WO2009119891A1 - Ｄｎａメチル化測定方法 - Google Patents

Ｄｎａメチル化測定方法 Download PDF

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WO2009119891A1
WO2009119891A1 PCT/JP2009/056785 JP2009056785W WO2009119891A1 WO 2009119891 A1 WO2009119891 A1 WO 2009119891A1 JP 2009056785 W JP2009056785 W JP 2009056785W WO 2009119891 A1 WO2009119891 A1 WO 2009119891A1
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dna
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methylated
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冨ヶ原祥隆
佐藤日出夫
樽井弘和
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住友化学株式会社
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    • G01N2440/12—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material alkylation, e.g. methylation, (iso-)prenylation, farnesylation

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring the content of methylated DNA in a target DNA region in genomic DNA contained in a biological specimen.
  • the content of methylated DNA in the target DNA region in the genomic DNA See, for example, Nucleic Acids Res. 1994 Aug 11; 22 (15): 2990-7, and Proc Natl Acad Sci US A. 1 997 Mar 18; 94 (6): 2284-9) .
  • this measurement method first, it is necessary to extract DNA containing the target DNA region from a DNA sample derived from genomic DNA, and the extraction operation is complicated.
  • a method for measuring the content of methylated DNA in the target region of the extracted DNA for example, (1) DNA modification using sulfite, etc., followed by DNA synthesis by DNA polymerase (2) A method of amplifying the target region by subjecting it to a chain reaction (hereinafter also referred to as PCR). (2) Digesting the DNA with a methylation-sensitive restriction enzyme, followed by PCR. A method for amplifying a target region by providing the information is known. Both of these methods require labor for modification of DNA for detection of methinorelation and subsequent purification of the product, preparation of a reaction system for PCR, confirmation of DNA amplification, and the like. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a method for easily measuring the content of methylated DNA in the target DNA region in the genomic DNA contained in a biological sample.
  • the following inventions are provided. [Invention 1]
  • a method for measuring the content of methylated DNA in a target DNA region in genomic DNA contained in a biological specimen A method for measuring the content of methylated DNA in a target DNA region in genomic DNA contained in a biological specimen
  • first pre-process The process of making single-stranded DNA (primary strand) (first pre-process) and 'genome-derived DNA (positive strand) that was made single-stranded in the first pre-process, A partial base sequence (positive strand) of the base sequence of the DNA (positive strand) in the state, and 3 'end further than the 3, end of the base sequence (positive strand) of the target DNA region Extension primer (forward primer) having a partial base sequence (positive strand) located on the side and a base sequence (negative strand) that is complementary to And extending the extension primer once to extend a single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region into a double-stranded DNA (second pre-step),
  • the double-stranded DNA formed by extension in the second previous step contains a single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region and a base sequence that is complementary to the target DNA region. It has a process (third pre-process) that separates into single-stranded DNA (negative chain) once.
  • Step A in which single-stranded DNA containing the DNA region
  • a single-stranded DNA (negative strand) containing a base sequence that is complementary to the generated target DNA region in a saddle shape, and a base that is complementary to the target DNA region A partial base sequence (negative strand) of the base sequence of the single-stranded DNA (negative strand) containing the sequence, and complementary to the base sequence (positive strand) of the target DNA region base
  • step B this step in which the extension primer is extended once, thereby extending the single-stranded DNA containing the target DNA region as a double-stranded DNA.
  • each step of the third step is repeated once after separating the elongated double-stranded DNA obtained in each step into a single-stranded state, and thereby to the target DNA region.
  • a third step of amplifying the methylated DNA to a detectable amount and quantifying the amount of amplified DNA is repeated once after separating the elongated double-stranded DNA obtained in each step into a single-stranded state, and thereby to the target DNA region.
  • a third step of amplifying the methylated DNA to a detectable amount and quantifying the amount of amplified DNA.
  • a DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological sample is a DNA sample that has been previously digested with a restriction enzyme that does not use the target DNA region of the genomic DNA as a recognition cleavage site, or has been purified in advance.
  • the first step is
  • the first (B) step of digesting the single-stranded DNA selected in the first (A) step with a methylation sensitive restriction enzyme and the invention according to any one of inventions 1 to 4, comprising Method.
  • invention 6 The method according to any one of Inventions 1 to 5, wherein the methylation-sensitive restriction enzyme is a restriction enzyme having a recognition cleavage site in a target DNA region of genomic DNA contained in a biological specimen, or Hhal. .
  • the second step is
  • the second (A) step comprises the second (B) step of binding the methylated single-stranded DNA obtained in step (A) and the immobilized methyl ⁇ DN A antibody.
  • FIG. 1 shows that in Example 1, methylated DNA in the region consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 23 was amplified from the prepared sample by PCR, and the obtained amplification product was subjected to 2% agarose gel electrophoresis. It is the figure which showed the result.
  • DNA marker “MK:” partially methylated oligonucleotide methylated with recognition sequence of Hpa II GPR 7— 2079-21 76 / 98me r M (7)
  • Sampnole treated with “A” solution “HJ” unmethylated oligonucleotide GPR 7—2079—21 76 / 98me ri
  • FIG. 2 shows the amplification of the methylated DNA in the target DNA region consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 28 from the sample prepared in Example 2 by PCR.
  • FIG. 5 shows the results of 5% agarose gel electrophoresis. From leftmost lane in the figure, DNA marker “MK”, methylated DNA fragment MX solution “MD” (negative control), unmethylated DNA fragment X solution “D” (Negative control), methylated DNA fragment MX solution “MC”, unmethylated DNA fragment X solution “C”, methylated DNA fragment MX solution “MB”, methylated The results are shown in solution “B” for DNA fragment X, “MA” for methylated DNA fragment MX, solution “A” for unmethylated DNA fragment X, “B”.
  • Figure 3 shows the amplification product obtained in Example 3 by amplifying methylated DNA in the target DNA region consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 45 from the prepared sample by PCR.
  • FIG. 6 is a view showing the results of 5% agarose gel electrophoresis.
  • FIG. 4 shows the amplification of the methylated DNA in the target DNA region consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 53 from the sample prepared in Example 4 by PCR.
  • FIG. 5 shows the results of 5% agarose gel electrophoresis.
  • FIG. 5 shows the amplification product obtained by amplifying the methylated DNA in the target DNA region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 53 in Example 5 by PCR from the prepared sample, and 1.
  • DNA marker “MK:” methylated yeast genomic DNA solution “MD” (negative control), unmethylated yeast genomic DNA solution “D” (negative control)
  • Methylated yeast genomic DNA solution “MC” Unmethylated yeast genomic DNA solution “C”
  • Methylated yeast genomic DNA solution “MB” Unmethylated yeast genomic DNA solution “MC” B
  • solution of methylated yeast genomic DNA” MA solution of unmethylated yeast genomic DNA “A” shows the results for and.
  • tissue has a broad meaning including blood, lymph nodes, etc.
  • biological samples such as plasma, serum, and lymph fluid, body secretions (such as urine and milk), and genomic DNA obtained by extraction from these biological samples.
  • biological specimen include samples derived from microorganisms, viruses, etc.
  • genomic DNAJ in the present invention means the genomic DNA of microorganisms and viruses.
  • DNA may be extracted using a commercially available DNA extraction kit.
  • plasma or serum is prepared from blood according to a conventional method, and the prepared plasma or serum is used as a specimen, and free DNA contained therein (cancer cells such as gastric cancer cells).
  • cancer cells such as gastric cancer cells.
  • the genomic DNA-derived DNA sample may be a DNA sample that has been previously digested with a restriction enzyme that does not use the target DNA region of the genomic DNA, which will be described later, as a recognition cleavage site, or a predetermined method. It can be a DNA sample that has been purified in advance. Normally, there are four types of bases that make up a gene (genomic DNA). Of these bases, it is known that only cytosine is methylated, and such DNA methylation modification is based on the nucleotide sequence represented by 5 '— CG—3, where C represents cytosine. , G stands for Gwan, and the base sequence is sometimes referred to as “CpG.” This is limited to cytosines.
  • cytosine The site that is methylated in cytosine is at position 5.
  • “methylated DN Aj and Means DNA produced by such methylation modification “methylated DN Aj and Means DNA produced by such methylation modification.
  • the “C p G pair” in the present invention means a double-stranded oligonucleotide formed by base pairing of a base sequence represented by C p G and a complementary C p G.
  • the “target DNA region” in the present invention (hereinafter sometimes referred to as a target region) is a DNA region to be examined for the presence or absence of methylation of cytosine contained in the region, and is at least one kind of DNA region. Has a recognition site for a methylation sensitive restriction enzyme. For example, Lysy 1 oxidase, HRAS-like suppressor bA305P22. 2.
  • the base sequence shown by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region)
  • the base sequence containing one or more include the base sequence of genomic DNA containing exon 1 of the human Lysyl oxidase gene and the promoter region located 5 'upstream thereof.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AF270645) This corresponds to the base sequence represented by base numbers 16001 to 18661. ).
  • the ATG codon that encodes the amino terminal methionine of Lysyl oxidase protein derived from human is represented by nucleotide numbers 2031 to 2033.
  • the nucleotide sequence of the above exon 1 is represented by nucleotide number 1957-2661.
  • the cytosine in G exhibits a high methylation frequency (ie, hypermethylation) in cancer cells such as gastric cancer cells.
  • cytosine with high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, base numbers 1539, 1560, 1574, 1600, 1623, 1635, 1644, 1654, 1661, Examples include cytosine represented by 1682, 1686, 1696, 1717, 1767, 1774, 1783, 1785, 1787, 1795, and the like.
  • the useful protein gene is HRAS-like suppressor gene, it is represented by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • the base sequence of genomic DNA containing exon 1 of the HRAS-like suppressor gene derived from human and a promoter region located 5 ′ upstream thereof can be mentioned, More specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (corresponding to the base sequence represented by base numbers 172001 to 173953 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC068162) can be mentioned. In the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, the base sequence of exon 1 of the human-derived HRAS-like suppress or gene is represented by base numbers 1743-1953.
  • cytosine having high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, base numbers 1316, 1341, 1357, 1359, 1362, 1374, 1390, 1399, 1405, 1409 , 1414, 1416, 1422, 1428, 1434, 1449, 1451, 1454, 1463, 1469, 1477, 1479, 14 83, 1488, 1492, 1494, 1496, 1498, 1504, 1510, 1513, 1518, 1520, etc. Can be given.
  • the useful protein gene when the useful protein gene is bA305P22.2.1 gene, it is indicated by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • Examples of nucleotide sequences that include one or more nucleotide sequences include those of genomic DNA containing human exon 1 of bA 3 05P22.2. 1 gene and the 5 'upstream promoter region. More specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 (corresponding to the base sequence represented by base numbers 13001 to 13889 of the base sequence described in Genbank Accession No. AL121673) can be mentioned.
  • the ATG codon encoding the methionine at the amino amino terminal of the human-derived bA305P22.2.1 protein is shown in base numbers 849 to 851, and the base sequence of exon 1 above is shown. Is shown in base numbers 663-889.
  • the cytosine in G shows a high methylation frequency (ie, hypermethylation) in cancer cells such as gastric cancer cells.
  • cytosine having a high frequency of metinorelation in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, base numbers 329, 335, 337, 351, 363, 373, 405, 424, 427 , 446, 465, 472, 486, and the like.
  • the useful protein gene is a Gamma filamin gene, it is represented by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • a base sequence containing one or more base sequences a genomic DNA base sequence containing exon 1 of a human-derived Gamma filamin gene and a promoter region located 5 ′ upstream thereof can be mentioned.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 (base described in Genbank Accession No. AC074373) It corresponds to a complementary sequence of the base sequence represented by base numbers 63528 to 64390 of the sequence. ).
  • the ATG codon encoding the amino terminal methionine of the Gamma filamin protein derived from human is shown in base numbers 572 to 574.
  • the base sequence of exon 1 is Base numbers 463 to 863.
  • cytosine having a high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, base numbers 329, 333, 337, 350, 353, 360, 363, 370, 379.
  • Examples include cytosine represented by 382, 384, 409, 414, 419, 426, 432, 434, 445, 449, 459, 472, 474, 486, 490, 503, 505, and the like.
  • the useful protein gene is HA D1 gene
  • the base sequence represented by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • a base sequence S of genomic DNA containing exon 1 of the HAND1 gene derived from human and its promoter region located upstream of it can be mentioned. Includes a base sequence represented by ⁇ & column number 5 (corresponding to a complementary sequence of the base sequence represented by base numbers 243 03 to 26500 of the base sequence described in Genbank Accession No. 'AC026688). .
  • the ATG codon encoding the amino acid at the amino terminal of the HAND1 protein derived from human is represented by nucleotide numbers 1656 to 1658.
  • the nucleotide sequence of exon 1 is The number 1400-2198 is shown.
  • the cytosine in G shows a high methylation frequency (ie, hypermethylation) in cancer cells such as gastric cancer cells. More specifically, as cytosine having a high methylation frequency in gastric cancer cells, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, No. 1153, 1160, 1178, 1187, 1193, 1218, 1232, 1266, 1272, 1292, 1305, 1307, 13 16, 1356, 1377, 1399, 1401, 1422, 1434, etc. .
  • the useful protein gene is the Homologue of RIKEN 2210016F16 gene
  • the base sequence containing one or more base sequences indicated by G includes the base sequence of genomic DNA containing exon 1 of the human-derived Homologue of RIKEN 2210016F16 gene and the promoter region located 5 ′ upstream thereof.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 the complementary nucleotide sequence of the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 157056 to 159000 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AL354733) Equivalent
  • the base sequence IJ of exon 1 of the human-derived Homologue of RIKEN 2210016F16 gene is represented by base numbers 1392 to 1945.
  • the cytosine in G shows a high methylation frequency (ie, hypermethylation) in cancer cells such as gastric cancer cells.
  • cytosine having a high methyline frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 6, the base numbers 1172, 1175, 1180, 1183, 1189, 1204, 1209, 1267, 1271, Examples include 1278, 1281, 1313, 1319, 1332, 1334, 1338, 1346, 1352, 1358, 1366, 1378, 1392, 1402, 1433, 1436, 1438, and the like.
  • the base sequence represented by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) is Examples of the nucleotide sequence containing one or more include the nucleotide sequence of genomic DNA containing exon 1 of the FLJ32130 gene derived from human and its promoter region located upstream of the gene. More specifically, In SEQ ID NO: 7 (Corresponding to a complementary nucleotide sequence of the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 to 2379 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AC002310).
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 the ATG codon encoding the methionine at the amino acid end of the FLJ32130 protein derived from human is represented by nucleotide numbers 2136 to 2138, and the nucleotide sequence considered to be exon 1 is Base numbers 2136 to 2379 are shown.
  • cytosine in pG shows a high frequency of methine leihi (ie, hypermethylation) in cancer cells such as gastric cancer cells.
  • cytosine having high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 7, base numbers 1714, 1716, 1749, 1753, 1762, 1795, 1814, 1894 1911, 1915, 1925, 1940, 1955, 1968 and the like.
  • the useful protein gene is a PPARG angiopoietin-related protein gene
  • the base sequence containing one or more base sequences represented by G includes genomic DNA bases containing exon 1 of human-derived PPARG angiopoietin-related protein gene, its 5, promoter region located upstream.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 can be mentioned.
  • ATG codon encoding Mechionin of Amino-terminal of PPARG angio P oietin-r elated protein protein from human is represented in salt group number 717-719, the Ekuson
  • the base sequence of the 5 ′ side part of 1 is shown in base numbers 1957 to 2661. Cytosine in the base sequence shown by C p G present in the base sequence shown in SEQ ID NO: 8, particularly C p G present in the region where C p G is densely present in the base sequence shown in SEQ ID NO: 8.
  • the cytosine in the middle shows high methylation frequency (ie, hypermethylation) in cancer cells such as gastric cancer cells. More specifically, as cytosine with high methylation frequency in gastric cancer cells, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 8, base numbers 35, 43, 51, 54, 75, 85 107, 127, 129, 143, 184, 194, 223, 227, 236, 251, 258 and the like. More specifically, for example, when the useful protein gene is a Throtnbomodulin gene, it is represented by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • nucleotide sequence containing one or more nucleotide sequences examples include the genomic DNA nucleotide sequence containing exon 1 of the Thrombomodulin gene derived from human and 5, a promoter region located upstream.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 (corresponding to the base sequence represented by base numbers 1 to 6096 of the base sequence described in Genbank Accession No. AF495471) can be mentioned.
  • the ATG codon encoding the amino terminal methionine of the human Thrombomodulin protein is represented by nucleotide numbers 2590 to 2592.
  • the nucleotide sequence of the above exon 1 is Base numbers 2048-6096 are shown.
  • cytosine having a high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 9, the base numbers 1539, 1551, 1571, 1579, 1581, 1585, 1595, 1598, 1.601 1621, 1632, 1638, 1645, 1648, 1665, 1667, 1680, 1698, 1710, 1724, 1726, 1756, and the like.
  • the useful protein gene is p53-responsive gene 2 gene, it is C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • nucleotide sequence containing one or more of the nucleotide sequences shown include those of genomic DNA containing exon 1 of human-derived p53-responsive gene 2 gene and a promoter region located 5 'upstream thereof. More specifically, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10 (Genbank Accession No. AC00947 1 corresponds to a complementary sequence of the base sequence represented by base numbers 113501 to 116000 of the base sequence described in 1. ). In the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10, the nucleotide sequence of exon 1 of the human-derived p53-responsive gene 2 gene is represented by nucleotide numbers 1558 to 1808.
  • Cytosine in the base sequence represented by C p G present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 has a high methylation frequency (ie, hypermethylation state in cancer cells such as knee cancer cells). hypermethylation)). More specifically, cytosine having a high methylation frequency in spleen cancer cells, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 10, base numbers 1282, 1284, 1301, 1308, 1315, 1319, 1349, The cytosine shown by 1351, 1357, 1361, 1365, 1378, 1383 etc. can be mentioned.
  • the base sequence represented by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • the nucleotide sequence containing one or more of the above include the nucleotide sequence of genomic DNA containing exon 1 of the Fibrillin2 gene derived from human, and its promoter region located upstream of the gene. Is a base sequence represented by SEQ ID NO: 11 (corresponding to a complementary sequence of the base sequence represented by base numbers 118801 to 121000 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC113387).
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 the nucleotide sequence of exon 1 of the human-derived Fibrillin gene is represented by nucleotide numbers 1091 to 1345.
  • Cytosine in the base sequence represented by C p G present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 1 has a high methylation frequency (ie, hypermethylation state ( hypermethylati on)).
  • cytosine having a high methylation frequency in the spleen cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 11, the base numbers 679, 687, 690, 699, 746, 773, 777, 783 795, 799, 812, 823, 830, 834, 843, and the like.
  • the useful protein gene is a Neurofilament 3 gene
  • the base sequence containing one or more base sequences represented by CG in the base sequence includes genomic DNA containing exon 1 of the human-derived neurofilaments gene, and a promoter region located upstream of it.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 corresponds to a complementary sequence.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12 the nucleotide sequence of exon 1 of the human-derived Neurofilaments gene is represented by nucleotide numbers 614 to 1694.
  • cytosine in the nucleotide sequence represented by C p G present in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 2 has a high methylation frequency (ie, hypermethylation state ( hypermethylation)).
  • cytosine with high methylation frequency in spleen cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 12, base numbers 428, 432, 443, 451, 471, 475, 482, Examples include cytosine represented by 491, 499, 503, 506, 514, 519, 532, 541, 544, 546, 563, 566, 572, 580, and the like.
  • the nucleotide sequence containing one or more nucleotide sequences represented by is a genomic DNA nucleotide sequence containing exon 1 of the human-derived disintegrin and metalloproteinase doma in 23 gene and a promoter region located 5 ′ upstream thereof. More specifically, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13 (corresponding to the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 21001 to 23300 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AC009225). ).
  • nucleotide sequence IJ represented by SEQ ID NO: 13 the base sequence of exon 1 of the human-derived disintegrin and metalloproteinase domain 23 gene is represented by nucleotide numbers 1194 to 1630.
  • cytosine in the base sequence represented by CpG present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 has a high methylation frequency (ie, hypermethylation state in cancer cells such as spleen cancer cells).
  • cytosine having a high methylation frequency in knee cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 998, 1003, 1007, 1011, 1016, 1018, 1020, 1026, 1028, 1031, 1035, 1041, 1043, 1045, 1051, 1053, 1056, 1060, 1066, 1068, 1070, 1073, 1093, 1096, 1106, 11 12, 1120, 1124, 1126 and the like can be mentioned.
  • the useful protein gene is a G protein-coupled receptor 7 gene, it is a CG present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • the nucleotide sequence containing one or more of the nucleotide sequences shown is the nucleotide sequence of genomic DNA containing exon 1 of the human G protein-coupled receptor 7 gene, and its upstream promoter region. More specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 (corresponds to the base sequence represented by base numbers 75001 to 78000 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC009800). can give. In the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14, the nucleotide sequence of exon 1 of G protein-coupled receptor 7 gene derived from human is represented by nucleotide numbers 1666 to 2652.
  • Cytosine in the base sequence represented by C p G present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 is, for example, a high methylation frequency (ie, hypermethylated state) in cancer cells such as presumptive cancer cells. (Hypermethylation)). More specifically, as cytosine having high methylation frequency in knee cancer cells, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 14, base numbers 1480, 1482, 1485, 1496, 1513, 1526, 1542, 1560 1564, 1568, 1570, 1580, 1590, 1603, 1613, 1620 and the like.
  • a useful protein gene is a G-protein coupled somatostat in and angiotensin-like peptide receptor ⁇ is a child, its promoter region, untranslated region or translation region
  • the base sequence that contains one or more base sequences indicated by C p G present in the base sequence of the region (coding region) is human exogenous G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor gene 1
  • the nucleotide sequence of the genomic DNA containing the promoter region located upstream thereof, and more specifically, the salt represented by SEQ ID NO: 15 A base sequence (corresponding to a complementary sequence of the base sequence represented by base numbers 57001 to 60 000 of the base sequence described in Genbank Accession No.
  • the nucleotide sequence of exon 1 of G-protein coupled somatostatin and ang iotensin-like peptide receptor gene derived from baboon is represented by nucleotide numbers 776-2632.
  • Cytosine in the base sequence represented by C p G present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 is, for example, a high methylation frequency (ie, hypermethylated state) in cancer cells such as knee cancer cells. (Hypermethylation)).
  • cytosine having a high methyl baboon frequency in knee cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 15, the base numbers 470, 472, 490, 497, 504, 506, 509, 514, The cytosine shown by 522, 540, 543, 552, 566, 582, 597, 610, 612 etc. can be mentioned. More specifically, for example, when the useful protein gene is Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalm member 2, the nucleotide sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • the base sequence including one or more base sequences represented by C p G in it includes the human-derived Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalm member 2 and the exon 1 of the remaining 5 'upstream. And more specifically, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16 (base number 78801 to the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AC026802). This corresponds to a complementary sequence of the base sequence represented by 81000.
  • the nucleotide sequence of exon 1 of the human-derived Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2 gene is represented by nucleotide numbers 1479-1804 as shown in SEQ ID NO: 16 Has been.
  • Cytosine in the base sequence represented by C p G present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 is, for example, a high methylation frequency (ie, hypermethylation state in cancer cells such as knee cancer cells). )) More specifically, as cytosine having a high methylation frequency in spleen cancer cells, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 16, base numbers 1002, 1010, 1019, 1021, 1051, 1056, 1061, 1063, The cytosine shown by 1080, 1099, 1110, 1139, 1141, 1164, 1169, 1184 etc. can be mentioned.
  • Methods of Methods means an antibody that binds a methylated base in DNA as an antigen.
  • a specific example is a methylcytosine antibody that has the property of recognizing and binding to cytosine methylated at the 5-position in single-stranded DNA.
  • Even a commercially available methylated DNA antibody may be any antibody that can specifically recognize and bind to methylated DNA described in this patent.
  • a methylated DNA antibody can be prepared by a conventional method using a methylated base, methylated DNA or the like as an antigen. Specifically, in order to prepare a methylcytosine antibody, a specific antibody from an antibody prepared using 5-methylcytidine, 5-methylcytosine, or DNA containing 5-methylcytosine as an antigen to methylcytosine in DNA It can be produced by selecting the appropriate bond as an index.
  • the antibodies obtained by immunizing animals with antigens include immunization with purified antigens, followed by the use of antibodies from the IgG fraction (polyclonal antibodies), and antibodies that produce single clones (monoclonal antibodies). ) Is available.
  • polyclonal antibodies antibodies that produce single clones
  • monoclonal antibodies antibodies that produce single clones
  • Is available it is desirable that the antibody is capable of specifically recognizing methylated DNA or methylcytosine, and therefore it is desirable to use a monoclonal antibody.
  • An example of a method for producing a monoclonal antibody is a cell fusion method.
  • spleen cells B cells
  • myeloma cells fused together to produce a hyperidoma
  • the antibodies produced by the hyperidoma are selected and methylcytosine antibodies are selected.
  • Monoclonal antibody can be prepared.
  • 5-methylcytidine, 5-methylcytosine, or a mixture of DNA containing 5-methylcytosine is used as an antigen and administered to animals used for immunization. it can.
  • 5-methylcytidine, 5-methylcytosine, or DNA containing 5-methylcytosine is directly administered to a mouse producing an antibody. If it is difficult to produce antibodies, support the antigen. It may be immunized by binding to a carrier.
  • an adjuvant solution for example, a mixture of fluid paraffin and A race 1 A and a mixture of dead bacteria of Mycobacterium tuberculosis as an adjuvant
  • immunization by incorporating it into a ribosome, Can increase immunity.
  • a solution containing the antigen and an adjuvant solution in equal amounts and make it sufficiently milky then inject it subcutaneously or intraperitoneally into the mouse, or mix well with alum water, and then kill Bordetella pertussis as an adjuvant.
  • a method of adding It is also possible to boost the mouse intraperitoneally or intravenously after an appropriate period after the first immunization.
  • a solution in which the antigen is suspended may be directly injected into the mouse spleen for immunization.
  • the spleen is removed and the adipose tissue is removed, and then a spleen cell suspension is prepared.
  • the spleen cells are fused with, for example, HGPRT-deficient myeloma cells to produce a hybridoma.
  • Any cell fusion agent may be used as long as it can efficiently fuse spleen cells (B cells) and myeloma cells.
  • a method using Sendai virus (HV J) or polyethylene glycol (PEG) may be used.
  • cell fusion may be performed by a method using a high voltage pulse. '
  • An antigen-antibody reaction system can be used for the antibody detection method and antibody titer measurement method for selecting a hybridoma producing the desired antibody.
  • Specific examples of antibody measurement methods for soluble antigens include radioisotope immunoassay (RIA) and enzyme immunoassay (ELISA).
  • methyli-ligated single-stranded DNA in the present invention means single-stranded DNA in which C p G present in the single-stranded DNA is methylated at more than one site. It is not limited to single-stranded DNA in which all CpGs present in single-stranded DNA are methylated.
  • amplified methylated DNA in the target DNA region to a detectable amount and the amount of amplified DNA refers to the amount of genomic DNA contained in a biological sample.
  • the biological specimen is 1 mL of serum
  • a DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological specimen is digested with a methylation sensitive restriction enzyme.
  • “Methylation-sensitive restriction enzyme” means, for example, a restriction enzyme that can digest only a recognition sequence containing unmethylated cytosine without digesting a recognition sequence containing methylated cytosine. . That is, in the case of DNA in which the cytosine contained in the recognition sequence that can be originally recognized by the methylation-sensitive restriction enzyme is methylated, even if the methyli koji sensitive restriction enzyme acts on the DNA, The DNA is not cleaved. On the other hand, when the cytosine contained in the recognition sequence that can be originally recognized by the methylation-sensitive restriction enzyme is not methylated, the methylation-sensitive restriction enzyme is allowed to act on the DNA. The DNA is cleaved.
  • methylation-sensitive enzymes include, for example, HpaII, BstUI, Narl, which are restriction enzymes having a recognition cleavage site in the target DNA region of genomic DNA contained in a biological specimen. , SacII, Hhal and the like.
  • the methylation sensitive restriction enzyme is already
  • the methylation sensitive restriction enzyme does not cleave the methylated DNA! / It can be discriminated whether or not cytosine in the C p G pair existing in the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme in the genomic DNA contained in the biological specimen has been methylated. That is, at least one C p existing in the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme in the genomic DNA contained in the biological specimen is removed by performing a treatment with the methylation-sensitive restriction enzyme. If cytosine in the G pair is not methylated, it is cleaved by the methylation sensitive restriction enzyme.
  • genomic DNA contained in biological samples can be obtained by performing PCR using a pair of primers capable of amplifying the target DNA region. If the cytosine in at least one C p G pair existing in the restriction enzyme recognition site in FIG. 4 is not methylated, no PCR amplification product can be obtained. If cytosine in all C p G pairs existing in the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme in the genomic DNA included is methylated, a PCR amplification product can be obtained. become.
  • the first step may be performed as follows.
  • Optimal 10X buffer 330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM for genomic DNA from mammals
  • a preferred embodiment of the methylation sensitive restriction enzyme treatment in the first step is a method of adding a masking oligonucleotide. Specifically, a single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region is mixed with a masking oligonucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme.
  • first (A) step and first (B) step even if the DNA sample derived from the genomic DNA contained in the biological specimen is single-stranded DNA, only double-stranded DNA is used as the substrate. Can be digested with a methylation sensitive restriction enzyme. Also, the first (A) step and the first (B) step may be carried out continuously or simultaneously.
  • a “masking oligonucleotide” is an oligonucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of the recognition site of a methylation-sensitive restriction enzyme, and several sites contained in the target DNA region in single-stranded DNA Complementary base pairing with at least one site (or all sites) of a recognition sequence of a methyl enzyme-sensitive restriction enzyme forms a duplex (that is, the site is made into a double-stranded state). ) Methylation sensitive restriction enzyme that can digest the above-mentioned site with methylation sensitive restriction enzyme using only double stranded DNA as a substrate. Also, when sample is single stranded DNA, it can digest single stranded DNA.
  • Restriction enzymes methylation sensitive restriction enzymes capable of quenching single-stranded DNA can also digest double-stranded DNA, and their digestion efficiency is higher for double-stranded DNA than for single-stranded DNA
  • An oligonucleotide of order to be able to improve the efficiency, and duplexes with single-stranded DNA and single-stranded immobilized oligonucleotide comprising a DNA region of interest Means an oligonucleotide that does not inhibit the formation of
  • the masking oligonucleotide is an oligonucleotide that cannot be used for the reaction of extending the extension primer, using the reverse primer (positive strand) described below as an extension primer and the masking oligonucleotide (negative strand) as a saddle type.
  • the base length is preferably 8 to 200 bases.
  • One or more types of masking oligonucleotides may be mixed with a DNA sample derived from genomic DNA. When multiple types are used, many of the recognition sites for the methyl enzyme-sensitive restriction enzyme of the single-stranded DNA containing the target DNA region will be in a double-stranded state. “Uncut NA” can be minimized. For example, the masking oligonucleotide is digested if it is not methylated but not methylated among the recognition sequences of methylation-sensitive restriction enzymes in several locations contained in the target DNA region.
  • DNA fragmentation a recognition sequence containing cytosine that is not methylated cannot be completely digested.
  • DNA fragmentation a recognition sequence containing cytosine that is not methylated cannot be completely digested.
  • DNA sample derived from genomic DNA contained in biological specimen is preferably a DNA sample that has been previously digested with a restriction enzyme that does not use the target DNA region of the genomic DNA as a recognition cleavage site. It can be mentioned as one of the embodiments.
  • digested genomic DNA contained in biological samples is immobilized with immobilized oligonucleotides. When selecting, the short vertical DNA is easier to select, and when the target region is amplified by PCR, the shorter vertical DNA is considered to be better.
  • Digestion may be carried out by directly using a restriction enzyme with a DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological sample, using the DNA region as a recognition cleavage site.
  • a general restriction enzyme treatment method may be used as a digestion treatment with a restriction enzyme that does not use the target DNA region as a recognition cleavage site.
  • the amount of methylation can be obtained with high accuracy by subjecting the biological specimen itself to the above-described restriction enzyme in advance. This method is useful for eliminating the “DNA residue”.
  • a method of digesting a sample derived from genomic DNA contained in a biological sample with a methylation-sensitive restriction enzyme when the biological sample is genomic DNA itself, the same method as described above may be used.
  • a large excess of methylation sensitive restriction enzyme for example, 500 fold amount (10 U) or 25 ng DNA amount Digestion treatment may be performed using the above methylation-sensitive restriction enzyme.
  • Genomic DNA basically exists as double-stranded DNA. Therefore, in this procedure, not only methylation-sensitive restriction enzymes that can digest single strands (for example, Hhal) but also methyl babies that can digest double-stranded DNA '[ ⁇ live restriction enzymes (for example, HpaII, BstUI, Narl, SacII, Hhal, etc.) can be used.
  • the second step can be performed without performing a digestion treatment with a methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting single-stranded DNA. If the target DNA region does not contain a base sequence that can be digested with a methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting single-stranded DNA, the second step may be performed without performing the first step.
  • a single-stranded DNA subjected to methylation is obtained from the digested DNA sample obtained in the first step, the single-stranded DNA and the immobilized methyl alcohol are obtained.
  • D Select single-stranded DNA by binding NA antibody.
  • the methylated double-stranded DNA contained in the digested DNA sample obtained in the first step is separated into methylated single-stranded DNA (second ( It may be composed of a step A) and a second step (B) in which the methylated single chain DNA obtained in the second (A) step and the immobilized methylated DNA antibody are bound.
  • the methylated double-stranded DNA contained in the digested DNA sample obtained in the first step is converted into a methylated single-stranded DNA.
  • a general procedure for converting a double-stranded DNA into a single-stranded DNA may be performed. Specifically, a DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological sample may be dissolved in an appropriate amount of ultrapure water, heated at 95 ° C for 10 minutes, and then rapidly cooled in ice.
  • the methylated single-stranded DNA is selected from the DNA obtained in the first step by binding with an immobilized methylated DNA antibody.
  • Immobilized methylated DNA antibodies are used to select single-stranded DNA that has been methylolated from DNA samples derived from genomic DNA contained in biological specimens.
  • the immobilized methyl DNA antibody may be any antibody as long as it can be immobilized on a support, and “immobilized on a support” means that the immobilized methylated DNA antibody is directly attached to the support, or It means that it can be fixed indirectly.
  • the immobilized methylated DNA antibody may be immobilized on a support according to a normal genetic engineering operation method or a commercially available kit / equipment (binding to a solid phase).
  • a support in which biotinylated immobilized methylated DNA antibody obtained by piotination of immobilized methylated DNA antibody is coated with streptavidin (eg, a PCR tube coated with streptavidin, streptavidin, And a method of fixing to magnetic beads coated with (1).
  • streptavidin eg, a PCR tube coated with streptavidin, streptavidin, And a method of fixing to magnetic beads coated with (1).
  • a glass whose surface has been activated with a silane coupling agent or the like after covalently binding a molecule having an active functional group such as an amino group, a thiol group, or an aldehyde group to an immobilized methylated DNA antibody.
  • a method of covalently bonding to a polysaccharide derivative, silica gel, the synthetic resin, or the like, or a heat-resistant plastic support is also a method in which five units of liglyceride are linked in series by a spacer, a crosslinker or the like.
  • the immobilized methylated DNA antibody may be directly immobilized on the support, or the antibody against the immobilized methylated DNA antibody (secondary antibody) is immobilized on the support and the secondary antibody is immobilized. Alternatively, it may be immobilized on a support by binding a methylated antibody.
  • the immobilized DNA-immobilized methylated DNA antibody is immobilized on a support.
  • (2) after the binding between the single-stranded DNA (positive strand) and the immobilized immobilized methylated DNA antibody, the binding between the immobilized DNA immobilized DNA antibody and the support It may be fixed by.
  • the single-stranded DNA is selected.
  • a “Piotin-labeled pyotinylated methylcytosine antibody” may be used as an immobilized immobilized methylated DNA antibody as follows.
  • washing buffer for example, 0.05% Tween20-containing phosphate buffer (lmM KH 2 P0 4, 3mM Na2HP0 7H20, 154mM NaCl pH7.4) was added at a rate of 100 mu L / tube, and the solution is removed. This washing operation is repeated several times to leave the pyotinylated methylcytosine antibody immobilized on the support in the PCR tube.
  • (b) Mix double-stranded DNA derived from genomic DNA contained in a biological sample with a buffer (for example, 33 mM Tris-Acetate pH 7.9, 66 mM K0Ac, lOmM MgOAc 2 , 0.5 mM Dithiothreitol) at 95 ° C. Heat for several minutes. Then, quickly cool to a temperature of about 0-4 ° C and incubate at that temperature for several minutes to form single-stranded DNA. Then return to room temperature.
  • a buffer for example, 33 mM Tris-Acetate pH 7.9, 66 mM K0Ac, lOmM MgOAc 2 , 0.5 mM Dithiothreitol
  • the biotinylated methylcytosine antibody is immobilized on the formed single-stranded DNA. After that, it is allowed to stand at room temperature for about 1 hour to promote the binding of the pyotinylated methylcytosine antibody to the methylated single chain DNA of the single chain DNA.
  • Formation of a conjugate (At this stage, single-stranded DNA containing at least an unmethylated DNA region does not form a conjugate.). After that, the remaining solution is removed and washed.
  • Wash buffer eg, phosphate buffer containing 0.05% Tween20 (ImM KH2P04, 3raM Na2HP07H20, 154 mM NaCl pH7.4)
  • phosphate buffer containing 0.05% Tween20 ImM KH2P04, 3raM Na2HP07H20, 154 mM NaCl pH7.4
  • the buffer used in (b) is not limited to the buffer as long as it is suitable for separating double-stranded DNA derived from biological DNA derived from genomic DNA into single-stranded DNA.
  • the washing operations in (a) and (c) were suspended in a solution that was not bound to the immobilized, non-immobilized, methylated DNA antibody or the immobilized methylated DNA antibody that was suspended in the solution. It is important for removing unmethylated single-stranded DNA or DNA floating in a solution digested with restriction enzymes described later from the reaction solution.
  • the washing buffer only needs to be suitable for the removal of the above-mentioned free immobilized DNA methylated ring A antibody, single-stranded DNA floating in the solution, and the like. buffer
  • a counter oligonucleotide can be added in the second step (A).
  • a counter oligonucleotide is obtained by dividing the same base sequence as the target DNA region into short oligonucleotides. The length is usually 10 to 100 bases, more preferably 20 to 50 bases. Counter oligonucleotides should not be designed on base sequences that complementarily base pair with the target DNA region for the forward primer or repurse primer. Counter oligonucleotide is added in a large excess compared to genomic DNA, and the desired DNA region is removed.
  • the complementary strand (negative strand) of the target DNA region and the single strand (positive strand) complement the target DNA region. Add to prevent recombination due to sex.
  • the target region is a single-stranded methylated DNA antibody. It is because it is easy to combine with.
  • the amount of counter oligonucleotide is added at least 10 times, usually 100 times or more, compared to the target DNA region.
  • ⁇ Addition of counter oligonucleotide when separating ⁇ -methylated single-stranded DNA '' specifically refers to methylated single DNA from a DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological specimen.
  • a DNA sample derived from a genomic DNA contained in a biological specimen is mixed with a counter oligonucleotide, and the complementary strand of the target DNA region and the double strand of the counter oligonucleotide are mixed. You should make it.
  • the a DNA sample, the counter oligonucleotide, buffer - and (330mM Tris Acetate pH 7.9, 660raM K0Ac, lOOraM MgOAc have 5mM Dithiothreitol) 5 / L, and M g C 1 2 solution 5 L of LOOmM, lm Add 5 L of g / mL BSA solution, add sterilized ultrapure water to the mixture to make 50 ⁇ L, mix, heat at 95 ° C for 10 minutes, and heat to 70 ° C. Cool quickly, hold at that temperature for 10 minutes, then cool to 50 ° C, keep warm for 10 minutes, keep at 37 ° C for 10 minutes, then return to room temperature.
  • the single-stranded DNA selected in the second step is separated from the immobilized DNA antibody, and free single-stranded DNA is separated.
  • the first step first previous step
  • the double-stranded DNA formed by extension in the second previous step contains a single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region and a base sequence that is complementary to the target DNA region. It has a process (third pre-process) that separates into single-stranded DNA (negative chain) once.
  • Step A (this step) in which a single-stranded DNA containing the target DNA region is elongated as a double-stranded DNA;
  • a single-stranded DNA (negative strand) containing a base sequence that is complementary to the generated target DNA region in a saddle shape, and a base that is complementary to the target DNA region A partial base sequence (negative strand) of the base sequence of the single-stranded DNA (negative strand) containing the sequence, and complementary to the base sequence (positive strand) of the target DNA region.
  • An extension primer having a base sequence (positive strand) complementary to a partial base sequence (negative strand) located further 3 'than the 3' end of a base sequence (negative strand) (a reverse primer) )
  • a step B this step in which the single-stranded DNA containing the target DNA region is formed as a double-stranded DNA.
  • each step of the third step is repeated after separating the elongated double-stranded DNA obtained in each step into a single-stranded state, and then repeating the above steps. Amplify the methylated DNA in to a detectable amount and quantify the amount of amplified DNA.
  • the single-stranded DNA selected in the second step is first separated from the immobilized and immobilized methylated DNA antibody as a first pre-step of the following steps of each of the following steps.
  • Set to DNA A which is in the main chain state. Specifically, for example, an annealing buffer is added to the single-stranded DNA selected in the second step to obtain a mixture.
  • the resulting mixture is heated at 95 ⁇ for several minutes to obtain single-stranded DNA (positive strand). Thereafter, in the second pre-process, specifically, for example, the single-stranded DNA (positive strand) obtained in the first pre-process and the forward primer are used, and sterile ultrapure water is used at 17.85 ⁇ L.
  • an annealing buffer is added to the double-stranded DNA extended and formed in the second pre-process to obtain a mixture, and the resulting mixture is obtained. By heating to 95 ° C for several minutes, once to the single-stranded DNA containing the desired DNA region. To away.
  • the Tm value of the forward primer is about 0 to Cool quickly to a temperature lower by 20 ° C and keep at that temperature for several minutes
  • the single-stranded DNA annealed in the above (i) is used as a saddle type, the primer for extension is used as an extension primer, and the primer is extended once.
  • a single-stranded DNA containing a base sequence that is complementary to the DNA region to be extended is formed as a double-stranded DNA (ie, step A). Specifically, for example, it may be carried out according to the following description or the operation method in the extension reaction in the second previous step of the present invention described above.
  • a single-stranded DNA (negative strand) containing a base sequence complementary to the generated target DNA region is used as a saddle, and the single-stranded DNA containing the target DNA region (A) A partial base sequence (negative strand) of the base sequence possessed by the negative strand and complementary to the base sequence (positive strand) of the target DNA region A partial base sequence (negative strand) located further to the 3 'end side than the 3' end, a base sequence that is complementary to (
  • the extension primer (reverse primer) having a positive strand as an extension primer and extending the extension primer once, the single-stranded DNA is converted into a double-stranded DNA that has been formed.
  • Step B it may be carried out according to the operation method in the extension reaction in the second previous step, as in the step A of (iii) above.
  • each step in the third step is repeated after separating the elongated double-stranded DNA obtained in each step into a single-stranded state (for example, step A and step A).
  • step B the methylated DNA in the target DNA region is amplified to a detectable amount, and the amount of amplified DNA is quantified.
  • the reaction from the first pre-step to the main step can be carried out as one PCR reaction. Further, it is also possible to carry out each of the first pre-process to the third pre-process as an independent reaction, and to perform only this process as a PCR reaction.
  • PCR can be used as a method for amplifying the target DNA region (ie, the target region) contained in the selected single-stranded DNA.
  • a target region is amplified, by using a primer previously labeled with fluorescence or the like and using the label as an index, the presence or absence of an amplification product can be evaluated without performing troublesome operations such as electrophoresis.
  • PCR reaction solution for example, DNA obtained in the second step of this effort, 0.15 ⁇ 1 of 50 ⁇ primer solution, 2.5 ⁇ 1 of 2 mM dNTP, 10 ⁇ buffer solution (lOOmM Tris-HC1 pH 8.3, and 500mM KC1, 20mM MgCl 2, 0.01 % Gelatin) to 2.5 ⁇ 1, AmpliTaq Gold (one kind of thermostable DNA polymerase: 5U / 1) were mixed and 0.2 ⁇ 1 the liquid added with sterile ultrapure water A reaction liquid whose amount is 25 1 can be mentioned.
  • the reaction may be carried out by adding an appropriate amount of betaine, DMSO, etc. at times.
  • the above reaction solution is kept at 95 ° C. for 10 minutes, then at 95 ° C. for 30 seconds and then at 55 to 65 ° C. for 30 seconds and further to 72 ° C. 30 to 40 cycles of heat insulation with 30 seconds as one cycle
  • the conditions to perform are mentioned.
  • the obtained amplification product is detected.
  • the amplification amount in the PCR reaction can be evaluated by measuring the amount of the fluorescent label after performing the same washing and purification operation as before.
  • PCR when PCR is performed using normal unlabeled primers, detection is performed by annealing the gold colloid particles, probes labeled with fluorescence, etc., and measuring the amount of the probe bound to the target region. can do.
  • real-time PCR may be used to obtain the amount of amplification product more accurately.
  • the real-time PCR method is a method that monitors the PCR in real time and analyzes the obtained monitoring results by force kinetics. For example, it can detect even a slight difference of about twice the gene amount. This method is known as the quantitative PCR method.
  • Examples of the real-time PCR method include a method using a probe such as a cage-type nucleic acid polymerase probe, a method using an inter forceator such as Cyber Green, and the like. Commercially available equipment and kits for real-time PCR may be used.
  • the detection is not particularly limited, and detection by any method known so far is possible. In these methods, operations up to detection can be performed without changing the reaction vessel.
  • the present invention may be used in the following situations.
  • genomic DNA contained in a biological specimen derived from a disease there is a DNA region that is 100% methylated in genomic DNA contained in a biological specimen derived from a disease, and if the present invention is carried out for that DNA region, the amount of methylated DNA increases.
  • the genomic DNA contained in a biological sample from a healthy person is hypomethylated, and the genome contained in a biological sample from a diseased patient.
  • DNA region that is hypermethylated in DNA there is a DNA region that is hypermethylated in DNA.
  • the amount of methylated DNA in a healthy person is:
  • the value is significantly higher than the value in the case of a healthy person, so the “degree of disease” can be determined based on the difference in this value.
  • the “degree of disease” here has the same meaning as that generally used in the field, and specifically means, for example, the malignancy of the cell when the biological specimen is a cell.
  • the biological specimen is a tissue, it means the abundance of disease cells in the tissue.
  • the biological specimen is plasma / serum, it means the probability that the individual has a disease.
  • the present invention makes it possible to diagnose various diseases by examining methylation abnormalities.
  • restriction enzymes, primers or probes that can be used in various methods for measuring the amount of methylated DNA in the target region in the present invention are useful as reagents for detection kits.
  • the present invention also provides a detection kit containing these restriction enzymes, primers or probes as reagents, and a detection chip in which these primers or probes are immobilized on a support,
  • the scope of rights of the present invention or the methylation ratio measurement method of the present invention includes use in the form of a detection kit or a detection chip as described above utilizing the substantial principle of the method.
  • ⁇ Partially methylated oligonucleotide having a methylated recognition sequence of HpaI I> N represents 5-methylcytosine.
  • GGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3 ′ (SEQ ID NO: 17) Partially methylated oligonucleotide> N in which the recognition sequence of HpaI I is not methylated represents 5-methylcytosine.
  • a treatment group (no treatment group): Buffer (330raM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOniM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol) 5 ⁇ and B SA (Bovine serum albumin lmg / mL) was added to 5 L, and sterilized ultrapure water was added to the mixture to make the volume 50 ⁇ L.
  • Buffer 330raM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOniM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol
  • B SA Bovine serum albumin lmg / mL
  • Hpa II treated group 5 ⁇ L of buffer solution (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 5 mM Dithiothreitol) and B SA (Bovine serum albumin lmg) / mL) was added to 5 / L and Hpa II was added to 10 U, and sterilized ultrapure water was further added to the mixture to adjust the volume to 50 ⁇ L.
  • buffer solution 330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 5 mM Dithiothreitol
  • B SA Bovine serum albumin lmg
  • Group C (masking oligonucleotide added + Hpa II treatment group): 5 / L of buffer solution (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol) was added to the sample prepared above. Add 5 p mo 1 as a masking oligonucleotide to 5 L of BSA (Bovine serum albumin lmg / ml), 5 U of Hpa II, 10 U of Hpa II, and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 20, and then mix the mixture. Sterile ultrapure water was added to the mixture to make the volume 5 L. Gus masking oligonucleotides>
  • PR 1 5 GCACGACGAGTGTGACGATC-3 (SEQ ID NO: 22)
  • the PCR reaction solution was prepared by adding a primer solution consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 21 and a primer solution consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 22 prepared in 3 M to the vertical DNA.
  • methylcytosine antibody manufactured by Aviva Systems Biology
  • pyotinylated kit Biotin Labeling Kit-NH2, manufactured by Dojindo Laboratories
  • PR 2 5 '-CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3' (SEQ ID NO: 25)
  • PCR reaction solution 5 ⁇ g of genomic DNA to be ⁇ type and 3 ⁇ 1 each of oligonucleotide primer solution prepared to 5 ⁇ , 5 ⁇ each 2 mM dNTP, 10 X buffer solution (LOOmM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KC1, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) 5 ⁇ 1 and metathermal DNA polymerase (AmpliTaq Gold, AB I) 5U / U mixed with 0.25 1 Then, sterilized ultrapure water was added to make the volume 50 1. The reaction solution is kept at 95 ° C for 10 minutes, then at 95 ° C for 30 seconds, then at 61 ° C for 30 seconds, and further at 72 ° C for 45 seconds for one cycle for 40 cycles. PCR was performed under conditions.
  • DNA fragment X was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PR0MEGA). About a part of the obtained DNA fragment solution, Sssl methylase (manufactured by NEB) 1 ⁇ 1, 10 xNEBuffer2 (manufactured by NEB) 10 1, S- adenosyl methionine (3.2 mM, NEB) was mixed with 1 1, and sterilized ultrapure water was added thereto to adjust the volume to 100 1.
  • Sssl methylase manufactured by NEB
  • 10 xNEBuffer2 manufactured by NEB
  • S- adenosyl methionine 3.2 mM, NEB
  • Solution A 100pg / 5 / zL TE solution
  • Solution B 10pg / 5L TE solution
  • Solution D TE solution (negative control solution)
  • TE solution negative control solution
  • Solution MA 100pg / 5L TE solution
  • Counter oligonucleotide C 1 consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 29 to SEQ ID NO: 40 each capable of base pairing by complementarity to the negative strand of the target DNA region X ′ consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 28 ⁇ C 12 was synthesized, and a TE buffer solution having a concentration of 0.01 was prepared.
  • the PCR tube was heated at 95 ° C. for 10 minutes, rapidly cooled to 70 ° C., and kept at that temperature for 10 minutes.
  • the mixture was cooled to 50 ° C., kept warm for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature (this corresponds to the second step of the measurement method of the present invention).
  • the DNA fragment reaction solution 50 prepared above was added to the streptavidin-coated PCR tube on which the biotin-labeled methylcytosine antibody had been immobilized, and left at room temperature for 30 minutes. Thereafter, the solution was removed by pipetting, 1 ⁇ 0 mu L of the washing puffer [0.
  • PR 2 5 '-CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3' (SEQ ID NO: 25)
  • GGCCAG-3 ′ (SEQ ID NO: 28)
  • a reaction solution for PCR the DNA of the vertical shape, 3 L each of oligonucleotide primer solution prepared at 5 / M, each 2 mM dNTP, and buffer solution ( Mix 5 L of lOOmM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KC1 15 mM MgCl 2 0.01% Gelatin) and metathermic DNA polymerase (AmpliTaq Gold AB I) 5 ⁇ / ⁇ with 0.25 ⁇ L. The solution was adjusted to 50 by adding sterilized ultrapure water. Incubate the reaction solution at 95 ° C for 10 minutes, then heat at 95 ° C for 20 seconds, then at 61 ° C for 30 seconds, and then at 72 ° C for 30 seconds for one cycle for 25 cycles.
  • a commercially available methylcytosine antibody (Aviva, Systems Biology) was biotin-labeled using a commercially available pyotinylated kit (Biotin Labeling Kit_NH2, manufactured by Dojindo Laboratories) according to the method described in the catalog.
  • Solution of the resulting biotin-labeled methylcytosine antibody [Phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3niM Na 2 HP0 70, 154raM NaCl pH7.4) solution containing approximately 0.25 ⁇ g / VL 0, 1% BSA] As refrigerated.
  • Streptavidin-coated PCR tubes (total of 8 tubes) were added with 0.1 ⁇ / 50 / b solution of biotin-labeled methylcytosine antibody obtained by synthesis at a rate of 50 ° C for about 1 hour. It was allowed to stand at room temperature and immobilized on a PCR tube. Then, the solution was removed by pipetting, and a lOO ⁇ L wash buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (lmM KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP0 7H 20 , 154raM NaCl pH 7.4)] was added. Thereafter, the buffer was removed by pipetting.
  • DNA fragment Y was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PR0MEGA).
  • Sssl methylase manufactured by NEB
  • 10 x NEBuffer 2 manufactured by NEB
  • S- adenosyl methionine 3.2 nil, NEB3 ⁇ 4t®
  • Solution A 100pg / 5 ⁇ L TE solution
  • Solution B 10pg / 5L TE solution
  • Solution D TE solution (negative control solution) The following solution was prepared for the obtained DNA fragment MY.
  • the PCR tube was heated at 95 ° C for 10 minutes, rapidly cooled to 70 ° C, and kept at that temperature for 10 minutes. Next, it was cooled to 50 ° C and kept for 10 minutes, further kept at 37 ° C for 10 minutes, and then returned to room temperature (this corresponds to the second step of the measurement method of the present invention).
  • the DNA fragment reaction solution 50 prepared above was added to the streptavidin-coated PCR tube immobilized with the above-mentioned piotin-labeled methylcytosine antibody, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
  • PCR is performed in the above PCR tube using each solution of oligonucleotide primers PF3 and PR3 consisting of the base sequences represented by SEQ ID NO: 41 and SEQ ID NO: 42, respectively, using the following reaction conditions:
  • oligonucleotide primers PF3 and PR3 consisting of the base sequences represented by SEQ ID NO: 41 and SEQ ID NO: 42, respectively, using the following reaction conditions:
  • methylated DNA in the target DNA region Y ′ consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 45 was amplified.
  • PCR reaction solution we prepared 3 ⁇ L each of oligonucleotide primer solution prepared in 5 ⁇ , 5 each 2 mM dNTP, and buffer solution (lOOmM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KC1). , 15 mM MgCl, 0.01% Gelatin); 5 uL, Metathermal DN A polymerase (AmpliTaq Gold, manufactured by AB I)! ! / Mix with 25 / zL Then, sterilized ultrapure water was added to make the volume 50 / ⁇ L. Incubate the reaction solution at 95 ° C for 10 minutes, then heat at 95 ° C for 20 seconds, then at 60 ° C for 30 seconds, and then at 72 ° C for 30 seconds for one cycle for 25 cycles. PCR was performed under conditions.
  • a commercially available methylcytosine antibody (manufactured by Aviva Systems Biology) was labeled using a commercially available pyotinylated kit (Biotin Labeling Kit-NH2, manufactured by Dojindo Laboratories) according to the method described in the catalog.
  • the obtained biotin-labeled methylcytosine antibody was refrigerated and stored as a solution [an antibody of about 0.25 / 0.1% BSA-containing phosphate buffer (lmM KH 2 P0 4 , 3raM Na 2 HP0 73 ⁇ 40, 154 mM NaCl pH 7.4) solution].
  • the baker's yeast strain X 2180-1 A in YPD medium (1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6.0) has a turbidity of 0D 6 . .
  • the cells were cultured until 0.6-1.0, and centrifuged at 10, OOOg for 10 minutes to prepare lxlO 7 yeast cells. From the prepared yeast cells, the yeast genome was obtained using a general yeast genome preparation method as described in Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory).
  • PCR was performed using the oligonucleotide primers (PF 4 and PR 4) represented by SEQ ID NO: 49 and SEQ ID NO: 50, respectively, and the following reaction conditions.
  • PF 4 and PR 4 oligonucleotide primers represented by SEQ ID NO: 49 and SEQ ID NO: 50, respectively, and the following reaction conditions.
  • T a DNA fragment (T, a region corresponding to base number 384569-384685 of yeast chromosome VII shown in SEQ ID NO: 51, Genbank Accession No. NC-001139, etc.) used as a test sample was amplified.
  • PCR reaction solution 10 ng of the genomic DNA in the shape of a cage, 3 1 each of oligonucleotide primer solution prepared in 5 ⁇ , each 2 mM (1 ⁇ 1 ?? 5 1 and 10 X Buffer 5 (lOOraM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KC1, 15raM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) 5 ⁇ 1 and thermostable DNA polymerase (AmpliTaq Gold, AB I) 511/1 0.25 ⁇ 1 And sterilized ultrapure water was added to adjust the volume to 50. 1. The reaction solution was kept at 95 ° C for 10 minutes and then heated to 95 ° C. Then, PCR was performed for 20 seconds, followed by 40 cycles of incubation at 58 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 30 seconds.
  • DNA fragment T was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PR0MEGA). About a part of the obtained DNA fragment solution, 1 ⁇ 1 of Sssl methylase (manufactured by NEB), 10 ⁇ m of 10 x NEBuffer 2 (manufactured by NEB), and S-adenosyl methionine (3.2 ⁇ , NEB) 1) was mixed with 1 ⁇ 1 and sterilized ultrapure water was added thereto to adjust the volume to 100 ⁇ 1. Incubate the reaction at 37 ° C for 15-30 minutes.
  • Sssl methylase manufactured by NEB
  • 10 ⁇ m of 10 x NEBuffer 2 manufactured by NEB
  • S-adenosyl methionine 3.2 ⁇ , NEB
  • Solution A 100pg / 5 a L TE solution
  • Solution B lOpg / S ⁇ L TE solution
  • Solution D TE solution (negative control solution) The following solution was prepared for the obtained DNA fragment MT.
  • Solution MA 100 ⁇ ⁇ / 5 ⁇ TE solution
  • Solution MD TE solution (negative control solution)
  • buffer solution 330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc ⁇ lOOniM MgOAc 5 mM Dithiothreitol
  • B SA Bovine serum albumin lmg / ml
  • H pa II 12U methylation sensitive restriction enzyme
  • Counter oligonucleotide C 16 consisting of the base sequences shown in SEQ ID NO: 54 to SEQ ID NO: 57 each capable of base pairing by complementarity to the negative strand of the target DNA region T ′ consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 53 ⁇ C19 was synthesized, and a TE buffer solution having a concentration of 0.01 / XM was prepared.
  • the PCR tube was heated at 95 ° C for 10 minutes, rapidly cooled to 70 ° C, and kept at that temperature for 10 minutes. Next, it was cooled to 50 ° C, kept for 10 minutes, further kept at 37 for 10 minutes, and then returned to room temperature (this corresponds to the second step of the measurement method of the present invention).
  • 50 L of the DNA fragment reaction solution prepared above was added to the streptavidin-coated PCR tube to which the biotin-labeled methylcytosine antibody had been immobilized, and left at room temperature for 30 minutes.
  • washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP0 7H 20 , 154raM NaCl pH7.4)] The buffer was removed by pipetting. This operation was repeated twice more (this corresponds to the third step of the measurement method of the present invention).
  • PCR is performed on the above-mentioned PCR tube using each solution of oligonucleotide primers PF4 and PR4 each consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 49 and SEQ ID NO: 50, and the following reaction conditions:
  • the methylated DNA in the target DNA region T ′ consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 53 was amplified.
  • PR 4 5 '-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3' (SEQ ID NO: 50)
  • the baker's yeast strain X 2180-1 A in YPD medium (1 ° /. Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6.0) has a turbidity of 0D 6 . .
  • the cells were cultured until 0.6-1.0, and centrifuged at 10, OOOg for 10 minutes to prepare lxlO 7 yeast cells. From the prepared yeast cells, the yeast genome was obtained using a general white yeast genome preparation method as described in Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory).
  • the prepared yeast cells are suspended in buffer A (1M sorbitol, 0.1M EDTA, pH 7.4), 0.1% 2_mercaptoethanol (final concentration 14 mM) and 100 zymolase (10 mg / ml) are added to the solution. Incubate with stirring at 30 ° C for 1 hour until clear. Protoplasts are collected by centrifugation at 550 g for 10 minutes, suspended in Notfer B (50 mM Tris-HC1, pH 7.4, 20 mM EDTA), and sodium dodecyl sulfate is added to 1% (w / v). And then incubated at 65 ° C for 30 minutes. Subsequently, 2/5 volume ratio of 5M C3 ⁇ 4C00K was added and mixed.
  • buffer A 1M sorbitol, 0.1M EDTA, pH 7.4
  • 2_mercaptoethanol final concentration 14 mM
  • 100 zymolase 10 mg / ml
  • Solution A lOng / 5 / zL TE solution
  • Solution B Ing / 5 W L TE solution
  • Solution D TE solution (negative control solution)
  • TE solution negative control solution
  • Solution MA lOng / 5 iL TE solution
  • Solution MD TE solution (negative control solution) The following treatment was applied to each of the above-mentioned yeast genome DNA solution and methylated yeast genome DNA solution.
  • a PCR tube In a PCR tube, add the genomic DNA solution 5 prepared above, 5 U of the restriction enzyme X sp I, and 10 x buffer (200 mM Tris-HCl pH 8.5, lOOmM MgCl 2 , lOmM Dithiothreitol, lOOOmM) KC1) ⁇ ⁇ was mixed and sterilized ultrapure water was added to prepare a solution volume of 10 ⁇ 1. The reaction solution was incubated at 37 ° C for 1 hour.
  • 10 x buffer 200 mM Tris-HCl pH 8.5, lOOmM MgCl 2 , lOmM Dithiothreitol, lOOOmM
  • buffer solution 330 mM Tris-Acetate H 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol
  • BSA Bovine serum albumin lmg / ml
  • methylation sensitive restriction enzyme 12 U of H pa II was added, and sterilized ultrapure water was further added to the mixture to make a volume of 20 ⁇ L. Each mixture was incubated at 37 for 3 hours. Equivalent to one step).
  • a counter oligonucleotide solution 10 L was prepared, a buffer solution and (330mM Tris- Acetate pH 7.9, 66O111M K0Ac, lOOmM MgOAc have 5mM Dithiothreitol) 5 ⁇ L, and M g C 1 2 solution LOOmM, 1111 ⁇ / 1111 ⁇ : 83 A solution 5 L was added, and further sterilized ultrapure water was added to the mixture to make the volume 50 L and mixed. Thereafter, the PCR tube was heated at 95 ° C for 10 minutes, rapidly cooled to 70 ° C, and kept at that temperature for 10 minutes. Next, it was cooled to 50 ° C and kept for 10 minutes, further kept at 37 ° C for 10 minutes, and then returned to room temperature (this corresponds to the second step of the measurement method of the present invention).
  • PCR was carried out in the above PCR tube using a solution of each of the oligonucleotide primers PF 4 and PR 4 consisting of the base sequences represented by SEQ ID NO: 49 and SEQ ID NO: 50, and the following reaction conditions:
  • the methylated DNA in the target DNA region T which consists of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 53, was amplified.
  • PCR reaction solution As the PCR reaction solution, mirror-type DNA was added to each 5 ml of oligonucleotide primer solution prepared at 5 M, each 2 mM dNTP 5 L, buffer ( ⁇ ⁇ Tris-HCl pH 8.3, 500 raM KC1, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) 5 / zL, metathermic DNA polymerase (AmpliTaq Gold, manufactured by AB I) 511 and 0.25 / zL were mixed with sterilized ultrapure water. The liquid volume was 50. Incubate the reaction solution at 95 ° C for 10 minutes, then heat at 95 ° C for 20 seconds, then at 58 ° C for 30 seconds, and further at 72 ° C for 30 seconds, with 31 cycles. PCR was performed under conditions.
  • Designed oligonucleotide consisting of the desired DNA region (GPR7-2079-2176) SEQ ID NO: 2 4
  • Amplified oligonucleotide consisting of the target DNA region (Genbank Accession No. NT 029419 25687390-25687775 homosapiens)
  • SEQ ID NO: 2 7 Designed oligonucleotide consisting of the target DNA region (Genbank Accession No. NT— 029419 25687390-25687775 homo sapiens), n 2 m5c
  • Designed oligonucleotide consisting of the desired DNA region (Genbank Accession No. NT_029419 25687390-25687775 homo sapiens)
  • Amplified oligonucleotide consisting of the desired DNA region (Genbank Accession No. AC009800 76606-76726 homosapiens)
  • n m5c
  • Amplified oligonucleotide consisting of the desired DNA region (Genbank Accession No. NC001139 384569—384685 Saccharomyces cerevisiae chromo, Nome VII)
  • n m5c

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Abstract

本発明は、生物由来検体に含まれるゲノムＤＮＡ中の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法等に関する。

Description

明細書
DN Aメチル化測定方法 技術分野
本発明は、 生物由来検体に含まれるゲノム DNA中の目的とする DNA領域におけ るメチルイ匕された D N Aの含量を測定する方法等に関する。 背景技術
生物由来検体に含まれるゲノム DNA中の目的とする DNA領域における DN Aの メチル化状態を評価するための方法としては、 例えば、 ゲノム DNA中の目的とする DNA領域におけるメチルイ匕された DNAの含量を測定する方法がある （例えば、 Nu cleic Acids Res. 1994 Aug 11 ;22 (15) :2990— 7、 及び Proc Natl Acad Sci U S A. 1 997 Mar 18 ;94 (6) :2284-9参照） 。 当該測定方法では、 まず、 ゲノム DNA由来の D NA試料から、 目的とする DNA領域を含む DNAを抽出する必要があり、 抽出操作 が煩雑である。
また、 抽出された D N Aの目的領域におけるメチル化された D N Aの含量を測定す る方法としては、 例えば、 （1) 亜硫酸塩等を用いて当該 DNAを修飾した後、 DN Aポリメラーゼによる DN A合成の連鎖反応 （Polymerase Chain Reaction；以下、 PCRと記すこともある。 ） に供することにより目的領域を増幅する方法、 （2) メ チル化感受性制限酵素を用いて当該 DNAを消化した後、 PCRに供することにより 、 目的領域を増幅する方法等が知られている。 これらのいずれの方法とも、 メチノレ化 の検出のための DNAの修飾及ぴその後の生成物の精製、 P C Rのための反応系の調 製、 DN Aの増幅の確認等に手間を要する。 発明の開示
本発明は、 生物由来検体に含まれるゲノム DN A中の目的とする DN A領域におけ るメチル化された D N Aの含量を簡便に測定する方法等 提供することを目的とする 即ち、 本発明は、 以下のような発明を提供するものである。 [発明 1 ]
生物由来検体に含まれるゲノム DNA中の目的とする D N A領域におけるメチル化 された D N Aの含量を測定する方法であって、
( 1 ) 生物由来検体に含まれるゲノム DNA由来の DN A試料をメチル化感受性制限 酵素による消化処理を行う第一工程、
(2) 第一工程で得られた消化処理が行われた DN A試料からメチル化された一本鎖 DNAを取得し、 該一本鎖 DNAと、 固定化メチル化 DNA抗体とを結合させて一本 鎖 DNAを選択する第二工程、 及び、 （3) 下記の各本工程の前工程として第二工程 で選択された一本鎖 DNAを、 固定化固定化メチル化 DNA抗体から分離して一本鎖状 態である DNA (正鎖） にする工程 （第一前工程） と、 ' 第一前工程で一本鎖状態にされたゲノム由来の DN A (正鎖） を、 一本鎖状態である DNA (正鎖） が有する塩基配列の部分塩基配列 （正鎖） であって、 且つ、 前記の目 的とする DNA領域の塩基配列 （正鎖） の 3， 末端より更に 3' 末端側に位置する 部分塩基配列 （正鎖） 、 に対して相補性である塩基配列 （負鎖） を有する伸長プライ マー （フォーワード用プライマー） を伸長プライマーとして、 該伸長プライマーを 1 回伸長させることにより、 目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） を二本 鎖 DN Aに伸長形成させる工程 （第二前工程） と、
第二前工程で伸長形成された二本鎖 DN Aを、 目的とする DN A領域を含む一本鎖 D NA (正鎖） と目的とする DNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖 D NA (負鎖） に一旦分離する工程 （第三前工程） を有し、 且つ、 本工程として
(a) 生成した目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） を鎵型として、 前 記フォワード用プライマーを伸長プライマーとして、 該伸長プライマーを一回伸長さ せることにより、 前記の目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNAを二本鎖 DNAと して伸長形成させる第 A工程 （本工程） と、
(b) 生成した目的とする DNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖 D NA (負鎖） を铸型として、 前記の目的とする DNA領域に対して相補性である塩基 配列を含む一本鎖 DNA (負鎖） が有する塩基配列の部分塩基配列 （負鎖） であって 、 且つ、 前記の目的とする DNA領域の塩基配列 （正鎖） に対して相補性である塩基 配列 （負鎖） の 3' 末端より更に 3' 末端側に位置する部分塩基配列 （負鎖） 、 に 対して相補性である塩基配列 （正鎖） を有する伸長プライマー （リバース用プライマ 一） を伸長プライマーとして、 該伸長プライマーを 1回伸長させることにより、 前記 の目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNAを二本鎖 DN Aとして伸長形成させる第 B工程 （本工程） とを有し、
更に第三工程の各本工程を、 前記各本工程で得られた伸長形成されたニ本鎖 D N Aを —本鎖状態に一旦分離した後、 繰り返すことにより、 前記の目的とする DN A領域に おけるメチル化された D N Aを検出可能な量になるまで増幅し、 增幅された D N Aの 量を定量する第三工程、 を有することを特徴とする方法。
[発明 2]
固定化固定化メチル化 DNA抗体がメチルシトシン抗体である発明 1に記載の方法。
[発明 3]
生物由来検体が哺乳動物の血液、 体液、 血清、 血漿、 細胞溶解液又は組織溶解液で ある発明 1又は 2に記載の方法。
[発明 4 ]
生物由来検体に含まれるゲノム DNA由来の D N A試料が、 該ゲノム D N Aが有す る目的とする DNA領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなる D N A試料、 又は予め精製されてなる D N A試料である発明 1〜3のレ、ずれか一に記 载の方法。
[発明 5]
第一工程が、
目的とする DN A領域を含む一本鎖 DN A (正鎖） と、 メチル化感受性制限酵素の 認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドと 、 を混合することにより、 該メチルイヒ感受性制限酵素の認識部位が保護されてなる一 本鎖 DNAを選択する第一 （A) 工程と、
第一 （A) 工程で選択された一本鎖 DN Aをメチル化感受性制限酵素で消化処理す る第一 （B) 工程と、 力 ら構成される発明 1〜4のいずれか一に記載の方法。
[発明 6] メチル化感受性制限酵素が、 生物由来検体に含まれるゲノム DNAが有する目的と する DN A領域の中に認識切断部位を有する制限酵素、 又は Hhalである発明 1〜 5の いずれか一に記載の方法。
[発明 7]
第一工程におけるメチルイヒ感受性制限酵素による消化処理を行わずに第二工程を行 う発明 1〜 6のいずれかの請求項記載の方法。
[発明 8]
第二工程が、
第一工程で得られた消化処理が行われた DN A試料に含まれるメチル化された二本 鎖 DN Aをメチル化された一本鎖 DN Aに分離する第二 （A) 工程と、
第二 （A) 工程で得られたメチル化一本鎖 DN Aと固定化メチルイ匕 DN A抗体と結 合させる第二 （B) 工程とからなり、
第二 （A) 工程でメチル化された二本鎖 DN Aをメチル化一本鎖 DN Aに分離する 際に、 カウンターオリゴヌクレオチドを添加する発明 1〜 7のいずれか一項に記載の 方法。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1において、 調製されたサンプルから配列番号 23で示される塩基 配列からなる領域におけるメチル化された DNAを PCRにて増幅し、 得られた増幅 産物を 2 %ァガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。
図中の一番左のレーンから、 DNAマーカー 「MK：」 、 Hp a I Iの認識配列がメ チル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチド GPR 7— 2079-21 76/ 98me r一 M (7) 溶液の 「A」 処理が施されたサンプル 「M」 、 Hp a I Iの認 識配列の一部がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチド G P R 7— 2 079-21 76 /98me r -HM (5) 溶液の 「A」 処理が施されたサンプノレ 「 HJ 、 アンメチル化オリゴヌクレオチド GPR 7— 2079— 21 76/98me r 一 UM溶液の 「A」 処理が施されたサンプル 「U」 、 Hp a I Iの認識配列がメチル 化されてレ、る部分メチル化ォリゴヌクレオチド GPR 7— 2079— 2176/98 me r一 M (7) 溶液の 「B」 処理が施されたサンプル 「M」 、 Hp a I Iの認識配 列の一部がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチド GPR 7— 207 9- 21 76/98me r -HM (5) 溶液の 「B」 処理が施されたサンプル 「H」
、 アンメチル化オリゴヌクレオチド GPR7— 2079— 2176/98 m e r— U
M溶液の 「B」 処理が施されたサンプル 「U」 、 Hp a I Iの認識配列がメチル化さ れている部分メチル化オリゴヌクレオチド GPR7— 2079— 2176/98 m e r -M (7) 溶液の 「C」 処理が施されたサンプル 「M」 、 Hp a I Iの認識配列の 一部がメチル化されていない部分メチル化ォリゴヌクレオチド G PR 7— 2079- 21 76/98me r -HM (5) 溶液の 「CJ 処理が施されたサンプル 「Η」 、 Ύ ンメチル化オリゴヌクレオチド GPR7— 2079— 21 76/98me r— UM溶 液の 「C」 処理が施されたサンプル 「U」 、 での結果を示している。 図 2は、 実施例 2において、 調製されたサンプルから配列番号 28で示される塩基 配列からなる目的とする DN A領域におけるメチル化された D N Aを P C Rにて増幅 し、 得られた増幅産物を 1. 5 %ァガロースゲル電気泳動した結果を示した図である 。 図中の一番左のレーンから、 DNAマーカー 「MK」 、 メチルイヒされた DNAフラ グメント MXの溶液 「MD」 (ネガテイブコント口ール) 、 メチル化されていない D NAフラグメント Xの溶液 「D」 （ネガティブコントロール） 、 メチル化された DN Aフラグメント MXの溶液 「MC」 、 メチル化されていない DNAフラグメント Xの 溶液 「C」 、 メチル化された DNAフラグメント MXの溶液 「MB」 、 メチル化され ていない DNAフラグメント Xの溶液 「B」 、 メチル化された DNAフラグメント M Xの溶液 「MA」 、 メチル化されていない DNAフラグメント Xの溶液 「A」 、 での 結果を示している。 図 3は、 実施例 3において、 調製されたサンプルから配列番号 45で示される塩基 配列からなる目的とする D N A領域におけるメチル化された D N Aを P C Rにて増幅 し、 得られた増幅産物を 1. 5%ァガロースゲル電気泳動した結果を示した図である 。 図中の一番左のレーンから、 DNAマーカー 「MK：」 、 メチルイ匕された DNAフラ グメント MYの溶液 「MD」 （ネガティブコントロール） 、 メチル化されていない D NAフラグメント Yの溶液 「D」 (ネガティブコン卜ロール) 、 メチル化された DN Aフラグメント MYの溶液 「MC」 、 メチル化されていない DNAフラグメント Yの 溶液 「C」 、 メチル化された DNAフラグメント MYの溶液 「MB」 、 メチル化され ていない DNAフラグメント Yの溶液 「B」 、 メチル化された DNAフラグメント M Yの溶液 「MA」 、 メチルイ匕されていない DNAフラグメント Yの溶液 「A」 、 での 結果を示している。 図 4は、 実施例 4において、 調製されたサンプルから配列番号 53で示される塩基 配列からなる目的とする DN A領域におけるメチル化された DNAを PCRにて増幅 し、 得られた増幅産物を 1. 5%ァガロースゲル電気泳動した結果を示した図である 。 図中の一番左のレーンから、 DNAマーカー 「MK：」 、 メチノレイヒされた DNAフラ グメント MTの溶液 「MD」 （ネガティブコントロール） 、 メチル化されていない D N Aフラグメント Tの溶液 「D」 (ネガテイブコント口一ル) 、 メチル化された DN Aフラグメント MTの溶液 「MC」 、 メチル化されていない DNAフラグメント丁の 溶液 「C」 、 メチル化された DNAフラグメント MTの溶液 「MB」 、 メチル化され ていない DNAフラグメント Tの溶液 「B」 、 メチノレ化された DNAフラグメント M Tの溶液 「MA」 、 メチル化されていない DNAフラグメント Tの溶液 「A」 、 での 結果を示している。 図 5は、 実施例 5において、 配列番号 53で示される塩基配列からなる目的とする D N A領域におけるメチル化された D N Aを調製されたサンプルから P C Rにて増幅 し、 得られた増幅産物を 1. 5 %ァガロースゲル電気泳動した結果を示した図である 。 図中の一番左のレーンから、 DNAマーカー 「MK：」 、 メチル化酵母ゲノム DN A の溶液 「MD」 （ネガティブコントロール） 、 メチルイヒされていない酵母ゲノム DN Aの溶液 「D」 （ネガティブコントロール） 、 メチル化酵母ゲノム DN Aの溶液 「M C」 、 メチル化されていない酵母ゲノム DNAの溶液 「C」 、 メチル化酵母ゲノム D NAの溶液 「MB」 、 メチル化されていない酵母ゲノム DNAの溶液 「B」 、 メチル 化酵母ゲノム DNAの溶液 「MA」 、 メチル化されていない酵母ゲノム DNAの溶液 「A」 、 での結果を示している。 発明を実施するための形態
本発明における 「生物由来検体」 としては、 例えば、 細胞溶解液、 組織溶解液 （こ こでの組織とは、 血液、 リンパ節等を含む広義の意味である。 ） 若しくは、 哺乳動物 においては、 血漿、 血清、 リンパ液等の体液、 体分泌物 （尿や乳汁等） 等の生体試料 及びこれら生体試料から抽出して得られたゲノム DNAを挙げることができる。 また 該生物由来検体としては、 例えば、 微生物、 ウィルス等由来の試料も挙げられ、 この 場合には、 本発明における 「ゲノム DNAJ とは、 微生物、 ウィルスのゲノム DNA を意味するものである。 哺乳動物由来の検体が血液である場合には、 定期健康診断や 簡便な検查等での本発明の利用が期待できる。
ゲノム DNAを哺乳動物由来の検体から得るには、 例えば、 市販の DNA抽出用キ ット等を用いて DNAを抽出すればよい。
血液を検体として用いる場合には、 血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調 製し、 調製された血漿又は血清を検体として、 その中に含まれる遊離 DNA (胃癌細 胞等の癌細胞由来の DNAが含まれる） を分析すると、 血球由来の DN Aを避けて胃 癌細胞等の癌細胞由来の DNAを角军析することができ、 胃癌細胞等の癌細胞、 それを 含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
前記ゲノム DNA由来の DN A試料は、 該ゲノム D N Aが有する後述する目的とす る DNA領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなる DNA試料 であってもよく、 又は所定の方法により予め精製されてなる DNA試料であってもよ レ、。 通常、 遺伝子 （ゲノム DNA) を構成する塩基は 4種類である。 これらの塩基のう ち、 シトシンのみがメチル化されるという現象が知られており、 このような DNAの メチル化修飾は、 5' — CG— 3， で示される塩基配列 （Cはシトシンを表し、 Gは グァェンを表す。 以下、 当該塩基配列を 「CpG」 と記すこともある。 ） 中のシトシ ンに限られている。 シトシンにおいてメチル化される部位は、 その 5位である。 細胞 分裂に先立つ D NA複製に際して、 複製直後は铸型鎖の 「C p G」 中のシトシンのみ がメチル化された状態となるが、 メチル基転移酵素の働きにより即座に新生鎖の 「C p G J 中のシトシンもメチル化される。 従って、 D NAのメチル化の状態は、 D N A 複製後も、 新しい 2組の D NAにそのまま引き継がれることになる。 本発明における 「メチル化された D N Aj とは、 このようなメチル化修飾により生じた D N Aを意味 するものである。
本発明における 「C p G対」 とは、 C p Gで示される塩基配列と、 これに相補する C p Gが塩基対合してなる二本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。 本発明における 「目的とする D NA領域」 （以下、 目的領域と記すこともある。 ） は、 当該領域に含まれるシトシンのメチル化有無を調べようとする D N A領域であつ て、 少なくとも 1種類のメチル化感受性制限酵素の認識部位を有する。 例えば、 Lysy 1 oxidase, HRAS-like suppressor bA305P22. 2. 1、 Gamma filamin、 HAND1、 Homo log ue of RIKEN 2210016F16、 FLJ32130, PPARG angiopoietin- related protein, Thromb omodulin、 p53~responsive gene 2、 Fibrillin2 Neurofilaments^ disintegrin and meta丄丄 oproteinase domain 23、 G protein-coupled receptor 7、 G— protein couple d somatostatin and angiotensin - like peptide receptor Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2等の有用タンノ ク質遺 feナ のプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列中に 存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシンを一つ以上含む D N Aの領域等を挙 げることができる。 具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が Lysyl oxidase遺伝子である場合には 、. そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 (コーディング領域) の塩基配列 中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒ ト由来 の Lysyl oxidase遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモーター領域 とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列を挙げることができ、 より具体的には、 配列番 号 1で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AF270645に記載される塩基配列の 塩基番号 16001〜18661で示される塩基配列に相当する。 ） が挙げられる。 配列番号 1 で示される塩基配列においては、 ヒト由来の Lysyl oxidaseタンパク質のァミノ末端 のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 2031〜2033に示されており、 上記 ェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1957〜2661に示されている。 配列番号 1で示され る塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、 とりわけ配列番号 1で示される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在する C p G中のシ トシンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル 化状態 （hypermethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌細胞においてメチル 化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 1で示される塩基配列において、 塩基番号 1539、 1560、 1574、 1600、 1623、 1635、 1644、 1654、 1661、 1682、 1686、 16 96、 1717、 1767、 1774、 1783、 1785、 1787、 1795等で示されるシトシンを挙げること ができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が HRAS - like suppressor遺伝子であ る場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては 、 ヒト由来の HRAS - like suppressor遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置する プロモータ一領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、 より具 体的には、 配列番号 2で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AC068162に記载 される塩基配列の塩基番号 172001〜173953で示される塩基配列に相当する。 ） があげ られる。 配列番号 2で示される塩基配列においては、 ヒト由来の HRAS- like suppress or遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1743〜1953に示されている。 配列番号 2で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、 とりわ け配列番号 2で示される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在する C p G中のシトシンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち 、 高メチノレ化状態 （hypermethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌細胞にお いてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 2で示される塩基配列 において、 塩基番号 1316、 1341、 1357、 1359、 1362、 1374、 1390、 1399、 1405、 1409 、 1414、 1416、 1422、 1428、 1434、 1449、 1451、 1454、 1463、 1469、 1477、 1479、 14 83、 1488、 1492、 1494、 1496、 1498、 1504、 1510、 1513、 1518、 1520等で示されるシ トシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 bA305P22. 2. 1遺伝子である場合 には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 (コーディング領域) の塩基 配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒト 由来の bA305P22. 2. 1遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモーター領 域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列 番号 3で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AL121673に記載される塩基配列 の塩基番号 13001〜13889で示される塩基配列に相当する。 ) があげられる。 配列番号 3で示される塩基配列においては、 ヒト由来の bA305P22. 2. 1タンパク質のァミノ末端 のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 849〜851に示されており、 上記ェ クソン 1の塩基配列は、 塩基番号 663〜889に示されている。 配列番号 3で示される塩 基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、 とりわけ配列番号 3で 示される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在する C p G中のシトシ ンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状 態 （hypermethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌細胞においてメチノレイ匕頻 度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 3で示される塩基配列において、 塩基 番号 329、 335、 337、 351、 363、 373、 405、 424、 427、 446、 465、 472、 486等で示さ れるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Gamma filamin遺伝子である場 合には、 そのプロモータ一領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩 基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒ ト由来の Gamma filamin遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモータ 一領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 4で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AC074373に記載される塩基 配列の塩基番号 63528〜64390で示される塩基配列の相補的配列に相当する。 ) があげ られる。 配列番号 4で示される塩基配列においては、 ヒ ト由来の Gamma filaminタン パク質のアミノ末端のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 572〜574に示 されており、 上記ェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 463〜863に示されている。 配列 番号 4で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、 と りわけ配列番号 4で示される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在す る C p G中のシトシンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （ 即ち、 高メチル化状態 （hypermethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌細胞 においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 4で示される塩基 配列において、 塩基番号 329、 333、 337、 350、 353、 360、 363、 370、 379、 382、 384 、 409、 414、 419、 426、 432、 434、 445、 449、 459、 472、 474、 486、 490、 503、 505 等で示されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 HA D1遺伝子である場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 (コーディング領域) の塩基配列中 に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒト由来の HAND1遺伝子のェクソン 1と、 その 5， 上流に位置するプロモーター領域とが含まれ るゲノム D N Aの塩基酉 S列をあげることができ、 より具体的には、 酉&列番号 5で示さ れる塩基配列 （Genbank Accession No. 'AC026688に記載される塩基配列の塩基番号 243 03〜26500で示される塩基配列の相補的配列に相当する。 ) があげられる。 配列番号 5で示される塩基配列においては、 ヒト由来の HAND1タンパク質のァミノ末端のメチ ォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 1656〜1658に示されており、 上記ェクソ ン 1の塩基配列は、 塩基番号 1400〜2198に示されている。 配列番号 5で示される塩基 配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、 とりわけ配列番号 5で示 される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在する C p G中のシトシン は、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 (hypermethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌細胞においてメチル化頻度 が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 5で示される塩基配列において、 塩基番 号 1153、 1160、 1178、 1187、 1193、 1218、 1232、 1266、 1272、 1292、 1305、 1307、 13 16、 1356、 1377、 1399、 1401、 1422、 1434等で示されるシトシンをあげることができ る。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Homologue of RIKEN 2210016F1 6遺伝子である場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コ一デ ィング領域） の塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基 配列としては、 ヒト由来の Homologue of RIKEN 2210016F16遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあ げることができ、 より具体的には、 配列番号 6で示される塩基配列 （Genbank Access ion No. AL354733に記載される塩基配列の塩基番号 157056〜159000で示される塩基配 列の相補的塩基配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 6で示される塩基配列に おいては、 ヒト由来の Homologue of RIKEN 2210016F16遺伝子のェクソン 1の塩基配 歹 IJは、 塩基番号 1392〜1945に示されている。 配列番号 6で示される塩基配列中に存在 する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、 とりわけ配列番号 6で示される塩基配 列において C p Gが密に存在する領域中に存在する C p G中のシトシンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチルヒ頻度 （即ち、 高メチル化状態 （hypermethy lation) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌細胞においてメチルイヒ頻度が高いシトシ ンとしては、 例えば、 配列番号 6で示される塩基配列において、 塩基番号 1172、 1175 、 1180、 1183、 1189、 1204、 1209、 1267、 1271、 1278、 1281、 1313、 1319、 1332、 13 34、 1338、 1346、 1352、 1358、 1366、 1378、 1392、 1402、 1433、 1436、 1438等で示さ れるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 FLJ32130遺伝子である場合には 、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列 中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒト由来 の FLJ32130遺伝子のェクソン 1と、 その 5， 上流に位置するプロモーター領域とが含 まれるゲノム D NAの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 7で 示される塩基配列 （Genbank Accession No. AC002310に記載される塩基配列の塩基番 号 1〜2379で示される塩基配列の相補的塩基配列に相当する。 ） があげられる。 配列 番号 7で示される塩基配列においては、 ヒト由来の FLJ32130タンパク質のアミノ酸末 端のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 2136〜2138に示されており、 上 記ェクソン 1と考えられる塩基配列は、 塩基番号 2136〜2379に示されている。 配列番 号 7で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、 とり わけ配列番号 7で示される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在する C p G中のシトシンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチノレイヒ頻度 （即 ち、 髙メチル化状態 （hypermethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌細胞に おいてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 7で示される塩基配 列において、 塩基番号 1714、 1716、 1749、 1753、 1762、 1795、 1814、 1894、 1911、 19 15、 1925、 1940、 1955、 1968等で示されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 PPARG angiopoietin-related p rotein遺伝子である場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コ 一ディング領域） の塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む 塩基酉己列としては、 ヒト由来の PPARG angiopoietin-related protein遺伝子のェクソ ン 1と、 その 5， 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基 配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 8で示される塩基配列があげら れる。 配列番号 8で示される塩基配列においては、 ヒ ト由来の PPARG angioPoietin-r elated proteinタンパク質のァミノ末端のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩 基番号 717〜719に示されており、 上記ェクソン 1の 5 ' 側部分の塩基配列は、 塩基番 号 1957〜2661に示されている。 配列番号 8で示される塩基配列中に存在する C p Gで 示される塩基配列中のシトシン、 とりわけ配列番号 8で示される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在する C p G中のシトシンは、 例えば、 胃癌細胞等の 癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 (hypermethylation) ) を 示す。 さらに具体的には、 胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては 例えば、 配列番号 8で示される塩基配列において、 塩基番号 35、 43、 51、 54、 75、 85 、 107、 127、 129、 143、 184、 194、 223、 227、 236、 251、 258等で示されるシトシン をあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Throtnbomodul in遺伝子である場 合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩 基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒ ト由来の Thrombomodulin遺伝子のェクソン 1と、 その 5， 上流に位置するプロモータ 一領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 9で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AF495471に記載される塩基 配列の塩基番号 1〜6096で示される塩基配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 9で示される塩基配列においては、 ヒ ト由来の Thrombomodulinタンパク質のアミノ末 端のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 2590〜2592に示されており、 上 記ェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 2048〜6096に示されている。 配列番号 9で示さ れる塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、 とりわけ配列番 号 9で示される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在する C p G中の シトシンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高メチ ノレ化状態 （hypermethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌細胞においてメチ ル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 9で示される塩基配列において 、 塩基番号 1539、 1551、 1571、 1579、 1581、 1585、 1595、 1598、 1.601、 1621、 1632、 1638、 1645、 1648、 1665、 1667、 1680、 1698、 1710、 1724、 1726、 1756等で示される シトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 p53- responsive gene 2遺伝子 である場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領 域） の塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列とし ては、 ヒト由来の p53 - responsive gene 2遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位 置するプロモーター領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 1 0で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AC00947 1に記載される塩基配列の塩基番号 113501〜116000で示される塩基配列の相補的配列 に相当する。 ） があげられる。 配列番号 1 0で示される塩基配列においては、 ヒト由 来の p53- responsive gene 2遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1558〜： 1808 に示されている。 配列番号 1 0で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩 基配列中のシトシンは、 例えば、 膝臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （ 即ち、 高メチル化状態 （hypermethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 瞎臓癌細 胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 1 0で示される 塩基配列において、 塩基番号 1282、 1284、 1301、 1308、 1315、 1319、 1349、 1351、 13 57、 1361、 1365、 1378、 1383等で示されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Fibrillin遺伝子である場合に は、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 (コーディング領域) の塩基配 列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒト由 来の Fibrillin2遺伝子のェクソン 1と、 その 5， 上流に位置するプロモーター領域と が含まれるゲノム D NAの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 1 1で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AC113387に記載される塩基配列の 塩基番号 118801〜121000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。 ) があげられ る。 配列番号 1 1で示される塩基配列においては、 ヒト由来の Fibrillin遺伝子のェ クソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1091〜1345に示されている。 配列番号 1 1で示され る塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシンは、 例えば、 膝臓癌 細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 （hypermethylati on) ) を示す。 さらに具体的には、 藤臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシン としては、 例えば、 配列番号 1 1で示される塩基配列において、 塩基番号 679、 687、 690、 699、 746、 773、 777、 783、 795、 799、 812、 823、 830、 834、 843等で示される シトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Neurof i lament3遺伝子である場 合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩 基配列中に存在する C Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒ ト由来の Neurofilaments遺伝子のェクソン 1と、 その 5， 上流に位置するプロモータ 一領域とが含まれるゲノム D NAの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 1 2で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AF106564に記载される塩 基配列の塩基番号 28001〜30000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。 ） があ げられる。 配列番号 1 2で示される塩基配列においては、 ヒ ト由来の Neurofilaments 遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 614〜1694に示されている。 配列番号 1 2で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシンは、 例え ば、 膝臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 （hype rmethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 瞎臓癌細胞においてメチル化頻度が高 ぃシトシンとしては、 例えば、 配列番号 1 2で示される塩基配列において、 塩基番号 428、 432、 443、 451、 471、 475、 482、 491、 499、 503、 506、 514、 519、 532、 541、 5 44、 546、 563、 566、 572、 580等で示されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 disintegrin and metalloprote inase domain 23遺伝子である場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻 訳領域 （コーディング領域） の塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一 つ以上含む塩基配歹としては、 ヒト由来の disintegrin and metalloproteinase doma in 23遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモーター領域とが含まれ るゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 1 3で示 される塩基配列 （Genbank Accession No. AC009225に記載される塩基配列の塩基番号 2 1001〜23300で示される塩基配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 1 3で示さ れる塩基配歹 IJにおいては、 ヒト由来の disintegrin and metalloproteinase domain 2 3遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1194〜1630に示されている。 配列番号 1 3で示される塩基配列中に存在する CpGで示される塩基配列中のシトシンは、 例え ば、 瞎臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 （hype rmethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 膝臓癌細胞においてメチル化頻度が高 ぃシトシンとしては、 例えば、 配列番号 1 3で示される塩基配列において、 塩基番号 998、 1003、 1007、 1011、 1016、 1018、 1020、 1026、 1028、 1031、 1035、 1041、 1043 、 1045、 1051、 1053、 1056、 1060、 1066、 1068、 1070、 1073、 1093、 1096、 1106、 11 12、 1120、 1124、 1126等で示されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 G protein-coupled receptor 7 遺伝子である場合には、.そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディ ング領域） の塩基配列中に存在する C Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配 列としては、 ヒト由来の G protein-coupled receptor 7遺伝子のェクソン 1と、 その 5， 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノム D NAの塩基配列をあげる ことができ、 より具体的には、 配列番号 1 4で示される塩基配列 （Genbank Accessio n No. AC009800に記載される塩基配列の塩基番号 75001〜78000で示される塩基配列に 相当する。 ） があげられる。 配列番号 1 4で示される塩基配列においては、 ヒ ト由来 の G protein-coupled receptor 7遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1666〜 2652に示されている。 配列番号 1 4で示される塩基配列中に存在する C p Gで示され る塩基配列中のシトシンは、 例えば、 勝臓癌細胞等の癌細胞において高いメチルイ匕頻 度 （即ち、 高メチル化状態 （hypermethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 膝臓 癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 1 4で示さ れる塩基配列において、 塩基番号 1480、 1482、 1485、 1496、 1513、 1526、 1542、 1560 、 1564、 1568、 1570、 1580、 1590、 1603、 1613、 1620等で示されるシトシンをあげる ことができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 G- protein coupled somatostat in and angiotensin - like peptide receptor遑 is子でめる場合には、 そのフ口モータ 一領域、 のプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基 配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒト 由来の G - protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺 伝子のェクソン 1と、 その 5， 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 1 5で示される塩 基配列 （Genbank Accession No. AC008971に記載される塩基配列の塩基番号 57001〜60 000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 1 5で 示さ る塩基酉己歹に; レヽては、 ヒ卜由来の G—protein coupled somatostatin and ang iotensin - like peptide receptor遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 776〜2 632に示されている。 配列番号 1 5で示される塩基配列中に存在する C p Gで示され る塩基配列中のシトシンは、 例えば、 膝臓癌細胞等の癌細胞において高いメチルイ匕頻 度 （即ち、 高メチル化状態 （hypermethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 膝臓 癌細胞においてメチルイヒ頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 1 5で示さ れる塩基配列において、 塩基番号 470、 472、 490、 497、 504、 506、 509、 514、 522、 5 40、 543、 552、 566、 582、 597、 610、 612等で示されるシトシンをあげることができ る。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Solute carrier family 6 neur otransmitter transporter noradrenalm member 2遺 feナで、ある場合には、 そのプロ モーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列中に存在す る C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒト由来の Solute c arrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalm member 2遺 ナのェ クソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノム D N Aの 塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 1 6で示される塩基配列 （ Genbank Accession No. AC026802に記載される塩基配列の塩基番号 78801〜81000で示 される塩基配列の相捕的配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 1 6で示される 塩基酉 ti歹' Jにおレヽては、 ヒト由来の Solute carrier family 6 neurotransmitter trans porter noradrenalin member 2遺伝子のェクソン 1，の塩基配列は、 塩基番号 1479〜18 04に示されている。 配列番号 1 6で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される 塩基配列中のシトシンは、 例えば、 膝臓癌細胞等の癌細胞において高いメチルイ匕頻度 (即ち、 高メチル化状態 （hypermethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 睦臓癌 細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 1 6で示され る塩基配列において、 塩基番号 1002、 1010、 1019、 1021、 1051、 1056、 1061、 1063、 1080、 1099、 1110、 1139、 1141、 1164、 1169、 1184等で示されるシトシンをあげるこ とができる。
「メチル化 D N A抗体」 とは、 D NA中のメチル化された塩基を抗原として結合す る抗体を意味する。 具体的には、 メチルシトシン抗体であり、 一本鎖 D N A中の 5位 がメチル化されたシトシンを認識して結合する性質を有している抗体を挙げることが できる。 。 ま fこ、 市販されているメチル化 DNA抗体であっても、 本特許記載のメチル 化状態の D N Aを特異的に認識して、 特異的に結合できる抗体であればよい。
メチル化 DNA抗体は、 メチル化された塩基、 メチル化 D NA等を抗原として、 通常 の方法により作成できる。 具体的にメチルシトシン抗体を作成するためには、 5—メ チルシチジン、 5—メチルシトシン、 或いは、 5—メチルシトシンを含む D N A等を 抗原として作製された抗体から D N A中のメチルシトシンへの特異的な結合を指標と して選抜することで作製できる。
動物に抗原を免疫して得られる抗体としては、 精製した抗原を免疫した後、 I g G 画分の抗体 （ポリクローナル抗体） を利用する方法と、 単一のクローンを生産する抗 体 (モノクローナル抗体) を利用する方法がある。 本特許ではメチル化 D NA、 或い はメチルシトシンを特異的に認識できる抗体であることが望ましいため、 モノクロ一 ナル抗体を利用することが望ましい。 モノクローナル抗体を作製する方法としては、 細胞融合法による方法を挙げること ができる。 例えば、 細胞融合法は免疫したマウス由来の脾細胞 （B細胞） と骨髄腫細 胞とを細胞融合させることでハイプリ ドーマを作製し、 ハイプリ ドーマの生産する抗 体を選抜して、 メチルシトシン抗体 （モノクローナル抗体） を作製できる。 細胞融合 法でモノクローナル抗体を作製する場合は、 抗原を精製する必要がなく、 例えば、 5 ーメチルシチジン、 5ーメチルシトシン、 又は、 5—メチルシトシンを含む D N A等 の混合物を抗原として、 免疫に用いる動物に投与できる。 投与方法としては、 5—メ チルシチジン、 5〜メチルシトシン、 又は、 5—メチルシトシンを含む D N A等を、 直接、 抗体を産生させるマウスへ投与する。 抗体が産生されにくい場合は、 抗原を支 持体へ結合させて免疫しても良い。 また、 アジュパント溶液 （例えば、 流動パラフィ ンと A r a c e 1 Aを混合し、 アジュバントとして結核菌の死菌を混合したもの) と抗原をよく混合することや、 リボソームに組み入れて免疫することで、 抗原の免疫 性を上げることができる。 或いは、 抗原を含む溶液とアジュバント溶液を等量添カロし 、 十分に乳液状にしてから、 マウスの皮下或いは腹腔内に注射する方法や、 ミヨゥバ ン水とよく混合してから百日咳死菌をアジュバントとして添加する方法がある。 尚、 最初の免疫をしてから適当な期間の後、 マウスの腹腔内或いは静脈内に追加免疫する こともできる。 また、 抗原の量が少ない場合には、 抗原が浮遊する溶液を、 直接マウ ス脾臓に注入して免疫しても良い。
最終免疫から数日後に脾臓を摘出し脂肪組織を剥離してから、 脾細胞浮遊液を作製 する。 この脾細胞と、 例えば H G P R T欠損骨髄腫細胞とを細胞融合してハイプリ ド 一マを作製する。 細胞融合剤としては脾細胞 （B細胞） と骨髄腫細胞を効率的に融合 できる方法ならば何でもよく、 例えば、 センダイウィルス (HV J ) 、 ポリエチレン グリコール ( P E G) を用いる方法などが挙げられる。 また、 高電圧パルスを用いる 方法で細胞融合をしても良い。 '
細胞融合操作の後、 H A T培地で培養し、 脾細胞と骨髄 S重細胞が融合したハイブリ ドーマのクローンを選択し、 スクリ一ニングが可能になるまで細胞が成育するのを待 つ。 目的とする抗体を生産するハイプリ ドーマを選択するための抗体の検出法や抗体 力価の測定法には、 抗原抗体反応系を利用できる。 具体的には、 可溶性抗原に対する 抗体測定法で、 放射性同位元素免疫定量法 （R I A) 、 酵素免疫定量法 （E L I S A ) などが挙げられる。
—本鎖 D NA中に存在する C p Gがー箇所以上メチル化されていれば抗メチル化抗 体と結合することができる。 従って、 本発明における 「メチルイ匕された一本鎖 D N A 」 とは、 一本鎖 D N A中に存在する C p Gがー箇所以上メチル化されている一本鎖 D NAを意味しており、 一本鎖 D NA中に存在する C p Gの全てがメチル化されている 一本鎖 D N Aに限った意味ではない。 本発明における 「 （目的とする DNA領域におけるメチル化された DNAを検出可 能な量になるまで増幅し、 ） 増幅された DN Aの量」 とは、 生物由来検体に含まれる ゲノム DNA中の目的領域におけるメチル化された D N Aの増幅後の量そのもの、 即 ち、 本発明の後述する第三工程で求めた量を意味するものである。 例えば、 生物由来 検体が lmLの血清であった場合には、 血清 lmL中に含まれる前記のメチル化され た D N Aに基づいて増幅された D N Aの量を意味する。 第一工程において、 生物由来検体に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料をメチ ル化感受性制限酵素による消化処理を行う。
「メチル化感受性制限酵素」 とは、 例えば、 メチルイ匕されたシトシンを含む認識配 列を消化せず、 メチル化されていないシトシンを含む認識配列のみを消化することの できる制限酵素等を意味する。 即ち、 メチル化感受性制限酵素が本来認識することが できる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されている DN Aの場合には、 該メチ ルイ匕感受性制限酵素を該 DN Aに作用させても、 該 DN Aは切断されない。 これに対 して、 メチル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシト シンがメチル化されていない DNAの場合には、 該メチル化感受性制限酵素を該 DN Aに作用させれば、 該 DNAは切断される。 このようなメチル化感受性酵素の具体的 な例としては、 例えば、 生物由来検体に含まれるゲノム DNAが有する目的とする D NA領域の中に認識切断部位を有する制限酵素である HpaII、 BstUI、 Narl、 SacII、 Hhal等を挙げることができる。 尚、 前記のメチル化感受性制限酵素は、 すでに
Gruenbaumらにより明らかにされている （Nucleic Acid Research, 9、 2509- 2515) 。 メチル化感受性制限酵素による消化の有無を調べる方法としては、 具体的には例え ば、 前記 DNAを錄型とし、 解析対象とするシトシンを認識配列に含む DNAを増幅 可能なプライマー対を用いて PC Rを行い、 DNAの増幅 （増幅産物） の有無を調べ る方法を挙げることができる。 解析対象とするシトシンがメチル化されている場合に は、 増幅産物が得られる。 一方、 解析対象とするシトシンがメチル化されていない場 合には、 増幅産物が得られない。 このようにして、 増幅された DNAの量を比較する ことにより、 解析対象となるシトシンのメチル化されている割合を測定することがで きる。
即ち、 生物由来検体に含まれるゲノム DNAがメチル化されていれば、 前記のメチ ル化感受性制限酵素がメチル化状態である D N Aを切断しな!/、という特性を利用する ことにより、 前記の生物由来検体に含まれるゲノム DNAにおける前記のメチル化感 受性制限酵素の認識部位の中に存在している C p G対におけるシトシンがメチルイ匕さ れていたか否かを区別することができる。 即ち、 前記のメチル化感受性制限酵素で消 化処理することにより、 仮に生物由来検体中に含まれるゲノム DNAにおける前記の メチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも 1つの C p G対に おけるシトシンがメチル化されていないのであれば、 該メチル化感受性制限酵素によ り切断される。 また仮に生物由来検体に含まれるゲノム D N Aにおける前記のメチル 化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している全ての C p G対におけるシトシンが メチル化されていたのであれば、 該メチル化感受性制限酵素により切断されない。 従 つて、 消化処理を実施した後、 後述のように、 前記の目的とする DNA領域を増幅可 能な一対のプライマーを用いた PC Rを実施することにより、 生物由来検体に含まれ るゲノム DNAにおける前記制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも 1つ の C p G対におけるシトシンがメチル化されていないのであれば、 P CRによる増幅 産物は得られず、 一方、 生物由来検体に含まれるゲノム DN Aにおける前記のメチル 化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している全ての C p G対におけるシトシンが メチル化されていたのであれば、 P CRによる増幅産物が得られることになる。 第一工程は、 具体的には例えば、 生物由来検体に含まれるゲノム DNAが哺乳類由 来のゲノム DNAの場合には、 以下のように実施すればよい。 哺乳類由来のゲノム D NAに、 最適な 10X緩衝液 （330mM Tris- Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM
MgOAc2、 5mM Dithiothreitol) を 3AIL、 lmg/mL BSA水溶液を 3;uL、 メチル化感受性 制限酵素 Hpall又は Hhal (lOU/^L) 等を夫々 1· 5μ L加え、 次いで該混合物に滅菌超純 水を加えて液量を とし、 37°Cで 1時間〜 3時間インキュベーションすればよい また第一工程における、 メチル化感受性制限酵素処理の好ましい態様としては、 マ スキング用オリゴヌクレオチドを添加する方法が挙げられる。 具体的には、 目的とす る DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） と、 メチル化感受性制限酵素の認識部位の 塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドと、 を混合す ることにより、 該メチル化感受性制限酵素の認識部位が保護されてなる一本鎖 DN A を選択する第一 （A) 工程と、 第一 （A) 工程で選択された一本鎖 DN Aをメチル化 感受性制限酵素で消化処理する第一 （B) 工程と、 から構成されてもよい。 具体的に. は例えば、 メチル化感受性制限酵素処理をするための溶液中にマスキング用オリゴヌ クレオチドを添加すればよい。
この第一 （A) 工程と第一 （B) 工程とを経ることによって、 生物由来検体に含ま れるゲノム DNA由来の DNA試料が一本鎖 DNAであっても、 二本鎖 DNAのみを 基質とするメチル化感受性制限酵素により消化することができる。 また、 第一 （A) 工程と第一 （B) 工程は連続して実施しても構わないし、 同時に実施しても構わない
「マスキング用オリゴヌクレオチド」 とは、 メチル化感受性制限酵素の認識部位の 塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、 一本鎖 DNA中の 目的とする DN A領域に含まれる数箇所あるメチルイヒ感受性制限酵素の認識配列のう ち、 少なくとも 1箇所 （全ての個所でも良い） と相補的に塩基対合することで二本鎖 を形成し （即ち、 前記箇所を二本鎖状態にして） 、 二本鎖 DNAのみを基質とするメ チル化感受性制限酵素でも前記箇所を消化できるように、 また、 試料が一本鎖 DN A である場合、 一本鎖 DN Aを消化できるメチル化感受性制限酵素 （一本鎖 DNAを消 化できるメチル化感受性制限酵素は二本鎖 DN Aも消化でき、 その消化効率は、 二本 鎖 DN Aに対する方が一本鎖 DNAに対するよりも高い） での前記箇所の消化効率を 向上させることができるようにするためのオリゴヌクレオチドであり、 且つ、 目的と する領域の DNAを含む一本鎖 DNAと一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとの二本鎖 の形成を阻害しないオリゴヌクレオチドを意味する。 また、 該マスキング用オリゴヌ クレオチドは、 後述のリバース用プライマー (正鎖) を伸長プライマーとして、 該マ スキング用オリゴヌクレオチド （負鎖） を錶型として、 伸長プライマーを伸長させる 反応に利用できないオリゴヌクレオチドでなければならない。 尚、 塩基長としては、 8〜2 0 0塩基長が望ましい。 ゲノム D N A由来の D N A試料に混合させるマスキング用オリゴヌクレオチドは、 1種類でもよく複数種類でも良い。 複数種類を用いると、 目的とする D NA領域を含 む一本鎖 D N Aのメチルイヒ感受性制限酵素の認識部位の多くが二本鎖状態になり、 メ チル化感受性制限酵素での、 後述の 「D NAの切れ残し」 を最小限に抑えることがで きる。 マスキング用オリゴヌクレオチドは、 例えば、 目的とする D N A領域に含まれ る数箇所あるメチル化感受性制限酵素の認識配列のうち、 メチル化している場合には 消化せずにメチル化していない場合には消化したい箇所 （例えば、 疾患患者検体では 100%メチル化されており、 健常者検体では 100%メチル化されていない箇所等） に応じ て設計し、 これを使用することが特に有用である。 尚、 第一工程におけるメチル化感受性制限酵素による消化処理での懸念点として、 メチル化されていないシトシンを含む認識配列を完全に消化できない （所謂 「D N A の切れ残し」 ） 虞を挙げることができる。 このような虞が問題となる場合には、 メチ ル化感受性制限酵素の認識部位が多く存在すれば、 「D N Aの切れ残し」 を最小限に 抑えることができるので、 目的とする D N A領域としては、 メチル化感受性制限酵素 の認識部位を 1つ以上有しており、 その認識部位が多ければ多いほどよいと考えられ る。 尚、 「生物由来検体に含まれるゲノム D N A由来の D N A試料」 力 該ゲノム D N Aが有する目的とする D N A領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理さ れてなる D N A試料であることを好ましい態様の一つとして挙げることができる。 こ こで、 生物由来検体に含まれるゲノム D N Aの消化物を固定化オリゴヌクレオチドで 選択する場合には、 短い铸型 D NAの方がより選択され易く、 また、 P C Rで目的領 域を増幅する場合にも、 铸型 D NAが短い方がよいと考えられるので、 目的とする D N A領域を認識切断部位としなレ、制限酵素を生物由来検体に含まれるゲノム D NA由 来の D N A試料に直接使用し消化処理を実施してもよい。 尚、 目的とする D N A領域 を認識切断部位としない制限酵素により消化処理する方法としては、 一般的な制限酵 素処理法を用いればよい。
これらの好ましい態様は、 生物由来検体そのものを予め上記のような制限酵素で消 化処理しておくことにより、 メチル化量を精度良く求めることができるためである。 該方法は、 上記のような 「D NAの切れ残し」 を無くすのに有用である。 生物由来検体に含まれるゲノム D N A由来の試料をメチル化感受性制限酵素により 消化する方法としては、 生物由来検体がゲノム D N A自体の場合には前記の方法と同 様な方法でよく、 生物由来検体が組織溶解液、 細胞溶解液等の場合には前記の方法と 同様な方法に準じて、 大過剰のメチル化感受性制限酵素、 例えば、 25ngの D NA量に 対して 500倍量 （10U) 又はそれ以上のメチル化感受性制限酵素を用いて消化処理を実 施すればよい。
ゲノム D NAは、 基本的には二本鎖 D N Aとして存在している。 したがって、 本操 作においては、 一本鎖を消化できるメチル化感受性制限酵素 （例えば、 Hhal) だけで なく、 二本鎖 D N Aを消化できるメチルイヒ感受' [·生制限酵素 （例えば、 HpaII、 BstUI、 Narl、 SacII、 Hhal等） を用いることができる。 他に、 第一工程の態様としては、 一本鎖 D NAを消化できるメチル化感受性制限酵 素での消化処理を実施せずに第二工程を実施する等を挙げることができる。 目的とす る D N A領域に一本鎖 D N Aを消化できるメチル化感受性制限酵素で切断される塩基 配列が無い場合には、 第一工程を実施せずに第二工程を実施しても構わない。 本発明測定方法の第二工程では、 第一工程で得られた消化処理が行われた D N A試 料からメチルイヒされた一本鎖 D N Aを取得し、 該一本鎖 D NAと、 固定化メチルイ匕 D N A抗体とを結合させて一本鎖 D N Aを選択する。 また、 第二工程は、 第一工程で得 られた消化処理が行われた D N A試料に含まれるメチル化されたニ本鎖 D N Aをメチ ル化された一本鎖 D NAに分離する第二 （A) 工程と、 第二 （A) 工程で得られたメ チル化一本鎖 D NAと固定化メチル化 D NA抗体と結合させる第二 （B ) 工程とから 構成されてもよい。 本発明測定方法の第二 （A) 工程において、 「第一工程で得られた消化処理が行わ れた D N A試料に含まれるメチル化されたニ本鎖 D N Aをメチル化された一本鎖 D N Aに分離する」 際、 二本鎖 D NAを一本鎖 D NAにするための一般的は操作を行えば よい。 具体的には、 生物由来検体に含まれるゲノム D NA由来の D NA試料を適当量 の超純水に溶解し、 95°Cで 10分間加熱し、 氷中で急冷すればよい。 第二 （B ) 工程においては、 第一工程で得られた D N Aから、 メチル化された一本 鎖 D N Aを、 固定化メチル化 D N A抗体とを結合させることにより選択する。 固定化 メチル化 DNA抗体は、 生物由来検体に含まれるゲノム D NA由来の D N A試料から、 メチノレ化された一本鎖 D N Aを選択するために用いられる。 また、 固定化メチルイ匕 DNA抗体は、 支持体に固定化され得るものであればよく、 「支持体に固定化され得る もの」 とは、 固定化メチル化 DNA抗体を支持体へ直接的、 或いは間接的に固定できる ことを意味する。 このように固定化されるためには、 固定化メチル化 DNA抗体を通常 の遺伝子工学的な操作方法又は市販のキット ·装置等に従って、 支持体に固定すれば よい （固相への結合） 。 具体的には、 固定化メチル化 DNA抗体をピオチン化して得ら れたビォチン化固定化メチル化 DNA抗体をストレプトァビジンで被覆した支持体 （例 えば、 ストレプトアビジンで被覆した P C Rチューブ、 ストレプトアビジンで被覆し た磁気ビーズ等) に固定する方法を挙げることができる。
また、 固定化メチル化 DNA抗体を、 アミノ基、 チオール基、 アルデヒド基等の活十生 官能基を有する分子を共有結合させた後、 シランカツプリング剤等で表面を活性ィ匕さ せたガラス、 多糖類誘導体、 シリカゲル、 或いは前記合成樹脂等、 若しくは耐熱性プ ラスチック製の支持体に共有結合させる方法もある。 尚、 共有結合には、 例えば、 ト リグリセライドを 5個直列に連結して成るようなスぺーサ一、 クロスリンカ一等によ り共有結合させる方法も挙げられる。
更に、 固定ィ匕メチル化 DNA抗体を直接支持体に固定ィ匕してもよく、 また、 固定化メ チル化 DNA抗体に対する抗体 （二次抗体） を支持体に固定ィヒし、 二次抗体にメチル化 抗体を結合させることで支持体に固定してもよい。
尚、 前記の目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） を選択する際に本固 定ィ匕固定化メチル化 DNA抗体が支持体に固定化されていればよく、 （1) 該一本鎖 D NA (正鎖） と本固定ィ匕固定ィ匕メチル化 DNA抗体との結合前に、 本固定化固定化メチ ルイ匕 DNA抗体と支持体との結合により固定化されるものであってもよく、 また （2) 該一本鎖 DNA (正鎖） と本固定化固定化メチル化 DNA抗体との結合後に、 本固定ィ匕 固定化メチル化 DNA抗体と支持体との結合により固定化されるものであってもよい。 第二 (B) 工程において、 Γメチル化された一本鎖 D N Aを、 固定化固定化メチル 化 DNA抗体と結合させることにより、 前記の一本鎖 DN Aを選択する」 際、 具体的に は例えば、 固定化固定ィ匕メチル化 DNA抗体として、 「ピオチン標識されたピオチン化 メチルシトシン抗体」 を使用して、 以下のように実施すればよい。
(a) ピオチン化メチルシトシン抗体を適当量 （例えば、 0. l g/50 tL) アビジン被 覆 PC Rチューブに添加し、 その後、 室温で約 1時間静置し、 ピオチン化メチルシト シン抗体とストレプトアビジンの固定化を促す。 その後、 残溶液の除去及び洗浄を行 う。 洗浄バッファー [例えば、 0.05% Tween20含有リン酸バッファー （lmM KH2P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7.4) ]を、 100 μ L/チューブの割合で添加し、 溶液を取り除く。 この洗浄操作を数回繰り返し、 支持体に固定化されたピオチン化メ チルシトシン抗体を PC Rチューブ内に残す。
(b) 生物由来検体に含まれるゲノム DNA由来の二本鎖 DNAをバッファー （例え ば、 33mM Tris- Acetate pH 7.9、 66mM K0Ac、 lOmM MgOAc2、 0.5mM Dithiothreitol) とを混合して、 95°Cで数分間加熱する。 その後、 約 0〜4°Cの温度まで速やかに冷 却し、 その温度で数分間保温し、 一本鎖 DN Aを形成させる。 その後、 室温に戻す。
(c) 形成された前記一本鎖 D N Aを、 ビォチン化メチルシトシン抗体が固定化され たアビジン被覆 PC Rチューブに添加し、 その後、 室温で約 1時間静置し、 ピオチン 化メチルシトシン抗体と、 前記一本鎖 DN Aのうちメチル化された一本鎖 DN Aとの 結合を促す （結合体の形成） （この段階で、 少なくともメチル化されてない DNA領 域を含む一本鎖 DNAは、 結合体を形成しない。 ） 。 その後、 残溶液の除去及び洗浄 を行う。 洗浄バッファー [例えば、 0.05% Tween20含有リン酸パッファー （ImM KH2P04 、 3raM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7.4) ]を、 100 μ L/チューブの割合で添加し 、溶液を取り除く。 この洗浄操作を数回繰り返し、 結合体を PC Rチューブ内に残す (結合体の選択） 。
(b) において使用するバッファ一としては、 生物試料由来のゲノム DNA由来の二 本鎖 DNAを一本鎖 DNAへ分離するために適していれば良く、 前記バッファーに限 つたわけではない。
(a) 及び （c) における洗浄操作は、 溶液中に浮遊している固定ィ匕されていない固 定ィ匕メチル化 DNA抗体、 固定化メチル化 DNA抗体に結合しなかった溶液中に浮遊してい るメチル化されていない一本鎖 DNA、 または、 後述の制限酵素で消化された溶液中 に浮遊している DNA等を反応溶液から取り除くため重要である。 尚、 洗浄バッファ 一は、 上記の遊離の固定ィ匕メチル化環 A抗体、 溶液中に浮遊している一本鎖 DNA等 の除去に適していれば良く、 前記洗浄バッファーに限らず、 DELF IAバッファー
(PerkinElmer社製、 Tris-HCl pH 7.8 with Tween 80) 、 TEバッファ一等でも良い
他に第二 （A) 工程において、 メチル化された一本鎖 DN Aを分離する際の好まし い態様としては、 カウンターオリゴヌクレオチドを添加すること等を挙げることがで きる。 カウンターオリゴヌクレオチドとは、 目的とする DNA領域と同じ塩基配列を 短いオリゴヌクレオチドに分割したものである。 通常 10〜100塩基、 より好まし くは、 20〜50塩基の長さに設計したものであればよい。 尚、 カウンターオリゴヌ クレオチドは、 フォーワード用プライマーあるいはリパース用プライマーが目的とす る DNA領域と相補的に塩基対合する塩基配列上には設計しない。 カウンターオリゴ ヌクレオチドは、 ゲノム DN Aに比し、 大過剰で添加され、 目的とする DN A領域を 一本鎖 （正鎖） にした後、 固定化メチルイヒ DNA抗体と結合させる際に、 目的とする DNA領域の相補鎖 （負鎖） と目的とする DNA領域を一本鎖 （正鎖） が相補性によ り再結合することを妨げるために添加する。 目的とする D N A領域にメチル化 DNA 抗体を結合させて、 DNAのメチル化頻度又はそれに相関関係のある指標値を測定す る際に、 目的領域が一本鎖である方がメチル化 DN A抗体に結合しやすいからである 。 尚、 カンウタ一オリゴヌクレオチドは、 目的とする DN A領域に比べて、 少なくと も 10倍、 通常は 100倍以上の量が添カ卩されることが望ましい。
Γメチル化された一本鎖 DNAを分離する際にカウンターオリゴヌクレオチドを添 加する」 とは、 具体的には、 生物由来検体に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料 から、 メチル化された一本鎖 DNAを選択するために、 生物由来生物由来検体に含ま れるゲノム DNA由来の DNA試料をカウンターオリゴヌクレオチドと混合して、 目 的とする DNA領域の相補鎖とカウンターオリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させ ればよレ、。 例えば、 前記 DNA試料と、 前記カウンターオリゴヌクレオチドを、 緩衝 液 (330mM Tris - Acetate pH 7.9、 660raM K0Ac、 lOOraM MgOAcい 5mM Dithiothreitol ) 5 / Lと、 lOOmMの M g C 12溶液 5 Lと、 lm g /m Lの B S A溶液 5 Lを 添加し、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 50 μ Lとし、 混合して、 9 5°Cで 10分間加熱し、 70°Cまで速やかに冷却し、 その温度で 10分間保温し、 次 いで、 50 °Cまで冷却し 10分間保温し、 さらに 37 °Cで 10分間保温した後、 室温 に戻せばよい。 第三工程において、 下記の各本工程の前工程として、 第二工程で選択された一本鎖 DNAを、 固定ィ匕固定ィ匕メチルイ匕 DNA抗体から分離して遊離の一本鎖状態の DNAに する工程 （第一前工程） と、
第一前工程で遊離の一本鎖状態にされたゲノム由来の DN A (正鎖） と、 一本鎖状態 である DNA (正鎖） が有する塩基配列の部分塩基配列 （正鎖） であって、 且つ、 前 記の目的とする DNA領域の塩基配列 （正鎖） の 3' 末端より更に 3' 末端側に位 置する部分塩基配列 （正鎖） 、 に対して相補性である塩基配列 （負鎖） を有する伸長 プライマー （フォーワード用プライマー） を伸長プライマーとして、 該伸長プライマ 一を 1回伸長させることにより、 遊離の一本鎖状態である DN A (正鎖） を二本鎖 D NAに伸長形成させる工程 （第二前工程） と、
第二前工程で伸長形成されたニ本鎖 D NAを、 目的とする DN A領域を含む一本鎖 D NA (正鎖） と目的とする DNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖 D NA (負鎖） に一旦分離する工程 （第三前工程） を有し、 且つ、 本工程として
(a) 生成した目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） を铸型として、 前 記フォヮ一ド用プライマーを伸長プライマーとして、 該伸長プライマーを一回伸長さ せることにより、 前記の目的とする DN A領域を含む一本鎖 DN Aを二本鎖 DN Aと して伸長形成させる第 A工程 （本工程） と、
(b) 生成した目的とする D N A領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖 D NA (負鎖） を铸型として、 前記の目的とする DNA領域に対して相補性である塩基 配列を含む一本鎖 DN A (負鎖） が有する塩基配列の部分塩基配列 （負鎖） であって 、 且つ、 前記の目的とする DNA領域の塩基配列 （正鎖） に対して相補性である塩基 配列 （負鎖） の 3' 末端より更に 3' 末端側に位置する部分塩基配列 （負鎖） 、 に 対して相補性である塩基配列 （正鎖） を有する伸長プライマー （リバース用プライマ 一） を伸長プライマーとして、 該伸長プライマーを 1回伸長させることにより、 前記 の目的とする DN A領域を含む一本鎖 DNAを二本鎖 DNAとして伸長形成させる第 B工程 （本工程） とを有し、
更に第三工程の各本工程を、 前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖 DN Aを 一本鎖状態に一且分離した後、 繰り返すことにより、 前記の目的とする DNA領域に おけるメチル化された D N Aを検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された D N Aの 量を定量する。 第三工程では、 まず、 下記の各本工程の前工程のうち第一前工程として、 第二工程 で選択された一本鎖 D N Aを固定化固定化メチル化 D N A抗体からー且分離して一本 鎖状態である DN Aにする。 具体的には例えば、 第二工程で選択された一本鎖 DN A に、 アニーリングバッファーを添加することにより、 混合物を得る。 次いで、 得られ た混合物を 95^で数分間加熱することにより、 一本鎖状態である DNA (正鎖） を 得る。 その後、 第二前工程では、 具体的には例えば、 第一前工程で得られた一本鎖状 態の DNA (正鎖） とフォワードプライマーを、 滅菌超純水を 17.85 μレ 最適な緩衝 液 （例えば、 lOOmM Tris - HC1 pH 8.3、 500mM KC1、 15mM MgClJ を 3;uL、 2mM dNTP を 3 レ 5N ベタインを 6;uL加え、 次いで該混合物に AmpliTaq (DNAポリメラーゼ の 1種： 5U// L) を 0.15 iLカ卩えて液量を 30μίとした溶液中で混合し、 37°Cで約 2時 間インキュベーションし、 目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） を二本 鎖 DNAに伸長形成させる。 第三前工程においては、 具体的には例えば、 第二前工程 で伸長形成された二本鎖 DNAに、 アニーリングバッファーを添加することにより混 合物を得て、 得られた混合物を 95°Cで数分間加熱することにより、 目的とする DN A領域を含む一本鎖 D N Aに一旦分離する。
その後、 本工程として、
(i) 生成した目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） に、 前記のフォヮ一 ド用プライマーをアニーリングさせるために、 例えば、 前記のフォワード用プライマ 一の Tm値の約 0〜20°C低い温度まで速やかに冷却し、 その温度で数分間保温する
(ii)その後、 室温に戻す。
(iii)上記（i)でアニーリングさせた前記の一本鎖状態である DNAを錶型として、 前 記のフォワード用プライマーを伸長プライマーとして、 該プライマーを 1回伸長させ ることにより、 前記の目的とする DN A領域に対して相補性である塩基配列を含む一 本鎖 DNAを二本鎖 DNAとして伸長形成させる （即ち、 第 A工程） 。 具体的には例 えば、 後述の説明や前述の本発明の第二前工程における伸長反応での操作方法等に準 じて実施すればよい。
(iv)生成した目的とする D N A領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖 D N A (負鎖） を铸型として、 前記の目的とする DN A領域を含む一本鎖 DN A (負鎖） が有する塩基配列の部分塩基配列 （負鎖） であって、 且つ、 前記の目的とする DN A 領域の塩基配列 （正鎖） に対して相補性である塩基配列 （負鎖） の 3' 末端より更 に 3' 末端側に位置する部分塩基配列 （負鎖） 、 に対して相補性である塩基配列 （ 正鎖） を有する伸長プライマー （リバース用プライマー） を伸長プライマーとして、 該伸長プライマーを 1回伸長させることにより、 前記の一本鎖状態である DN Aを伸 長形成された二本鎖 DNAとする （即ち、 第 B工程） 。 具体的には例えば、 上記 (iii)の A工程と同様に、 第二前工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施 すればよレ、。
(V)更に第三工程の各本工程を、 前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖 DN Aを一本鎖状態に一旦分離した後、 繰り返すこと （例えば、 第 A工程及び第 B工程） により、 前記の目的とする D N A領域におけるメチル化された D N Aを検出可能な量 になるまで増幅し、 増幅された D N Aの量を定量する。 第三工程は、 具体的には、 第一前工程から開始して本工程に至るまでの反応を、 一 つの PC R反応として実施することもできる。 また、 第一前工程から第三前工程まで 、 各々、 独立した反応として実施し、 本工程のみを PC R反応として実施することも できる。 選択された一本鎖 DNAに含まれる目的とする DNA領域 （即ち、 目的領域） を増 幅する方法としては、 例えば、 PCRを用いることができる。 目的領域を増幅する際 に、 予め蛍光等で標識されたプライマーを使用してその標識を指標とすれば、 電気泳 動等の煩わしい操作を実施せずに増幅産物の有無を評価できる。 P C R反応液として は、 例えば、 本努明の第二工程で得た DN Aに、 50μΜのプライマーの溶液を 0.15μ1 と、 2mM dNTPを 2.5μ1と、 10X緩衝液（lOOmM Tris- HC1 pH 8.3、 500mM KC1、 20mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 2.5^ 1と、 AmpliTaq Gold (耐熱性 DNAポリメラーゼの一 種： 5U/ 1)を 0.2μ1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 25 1とした反 応液を挙げることができる。
目的とする DNA領域 （即ち、 目的領域） は、 GCリッチな塩基配列が多いため、 時に、 ベタイン、 DMSO等を適量加えて反応を実施してもよい。 反応条件としては 、 例えば、 前記のような反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 95°Cにて 30秒間次い で 55〜65°Cにて 30秒間更に 72°Cにて 30秒間を 1サイクルとする保温を 30〜40サイクル 行う条件が挙げられる。 かかる PC Rを行った後、 得られた増幅産物を検出する。 例 えば、 予め標識されたプライマーを使用した場合には、 先と同様の洗浄'精製操作を 実施後、 蛍光標識体の量の測定により P C R反応での増幅量を評価することができる 。 また、 標識されていない通常のプライマーを用いた PCRを実施した場合は、 金コ ロイド粒子、 蛍光等で標識したプローブ等をアニーリングさせ、 目的領域に結合した 該プローブの量を測定することにより検出することができる。 また、 増幅産物の量を より精度よく求めるには、 例えば、 リアルタイム PCR法を用いればよい。 リアルタ ィム PCR法とは、 P CRをリアルタイムでモニターし、 得られたモニター結果を力 イネティックス分析する方法であり、 例えば、 遺伝子量に関して 2倍程度のほんのわ ずかな差異をも検出できる高精度の定量 PCR法として知られる方法である。 該リア ルタイム P CR法には、 例えば、 鎵型依存性核酸ポリメラーゼプローブ等のプローブ を用いる方法、 サイバーグリーン等のインター力レーターを用いる方法等を挙げるこ とができる。 リアルタイム PCR法のための装置及びキットは市販されるものを利用 してもよい。 以上の如く、 検出については特に限定されることはなく、 これまでに周 知のあらゆる方法による検出が可能である。 これら方法では、 反応容器を移し換える ことなく検出までの操作が可能となる。 本発明は、 下記のような場面において利用すればよい。
各種疾患 （例えば、 癌） において DNAのメチルイ匕異常が起こることが知られてお り、 この DN Aメチル化異常を検出することにより、 各種疾患の度合いを測定するこ とが可能と考えられている。
例えば、 疾患由来の生物由来検体に含まれるゲノム D N Aにおいて 100%メチル化 されている DNA領域があり、 その DNA領域について、 本発明を実施すれば、 メチ ル化された DNAの量は多くなり、 例えば、 疾患由来の生物由来検体に含まれるゲノ ム DNAにおいて 100%メチル化されていない DNA領域があり、 その DNA領域につ いて、 本発明を実施すれば、 メチル化された DNAの量はほぼ 0に近い値となるであ ろう。 また、 例えば、 健常者の生物由来検体に含まれるゲノム DNAにおいて低メチ ル化状態 （hypomethylation) で、 且つ、 疾患患者の生物由来検体に含まれるゲノム D N Aにおいて高メチル化状態 （hypermethylation) である D N A領域があり' ;'' 'その D NA領域について、 本発明を実施すれば、 健常者の場合には、 メチル化された D N Aの量は、 ◦に近い値を示し、 一方、 疾患患者の場合には、 健常者の場合における値 よりも有意に高い値を示すため、 この値の差異に基づき、 「疾患の度合い」 を判定す ることができる。 ここでの 「疾患の度合い」 とは、 一般に該分野において使用される 意味と同様であって、 具体的には、 例えば、 生物由来検体が細胞である場合には該細 胞の悪性度を意味し、 また、 例えば、 生物由来検体が組織である場合には該組織にお ける疾患細胞の存在量等を意味している。 更に、 生物由来検体が血漿 ·血清である場 合にはその個体が疾患を有する確率を意味している。 従って、 本発明は、 メチル化異 常を調べることにより、 各種疾患を診断することを可能にする。 このような本発明における、 目的領域のメチル化された D N A量の測定を行うため の各種方法で使用し得る制限酵素、 プライマー又はプローブは、 検出用キットの試薬 として有用である。 本発明は、 これら制限酵素、 プライマー又はプロ一ブ等を試薬と して含有する検出用キットや、 これらプライマー又はプローブ等が支持体上に固定化 されてなる検出用チップも提供しており、 本発明又は本発明メチル化割合測定方法の 権利範囲は、 該方法の実質的な原理を利用してなる前記のような検出用キットゃ検出 用チップのような形態での使用も含むものである。 実施例
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、 本発明はこれらに限定されるもので はない。
実施例 1
市販のメチルシトシン抗体 （Aviva Systems Biology社製） を、 市販ビォチン化キ ット （Biotin Labeling Kit- NH2、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載さ れた方法に準じて、 ビォチン標識した。 得られたピオチン標識メチルシトシン抗体を 溶液 [抗体約 0. 1 μ g/100 μ L 0. 1% BSA含有リン酸バッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na,HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) 溶液]として冷蔵保存した。 ストレプトアビジン被覆済み PCRチューブ （計 9本） に、 合成して得られたピオ チン標識メチルシトシン抗体溶液を各 50 μ Lの割合で添加し、 約 1時間室温で放置 して PCRチューブに固定化した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 100 t Lの洗浄パッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 該バッファーをピベッティン グにより取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した （以上、 本発明で使用する固定 化メチルイヒ DNA抗体の調製に相当する） 。 配列番号 1 7で示される塩基配列からなり H p a I Iの認識配列がメチル化されて いる部分メチルイ匕オリゴヌクレオチド GPR7— 2079— 21 76 / 98 m e r - M ( 7 )、 配列番号 18で示される塩基配列からなり H p a I Iの認識配列の一部がメ チル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチ GPR7-2079-21 76 /98me r— HM (5) 、 配列番号 19で示される塩基配列からなるアンメチル化 オリゴヌクレオチド GPR 7— 2079— 2176/98me r - UMを合成して、 夫々にっき 0. 001 pmo 1 /10 L T Eバッファー溶液を調製した。
<Hp a I Iの認識配列がメチル化されている部分メチル化ォリゴヌクレオチド> Nは 5-メチルシトシンを示す。
GPR7- 2079- 2176/98mer- M(7) ：
5， -
GGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3' (配列番号 1 7) く Hp a I Iの認識配列がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチド> Nは 5-メチルシトシンを示す。 ' GPR7-2079-2176/98mer-HM (5) ：
5' 一 GGGATCGTCACACTCGTCGTGC一 3 (配列番号 1 8)
<ァンメチル化ォリゴヌクレオチド >
GPR7-2079-2176/98mer-UM：
5, - GTTGGC
GGGATCGTCACACTCGTCGTGC—3， （配列番号 19) 得られた夫々の溶液 （各溶液について 3本ずつ調製） について、 以下の A処理、 B 処理または C処理を施した （各 1本ずつ調製） 。
A処理群 （無処理群） ：前記で調製したサンプルに、 緩衝液 （330raM Tr is- Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOniM MgOAc2、 5mM Dithiothreitol) を 5 ^ と、 B SA ( Bovine serum albumin lmg/mL) を 5 Lとを加えて、 更に該混合物に滅菌超純水を 加えて液量を 50 μ Lとした。
Β処理群 (Hp a I I処理群） ：前記で調製したサンプルに、 緩衝液 (330mM Tris-Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAcい 5mM Dithiothreitol) を 5 μ L と、 B SA (Bovine serum albumin lmg/mL) を 5 / Lと、 Hp a I Iを 10Uとを 加えて、 更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 50 μ Lとした。
C群 （マスキング用オリゴヌクレオチド添加 + Hp a I I処理群） ：前記で調製し たサンプルに、 緩衝液 （330mM Tris-Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithiothreitol) を 5 / Lと、 BSA (Bovine serum albumin lmg/ml) を 5 Lと、 Hp a I Iを 10Uと、 配列番号 20で示される塩基配列からなるオリゴヌク レオチド MAをマスキング用オリゴヌクレオチドとして 5 p mo 1加えて、 更に該混 合物に滅菌超純水を加えて液量を 5◦ Lとした。 ぐマスキング用オリゴヌクレオチド〉
GCCACCCGGCGCGA -3 (配列番号 20) 各々の反応液を 37 °Cで 1晚インキュベーションした。 （以上、 本発明の第一工程 に相当する） 前記のビォチン標識メチルシトシン抗体が固定ィ匕されたストレプトァビジン被覆済 み PCRチューブに、 前記で調製したオリゴヌクレオチド反応液 50 Lを加え、 室 温で 1時間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 100 Lの 洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファー （lniM KH2P04、 3mM Na2HP0 7H20 、 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 該バッファーをピペッティングにより取り除 いた。 この操作を更に 2回繰り返した （以上、 本発明の第二工程に相当する） 。 次に、 上記の PCRチューブに、 配列番号 21で示される塩基配列からなるプライ マー及び配列番号 22で示される塩基配列からなるプライマーの各溶液 （PF 1及び PR 1) 及び、 下記の反応条件を用いて PC Rを行うことにより、 目的とする DN A 領域 （GPR7-2079- 21 76、 配列番号 23、 メチルシトシンも Cで表す） に おけるメチルイ匕された D N Aを增幅した。
<プライマー >
-GTTGGCCACTGCGGAGTCG-3 (配列番号 21)
PR 1 ： 5 GCACGACGAGTGTGACGATC-3 (配列番号 22)
<目的とする DNA領域〉
GPR7-2079-2176 : 5， 一
Figure imgf000038_0001
GGGATCGTCACACTCGTCGTGC—3， (配列番号 23) PCRの反応液としては、 鎵型とする DNAに、 3 Mに調製された配列番号 21 で示される塩基配列からなるプライマーの溶液及び配列番号 22で示される塩基配列 からなるプライマーの溶液各 5 と、 each 2 mM dNTPを 5 ^Lと、 緩衝液 (lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KC1、 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 しと、 耐 熱性 DNAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold) 511/ しを 0. 25 ;uLと、 5Nベタイ ン水溶液を 10 μ Lとを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 ;zLとしたも のを用いた。 該反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 95°Cにて 30秒間次い で 59°Cにて 30秒間更に 72°Cにて 45秒間を 1サイクルとする保温を 25サイク ル行う条件で PC Rを行った。
PCRを行った後、 2%ァガロースゲル電気泳動により DNAの増幅を確認した （ 以上、 本発明の第三工程に相当する。 ） 。 その結果を図 1に示す。 A処理群 （無処理 群） の場合、 Hp a I Iの認識配列がメチル化されている部分メチル化オリゴヌタレ ォチド GPR7— 2079— 21 76/98me r— M (7) と、 H p a I Iの認識 配列の一部がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチド GPR 7— 20 79-21 76/98me r一 HM (5) では、 DNAの増幅が確認されその増幅産 物 （目的とする DNA領域： GPR7— 2079— 21 76) が得られた。 アンメチ ル化オリゴヌクレオチド GPR7— 2079— 21 76/98 m e r一 UMでは、 D NAの増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。 B処理群 （Hp a I I処理 群） の場合も、 A処理群と同様の結果であった。 C処理群 （マスキング用オリゴヌク レオチド添加 + Hp a I I処理群） の場合、 Hp a I Iの認識配列がメチルイ匕されて レヽる部分メチル化オリゴヌクレオチド G PR 7— 2079-21 76/98 m e r - M (7) では、 DNAの増幅が確認されその増幅産物 （目的とする DNA領域： GP R 7-2079-2176) が得られたが、 H p a I Iの認識配列の一部がメチル化 されていない部分メチル化オリゴヌクレオチド G PR 7— 2079-2176/98 me r— HM (5) 、 及び、 アンメチル化オリゴヌクレオチド G P R 7— 2079— 21 76/98me r _UMでは、 D N Aの増幅が確認されずその増幅産物は得られ なかった。 以上より、 固定化したメチルシトシン抗体で、 メチルイヒされた目的とする DNA镇 域を含む一本鎖 DNAを選択することが可能であること、 また、 マスキング用オリゴ ヌクレオチドを添カ卩 ·混合しメチルイ匕感受性制限酵素で処理することにより、 マスキ ング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチルイ匕感受性制限酵素認識部位がメチル化 されていない目的とする DNA領域を消化できること、 且つ、 前記の目的とする DN A領域におけるメチル化されていない D N Aを増幅することなく、 メチル化された D NAのみを検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された DNAの量を定量できること が確認された。 実施例 2
市販のメチルシトシン抗体 （Aviva Systems Biology社製） を、 市販ピオチン化キッ ト （Biotin Labeling Kit- NH2、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載され た方法に準じて、 ピオチン標識した。 得られたピオチン標識メチルシトシン抗体を溶 液 [抗体約 0.25 μΕ/μΙ 0.1% BSA含有リン酸バッファー （IraM KH2P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154fflM NaCl pH7.4) 溶液]として冷蔵保存した。 ストレプトアビジン被覆済み PCRチューブ （計 8本） に、 合成して得られたビォチ ン標識メチルシトシン抗体の 0.1 μ g/50 μ L溶液を各 50 Lの割合で添カ卩し、 約 1 時間室温で放置して PC Rチューブに固定ィヒした。 その後、 溶液をピペッティングに より取り除き、 l O O i Lの洗浄パッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファー （ ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 7H20、 15½M NaCl pH7.4) ]を添加した後、 当該バッファー をピペッティングにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （以上、 本発 明測定方法で使用する固定化メチル化 DNA抗体の調製に相当する） 。 クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノム DNAについて、 配列番号 24 で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及ぴ配列番号 25で示されるオリゴヌクレ ォチドプライマ一 （PF 2及ぴ PR 2) 及び以下の反応条件を用いて PC Rを行うこ とにより、 供試サンプルとして用いられる DN Aフラグメント （X、 配列番号 26、 Genbank Accession No. NT— 029419等に示される塩基番号 25687390- 256877ァ5に相当す る領域） を増幅した。 く PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー〉
P F 2 ： 5， - CTCAGCACCCAGGCGGCC -3' (配列番号 24)
PR 2 : 5' - CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3' (配列番号 25)
<DNAフラグメント >
X： 5' 一
Figure imgf000041_0001
GGCCAG -3' (配列番号 26)
PCRの反応液としては、 铸型とするゲノム DNAを 5 n gと、 5μΜになるよう 調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各 3 μ 1 と、 each 2 mM dNTP を 5 μΐと、 10 X緩衝液（lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KC1、 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 μ 1 と、 而ォ熱性 DNAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold, AB I社製） 5U/ Uを 0. 25 1 とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 1 とした ものを用いた。 当該反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 95°Cにて 30秒間 次いで 61°Cにて 30秒間更に 72°Cにて 45秒間を 1サイクルとする保温を 40サ イクル行う条件で P C Rを行った。
PCRを行った後、 1. 5%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、 Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） により、 D N Aフラグメント Xを精製した。 得られた DNAフラグメント溶液の一部について、 Sssl methylase (NEB社製）を 1 μ 1と、 1 0 xNEBuffer2 (NEB社製）を 1 0 1と、 S— adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製）を 1 1 とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 1 0 0 1 としたも のを調製した。 当該反応液を、 37°Cにて 1 5-3 0分間インキュベーションし、 さら に S- adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製）を 1 1を追加して 37°Cにて 1 5-3 0 分間インキュベーションした。 これを Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） によ り精製した。 さらにこれらの操作を 5回繰り返し、 メチル化した DN Aフラグメン卜 (MX, 配列番号 2 7) を得た。 く DNAフラグメント > (Nは 5 -メチルシトシンを示す)
MX： 5' 一
Figure imgf000042_0001
GGCCAG - 3' (配列番号 2 7) 得られた DNAフラグメント Xについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 A： 100pg/5/zL TE溶液
溶液 B ： 10pg/5 L TE溶液
溶液 C ： lpg/5 L TE溶液
溶液 D ： TE溶液 （ネガテイブコント口ール液） 得られた DNAフラグメント MXについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 MA： 100pg/5 L TE溶液
溶液 MB ： 10pg/5 L TE溶液
溶液 MC ： lpg/5 zL TE溶液 溶液 MD ： TE溶液 （ネガテイブコント口ール液) 前記の DN Aフラグメント Xの溶液及びメチ/レイヒした DNAフラグメント MXの溶液 の夫々について、 以下の処理を施した。 前記で調製した DN Aフラグメント溶液 5 Lに、 緩衝液 （330mM Tris- Acetate pH 7.9、 660raM K0Ac、 lOOraM MgOAc2、 5mM Dithiothreitol) を 2 /i Lと、 BSA ( Bovine serum albumin lmg/ml) を 2 Lと、 メチル化感受性制限酵素 H p a I Iを 12 Uを加え、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 20 Lとした各々の 混合液を 37 °Cで 3時間ィンキュベーションした （以上、 本発明測定方法の第一工程 に相当する） 。 配列番号 28で示される塩基配列からなる目的とする DNA領域 X' の負鎖に相補 性により塩基対合可能な配列番号 29〜配列番号 40で各々示される塩基配列からな るカウンターオリゴヌクレオチド C 1〜C 12を合成し、 夫々の濃度が 0. 01 である T Eバッファ一溶液を調製した。
<目的とする DNA領域〉
Figure imgf000043_0001
GGCCAG -3' (配列番号 28) ぐカウンターオリゴヌクレオチド>
C 1 ： 5' - GCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCG -3' (配列番号 29) c 2 ： 5， - GCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACG - 3， (配列番号 3 0 )
C 3 ： 5， - CGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGA - 3 ' (配列番号 3 1 )
c 4 ： 5， - AGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATG -3 ' (配列番号 3 2 )
c 5 ： 5， - ACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCC - 3， (配列番号 3 3 )
c 6 ： 5' - TAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGC - 3 ' (配列番号 3 4 )
c 7 ： 5' - CGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGG - 3， (配列番号 3 5 )
c 8 ： 5' - ATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACG - 3 ' (配列番号 3 6 )
c 9 ： 5 ' - ATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAAC - 3 ' (配列番号 3 7 )
c 1 0 ： 5' - TGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTC -3， (配列番号 3 8 ) c 1 1 ： 5， - CGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGG -3， (配列番号 3 9 ) c 1 2 ： 5' - CAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGG - 3， (配列番号 4 0 ) 前記の反応液に、 調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液 1 0 Z Lと、 緩衝液 (330mM Tris— Acetate H 7. 9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithiothreitol) 5 Lと、 lOOmMの M g C 1 2溶液 5 Lと、 lm g /m Lの B S A溶液 5 μ Lを添 加し、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 5 0 / Lとし、 混合した。 その 後、 本 P C Rチューブを 9 5 °Cで 1 0分間加熱し、 7 0 °Cまで速やかに冷却し、 その 温度で 1 0分間保温した。 次いで、 5 0 °Cまで冷却し 1 0分間保温し、 さらに 3 7 °C で 1 0分間保温した後、 室温に戻した （以上、 本発明測定方法の第二工程に相当する ) 。 前記のビォチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトァビジン被覆済 み P C Rチューブに、 前記で調製した D N Aフラグメントの反応液 5 0 を加え、 室温で 3 0分間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 1 ◦ 0 μ Lの洗浄パッファー [0. 05% Tween20含有リン酸パッファー （ImM ΚΗ, Ρ04、 3mM Na2HP0 7 0、 154mM NaCl pH7. 4) ]を添加した後、 当該バッファーをピペッティングにより 取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （以上、 本発明測定方法の第三工程に 相当する） 。 次に、 上記の PCRチューブに、 配列番号 24及び配列番号 25で各々示される塩 基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー PF 2及び PR 2の各溶液及び、 下記 の反応条件を用いて P CRを行うことにより、 配列番号 28で示される塩基配列から なる目的とする DN A領域 X ' におけるメチル化された D N Aを増幅した。 く PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 >
P F 2 ： 5' - CTCAGCACCCAGGCGGCC -3， （配列番号 24)
PR 2 : 5' - CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3 ' (配列番号 25 )
<目的とする DNA領域〉
X ： 5, 一
Figure imgf000045_0001
GGCCAG -3' (配列番号 28) PCRの反応液としては、 鎳型とする DNAに、 5 /Mに調製されたオリゴヌクレ ォチドプライマー溶液各 3 Lと、 each 2 mM dNTPを と、 緩衝液（lOOmM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KC1 15mM MgCl2 0.01% Gelatin)を 5 Lと、 而ォ熱性 DN Aポリメラーゼ （AmpliTaq Gold AB I社製） 5υ/ ίを 0. 25〃Lとを混合.し 、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 としたものを用いた。 当該反応液を、 9 5 °Cにて 10分間保温した後、 95 °Cにて 20秒間次いで 61 °Cにて 30秒間さらに 72°Cにて 30秒間を 1サイクルとする保温を 25サイクル行う条件で PC Rを行つ
I
PCRを行った後、 1. 5%ァガロースゲル電気泳動により DNAの増幅を確認し た （以上、 本発明測定方法の第四工程に相当する。 ） 。 その結果を図 2に示す。 メチ ル化された DNAフラグメント MXの溶液 MA、 MB及ぴ MCでは、 増幅が確認され その増幅産物が得られた。 ネガテイブコント口ール溶液 MDでは、 D N Aの増幅が確 認されずその増幅産物は得られなかった。 メチル化されていない DNAフラグメント Xの溶液 A、 B、 C及び Dでは、 DNAの増幅が確認されずその増幅産物は得られな かった。 以上より、 固定化したメチルシトシン抗体で、 メチル化された目的とする DNA領域 を含む DNAを選択することが可能であること、 また、 メチル化された DNAを検出 可能な量になるまで増幅し、 增幅された DNAをより高感度に検出できることが確認 された。 実施例 3
市販のメチルシトシン抗体 （Aviva, Systems Biology社製） を、 市販ピオチン化キッ ト （Biotin Labeling Kit_NH2、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載され た方法に準じて、 ビォチン標識した。 得られたピオチン標識メチルシトシン抗体を溶 液 [抗体約 0.25 μ g/V L 0, 1% BSA含有リン酸バッファー （ImM KH2 P04、 3niM Na2HP0 7 0、 154raM NaCl pH7.4) 溶液]として冷蔵保存した。 ストレプトアビジン被覆済み P CRチューブ （計 8本） に、 合成して得られたビォチ ン標識メチルシトシン抗体の 0.1 μ /50 /し溶液を各5 0 しの割合で添カ卩し、 約 1 時間室温で放置して P CRチューブに固定化した。 その後、 溶液をピペッティングに より取り除き、 l O O ^ Lの洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファー （ lmM KH2P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154raM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 当該バッファー をピペッティングにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （以上、 本発 明測定方法で使用する固定化メチルイ匕 DN A抗体の調製に相当する） 。 クロンテック社より 犛入されたヒト血液由来ゲノム DNAについて、 配列番号 4 1 及び配列番号 42で各々示されるオリゴヌクレオチドプライマー （PF 3及び PR 3 ) 及び以下の反応条件を用いて PC Rを行うことにより、 供試サンプルとして用いら れる DNAフラグメント （Y、 配列番号 43、 Genbank Accession No. ac009800等に 示される塩基番号 76606-76726に相当する領域） を増幅した。 く P C Rのために設計されたォリゴヌクレオチドプライマー〉
PF 3 : 5' - TGAGCTCCGTAGGGCGTCC -3， （配列番号 41)
PR 3 : 5' - GCGCCGGGTCCGGGCCC -3' (配列番号 42) ぐ DNAフラグメント >
Y： 5' - GCGCCGI
GGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3， （配列番号 43) PCRの反応液としては、 鏡型とするゲノム DNAを 5 n gと、 5μΜに調製され たオリゴヌクレオチドプライマー溶液各 3 1と、 each 2 mM dNTPを 5 1と 、 10 X緩衝液（lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KC1、 15mM MgClい 0.01% Gelatin) を 5 1と、 耐熱性 DNAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold, AB I社製） 5υ/μ1を 0 . 25 μ 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 μ 1としたものを用い た。 当該反応液を、 95 °Cにて 10分間保温した後、 95 °Cにて 30秒間次いで 60 °Cにて 30秒間更に 72 °Cにて 45秒間を 1サイクルとする保温を 50サイクル行う 条件で PC Rを行った。
PCRを行った後、 1. 5%ァガロースゲル電気泳動により DNAの増幅を確認し 、 Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） により、 DNAフラグメント Yを精製し た。 得られた DNAフラグメント溶液の一部について、 Sssl methylase (NEB社製）を 1 1と、 10 xNEBuffer 2 (NEB社製）を 10 1と、 S— adenosyl methionine (3.2 nil, NEB¾t®)を 1 1 とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 100 μ 1 としたも のを調製した。 当該反応液を、 37°Cにて 1 5-30分間インキュベーションし、 さら に S- adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製）を 1 μ 1を追加して 37°Cにて 15-30 分間インキュベーションした。 これを Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） によ り精製した。 さらにこの操作を 5回繰り返し、 メチル化した DNAフラグメント （M Y、 配列番号 44) を得た。 く DNAフラグメント > (Νは 5
MY： 5'
GNGCNGGC
GGAGCNGGNGACCTGGNGTCCCCCAAGGANGCCCTANGGAGCTCA -3' (配列番号 44) 得られた DNAフラグメント Yについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 A： 100pg/5 μ L TE溶液
溶液 B ： 10pg/5 L TE溶液
溶液 C ： lpg/5//L TE溶液
溶液 D ： TE溶液 （ネガティブコントロール液） 得られた DNAフラグメント MYについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 MA： lOOpg/S/^L TE溶液
溶液 MB ： 10pg/5; L TE溶液
溶液 MC ： lpg/5^L TE溶液
溶液 MD ： TE溶液 （ネガティブコントロール液） 前記の DNAフラグメント Yの溶液及びメチル化した DNAフラグメント MYの溶液 の夫々について、 以下の処理を施した。 前記で調製した DN Aフラグメント溶液 5 w Lに、 緩衝液 （330mM Tris- Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithiothreitol) を 2 Ai Lと、 B SA ( Bovine serum albumin lmg/ml) を 2 Lと、 メチル化感受性制限酵素 H p a I Iを 1 2 Uを加え、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 20 Lとした各々の 混合液を 37 °Cで 3時間インキュベーションした （以上、 本発明測定方法の第一工程 に相当する） 。 配列番号 45で示される塩基配列からなる目的とする DN A領域 Y' の負鎖に相 補性により塩基対合可能な配列番号 46、 塩基配列 47及び配列番号 48で各々示さ れる塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチド C 13、 C 14、 及び C 1 5を 合成し、 夫々の濃度が 0. 01 μΜである TEバッファー溶液を調製した。 く目的とする DNA領域〉
Figure imgf000049_0001
GGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3 ' (配列番号 45)
一オリゴヌクレオチド〉
C 1 3 - GCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA - 3 (配列番号 46)
C 14 - CTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTG - 3 (配列番号 47)
C 1 5 - CGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGG - 3 (配列番号 48) 前記の反応液に、 調製した力ゥンターオリゴヌクレオチド溶液 10 Lと、 緩衝液 (330mM Tris- Acetate H 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithiothreitol) と、 lOOmMの Mg C 12溶液 5 μ Lと、 lm g /m Lの B S A溶液 5 Lを添 加し、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 50 ;z Lとし、 混合した。 その 後、 本 PCRチューブを 95°Cで 10分間加熱し、 70°Cまで速やかに冷却し、 その 温度で 10分間保温した。 次いで、 50 °Cまで冷却し 10分間保温し、 さらに 37 °C で 10分間保温した後、 室温に戻した （以上、 本発明測定方法の第二工程に相当する 前記のピオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトァビジン被覆済 み PCRチューブに、 前記で調製した DNAフラグメントの反応液 50 を加え、 室温で 30分間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 100 // Lの洗浄パッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154niM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 当該バッファーをピペッティングにより 取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （以上、 本発明測定方法の第三工程に 相当する） 。 次に、 上記の PCRチューブに、 配列番号 41及び配列番号 42で各々示される塩 基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー PF 3及び PR 3の各溶液及ぴ、 下記 の反応条件を用いて PCRを行うことにより、 配列番号 45で示される塩基配列から なる目的とする DNA領域 Y' におけるメチル化された DNAを増幅した。
< P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一〉
P F 3 ： 5' - TGAGCTCCGTAGGGCGTCC -3， （配列番号 41 )
PR 3 : 5， - GCGCCGGGTCCGGGCCC -3' (配列番号 42)
<目的とする DNA領域 >
Figure imgf000050_0001
GGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA - 3' (配列番号 45)
PCRの反応液としては、 铸型とする DNAに、 5 μΜに調製されたオリゴヌクレ ォチドプライマー溶液各 3 Lと、 each 2 mM dNTPを 5 と、 緩衝液（lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KC1、 15mM MgClい 0.01% Gelatin)を 5； uLと、 而†熱性 DN Aポリメラーゼ （AmpliTaq Gold、 AB I社製） ！！/ しを。. 25 /zLとを混合し 、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 /^Lとしたものを用いた。 当該反応液を、 9 5 °Cにて 10分間保温した後、 95 °Cにて 20秒間次いで 60 °Cにて 30秒間さらに 72°Cにて 30秒間を 1サイクルとする保温を 25サイクル行う条件で P C Rを行つ た。
PCRを行った後、 1. 5%ァガロースゲル電気泳動により DN Aの増幅を確認し た （以上、 本発明測定方法の第三工程に相当する。 ） 。 その結果を図 3に示す。 メチ ル化された DNAフラグメント MYの溶液 MA、 MB及び MCでは、 増幅が確認され た。 ネガティブコントロール溶液 MDでは、 DNAの増幅が確認されなかった。 メチ ル化されていない DNAフラグメント Yの溶液 A、 B、 C及ぴ Dでは、 DNAの増幅 が確認されなかった。 以上より、 固定化したメチルシトシン抗体で、 メチル化された目的とする DN A領 域を含む DNAを選択することが可能であること、 また、 メチル化された DN Aを検 出可能な量になるまで増幅し、 増幅された D N Aをより高感度に検出できることが確 認された。 実施例 4
市販のメチルシトシン抗体 （Aviva Systems Biology社製） を、 市販ピオチン化キッ ト （Biotin Labeling Kit- NH2、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載され た方法に準じて、 ピオチン標識した。 得られたビォチン標識メチルシトシン抗体を溶 液 [抗体約 0.25 / し 0.1% BSA含有リン酸バッファー （lmM KH2P04、 3raM Na2HP0 7¾0、 154mM NaCl pH7.4) 溶液]として冷蔵保存した。 ストレプトアビジン被覆済み PCRチューブ （計 8本） に、 合成して得られたピオ チン標識メチルシトシン抗体の 0· 1 μ g/50 μ L溶液を各 50 ^ Lの割合で添加し、 約 1時間室温で放置して PCRチューブに固定化した。 その後、 溶液をピペッティング により取り除き、 l O O ^ Lの洗浄バッファ一 [0.05% Tween20含有リン酸バッファー (ImM KH2P04、 3raM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 当該バッファ ーをピペッティングにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した (以上、 本 発明測定方法で使用する固定化メチル化 DNA抗体の調製に相当する） 。 パン酵母酵母株 X 2180-1 Aを YPD培地 （1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6.0) で、 濁度が 0D6。。 0.6-1.0 になるまで培養し、 10， OOOgで 10分間遠心して、 lxlO7の酵母細胞を調製した。 調製した酵母細胞から、 Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、 —般的 な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、 バッファー A (1M ソルビトール、 0.1M EDTA、 pH 7.4) に 懸濁し、 0.1% 2-メルカプトエタノーノレ (終濃度 14mM) 及び 100U zymolase (10 mg/ml) を添加して、 溶液が透明になるまで 30° Cで 1時間、 撹拌しながらインキュ ペートした。 550gで 10分間遠心してプロトプラストを回収後、 バッファー B (50 mM Tris-HCl, pH 7.4、 20 mM EDTA) に懸濁してから、 ドデシル硫酸ナトリウムを 1 % (w/v) になるように加えた後、 65°Cで 30分間インキュベートした。 続いて、 体積 比 2/5量の 5M CH3 C00Kを添カ卩して混和してから 30分間氷冷後、 15, 000gで 30分間遠心し て上清を回収した。 回収した上清に体積比 1/10量の 3M CH3C00Naと等量のイソプロパ ノールを加えてよく混和し、 15， 000g 4 °Cで 30分間遠心して得られた沈澱を 70%ェ タノールでリンスして回収した。 沈澱を乾燥させてから、 1ml の TEバッファー （10 mM Tris- HC1、 pH 8.0、 1 mM EDTA) に溶解し、 40μ g/mlになるように RN a s e A (Sigma社製） を加えて 37°Cで 1時間ィンキュペートし、 続いて、 混合液に proteinase K (Sigma社製） を 500 g/m 1及びドデシル硫酸ナトリウムを 1 %
(w/v) になるように加えた後、 これを 55°Cで約 16時間振とうした。 振とう終 了後、 当該混合物をフヱノール [1M Tris-HCl (pH 8.0) にて飽和] ·クロ口ホルム抽 出処理した。 水層を回収し、 これに Na C lを 0. 5 Nとなるよう加えた後、 これを エタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。 回収された沈澱を 70%エタノール でリンスすることにより、 ゲノム DN Aを得た。
得られたゲノム DNAから、 配列番号 49及び配列番号 50で各々示されるオリゴ ヌクレオチドプライマー （PF 4及び PR 4) 及び以下の反応条件を用いて PC Rを 行うことにより、 供試サンプルとして用いられる DN Aフラグメント （T、 配列番号 5 1、 Genbank Accession No. NC— 001139等に示される酵母染色体 VIIの塩基番号 384569- 384685に相当する領域） を増幅した。
< P CRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー〉
P F 4 : 5' - GGACCTGTGTTTGACGGGTAT - 3， （配列番号 4 9)
PR4 : 5' - AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3' (配列番号 5 0 ) ぐ DNAフラグメント〉
T： 5' 一
TTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT - 3， （配列番号 5
P CRの反応液としては、 铸型とするゲノム DNAを 10n gと、 5μΜに調製され たオリゴヌクレオチドプライマー溶液各 3 1と、 each 2 mM (1^1丁？を5 1と 、 1 0 X緩衝液（lOOraM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KC1、 15raM MgCl2、 0.01% Gelatin) を 5 μ 1と、 耐熱性 DNAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold, AB I社製） 511/ 1を0 . 2 5 μ 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 5 0 1としたものを用い た。 当該反応液を、 9 5°Cにて 1 0分間保温した後、 9 5 °Cにて 2 0秒間次いで 5 8 °Cにて 3 0秒間更に 7 2°Cにて 3 0秒間を 1サイクルとする保温を 40サイクル行う 条件で P CRを行った。
P CRを行った後、 1. 5%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、 Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） により、 DNAフラグメント Tを精製した。 得られた DNAフラグメント溶液の一部について、 Sssl methylase (NEB社製）を 1 μ 1と、 1 0 xNEBuffer 2 (NEB社製）を 1 0 μ 1と、 S - adenosyl methionine (3.2 πιΜ, NEB社製）を 1 μ 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 1 0 0 μ 1としたも のを調製した。 当該反応液を、 37°Cにて 1 5-3 0分間インキュベーションし、 さら に S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製）を 1 μ 1を追加して 37°Cにて 15-30 分間インキュベーションした。 これを Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） によ り精製した。 さらにこの操作を 3回繰り返し、 メチル化した DN Aフラグメント （M T、 配列番号 52) を得た。 く DN Αフラグメント > (Nは 5-メチルシトシンを示す)
MT ： 5' -
GGACCTGTGTTTGANGGGTATAACACTAAGTTGNGCAATTTGCTGTATTGNGAAATCNGCCN TTGAGNGCATGTGCNGTTTCNGAGAANGCCAGATCTGTACT -3， （配列番号 52) 得られた DNAフラグメント Tについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 A： 100pg/5 a L TE溶液
溶液 B ： lOpg/S^L TE溶液
溶液 C ： lpg/5 L TE溶液
溶液 D ： TE溶液 （ネガテイブコント口ール液） 得られた DNAフラグメント MTについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 MA： 100ρ§/5μί TE溶液
溶液 MB ： 10ρε/5μί TE溶液
溶液1^じ ： 1 /5 し TE溶液
溶液 MD ： TE溶液 （ネガテイブコント口ール液） 前記の DN Aフラグメント Tの溶液及びメチル化した D N Aフラグメント MTの溶 液の夫々について、 以下の処理を施した。 前記で調製した DN Aフラグメント溶液 5 μ に、 緩衝液 （330mM Tris - Acetate pH 7.9、 660mM KOAcヽ lOOniM MgOAcい 5mM Dithiothreitol) を 2 ^ Lと、 B SA ( Bovine serum albumin lmg/ml) を 2 Lと、 メチル化感受性制限酵素 H p a I Iを 12Uを加え、 ·さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 20 μ Lとした各々の 混合液を 37 °Cで 3時間ィンキュベーションした （以上、 本発明測定方法の第一工程 に相当する） 。 配列番号 53で示される塩基配列からなる目的とする DNA領域 T' の負鎖に相補 性により塩基対合可能な配列番号 54〜配列番号 57で各々示される塩基配列からな るカウンターオリゴヌクレオチド C 16〜C 19を合成し、 夫々の濃度が 0. 01 /X Mである T Eバッファ一溶液を調製した。 く目的とする DN A領域 >
Figure imgf000055_0001
TTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3， （配列番号 53) くカウンターオリゴヌクレオチド>
C 16 : 5' 一 GGACCTGTGTTTGACGGGTAT _3， （配列番号 54)
C 17 ： 5' - AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3，. （配列番号 55)
C 18 ： 5， - ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3' (配列番号 56)
C 19 : 5' - CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC -3' (配列番号 57) 前記の反応液に、 調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液 10 t Lと、 緩衝液 ( 330mM Tris - Acetate H 7.9、 660raM KOAcゝ lOOmM MgOAc2、 5mM Dithiothreitol) 5 μ Lと、 lOOmMの M g C 1 2溶液 と、 11118/111 の83 A溶液 5 Lを添カロ し、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 50 Lとし、 混合した。 その後 、 本 PCRチューブを 95°Cで 10分間加熱し、 70 °Cまで速やかに冷却し、 その温 度で 10分間保温した。 次いで、 50 °Cまで冷却し 10分間保温し、 さらに 37 で 10分間保温した後、 室温に戻した （以上、 本発明測定方法の第二工程に相当する） 前記のビォチン標識メチルシトシン抗体が固定ィ匕されたストレプトアビジン被覆済み PCRチューブに、 前記で調製した DNAフラグメントの反応液 50 Lを加え、 室 温で 30分間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 100 μ L の洗浄パッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154raM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 当該バッファーをピペッティングにより 取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （以上、 本発明測定方法の第三工程に 相当する） 。 次に、 上記の PC Rチューブに、 配列番号 49及び配列番号 50で各々示される塩基 配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー P F 4及び PR 4の各溶液及び、 下記の 反応条件を用いて PCRを行うことにより、 配列番号 53で示される塩基配列からな る目的とする DN A領域 T ' におけるメチル化された D N Aを増幅した。 く P CRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 >
PF4 : 5， - GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号 49)
PR 4 : 5' - AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3' (配列番号 50 )
<目的とする DNA領域〉
Figure imgf000056_0001
TTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3， （配列番号 53)
PCRの反応液としては、 鎵型とする DNAに、 5 Μに調製されたオリゴヌクレオ チドプライマ一溶液各 3 zLと、 each 2 mM dNTPを 5 μίと、 緩衝液（lOOmM
Tris-HCl H 8.3、 500raM KC1、 15mM MgClい 0.01% Gelatin)を 5 と、 If熱性 DN Aポリメラーゼ （AmpliTaq Gold、 AB I社製） 5U//iLを 0. 25 //Lとを混合し 、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 Lとしたものを用いた。 当該反応液を、 9 5°Cにて 1 0分間保温した後、 9 5°Cにて 2 0秒間次いで 5 8°Cにて 3 0秒間さらに 7 2 °Cにて 3 0秒間を 1サイクルとする保温を 2 8サイクル行う条件で P C Rを行つ
P CRを行った後、 1. 5%ァガロースゲル電気泳動により DN Aの増幅を確認し た （以上、 本発明測定方法の第四工程に相当する。 ） 。 その結果を図 4に示す。 メチ ル化された DNAフラグメント MTの溶液 MA、 MB及ぴ MCでは、 DNAの増幅が 確認されその増幅産物が得られた。 ネガティブコントロール溶液 MDでは、 DNAの 増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。 メチル化されていない D N Aフラ グメント Tの溶液 A、 B、 C及び Dでは、 DNAの増幅が確認されずその増幅産物は 得られなかった。 以上より、 固定ィヒしたメチルシトシン抗体で、 メチル化された目的とする DNA領 域を含む DN Aを選択することが可能であること、 また、 メチル化された DN Aを検 出可能な量になるまで増幅し、 増幅された D N Aをより高感度に検出できることが確 認された。 実施例 5 '
市販のメチルシトシン抗体 （Aviva Systems Biology社製） を、 市販ピオチン化キ ット （Biot in Labeling Kit- NH2、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載さ れた方法に準じて、 ピオチン標識した。 得られたビォチン標識メチルシトシン抗体を 溶液 [抗体約 0.25 ug/^uL 0.1% BSA含有リン酸バッファ一 （lmM KH2P04、 3mM Na2HP0 7 0、 154mM NaCl pH7.4) 溶液]として冷蔵保存した。 ストレプトアビジン被覆済み P CRチューブ （計 8本） に、 合成して得られたピオ チン標識メチルシトシン抗体の 0.1 μ g/50 μ L溶液を各 5 0 Lの割合で添加し、 約 1時間室温で放置して P CRチューブに固定化した。 その後、 溶液をピペッティング により取り除き、 1 0 0 / Lの洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファー (ImM K¾P04、 3mM Na2HP0 7 0、 154mM NaCl pH7.4) ：]を添加した後、 当該バッファ ーをピペッティングにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （以上、 本 発明測定方法で使用する固定化メチルイ匕 DNA抗体の調製に相当する） 。 パン酵母酵母株 X 2180-1 Aを YPD培地 （1°/。 Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6.0) で、 濁度が 0D6。。 0.6-1.0 になるまで培養し、 10， OOOgで 10分間遠心して、 lxlO7の酵母細胞を調製した。 調製した酵母細胞から、 Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されてレヽるような、 一般白勺 な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、 バッファー A (1M ソルビトール、 0.1M EDTA、 pH 7.4) に 懸濁し、 0.1% 2_メルカプトエタノール （終濃度 14mM) 及び 100ひ zymolase (10 mg/ml) を添加して、 溶液が透明になるまで 30° Cで 1時間、 撹拌しながらインキュ ペートした。 550gで 10分間遠心してプロトプラストを回収後、 ノ ッファー B (50 mM Tris - HC1、 pH 7.4、 20 mM EDTA) に懸濁してから、 ドデシル硫酸ナトリゥムを 1 % (w/v) になるように加えた後、 65°Cで 30分間インキュベートした。 続いて、 体積 比 2/5量の 5M C¾ C00Kを添加して混和してから 30分間永冷後、 15， 000gで 30分間遠心し て上清を回収した。 回収した上清に体積比 1/10量の 3M CH3C00Naと等量のイソプロパ ノールを加えてよく混和し、 15, 000g 4 °Cで 30分間遠心して得られた沈澱を 70 %ェ タノールでリンスして回収した。 沈澱を乾燥させてから、 1ml の TEバッファー （10 mM Tris— HC1、 pH 8,0、 1 mM EDTA) に溶解し、 40μ g/mlになるように RN a s e A (Sigma社製） を加えて 37 °Cで 1時間インキュベートし、 続いて、 混合液に proteinase K (Sigma社製） を 500 μ g /m 1及ぴドデシル硫酸ナトリウムを 1 %
(w/v) になるように加えた後、 これを 55°Cで約 16時間振とうした。 振とう終 了後、 当該混合物をフエノール [1M Tris-HCl (pH 8.0) にて飽和] ·クロ口ホルム抽 出処理した。 水層を回収し、 これに Na C lを 0. 5 Nとなるよう加えた後、 これを エタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。 回収された沈澱を 70%エタノール でリンスすることにより、 ゲノム DN Aを得た。 得られた酵母ゲノム DNAの二部について、 Sssl methylase (NEB社製）を 1 μ 1と 、 10 NEBuffer2 (NEB社製）を 10 μ 1と、 S - adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社 製）を 1 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 100 μ 1としたものを 調製した。 当該反応液を、 37°Cにて 1 5-30分間インキュベーションし、 さらに S- adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製）を 1 μ 1を追加して 37。Cにて 15-30分間 インキュベーションした。 これを Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） により精 製した。 さらにこの操作を 3回繰り返し、 メチル化酵母ゲノム DN Aを得た。 得られた酵母ゲノム DNAについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 A： lOng/5/zL TE溶液
溶液 B ： Ing/5WL TE溶液
溶液 C： 0. lng/5/zL TE溶液
溶液 D： TE溶液 (ネガテイブコント口ール液） 得られたメチル化酵母ゲノム D N Aについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 MA： lOng/5 iL TE溶液
溶液 MB ： lng/5/zL TE溶液
溶液 MC： 0. lng/5 L TE溶液
溶液 MD： TE溶液 （ネガテイブコントロール液） 上記の酵母ゲノム DN Aの溶液及ぴメチル化酵母ゲノム DN Aの溶液の夫々について 、 以下の処理を施した。
PCRチューブに、 上記に調製したゲノム DNA溶液 5 と、 制限酵素 X s p I を 5 Uと、 X s p Iに最適な 10 x緩衝液 （200mM Tris-HCl pH 8.5、 lOOmM MgCl2、 lOmM Dithiothreitol, lOOOmM KC1) Ι μΐとを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液 量を 10 μ 1としたものを調製した。 当該反応液を、 37°Cにて 1時間インキュベーシ ョンした。 さらに上記の反応液に、 緩衝液 （330mM Tris- Acetate H 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithiothreitol) を と、 BSA (Bovine serum albumin lmg/ml ) を 2 μ Lと、 メチル化感受性制限酵素 H p a I Iを 12 Uを加え、 さらに当該混合 物に滅菌超純水を加えて液量を 20 μ Lとした各々の混合液を 37 で 3時間ィンキ ュベーシヨンした （以上、 本発明測定方法の第一工程に相当する） 。 配列番号 58で示される塩基配列からなる DNAフラグメント T' (Genbank Accession No. NC一 001139等に示される酵母染色体 VI Iの塩基番号 384523- 384ァ66に相 当する領域） の負鎖に相補性により塩基対合可能な配列番号 54〜配列番号 57及ぴ 配列番号 59〜配列番号 62で各々示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌク レオチド C 16〜C 23を合成し、 夫々の濃度が 0. 01 / Mである TEバッファー 溶液を調製した。
<DNAフラグメント >
丁， ： 5' 一
Figure imgf000060_0001
GGCCACGCCTCTAATC -3' (配列番号 58)
<カウ： /タ —オリゴヌクレオチド>
C 16 ： 5， - GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号 54)
C 1 7 ： 5' - AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3' (配列番号 55)
C 18 ： 5， - ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3' (配列番号 56 )
C 19 ： 5， - CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC - 3' (配列番号 57)
C 20 ： 5， - AATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCC - 3' (配列番号 59)
C 21 ： 5， - GCGATCGCACACGAGGAGACA -3， (配列番号 60)
C 22 ： 5， - AGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGAC -3' (配列番号 61) C 23 : 5' - AAATGAACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC -3' (配列番号 62) 前記の酵母ゲノム DN A及びメチル化酵母ゲノム DN Aの夫々の反応液について、 以下の処理を施した。
前記の反応液に、 調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液 10 Lと、 緩衝液 (330mM Tris- Acetate pH 7.9、 66O111M K0Ac、 lOOmM MgOAcい 5mM Dithiothreitol) 5 μ Lと、 lOOmMの M g C 12溶液 と、 1111 §/1111^の：83 A溶液 5 Lを添 加し、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 50 Lとし、 混合した。 その 後、 本 PCRチューブを 95°Cで 10分間加熱し、 70°Cまで速やかに冷却し、 その 温度で 10分間保温した。 次いで、 50 °Cまで冷却し 10分間保温し、 さらに 37 °C で 10分間保温した後、 室温に戻した （以上、 本発明測定方法の第二工程に相当する
) o 前記のピオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトァビジン被覆済 み PC Rチューブに、 前記で調製した DN Aフラグメントの反応液 5 をカ卩え、 室温で 30分間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 100 μ Lの洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 当該バッファーをピぺッティングにより 取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （以上、 本発明測定方法の第三工程に 相当する） 。 次に、 上記の PCRチューブに、 配列番号 49及ぴ配列番号 50で各々示される塩 基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマ一 P F 4及び P R 4の各溶液及ぴ、 下記 の反応条件を用いて PCRを行うことにより、 配列番号 53で示される塩基配列から なる目的とする DNA領域 T， におけるメチルイ匕された DNAを增幅した。
<PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー > P F 4 ： 5' - GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号 49)
PR4 : 5' - AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3' (配列番号 50 ) く目的とする DNA領域〉
Figure imgf000062_0001
TTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3' (配列番号 53)
PCRの反応液としては、 鏡型とする DNAに、 5 Mに調製されたオリゴヌクレ ォチドプライマ一溶液各 3 と、 each 2 mM dNTPを 5 Lと、 緩衝液（ΙΟΟηιΜ Tris-HCl pH 8.3、 500raM KC1、 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 /zLと、 而ォ熱性 DN Aポリメラーゼ （AmpliTaq Gold、 AB I社製） 511 しを0. 25 /zLとを混合し 、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 としたものを用いた。 当該反応液を、 9 5 °Cにて 10分間保温した後、 95 °Cにて 20秒間次いで 58 °Cにて 30秒間さらに 72 °Cにて 30秒間を 1サイクルとする保温を 31サイクル行う条件で P C Rを行つ た。
PCRを行った後、 1. 5%ァガロースゲル電気泳動により DNAの増幅を確認し た （以上、 本発明測定方法の第四工程に相当する。 ） 。 その結果を図 5に示す。 メチ ル化酵母ゲノム DNAの溶液 MA、 MB及び MCでは、 DN Aの増幅が確認された。 ネガティブコントロール溶液 MDでは、 DN Aの増幅が確認されなかった。 メチル化 されていない酵母ゲノム DNAの溶液 A、 B、 C及び Dでは、 DNAの増幅が確認さ れなかった。 以上より、 固定化したメチルシトシン抗体で、 メチル化された目的とする DNA領 域を含む DNAを選択することが可能であること、 また、 メチル化された DNAを検 出可能な量になるまで増幅し、 増幅された D N Aをより高感度に検出できることが確 レ /こ。 産業上の利用可能性
本発明により、 生物由来検体に含まれるゲノム D NA中の目的とする D NA領域に おけるメチル化された D N Aの含量を簡便に測定する方法等を提供することが可能と なる。 配列表フリーテキスト
配列番号 1 7
目的とする D N A領域からなる設計されたオリゴヌクレオチド（GPR7 - 2079- 2176) 配列番号 1 8
目的とする D NA領域からなる設計されたオリゴヌクレオチド (GPR7-2079 - 2176) 配列番号 1 9
目的とする D N A領域からなる設計されたオリゴヌクレオチド (GPR7 - 2079 - 2176) 配列番号 2 0
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 2 1
P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 2 2
P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 2 3
目的とする D NA領域からなる設計されたオリゴヌクレオチド（GPR7 - 2079 - 2176) 配列番号 2 4
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 2 5
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 2 6
目的とする D N A領域からなる増幅されたオリゴヌクレオチド（Genbank Accession No. NT一 029419 25687390-25687775 ホモサピエンス）
配列番号 2 7 目的とする D N A領域からなる設計されたオリゴヌクレオチド（Genbank Accession No. NT— 029419 25687390-25687775 ホモ サピエンス）， n二 m5c
配列番号 2 8
目的とする D N A領域からなる設計されたオリゴヌクレオチド（Genbank Accession No. NT_029419 25687390-25687775 ホモ サピエンス）
配列番号 2 9
目的とする D N A領域の 1本鎖 DNAを作成するために設計されたカウンターオリゴ ヌクレオチド
配列番号 3 0
目的とする D NA領域の 1本鎖 DNAを作成するために設計されたカウンターオリゴ ヌクレオチド
配列番号 3 1
目的とする D N A領域の 1本鎖 DNAを作成するために設計されたカウンターオリゴ ヌクレオチド
配列番号 3 2
目的とする D N A領域の 1本鎖 DNAを作成するために設計されたカウンターオリゴ ヌクレオチド
配列番号 3 3
目的とする D N A領域の 1本鎖 DNAを作成するために設計されたカウンターオリゴ ヌクレオチド
配列番号 3 4
目的とする D N A領域の 1本鎖 DNAを作成するために設計されたカウンターオリゴ ヌクレオチド
配列番号 3 5
目的とする D N A領域の 1本鎖 DNAを作成するために設計されたカウンターオリゴ ヌクレオチド
配列番号 3 6
目的とする D N A領域の 1本鎖 DNAを作成するために設計されたカウンターオリゴ ヌクレオチド
配列番号 3 7
目的とする D N A領域の 1本鎖 DNAを作成するために設計されたカウンターオリゴ ヌクレオチド
配列番号 3 8
目的とする D N A領域の 1本鎖 DNAを作成するために設計されたカウンターオリゴ ヌクレオチド
配列番号 3 9
目的とする D N A領域の 1本鎖 DNAを作成するために設計されたカゥンターオリゴ ヌクレオチド
配列番号 4 0
目的とする D N A領域の 1本鎖 DNAを作成するために設計されたカウンターオリゴ ヌクレオチド
配列番号 4 1
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 4 2
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 4 3
目的とする D N A領域からなる増幅されたオリゴヌクレオチド（Genbank Accession No. AC009800 76606 - 76726 ホモサピエンス）
配列番号 4 4
目的とする D NA領域からなる設計されたオリゴヌクレオチド（Genbank Accession No. AC009800 76606-76726 ホモ サピエンス） n=m5c
配列番号 4 5
目的とする D N A領域からなる設計されたオリゴヌクレオチド（Genbank Accession No. AC009800 76606 - 76726 ホモサピエンス）
配列番号 4 6
目的とする D N A領域の 1本鎖 DNAを作成するために設計されたカゥンターオリゴ ヌクレオチド
配列番号 4 7
目的とする D N A領域の 1本鎖 DNAを作成するために設計されたカウンターオリゴ ヌクレオチド
配列番号 4 8
目的とする D N A領域の 1本鎖 DNAを作成するために設計されたカウンターオリゴ ヌクレオチド
配列番号 4 9
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 5 0
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 5 1
目的とする D N A領域からなる増幅されたオリゴヌクレオチド（Genbank Accession No. NC001139 384569—384685 サッカロマイセス セレビシェ クロモ、ノーム VII)
配列番号 5 2
目的とする D N A領域からなる設計されたオリゴヌク レオチド（Genbank Accession No. NC001139 384569-384685 サッカロマイセス セレ シェ クロモソ ム VII) n=m5c
配列番号 5 3
目的とする D N A領域からなる設計されたオリゴヌクレオチド（Genbank Access ion No. NC001139 384569 - 384685 サッカロマイセス セレビシェ モソーム VII)
配列番号 5 4
目的とする D N A領域の 1本鎖 DNAを作成するために設計されたカウンターオリゴ ヌクレオチド
配列番号 5 5
目的とする D N A領域の 1本鎖 DNAを作成するために設計されたカウンターオリゴ ヌクレオチド
配列番号 5 6
目的とする D N A領域の 1本鎖 DNAを作成するために設計されたカウンターオリゴ ヌクレオチド
配列番号 5 7
目的とする D N A領域の 1本鎖 DNAを作成するために設計された力ゥンターォリゴ ヌクレオチド
配列番号 5 8
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 5 9
目的とする D N A領域の 1本鎖 DNAを作成するために設計されたカウンターオリゴ ヌクレオチド
配列番号 6 0
目的とする D N A領域の 1本鎖 DNAを作成するために設計されたカウンターォリゴ ヌクレオチド
配列番号 6 1
目的とする D N A領域の 1本鎖 DNAを作成するために設計されたカウンターオリゴ ヌクレオチド
配列番号 6 2
目的とする D N A領域の 1本鎖 DNAを作成するために設計された力ゥンターォリゴ ヌクレオチド

Claims

請求の範囲
1. 生物由来検体に含まれるゲノム DNA中の DNA領域におけるメチルイヒされた D N Aの含量を測定する方法であって、
( 1 ) 生物由来検体に含まれるゲノム DNA由来の DN A試料をメチル化感受性制限 酵素による消化処理を行う第一工程、
(2) 第一工程で得られた消化処理が行われた DN A試料からメチル化された一本鎖 DNAを取得し、 該一本鎖 DNAと、 固定化メチル化 DN A抗体とを結合させて一本 鎖 DNAを選択する第二工程、 及び、
(3) 下記の各本工程の前工程として第二工程で選択された一本鎖 DN Aを、 固定化 メチル化 DNA抗体から分離して一本鎖状態である DNA (正鎖） にする工程 （第一 前工程） と、
第一前工程で一本鎖状態にされたゲノム由来の DN A (正鎖） を、 一本鎖状態である DNA (正鎖） が有する塩基配列の部分塩基配列 （正鎖） であって、 且つ、 前記の目 的とする DN A領域の塩基配列 （正鎖） の 3' 末端よりさらに 3， 末端側に位置する 部分塩基配列 （正鎖） 、 に対して相補性である塩基配列 （負鎖） を有する伸長プライ マー （フォーワード用プライマー） を伸長プライマーとして、 該伸長プライマーを 1 回伸長させることにより、 目的とする DN A領域を含む一本鎖 DN A (正鎖） を二本 鎖 DNAに伸長形成させる工程 （第二前工程） と、
第二前工程で伸長形成されたニ本鎖 D NAを、 目的とする DN A領域を含む一本鎖 D NA (正鎖） と目的とする DN A領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖 D NA (負鎖） に一旦分離する工程 （第三前工程） を有し、 且つ、 本工程として
(a) 生成した目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） を铸型として、 前 記フォヮ一ド用プライマーを伸長プライマーとして、 該伸長プライマーを一回伸長さ せることにより、 前記の目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNAを二本鎖 DNAと して伸長形成させる第 A工程 （本工程） と、
(b) 生成した目的とする D N A領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖 D NA (負鎖） を鎵型として、 前記の目的とする DNA領域に対して相補性である塩基 配列を含む一本鎖 DNA (負鎖） が有する塩基配列の部分塩基配列 （負鎖） であって 、 且つ、 前記の目的とする DNA領域の塩基配列 （正鎖） に対して相補性である塩基 配列 （負鎖） の 3' 末端よりさらに 3' 末端側に位置する部分塩基配列 （負鎖） 、 に 対して相補性である塩基配列 （正鎖） を有する伸長プライマー （リバース用プライマ 一） を伸長プライマーとして、 該伸長プライマーを 1回伸長させることにより、 前記 の目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNAを二本鎖 DNAとして伸長形成させる第 B工程 （本工程） とを有し、
さらに第三工程の各本工程を、 前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖 DN A を一本鎖状態にー且分離した後、 繰り返すことにより、 前記の目的とする DNA領域 におけるメチル化された D N Aを検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された D N A の量を定量する第三工程、 を有することを特徴とする方法。
2. 固定化メチル化 D N A抗体がメチルシトシン抗体である請求項 1に記載の方法。
3. 生物由来検体が哺乳動物の血液、 体液、 血清、 血漿、 細胞溶解液又は組織溶解液 である請求項 1又は 2に記載の方法。
4. 生物由来検体に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料が、 該ゲノム DNAが有 する目的とする DN A領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてな る D N A試料、 又は予め精製されてなる D N A試料である請求項 1〜 3の!/、ずれか一 項に記載の方法。
5. 第一工程が、
目的とする DN A領域を含む一本鎖 DN A (正鎖） と、 メチル化感受性制限酵素の 認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドと 、 を混合することにより、 該メチル化感受性制限酵素の認識部位が保護されてなる一 本鎖 DN Aを選択する第一 （A) 工程と、
第一 （A) 工程で選択された一本鎖 DN Aをメチル化感受性制限酵素で消化処理す る第一 （B) 工程と、 力、ら構成される請求項 1〜4のいずれか一項に記載の方法。
6. メチル化感受性制限酵素が、 生物由来検体に含まれるゲノム DNA中の目的とす る DNA領域の中に認識切断部位を有する制限酵素、 又は Hhalである請求項 1〜 5の V、ずれか一項に記載の方法。
7. 第一工程におけるメチル化感受性制限酵素による消化処理を行わずに第二工程を 行う請求項 1〜 6のいずれか一項に記載の方法。
8. 第二工程が、
第一工程で得られた消化処理が行われた DN A試料に含まれるメチルイヒされた二本 鎖 DN Aをメチル化された一本鎖 DN Aに分離する第二 （A) 工程と、
第二 （A) 工程で得られたメチル化一本鎖 DNAと固定化メチル化 DNA抗体と結 合させる第二 （B) 工程とからなり、
第二 （A) 工程でメチル化された二本鎖 DNAをメチル化一本鎖 DNAに分離する 際に、 カウンターオリゴヌクレオチドを添加する請求項 1〜7のいずれか一項に記載 の方法。
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