, 그 5’상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, HAND1유전자의 염기 배열(Genbank Accession No. AC026688에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 24303∼26500으로 나타내어지는 염기 배열의 상보적 배열에 상당한다.)을 들 수 있다. 본 영역에 있어서는, 인간 유래의 HAND1단백질의 아미노 말단의 메티오닌을 코딩하는 ATG코돈이 염기 번호 25959∼25961에 나타내어져 있으며, 상기 엑손 1의 염기 배열은 염기 번호 25703∼26501에 나타내어져 있다.
또, 구체적으로 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 Homologue of RIKEN 2210016F16유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 하나 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 Homologue of RIKEN 2210016F16유전자의 엑손 1과, 그 5’상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, Homologue of RIKEN 2210016F16유전자의 염기 배열(Genbank Accession No. AL354733에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 157056∼159000으로 나타내어지는 염기 배열의 상보적 염기 배열에 상당한다.)을 들 수 있다. 본 영역에 있어서는, 인간 유래의 Homologue of RIKEN 2210016F16단백질의 엑손 1의 염기 배열은 염기 번호 158448∼159001에 나타내어져 있다.
또, 구체적으로 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 FLJ32130유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 하나 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 FLJ32130유전자의 엑손 1과, 그 5’상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, FLJ32130유전자의 염기 배열(Genbank Accession No. AC002310에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 1∼2379로 나타내어지는 염기 배열의 상보적 염기 배열에 상당한다.)을 들 수 있다. 본 영역에 있어서는, 인간 유래의 FLJ32130단백질의 아미노 말단의 메티오닌을 코딩하는 ATG코돈이 염기 번호 2136∼2138에 나타내어져 있으며, 상기 엑손 1로 생각되는 염기 배열은 염기 번호 2136∼2379에 나타내어져 있다.
또, 구체적으로 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 PPARG angiopoietin-related protein유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 하나 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 PPARG angiopoietin-related protein유전자의 엑손 1과, 그 5’상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 배열 번호 8로 나타내어지는 염기 배열을 들 수 있다. 본 영역에 있어서는, 인간 유래의 PPARG angiopoietin-related protein단백질의 아미노 말단의 메티오닌을 코딩하는 ATG코돈의 5’측 약 1200염기∼2000염기가 포함되는 영역이 바람직하다.
또, 구체적으로 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 Thrombomodulin유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 하나 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 Thrombomodulin유전자의 엑손 1과, 그 5’상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, Thrombomodulin유전자의 염기 배열(Genbank Accession No. AF495471에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 1∼6096으로 나타내어지는 염기 배열에 상당한다.)을 들 수 있다. 본 영역에 있어서는, 인간 유래의 Thrombomodulin단백질의 아미노 말단의 메티오닌을 코딩하는 ATG코돈이 염기 번호 2590∼2592에 나타내어져 있으며, 상기 엑손 1의 염기 배열은 염기 번호 2048∼6096에 나타내어져 있다.
또, 구체적으로 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 p53-responsive gene 2유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 하나 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 p53-responsive gene 2유전자의 엑손 1과, 그 5’상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, p53-responsive gene 2유전자의 염기 배열(Genbank Accession No. AC009471에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 113501∼116000으로 나타내어지는 염기 배열의 상보적 배열에 상당한다.)을 들 수 있다. 본 영역에 있어서는, 인간 유래의 p53-responsive gene 2유전자의 엑손 1의 염기 배열은 염기 번호 114059∼115309에 나타내어져 있다.
또, 구체적으로 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 Fibrillin2유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 하나 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 Fibrillin2유전자의 엑손 1과, 그 5’상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, Fibrillin2유전자의 염기 배열(Genbank Accession No. AC113387에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 118801∼121000으로 나타내어지는 염기 배열의 상보적 배열에 상당한다.)을 들 수 있다. 본 영역에 있어서는, 인간 유래의 Fibrillin2유전자의 엑손 1의 염기 배열은 염기 번호 119892∼112146에 나타내어져 있다.
또, 구체적으로 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 Neurofilament3유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 하나 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 Neurofilament3유전자의 엑손 1과, 그 5’상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, Neurofilament3유전자의 염기 배열(Genbank Accession No. AF106564에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 28001∼30000으로 나타내어지는 염기 배열의 상보적 배열에 상당한다.)을 들 수 있다. 본 영역에 있어서는, 인간 유래의 Neurofilament3유전자의 엑손 1의 염기 배열은 염기 번호 28615∼29695에 나타내어져 있다.
또, 구체적으로 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 disintegrin and metalloproteinase domain 23유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 하나 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 disintegrin and metalloproteinase domain 23유전자의 엑손 1과, 그 5’상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, disintegrin and metalloproteinase domain 23유전자의 염기 배열(Genbank Accession No. AC009225에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 21001∼23300으로 나타내어지는 염기 배열에 상당한다.)을 들 수 있다. 본 영역에 있어서는, 인간 유래의 disintegrin and metalloproteinase domain 23유전자의 엑손 1의 염기 배열은 염기 번호 22195∼22631에 나타내어져 있다.
또, 구체적으로 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 G protein-coupled receptor 7유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 하나 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 G protein-coupled receptor 7유전자의 엑손 1과, 그 5’상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, G protein-coupled receptor 7유전자의 염기 배열(Genbank Accession No. AC009800에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 75001∼78000으로 나타내어지는 염기 배열에 상당한다.)을 들 수 있다. 본 영역에 있어서는, 인간 유래의 G protein-coupled receptor 7유전자의 엑손 1의 염기 배열은 염기 번호 76667∼77653에 나타내어져 있다.
또, 구체적으로 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 하나 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor유전자의 엑손 1과, 그 5’상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor유전자의 염기 배열(Genbank Accession No. AC008971에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 57001∼60000으로 나타내어지는 염기 배열의 상보적 배열에 상당한다.)을 들 수 있다. 본 영역에 있어서는, 인간 유래의 G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor유전자의 엑손 1의 염기 배열은 염기 번호 57777∼59633에 나타내어져 있다.
또, 구체적으로 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 하나 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2유전자의 엑손 1과, 그 5’상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2유전자의 염기 배열(Genbank Accession No. AC026802에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 78801∼81000으로 나타내어지는 염기 배열의 상보적 배열에 상당한다.)을 들 수 있다. 본 영역에 있어서는, 인간 유래의 Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2유전자의 엑손 1의 염기 배열은 염기 번호 80280∼80605에 나타내어져 있다.
“목적으로 하는 DNA영역”(이하, 목적 영역으로 기재하는 일도 있다.)으로서는 예를 들면, MLH1, RUNX3, CDH1, TIMP3, CSPG, RARβ, 14-3-3σ, CALCA, HIC1, ESR1, PTEN, SOCS1, BLT1, ESR2, MTMG, TWIST, INK4, CDKN2, GSTP, DCR2, TP73, PGR, HIC2, MTHFR, TFF1, MLLT7, SLC5A8, THBS1, SOCS2, ACTB, CDH13, FGF18, GSTM3, HSD17B4, HSPA2, PPP1R13B, PTGS2, SYK, TERT, TITF1, BRACA1, AATF, ABCB1, ABCC1, ABI1, ABL1, AF1Q, AF3P21, AF4, AF9, AFF3, AKAP12, AKAP9, ALEX3, ALK, ALOX15, APAF1, APC, ARHA ARHGAP26, ARHGEF12, ARNT, ATBF1, ATF1, ATM, AXIN2, BCAS3, BCAS4, BCL1, BCL10, BCLllA, BCL11B, BCL2, BCL5, BCL7A, BCR, BIRC3, BMPR1A, BRCA2, BRD4, BRIP1, BTG1, BUB1B, CAGE-1, CARS, CASC5, CCDC6, CCND2, CCND3, CDHll, CDKN1B, CDKN2A, CDX2, CEP110, CKN1, CLP1, CLTC, CLTCL1, CNC, COL1A1, COX6C, CREBBP, CXXC6, DAB2IP, DDIT3, DDX43, DIRC1, DIRC2, DKK1, E2F3, EEN, EGFR, ELL, EPS15, ERBB2, ERC1, ERCC1, ERCC4, ERG, ETV1, ETV6, EVIl, EWSR1, EXT1, EXT2, FANCA, FANCD2, FANCF, FAS, FBP17, FCRL4, FEV, FGFR1, FHIT, FLI1, FOX03A, FUS, FVT1, GAS7, GLI1, GNAS, GOLGA5, GOPC, GRB2, HCMOGT- l, HIST1H4I, HLF, HMGA2, HOXA13, HOXCll, HOXC13, HOXD13, HSPBAP1, HSPCB, HSPD1, HSPH1, IKZF2, INTS6, IRF4, JAG1, JAG2, JAK2, JARID1A, JAZF1, JMJD2C, JUN, KIT, KITLG, KLF5, KLF6, LASP1, LDB1, LHFP, LM01, LMO2, LPHN2, LPP, LYL1, MADH4, MAF, MAFB, MDM2, MDS2, MET, MKL1, MLF1, MLH1, MLL, MLLT10, MMP2, MN1, MRE11B, MSF, MSH2, MSH6, MSI2, MUC1, MUTYH, MXIl, MYC, MYH9, MYST3, NF1, NFKB1, NIN, NKX2-5, NONO, NOTCH1, N-RAS, NTRK3, NUMA1, NUP214, NUP98, OLIG2, P53, PALB2, PAX2, PAX5, PAX7, PAX9, PBX1, PCM1, PCSK7, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PHOX2B, PICALM, PLAG1, PLCB1, PLK, PML, PMS1, POLH, POU5F1P1, POU6F2, PPP1R13L, PRDM16, PRRX1, PSIP1, PTCH, RABEP1, RAD51L1, RAD53, RANBP17, RAP1GDS1, RAP2B, RARA, RASSF1, RB1, RBL2, RBM15, RBM5, RCHY1, RECQL, RECQL5, RET, RUNX, RUNX1T1, SBDS, SDHC, SDHD, SET, SHH, SIL, SIX1, SNAI2, SPI1, SPINK7, STARD3, STAT3, STKll, STK4, SUFU, SYK, SYNP02, TBX2, TCF3, THBS2, THRAP3, TMPRSS2, TNF, TOP1, TPM4, TPR, TRIM24, TRIM33, TRIPll, TSC1, TSC2, TSHR, TTL, VAV1, VHL, WFDC1, WT1, WWOX, XPC, ZBTB16, ZNF146, ZNF217 등의 심벌로 나타내어지는 유전자의 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열을 포함하는 DNA의 영역 등을 들 수 있다. 본 발명의 방법에 있어서, 이들 목적으로 하는 DNA영역을 개개로 정량 또는 검출해도 좋지만, 하나의 검출계에 있어서, 이들 목적으로 하는 DNA영역을 보다 많이 정량 또는 검출하면, 그만큼 정량 정밀도 및 검출 감도가 향상된다.
본 발명에 있어서의 목적 영역이 미생물 유래의 염기 배열인 경우, 목적 영역으로서는, 검체 중으로부터 추출한 게놈 DNA 또는 DNA단편, 또는 검체 중으로부터 추출한 RNA를 역전사 효소에 의해 DNA로 한 염기 배열을 들 수 있다. 따라서, 검출 올리고뉴클레오티드와의 상보적인 결합이 가능한 염기 배열로서는, 상기 미생물에 특이적인 영역을 선택하면 좋다. 예를 들면, 본 발명에 있어서의 목적 영역이 미생물의 염기 배열인 경우, 목적 영역을 검체 중으로부터 선택적으로 추출하기 위해서는, 미생물 게놈 DNA, 또는 검체 중으로부터 추출한 RNA를 역전사 효소에 의해 DNA 등의 염기 배열 중, 목적 영역 근처에 있는 미생물 특유의 염기 배열을 특정 올리고뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 염기 배열로 하면 좋다.
본 발명에 있어서의 “목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA”로서는, 그램 양성균, 그램 음성균 등의 세균, 진균, 바이러스, 항원성 원충 등의 미생물 등유래의 DNA나 상기 미생물 등 유래의 RNA로부터 역전사 효소에 의해 취득한 DNA를 들 수 있다. 예를 들면, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma pneumoniae, Borrelia burgdorferi B31, Rickettsia prowazekii, Treponema pallidum, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Helicobacter pylori J99, Helicobacter pylori 26695, Haemophilus influenzae Rd, Mycobacterium tuberculosis H37Rv, Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Serratia marcescens, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella enterica, Campylobacter jejuni subsp. Jejuni, Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus, Bacillusu cereus, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberuculosis, Trichophyton ruburum, Trichophyton mentagrophytes, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Pneumocystis carinii, Coccidioides immitis, Cytomegalovirus, human herpesvirus 5, Epstein-Barr virus, Human Immunodeficiency Virus, Human Papilloma Virus, Enterovirus, Norovirus Influenza Virus, Toxoplasma gondii, Cryptosporidium parvum, Entamoeba histolytica의 게놈 DNA 또는 RNA로부터 역전사 효소에 의해 제작된 DNA는 검체 중의 감염증 원인균 또는 식품 중의 식중독 원인균 등의 검출에 이용할 수 있다.
생체 검사 샘플 중 또는 식품 등의 일반 제품 중에 포함되는 병원성 미생물 등의 유무를 검사하는 경우, 통상, 각각 미생물 등의 항원에 대한 면역법에 의한 검사에 의해 병원성 미생물 등의 유무의 결정 또는 병원성 미생물 등의 특정을 한다. 그러나 면역법에 의한 검사에 이용하는 항체 제작은 용이하지 않은 경우가 있으며, 또한, 복수의 균을 검출하기 위해서는, 각각 세균 등의 항원에 대한 항체를 제작할 필요가 있다. 그러나 본 발명을 이용함으로써 항체를 제작하지 않고 검사가 가능하게 된다. 즉, 본 발명을 이용함으로써 항체 제작이 어려운 미생물 또는 항체가 제작되어 있지 않은 미생물에 대한 간이한 검사법의 제공이 가능하게 된다. 또, 본 발명에서는, 다른 미생물의 염기 배열을 동시에 검사할 수 있는 것에서, 하나의 검체 중에 포함되는 몇 종류의 미생물을 동시에 검출할 수 있게 된다. 이들의 미생물로서는 구체적으로는, Listeria monocytogenes, Salmonella enterica, Campylobacter jejuni subsp. Jejuni, Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus, Bacillusu cereus, Clostridium botulinum, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberuculosis, Clostridium perfringens 등의 식중독균이 알려져 있는데, 이들의 균을 동시에 검출하는 기술은 알려져 있지 않다. 본 발명에서는 복수의 염기 배열의 동시 검출이 가능하기 때문에 복수의 식중독균의 유무를 동시에 검사하는 것이 가능하게 된다. 또, 검출 대상의 염기 배열로서, CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)영역과 같이, 게놈 중에 복수 발견되는 염기 배열을 후술하는 특정 올리고뉴클레오티드에 의해 선택(결합)하는 경우, 1게놈 중의 1유전자를 검출하는 것보다도 고감도에서의 검출이 가능하게 된다. 이와 같은 기술은 감염증의 진단이나 식중독균의 신속 검출에도 유용하다. 또, 본 발명은 환경 중의 미생물의 게놈 DNA를 검출함으로써 산업상의 유용한 균의 동정(同定)이나 토양이나 하천이나 호수늪의 저질(底質) 등의 미생물군의 간이 조사 등에도 이용할 수 있다. 환경 중에 서식하는 미생물 중, 예를 들면, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum deltaH, Aquifex aeolicus, Pyrococcus horikoshii OT3, Archaeoglobus fulgidus, Thermotoga maritima MSB8, Aeropyrum pernix K1, Haloferax mediterranei 등의 서식을 확인하는 것이 가능하게 된다. 또, Geobacter sulfurreducens와 같이 공업상 이용할 수 있는 세균, Streptococcus thermophilus와 같은 발효에 이용되는 미생물 등의 검출 및 동정도 가능하게 된다.
예를 들면, 미생물 중의 게놈을 검출하기 위한 목적 영역과 후술하는 검출 올리고뉴클레오티드가 상보적으로 결합하는 영역으로서는 구체적으로는, Genbank Accession No. NC_OO1139 등에 나타내어지는 효모 염색체(Ⅶ)의 염기 번호 271743-272083의 염기 배열, Genbank Accession No. NC_OO1139 등에 나타내어지는 효모 염색체(Ⅶ)의 염기 번호 384569-384685의 염기 배열과 같이, 유전자를 코딩하지 않는 염기 배열로도 좋다. 또, 여러 가지 병원성 미생물에 공통되는 특징적인 유전자의 병원성 미생물로 보존된 염기 배열을 검출 대상으로 하는 것은 복수의 병원성 미생물을 동시에 검출하는 방법을 제공할 수 있는 것이기 때문에 유용하다. 구체적으로는, mce-family유전자(Micobacterium tuberculosis), 13번 염색체 상의 tRNA-Tyr염기 배열(Cryptococcus neoformans), chitin synthase activator(Chs3)는 Aspergillus fumigatus 및 Neosartorya속에 특유의 염기 배열을 갖는 것에서, 인간의 담, 폐의 생체 검사 샘플 중으로부터 추출한 DNA 중에 이들 미생물 유래의 DNA가 포함되는지의 여부를 검정하는 것으로, 미생물에 의한 감염증의 검정에 이용할 수 있다. 또, actA(Listeria monocytogenes), pyrG(NC_002163, Campylobacter jejuni subsp. jejuni) 등은 식중독균에 특유 공통된 유전자인 것에서, 이들의 유전자는 식중독에 있어서의 미생물 검정에 이용할 수 있다. 또, thrA는 Salmonella enterica, Yersinia enterocolitica, Escherichia coli로 보존된 배열을 갖고 있으며, 하나의 유전자로 복수의 미생물을 검출하는 것도 가능하다.
“반복 배열”이란, 게놈 중에 같은 소정의 배열이 복수개 나타나는 염기 배열을 의미하고 있다. 이와 같은 반복 배열로서는, 단순 반복 배열(종렬 반복 배열 또는 탠덤 리피트라 불린다)이나 산재 반복 배열 등이 알려져 있다.
단순 반복 배열은 같은 배열이 같은 방향에 이웃하여 존재하는 것을 특징으로 하고, 세틀라이트DNA, 미니 세틀라이트, 마이크로 세틀라이트, 센트로미어, 텔로미어, 동원체, 리보솜 집단 유전자와 같은 일련의 염기 배열 등이 알려져 있다.
산재 반복 배열은 이웃하지 않고 산재하는 것을 특징으로 하고, 레트로 트랜스포존에 유래하는 DNA라고 생각되고 있다. 산재 반복 배열은 염기 배열의 길이에 의해 SINE(Short Interspersed Repetitive Element: 단쇄 산재 반복 배열)와 LINE(Long Interspersed Elements: 장쇄 산재 반복 배열)로 분류되고, 인간의 염기 배열로서는, 각각 Alu배열이나 LINE―1배열이 대표적인 반복 배열로서 알려져 있다. 또, RNA나 단백질로부터 역전이한 불활성인 프로세싱 완료의 위유전자, 유전자 중복에 의해 증폭한 유전자 배열도 알려져 있다.
중복 유전자란, 하나의 게놈 상에 복수의 높은 상동성(相同性)을 갖는 유전자가 존재하는 경우를 가리키고, 대부분의 경우는 1유전자의 근처에 탠덤하게 나열하여 존재하는 염기 배열이다. 또한, 위유전자에도 중복 유전자에 포함되는 것이 알려져 있다.
반복 배열의 구체적인 예로서는 예를 들면, 비교적 짧은 염기 배열로 이루어지는 반복으로서는, (A)n, (T)n, (GA)n, (CA)n, (TAA)n, (GGA)n, (CAGC)n, (CATA)n, (GAAA)n, (TATG)n, (TTTG)n, (TTTA)n, (TTTC)n, (TAAA)n, (TTCA)n, (TATAA)n, (TCTCC)n, (TTTCC)n, (TTTAA)n, (TTTTC)n, (TTTTA)n, (TTTTG)n, (CAAAA)n, (CACCC)n, (TATATG)n, (CATATA)n, (TCTCTG)n, (AGGGGG)n, (CCCCCA)n, (TGGGGG)n(n은 반복수를 의미한다) 등의 배열이 알려져 있으며, 전사 인자에 유래하는 배열로서는, hAT그룹으로서, MER1-Charlie, Zaphod가 상기되고, Tc-1그룹으로서, MER2-Tigger, Tc-1, Mariner가 상기된다. 그 밖에, 구체적으로는, Tigger1, Tigger2a, Tigger5, Charlie4a, Charlie7 등이 알려져 있다. 이들의 배열은 일반적으로 짧고, 또한, 단순한 염기 배열이고, 후술하는 특정 접착 배열 및 검출용 접착 배열을 설정하는 것은 어렵지만, 본 발명에 있어서의 후술하는 특정 접착 배열 및 검출용 접착 배열의 설정 대상과 설정 가능한 배열을 갖고 있으면, 본 발명에도 이용 가능한 것에서, 반드시 본 발명의 대상으로서 배제하는 것은 아니다. 또, 세틀라이트DNA, 미니 세틀라이트, 마이크로 세틀라이트 등은 단순 반복 배열로 분류되는 반복 배열이다.
또, 유전자 중에 다(多) 카피 존재하는 배열로서, 센트로미어에 존재하는 배열로서 ALR6, 또, snRNA로서 U2나 U6 또는 tRNA나 rRNA와 같이 일반적으로 게놈 중에 다 카피 존재하는 것이 알려져 있는 유전자 외에, 유전자 중복에 의해 게놈 중에 복수 카피 존재하는 유전자 등을 들 수 있다.
위유전자란, DNA의 배열 중, 유전자 산물(특히, 단백질)을 카피하고 있던 것을 상상시키는 특징이 있는 염기 배열을 갖고 있는데, 현재는 기능을 상실하고 있는 유전자를 말한다. 원래의 기능을 갖는 배열에 돌연 변이가 발생한 결과 생겼다고 생각되고 있다. 예를 들면, 돌연변이에 의해 스톱 코돈이 발생하여 단백질의 펩티드 사슬이 짧아져 버려서 단백질로서 기능을 완수할 수 없게 되는 경우나 1염기 치환 등의 돌연 변이에 의해 정상적인 전사에 필요한 조절 배열이 기능을 상실하는 경우 등이 있다. 위유전자는 원래의 정상적인 유전자가 별도로 남아 있는 경우가 많은데, 단독으로 위유전자가 되는 것도 있다.
위유전자는 유전자 배열의 특징에 의해 3타입으로 분류할 수 있다. mRNA로부터 레트로 트랜스포존의 역전사 효소에 의하여 만들어진 DNA가 게놈에 삽입되는 경우(프로세스형 위유전자), 게놈 내에서 원래의 유전자 배열이 중복되고, 그 카피 중 일부가 돌연변이 등에 의해 기능을 상실하여 위유전자가 되는 경우(중복 위유전자 또는 비프로세스형 위유전자) 및 게놈 내의 유전자가(중복 유전자가 아니고, 단독의 유전자인 채) 기능을 상실함으로써 위유전자가 되는 경우가 있다.
현재, 위유전자로서 알려지는 유전자 중에는 전사되어 있는 예나 유전자 기능을 갖는 예(위유전자라 불러야 하는지의 여부는 정해져 있지 않다)도 알려지게 되어 있는 것에서, 본 발명 방법에 있어서의 “위유전자”란, 유전자 기능의 유무, 또는 전사되는지의 여부는 아니고, 상기의 “프로세스형 위유전자”와 “중복 위유전자(비프로세스형 위유전자)”를 의미한다.
중복 유전자란, 유전자 중복에 의해 게놈 중의 특정한 유전자나 유전자 단편이 배가함으로써 발생한 유전자 또는 그 유전자 단편을 의미한다. 유전자 중복이란, 유전자를 포함하는 DNA의 어떤 영역이 중복되는 현상을 말한다. 유전자 중복이 일어나는 원인으로서는, 유전적 재조합의 이상, 레트로 트랜스포존의 전이, 염색체 전체의 중복 등이 있다. 예를 들면, 하나의 유전자가 카피되어 게놈 DNA에 삽입될 때에 다른 염색체 위치에 삽입되는 경우와 원래의 유전자의 근처에 삽입되는 경우가 있다. 원래의 유전자의 근처로의 삽입에 의해 카피된 유전자가 나열해 있는 장소를 탠덤 리피트라 부르고, 유전자 중복에 의하여 만들어내어진 유전자의 그룹을 유전자족(유전자 패밀리)라 부른다.
그 밖에, 레트로 바이러스나 말단에 LTR(Long terminal repeat)을 갖는 레트로 트랜스포존, MaLRs(Mammalian apparent LTR-Retrotransposons)와 같은 바이러스 유래라 생각되는 내재 배열이나 레트로 바이러스 유래의 LTR에 대해서도, 1게놈 중에 복수 존재하는 것이 알려져 있다. 예를 들면, 레트로 바이러스 유래의 LTR로서는 구체적으로는, LTR1, LTR1B, LTR5, LTR7, LTR8, LTR16A1, LTR16A1, LTR16C, LTR26, LTR26E, MER48, MLT2CB 등의 서브 패밀리가 알려져 있다. 또, 레트로 트랜스포존 유래의 LTR은 ERV, ERVK, ERVL의 각 클래스로 분류되고, 구체적으로는, LTR8A, LTR28, MER21B, MER83, MER31B, MER49, MER66B, HERVH, ERVL, LTR16A1, LTR33A, LTR50, LTR52, MLT2A1, MLT2E, MER11C, MER11C 등의 서브 패밀리를 들 수 있다. 또한, MaLRs는 전형적인 레트로 트랜스포존과 마찬가지로 그 배열의 양단에 LTR을 포함하는데, LTR에 끼워진 내부 배열이 레트로 바이러스 유래는 아닌 배열의 DNA인자를 가리킨다. 예를 들면, MLT1A1, MLT1A2, MLT1B, MLT1C, MLT1D, MLT1F, MLT1G, MLT1H, MLT1J, MLT1K, MLT1I, MLT2CB, MSTA, MSTA-int, MSTB, THE1A, THE1B, THE1B-internal, THE1 등의 서브 패밀리를 들 수 있다.
“산재 반복 배열”은 이웃하지 않고 산재하는 것을 특징으로 하고 있으며, 레트로 트랜스포존에 유래한다고 생각되고 있다. 또, 산재 반복 배열은 그 길이에 따라 SINE(Short Interspersed Repetitive Element: 단쇄 산재 반복 배열)와 LINE(Long Interspersed Elements: 장쇄 산재 반복 배열)로 분류되어 있다. SINE 중 대부분은 Alu패밀리에 속하는 배열이다. 특징으로서는, 7SL RNA의 3’측의 배열 또는 5’측의 배열을 갖고, 또한, Left-monomer와 Right-monomer라 불리는 영역에 끼워진 AT-Rich영역을 갖고 있다. Alu패밀리의 서브 패밀리로서는, Alu, AluJb, AluJo, AluSc, AluSg, AluSp, AluSq, AluSx, AluY를, 나아가서는 FAM(Fossil Alu Monomer)과, FAM의 배열을 갖는 FLAM(Free Left Alu Monomer)과 FRAM(Free Right Alu Monomer)을 들 수 있다. Alu패밀리 이외의 SINE로서는, MIR 및 Ther／MIR3이 알려져 있으며, 각각 서브 패밀리로서, MIR, MIR3이 알려져 있다. 그 밖에, 다른 생물종의 Alu패밀리의 서브 패밀리로서는, B1, B2, B4, PB1, PB1D 등이 알려져 있다. LINE로서는, LINE1로부터 Line23의 서브 패밀리가 보고되어 있는데, LINE-1, LINE2, LINE3이 널리 게놈 중에 존재하는 것이 알려져 있다. 또한, LINE-1에 대해서는 예를 들면, L1M1, L1M2, L1M3, L1M3d, L1M4, L1M4c, L1MA2, L1MA7, L1MA8, L1MA9, L1MB1, L1MB1, L1MB3, L1MB4, L1MB5, L1MB6, L1MB7, L1MCa, L1MCb, L1MC2, L1MC3, L1MC4, L1MC4a, L1MC5, L1MDa, L1ME, L1MEc, L1MEd, L1MEg, L1ME1, L1ME2, L1ME3, L1ME3A, L1ME3B, L1ME4a, L1PB3, L1P4, L1PA2, L1PA3, L1PA4, L1PA5, L1PA6, L1PA7, L1PA10, L1PA12, L1PA13, L1PA14, L1PA16, L1PB1, L1PB3, L1PB4, L1PREC2, HAL1의 서브 패밀리가 알려져 있으며, LINE-2로서는, L2, L2c의 서브 패밀리가 알려져 있다. 또한 예를 들면, Alu패밀리 또는 Alu의 서브 패밀리에 공통의 배열, LINE-1패밀리 또는 LINE-1의 서브 패밀리에 공통의 배열에 대하여 후술하는 특정 접착 배열 및 검출용 접착 배열을 설정할 수 있으면, 1게놈 중에 복수의 검출 대상을 설정할 수 있기 때문에 게놈의 검출을 보다 고감도로 할 수 있다.
목적으로 하는 DNA영역으로서는, 구체적으로 예를 들면, LINE―1의 부분 배열(배열 번호 12, 배열 번호 13 또는 배열 번호 14에 나타내는 염기 배열)이나 Alu의 부분 배열(배열 번호 15에 나타내는 염기 배열), 또는 그들의 상동성을 나타내는 염기 배열 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 반복 배열을 측정하는 것은 1게놈 중에 복수 존재하는 염기 배열을 동시에 측정하는 것을 의미하고, 예를 들면, 배열 번호 13으로 나타내어지는 염기 배열과 80％ 이상의 배열 동일성을 갖는 염기 배열은 인간 게놈 중에 약 280카피 있으며, 배열 번호 15로 나타내어지는 염기 배열과 80％ 이상의 상동성을 갖는 염기배열은 인간 게놈 중에 약 820카피 있다. 따라서, 각각의 염기 배열 중에 검출용 접착 배열과 특정 접착 배열을 설정할 수 있으면, 1게놈 중에 1종류밖에 없는 배열에 대하여 검출용 접착 배열과 특정 접착 배열을 설정하는 경우에 비하면, 1게놈의 검출 감도를 이론상으로 280∼820배 올리는 것이 가능하게 된다.
제2 공정은 제1 공정에서 조제된 검체에 함유되는 피검 올리고뉴클레오티드와, 상기 피검 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합하고, 또한, 복수의 식별 기능을 갖는 검출 올리고뉴클레오티드를 혼합시켜서, 상기 피검 올리고뉴클레오티드와 상기 검출 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 검출 복합체를 형성시키고, 상기 검출 복합체를 지지체에 고정화시키는 공정이다.
복수의 식별 기능을 갖는 검출 올리고뉴클레오티드로서는, 복수의 올리고뉴클레오티드가 상보적으로 결합하여 이루어지는 복합 검출 올리고뉴클레오티드, 복수의 메틸화 부위를 갖는 메틸화 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 복합 검출 올리고뉴클레오티드 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 “검출 올리고뉴클레오티드”란, 후술하는 “식별 기능”에 의해 검출 가능하고, 또한, 피검 올리고뉴클레오티드에 상보적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 또, 검출 올리고뉴클레오티드는 “식별 기능”을 갖고, 또한, 피검 올리고뉴클레오티드에 상보적으로 결합하면, 어떠한 올리고뉴클레오티드이어도 좋으며, 복수의 올리고뉴클레오티드가 상보적으로 결합하여 이루어지는 복합 올리고뉴클레오티드이어도 좋다. 식별 기능으로서, 후술하는 “검출 분자”를 결합시키는 경우에는, 검출 올리고뉴클레오티드는 후술하는 “검출 배열”을 갖고 있어도 좋다.
본 발명 방법에 있어서의 “복수의 식별 기능을 갖는 검출 올리고뉴클레오티드”란, 검출 올리고뉴클레오티드가 복수의 식별 기능을 갖고 있는 것을 의미한다. 예를 들면, 검출 올리고뉴클레오티드가, 복수의 올리고뉴클레오티드가 상보적으로 결합하여 이루어지는 복합 올리고뉴클레오티드인 경우, 복합 올리고뉴클레오티드 상에 복수의 식별 기능을 갖고 있으면 무엇이어도 좋고, 특히, 식별 기능의 위치를 특정하는 것은 아니다. 보다 구체적으로는, 후술하는 “복합 검출 올리고뉴클레오티드”이어도 좋다. 또, 검출 올리고뉴클레오티드가 1개의 올리고뉴클레오티드인 경우, 올리고뉴클레오티드 상에 복수의 식별 기능이 있으면 무엇이어도 좋다. 예를 들면, 검출 올리고뉴클레오티드가 메틸화 올리고뉴클레오티드인 경우, 검출 올리고뉴클레오티드 상에 복수 갖는 메틸화 DNA를 합성하여 검출 올리고뉴클레오티드로서 이용할 수 있다. 메틸화 DNA는 메틸화 DNA항체를 이용하여 검출할 수 있기 때문에 검출 올리고뉴클레오티드로의 메틸화 DNA항체의 결합수가 많을수록 높은 검출 감도를 얻는 것이 기대된다. 또한, 메틸화 DNA를 검출하기 위해서는, 메틸화 DNA항체를 이용하는 방법 외에, 후술하는 “오스뮴 착체”를 이용하는 방법도 있다.
검출 올리고뉴클레오티드가 메틸화 올리고뉴클레오티드인 경우, 검출 올리고뉴클레오티드 상의 식별 기능을 용이하게 증가시킬 수 있고, 또한, 메틸화 DNA항체를 이용하는 검출 방법이나 오스뮴 착체 등을 이용하는 검출 방법 등, 다양한 검출 방법으로부터 측정에 적합한 검출 방법을 선택하는 것이 가능해진다.
본 발명에 있어서의 “복합 검출 올리고뉴클레오티드”란, 피검 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합하고, 또한, 복수의 올리고뉴클레오티드가 상보적으로 결합하여 이루어지는 올리고뉴클레오티드이다. 또, 복합 검출 올리고뉴클레오티드는 후술하는 식별 기능을 갖고 있으며, 복수의 올리고뉴클레오티드가, 각각 올리고뉴클레오티드가 갖는 서로 상보적인 염기 배열로 이루어지는 접착 염기 배열에 의해 결합되어 이루어지는 구조를 취한다.
또한, 식별 기능은 미리 복합 검출 올리고뉴클레오티드에 결합되어 있는 것이어도 좋고, 간접적으로 결합되는 것이어도 좋다.
복합 검출 올리고뉴클레오티드를 구성하는 올리고뉴클레오티드는, 그 전체 또는 일부분이 메틸화되어 있어도 상관없다. 본 발명에 있어서, 복합 검출 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부분이 메틸화된 것을 메틸화 복합 검출 올리고뉴클레오티드라 부르는 일도 있다. 메틸화 올리고뉴클레오티드를 상보적으로 결합시켜서 복합 검출 올리고뉴클레오티드를 형성시키는 경우에는, 메틸화 복합 검출 올리고뉴클레오티드는 예를 들면, 메틸화 올리고뉴클레오티드 만을 결합시켜도 좋고, 메틸화 올리고뉴클레오티드와 메틸화되어 있지 않은 올리고뉴클레오티드를 조합하여 결합시켜도 좋다.
“메틸화 올리고뉴클레오티드”란, 올리고뉴클레오티드를 구성하는 뉴클레오티드의 염기가 메틸화된 올리고뉴클레오티드를 의미하는 것이고, 본 발명에 있어서는, 인공적으로 합성된 것이어도 좋다. 또, 인공적으로 합성된 올리고뉴클레오티드나 게놈 DNA를 단편화하여 얻어진 올리고뉴클레오티드를 메틸기 전이 효소로 수식하여 작성해도 좋다. 몇 가지의 메틸기 전이 효소는 올리고뉴클레오티드 중의 “CpG” 중의 사이토신의 5위를 메틸화하는 것이 알려져 있으며, 이와 같은 메틸화 효소의 구체예로서는, Sss I methylase, Dmnt1 methylase 등을 들 수 있다. 또한, 게놈 DNA는 부분적으로 메틸화되어 있기 때문에 세포 등으로부터 취득한 게놈 DNA를 단편화하면, 게놈 중에서 메틸화되어 있는 영역을 메틸화 올리고뉴클레오티드로서 취득할 수 있는 경우도 있다. 또, 사이토신의 5위가 메틸화된 메틸화 올리고뉴클레오티드는 5―메틸사이토신을 사이토신 대신에 이용하여 인공적으로 합성된 메틸화 올리고뉴클레오티드이어도 좋다. 이 경우, “CpG”의 사이토신 뿐만 아니라, 모든 사이토신(예를 들면, 5’―CA―3’, 5’―CT―3’, 5’―CC―3’ 등)을 5―메틸사이토신으로서 합성하는 것이 가능하다.
“DNA메틸화 효소”란, DNA 중의 염기를 메틸화하는 효소이고, 포유 동물 세포, 세균 등으로부터 대부분의 DNA메틸화 효소가 단리되어 있다. DNA메틸화 효소는 기질의 염기의 종류로부터 아데닌 메틸화 효소, 사이토신 메틸화 효소 등, 복수 종류로 분류된다. 사이토신 메틸화 효소는 DNA염기 배열 중의 특정한 배열을 인식하고, 그 배열의 근처의 사이토신을 메틸화하는 효소이며, 인식하는 염기 배열에 의해 다른 사이토신 메틸화 효소가 알려져 있다.
또, DNA메틸화 효소의 촉매하는 DNA의 메틸화 반응은 제한 수식계라 불리는 원시적인 면역계로부터 다수 발견되어 있다. 제한 수식계란, 세균에서 기능하는 게놈 전체를 정기적으로 메틸화함으로써 특정한 배열을 인식하는 제한 효소(제한 엔도뉴클레아제)에 의하여 소화되지 않도록 한 후에 외래 DNA(특히, 박테리오파지)를 제한 효소에 의하여 소화하는 기능이고, 박테리오파지 감염으로부터 미생물 게놈을 방어하는 시스템을 말한다. 게놈의 메틸화에 기능하고 있는 효소는 사이토신 또는 아데닌을 메틸화하고, 대부분은 퓨린 잔기의 6위의 질소(N6) 또는 5위의 탄소(C5)를 메틸화하는 것이 알려져 있다. 이와 같은 효소 중, 사이토신의 C5를 메틸화하는 사이토신 메틸화 효소로서는, SssI(M. SssI) 메틸라아제, AluI메틸라아제, HhaI메틸라아제, HpaII메틸라아제, MspI메틸라아제, HaeIII메틸라아제 등이 알려져 있다. 또, 이들 사이토신의 C5위를 메틸화하는 효소는 인식하는 염기 배열이 상이하며, CpG를 인식하는 사이토신 메틸화 효소는 SssI 뿐이다.
또, 인간 게놈 중의 DNA의 메틸화 반응으로서는, 에피제네틱스(유전자 배열에 의하지 않는 유전자 발현의 다양성을 산출하는 구조)로서, CpG의 사이토신의 5위(C5)의 메틸화가 알려져 있으며, 이와 같은 사이토신 메틸화 효소로서, DNA메틸 트랜스페라아제가 알려져 있다. DNA메틸 트랜스페라아제로서는, DnmtI메틸 트랜스페라아제가 알려져 있다.
따라서, 인간 세포 중에서는 CpG배열의 사이토신의 C5위가 메틸화되어 있기 때문에 인위적으로 게놈을 메틸화하는 경우에는 SssI를 이용하는 것으로 인간 세포 내에서의 메틸화와 같은 배열(CpG)의, 같은 사이토신의, 같은 위치를 메틸화하는 것이 가능하게 된다.
사이토신 메틸화 효소에 의해 메틸화된 DNA로 하기 위해서는 구체적으로는 예를 들면, 이하와 같이 실시하면 좋다. DNA시료에 최적인 10×완충액(NEBuffer2(NEB사제))을 5μL, S-adenosyl methionine(3.2mM, NEB사제)을 0.5㎕, 사이토신 메틸화 효소 SssI(NEB사제)를 각각 0.5μL 첨가하고, 이어서, 상기 혼합물에 멸균 초순수를 첨가하여 액량을 50μL로 하고, 37℃에서 30분간 인큐베이션하면 좋다.
본 발명에 있어서는, 복합 검출 올리고뉴클레오티드를 구성하는 올리고뉴클레오티드가 상호 상보적으로 직렬로 결합(연결)하는 경우(“직렬형”으로 부르는 일도 있다), 복합 검출 올리고뉴클레오티드를 구성하는 올리고뉴클레오티드(메틸화 올리고뉴클레오티드를 포함한다) 중, 피검 올리고뉴클레오티드 상의 연결 염기 배열과 상보성에 의하여 결합하는 상보 연결 염기 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드(메틸화 올리고뉴클레오티드를 포함한다)를 제1 올리고뉴클레오티드라 부른다.
제1 올리고뉴클레오티드는 피검 올리고뉴클레오티드의 염기 배열과는 상보적인 결합을 하지 않고, 또한, 제1 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드(메틸화 올리고뉴클레오티드를 포함한다)인 제2 올리고뉴클레오티드의 상보 접착 배열과 상보적으로 결합할 수 있는 접착 염기 배열인 제1 접착 염기 배열을 갖는다. 또, 제2 올리고뉴클레오티드는 제1 접착 염기 배열과 상보적으로 결합할 수 있는 염기 배열로 이루어지는 상보 제1 접착 염기 배열을 갖는다.
제2 올리고뉴클레오티드는 피검 올리고뉴클레오티드 및 제1 접착 배열 이외의 제1 올리고뉴클레오티드의 염기 배열 부분과는 상보적인 결합을 하지 않고, 제2 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드(메틸화 올리고뉴클레오티드를 포함한다)인 제3 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합할 수 있는 접착 염기 배열인 제2 접착 염기 배열을 갖는다. 이 제2 접착 염기 배열과 상보적으로 결합할 수 있는 염기 배열로 이루어지는 상보 제2 접착 염기 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드(메틸화 올리고뉴클레오티드를 포함한다)를 제3 올리고뉴클레오티드라 부른다.
마찬가지로, 제N 접착 염기 배열과 상보적으로 결합할 수 있는 염기 배열로 이루어지는 상보 제N 접착 염기 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드(메틸화 올리고뉴클레오티드를 포함한다)를 제(N＋1) 올리고뉴클레오티드라 부른다. 제(N＋1) 올리고뉴클레오티드는 피검 올리고뉴클레오티드 및 제N 접착 배열 이외의 제1 올리고뉴클레오티드로부터 제N 올리고뉴클레오티드까지의 올리고뉴클레오티드의 염기 배열 부분과는 상보적인 결합을 하지 않고, 제(N＋1) 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드(메틸화 올리고뉴클레오티드를 포함한다)인 제(N＋2) 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합할 수 있는 접착 염기 배열인 제(N＋1) 접착 염기 배열을 갖는다. 이 제(N＋1) 접착 염기 배열과 상보적으로 결합할 수 있는 염기 배열로 이루어지는 상보 제(N＋1) 접착 염기 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드(메틸화 올리고뉴클레오티드를 포함한다)를 제(N＋2) 올리고뉴클레오티드라 부른다.
마찬가지로, 제(N－1) 접착 염기 배열과 상보적으로 결합할 수 있는 염기 배열로 이루어지는 상보 제(N－1) 접착 염기 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드(메틸화 올리고뉴클레오티드를 포함한다)를 제N 올리고뉴클레오티드라 부른다. 제N 올리고뉴클레오티드는 피검 올리고뉴클레오티드 및 제(N－1) 접착 배열 이외의 제1 올리고뉴클레오티드로부터 제(N－1) 올리고뉴클레오티드까지의 올리고뉴클레오티의 염기 배열 부분과는 상보적인 결합을 하지 않고, 제N 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드(메틸화 올리고뉴클레오티드를 포함한다)인 제(N＋1) 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합할 수 있는 접착 염기 배열인 제N 접착 염기 배열을 갖는다.
또한, 제(N＋1) 올리고뉴클레오티드가 존재하지 않는 경우에는, 제N 올리고뉴클레오티드를 종말 올리고뉴클레오티드라 부르고, 상기 제N 올리고뉴클레오티드는 제N 접착 염기 배열을 갖고 있지 않아도 상관없다.
즉, 본 발명에 있어서의 복합 검출 올리고뉴클레오티드의 하나의 형태는 제1 올리고뉴클레오티드로부터 종말 올리고뉴클레오티드까지가 접착 염기 배열과 상보 접착 염기 배열의 상보적인 결합에 의해 연결된 것이다.
복합 검출 올리고뉴클레오티드가 복수의 메틸화 부위를 갖는 메틸화 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 제1 올리고뉴클레오티드 만으로 형성되어 있는 경우에는 상기에 따라 그 제1 올리고뉴클레오티드는 접착 염기 배열을 갖고 있지 않아도 좋다.
또, 복합 검출 뉴클레오티드를 이용하지 않고, 하나의 메틸화 부위 만을 갖는 메틸화 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 검출 올리고뉴클레오티드를 이용해도 검체 중에 포함되는 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA를 정량 또는 검출하는 것은 가능하다.
접착 염기 배열과 상보 접착 염기 배열은 올리고뉴클레오티드(메틸화 올리고뉴클레오티드를 포함한다)를 상보적으로 결합할 수 있는 것이면 좋고, 올리고뉴클레오티드(메틸화 올리고뉴클레오티드를 포함한다)의 말단에 위치해 있어도 좋으며, 중간에 위치해 있어도 좋다.
또한, 제N 접착 염기 배열은 상보 제N 접착 염기 배열 이외의 염기 배열과 상보적인 결합을 하지 않고, 또한, 상기 상보 제N 접착 염기 배열 이외의 어느 쪽의 상보적인 결합도 저해하지 않는 것이 바람직하다. 또, 제N 접착 염기 배열은 상보 제N 접착 염기 배열 이외의 복합 검출 올리고뉴클레오티드를 구성하는 올리고뉴클레오티드, 검체 중에 포함되는 핵산, 피검 올리고뉴클레오티드 및 후술하는 특정 올리고뉴클레오티드를 포함하는 그 밖의 올리고뉴클레오티드의 염기 배열과 상보적인 결합을 하지 않는 것이 바람직하다.
본 발명 방법에서는 복합 검출 올리고뉴클레오티드를 구성하는 올리고뉴클레오티드가 상호 상보적으로 분기하여(직렬 이외로) 결합(연결)할 수 있는 경우(“분기형”으로 부르는 일도 있다), 복합 검출 올리고뉴클레오티드를 구성하는 올리고뉴클레오티드(메틸화 올리고뉴클레오티드를 포함한다) 중, 제N 올리고뉴클레오티드 상에 복수의 접착 염기 배열이 존재해도 좋다. 예를 들면, 제N 올리고뉴클레오티드에 접착 염기 배열이 M개 존재하는 경우에는 각각 제(N, 1) 접착 염기 배열, 제(N, 2) 접착 염기 배열, 제(N, 3) 접착 염기 배열, ㆍㆍㆍ, 제(N, (M－1)) 접착 염기 배열, 제(N, M) 접착 염기 배열이라 부르고, 그들의 접착 염기 배열에 상보성에 의하여 결합하는 올리고뉴클레오티드를 각각 제((N＋1), 1) 올리고뉴클레오티드, 제((N＋1), 2) 올리고뉴클레오티드, 제((N＋1), 3) 올리고뉴클레오티드, ㆍㆍㆍ, 제((N＋1), (N－1)) 올리고뉴클레오티드, 제((N＋1), M) 올리고뉴클레오티드라 부른다. 이 때 예를 들면, 제((N＋2), 1) 올리고뉴클레오티드가 존재하지 않는 경우, 제((N＋1), 1) 올리고뉴클레오티드는 종말 올리고뉴클레오티드이고, 제((N＋1), 1) 접착 염기 배열은 존재하지 않아도 좋다.
마찬가지로, 제(N, 1) 올리고뉴클레오티드 상에 복수의 접착 염기 배열이 존재하는 경우, 예를 들면, 제(N, 1) 올리고뉴클레오티드 상에 접착 염기 배열이 L개 존재하는 경우에는 각각 제(N, 1, 1) 접착 염기 배열, 제(N, 1, 2) 접착 염기 배열, 제(N, 1, 3) 접착 염기 배열, ㆍㆍㆍ, 제(N, 1, (L－1)) 접착 염기 배열, 제(N, 1, L) 접착 염기 배열이라 부르고, 그들의 접착 염기 배열에 상보성에 의하여 결합하는 올리고뉴클레오티드를 각각 제((N＋1), 1, 1) 올리고뉴클레오티드, 제((N＋1), 1, 2) 올리고뉴클레오티드, 제((N＋1), 1, 3) 올리고뉴클레오티드, ㆍㆍㆍ, 제((N＋1), 1, (L－1)) 올리고뉴클레오티드, 제((N＋1), 1, L) 올리고뉴클레오티드라 부른다. 이 때 예를 들면, 제((N＋2), 1, 1) 올리고뉴클레오티드가 존재하지 않는 경우, 제((N＋1), 1, 1) 올리고뉴클레오티드는 종말 올리고뉴클레오티드이고, 제((N＋1), 1, 1) 접착 염기 배열은 존재하지 않아도 좋다.
분기형의 복합 올리고뉴클레오티드란, 제1 올리고뉴클레오티드가 몇 종류 존재하고, 피검 올리고뉴클레오티드 상에 복수의 제1 올리고뉴클레오티드가 결합하는 경우도 포함하는 것이다. 이 경우, 피검 올리고뉴클레오티드 상에 M개의 제1 올리고뉴클레오티드가 있는 경우에는 피검 올리고뉴클레오티드 상의 제1 연결 배열, 제2 연결 배열ㆍㆍㆍㆍ제N 연결 배열에 대하여 각각 상보적으로 결합할 수 있는 제(1, 1) 접착 배열, 제(1, 2) 접착 배열, 제(1, 3) 접착 배열ㆍㆍㆍ제(1, M) 접착 배열을 갖는 제(1, 1) 올리고뉴클레오티드, 제(1, 2) 올리고뉴클레오티드, 제(1, 3) 올리고뉴클레오티드ㆍㆍㆍ제(1, M) 올리고뉴클레오티드이면 좋다.
또, 제1 올리고뉴클레오티드 상에 M개의 제2 올리고뉴클레오티드가 있는 경우에는, 제1 올리고뉴클레오티드 상의 제1 연결 배열, 제2 연결 배열ㆍㆍㆍㆍ제M 연결 배열에 대하여 각각 상보적으로 결합할 수 있는 제(2, 1) 접착 배열, 제(2, 2) 접착 배열, 제(2, 3) 접착 배열ㆍㆍㆍ제(2, M) 접착 배열을 각각 갖는 제(2, 1) 올리고뉴클레오티드, 제(2, 2) 올리고뉴클레오티드, 제(2, 3) 올리고뉴클레오티드ㆍㆍㆍ제(2, M) 올리고뉴클레오티드이면 좋다.
또한, 제N 올리고뉴클레오티드 상에 M개의 제N＋1 올리고뉴클레오티드가 있는 경우에는 제N 올리고뉴클레오티드 상의 제1 연결 배열, 제2 연결 배열ㆍㆍㆍㆍ제M 연결 배열에 대하여 각각 상보적으로 결합할 수 있는 제(N＋1, 1) 접착 배열, 제(N＋1, 2) 접착 배열, 제(N＋1, 3) 접착 배열ㆍㆍㆍ제(N＋1, M) 접착 배열을 각각 갖는 제(N＋1, 1) 올리고뉴클레오티드, 제(N＋1, 2) 올리고뉴클레오티드, 제(N＋1, 3) 올리고뉴클레오티드ㆍㆍㆍ제(N＋1, M) 올리고뉴클레오티드이면 좋다.
또한, 제(N, M) 올리고뉴클레오티드 상에 P개의 제N＋1 올리고뉴클레오티드가 있는 경우에는, 제(N, M) 올리고뉴클레오티드 상의 제(N＋1, M, 1) 연결 배열, 제(N＋1, M, 2) 연결 배열ㆍㆍㆍ제(N＋1, M, P) 연결 배열에 대하여 각각 상보적으로 결합할 수 있는 제(N＋1, M, 1) 접착 배열, 제(N＋1, M, 2) 접착 배열, 제(N＋1, M, 3) 접착 배열ㆍㆍㆍ제(N＋1, M, P) 접착 배열을 각각 갖는 제(N＋1, M, 1) 올리고뉴클레오티드, 제(N＋1, M, 2) 올리고뉴클레오티드, 제(N＋1, M, 3) 올리고뉴클레오티드ㆍㆍㆍ제(N＋1, M, P) 올리고뉴클레오티드이면 좋다.
또한, 제(N, M, ㆍㆍㆍ, X) 올리고뉴클레오티드 상에 P개의 제N＋1 올리고뉴클레오티드가 있는 경우에는, 제(N, M, ㆍㆍㆍ, X) 올리고뉴클레오티드 상의 제(N＋1, M, ㆍㆍㆍ, X, 1) 연결 배열, 제(N＋1, M, ㆍㆍㆍ, X, 2) 연결 배열ㆍㆍㆍㆍ제(N＋1, M, ㆍㆍㆍ, X, P) 연결 배열에 대하여 각각 상보적으로 결합할 수 있는 제(N＋1, M, ㆍㆍㆍ, X, 1) 접착 배열, 제(N＋1, M, ㆍㆍㆍ, X, 2) 접착 배열, 제(N＋1, M, ㆍㆍㆍ, X, 3) 접착 배열ㆍㆍㆍ제(N＋1, M, ㆍㆍㆍX, P) 접착 배열을 각각 갖는 제(N＋1, M, ㆍㆍㆍ, X, 1) 올리고뉴클레오티드, 제(N＋1, M, ㆍㆍㆍ, X, 2) 올리고뉴클레오티드, 제(N＋1, M, ㆍㆍㆍ, X, 3) 올리고뉴클레오티드ㆍㆍㆍ제(N＋1, M, ㆍㆍㆍ, X, P) 올리고뉴클레오티드이면 좋다.
이상과 같이, 여러 가지 조합을 실시하여 고감도화하는 것이 가능하고, 검출하고 싶은 감도 또는 정밀도에 따라 각 올리고뉴클레오티드나 종말 올리고뉴클레오티드의 조합을 조정할 수 있다.
하나의 올리고뉴클레오티드 상에 복수의 접착 염기 배열이 존재하는 경우, 그들 접착 염기 배열은 같아도 좋고, 전혀 상이해도 좋다. 구체적으로 예를 들면, 상기 제(N, 1) 접착 염기 배열, 제(N, 2) 접착 염기 배열, 제(N, 3) 접착 염기 배열의 염기 배열은 모두 같아도 좋고, 각각 다른 염기 배열이어도 좋다. 연결 접착 배열과 상보 연결 염기 배열 및 접착 염기 배열과 상보 접착 염기 배열은 서로 상보적으로 결합할 수 있는 염기 배열이면 좋고, 구체적으로는, 90％ 이상의 상동성을 갖고 있으면 좋고, 또, 각각 통상 5∼100bp, 바람직하게는 10∼50bp이면 좋다. 접착 염기 배열과 상보 접착 염기 배열은 게놈과의 상보적인 결합을 하지 않도록 설계되는 것이 바람직하고, 또, 인공적으로 합성한 DNA가 바람직하다. 설계된 접착 염기 배열과 연결 염기 배열 등이 게놈과의 상보적인 결합을 하지 않는 것을 간편히 확인하기 위해서는, PubMeD 등의 공적 기관 등의 게놈 데이터 베이스에서 Blast검색을 실시하고, 80％ 이상의 상동성을 나타내는 염기 배열이 없는 것을 확인하면 좋다.
즉, “복합 검출 올리고뉴클레오티드”는 연결 염기 배열과 상보 연결 염기 배열의 상보적인 결합에 의해 피검 올리고뉴클레오티드와 연결되어 검출 복합체를 형성한다. 검출 복합체는 하나의 피검 올리고뉴클레오티드에 복합 검출 올리고뉴클레오티드가 결합한 것, 또는, 복수의 복합 검출 올리고뉴클레오티드가 결합한 것이다. 복수의 복합 검출 올리고뉴클레오티드가 하나의 피검 올리고뉴클레오티드에 결합하는 경우, 각각 복합 검출 올리고뉴클레오티드는 동일한 복합 검출 올리고뉴클레오티드이어도 좋고, 또는 다른 복합 검출 올리고뉴클레오티드이어도 좋다. 또, 피검 올리고뉴클레오티드 상의 연결 염기 배열은 복수 종류의 연결 염기 배열이 각각 하나씩이어도 좋고, 한 종류의 연결 염기 배열이 복수 있어도 좋다.
본 발명에 있어서의 “검출 복합체”란, 피검 올리고뉴클레오티드의 연결 염기 배열과 복합 검출 올리고뉴클레오티드의 상보 연결 염기 배열의 상보적인 결합에 의해 피검 올리고뉴클레오티드에 복합 검출 올리고뉴클레오티드가 연결된 것을 의미한다. 검출 복합체는 후술하는 식별 기능에 의해 검출함으로써 후술하는 제3 공정에 있어서, 상기 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA를 정량 또는 검출하기 위한 식별 기능을 갖거나, 또는 식별 기능을 갖는 검출 분자와 결합할 수 있는 것으로 되어 있으면 좋다.
“식별 기능”이란, 복합 검출 올리고뉴클레오티드를 검출 또는 정량할 수 있는 기능이다. 즉, 식별 기능은 복합 검출 올리고뉴클레오티드를 식별할 수 있는 기능이면 무엇이어도 좋고, 예를 들면, 복합 검출 올리고뉴클레오티드의 표지에 기초하는 식별 기능이나 복합 검출 올리고뉴클레오티드에 결합하는 검출 분자에 의하여 검출 올리고뉴클레오티드에 부여되는 식별 기능을 들 수 있다. 구체적으로는, 복합 검출 올리고뉴클레오티드를 구성하는 올리고뉴클레오티드의 5’말단 또는 3’말단에 유로퓸 표지, 금콜로이드 표지, 라텍스 비드 표지, 방사성 동위체 표지, 형광 물질(FITC 등) 표지, horseradish Peroxidase(HRP) 표지, 알칼리포스파타아제 표지 등이 이루어진 복합 검출 올리고뉴클레오티드의 형광ㆍ발색 등의 특성을 들 수 있다.
유로퓸의 검출을 위해서는, Enhancement Solution(PerkinElmer사제)을 첨가ㆍ혼합하고, 약 45분간 실온에서 정치(靜置)한 후, 형광 검출기로 형광(여기 340㎚／형광 612㎚)을 측정하면 좋다. 또, 복합 검출 올리고뉴클레오티드가 메틸화 복합 올리고뉴클레오티드인 경우에는 검출 분자로서는 구체적으로는, 메틸화 DNA항체나 오스뮴 착체(J. Am. Chem. Soc., 2007;129:5612-5620) 등을 들 수 있다. 메틸화 복합 올리고뉴클레오티드란, 구체적으로는, 5―메틸사이토신, 6―메틸아데닌 등을 포함하는 복합 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 또한, 복합 검출 올리고뉴클레오티드가 FITC표지되어 있는 경우에는, 검출 분자로서 FITC항체를 들 수 있다.
검출 분자가 메틸화 DNA항체인 경우에는, 이하의 방법에 의해 정량 또는 검출을 위해 이용되는 식별 기능으로서의 기능을 부여할 수 있다. 구체적으로는, 유로퓸 표지, 금콜로이드 표지, 라텍스 비드 표지, 방사성 동위체 표지, 형광 물질(FITC 등) 표지, horseradish Peroxidase(HRP) 표지, 알칼리포스파타아제 표지, 비오틴 표지 등, 표지이 형광ㆍ발색 등의 기능이다. 또한, 이들 검출 분자로서의 항체에 식별 기능을 부여하는 방법으로서는, 검출 분자인 항체에 직접 식별 기능을 결합시켜도 좋고, 식별 기능을 가진 2차 항체 또는 3차 항체를 검출 분자인 항체에 결합시키는 방법을 들 수 있다. 구체적으로는, 형광 물질로 표지된 항체, horseradish Peroxidase(HRP) 표지된 항체, 알칼리포스파타아제 표지된 항체, 비오틴 표지된 항체, 유로퓸 표지된 항체는 시판되고 있기 때문에 2차 항체 또는 3차 항체로서 이용할 수 있다. 또, 효소 사이클법으로 검출 가능한 기질을 결합한 항체이어도 좋다. 이들 기능의 정량 또는 검출 수단으로서는 예를 들면, 방사선 검출기, 분광 광도계 등에 의한 측정, 또는 육안 식별 등을 들 수 있다. 예를 들면, 복합 검출 올리고뉴클레오티드를, 그 식별 기능에 의해 검출 또는 정량하는 경우로서, 구체적으로 검출 또는 정량 가능한 기능으로서 유로퓸이 부가된 2차 항체를 사용하는 경우, 검출 복합체에 2차 항체를 결합시킨 후, Enhancement Solution(PerkinElmer사제)을 첨가ㆍ혼합하고, 약 45분간 실온에서 정치한다. 그 후, 형광 검출기로 형광(여기 340㎚／형광 612㎚)을 측정하면 좋다.
복합 검출 올리고뉴클레오티드 상의 메틸화 DNA에 메틸화 DNA항체를 결합시켜서, 그 기능에 따라 검출 또는 정량하는 경우에는 구체적으로 예를 들면, 이하와 같이 조작을 실시하면 좋다. 지지체에 결합시킨 검출 복합체에 메틸화 DNA항체를 결합시킨 후, 메틸화 DNA항체에 대한 2차 항체(예를 들면, Eu-N1표지 마우스 IgG항체: PerkinElmer사제)를 첨가하여 실온에서 약 1시간 정치하고, 2차 항체의 검출 복합체로의 결합을 재촉한다. 그 후, Enhancement Soulution(PerkinElmer사제)을 첨가ㆍ혼합하고, 예를 들면, 약 45분간 실온에서 정치한다. 그 후, 형광 검출기로 형광(여기 340㎚／형광 612㎚)을 측정함으로써 검출 또는 정량한다.
또한, 지지체에 결합시키기 위해 메틸화 DNA항체를 이용하는 경우에는, 지지체에 결합시키기 위해 이용한 메틸화 DNA항체와는 다른 기질 특이성을 갖는 메틸화 DNA항체를 상기 검출 올리고뉴클레오티드의 메틸화 DNA에 결합하는 검출 분자로서 이용한다.
복합 검출 올리고뉴클레오티드 상의 메틸화 DNA에 결합하는 메틸화 DNA항체를 FITC로 표지하는 경우에는 2차 항체로서 FITC를 결합시킨 항체를 이용할 수도 있다. 이 경우, 공지의 방법에 의해 FITC의 형광을 측정하여 검출 또는 정량할 수도 있고, 항FITC항체를 2차 항체로서 검출 또는 정량할 수도 있다. 또한, 검출 올리고뉴클레오티드에 FITC를 직접 결합시킨 경우는 FITC를 식별 기능으로서 이용할 수도 있고, horseradish Peroxidase(HRP) 표지된 FITC항체, 알칼리포스파타아제 표지된 FITC항체, 비오틴 표지된 FITC항체, 유로퓸 표지된 FITC항체 등에 의해 표지 기능을 부여할 수도 있다. 구체적으로는, 복합 검출 올리고뉴클레오티드로서, FITC표지한 올리고뉴클레오티드를 복합 검출 올리고뉴클레오티드로서 사용하는 경우에는, 상기 복합 검출 올리고뉴클레오티드를 포함하는 검출 복합체를 지지체에 결합시킨 후에 horseradish Peroxidase(HRP) 표지된 항체(예를 들면, HRP표지 FITC항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories사제))를 첨가하여, 실온에서 약 1시간∼2시간 정치하고, FITC항체의 지지체에 결합한 검출 복합체로의 결합을 재촉한다. 그 후, FITC항체 용액을 세정 제거하고나서 적절한 기질(예를 들면, Substrate Reagent Pack ＃DY999: R&D SYSTEMS사제)을 첨가ㆍ혼합한다. 약 5∼60분간 실온에서 정치한 후, 스톱 용액(2N H2SO4수용액)을 첨가하여 horseradish Peroxidase(HRP)의 반응을 정지시키고, 반응 정지 후 30분 이내에 450㎚의 흡광도를 측정하면 좋다.
피검 올리고뉴클레오티드를 지지체에 고정화하기 위해 비오틴을 이용하지 않는 경우, 비오틴화 검출 올리고뉴클레오티드를 검출 또는 정량에 이용할 수 있다. 비오틴화된 검출 올리고뉴클레오티드를 검출 또는 정량하는 경우에는 예를 들면, HRP표지 스트렙트아비딘을 지지체에 고정화된 검출 복합체에 첨가ㆍ혼합하고, 비오틴화 검출 올리고뉴클레오티드와 HRP표지 스트렙트아비딘의 결합체를 형성ㆍ분리한 후, 공지의 방법에 의해 HRP의 활성을 측정함으로써 비오틴화 메틸화 DNA항체를 검출 또는 정량할 수 있다.
또, 식별 기능으로서는, 효소 사이클법 등의 고감도 검출법에서 이용되는 기질 등을 이용하는 것이어도 좋다. 구체적으로는, 효소 사이클법에서 이용되는 효소를 결합한 항체를 검출 분자로 하여 검출 복합체에 결합시키면 좋다. 또한, 본 발명에 있어서, 검출 분자에 부여되는 식별 기능으로서는, 상기의 방법에 한정되는 것은 아니다.
“검출 분자”란, 복합 검출 올리고뉴클레오티드를 검출 또는 정량하는 성질을 갖고 있으면 좋다. 또, 검출 분자는 복합 검출 올리고뉴클레오티드의 검출 배열을 인식하는 것이어도 좋고, 미리 복합 검출 올리고뉴클레오티드에 결합되어 있어도 상관없다. 즉, 검출 분자는 검출 올리고뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 성질을 갖고, 또한, 정량 또는 검출을 위해 이용되는 기능ㆍ특성인 “식별 기능”을 갖거나, 또는 식별 기능을 부여할 수 있는 것이면 좋다. 구체적으로는, 검출 분자는 검출 배열이 메틸화 올리고뉴클레오티드인 경우, 상기 메틸화 올리고뉴클레오티드에 결합하여 상기 메틸화 올리고뉴클레오티드를 검출할 수 있으면 좋고, 상기 메틸화 올리고뉴클레오티드에 특이적으로 결합하여 식별 기능을 나타내는 것이면 좋다.(다만, 지지체에 결합시키기 위해, 메틸화 DNA항체를 이용하는 경우에는, 지지체에 결합시키기 위해 이용한 메틸화 DNA항체와는 다른 기질 특이성을 갖는 메틸DNA항체를 상기 검출 올리고뉴클레오티드의 메틸화 DNA에 결합하는 검출 분자로서 이용한다). 그 밖에 예를 들면, 검출 분자는 메틸화 DNA항체이어도 좋다. 또, 검출 배열이 검출 분자 그 자체인 경우, 복합 검출 올리고뉴클레오티드를 검출하기 위해 새로운 검출 분자를 첨가하지 않아도 좋고, 검출 올리고뉴클레오티드에 편입된 검출 분자를 검출함으로써 상기 검출 올리고뉴클레오티드의 검출이 가능해진다.
본 발명 방법에 있어서의 “검출 배열”이란, 검출 분자를 복합 검출 올리고뉴클레오티드에 결합시키기 위한 염기 배열을 의미한다.
검출 배열은 접착 배열, 상보 접착 배열 등, 본 발명 방법에 있어서의 검출 복합체의 형성에 관여하는 염기 배열과 상보적으로 결합하지 않는 배열이면 좋고, 합성된 염기 배열이어도 자연계에 존재하는 염기 배열과 상동성을 갖고 있어도 좋고, 검출 복합체에 검출 분자가 결합 가능한 형태로 존재하고 있으면 상관없다.
예를 들면 구체적으로는, 모든 복합 검출 올리고뉴클레오티드에 검출 배열이 있어도 좋고, 검출 복합체에 포함되는 특정한 복합 검출 올리고뉴클레오티드 만이 갖고 있어도 좋다.
본 발명에 있어서, “메틸화 DNA항체”란, DNA 중의 메틸화된 염기를 항원으로서 결합하는 항체를 의미한다. 구체적으로는, 메틸사이토신 항체이며, 1개 사슬 DNA 중의 5위가 메틸화된 사이토신을 인식하여 결합하는 성질을 갖고 있는 항체를 들 수 있다. 또, 시판되고 있는 메틸화 DNA항체이어도, 본 명세서 기재의 메틸화 상태의 DNA를 특이적으로 인식하여 특이적으로 결합할 수 있는 항체이면 좋다. 메틸화 DNA항체는 메틸화된 염기, 메틸화 DNA 등을 항원으로 하여 통상의 방법에 의해 제작할 수 있다. 구체적으로, 메틸사이토신 항체를 작성하기 위해서는, 5―메틸시티딘, 5―메틸사이토신, 또는 5―메틸사이토신을 포함하는 DNA 등을 항원으로 하여 제작된 항체로부터 DNA 중의 메틸사이토신으로의 특이적인 결합을 지표로서 선발하는 것으로 제작할 수 있다. 또한, 이와 같은 고정화 메틸화 DNA항체의 성질(1개의 메틸화된 염기(사이토신)에 1개의 항체가 결합하는 것)에서 생각하면, 목적으로 하는 DNA영역으로서는, 수많은 메틸화된 염기(사이토신), 즉, CpG가 존재하는 영역을 선발하는 것이 바람직하고, 또, 정량 정밀도 및 검출 감도의 향상을 기대할 수 있다.
동물에 항원을 접촉시켜서 얻어지는 항체로서는, 동물로부터 정제한 항원을 면역한 후, IgG획분의 항체(폴리클로날 항체)를 이용하는 방법과 단일한 클론을 생산하는 항체(모노클로날 항체)를 이용하는 방법이 있다. 본 발명에 있어서는, 메틸화 DNA 또는 메틸사이토신을 특이적으로 인식할 수 있는 항체인 것이 바람직하기 때문에 모노클로날 항체를 이용하는 것이 바람직하다.
모노클로날 항체를 제작하는 방법으로서는, 세포 융합법에 의한 방법을 들 수 있다. 예를 들면, 세포 융합법은 면역한 마우스 유래의 비세포(B세포)와 골수종 세포를 세포 융합시키는 것으로 하이브리도마를 제작하고, 하이브리도마가 생산하는 항체를 선발하여 메틸사이토신 항체(모노클로날 항체)를 제작할 수 있다. 세포 융합법으로 모노클로날 항체를 제작하는 경우에는 항원을 정제할 필요가 없고, 예를 들면, 5―메틸시티딘, 5―메틸사이토신, 또는 5―메틸사이토신을 포함하는 DNA 등의 혼합물을 항원으로 하여 면역에 이용하는 동물에 투여할 수 있다. 투여 방법으로서는, 5―메틸시티딘, 5―메틸사이토신, 또는 5―메틸사이토신을 포함하는 DNA 등을 직접 항체를 산생시키는 마우스에 투여한다. 항체가 산생되기 어려운 경우에는 항원을 지지체에 결합시켜서 면역해도 좋다. 또, 애주번트 용액(예를 들면, 유동 파라핀과 Aracel A를 혼합하고, 애주번트로서 결핵균의 사균을 혼합한 것)과 항원을 혼합하여 투여하는 것이나, 항원을 리포솜에 포함시켜서 면역하는 것으로 항원의 면역성을 올릴 수 있다. 또는, 항원을 포함하는 용액과 애주번트 용액을 등량 첨가하여 충분히 유액상으로 하고나서 마우스의 피하 또는 복강 내에 주사하는 방법이나 명반수(alum water)와 잘 혼합하고나서 백일해 사균을 애주번트로서 첨가하는 방법이 있다. 또한, 최초의 면역을 하고나서 적당한 기간 후, 마우스의 복강 내 또는 정맥 내에 추가 면역시킬 수도 있다. 또, 항원의 양이 적은 경우에는 항원이 부유하는 용액을 직접 마우스 비장에 주입하여 면역시켜도 좋다. 최종 면역으로부터 몇 일 후에 비장을 적출하여 지방 조직을 박리하고나서 비세포 부유액을 제작한다. 이 비세포와, 예를 들면, HGPRT결손 골수종 세포를 세포 융합하여 하이브리도마를 제작한다. 세포 융합제로서는, 비세포(B세포)와 골수종 세포를 효율적으로 융합할 수 있는 방법이라면 무엇이어도 좋고, 예를 들면, 센다이 바이러스(HVJ), 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 이용하는 방법 등을 들 수 있다. 또, 고전압 펄스를 이용하는 방법으로 세포 융합을 해도 좋다. 세포 융합 조작 후, HAT배지로 배양하고, 비세포와 골수종 세포가 융합한 하이브리도마의 클론을 선택하고, 스크리닝이 가능해지기까지 세포가 성육(成育)하는 것을 기다린다. 목적으로 하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하기 위한 항체의 검출법이나 항체 역가(抗體力價)의 측정법에는 항원 항체 반응계를 이용할 수 있다. 구체적으로는, 가용성 항원에 대한 항체 측정법으로 방사성 동위 원소 면역 정량법(RIA), 효소 면역 정량법(ELISA) 등을 들 수 있다.
“상보적으로 결합하는”이란, 염기끼리의 수소 결합에 의한 염기 대합에 의해 2개의 1개 사슬 DNA 또는 1개 사슬 DNA와 RNA가 2개 사슬 DNA 또는 DNA와 RNA로 이루어지는 헤테로 2개 사슬을 형성하는 것을 의미한다. 예를 들면, 1개 사슬 DNA를 구성하는 염기가 다른 1개 사슬 DNA를 구성하는 염기와의 사이에서 퓨린과 피리미딘의 염기 대합을 발생시킴으로써 이들 1개 사슬 DNA가 2개 사슬 DNA를 형성하는 것이며, 보다 구체적으로는, 복수의 연속된 티민과 아데닌, 구아닌과 사이토신의 수소 결합에 의한 염기 결합에 의해 2개 사슬 DNA를 형성하는 것을 의미한다. 또 예를 들면, 1개 사슬 DNA를 구성하는 염기가 RNA를 구성하는 염기와의 사이에서 퓨린과 피리미딘의 염기 대합을 발생시킴으로써 이들 1개 사슬 DNA와 RNA가 2개 사슬을 형성하는 것이며, 보다 구체적으로는, 복수의 연속된 라우실과 아데닌, 구아닌과 사이토신의 수소 결합에 의한 염기 결합에 의해 헤테로 2개 사슬을 형성하는 것을 의미한다.
“상보적으로 결합”은 “상보적인 염기 대합에 의한 결합”, “상보적인 염기 대합”, 또는 “상보성에 의하여 결합”으로 표현하는 일도 있다. 또, 상보적으로 결합할 수 있는 염기 배열을 서로 “상보성을 갖는”, “상보성인”으로 표현하는 일도 있다. 인공적으로 제작되는 올리고뉴클레오티드에 포함되는 이노신이 사이토신 또는 아데닌, 또는 티민과 수소 결합으로 결합하는 것도 상보적인 결합에 포함된다. “목적으로 하는 DNA영역에 대하여 상보성인 염기 배열을 포함하는 1개 사슬 DNA”란, 목적으로 하는 DNA영역을 포함하는 1개 사슬 DNA와의 결합체(2개 사슬 DNA)를 형성하기 위해 필요한 염기 배열, 즉, 목적으로 하는 DNA영역의 염기 배열의 일부에 상보적인 염기 배열을 포함하는 염기 배열인 것을 의미하고, “상보적 염기 배열”로 표현하는 일도 있다.
“상동성을 나타내는 염기 배열”이란, 배열 동일성을 갖는 염기 배열을 의미한다. 본 발명에 있어서, 배열 상동성의 비율을 기술하지 않는 경우는 75％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상의 배열 동일성을 갖는 염기 배열을 말한다. 구체적으로, “배열 번호 1과 상동성을 나타내는 염기 배열”이란, 배열 번호 1의 염기 배열 또는 배열 번호 1의 염기 배열과 75％ 이상의 배열 동일성을 갖는 염기 배열이고, 바람직하게는 80％ 이상의 배열 동일성을 갖는 염기 배열인 것을 의미한다.
제2 공정에 있어서 검출 복합체는 지지체에 고정된다. 검출 복합체를 지지체에 고정화하는 경우에, 미리 얻어져 있는 피검 올리고뉴클레오티드의 5’말단 또는 3’말단을 비오틴화하고, 상기와 동일한 방법을 실시함으로써 직접 지지체에 결합시켜도 좋다.
예를 들면, 스트렙트아비딘 표지된 항체에 비오틴 표지된 피검 올리고뉴클레오티드를 고정화해도 좋다. 이와 같은 경우에는, 복합 검출 올리고뉴클레오티드의 식별 기능에 의해 피검 올리고뉴클레오티드를 정량 또는 검출하는 것은 스트렙트아비딘 표지된 항체를 정량 또는 검출하게 된다. 즉, 피검 올리고뉴클레오티드를 인공적으로 합성한 올리고뉴클레오티드로 하는 경우에는, 피검 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 대상(즉, 지지체)의 정량 또는 검출에 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서의 “피검 올리고뉴클레오티드”를 고정화하는 지지체로서는, DNA나 RNA의 검출 뿐만 아니라, 항체 등의 단백질이어도 좋다. 예를 들면, “복합 검출 올리고뉴클레오티드”가 메틸화 올리고뉴클레오티드를 포함하는 경우, “복합 검출 올리고뉴클레오티드”에는 복수의 메틸화 DNA항체가 결합할 수 있기 때문에 메틸화 DNA항체의 결합수에 상관한 검출 감도로 지지체를 검출하는 것이 가능하게 된다. 통상, 항체 등의 검출에는 항체 1분자에 대하여 표지 분자는 하나이기 때문에(HRP, FITC 등), 본 발명에 의해 고감도화가 기대된다. 또, 메틸화 올리고뉴클레오티드가 5―메틸사이토신을 포함하는 경우, 복합 검출 올리고뉴클레오티드는 오스뮴 착체에 의해 식별 가능하게 되고, “복합 검출 올리고뉴클레오티드”에 포함되는 5―메틸사이토신의 수와 상관한 검출 감도의 고감도화를 기대할 수 있다.
구체적으로, 제3 올리고뉴클레오티드까지를 이용한 복합 검출 올리고뉴클레오티드와 피검 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 검출 복합체를 비오틴화 특정 올리고뉴클레오티드에 의해 지지체에 고정화하는 경우, 피검 올리고뉴클레오티드를 포함하는 게놈 DNA수용액(0.1pmol／10㎕, 게놈 DNA인 경우, 미리 적절한 제한 효소로 처리하고, DNA를 단편화해 두는 것이 바람직하다.)에 피검 올리고뉴클레오티드와 상보성에 의하여 결합하는 제1 올리고뉴클레오티드 수용액(0.02μM), 제1 올리고뉴클레오티드와 상보성에 의하여 결합하는 제2 올리고뉴클레오티드 수용액(0.02μM), 제2 올리고뉴클레오티드와 상보성에 의하여 결합하는 제3 올리고뉴클레오티드 수용액(0.02μM, 이 경우, 제3 올리고뉴클레오티드가 종말 올리고뉴클레오티드로 된다.), 상기 피검 올리고뉴클레오티드와 상기 복합 검출 올리고뉴클레오티드의 결합을 저해하지 않고, 또한, 상기 피검 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합하는 비오틴화 특정 올리고뉴클레오티드(0.02μM)를 각각 5μL 첨가하고, 또한, 100mM의 MgCl2를 20μL 및 최적인 10×완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithothreitol)을 10㎕ 첨가하고, 이어서, 상기 혼합물에 멸균 초순수를 첨가하여 액량을 100μL로 하고, 95℃에서 10분간 가열하고, 70℃에서 10분간 보온 후, 50℃에서 10분간 보온하고나서 37℃에서 10분간 냉각 처리하여 검출 복합체와 특정 올리고뉴클레오티드가 상보적으로 결합한 특정 검출 복합체를 취득한다. 이와 같이 하여 형성된 특정 검출 복합체를 아비딘 플레이트로 옮기고, 30분간 실온에서 정치하면 좋다. 그 후, 잔(殘)용액의 제거 및 세정을 실시한다. 세정 버퍼[예를 들면, 0.05％의 Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 200μL／웰의 비율로 첨가하고, 용액을 제거한다. 이 세정 조작을 수회 반복하여 특정 올리고뉴클레오티드를 통해서 아비딘 플레이트에 결합한 검출 복합체를 남긴다(선택한다). 또한, 상기 방법에 있어서의 제1 올리고뉴클레오티드∼종말 올리고뉴클레오티드 중, 적어도 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 메틸화 올리고뉴클레오티드가 아니면 안된다. 모든 올리고뉴클레오티드가 메틸화 올리고뉴클레오티드이어도 좋다. 상기에서는 제3 올리고뉴클레오티드까지의 경우를 나타냈지만, 제N 올리고뉴클레오티드까지 상기 동일한 방법으로 실시하면 좋다. 피검 메틸화 올리고뉴클레오티드 복합체를 고정화(선택)할 때, 최종적으로 피검 메틸화 올리고뉴클레오티드 복합체가 형성되고, 고정화(선택)되면 좋기 때문에, 상기 방법에서는 피검 올리고뉴클레오티드, 비오틴화 특정 올리고뉴클레오티드, 메틸화 올리고뉴클레오티드(복합체)를 동시에 첨가하여 상기 복합체를 취득하고, 그 후, 비오틴화 특정 올리고뉴클레오티드를 이용하여 고정화(선택)하고 있지만, 그 순서는 특별히 한정되지 않는다. 즉, 먼저 비오틴화 특정 올리고뉴클레오티드를 아비딘 플레이트에 고정화해 두고, 그 후, 피검 올리고뉴클레오티드 및 메틸화 올리고뉴클레오티드(복합체)를 첨가하여 피검 메틸화 올리고뉴클레오티드 복합체를 취득하고, 고정화(선택)해도 좋다.
또한, 세정 버퍼는 용액 중에 부유해 있는 1개 사슬DNA 등의 제거에 적합하면 좋고, 상기 세정 버퍼에 한정되지 않고, DELFIA버퍼(PerkinElmer사제, Tris-HCl pH 7.8 with Tween 80), TE버퍼 등이어도 좋다.
“지지체”로서는, 검출 복합체가 결합 가능한 지지체이면, 재질 및 형상은 무엇이어도 좋다. 예를 들면, 형상은 사용 목적에 적합하면 좋고, 튜브상, 테스트 플레이트상, 필터상, 디스크상, 비드상 등을 들 수 있다. 또, 재질로서는, 통상의 면역 측정법용 지지체로서 이용되는 것, 예를 들면, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴산메틸, 폴리설폰, 폴리아크릴로니트릴, 나일론 등의 합성 수지, 또는 상기 합성 수지에 설폰기, 아미노기 등의 반응성 관능기를 도입한 것이어도 좋다. 또, 유리, 다당류 또는 그 유도체(셀룰로오스, 니트로 셀룰로오스 등), 실리카겔, 다공성 세라믹스, 금속 산화물 등이어도 좋다. 또한, 지지체는 금콜로이드(금나노 입자), 라텍스 비드이어도 좋다. 또, 지지체로서, 생체 분자로서의 단백질이나 항체, 지질 등의 생체 분자, 올리고뉴클레오티드이어도 좋다.
제2 공정에 있어서의 “검출 복합체를 지지체에 고정화시키는” 경우, 상기 피검 올리고뉴클레오티드와 상기 복합 검출 올리고뉴클레오티드의 결합을 저해하지 않고, 또한, 상기 피검 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합하며, 또한, 지지체에 결합할 수 있는 특정 올리고뉴클레오티드를 상보적으로 결합시킴으로써 검출 복합체를 지지체에 고정화해도 좋다. 특정 올리고뉴클레오티드를 지지체에 결합시키는 경우에는, 특정 올리고뉴클레오티드는 지지체로의 결합 기능과 피검 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합할 수 있는 배열을 갖고 있으면 좋다.
본 발명의 제2 공정에 있어서의 “검출 복합체를 형성”하는 방법으로서는 구체적으로는 예를 들면, 제3 올리고뉴클레오티드까지를 이용한 복합 검출 올리고뉴클레오티드와 피검 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 검출 복합체를 취득하는 경우, 피검 올리고뉴클레오티드를 포함하는 게놈 DNA수용액(0.1pmol／10㎕, 게놈 DNA인 경우, 미리 적절한 제한 효소로 처리하고, DNA를 단편화해 두는 것이 바람직하다.)에 피검 올리고뉴클레오티드와 상보성에 의하여 결합하는 제1 올리고뉴클레오티드 수용액(0.02μM), 제1 올리고뉴클레오티드와 상보성에 의하여 결합하는 제2 올리고뉴클레오티드 수용액(0.02μM) 및 제2 올리고뉴클레오티드와 상보성에 의하여 결합하는 제3 올리고뉴클레오티드 수용액(0.02μM, 이 경우, 제3 올리고뉴클레오티드가 종말 올리고뉴클레오티드로 된다.)을 각각 5μL 첨가하고, 또한, 100mM의 MgCl2를 20μL 및 최적인 10×완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithothreitol)을 10㎕ 첨가하고, 이어서, 상기 혼합물에 멸균 초순수를 첨가하여 액량을 100μL로 하고, 95℃에서 10분간 가열하고, 70℃에서 10분간 보온 후, 50℃에서 10분간 보온하고나서 37℃에서 10분간 냉각 처리하면 좋다. 또한, 상기 방법에 있어서의 제1 올리고뉴클레오티드∼종말 올리고뉴클레오티드 중, 적어도 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 메틸화 올리고뉴클레오티드가 아니면 안된다. 모든 올리고뉴클레오티드가 메틸화 올리고뉴클레오티드이어도 좋다. 상기에서는 제3 올리고뉴클레오티드까지의 경우를 나타냈지만, 제N 올리고뉴클레오티드까지 상기 동일한 방법으로 실시하면 좋다.
본 발명에 있어서의 “특정 올리고뉴클레오티드”란, 목적으로 하는 DNA영역을 포함하는 DNA와 상보성에 의해 결합할 수 있는 염기 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드이고, 또한, 지지체에 결합하는 기능을 갖고 있으면 좋다. 구체적으로는, 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA와 상보적으로 결합하는 특정 접착 배열을 갖고, 또한, 상기 지지체에 결합한다. 또, “특정 올리고뉴클레오티드”는 복합 검출 올리고뉴클레오티드와 피검 올리고뉴클레오티드의 결합을 저해하지 않는 것이 바람직하고, 또한, 복합 검출 올리고뉴클레오티드의 형성을 저해하지 않는 것이 바람직하다. 또한, 검체 중에 포함되는 핵산이나 그 밖의 올리고뉴클레오티드의 염기 배열과 상보적인 결합을 하지 않는 것이 바람직하다.
“특정 접착 배열”이란, 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 염기 배열(피검 올리고뉴클레오티드)에 상보적인 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로서, 특정 접착 배열이 대합할 수 있는 피검 올리고뉴클레오티드의 염기 배열의 상보적 염기 배열은 특정 접착 배열의 염기 배열과 75％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상의 상동성을 갖고 있는 것을 의미한다. 특정 접착 배열의 염기 배열의 길이는 5bp∼100bp, 바람직하게는 10bp∼50bp이면 좋다. 또, 특정 접착 배열은 검출용 접착 배열과 목적으로 하는 DNA영역의 결합을 저해하지 않는 것이면 좋다. 또, “특정 접착 배열”은 게놈 중의 반복 배열에 결합하는 염기 배열인 것이 바람직하고, 동일 반복 배열 중에 검출용 접착 배열이 설계되어 있는 것이면 더욱 좋다. 또, 동일 반복 배열 중에 설계된 검출용 접착 배열과 특정 접착 배열은 서로 피검 올리고뉴클레오티드와의 결합을 저해하지 않는 것이 바람직하다.
특정 올리고뉴클레오티드를 지지체에 고정화하기 위해서는 구체적으로는, 특정 올리고뉴클레오티드의 5’말단 또는 3’말단을 비오틴화하여 얻어진 비오틴화 올리고뉴클레오티드를 스트렙트아비딘으로 피복한 지지체(예를 들면, 스트렙트아비딘으로 피복한 PCR튜브, 스트렙트아비딘으로 피복한 자기 비드, 스트렙트아비딘으로 일부를 피복한 크로마토스트립 등)에 고정하는 방법을 들 수 있다.
특정 올리고뉴클레오티드의 5’말단 또는 3’말단을, 아미노기, 티올기, 알데히드기 등의 활성 관능기를 갖는 분자를 공유 결합시킨 후, 실란 커플링제 등으로 표면을 활성화시킨 유리, 다당류 유도체, 실리카겔, 또는 상기 합성 수지 등, 또는 내열성 플라스틱제의 지지체에 공유 결합시키는 방법도 있다. 또한, 공유 결합에는 예를 들면, 트리글리세라이드를 5개 직렬로 연결하여 이루어지는 스페이서, 크로스 링커 등에 의해 공유 결합시킨다. 또한, 유리 또는 실리콘제의 지지체의 위에서 직접 특정 올리고뉴클레오티드의 말단측으로부터 화학 합성시키는 방법도 들 수 있다.
제3 공정은 제2 공정에서 형성한 검출 복합체에 포함되는 복합 검출 올리고뉴클레오티드를 그 식별 기능에 의해 검출함으로써 상기 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA를 정량 또는 검출하는 공정이다.
본 발명의 제3 공정에 있어서의 “검출 복합체에 포함되는 복합 검출 올리고뉴클레오티드를 그 식별 기능에 의해 검출”하는 방법으로서는 예를 들면, (1) 피검 검출 올리고뉴클레오티드로서 메틸화 올리고뉴클레오티드를 이용하는 경우, 검출 복합체가 결합된 아비딘 플레이트에 메틸화 DNA항체와 결합하는 유로퓸(이하, “Eu”로 기재하는 일도 있다) 표지된 항체(2차 항체)를 결합시키고, Enhancement solution(Perkin Elmer사제)을 첨가 후, 여기 340㎚／형광 612㎚로 형광을 측정하면 좋다. Eu표지 대신에 FITC표지을 이용할 수도 있다. 또, FITC표지한 항체(2차 항체)는 다시 HRP표지한 FITC항체를 결합시키고, HRP의 효소 활성에 의해 검출할 수도 있다. HRP의 효소 활성을 이용하여 검출하는 경우, 기질(R&D사, ＃DY999)을 첨가하여 실온에서 인큐베이션한 후, Stop solution(1M H2SO4: 50μL／well)을 첨가하여 흡광 450㎚(Reference 650㎚)를 측정하면 좋다.
(2) 예를 들면, 상기의 방법 구체예에서 얻어진 아비딘 플레이트에 결합한 검출 복합체에 메틸화 DNA항체를 적당량(예를 들면, 4㎍／mL용액을 100μL／웰) 웰에 첨가하고, 그 후, 실온에서 예를 들면, 약 3시간 정치하고, 메틸화 DNA항체와 복합 검출 올리고뉴클레오티드에 포함되는 메틸화 DNA의 결합을 재촉한다. 그 후, 잔용액의 제거 및 세정을 실시한다. 세정 버퍼(예를 들면, 0.05％ Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4))를 예를 들면, 300μL／웰의 비율로 첨가하고, 용액을 제거한다. 이 세정 조작을 수회 반복하고, 메틸화 DNA항체가 결합한 검출 복합체를 웰 상에 남긴다. 또한, 세정 버퍼는 상기 유리의 메틸화 DNA항체, 용액 중에 부유해 있는 1개 사슬 DNA 등의 제거에 적합하면 좋고, 상기 세정 버퍼에 한정되지 않고, DELFIA버퍼(PerkinElmer사제, Tris-HCl pH 7.8 with Tween 80), TE버퍼 등이어도 좋다.
(3) 예를 들면, 아비딘 플레이트의 각 웰에 메틸사이토신 항체[Aviva Systems Biology사제, 0.5㎍／mL 0.1％ BSA함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]를 100μL을 첨가하고, 1시간 실온에서 방치했다. 그 후, 용액을 피펫팅(pipetting)으로 제거하고, 각 웰을 세정 버퍼[0.05％ Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정했다. 또한, 메틸화 DNA항체에 대한 2차 항체(예를 들면, Eu-N1표지 마우스IgG항체: PerkinElmer사제)를 첨가하고, 실온에서 약 1시간 정치하고, 2차 항체의 복합체로의 결합을 재촉한다. 그 후, Enhancement Solution(PerkinElmer사제)을 첨가ㆍ혼합하고, 예를 들면, 약 45분간 실온에서 정치한다. 그 후, 형광 검출기로 형광(여기 340㎚／형광 612㎚)을 측정함으로써 메틸화 DNA항체를 검출 또는 정량한다.
또는 아비딘 플레이트에 결합한 검출 복합체에 2차 항체로서 2㎍／mL로 조정한 FITC로 표지한 마우스IgG항체(염소)를 100μL／웰의 비율로 첨가하고, 1시간 실온에서 정치 후, 잔용액을 제거하고, 세정 버퍼[예를 들면, 0.05％의 Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 200μL／웰의 비율로 첨가하고, 용액을 제거한다. 이 세정 조작을 수회 반복한다. 또한, FITC에 대한 2차 항체(예를 들면, HRP표지 FITC항체: Jackson ImmunoResearch Laboratories사제)를 100μL／웰의 비율로 아비딘 코트 플레이트에 첨가하여 실온에서 인큐베이션한다. 세정 버퍼[예를 들면, 0.05％의 Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 200μL／웰의 비율로 첨가하고 용액을 제거한다. 이 세정 조작을 수회 반복한다. 기질(R&D사, ＃DY999)을 100μL／웰의 비율로 첨가하고, 10초 정도 교반한다. 실온에서 인큐베이션하고, Stop solution(1M H2SO4: 50μL／well)을 첨가하고, 10초 정도 교반한다. 30분 이내에 흡광 450㎚(Reference 650㎚)를 측정한다(차광이 바람직하다).
본 발명에 있어서 목적으로 하는 RNA영역을 갖는 RNA를 정량 또는 검출하는 방법으로서는 우선, 생체 유래 검체로부터 목적으로 하는 RNA영역을 갖는 RNA를 취득하면 좋다.
예를 들면 구체적으로는, 생체 유래 검체로부터 RNA를 얻기 위해서는 예를 들면, 시판하는 RNA추출용 키트 등을 이용하여 RNA를 추출하면 좋다.
다음으로, 목적으로 하는 RNA영역을 갖는 RNA와 상보적으로 결합할 수 있는 피검 검출 올리고뉴클레오티드와의 결합체를 지지체에 고정화시켜서 피검 검출 올리고뉴클레오티드의 식별 기능에 의해 검출하면 좋다. 상기 목적으로 하는 RNA영역을 갖는 RNA와 상기 피검 검출 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 검출 복합체를 지지체에 고정화하기 위해서는, 검출 복합체를 구성하는 상기 목적으로 하는 RNA영역을 갖는 RNA와 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드이고, 또한, 지지체로의 결합하는 기능을 갖는 특정 올리고뉴클레오티드를 상기 검출 복합체를 형성할 때에 첨가하고, 상기 목적으로 하는 RNA영역을 갖는 RNA와 상기 피검 검출 올리고뉴클레오티드와 상기 특정 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 복합체를 형성시켜서 지지체에 고정화하면 좋다.
“상기 목적으로 하는 RNA영역을 갖는 RNA와 상기 피검 검출 올리고뉴클레오티드와 상기 특정 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 복합체를 형성”시키는 데는 예를 들면, 생체 유래 검체로부터 추출한 RNA를 제1 올리고뉴클레오티드로부터 제3 올리고뉴클레오티드로 형성되는 “직쇄형”의 복합 검출 올리고뉴클레오티드와 상기 목적으로 하는 RNA영역을 갖는 RNA가 상보적으로 결합하여 이루어지는 검출 복합체와 비오틴화 특정 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성시켜서 지지체에 고정화하면 좋다. 구체적으로는, 상기 RNA를 포함하는 수용액(0.1pmol／10㎕, RNAse를 포함하지 않는 수용액으로 조제한다. 구체적으로는, 120기압으로 20분 처리한 물 등을 이용하여 수용액을 조제하는 등)에 상기 RNA와 상보성에 의하여 결합하는 제1 올리고뉴클레오티드 수용액(0.02μM), 제1 올리고뉴클레오티드와 상보성에 의하여 결합하는 제2 올리고뉴클레오티드 수용액(0.02μM), 제2 올리고뉴클레오티드와 상보성에 의하여 결합하는 제3 올리고뉴클레오티드 수용액(0.02μM, 이 경우, 제3 올리고뉴클레오티드가 종말 올리고뉴클레오티드로 된다.), 상기 RNA와 상기 복합 검출 올리고뉴클레오티드의 결합을 저해하지 않고, 또한, 상기 RNA와 상보적으로 결합하는 비오틴화 특정 올리고뉴클레오티드(0.02μM)를 각각 5μL 첨가한 용액을 추가한 혼합액(50％포름아미드, 5×SSC(150mM의 NaCl, 15mM의 구연산3나트륨), 50mM의 인산나트륨(pH 7.6), 5×덴하르트액, 10％황산덱스트란 및 20㎍／㎖의 변성 전단 연어 정자DNA를 포함한다)을 조제하고, 상기 혼합액의 액량을 100μL로 하고, 95℃에서 10분간 가열하고, 70℃에서 10분간 보온 후, 50℃에서 10분간 보온하고나서 37℃에서 10분간 냉각 처리하여 검출 복합체와 특정 올리고뉴클레오티드가 상보적으로 결합한 특정 검출 복합체를 취득한다. 또한, 상기 혼합액은 일반적인 혼성화 용액이며, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)에 기재되어 있는 바와 같은 주지의 혼성화의 방법에 이용되는 용액이다.
“상기 목적으로 하는 RNA영역을 갖는 RNA와 상기 피검 검출 올리고뉴클레오티드와 상기 특정 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 복합체”를 “지지체에 고정화”시키는 데는 구체적으로는, 제1 올리고뉴클레오티드로부터 제3 올리고뉴클레오티드로 형성되는 “직쇄형”의 복합 검출 올리고뉴클레오티드와 상기 목적으로 하는 RNA영역을 갖는 RNA가 상보적으로 결합하여 이루어지는 검출 복합체에 비오틴화 특정 올리고뉴클레오티드를 상보적으로 결합시켜서 이루어지는 복합체를 아비딘 플레이트로 옮기고, 30분간 실온에서 정치하면 좋다. 그 후, 잔용액의 제거 및 세정을 실시한다. 세정 버퍼[예를 들면, 0.05％의 Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 200μL／웰의 비율로 첨가하고, 용액을 제거한다. 이 세정 조작을 수회 반복하여 특정 올리고뉴클레오티드를 통해서 아비딘 플레이트에 결합한 검출 복합체를 남긴다(선택한다). 또한, 상기 방법에 있어서의 제1 올리고뉴클레오티드∼종말 올리고뉴클레오티드 중, 적어도 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 메틸화 올리고뉴클레오티드가 아니면 안된다. 모든 올리고뉴클레오티드가 메틸화 올리고뉴클레오티드이어도 좋다. 상기에서는 제3 올리고뉴클레오티드까지의 경우를 나타냈지만, 제N 올리고뉴클레오티드까지 상기 동일한 방법으로 실시하면 좋다. 피검 메틸화 올리고뉴클레오티드 복합체를 고정화(선택)할 때, 최종적으로 피검 메틸화 올리고뉴클레오티드 복합체가 형성되고, 고정화(선택)되면 좋기 때문에, 상기 방법에서는 피검 올리고뉴클레오티드, 비오틴화 특정 올리고뉴클레오티드, 메틸화 올리고뉴클레오티드(복합체)를 동시에 첨가하여 상기 복합체를 취득하고, 그 후, 비오틴화 특정 올리고뉴클레오티드를 이용하여 고정화(선택)하고 있지만, 그 순서는 특별히 한정되지 않는다. 즉, 먼저 비오틴화 특정 올리고뉴클레오티드를 아비딘 플레이트에 고정화해 두고, 그 후, 피검 올리고뉴클레오티드 및 메틸화 올리고뉴클레오티드(복합체)를 첨가하여 피검 메틸화 올리고뉴클레오티드 복합체를 취득하고, 고정화(선택)해도 좋다.
본 발명에 있어서 목적으로 하는 RNA영역을 갖는 RNA를 정량 또는 검출하는 방법으로서, “상기 제1 올리고뉴클레오티드로부터 제3 올리고뉴클레오티드로 형성되는 “직쇄형”의 복합 검출 올리고뉴클레오티드와 상기 목적으로 하는 RNA영역을 갖는 RNA가 상보적으로 결합하여 이루어지는 검출 복합체에 비오틴화 특정 올리고뉴클레오티드를 상보적으로 결합시켜서 이루어지는 복합체”를 정량 또는 검출하기 위해서는, 피검 검출 올리고뉴클레오티드의 식별 기능을 이용하면 좋다. 구체적으로는, 아비딘 플레이트의 각 웰에 메틸사이토신 항체[Aviva Systems Biology사제, 0.5㎍／mL 0.1％ BSA함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]를 100μL을 첨가하고, 1시간 실온에서 방치했다. 그 후, 용액을 피펫팅으로 제거하고, 각 웰을 세정 버퍼[0.05％ Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정했다. 또한, 메틸화 DNA항체에 대한 2차 항체(예를 들면, Eu-N1표지 마우스 IgG항체: PerkinElmer사제)를 첨가하고, 실온에서 약 1시간 정치하고, 2차 항체의 복합체로의 결합을 재촉한다. 그 후, Enhancement Solution(PerkinElmer사제)을 첨가ㆍ혼합하고, 예를 들면, 약 45분간 실온에서 정치한다. 그 후, 형광 검출기로 형광(여기 340㎚／형광 612㎚)을 측정함으로써 메틸화 DNA항체를 검출 또는 정량함으로써 생물 유래 검체 중에 포함되는 상기 RNA의 목적으로 하는 영역과 상관한 측정값을 얻는 것이 가능하다.
본 발명은 하기와 같은 장면에서 이용하면 좋다.
각종 질환에 있어서, 각종 질환의 정도에 상관성을 나타내는 RNA 그 자체, 그 RNA를 주형으로 하여 제작된 DNA나 각종 질환의 정도에 상관성을 나타내는 DNA 등을 정량 또는 검출함으로써 각종 질환의 정도를 추정하는 것이 가능하게 된다. 예를 들면, 암 등에 있어서는, 혈액 중의 유리 DNA의 정량에 의해 정기 건강 진단에 있어서의 스크리닝 검사로서 이용이 가능하다. 감염증 등에 있어서는, 질환 원인이 되는 세균, 바이러스의 DNA, RNA, 그 RNA를 주형으로 하여 역전사 효소에 의해 제작된 DNA를 검출 또는 정량함으로써 원인균이나 원인 바이러스의 특정이 가능하다고 생각된다. 또, 지금까지 미량이기 때문에 PCR 등을 실시하여 DNA를 증폭한 후에 검출하고 있던 DNA나 역전사 효소에 의해 DNA를 합성하여 검출하고 있던 RNA 등에 대하여, PCR 등의 번잡한 방법을 실시하지 않고도 DNA를 검출하는 것이 본 발명에 의해 가능해진다. 또, 역전사 효소에 의해 DNA를 합성하지 않고도 RNA의 정량 또는 검출이 가능해진다.
혈액, 소변 등의 생체 시료 중에 포함되는 미량 물질의 검출 또는 정량하는 방법으로서, 면역학적 측정 방법이 범용되고 있다. 상기 면역학적 측정 방법 중, 크로마토그래피를 이용한 이른바 면역 크로마토법은 조작이 간단하고, 검정에 요하는 시간도 짧기 때문에 현재 예를 들면, 병원에 있어서의 임상 검사, 연구실에 있어서의 검정 시험 등의 많은 장면에서 널리 이용되고 있다. 또, 근래, 표지된 DNA(유전자)를 크로마토스트립 상에서 전개하고, 목적 DNA(유전자)를 포획할 수 있는 프로브를 이용하여 혼성화함으로써 목적 DNA(유전자)를 검출하는 이른바 하이브리드 크로마토법이 이용되게 되어 왔다. 이 방법도 조작이 간편하고, 검정에 요하는 시간도 짧기 때문에 현재, 병원에 있어서의 임상 검사, 연구실에 있어서의 검정 시험 등의 장면에서 널리 이용되기 시작되고 있다. 본 발명 측정 방법은 상기의 면역 크로마토법과 하이브리드 크로마토법을 혼합한 방법을 개념적으로 가능하게 하고 있다. 본 발명 측정 방법에서는 복합체 형성 및 복합체 취득에 관하여, 그 순서는 특별히 한정되지 않기 때문에 여러 가지 방법이 가능하다. 구체적으로는 예를 들면, 이하와 같이 실시하면 좋다.
예를 들면, 제2 공정 종료 직후의 시료에 비오틴화 특정 올리고뉴클레오티드와 식별 기능을 갖는 검출 올리고뉴클레오티드를 첨가하고, 목적으로 하는 DNA영역을 포함하는 메틸화된 1개 사슬 DNA와 식별 기능을 갖는 검출 올리고뉴클레오티드와 비오틴화 특정 올리고뉴클레오티드를 결합시켜서 목적으로 하는 DNA영역을 포함하는 1개 사슬 DNA와, 식별 기능을 갖는 검출 올리고뉴클레오티드와, 비오틴화 특정 올리고뉴클레오티드가 결합한 검출 복합체를 형성시킨다. 얻어진 시료를 크로마토스트립의 도입부에 적하(도입)하면, 상기 복합체가 전개부를 모세관 현상에 의해 이동하고, 미리 스트렙트아비딘으로 피복해 둔 부분에 포획된다. 그 후, 얻어진 복합체에 포함되는 검출 올리고뉴클레오티드를, 그 식별 기능에 기초하여 검출 또는 정량함으로써 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA를 검출 또는 정량할 수 있다.
목적으로 하는 DNA영역에 복수의 검출 부위(각각 다른 목적으로 하는 DNA영역과 상보적으로 결합할 수 있는 검출 올리고뉴클레오티드를 이용한다)를 존재시키고, 각 목적으로 하는 DNA영역을 차례 차례 검출 또는 정량하는 것도 가능하며, 또, 복수의 목적으로 하는 DNA영역과 복합체를 형성할 수 있도록, 게놈 중의 반복 배열이나 중복 유전자, 또는 복수의 다른 유전자를 동시에 검출하는, 복수의 목적으로 하는 DNA영역과 상보적으로 결합할 수 있는 검출 올리고뉴클레오티드를 이용해도 검출 감도를 비약적으로 올릴 수 있다. 또한, 하나의 목적 영역 중에서도 수많은 검출 올리고뉴클레오티드를 설계하고, 그들을 지지체측 또는 검출측에서 이용해도 검출 감도를 비약적으로 올릴 수 있다.
검출 올리고뉴클레오티드, 비오틴화 특정 올리고뉴클레오티드 및 목적으로 하는 DNA영역 또는 목적으로 하는 RNA영역의 복합체를 형성하여 지지체에 결합시키는 과정을 실시하는 방법으로서는, 상기의 방법에 한정되는 것은 아니고, 면역 항체법을 이용하는 방법이면 무엇이어도 좋다. 예를 들면, ELISA법에서는 크로마토스트립법과 동일한 원리를 이용하기 때문에 복합체를 형성하여 지지체에 결합시키는 과정을 기재된 순서로 실시하는 것은 가능하다.
이와 같은 본 발명에 있어서의 메틸화 올리고뉴클레오티드 등은 검출용 키트의 시약으로서 유용하다. 또, 본 발명의 권리 범위는 상기 방법의 실질적인 원리를 이용하여 이루어지는 상기와 같은 검출용 키트와 같은 형태에서의 사용도 포함하는 것이다.
데이터 베이스 상에서 공개되어 있는 염기 배열로부터 미생물 특유의 염기 배열을 탐색할 수 있다. 예를 들면, PubMed 등의 공개 데이터 베이스 상에 있는 염기 배열이면, 통상의 수속에 의해 취득하는 것이 가능하고, 취득한 염기 배열은 통상의 수속에 의한 Blast검색을 걺으로써 특유의 염기 배열인지의 여부를 검토할 수 있다. 또한, 특유의 염기 배열이란, 검출 대상의 염기 배열이 검출 대상 미생물 이외의 생물 유래의 염기 배열과 상동성을 나타내는 염기 배열을 갖지 않는 것을 의미한다.
특히, 검체가 인간 생체 검사 샘플인 경우, 인간 유전자와 상보적인 결합을 하지 않는 특정 올리고뉴클레오티드를 설계하는 것은 중요하다. 또, 마찬가지로, 검체가 식품인 경우, 식품에 포함되는 검출 대상 이외의 생물 유래의 염기 배열과 상보적인 결합을 하지 않는 접착용 염기 배열, 특정 염기 배열을 설계하는 것은 중요하다.
어떤 영역 중의 반복 배열을 조사하고 싶은 경우, PubMed 등의 일반적인 배열 검색의 데이터 베이스에서 검색하는 것은 어렵고, 통상은 Repbase(www.girinst.org／repbase／), RepeatMasker(www.repeatmasker.org／) 등의 데이터 베이스를 이용하면 좋다. 본 발명의 특정 접착 배열 및 검출용 접착 배열을 설정할 수 있으면, 검출 감도를 올릴 수 있다. 또한, 이들의 반복 배열을 측정하는 것은 예를 들면, 혈액 중의 유리 DNA량의 서로게이트 마커로서 취급하는 것이 가능하고, 생물종 특이적인 반복 배열에 주목하는 경우에는 생물종의 특정 등에 이용할 수 있다.
본 발명 방법에 있어서의 “복합 검출 올리고뉴클레오티드를 이용한 검체의 표지 방법”이란, 복수의 올리고뉴클레오티드가 상보적으로 결합한 복합 검출 올리고뉴클레오티드를 결합시킴으로써 피검 올리고뉴클레오티드 표지하는 방법을 의미한다. 예를 들면, 복합 검출 올리고뉴클레오티드의 식별 기능으로서, 메틸화 DNA를 검출하는 방법을 이용하는 경우, 이론상, 복합 검출 올리고뉴클레오티드 상에 메틸화 DNA를 상한 없이 설계할 수 있기 때문에 복합 검출 올리고뉴클레오티드 상에 설계한 메틸화 DNA의 수에 상관한 검출 감도의 증가를 기대할 수 있다. 본 발명 방법은 이와 같이 복합 검출 올리고뉴클레오티드를 이용함으로써 검출 감도를 증가시키는 방법을 포함한다.
검출 올리고뉴클레오티드는 하나의 메틸화 올리고뉴클레오티드로 이루어져 있어도 좋고, 이 경우, 검출 올리고뉴클레오티드 상에 설계된 메틸화 DNA의 수에 상관한 검출 감도의 향상을 기대할 수 있다. 즉, 본 발명 방법에 있어서, 메틸화 올리고뉴클레오티드를 검출 올리고뉴클레오티드로서 이용함으로써 상기 복합 검출 올리고뉴클레오티드에 의한 검출 감도의 향상과 마찬가지로, 검출 올리고뉴클레오티드 상에 설계된 메틸화 DNA의 수에 상관한 검출 감도를 기대할 수 있다.
본 발명 방법에 있어서, “복합 검출 올리고뉴클레오티드와 상기 복합 검출 올리고뉴클레오티드를 표지할 수 있는 시약을 이용한 검체의 표지 방법”에는 복합 검출 올리고뉴클레오티드에 의한 표지 방법과 복합 검출 올리고뉴클레오티드의 식별 기능을 조합한 어떠한 방법도 포함된다. 예를 들면, 복합 검출 올리고뉴클레오티드의 식별 기능이 메틸화 DNA를 이용하는 경우에 있어서, 복합 검출 올리고뉴클레오티드를 메틸화 DNA항체로 검출하는 경우, 복합 검출 올리고뉴클레오티드와 메틸화 DNA항체를 이용한 표지 방법을 들 수 있다. 예를 들면, 복합 검출 올리고뉴클레오티드를, 형광 표지한 올리고뉴클레오티드를 상보적으로 결합시켜서 표지하는 경우, 복합 검출 올리고뉴클레오티드와 형광 표지된 올리고뉴클레오티드를 이용한 표지 방법을 들 수 있다.
(실시예)
이하에 실시예에 의해 본 발명을 설명하는데, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
피검 올리고뉴클레오티드로서, 배열 번호 1로 나타내어지는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 이하의 TE버퍼 용액을 조제했다.
용액 A: 피검 올리고뉴클레오티드 0pmol／10μL TE버퍼 용액(네가티브 컨트롤액)
용액 B: 피검 올리고뉴클레오티드 0.001pmoL／10μL TE버퍼 용액
용액 C: 피검 올리고뉴클레오티드 0.01pmoL／10μL TE버퍼 용액
＜피검 올리고뉴클레오티드＞
5’―
AGTGACACCATCGAGAATGTCAGATCCGGATCAGAGCGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGACTACAACATCCAGA―3’ (배열 번호 1)
피검 올리고뉴클레오티드를 취득하기 위해 이용하는 특정 올리고뉴클레오티드로서, 배열 번호 2로 나타내어지는 염기 배열로 이루어지는 5’말단 비오틴화 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 0.1pmoL／5μL의 TE버퍼 용액을 조제했다.
＜5’말단 비오틴화 올리고뉴클레오티드＞
5’―Biotin―TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG―3’ (배열 번호 2)
피검 올리고뉴클레오티드를 검출하기 위해, 일반적인 DNA검출에 이용하는 형광 수식 올리고뉴클레오티드(컨트롤 1처리군용)로서, 플루오레세인 항체가 1군데 결합 가능한 배열 번호 3으로 나타내어지는 염기 배열로 이루어지는 5’말단 FITC화 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 0.1pmoL／5μL의 TE버퍼 용액을 조제했다.
＜5’말단 FITC화 올리고뉴클레오티드＞
5’―TGACATTCTCGATGGTGTCACT―3’(배열 번호 3)
또, 피검 올리고뉴클레오티드를 검출하기 위해, 일반적인 DNA검출에 이용하는 형광 수식 올리고뉴클레오티드(컨트롤 2처리군용)로서, 플루오레세인 항체가 1군데 결합 가능한 배열 번호 4로 나타내어지는 염기 배열로 이루어지는 3’말단 FLC화 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 0.1pmoL／5μL의 TE버퍼 용액을 조제했다.
＜3’말단 FLC화 올리고뉴클레오티드＞
5’―TGACATTCTCGATGGTGTCACTCACACACACACACACACACACACAGACAACGCCTCGTTCTCGG―FLC―3’(배열 번호 4)
피검 올리고뉴클레오티드를 검출하기 위한, 피검 올리고뉴클레오티드와 상보성에 의하여 결합하는 메틸화 올리고뉴클레오티드(제1 올리고뉴클레오티드, X처리군용)로서, 메틸사이토신 항체가 1군데 결합 가능한 배열 번호 5로 나타내어지는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드(M1)를 합성하고, 0.1pmoL／5μL의 TE버퍼 용액을 조제했다.
＜메틸화 올리고뉴클레오티드(M1)＞ N은 메틸화 사이토신을 나타낸다.
5’―TGACATTCTCGATGGTGTCACTCACACACACACACACACACACANAGACAACGCCTCGTTCTCGG―3’(배열 번호 5)
피검 올리고뉴클레오티드를 검출하기 위한, 피검 올리고뉴클레오티드와 상보성에 의하여 결합하는 메틸화 올리고뉴클레오티드(제1 올리고뉴클레오티드, Y처리군용)로서, 메틸사이토신 항체가 12군데 결합 가능한 배열 번호 6으로 나타내어지는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드(M12A)를 합성하고, 0.1pmoL／5μL의 TE버퍼 용액을 조제했다.
＜메틸화 올리고뉴클레오티드(M12A)＞ N은 메틸화 사이토신을 나타낸다.
5’―TGACATTCTCGATGGTGTCACTNANANANANANANANANANANANAGACAACGCCTCGTTCTCGG―3’(배열 번호 6)
상기에서 얻은 피검 올리고뉴클레오티드, 특정 올리고뉴클레오티드 및 메틸화(또는 형광 수식) 올리고뉴클레오티드 용액에 대하여, 이하의 4가지의 처리(컨트롤 1처리군, 컨트롤 2처리군, X처리군, Y처리군)를 실시했다.
＜컨트롤 1처리군＞
PCR튜브에 상기에서 조제한 피검 올리고뉴클레오티드 용액 10μL과, 상기의 특정 올리고뉴클레오티드 용액 5μL과, 상기의 5’말단 FITC화 올리고뉴클레오티드 용액 5μL과, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL과, 100mM MgCl2용액 20μL을 첨가하고, 또한, 상기 혼합물에 멸균 초순수를 첨가하여 액량을 100μL로 하고, 혼합했다. 그 후, 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기 위해, 다시 동시에 피검 올리고뉴클레오티드와 5’말단 FITC화 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기(즉, 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드와 5’말단 FITC화 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성시키기) 위해, 본(本) PCR튜브를 95℃에서 10분간 가열하고, 70℃까지 신속히 냉각하며, 그 온도로 10분간 보온했다. 이어서, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 또한, 37℃에서 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌렸다.
＜컨트롤 2처리군＞
PCR튜브에 상기에서 조제한 피검 올리고뉴클레오티드 용액 10μL과, 상기의 특정 올리고뉴클레오티드 용액 5μL과, 상기의 3’말단 FLC화 올리고뉴클레오티드 용액 5μL과, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL과, 100mM MgCl2용액 20μL을 첨가하고, 또한, 상기 혼합물에 멸균 초순수를 첨가하여 액량을 100μL로 하고, 혼합했다. 그 후, 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기 위해, 다시 동시에 피검 올리고뉴클레오티드와 3’말단 FLC화 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기(즉, 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드와 3’말단 FLC화 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성시키기) 위해, 본 PCR튜브를 95℃에서 10분간 가열하고, 70℃까지 신속히 냉각하며, 그 온도로 10분간 보온했다. 이어서, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 또한, 37℃에서 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌렸다.
＜X처리군＞
PCR튜브에 상기에서 조제한 피검 올리고뉴클레오티드 용액 10μL과, 상기의 특정 올리고뉴클레오티드 용액 5μL과, 상기의 메틸화 올리고뉴클레오티드(M1) 용액 5μL과, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL과, 100mM MgCl2용액 20μL을 첨가하고, 또한, 상기 혼합물에 멸균 초순수를 첨가하여 액량을 100μL로 하고, 혼합했다. 그 후, 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기 위해, 다시 동시에 피검 올리고뉴클레오티드와 메틸화 올리고뉴클레오티드(M1)의 2개 사슬을 형성시키기(즉, 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드와 메틸화 올리고뉴클레오티드(M1)의 복합체를 형성시키기) 위해, 본 PCR튜브를 95℃에서 10분간 가열하고, 70℃까지 신속히 냉각하며, 그 온도로 10분간 보온했다. 이어서, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 또한, 37℃에서 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌렸다.
＜Y처리군＞
PCR튜브에 상기에서 조제한 피검 올리고뉴클레오티드 용액 10μL과, 상기의 특정 올리고뉴클레오티드 용액 5μL과, 상기의 메틸화 올리고뉴클레오티드(M12A) 용액 5μL과, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL과, 100mM MgCl2용액 20μL을 첨가하고, 또한, 상기 혼합물에 멸균 초순수를 첨가하여 액량을 100μL로 하고, 혼합했다. 그 후, 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기 위해, 다시 동시에 피검 올리고뉴클레오티드와 메틸화 올리고뉴클레오티드(M12A)의 2개 사슬을 형성시키기(즉, 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드와 메틸화 올리고뉴클레오티드(M12A)의 복합체를 형성시키기) 위해, 본 PCR튜브를 95℃에서 10분간 가열하고, 70℃까지 신속히 냉각하며, 그 온도로 10분간 보온했다. 이어서, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 또한, 37℃에서 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌렸다.
얻어진 혼합물 전체를 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립으로 옮기고, 약 30분간 실온에서 방치하고, 8웰 스트립에 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드와 메틸화(또는 형광 수식) 올리고뉴클레오티드의 복합체를 비오틴―스트렙트아비딘 결합을 통하여 고정화했다. 그 후, 용액을 디캔테이션으로 제거하고, 각 웰을 세정 버퍼[0.05％ Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정했다.
이후의 조작은 컨트롤 1처리군 및 컨트롤 2처리군과, X처리군 및 Y처리군에서 이하의 다른 처리를 실시했다.
컨트롤 1처리군 및 컨트롤 2처리군(5’말단 FITC화 올리고뉴클레오티드 및 3’말단 FLC화 올리고뉴클레오티드를 이용한 경우)에 대해서는, 이하의 처리를 실시했다.
각 웰에 항체 용액[Peroxidase-conjugated IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Fluorescein: Jackson ImmunoResearch Laboratories사제, 0.1㎍／mL 0.1％ BSA함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]를 100μL의 비율로 첨가하고, 1시간 실온에서 방치했다. 그 후, 각 웰을 세정 버퍼[0.05％ Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정했다.
기질(R&D사제, ＃DY999)을 각 웰에 100μL의 비율로 첨가ㆍ혼합하고, 반응을 개시했다.
약 5분간 실온에서 방치하고, 스톱 용액(1N H2SO4수용액)을 각 웰에 50μL의 비율로 첨가하고, 반응을 정지했다. 반응 정지 후 30분 이내에 450㎚의 흡광도를 측정했다.
X처리군 및 Y처리군(메틸화 올리고뉴클레오티드(M1) 및 메틸화 올리고뉴클레오티드(M12A)를 이용한 경우)에 대해서는, 이하의 처리를 실시했다.
각 웰에 1차 항체 용액[메틸사이토신 항체: AVIVA사제, 1㎍／mL 0.1％ BSA함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]를 100μL의 비율로 첨가하고, 1시간 실온에서 방치했다. 그 후, 각 웰을 세정 버퍼[0.05％ Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정했다.
그 후, 2차 항체 용액[마우스 IgG항체FITC(염소 유래): MBL사제, 2㎍／mL 0.1％ BSA함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]을 각 웰에 100μL의 비율로 첨가 후, 1시간 실온에서 방치했다. 방치 후, 각 웰을 세정 버퍼[0.05％ Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정했다.
각 웰에 3차 항체 용액[Peroxidase-conjugated IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Fluorescein: Jackson ImmunoResearch Laboratories사제, 0.1㎍／mL 0.1％ BSA함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]를 100μL의 비율로 첨가하고, 1시간 실온에서 방치했다. 그 후, 각 웰을 세정 버퍼[0.05％ Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정했다.
기질(R&D사제, ＃DY999)을 각 웰에 100μL의 비율로 첨가ㆍ혼합하고, 반응을 개시했다.
약 5분간 실온에서 방치하고, 스톱 용액(1N H2SO4수용액)을 각 웰에 50μL의 비율로 첨가하고, 반응을 정지했다. 반응 정지 후 30분 이내에 450㎚의 흡광도를 측정했다.
데이터의 해석에는 이하의 방법을 이용했다. 네가티브 컨트롤액의 값이 전체의 군에서 일정한 값으로 되도록 모든 측정값을 각 군의 네가티브 컨트롤액의 측정값에서 나누고, 전군(全群)에서의 네가티브 컨트롤액의 최소값을 곱한다. 다음으로, 각 값으로부터 전군에서의 네가티브 컨트롤액의 최소값을 빼서 이것을 보정값으로서 이용한다.
[보정값]＝[측정값]×[최소값]／[각 군 네가티브 컨트롤액의 값]－[최소값]]
결과를 도 1에 나타냈다. 본 실시예에 있어서, 컨트롤 1처리군, 컨트롤 2처리군 및 X군에 있어서의 검출 감도는 대략 동등했다. 따라서, 메틸사이토신 항체가 결합 가능한 부분이 1군데(메틸화 사이토신이 1개)이면, 지금까지의 검출법에 있어서의 검출 감도와 별로 차이는 없는 것을 알았다. 메틸사이토신 항체가 결합 가능한 부분을 많이 갖는(12군데) 메틸화 올리고뉴클레오티드를 이용한 Y처리군에서는 컨트롤 1처리군, 컨트롤 2처리군 및 X군에 비하여 검출 감도가 높은 것이 명백하게 되었다. 즉, 메틸사이토신 항체가 결합 가능한 부분을 많이 갖는(메틸화 사이토신이 많이 존재하는) 올리고뉴클레오티드를 이용하면 검출 감도가 향상되는 것으로 나타났다.
실시예 2
피검 올리고뉴클레오티드로서, 배열 번호 1로 나타내어지는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 이하의 TE버퍼 용액을 조제했다.
용액 A: 피검 올리고뉴클레오티드 0pmol／10μL TE버퍼 용액(네가티브 컨트롤액)
용액 B: 피검 올리고뉴클레오티드 0.0001pmoL／10μL TE버퍼 용액
용액 C: 피검 올리고뉴클레오티드 0.001pmoL／10μL TE버퍼 용액
용액 D: 피검 올리고뉴클레오티드 0.01pmoL／10μL TE버퍼 용액
＜피검 올리고뉴클레오티드＞
5’―
AGTGACACCATCGAGAATGTCAGATCCGGATCAGAGCGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGACTACAACATCCAGA―3’ (배열 번호 1)
피검 올리고뉴클레오티드를 취득하기 위해 이용하는 특정 올리고뉴클레오티드로서, 배열 번호 2로 나타내어지는 염기 배열로 이루어지는 5’말단 비오틴화 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 0.1pmoL／5μL의 TE버퍼 용액을 조제했다.
＜5’말단 비오틴화 올리고뉴클레오티드＞
5’―Biotin―TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG―3’ (배열 번호 2)
피검 올리고뉴클레오티드를 검출하기 위한, 피검 올리고뉴클레오티드와 상보성에 의하여 결합하는 메틸화 올리고뉴클레오티드(제1 올리고뉴클레오티드, X처리군용)로서 배열 번호 5로 나타내어지는 염기 배열로 이루어지는 메틸사이토신 항체가 1군데 결합 가능한 메틸화 올리고뉴클레오티드(M1)를 합성하고, 0.1pmoL／5μL의 TE버퍼 용액을 조제했다.
＜메틸화 올리고뉴클레오티드(M1)＞ N은 메틸화 사이토신을 나타낸다.
5’―TGACATTCTCGATGGTGTCACTCACACACACACACACACACACANAGACAACGCCTCGTTCTCGG―3’(배열 번호 5)
피검 올리고뉴클레오티드를 검출하기 위한, 피검 올리고뉴클레오티드와 상보성에 의하여 결합하는 메틸화 올리고뉴클레오티드(제1 올리고뉴클레오티드, Y처리군용)로서, 배열 번호 6으로 나타내어지는 염기 배열로 이루어지는 메틸사이토신 항체가 12군데 결합 가능한 메틸화 올리고뉴클레오티드(M12A)를 합성하고, 0.1pmoL／5μL의 TE버퍼 용액을 조제했다.
＜메틸화 올리고뉴클레오티드(M12A)＞ N은 메틸화 사이토신을 나타낸다.
5’―TGACATTCTCGATGGTGTCACTNANANANANANANANANANANANAGACAACGCCTCGTTCTCGG―3’(배열 번호 6)
얻어진 피검 올리고뉴클레오티드, 특정 올리고뉴클레오티드 및 메틸화 올리고뉴클레오티드 용액에 대하여, 이하의 2가지의 처리(X처리군, Y처리군)를 실시했다.
＜X처리군＞
PCR튜브에 상기에서 조제한 피검 올리고뉴클레오티드 용액 10μL과, 상기의 특정 올리고뉴클레오티드 용액 5μL과, 상기의 메틸화 올리고뉴클레오티드(M1) 용액 5μL과, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL과, 100mM MgCl2용액 20μL을 첨가하고, 또한, 상기 혼합물에 멸균 초순수를 첨가하여 액량을 100μL로 하고, 혼합했다. 그 후, 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기 위해, 다시 동시에 피검 올리고뉴클레오티드와 메틸화 올리고뉴클레오티드(M1)의 2개 사슬을 형성시키기(즉, 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드와 메틸화 올리고뉴클레오티드(M1)의 복합체를 형성시키기) 위해, 본 PCR튜브를 95℃에서 10분간 가열하고, 70℃까지 신속히 냉각하며, 그 온도로 10분간 보온했다. 이어서, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 또한, 37℃에서 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌렸다.
＜Y처리군＞
PCR튜브에 상기에서 조제한 피검 올리고뉴클레오티드 용액 10μL과, 상기의 특정 올리고뉴클레오티드 용액 5μL과, 상기의 메틸화 올리고뉴클레오티드(M12A) 용액 5μL과, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL과, 100mM MgCl2용액 20μL을 첨가하고, 또한, 상기 혼합물에 멸균 초순수를 첨가하여 액량을 100μL로 하고, 혼합했다. 그 후, 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기 위해, 다시 동시에 피검 올리고뉴클레오티드와 메틸화 올리고뉴클레오티드(M12A)의 2개 사슬을 형성시키기(즉, 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드와 메틸화 올리고뉴클레오티드(M12A)의 복합체를 형성시키기) 위해, 본 PCR튜브를 95℃에서 10분간 가열하고, 70℃까지 신속히 냉각하며, 그 온도로 10분간 보온했다. 이어서, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 또한, 37℃에서 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌렸다.
얻어진 혼합물 전체를 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립으로 옮기고, 약 30분간 실온에서 방치하고, 8웰 스트립에 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드와 메틸화 올리고뉴클레오티드의 복합체를 비오틴―스트렙트아비딘 결합을 통하여 고정화했다. 그 후, 용액을 디캔테이션으로 제거하고, 각 웰을 세정 버퍼[0.05％ Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정했다.
각 웰에 1차 항체[메틸사이토신 항체: AVIVA사제, 1㎍／mL 0.1％ BSA함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]를 100μL의 비율로 첨가하고, 1시간 실온에서 방치했다. 그 후, 각 웰을 세정 버퍼[0.05％ Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정했다.
그 후, 2차 항체 용액[마우스 IgG항체Eu-N1: 0.25㎍／mL 0.1％ BSA함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]을 각 웰에 100μL의 비율로 첨가 후, 1시간 실온에서 방치했다. 방치 후, 각 웰을 세정 버퍼[0.05％ Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정했다.
Enhancement Solution을 각 웰에 200μL의 비율로 첨가, 혼합하고, 5분간 실온에서 플레이트 쉐이커를 이용하여 진탕했다. 그 후, 여기 340㎚／형광 612㎚로 형광을 측정했다.
데이터의 해석에는 이하의 방법을 이용했다. 네가티브 컨트롤액의 값이 전체의 군에서 일정한 값으로 되도록 모든 측정값을 각 군의 네가티브 컨트롤액의 측정값에서 나누고, 전군에서의 네가티브 컨트롤액의 최소값을 곱한다. 다음으로, 각 값으로부터 전군에서의 네가티브 컨트롤액의 최소값을 빼서 이것을 보정값으로서 이용한다.
[보정값]＝[측정값]×[최소값]／[각 군 네가티브 컨트롤액의 값]－[최소값]]
결과를 도 2에 나타냈다. 본 실시예에 있어서, 메틸사이토신 항체가 결합 가능한 부분을 많이 갖는(12군데) 메틸화 올리고뉴클레오티드를 이용한 Y군에서는 X군에 비해 검출 감도가 높은 것이 명백하게 되었다. 즉, 메틸사이토신 항체가 결합 가능한 부분을 많이 갖는(메틸화 사이토신이 많이 존재하는) 올리고뉴클레오티드를 이용하면 검출 감도가 향상되는 것으로 나타났다.
실시예 3
피검 올리고뉴클레오티드로서, 배열 번호 1로 나타내어지는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 이하의 TE버퍼 용액을 조제했다.
용액 A: 피검 올리고뉴클레오티드 0pmol／10μL TE버퍼 용액(네가티브 컨트롤액)
용액 B: 피검 올리고뉴클레오티드 0.003pmoL／10μL TE버퍼 용액
용액 C: 피검 올리고뉴클레오티드 0.01pmoL／10μL TE버퍼 용액
용액 D: 피검 올리고뉴클레오티드 0.03pmoL／10μL TE버퍼 용액
＜피검 올리고뉴클레오티드＞
5’―
AGTGACACCATCGAGAATGTCAGATCCGGATCAGAGCGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGACTACAACATCCAGA―3’ (배열 번호 1)
피검 올리고뉴클레오티드를 취득하기 위해 이용하는 특정 올리고뉴클레오티드로서, 배열 번호 2로 나타내어지는 염기 배열로 이루어지는 5’말단 비오틴화 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 0.1pmoL／5μL의 TE버퍼 용액을 조제했다.
＜5’말단 비오틴화 올리고뉴클레오티드＞
5’―Biotin―TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG―3’ (배열 번호 2)
피검 올리고뉴클레오티드를 검출하기 위한, 피검 올리고뉴클레오티드와 상보성에 의하여 결합하는 올리고뉴클레오티드로서 배열 번호 7로 나타내어지는 염기 배열로 이루어지는 메틸사이토신 항체가 3군데 결합 가능한 메틸화 올리고뉴클레오티드(제1 올리고뉴클레오티드)를 합성하고, 0.1pmoL／5μL의 TE버퍼 용액을 조제했다. 이 제1 올리고뉴클레오티드는 접착 염기 배열인 제1 접착 염기 배열을 3’말단에 갖는다.
＜제1 올리고뉴클레오티드＞ N은 메틸화 사이토신을 나타낸다.
5’―TGACATTCTCGATGGTGTCACTANACANACANATGCGCACCGTGCGCGAGC―3’(배열 번호 7)
피검 올리고뉴클레오티드를 검출하기 위한, 제1 접착 염기 배열과 상보적으로 결합할 수 있는 염기 배열로 이루어지는 상보 제1 접착 염기 배열을 갖는(제1 올리고뉴클레오티드와 상보성에 의하여 결합하는) 올리고뉴클레오티드로서, 배열 번호 8로 나타내어지는 염기 배열로 이루어지는 메틸화되어 있지 않은 올리고뉴클레오티드(제2 올리고뉴클레오티드)를 합성하고, 0.1pmoL／5μL의 TE버퍼 용액을 조제했다. 이 제2 올리고뉴클레오티드는 접착 염기 배열인 제2 접착 염기 배열을 5’말단에 갖는다.
＜제2 올리고뉴클레오티드＞
5’―ATAGTCTCGTGGTGCGCCGTACACACACACAGCTCGCGCACGGTGCGCA―3’(배열 번호 8)
피검 올리고뉴클레오티드를 검출하기 위한, 제2 접착 염기 배열과 상보적으로 결합할 수 있는 염기 배열로 이루어지는 상보 제2 접착 염기 배열을 갖는(제2 올리고뉴클레오티드와 상보성에 의하여 결합하는) 올리고뉴클레오티드로서 배열 번호 9로 나타내어지는 염기 배열로 이루어지는 메틸사이토신 항체가 3군데 결합 가능한 메틸화 올리고뉴클레오티드(제3 올리고뉴클레오티드)를 합성하고, 0.1pmoL／5μL의 TE버퍼 용액을 조제했다.
＜제3 올리고뉴클레오티드＞ N은 메틸화 사이토신을 나타낸다.
5’―ACGGCGCACCACGAGACTATANACANACANACAGACACAGACTGGCAAGTTGGA―3’(배열 번호 9)
얻어진 피검 올리고뉴클레오티드, 특정 올리고뉴클레오티드, 제1 올리고뉴클레오티드, 제2 올리고뉴클레오티드, 제3 올리고뉴클레오티드 용액을 이용하여 이하의 3가지의 처리(처리법 1, 2 및 3)를 실시했다.
처리법 1: PCR튜브에 상기에서 조제한 피검 올리고뉴클레오티드 용액 10μL과, 상기의 특정 올리고뉴클레오티드 용액 5μL과, 상기의 제1 올리고뉴클레오티드 용액 5μL과, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL과, 1㎎／mL BSA용액 10μL과, 100mM MgCl2용액 20μL을 첨가하고, 또한, 상기 혼합물에 멸균 초순수를 첨가하여 액량을 100μL로 하고, 혼합했다. 그 후, 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기 위해, 다시 동시에 피검 올리고뉴클레오티드와 제1 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기(즉, 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드와 제1 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성시키기) 위해, 본 PCR튜브를 95℃에서 10분간 가열하고, 70℃까지 신속히 냉각하며, 그 온도로 10분간 보온했다. 이어서, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 또한, 37℃에서 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌렸다.
처리법 2: PCR튜브에 상기에서 조제한 피검 올리고뉴클레오티드 용액 10μL과, 상기의 특정 올리고뉴클레오티드 용액 5μL과, 상기의 제1 올리고뉴클레오티드 용액 5μL과, 제2 올리고뉴클레오티드 용액 5μL과, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL과, 1㎎／mL BSA용액 10μL과, 100mM MgCl2용액 20μL을 첨가하고, 또한, 상기 혼합물에 멸균 초순수를 첨가하여 액량을 100μL로 하고, 혼합했다. 그 후, 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기 위해, 다시 동시에 피검 올리고뉴클레오티드와 제1 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기 위해, 또한 동시에 제1 올리고뉴클레오티드와 제2 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기(즉, 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드와 제1 올리고뉴클레오티드와 제2 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성시키기) 위해, 본 PCR튜브를 95℃에서 10분간 가열하고, 70℃까지 신속히 냉각하며, 그 온도로 10분간 보온했다. 이어서, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 또한, 37℃에서 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌렸다.
처리법 3: PCR튜브에 상기에서 조제한 피검 올리고뉴클레오티드 용액 10μL과, 상기의 특정 올리고뉴클레오티드 용액 5μL과, 상기의 제1 올리고뉴클레오티드 용액, 제2 올리고뉴클레오티드 용액, 제3 올리고뉴클레오티드 용액을 각각 5μL과, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL과, 1㎎／mL BSA용액 10μL과, 100mM MgCl2용액 20μL을 첨가하고, 또한, 상기 혼합물에 멸균 초순수를 첨가하여 액량을 100μL로 하고, 혼합했다. 그 후, 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기 위해, 다시 동시에 피검 올리고뉴클레오티드와 제1 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기 위해, 또한 동시에 제1 올리고뉴클레오티드와 제2 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기 위해, 또한 동시에 제2 올리고뉴클레오티드와 제3 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기(즉, 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드와 제1 올리고뉴클레오티드와 제2 올리고뉴클레오티드와 제3 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성시키기) 위해, 본 PCR튜브를 95℃에서 10분간 가열하고, 70℃까지 신속히 냉각하며, 그 온도로 10분간 보온했다. 이어서, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 또한, 37℃에서 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌렸다.
처리법 1, 2 및 3에서 얻어진 혼합물 전체를 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립으로 옮기고, 약 30분간 실온에서 방치하고, 8웰 스트립에 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드와 제1 올리고뉴클레오티드 및 또는 제2 올리고뉴클레오티드 및 또는 제3 올리고뉴클레오티드의 복합체를 고정화했다. 그 후, 용액을 디캔테이션으로 제거하고, 각 웰을 세정 버퍼[0.05％ Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정했다.
각 웰에 1차 항체 용액[메틸사이토신 항체: AVIVA사제, 1㎍／mL 0.1％ BSA함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]을 100μL의 비율로 첨가하고, 1시간 실온에서 방치했다. 그 후, 각 웰을 세정 버퍼[0.05％ Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정했다.
그 후, 2차 항체[마우스 IgG항체Eu-N1: 0.25㎍／mL 0.1％ BSA함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]를 각 웰에 100μL의 비율로 첨가 후, 1시간 실온에서 방치했다. 방치 후, 각 웰을 세정 버퍼[0.05％ Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정했다.
Enhancement Solution을 각 웰에 200μL의 비율로 첨가, 혼합하고, 5분간 실온에서 플레이트 쉐이커를 이용하여 진탕했다. 그 후, 여기 340㎚／형광 612㎚로 형광을 측정했다.
데이터의 해석에는 이하의 방법을 이용했다. 네가티브 컨트롤액의 값이 전체의 군에서 일정한 값으로 되도록 모든 측정값을 각 군의 네가티브 컨트롤액의 측정값에서 나누고, 전군에서의 네가티브 컨트롤액의 최소값을 곱한다. 다음으로, 각 값으로부터 전군에서의 네가티브 컨트롤액의 최소값을 빼서 이것을 보정값으로서 이용한다.
[보정값]＝[측정값]×[최소값]／[각 군 네가티브 컨트롤액의 값]－[최소값]]
결과를 도 3에 나타냈다. 피검 올리고뉴클레오티드를 검출하기 위해, 제1 올리고뉴클레오티드 만을 이용한 경우(처리법 1)와 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드를 이용한 경우(처리법 2)에서는 검출 감도에 차이는 인정되지 않았다. 이것은 제2 올리고뉴클레오티드로서 메틸화되어 있지 않은 올리고뉴클레오티드를 사용하고 있기 때문에, 즉, 메틸사이토신 항체가 결합 가능한 부분(메틸화 사이토신)은 동일수이기 때문에 검출 감도가 동등해진 것이라고 생각되었다. 피검 올리고뉴클레오티드를 검출하기 위해, 제1 올리고뉴클레오티드, 제2 올리고뉴클레오티드 및 제3 올리고뉴클레오티드를 이용한 경우(처리법 3)에서는 검출 감도가 향상되는 것이 명백하게 되었다. 이것은 피검 올리고뉴클레오티드에 제1 올리고뉴클레오티드, 제2 올리고뉴클레오티드 및 제3 올리고뉴클레오티드가 연결되었기 때문에 메틸사이토신 항체가 결합 가능한 부분(메틸화 사이토신)을 많이 갖게 되었기 때문이라고 생각되었다.
실시예 4
피검 올리고뉴클레오티드로서, 배열 번호 1로 나타내어지는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 이하의 TE버퍼 용액을 조제했다.
용액 A: 피검 올리고뉴클레오티드 0pmol／10μL TE버퍼 용액(네가티브 컨트롤액)
용액 B: 피검 올리고뉴클레오티드 0.003pmoL／10μL TE버퍼 용액
용액 C: 피검 올리고뉴클레오티드 0.01pmoL／10μL TE버퍼 용액
용액 D: 피검 올리고뉴클레오티드 0.03pmoL／10μL TE버퍼 용액
＜피검 올리고뉴클레오티드＞
5’―
AGTGACACCATCGAGAATGTCAGATCCGGATCAGAGCGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGACTACAACATCCAGA―3’ (배열 번호 1)
피검 올리고뉴클레오티드를 취득하기 위해 이용하는 특정 올리고뉴클레오티드로서, 배열 번호 2로 나타내어지는 염기 배열로 이루어지는 5’말단 비오틴화 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 0.1pmoL／5μL의 TE버퍼 용액을 조제했다.
＜5’말단 비오틴화 올리고뉴클레오티드＞
5’―Biotin―TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG―3’ (배열 번호 2)
피검 올리고뉴클레오티드를 검출하기 위한, 피검 올리고뉴클레오티드와 상보성에 의하여 결합하는 메틸화되어 있지 않은 올리고뉴클레오티드(제1 올리고뉴클레오티드)로서, 배열 번호 10으로 나타내어지는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드(제1 올리고뉴클레오티드)를 합성하고, 0.1pmoL／5μL의 TE버퍼 용액을 조제했다. 이 제1 올리고뉴클레오티드는 접착 염기 배열인 제(1, 1) 접착 염기 배열 및 제(1, 2) 접착 염기 배열을 갖는다.
＜제1 올리고뉴클레오티드＞
5’―TGACATTCTCGATGGTGTCACTCACACACACACACTCGCTTCGCGGGCAGTCAACACACACACACAGACAACGCCTCGTTCTCGG―3’(배열 번호 10)
피검 올리고뉴클레오티드를 검출하기 위한, 제(1, 1) 접착 염기 배열과 상보적으로 결합할 수 있는 염기 배열로 이루어지는 상보 제(1, 1) 접착 염기 배열을 갖는(제1 올리고뉴클레오티드와 상보성에 의하여 결합하는) 올리고뉴클레오티드(제2, 1) 올리고뉴클레오티드)로서, 배열 번호 11로 나타내어지는 염기 배열로 이루어지는 메틸사이토신 항체가 12군데 결합 가능한 메틸화 올리고뉴클레오티드(제(2, 1) 올리고뉴클레오티드)를 합성하고, 0.1pmoL／5μL의 TE버퍼 용액을 조제했다.
＜제(2, 1) 올리고뉴클레오티드＞ N은 메틸화 사이토신을 나타낸다.
5’―AGCCGACGAAGGGCTTATTAGNANANANANANANANANANANANACCGAGAACGAGGCGTTGTCT―3’(배열 번호 11)
피검 올리고뉴클레오티드를 검출하기 위한, 제(1, 2) 접착 염기 배열과 상보적으로 결합할 수 있는 염기 배열로 이루어지는 상보 제(1, 2) 접착 염기 배열을 갖는(제1 올리고뉴클레오티드와 상보성에 의하여 결합하는) 올리고뉴클레오티드(제(2, 2) 올리고뉴클레오티드)로서, 메틸화 올리고뉴클레오티드로서 배열 번호 16으로 나타내어지는 염기 배열로 이루어지는 메틸사이토신 항체가 12군데 결합 가능한 메틸화 올리고뉴클레오티드(제(2, 2) 올리고뉴클레오티드)를 합성하고, 0.1pmoL／5μL의 TE버퍼 용액을 조제했다.
＜제(2, 2) 올리고뉴클레오티드＞ N은 메틸화 사이토신을 나타낸다.
5’―GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGOANANANANANANANANANANANATTGACTGCCCGCGAAGCGAG―3’(배열 번호 16)
얻어진 피검 올리고뉴클레오티드, 특정 올리고뉴클레오티드, 제1 올리고뉴클레오티드, 제(2, 1) 올리고뉴클레오티드, 제(2, 2) 올리고뉴클레오티드 용액을 이용하여 이하의 3가지의 처리(처리법 1, 2 및 3)를 실시했다.
처리법 1: PCR튜브에 상기에서 조제한 피검 올리고뉴클레오티드 용액 10μL과, 상기의 특정 올리고뉴클레오티드 용액 5μL과, 상기의 제1 올리고뉴클레오티드 용액 5μL과, 상기의 제(2, 1) 올리고뉴클레오티드 용액 5μL과, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL과, 1㎎／mL BSA용액 10μL과, 100mM MgCl2용액 20μL을 첨가하고, 또한, 상기 혼합물에 멸균 초순수를 첨가하여 액량을 100μL로 하고, 혼합했다. 그 후, 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기 위해, 다시 동시에 피검 올리고뉴클레오티드와 제1 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기 위해, 다시 동시에 제1 올리고뉴클레오티드와 제(2, 1) 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기(즉, 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드와 제1 올리고뉴클레오티드와 제(2, 1) 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성시키기) 위해, 본 PCR튜브를 95℃에서 10분간 가열하고, 70℃까지 신속히 냉각하며, 그 온도로 10분간 보온했다. 이어서, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 또한, 37℃에서 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌렸다.
처리법 2: PCR튜브에 상기에서 조제한 피검 올리고뉴클레오티드 용액 10μL과, 상기의 특정 올리고뉴클레오티드 용액 5μL과, 상기의 제1 올리고뉴클레오티드 용액 5μL과, 상기의 제(2, 2) 올리고뉴클레오티드 용액 5μL과, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL과, 1㎎／mL BSA용액 10μL과, 100mM MgCl2용액 20μL을 첨가하고, 또한, 상기 혼합물에 멸균 초순수를 첨가하여 액량을 100μL로 하고, 혼합했다. 그 후, 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기 위해, 다시 동시에 피검 올리고뉴클레오티드와 제1 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기 위해, 또한 동시에 피검 올리고뉴클레오티드와 제(2, 2) 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기(즉, 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드와 제1 올리고뉴클레오티드와 제(2, 2) 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성시키기) 위해, 본 PCR튜브를 95℃에서 10분간 가열하고, 70℃까지 신속히 냉각하며, 그 온도로 10분간 보온했다. 이어서, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 또한, 37℃에서 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌렸다.
처리법 3: PCR튜브에 상기에서 조제한 피검 올리고뉴클레오티드 용액 10μL과, 상기의 특정 올리고뉴클레오티드 용액 5μL과, 상기의 제1 올리고뉴클레오티드 용액 5μL과, 상기의 제(2, 1) 올리고뉴클레오티드 용액 5μL과, 상기의 제(2, 2) 올리고뉴클레오티드 용액 5μL과, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL과, 1㎎／mL BSA용액 10μL과, 100mM MgCl2용액 20μL을 첨가하고, 또한, 상기 혼합물에 멸균 초순수를 첨가하여 액량을 100μL로 하고, 혼합했다. 그 후, 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기 위해, 다시 동시에 피검 올리고뉴클레오티드와 제1 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기 위해, 또한 동시에 제1 올리고뉴클레오티드와 제(2, 1) 올리고뉴클레오티드 및 제(2, 2) 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기(즉, 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드와 제1 올리고뉴클레오티드와 제(2, 1) 올리고뉴클레오티드 및 제(2, 2) 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성시키기) 위해, 본 PCR튜브를 95℃에서 10분간 가열하고, 70℃까지 신속히 냉각하며, 그 온도로 10분간 보온했다. 이어서, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 또한, 37℃에서 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌렸다.
얻어진 혼합물 전체를 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립으로 옮기고, 약 30분간 실온에서 방치하고, 8웰 스트립에 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드와 제1 올리고뉴클레오티드와 제(2, 1) 올리고뉴클레오티드 및 또는 제(2, 2) 올리고뉴클레오티드의 복합체를 고정화했다. 그 후, 용액을 디캔테이션으로 제거하고, 각 웰을 세정 버퍼[0.05％ Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정했다.
각 웰에 1차 항체[메틸사이토신 항체: AVIVA사제, 1㎍／mL 0.1％ BSA함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]를 100μL의 비율로 첨가하고, 1시간 실온에서 방치했다. 그 후, 각 웰을 세정 버퍼[0.05％ Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정했다.
그 후, 2차 항체[마우스 IgG항체Eu-N1: 0.25㎍／mL 0.1％ BSA함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]를 각 웰에 100μL의 비율로 첨가 후, 1시간 실온에서 방치했다. 방치 후, 각 웰을 세정 버퍼[0.05％ Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정했다.
Enhancement Solution을 각 웰에 200μL의 비율로 첨가, 혼합하고, 5분간 실온에서 플레이트 쉐이커를 이용하여 진탕했다. 그 후, 여기 340㎚／형광 612㎚로 형광을 측정했다.
데이터의 해석에는 이하의 방법을 이용했다. 네가티브 컨트롤액의 값이 전체의 군에서 일정한 값으로 되도록 모든 측정값을 각 군의 네가티브 컨트롤액의 측정값에서 나누고, 전군에서의 네가티브 컨트롤액의 최소값을 곱한다. 다음으로, 각 값으로부터 전군에서의 네가티브 컨트롤액의 최소값을 빼서 이것을 보정값으로서 이용한다.
[보정값]＝[측정값]×[최소값]／[각 군 네가티브 컨트롤액의 값]－[최소값]]
결과를 도 4에 나타냈다. 피검 올리고뉴클레오티드를 검출하기 위해, 제1 올리고뉴클레오티드 및 제(2, 1) 올리고뉴클레오티드를 이용한 경우(처리법 1)와 제1 올리고뉴클레오티드 및 제(2, 2) 올리고뉴클레오티드를 이용한 경우(처리법 2)에서는 검출 감도에 차이는 인정되지 않았다. 이것은 메틸사이토신 항체가 결합 가능한 부분(메틸사이토신)은 동일수이기 때문으로 생각되었다. 피검 올리고뉴클레오티드를 검출하기 위해, 제1 올리고뉴클레오티드, 제(2, 1) 올리고뉴클레오티드 및 제(2, 2) 올리고뉴클레오티드를 이용한 경우(처리법 3)에서는 검출 감도가 향상되는 것이 명백하게 되었다. 이것은 피검 올리고뉴클레오티드에 제1 올리고뉴클레오티드, 제(2, 1) 올리고뉴클레오티드, 제(2, 2) 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성함으로써 메틸사이토신 항체가 결합 가능한 부분(메틸화 사이토신)을 많이 갖게 된 것에 기인한다고 생각되었다.
실시예 5
피검 올리고뉴클레오티드로서, 배열 번호 1로 나타내어지는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 이하의 TE버퍼 용액을 조제했다.
용액 A: 피검 올리고뉴클레오티드 0pmol／10μL TE버퍼 용액(네가티브 컨트롤액)
용액 B: 피검 올리고뉴클레오티드 0.003pmoL／10μL TE버퍼 용액
용액 C: 피검 올리고뉴클레오티드 0.01pmoL／10μL TE버퍼 용액
용액 D: 피검 올리고뉴클레오티드 0.03pmoL／10μL TE버퍼 용액
＜피검 올리고뉴클레오티드＞
5’―
AGTGACACCATCGAGAATGTCAGATCCGGATCAGAGCGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGACTACAACATCCAGA―3’ (배열 번호 1)
피검 올리고뉴클레오티드를 취득하기 위해 이용하는 특정 올리고뉴클레오티드로서, 배열 번호 2로 나타내어지는 염기 배열로 이루어지는 5’말단 비오틴화 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 0.1pmoL／5μL의 TE버퍼 용액을 조제했다.
＜5’말단 비오틴화 올리고뉴클레오티드＞
5’―Biotin―TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG―3’ (배열 번호 2)
피검 올리고뉴클레오티드를 검출하기 위한, 피검 올리고뉴클레오티드와 상보성에 의하여 결합하는 올리고뉴클레오티드(제1 올리고뉴클레오티드)로서, 배열 번호 17로 나타내어지는 염기 배열로 이루어지는 메틸사이토신 항체가 3군데 결합 가능한 메틸화 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 0.1pmoL／5μL의 TE버퍼 용액을 조제했다. 이 제1 올리고뉴클레오티드는 접착 염기 배열인 제1 접착 염기 배열을 갖는다.
＜제1 올리고뉴클레오티드＞ N은 메틸화 사이토신을 나타낸다.
5’―TGACATTCTCGATGGTGTCACTCACACACACACACTCGCTTCGCGGGCAGTCAACANACANACANAGACAACGCCTCGTTCTCGG―3’(배열 번호 17)
피검 올리고뉴클레오티드를 검출하기 위한, 제1 접착 염기 배열과 상보적으로 결합할 수 있는 염기 배열로 이루어지는 상보 제1 접착 염기 배열을 갖는(제1 올리고뉴클레오티드와 상보성에 의하여 결합하는) 올리고뉴클레오티드(제2 올리고뉴클레오티드)로서, 배열 번호 16으로 나타내어지는 염기 배열로 이루어지는 메틸사이토신 항체가 12군데 결합 가능한 메틸화 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 0.1pmoL／5μL의 TE버퍼 용액을 조제했다.
＜제2 올리고뉴클레오티드＞ N은 메틸화 사이토신을 나타낸다.
5’―GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGOANANANANANANANANANANANATTGACTGCCCGCGAAGCGAG―3’(배열 번호 16)
얻어진 피검 올리고뉴클레오티드, 특정 올리고뉴클레오티드, 제1 올리고뉴클레오티드, 제2 올리고뉴클레오티드 용액을 이용하여 이하의 2가지의 처리(처리법 1 및 2)를 실시했다.
처리법 1: PCR튜브에 상기에서 조제한 피검 올리고뉴클레오티드 용액 10μL과, 상기의 특정 올리고뉴클레오티드 용액 5μL과, 상기의 제1 올리고뉴클레오티드 용액 5μL과, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL과, 1㎎／mL BSA용액 10μL과, 100mM MgCl2용액 20μL을 첨가하고, 또한, 상기 혼합물에 멸균 초순수를 첨가하여 액량을 100μL로 하고, 혼합했다. 그 후, 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기 위해, 다시 동시에 피검 올리고뉴클레오티드와 제1 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기(즉, 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드와 제1 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성시키기) 위해, 본 PCR튜브를 95℃에서 10분간 가열하고, 70℃까지 신속히 냉각하며, 그 온도로 10분간 보온했다. 이어서, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 또한, 37℃에서 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌렸다.
처리법 2: PCR튜브에 상기에서 조제한 피검 올리고뉴클레오티드 용액 10μL과, 상기의 특정 올리고뉴클레오티드 용액 5μL과, 상기의 제1 올리고뉴클레오티드 용액 5μL과, 상기의 제2 올리고뉴클레오티드 용액 5μL과, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL과, 1㎎／mL BSA용액 10μL과, 100mM MgCl2용액 20μL을 첨가하고, 또한, 상기 혼합물에 멸균 초순수를 첨가하여 액량을 100μL로 하고, 혼합했다. 그 후, 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기 위해, 다시 동시에 피검 올리고뉴클레오티드와 제1 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기 위해, 또한 동시에 제1 올리고뉴클레오티드와 제2 올리고뉴클레오티드의 2개 사슬을 형성시키기(즉, 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드와 제1 올리고뉴클레오티드와 제2 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성시키기) 위해, 본 PCR튜브를 95℃에서 10분간 가열하고, 70℃까지 신속히 냉각하며, 그 온도로 10분간 보온했다. 이어서, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 또한, 37℃에서 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌렸다.
얻어진 혼합물 전체를 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립으로 옮기고, 약 30분간 실온에서 방치하고, 8웰 스트립에 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드 및 제1 올리고뉴클레오티드, 또는 피검 올리고뉴클레오티드와 특정 올리고뉴클레오티드와 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드의 복합체를 고정화했다. 그 후, 용액을 디캔테이션으로 제거하고, 각 웰을 세정 버퍼[0.05％ Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정했다.
각 웰에 1차 항체 용액[메틸사이토신 항체: AVIVA사제, 1㎍／mL 0.1％ BSA함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]을 100μL의 비율로 첨가하고, 1시간 실온에서 방치했다. 그 후, 각 웰을 세정 버퍼[0.05％ Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정했다.
그 후, 2차 항체 용액[마우스 IgG항체FITC(염소 유래): MBL사제, 2㎍／mL 0.1％ BSA함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]을 각 웰에 100μL의 비율로 첨가 후, 1시간 실온에서 방치했다. 방치 후, 각 웰을 세정 버퍼[0.05％ Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정했다.
각 웰에 3차 항체 용액[Peroxidase-conjugated IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Fluorescein: Jackson ImmunoResearch Laboratories사제, 0.1㎍／mL 0.1％ BSA함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]을 100μL의 비율로 첨가하고, 1시간 실온에서 방치했다. 그 후, 각 웰을 세정 버퍼[0.05％ Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정했다.
기질(R&D사제, ＃DY999)을 각 웰에 100μL의 비율로 첨가ㆍ혼합하고, 반응을 개시했다.
약 5분간 실온에서 방치하고, 스톱 용액(1N H2SO4수용액)을 각 웰에 50μL의 비율로 첨가하고, 반응을 정지했다. 반응 정지 후 30분 이내에 450㎚의 흡광도를 측정했다.
데이터의 해석에는 이하의 방법을 이용했다. 네가티브 컨트롤액의 값이 전체의 군에서 일정한 값으로 되도록 모든 측정값을 각 군의 네가티브 컨트롤액의 측정값에서 나누고, 전군에서의 네가티브 컨트롤액의 최소값을 곱한다. 다음으로, 각 값으로부터 전군에서의 네가티브 컨트롤액의 최소값을 빼서 이것을 보정값으로서 이용한다.
[보정값]＝[측정값]×[최소값]／[각 군 네가티브 컨트롤액의 값]－[최소값]]
결과를 도 5에 나타냈다. 피검 올리고뉴클레오티드를 검출하기 위해, 제1 올리고뉴클레오티드 만을 이용한 경우(처리법 1)와 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드를 이용한 경우(처리법 2)에서는 처리법 2에 있어서 검출 감도가 향상되는 것이 명백하게 되었다. 이것은 피검 올리고뉴클레오티드에 제1 올리고뉴클레오티드와 제2 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성함으로써 메틸사이토신 항체가 결합 가능한 부분(메틸화 사이토신)을 많이 갖는 것에 기인한다고 생각되었다.
본 발명에 의해 검체 중에 포함되는 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA를 간편하게 고감도로 정량 또는 검출하는 방법 등을 제공하는 것이 가능하게 된다.
배열표 프리 텍스트
배열 번호 1
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 2
고정화를 위해 설계된 비오틴화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 3
설계된 FITC표지 올리고뉴클레오티드
배열 번호 4
설계된 FLC표지 올리고뉴클레오티드
배열 번호 5
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 6
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 7
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 8
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 9
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 10
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 11
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 16
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 17
설계된 올리고뉴클레오티드
SEQUENCE LISTING <110> Sumitomo Chemical Co., Ltd. <120> Method for determining or detecting DNA <130> S21224WO01 <150> JP2008-210467 <151> 2008-08-19 <160> 17 <210> 1 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 1 agtgacacca tcgagaatgt cagatccgga tcagagcgcc atctagatgg acatgtcact 60 gtctgactac aacatccaga 80 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed biotinated oligonucleotide for fixation <400> 2 tctggatgtt gtagtcagac ag 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed FITC labeled oligonucleotide <400> 3 tgacattctc gatggtgtca ct 22 <210> 4 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed FLC labeled oligonucleotide <400> 4 tgacattctc gatggtgtca ctcacacaca cacacacaca cacacagaca acgcctcgtt 60 ctcgg 65 <210> 5 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> 45 <223> n=m5c <400> 5 tgacattctc gatggtgtca ctcacacaca cacacacaca cacanagaca acgcctcgtt 60 ctcgg 65 <210> 6 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> 23,25,27,29,31,33,35,37,39,41,43,45 <223> n=m5c <400> 6 tgacattctc gatggtgtca ctnananana nanananana nananagaca acgcctcgtt 60 ctcgg 65 <210> 7 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> 24,28,32 <223> n=m5c <400> 7 tgacattctc gatggtgtca ctanacanac anatgcgcac cgtgcgcgag c 51 <210> 8 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 8 atagtctcgt ggtgcgccgt acacacacac agctcgcgca cggtgcgca 49 <210> 9 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> 22,26,30 <223> n=m5c <400> 9 acggcgcacc acgagactat anacanacan acagacacag actggcaagt tgga 54 <210> 10 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 10 tgacattctc gatggtgtca ctcacacaca cacactcgct tcgcgggcag tcaacacaca 60 cacacagaca acgcctcgtt ctcgg 85 <210> 11 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> 22,24,26,28,30,32,34,36,38,40,42,44 <223> n=m5c <400> 11 agccgacgaa gggcttatta gnanananan ananananan ananaccgag aacgaggcgt 60 tgtct 65 <210> 12 <211> 271 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Genbank Accession No.M80340 115-386 <400> 12 tagggagtgc cagacagtgg gcgcaggcca gtgtgtgtgc gcaccgtgcg cgagccgaag 60 cagggcgagg cattgcctca cctgggaagc gcaaggggtc agggagttcc ctttctgagt 120 caaagaaagg ggtgacggtc gcacctggaa aatcgggtca ctcccacccg aatattgcgc 180 ttttcagacc ggcttaagaa acggcgcacc acgagactat atcccacacc tggctcggag 240 ggtcctacgc ccacggaatc tcgctgattg c 271 <210> 13 <211> 332 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 tagaatatcc aatacagaga agtgcttaaa ggagctgatg gagctgaaaa ccaaggctcg 60 agaactacgt gaagaatgca gaagcctcag gagccgatgc gatcaactgg aagaaagggt 120 atcagcaatg gaagatgaaa tgaatgaaat gaagcgagaa gggaagttta gagaaaaaag 180 aataaaaaga aatgagcaaa gcctccaaga aatatgggac tatgtgaaaa gaccaaatct 240 acgtctgatt ggtgtacctg aaagtgatgt ggagaatgga accaagttgg aaaacactct 300 gcaggatatt atccaggaga acttccccaa tc 332 <210> 14 <211> 267 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 tagaactcag gattaagaat ctcactcaaa gccgctcaac tacatggaaa ctgaacaacc 60 tgctcctgaa tgactactgg gtacataacg aaatgaaggc agaaataaag atgttctttg 120 aaaccaacga gaacaaagac accacatacc agaatctctg ggacgcattc aaagcagtgt 180 gtagagggaa atttatagca ctaaatgcct acaagagaaa gcaggaaaga tccaaaattg 240 acaccctaac atcacaatta aaagaac 267 <210> 15 <211> 85 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Genbank Accession No.AF458110 178-262 <400> 15 cgggcgcggt ggctcacgcc tgtaatccca gcactttggg aggccgaggt gggcggatca 60 cgaggtcagg agatcgagac catcc 85 <210> 16 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> 24,26,28,30,32,34,36,38,40,42,44 <223> n=m5c <400> 16 gttggccact gcggagtcgc goanananan ananananan ananattgac tgcccgcgaa 60 gcgag 65 <210> 17 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> 57,61,65 <223> n=m5c <400> 17 tgacattctc gatggtgtca ctcacacaca cacactcgct tcgcgggcag tcaacanaca 60 nacanagaca acgcctcgtt ctcgg 85

Claims (14)

  1. 검체 중에 포함되는 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA를 정량 또는 검출하는 방법으로서,
    (1) 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA인 피검 올리고뉴클레오티드를 함유하는 검체를 조제하는 제1 공정,
    (2) 제1 공정에서 조제된 검체에 함유되는 피검 올리고뉴클레오티드와, 상기 피검 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합하고, 또한, 복수의 식별 기능을 갖는 검출 올리고뉴클레오티드를 혼합시켜서 상기 피검 올리고뉴클레오티드와 상기 검출 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 검출 복합체를 형성시키고, 상기 검출 복합체를 지지체에 고정화시키는 제2 공정 및,
    (3) 제2 공정에서 형성한 검출 복합체에 포함되는 검출 올리고뉴클레오티드를 그 식별 기능에 의해 검출함으로써 상기 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA를 정량 또는 검출하는 제3 공정
    을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    복수의 식별 기능을 갖는 검출 올리고뉴클레오티드가, 복수의 올리고뉴클레오티드가 상보적으로 결합하여 이루어지는 복합 검출 올리고뉴클레오티드 또는 복수의 메틸화 부위를 갖는 메틸화 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 복합 검출 올리고뉴클레오티드인 방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    복합 검출 올리고뉴클레오티드가 메틸화 DNA를 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 방법.
  4. 청구항 2 또는 청구항 3에 있어서,
    복합 검출 올리고뉴클레오티드의 식별 기능이, 결합된 메틸화 DNA항체의 식별 기능인 방법.
  5. 청구항 3 또는 청구항 4에 있어서,
    메틸화 DNA가 5―메틸사이토신인 방법.
  6. 청구항 4 또는 청구항 5에 있어서,
    메틸화 DNA항체가 메틸사이토신 항체인 방법.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    검체가 하기 중 어느 하나의 생물 유래 검체인 방법.
    (a) 포유 동물 유래의 혈액, 체액, 분뇨, 체분비물, 세포 용해액 또는 조직 용해액,
    (b) 포유 동물 유래의 혈액, 체액, 분뇨, 체분비물, 세포 용해액 및 조직 용해액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나로부터 추출된 DNA,
    (c) 포유 동물 유래의 조직, 세포, 조직 용해액 및 세포 용해액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나로부터 추출된 RNA를 주형으로 하여 제작된 DNA,
    (d) 세균, 진균 또는 바이러스로부터 추출된 DNA, 또는,
    (e) 세균, 진균 또는 바이러스로부터 추출된 RNA를 주형으로 하여 제작된 DNA.
  8. 청구항 2 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 이용하는 복합 검출 올리고뉴클레오티드를 이용한 검체의 표지 방법.
  9. 청구항 2 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 이용하는 복합 검출 올리고뉴클레오티드와 상기 복합 검출 올리고뉴클레오티드를 표지할 수 있는 시약을 이용한 검체의 표지 방법.
  10. 청구항 8 또는 청구항 9에 있어서,
    표지 대상이 DNA 또는 단백질인 방법.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 공정에 있어서, 검출 복합체와 지지체를, 피검 올리고뉴클레오티드와 검출 올리고뉴클레오티드의 결합을 저해하지 않고 또한, 상기 피검 올리고뉴클레오티드에 상보적으로 결합할 수 있는 특정 올리고뉴클레오티드를 통하여 결합시키는 방법.
  12. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA가 하기 중 어느 하나의 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA인 방법.
    (a) 목적으로 하는 DNA영역을 인식 절단 부위로 하지 않는 제한 효소로 미리 소화 처리되어 이루어지는 DNA,
    (b) 미리 정제되어 이루어지는 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA,
    (c) 혈액 중의 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 유리 DNA,
    (d) 미생물 게놈 유래의 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA, 또는,
    (e) RNA로부터 역전사 효소에 의하여 생성된 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA.
  13. 검체 중에 포함되는 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA를 정량 또는 검출하는 방법으로서,
    (1) 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA인 피검 올리고뉴클레오티드를 함유하는 검체를 조제하는 제1 공정,
    (2) 제1 공정에서 조제된 검체에 함유되는 피검 올리고뉴클레오티드와, 상기 피검 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합하고, 또한, 메틸화 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 검출 올리고뉴클레오티드를 혼합시켜서 상기 피검 올리고뉴클레오티드와 상기 검출 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 검출 복합체를 형성시키고, 상기 검출 복합체를 지지체에 고정화시키는 제2 공정 및,
    (3) 제2 공정에서 형성한 검출 복합체에 포함되는 검출 올리고뉴클레오티드를 그 식별 기능에 의해 검출함으로써 상기 목적으로 하는 DNA영역을 갖는 DNA를 정량 또는 검출하는 제3 공정
    을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    식별 기능이 메틸화 DNA항체, 메틸사이토신 항체를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9939442B2 (en) * 2011-09-08 2018-04-10 The Regents Of The University Of California Salivary biomarkers for gastric cancer detection
KR101922125B1 (ko) 2012-11-29 2018-11-26 삼성전자주식회사 표적 핵산을 표지하는 방법
JP6095058B2 (ja) 2013-03-14 2017-03-15 国立研究開発法人産業技術総合研究所 メチルシトシン検出法
CN112301024A (zh) 2013-03-15 2021-02-02 通用医疗公司 使用RNA引导的FokI核酸酶(RFN)提高RNA引导的基因组编辑的特异性
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
WO2014204578A1 (en) 2013-06-21 2014-12-24 The General Hospital Corporation Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing
DK3066201T3 (en) 2013-11-07 2018-06-06 Editas Medicine Inc CRISPR-RELATED PROCEDURES AND COMPOSITIONS WITH LEADING GRADES
JP6599630B2 (ja) * 2015-04-03 2019-10-30 住友化学株式会社 微生物製剤の製造方法及び微生物製剤
US9926546B2 (en) 2015-08-28 2018-03-27 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
US9512446B1 (en) 2015-08-28 2016-12-06 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
CN109136335B (zh) * 2018-09-06 2023-07-25 中国人民解放军陆军军医大学 一种dna甲基化特异位点的电化学分析方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4882269A (en) * 1985-12-13 1989-11-21 Princeton University Amplified hybridization assay
US6051373A (en) * 1994-12-07 2000-04-18 Scriptgen Pharmaceuticals, Inc. Methods for screening for inhibitors of the transcription-enhancing activity of the X protein of hepatitis B virus
DE69719057T2 (de) * 1996-07-12 2003-12-04 Tm Technologies Inc Verfahren zur signalverstärkung
AUPR142500A0 (en) * 2000-11-13 2000-12-07 Human Genetic Signatures Pty Ltd A peptide nucleic acid-based assay for the detection of specific nucleic acid sequences
WO2007064301A1 (en) * 2005-11-30 2007-06-07 Agency For Science, Technology And Research Nanoparticle and methods therefor

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