WO2008099745A1 - Ｄｎａメチル化測定方法 - Google Patents

Ｄｎａメチル化測定方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2008099745A1
WO2008099745A1 PCT/JP2008/051995 JP2008051995W WO2008099745A1 WO 2008099745 A1 WO2008099745 A1 WO 2008099745A1 JP 2008051995 W JP2008051995 W JP 2008051995W WO 2008099745 A1 WO2008099745 A1 WO 2008099745A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dna
stranded
oligonucleotide
base sequence
methylation
Prior art date
Application number
PCT/JP2008/051995
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yoshitaka Tomigahara
Hirokazu Tarui
Original Assignee
Sumitomo Chemical Company, Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Chemical Company, Limited filed Critical Sumitomo Chemical Company, Limited
Priority to US12/525,089 priority Critical patent/US20100009376A1/en
Priority to AU2008215531A priority patent/AU2008215531A1/en
Priority to KR1020097018066A priority patent/KR20090106420A/ko
Publication of WO2008099745A1 publication Critical patent/WO2008099745A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/30—Phosphoric diester hydrolysing, i.e. nuclease
    • C12Q2521/331—Methylation site specific nuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2533/00—Reactions characterised by the enzymatic reaction principle used
    • C12Q2533/10—Reactions characterised by the enzymatic reaction principle used the purpose being to increase the length of an oligonucleotide strand
    • C12Q2533/101—Primer extension

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring the content of methylated DNA in a target DNA region in genomic DNA contained in a biological specimen.
  • methylated DNA in the target DNA region of genomic DNA As a method for evaluating the methylation status of DN A in the target DN A region of genomic DNA contained in a biological sample, for example, methylated DNA in the target DNA region of genomic DNA (For example, see ucleic Acids Res. 1994 Aug 11; 22 (15): 2990-7, and Proc Natl Acad Sci US A. 1997 Mar 18; 94 (6): 2284-9) )
  • this measurement method first, it is necessary to extract DNA containing the target DNA region from the DNA sample derived from genomic DNA, and the extraction operation is complicated.
  • PCR DNA polymerase Chain Reaction
  • a method for amplifying a target region is known. Both of these methods require labor for modification of DNA for detection of methylation and subsequent purification of the product, preparation of a reaction system for PCR, confirmation of amplification of DNA, and the like. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a method for easily measuring the content of methylated DNA in a target DNA region in genomic DNA contained in a biological specimen. That is, the present invention
  • the target DNA region is included-the double-stranded DNA (positive strand) and complementary to the base sequence of the recognition site for the methylation-sensitive restriction enzyme
  • a first step comprising: and
  • the single-stranded DNA selected in the first step is digested with one or more methylation-sensitive restriction enzymes, and the resulting free digest (methylation protected with the masking oligonucleotides described above)
  • a single-stranded DNA positive strand
  • the single-stranded DNA is selected by base-pairing with a single-stranded immobilized oligonucleotide having a base sequence that is complementary to the target DNA region.
  • the first step and (2) By mixing the single-stranded DNA selected in the first step with a masking oligonucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of the recognition site of the methylation sensitive restriction enzyme, the methylation sensitivity is mixed.
  • the resulting single-stranded DNA was digested with one or more methylation-sensitive restriction enzymes, and the resulting free digest (protected with the above-described masking oligonucleotide).
  • the generated single-stranded DNA (positive strand) and the single-stranded oligonucleotide are base-paired to select the generated single-stranded DNA, and the selected single strand A step (second (A) pre-step) of forming a DNA consisting of DNA in a strand state and the above-mentioned single-stranded oligonucleotide by base pairing;
  • the DNA formed in the step (second (A) pre-step) is selected from the DNA, which is the selected single-stranded state, as a saddle, and the single-stranded oligonucleotide as a primer.
  • a step (second (B) pre-step) and a step (second (B) pre-step) by extending the primer once to convert the DNA in the selected single-stranded state into an extended double-stranded DNA. Two previous steps) and
  • the double-stranded DNA extended in the second pre-process (the double-stranded DNA containing no CpG pair in the methylated state at the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme protected by the masking oligonucleotide described above) Single-stranded DNA) and single-stranded DNA (positive strand) It has a step (third pre-step) of once separating into DNA (negative strand) that is in a double-stranded state, and as this step
  • Step A 1 and DNA in the single-stranded state selected in Step A 1 are used as a cage, the single-stranded immobilized oligonucleotide is used as a primer, and the primer is extended once.
  • a first step A having a second step of extending the single-stranded state DN A as a double-stranded DN A, and
  • extension primer reverse primer one
  • each of these steps is repeated once after the elongated double-stranded DNA obtained in each step is separated into a single-stranded state, and then methylated in the target DNA region.
  • a single-stranded DNA positive strand
  • a single-stranded oligonucleotide having a base sequence complementary to a part of the 3 ′ end of a single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region (positive strand) and in a free state (negative strand) An additional step (additional pre-step) of adding to the reaction system, and
  • a single-stranded oligonucleotide (negative strand) having a base sequence complementary to a part of the 3 ′ end of a single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region and in a free state ) Is added to the reaction system (pre-addition step), and
  • Step C 1 The DNA in the single-stranded state selected in Step C 1 is used as a saddle, the primer is used as a primer, and the primer is extended once by using the single-stranded oligonucleotide (negative strand) as a primer.
  • the second step—C wherein the single-stranded DNA is converted into a double-stranded DNA formed by extension;
  • Step C 1 By using the DNA in the single-stranded state selected in Step C 1 as a saddle, using the single-stranded oligonucleotide (negative strand) as a primer, and extending the primer once,
  • the first step C having the second step of converting the DNA in the single-stranded state into an elongated double-stranded DNA;
  • a single-stranded oligonucleotide having a base sequence complementary to a part of the 3 ′ end of a single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region (positive strand) and in a free state (negative strand) An additional step (additional pre-step) of adding to the reaction system, and
  • Step C 1 DNA that is in a single-stranded state selected in Step C 1 is used as a saddle, and the primer is extended once by using the single-stranded oligonucleotide (negative strand) as a primer.
  • a method for measuring a methylation ratio which further comprises the following two steps as a process of the method according to any one of 1 to 7 above (hereinafter referred to as the methylation ratio measurement method of the present invention): It may be noted.)
  • the preceding paragraphs 1 to 7 In the method according to any one of the preceding paragraphs 1 to 7 without performing the second step of the combination step (i) or the second step (B) of the combination step (ii)
  • the DNA of the target DNA region (the total amount of methylated DNA and unmethylated DNA) is amplified to a detectable amount, and the amplified DN
  • a fourth step of quantifying the amount of A is
  • a DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological specimen is a DNA sample that has been digested in advance with a restriction enzyme that does not use the target DNA region of the genomic DNA as a recognition cleavage site.
  • the DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological sample is a DNA sample digested with one or more types of methylation-sensitive restriction enzymes. the method of;
  • the restriction enzyme according to any one of 1 to 14 above, wherein the restriction enzyme having a recognition cleavage site in the target DNA region of genomic DNA contained in a biological sample is The method of; and
  • One or more methylation sensitive restriction enzymes are methylation sensitive restriction enzymes Hpa
  • Fig. 1 shows that the sample prepared in Example 1 was either "A (no treatment)", “B (Hpal treatment)” or “C (masking oligonucleotide added + HpaI I treatment)".
  • A no treatment
  • B Hapal treatment
  • C masking oligonucleotide added + HpaI I treatment
  • methylated oligonucleotide GPR7-2079-2176 / 98mer-M (7) (M) with methylated Hpal l recognition sequence was treated with "A" Sample, methylated oligonucleotide whose Hpal l recognition sequence is methylated GPR7-2079-2176 / 98mer- M (7) (M) treated sample B, Hpal I recognition sequence Methylated oligopolynucleotide GPR 7-2079-2176 / 98mer-M (7) (M) -treated sample, Hpal l recognition sequence unmethylated oligomethyloligo Nucleotide GPR7-2079-2176 / 98mer-A sample of UM (U) treated with ⁇ A '', Hpal l recognition sequence is not methylated Unmethylated oligonucleotide GPR7-2079-2176 / 98mer-UM (U ) Sample ⁇ B '', Hpal l recognition sequence is un
  • Figure 2 shows that the sample prepared in Example 2 was either “A (no treatment)”, “B (Hpal treatment)” or “C (masking oligonucleotide added + HpaI I treatment)”.
  • A no treatment
  • B Hapal treatment
  • C masking oligonucleotide added + HpaI I treatment
  • R7-2079-2176 / 98mer-M (7) Sample treated with ⁇ C '' in (M), unmethylated oligonucleotide with unrecognized Hpal l recognition sequence GPR7-2079-2176 / 98mer- Sample treated with UM (U) “A”, Hpal I recognition sequence unmethylated oligonucleotide GPR7-2079-2176 / 98nier-UM (U) “B” treated The results are shown for the sample treated with the “C” treatment of unmethylated oligonucleotide GPR7-2079-2176 / 98mer-UM (U) in which the recognition sequence of Hpal was not methylated.
  • FIG. 3 shows that in Example 3, the prepared sample ⁇ (I) ”was added to“ A (no treatment) ”,“ B (Hpal treatment) ”,“ C (Hhal treatment) ”or“ D (3 ⁇ 4 & 11 and Figure 2 shows the results of real-time PCR measurement of the amount of methylated DNA in the region consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 24 by performing any of the processes of It is.
  • the vertical axis in the figure shows the relative value when the amount of DNA in the sample treated with “A” is set to 1 (average soil standard deviation of 3 times). The theoretical value indicates the calculated value (methylation ratio) expected for Group B, Group C, and Group D.
  • FIG. 4 shows that the sample “(II)” prepared in Example 3 was added to “A (no treatment)”, “B (Hpal treatment)”, “C (Hhal treatment)” or “D (3 ⁇ 4 ⁇ 11 and 1 ⁇ 1 simultaneous processing) ”shows the results of measuring the amount of methylated DNA in the region consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 24 by real-time PCR. It is a figure.
  • the vertical axis in the figure shows the relative value when the amount of DNA in the sample treated with “A” is 1 (average soil standard deviation 3 times).
  • the theoretical value indicates the calculated value (methylation ratio) expected in the B group, the C group, and the D group.
  • FIG. 5 shows that the sample “(III)” prepared in Example 3 was added to “A (no treatment)”, “B (Hpal treatment)”, “C (Hhal treatment)” or “D (Hpal treatment)”. l and simultaneous processing of hal)) shows the result of measuring the amount of methylated DNA in the region consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 24 by real-time PCR.
  • FIG. 5 shows that the sample “(III)” prepared in Example 3 was added to “A (no treatment)”, “B (Hpal treatment)”, “C (Hhal treatment)” or “D (Hpal treatment)”.
  • the vertical axis in the figure shows the value when the amount of DNA in the sample treated with “A” is 1. Relative values are shown (average of 3 soil standard deviations). The theoretical value indicates the calculated value (methylation ratio) expected for Group B, Group C, and Group D.
  • FIG. 6 shows that in Example 3, the prepared sample “(IV)” was added to “A (no treatment)”, “B (Hpal treatment)”, “C (Hhal treatment)” or “D (Hpal l).
  • the vertical axis in the figure shows the relative value when the amount of DNA in the sample treated with “A” is 1 (average soil standard deviation 3 times).
  • the theoretical value shows the predicted value (methylation ratio) for the B, C, and D groups.
  • FIG. 7 shows that the sample “(V)” prepared in Example 3 was added to “A (no treatment)”, “B (Hpal treatment)”, “C (Hhal treatment)” or “D (Hpal l).
  • the results of measuring the amount of methylated DNA in the region consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 24 by real-time PCR were FIG.
  • the vertical axis in the figure shows the relative value when the amount of DNA in the sample treated with “A” is set to 1 (average soil standard deviation of 3 times).
  • the theoretical value indicates the calculated value (methylation ratio) expected for Group B, Group C, and Group D.
  • biological specimen examples include, for example, a cell lysate, a tissue lysate (herein, tissue has a broad meaning including blood, lymph nodes, etc.), or in mammals, plasma.
  • tissue has a broad meaning including blood, lymph nodes, etc.
  • biological samples such as serum and lymph, body fluids such as body secretions (urine, milk, etc.), and genomic DNA obtained by extraction from these biological samples.
  • biological specimen examples include samples derived from microorganisms, viruses, and the like.
  • “genomic DNA” in the measurement method of the present invention means genomic DNA such as microorganisms and viruses. To do.
  • the measurement method of the present invention can be expected to be used for periodic health examinations and simple tests.
  • DNA extraction DNA may be extracted using a kit or the like.
  • plasma or serum is prepared from blood according to a normal method, and the prepared plasma or serum is used as a specimen, and free DNA contained therein (derived from cancer cells such as stomach cancer cells) Analysis of cancer cells such as gastric cancer cells, avoiding blood cell-derived DNA, and detecting cancer cells such as gastric cancer cells and tissues containing them Sensitivity can be improved.
  • cancer cells such as gastric cancer cells, avoiding blood cell-derived DNA, and detecting cancer cells such as gastric cancer cells and tissues containing them Sensitivity can be improved.
  • there are four types of bases that make up a gene (genomic DNA).
  • the phenomenon that only cytosine is methylated is known.
  • Such a methylation modification of DNA is based on the base sequence represented by 5 '— CG—3, where C represents cytosine.
  • G represents guanine
  • the base sequence may be referred to as “CpG.”) It is limited to cytosine.
  • the site that is methylated in cytosine is at position 5.
  • cytosine in the cage chain “CpG” is methylated.
  • the cytosine in the nascent strand “CpG” is immediately activated by methyltransferase.
  • methyltransferase are also methylated. Therefore, the DNA methylation status is inherited by two new DNA groups after DNA replication.
  • the “methylated DNA” in the present invention means DNA generated by such methylation modification.
  • the “CpG pair” in the present invention means a double-stranded oligonucleotide formed by base pairing of a base sequence represented by CpG and a complementary C pG.
  • the “target DNA region” in the present invention (hereinafter sometimes referred to as the target region) is a DNA region to be examined for the presence or absence of methylation of cytosine contained in the region, and includes at least one kind of methyl region.
  • a susceptibility restriction enzyme for example, Lysyl oxidase, HRAS-like suppressor, bA305P22.2.K Gamma filamin, HAND1, Homologue of RIKEN 22111 loproteinase domain 23, G protein-coupled receptor 7, G-prot ein coupled somatostatin and angiotensin- 1 ike peptide receptor, Solute carriier family 6 neurotransmitter transporter noradrenal in member 2, etc., present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) of useful protein genes Examples include DNA regions containing one or more cytosines in the base sequence represented by C p G.
  • the useful protein gene is a Lysyl oxidase gene
  • the base indicated by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region)
  • the nucleotide sequence containing one or more sequences include the genomic DNA nucleotide sequence containing exon 1 of the human-derived Lysyl oxidase gene and a promoter region located 5 ′ upstream thereof. Includes a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (corresponding to a base sequence represented by base numbers 16001 to 18661 of the base sequence described in Genbank Accession No. AF270645).
  • the ATG codon encoding the amino terminal methionine of Lysyl oxidase protein derived from human is represented by nucleotide numbers 2031 to 2033, and the nucleotide sequence of exon 1 is Base numbers 1957 to 2661 are shown.
  • the cytosine in it shows a high methylation frequency (ie, hypermethylation) in cancer cells such as gastric cancer cells.
  • cytosine having a high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, base numbers 1539, 1560, 1574, 1600, 1623, 1635, 1644, 1654, 1661 1682, 1686, 1696, 1717, 1767, 1774, 1783, 1785, 1787, 1795 and the like.
  • the useful protein gene is a HRAS-like suppressor gene, it is indicated by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • a base sequence containing one or more base sequences For example, the base sequence of genomic DNA containing exon 1 of the HRAS-like supsups sor gene derived from humans, and the promoter region located upstream of the gene can be raised. And the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 (corresponding to the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 172001 to 173953 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession N0. ACO6 8162). In the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, the base sequence of exon 1 of the human-derived HRAS-ike suppres sor gene is shown in base numbers 1743-1953.
  • the cytosine in the middle shows high methylation frequency (ie, hypermethylation state) in cancer cells such as gastric cancer cells.
  • cytosine having high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, base numbers 1316, 1341, 1357, 1359, 1362, 1374, 1390, 1399, 1405, 1409, 1414, 1416, 1422, 1428, 1434, 1449, 1451, 1454, 1463, 1469, 1477, 1479, 1483, 1488, 1492, 1494, 1496, 1498, 1504, 1510, 151 3, 1518, 1520
  • the cytosine shown by etc. can be mention
  • the C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • the ATG codon encoding the amino terminal methionine of bA305P22.2.1 protein derived from human is shown in nucleotide numbers 849 to 851, and the nucleotide sequence of exon 1 above is shown. Is shown in base numbers 663-889. Cytosine in the base sequence shown by C p G present in the base sequence shown by SEQ ID NO: 3, especially in the region where C p G is densely present in the base sequence shown by SEQ ID NO: 3. The cytosine in C p G shows a high methylation frequency (ie, hypermethylation state (hyperme thy 1 at ion)) in cancer cells such as gastric cancer cells.
  • a high methylation frequency ie, hypermethylation state (hyperme thy 1 at ion
  • cytosine having high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, base numbers 329, 335, 337, 351, 363, 373, 405, 424, 427 , 446, 465, 472, 486, and the like. More specifically, for example, when the useful protein gene is a Gamma ⁇ lamin gene, the C p G present in the nucleotide sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) As the base sequence containing one or more of the base sequences shown, the base sequence of genomic DNA containing exon 1 of the human-derived thigh afil amin gene, and its promo overnight region located upstream is given.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 (corresponding to the complementary sequence of the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 63528 to 64390 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AC074373) )
  • base sequence represented by SEQ ID NO: 4 the ATG codon encoding the methionine at the amino terminal of human-derived gamma fil amin protein is represented by base numbers 572 to 574, and the base sequence of exon 1 is base It is shown in numbers 463-863.
  • the cytosine in the middle shows high methylation frequency (ie, hypermethylation state) in cancer cells such as gastric cancer cells.
  • cytosine having a high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, base numbers 329, 333, 337, 350, 353, 360, 363, 370, 379 , 382, 384, 409, 414, 419, 426, 432, 434, 445, 449, 459, 472, 474, 486, 490, 503, 505 and the like.
  • the base sequence represented by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) is As a base sequence including one or more
  • the base sequence of genomic DNA containing exon 1 of the conventional HAND1 gene and a promoter region located 5 'upstream can be given.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 This corresponds to the complementary sequence of the base sequence represented by base numbers 24303 to 26500 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC026688.
  • the ATG codon encoding the amino terminal methionine of the HAND1 protein derived from human is shown in base numbers 1656 to 1658, and the base sequence of the above exon 1 is base The number 1400-2198 is shown.
  • cytosine for example, exhibits a high methylation frequency (ie, hypermethylation) in cancer cells such as gastric cancer cells.
  • cytosine having high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, the base numbers 1153, 1160, 1178, 1187, 1193, 1218, 1232, 1266, Examples include cytosine represented by 1272, 1292, 1305, 1307, 1316, 1356, 1377, 1399, 1401, 1422, 1434, and the like.
  • the useful protein gene is the Homologue of RIKEN 2210016F 16 gene
  • the C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region)
  • the nucleotide sequence containing one or more of the nucleotide sequences shown include the genomic DNA nucleotide sequence containing exon 1 of the human-derived Homologue of RIKEN 2210016F16 gene and a promoter region located 5 'upstream thereof. More specifically, it corresponds to the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 (complementary base sequence of the base sequence represented by base numbers 157056 to 159000 of the base sequence described in Genbank Accession No. AL354733). ).
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 the nucleotide sequence of exon 1 of the human-derived Homologue of RIKEN 2210016F16 gene is represented by nucleotide numbers 1392 to 1945.
  • Cytosine in the base sequence shown by C p G present in the base sequence shown in SEQ ID NO: 6, particularly C p G present in the region where C p G is densely present in the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 Sit in Syn for example, exhibits a high methylation frequency (ie, hypermethylation) in cancer cells such as gastric cancer cells.
  • cytosine having high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 6, base numbers 1172, 1175, 1180, 1183, 1189, 1204, 1209, 1267, Examples include 1271, 1278, 128 1, 1313, 1319, 1332, 1334, 1338, 1346, 1352, 1358, 1366, 1378, 1392, 1402, 1433, 1436, 1438 and the like.
  • the useful protein gene is FLJ32130 gene
  • the base sequence represented by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) is used.
  • nucleotide sequence including one or more examples include the nucleotide sequence of genomic DNA containing exon 1 of the FLJ32130 gene derived from human and a promoter region located 5 ′ upstream thereof.
  • SEQ ID NO: 7 a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 (corresponding to a complementary nucleotide sequence of the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 to 2379 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AC002310). It is.
  • SEQ ID NO: 7 the ATG codon encoding the amino acid terminal methionine of human-derived FU32130 protein is shown in base numbers 2136 to 2138.
  • the base sequence considered to be exon 1 is a base sequence The number 2136-2379 is shown. Cytosine in the base sequence shown by C p G present in the base sequence shown by SEQ ID NO: 7, particularly C p present in the region where C p G is densely present in the base sequence shown by SEQ ID NO: 7. Cytosine in G exhibits a high methylation frequency (ie, hypermethylation state) in cancer cells such as gastric cancer cells.
  • cytosine having high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 7, the base numbers 1714, 1716, 1749, 1753, 1762, 1 795, 1814, 1894, The cytosine shown by 1911, 1915, 1925, 1940, 1955, 1968, etc. can be raised.
  • the useful protein gene is a PPARG angi opoi et in-related protein gene
  • its promoter region, untranslated region or translated region includes human-derived PPARG angiopoietin-related protein gene exon 1 and a promoter located 5 ′ upstream thereof.
  • the nucleotide sequence of genomic DNA containing one region can be exemplified, and more specifically, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 is exemplified.
  • the ATG codon encoding the amino acid methionine at the amino terminal of the human-derived PPARG ang iopoietin-related protein protein is represented by nucleotide numbers 717 to 719.
  • the base sequence of the side part is shown in base numbers 1957 to 2661.
  • cytosine having high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 8, base numbers 35, 43, 51, 54, 75, 85, 107, 127, 129 143, 184, 194, 223, 227, 236, 251, 258 and the like.
  • the useful protein gene is a Thrombomodulin gene
  • the base sequence represented by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) is used.
  • the nucleotide sequence containing one or more include the nucleotide sequence of genomic DNA containing exon 1 of the human-derived Thrombomodulin gene and a promoter region located 5 ′ upstream thereof.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 (corresponding to the base sequence represented by base numbers 1 to 6096 of the base sequence described in Genbank Accession No. AF495471) can be mentioned.
  • the ATG codon encoding the amino terminal methionine of the human-derived Thrombomodulin protein is shown in base numbers 2590 to 2592.
  • the base sequence of exon 1 is the base number It is shown in 2048-6096. Cytosine in the base sequence shown by C p G present in the base sequence shown by SEQ ID NO: 9, especially in a region where C p G is densely present in the base sequence shown by SEQ ID NO: 9.
  • the cytosine present in CpG exhibits a high methylation frequency (ie, hypermethylation) in cancer cells such as gastric cancer cells. More specifically, as cytosine with high methylation frequency in gastric cancer cells, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 9, base numbers 1539, 1551, 1571, 1579, 1581, 1585, 1595, 1598, 1601, Examples include cytosine represented by 1621, 1632, 1638, 1645, 1648, 1665, 1667, 1680, 1698, 1710, 1724, 1726, 1756, and the like.
  • the useful protein gene when it is p53-responsive gene 2 gene, it is indicated by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 corresponding to the complementary sequence of the base sequence represented by base numbers 113501 to 116000 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC009471).
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10 the nucleotide sequence of exon 1 of the human-derived p53-responsive gene 2 gene is represented by nucleotide numbers 1558 to 1808. Cytosine in the base sequence represented by C p G present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 has a high methylation frequency (ie, hypermethylation state in a cancer cell such as a spleen cancer cell).
  • cytosine having a high methylation frequency in spleen cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 10, base numbers 1282, 1284, 1301, 1308, 1315, 1319, 1349, The cytosine shown by 1351, 1357, 1361, 1365, 1378, 1383 etc. can be mentioned. More specifically, for example, when the useful protein gene is a Fibrillin gene, it is indicated by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • the base sequence containing one or more of the base sequences to be detected includes human exon 1 of the Fibrillin gene and a promoter located 5 ′ upstream.
  • the base sequence of genomic DNA containing one region can be mentioned. More specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 (base number 118801 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC113387) It corresponds to a complementary sequence of the base sequence represented by ⁇ 121000. In the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11, the nucleotide sequence of exon 1 of the human-derived fiber 2 gene is represented by nucleotide numbers 1091 to 1345.
  • the cytosine in the base sequence represented by C p G present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 1 has a high methylation frequency (ie, a hypermethylated state) in cancer cells such as, for example, spleen cancer cells.
  • cytosine having a high methylation frequency in spleen cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 11, the base numbers 679, 687, 690, 699, 746, 773, 777, The cytosine shown by 783, 795, 799, 812, 823, 830, 834, 843 etc. can be mentioned.
  • the useful protein gene is a neurofilament 3 gene, it is represented by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • Examples of the base sequence containing one or more base sequences include the base sequence of genomic DNA containing exon 1 of the human-derived neurofilament s gene and a region of the promoter located 5 'upstream. More specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 (corresponding to the complementary sequence of the base sequence represented by base numbers 28001 to 30000 of the base sequence described in Genbank Accession No. AF106564) ). In the base sequence represented by SEQ ID NO: 12, the base sequence of exon 1 of the human-derived eurofilament 3 gene is represented by base numbers 614 to 1694.
  • Cytosine in the nucleotide sequence represented by C p G present in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 2 has a high methylation frequency (ie, hypermethylation state (hypermethylated state) in cancer cells such as spleen cancer cells). at i on)). More specifically, as cytosine having a high methylation frequency in a ovarian cancer cell, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 12, the base numbers 428, 432, 443, 451, 471, 475, 482 491, 499, 503, 506, 514, 519, 532, 541, 544, 546, 563, 566, 572, 580 etc. can be raised.
  • the useful protein gene when it is disintegrin and metal loproteinase domain 23 gene, it is CpG present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • the nucleotide sequence containing one or more of the nucleotide sequences shown include a genomic DNA nucleotide sequence containing exon 1 of human-derived disintegrin and metalloproteinase domain 23 gene and a promoter region located 5 ′ upstream thereof. More specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 (corresponding to the base sequence represented by base numbers 21001 to 23300 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC009225) can be mentioned.
  • the base sequence of exon 1 of the human-derived disintegrin and metalloproteinase domain 23 gene is represented by base numbers 1194 to 1630.
  • Cytosine in the base sequence represented by CpG present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 has a high methylation frequency (ie, hypermethylation in cancer cells such as knee cancer cells).
  • cytosine having high methylation frequency in spleen cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 13, the base numbers 998, 1003, 1007, 1011, 1016, 1018, 1020, 1026 1028, 1031, 1035, 1041, 1043, 1045, 1051, 1053, 1056, 1060, 1066, 1068, 1070, 1073, 1 093, 1096, 1106, 1112, 1120, 1124, 1126 etc. That's right.
  • the useful protein gene is a G protein-coupled receptor 7 gene
  • C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • the base sequence of genomic DNA containing exon 1 of human-derived G protein-coupled receptor 7 gene and a promoter region located 5 'upstream thereof is used. More specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 (corresponding to the base sequence represented by base numbers 75001 to 78000 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC009800) can be mentioned. . In the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14 The base sequence of exon 1 of the human G protein-coupled receptor 7 gene is shown in base numbers 1666 to 2652.
  • Cytosine in the base sequence represented by CpG present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 has a high methylation frequency (ie, hypermethylation state in cancer cells such as spleen cancer cells). )) More specifically, cytosine with high methylation frequency in spleen cancer cells, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 14, the base numbers 1480, 1482, 1485, 1496, 1513, 1526, 1542 1560, 1564, 1568, 1570, 1580, 1590, 1603, 1613, 1620, and the like.
  • the useful protein gene is a G-protein coupled somatostatin and angiotensin-1 ike peptide receptor gene, its promoter region, promoter region, untranslated region or translated region
  • the coding sequence is a base sequence comprising one or more base sequences represented by C p G present in the base sequence of the human G-protein coupled somatostatin and angiotensin-1 ike peptide rec eptor gene exon 1;
  • the nucleotide sequence of the genomic DNA containing the 5 'upstream promoter region can be mentioned. More specifically, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 (described in Genbank Accession No.
  • AC008971 This corresponds to a complementary sequence of the base sequence represented by base numbers 57001 to 60000 of the base sequence.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 the nucleotide sequence of exon 1 of human-derived G-protein coupled somatostatin and angiotensin-1 ike peptide receptor gene is represented by nucleotide numbers 776 to 2632.
  • Cytosine in the base sequence represented by CpG present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 has a high methylation frequency (ie, hypermethylation) in cancer cells such as spleen cancer cells. ).
  • cytosine with high methylation frequency in knee cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 15, base numbers 470, 472, 490, 497, 504, 506, 509, 514 , 522, 540, 543, 552, 566, 582, 597, 610, 612 and the like.
  • the useful protein gene is Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2 gene, it is included in the base sequence of the promoter motor region, untranslated region or translated region (coding region).
  • the nucleotide sequence including one or more existing nucleotide sequences represented by CpG includes human-derived solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2 ⁇ gene exon 1 and a promoter region located 5 ′ upstream thereof. More specifically, the nucleotide sequence of genomic DNA containing the nucleotide sequence can be raised. More specifically, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16 (represented by nucleotide numbers 78801 to 81000 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AC026802) It corresponds to the complementary sequence of the base sequence.
  • the human solute carrier family 6 neurotran smitter transporter noradrenalin member 2 gene of exon 1 has a nucleotide sequence of nucleotide numbers 1479 to 1804.
  • Cytosine in the base sequence represented by CpG present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 has a high methylation frequency (ie, hypermethylation state) in cancer cells such as spleen cancer cells. Indicates.
  • cytosine with high methylation frequency in spleen cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 16, base numbers 1002, 1010, 1019, 1021, 1 051, 1056, 1061 1063, 1080, 1099, 1110, 1139, 1141, 1164, 1169, 1184, and the like.
  • “(amplified to a detectable amount of methylated DNA in the target DNA region) and the amount of amplified DNA” means the target region in the genomic DNA contained in the biological sample. This means the amount of methylated DNA after amplification in, ie, the amount determined in the fifth step of the measurement method of the present invention.
  • the biological specimen when the biological specimen is 1 mL of serum, it means the amount of DNA amplified based on the methylated DNA contained in 1 mL of serum.
  • the “methylation ratio” in the present invention is the methylation in the target DNA region in the genomic DNA contained in the biological specimen. It means a value obtained by dividing the amount after amplification of methylated DNA by the total amount of the amount after amplification of DNA that has been amplified and the amount after amplification of unmethylated DNA.
  • methylation-sensitive restriction enzyme in the present invention means, for example, a restriction enzyme that does not digest a recognition sequence containing methylated cytosine but can digest only a recognition sequence containing unmethylated cytosine. Etc. That is, in the case of DNA in which cytosine contained in a recognition sequence that can be originally recognized by a methylation-sensitive restriction enzyme is methylated, even if the methylation-sensitive restriction enzyme acts on the DNA, the DNA Is not disconnected. In contrast, when the cytosine contained in the recognition sequence that can be originally recognized by the methylation-sensitive restriction enzyme is non-methylated DNA, the methylation-sensitive restriction enzyme can be allowed to act on the DNA. In this case, the DNA is cut off.
  • methylation-sensitive restriction enzyme examples include Hpal, BstUI, Narl, Sac II, fflial and the like.
  • the methylation-sensitive restriction enzyme is a double-stranded DNA containing a CpG pair in the hemimethyl state (that is, cytosine of one strand of the CpG pair is methylated, The other strand cytosine does not cleave double-stranded DNA (unmethylated) and has already been clarified by Gruenbaum et al. (Nucleic Acid Research, 9, 2509-2515).
  • Some methylation sensitive restriction enzymes also digest single-stranded DNA.
  • Such a restriction enzyme does not digest a recognition sequence containing methylated cytosine in single-stranded DNA, but can digest only a recognition sequence containing unmethylated cytosine.
  • methylation-sensitive restriction enzymes that digest single-stranded DNA include Hhal and the like.
  • the “masking oligonucleotide” in the present invention is an oligonucleotide having a base sequence complementary to the base sequence of the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme, and is included in the target DNA region in the single-stranded DNA. Complementary base pairing with at least one (or all) of the recognition sequences for methylation-sensitive restriction enzymes in several locations forms a double strand (ie, the location is double-stranded).
  • a methylation-sensitive restriction enzyme that can digest single-stranded DNA (a methylation-sensitive restriction enzyme that can eliminate single-stranded DNA)
  • the enzyme can also digest double-stranded DNA, and its digestion efficiency is higher for double-stranded DNA than for single-stranded DNA.
  • the masking oligonucleotide is used for the reaction to extend the extension primer using the reverse primer (positive strand) described below as an extension primer and the masking oligonucleotide (negative strand) as a cage.
  • the base length is preferably 8 to 200 bases.
  • One or more types of masking oligonucleotides may be mixed with the single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region contained in the DNA sample derived from genomic DNA. When multiple types are used, many of the recognition sites for the methylation-sensitive restriction enzyme of the single-stranded DNA containing the target DNA region become double-stranded, and the methylation-sensitive restriction enzyme “D” described later “Uncut NA” can be minimized.
  • Masking oligonucleotides include, for example, several methylation-sensitive restriction enzyme recognition sequences contained in the target DNA region. If they are methylated, they are not digested and not methylated.
  • the “single-stranded DNA containing one or more amethylated CpGs in the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme protected by the masking oligonucleotide” means the restriction enzyme recognition site. It means single-stranded DNA in which cytosine in one or more C p G present therein is unmethylated cytosine.
  • methylation sensitive restriction fermentation protected with the above-mentioned masking oligonucleotide A single-stranded DNAJ that is formed by extension that does not contain C p G in the methyl state at the primary recognition site is defined as cytosine in all CPGs present in the recognition site of the restriction enzyme in single-stranded DNA. It means single-stranded DNA that is methylated.
  • the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme is protected by an oligonucleotide)
  • a single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region, and a part of the 3 ′ end of the single-stranded DNA is not included, but is selected by base pairing with a single-stranded immobilized oligonucleotide having a base sequence that is complementary to.
  • the “single-stranded immobilized oligonucleotide” in the first step (B) of the combination step (i) and the first step of the combination step (ii) of the measurement method of the present invention includes the target DNA region.
  • Single-stranded immobilized oligonucleotide having a base sequence complementary to a part of the 3 ′ end of single-stranded DNA (positive strand) (excluding the above-mentioned target DNA region) Sometimes referred to as the present immobilized oligonucleotide.
  • This immobilized oligonucleotide is used to select single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region from a DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological specimen.
  • the immobilized oligonucleotide preferably has a length of 5 to 50 bases.
  • the 5 ′ end side of the present immobilized oligonucleotide can be immobilized with a carrier, while the 3 ′ end side thereof is directed from the 5 ′ end to the 3 ′ end by the second pre-step and the step A2 described later. It should be free so that a single extension reaction can proceed.
  • “what can be immobilized on a carrier” means that the present immobilized oligonucleotide is immobilized on a carrier when a single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region is selected.
  • the carrier with the immobilized oligonucleotide is supported. It may be immobilized by binding to the body.
  • the 5 'end of an oligonucleotide having a complementary base sequence (hereinafter sometimes referred to as this oligonucleotide) is used as a carrier in accordance with a normal genetic engineering operation method or a commercially available kit-device. Fix it (binding to the solid phase).
  • a support in which the 5 ′ end of the oligonucleotide is piotinated and then the resulting piotinated oligonucleotide is coated with streptavidin for example, a PCR tube coated with streptavidin, or coated with streptavidin.
  • streptavidin for example, a PCR tube coated with streptavidin, or coated with streptavidin.
  • a molecule having an active functional group such as an amino group, an aldehyde group, or a thiol group was covalently bonded to the 5 ′ end side of the oligonucleotide, and then the surface was activated with a silane coupling agent or the like.
  • a silane coupling agent or the like for example, a method of covalently bonding to a support made of glass, silica or heat-resistant plastic via a spacer such as five triglycerides connected in series, a cross-linker, or the like.
  • a method of chemically synthesizing directly from the 5 ′ end side of the oligonucleotide on a glass or silicon support is also included.
  • At least one of the recognition sequences of the methylation-sensitive restriction enzymes contained in the target DNA region in single-stranded DNA can be protected (only that part is in a double-stranded state) and is sensitive to methylation using only double-stranded DNA as a substrate.
  • a methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting single-stranded DNA a methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting single-stranded DNA can also digest double-stranded DNA, The digestion efficiency is higher for double-stranded DNA than for single-stranded DNA.
  • the masking oligonucleotide is added before the digestion treatment with a methylation sensitive restriction enzyme in the second step of the combination step (i) of the measurement method of the present invention and the second step (B) of the combination step (ii).
  • the masking oligonucleotide is added before the digestion treatment with a methylation sensitive restriction enzyme in the second step of the combination step (i) of the measurement method of the present invention and the second step (B) of the combination step (ii).
  • the masking oligonucleotide may be mixed before or after separating the genomic DNA into single strands, and the masking oligonucleotide is mixed in the first step (A) of the combination step (i). Further, a masking oligonucleotide may be mixed in the second step (A) of the combination step (ii). That is, before treatment with a methylation-sensitive restriction enzyme, it is sufficient to form a double-stranded state by base pairing with a base sequence that can be recognized by the methylation-sensitive restriction enzyme.
  • the first step (B) of the combination step (i) or the combination step (The single-stranded DNA selected in the first step of ii) is digested with one or more methylation-sensitive restriction enzymes, and the resulting free digest (methyl masked with the above masking oligonucleotide) is then produced. Remove one or more single-stranded DNA containing CpG in the ammethyl state at the recognition site of the oxidization-sensitive restriction enzyme.
  • a method for examining the presence or absence of digestion with the methylation-sensitive restriction enzyme specifically, for example, using a pair of primers capable of amplifying DNA containing the cytosine to be analyzed as a recognition sequence using the DNA as a saddle type.
  • a method of examining the presence or absence of DNA amplification (amplification product) by performing PCR can be mentioned.
  • the cytosine to be analyzed is methylated If so, an amplification product is obtained.
  • the cytosine to be analyzed is not methylated, an amplification product cannot be obtained. In this way, by comparing the amount of amplified DNA, the ratio of cytosine to be analyzed can be measured.
  • the masking oligonucleotide is added in the single-stranded DNA selected in the first step (B) of the combination step (i) or the first step of the combination step (ii).
  • the base-paired portion of the single-stranded immobilized oligonucleotide and the target DNA region where the masking oligonucleotide is base-paired are in a double-stranded state.
  • This immobilized oligonucleotide as a negative strand does not base pair with the target DNA region, but the recognition site of the methylation sensitive restriction enzyme is in a double-stranded state due to base pairing with the masking oligonucleotide. .
  • the cytosine contained in the masking oligonucleotide as a negative strand is not methylated, and the cytosine contained in the single-stranded DNA derived from genomic DNA contained in the biological specimen on the positive strand side is Whether single-stranded DNA derived from genomic DNA is in an unmethylated state based on whether cytosine contained in genomic DNA contained in biological samples is methylated or not methylated Is decided. In other words, if the genomic DNA contained in a biological sample is methylated, the double-stranded DNA portion where the masking oligonucleotide is base-paired is in the hemimethyl state (not in the unmethyl state. Negative strand: methylated.
  • the double-stranded DNA portion where the masking oligonucleotide is base-paired Is an amethyl state (negative chain: unmethylated state, positive chain: unmethylated state). Therefore, by utilizing the property that the methylation-sensitive restriction enzyme does not cleave the double-stranded DNA in the hemimethyl state, the methylation-sensitive restriction in the genomic DNA contained in the biological sample is obtained. It can be distinguished whether cytosines in one or more C p G pairs present in the enzyme recognition site were methylated.
  • a masking oligonucleotide in genomic DNA contained in a biological specimen is assumed. If the cytosine in one or more C p G pairs present in the double-stranded DNA portion where the rhotide is base-paired is not methylated, the masking oligonucleotide will be base-paired. The strand DNA portion is in an ammethyl state and is cleaved by the methylation sensitive restriction enzyme. Also, if cytosine in all C pG pairs present in the double-stranded DNA portion where the masking oligonucleotide in the genomic DNA contained in the biological specimen is base-paired, is methylated. For example, a double-stranded DNA portion in which a masking oligonucleotide is base-paired is in a hemimethyl state and is not cleaved by the methylation-sensitive restriction enzyme.
  • the digestion treatment is performed as described below.
  • the masking oligonucleotide in the genomic DNA contained in the biological sample is applied to the double-stranded DNA portion that has undergone base pairing. If cytosine in one or more existing C pG pairs is not methylated, PCR amplification products will not be obtained, whereas masking oligonucleotides in genomic DNA contained in biological samples will not be obtained. If the cytosines in all CpG pairs present in the base-paired double-stranded DNA portion are methylated, PCR amplification products Will be obtained.
  • the presence or absence of methylation of single-stranded DNA can be determined by using Hpall or Hhal as a methylation-sensitive restriction enzyme and using a masking oligonucleotide. That is, if the CpG cytosine contained in the recognition site of the Hpall or Hhal of the single-stranded DNA that is base-paired with the single-stranded immobilized oligonucleotide obtained by the above operation is methylated, Or Hhal cannot digest the DNA. On the other hand, if not methylated, Hpall or Hhal can digest the DNA.
  • the DNA in the target DNA region possessed by the genomic DNA contained in the biological sample is obtained. If it is in an unmethylated state, no amplification product can be obtained, whereas if the DNA is in a methylated state, An amplification product will be obtained.
  • the steps up to the second step of the combination step (i) of the measurement method of the present invention are carried out as follows, for example, when the immobilized oligonucleotide is a pyotinylated oligonucleotide.
  • Including DNA region-For base pairing of double-stranded DNA (positive strand) and a piotinylated oligonucleotide for example, about 0-20 of Tm value of piotinylated oligonucleotide
  • the base pairing between the single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region and the piotinylated oligonucleotide is This is carried out prior to the fixation between the otinylated oligonucleotide and the support coated with streptavidin, but this order does not matter.
  • the operation after (c) may be carried out without carrying out (b), and further, after carrying out the operation up to the above (c), carrying out (d).
  • the operation (e) may be performed.
  • the solution when using a PCR tube coated with streptavidin, the solution is first removed by pipetting or decantation, and then the volume of the biological sample is approximately equal to that of the biological sample. A washing buffer is added, and then the washing buffer is removed by pipetting or decanting.
  • magnetic beads coated with streptavidin after fixing the beads with a magnet, first remove the solution by pipetting or decantation, and then wash with a volume equivalent to the volume of the biological specimen. A buffer can be added, and then the wash buffer can be removed by pipetting or decanting.
  • This operation is important in order to remove DNA NA that has not been immobilized, or DNA NA that has been suspended in a solution digested with the restriction enzymes described below, from the reaction solution. If these operations are inadequate, the DNA floating in the reaction solution will be in a bowl shape, and an unexpected amplification product will be obtained in the amplification reaction.
  • a large amount of DNA having a nucleotide sequence that is completely different from the target region eg rat DNA in the case of human biological samples
  • methylation-sensitive restriction enzymes Add one or more methylation-sensitive restriction enzymes to the sample obtained in (f) above, and incubate at 37 ° C for 1 hour to 1 hour. Specifically, for example, it may be carried out as follows. To the sample obtained in (e) above, the optimal buffer (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM Mg0Ac2, 5 mM Dithio) 3 ml of threi tol), 1.5 L of methylation sensitive restriction enzyme Hpal I or Hhal (10 U / U, etc., respectively), and an appropriate amount of BSA etc. if necessary, and then sterilized ultrapure water to the mixture.
  • the optimal buffer 330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM Mg0Ac2, 5 mM Dithio
  • the solution volume should be 30 L and incubated for 1 hour to 1 hour at 37 ° C. This makes it possible to limit the sensitivity to methylation protected with the oligonucleotide for masking contained in the target DNA region. If the enzyme recognition site is not methylated, it will be digested.
  • the resulting free digest (on the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme protected with the above-mentioned masking oligonucleotide) Remove and wash (DNA purification) the single-stranded DNA (NA) containing one or more ammethyl CpG. More specifically, for example, when using a PCR tube coated with streptavidin, the solution is first removed by pipetting or decantation, and then washed with an amount equivalent to the volume of the biological specimen. After adding the purification buffer, the washing buffer can be removed by pipetting or decanting.
  • the second step of the combination step (ii) of the measurement method of the present invention is specifically carried out as follows when, for example, the present immobilized oligonucleotide is a piotinylated oligonucleotide.
  • a DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological sample is added to an annealing buffer and a piotinylated oligonucleotide (the base of the single-stranded DNA (positive strand) and the immobilized oligonucleotide. Since it is immobilized by the binding of this immobilized oligonucleotide to the carrier at the stage after pairing, it is in a free state at this stage.
  • the mixture is obtained by adding (some).
  • the resulting mixture is converted into a single-stranded double-stranded DNA containing a target DNA region present in a DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological specimen. Heat at 5 ° C for several minutes. Then, in order to base pair the single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region with the piotinylated oligonucleotide, for example, the Tm value of the pyotinylated oligonucleotide is about 0 to 20 ° C lower. Cool quickly to temperature and incubate at that temperature for several minutes.
  • the base pairing between the single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region and the piotinylated oligonucleotide is biotinylated. This is carried out prior to the immobilization of the oligonucleotide and the streptavidin-coated support, but this order may be either.
  • the solution when using a PCR tube coated with streptavidin, the solution is first removed by pipetting or decantation, and then the washing buffer is approximately equivalent to the volume of the biological sample. After that, the washing buffer may be removed by pipetting or decanting.
  • the washing buffer when using magnetic beads coated with streptavidin, after fixing the beads with a magnet, first remove the solution by pipetting or decantation, and then wash approximately the same amount as the volume of the biological specimen. After adding a buffer, the washing buffer can be removed by pipetting or decanting. Then, the remaining solution is removed and washed (DNA purification) by performing such an operation several times.
  • This operation is important in order to remove DNA NA that has not been immobilized, or DNA NA that has been suspended in a solution digested with the restriction enzymes described below, from the reaction solution. These operations If the product is insufficient, the DNA floating in the reaction solution will be in a bowl shape, and an unexpected amplification product will be obtained in the amplification reaction. In order to avoid non-specific binding between the support and DNA in biological samples, a large amount of DNA having a nucleotide sequence that is completely different from the target region (eg, rat DNA in the case of human biological samples) is used. To the biological specimen, and then perform the above operation.
  • the target region eg, rat DNA in the case of human biological samples
  • the second (A) step and the second (B) step can be performed simultaneously. Specifically, for example, it may be carried out as follows. To the sample obtained in (d) above, add the optimal buffer (330 mM Tris-Acetate H7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc2, 5 mM Dithiothreitol) to 3 / L, methylation sensitive restriction enzyme Hpal I Or fflial (10U / XL), etc.
  • the optimal buffer 330 mM Tris-Acetate H7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc2, 5 mM Dithiothreitol
  • the resulting free digest (in the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme protected with the masking oligonucleotide) Remove and wash (DNA purification) the single-stranded DNA (NA) containing one or more ammethyl CpG. More specifically, for example, when using a PCR tube coated with streptavidin, the solution is first removed by pipetting or decantation, and then washed with an amount equivalent to the volume of the biological specimen. After adding the purification buffer, the washing buffer can be removed by pipetting or decanting.
  • the washing buffer may be removed by pipetting or decanting. Subsequently, by performing such an operation several times, digestion (single-stranded DNA containing one or more CpG in the methylated state at the restriction enzyme recognition site) and washing (DNA purification) To do.
  • steps (i) and (ii) of the measurement method of the present invention A single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region up to the second step, and one of the 3 ′ ends of the single-stranded DNA
  • a base pair is paired with a single-stranded immobilized oligonucleotide having a base sequence that is complementary to a portion (however, the target DNA region is not included), and the target DNA region
  • base-pairing can be mentioned in a reaction system containing a divalent cation.
  • the divalent cation is a magnesium ion.
  • the “reaction system containing a divalent cation” refers to an annealing buffer used for base-pairing the single-stranded DNA (positive strand) and the single-stranded immobilized oligonucleotide.
  • a salt containing magnesium ions eg, MgOAc 2, MgCl 2, etc.
  • concentration of lmM to 60 OmM is included. It is good to be.
  • the second step of the combination step (i) of the measurement method of the present invention and the combination
  • the treatment with a plurality of methylation sensitive restriction enzymes is performed in the second (B) step of the step (ii)
  • the optimal buffer 330 mM Tris- Acetate H 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM Mg0Ac2, 5 mM Dithiothreitol
  • one or more methylation-sensitive restriction enzymes Hpall and / or Hhal (10 U / L) etc.
  • the washing buffer may be removed by pipetting or decanting.
  • the washing buffer may be removed by pipetting or decanting.
  • the “DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological sample” does not use the target DNA region of the genomic DNA as a recognition cleavage site.
  • One preferred embodiment is a DNA sample that has been previously digested with a restriction enzyme.
  • genomic DNA obtained DNA contained in a biological sample with this immobilized oligonucleotide
  • short-form DNA is easier to select, and the target region is determined by PCR.
  • amplifying DNA it is considered better to have a short cage DNA.
  • a restriction enzyme that does not use the DNA cleavage region as a recognition cleavage site may be used directly for DNA samples derived from genomic DNA contained in biological samples.
  • a general restriction enzyme treatment method may be used as a method for digesting with a restriction enzyme that does not use the target DNA region as a recognition cleavage site.
  • the “DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological sample” is a DNA sample that has been digested with one or more methylation-sensitive restriction enzymes. be able to.
  • the amount of methylation can be obtained with high accuracy by digesting the biological specimen itself with the restriction enzymes as described above. This method is useful for eliminating the “DNA residue” as described above.
  • a method of digesting a sample derived from genomic DNA contained in a biological sample with a methylation-sensitive restriction enzyme the same method as described above may be used when the biological sample is genomic DNA itself.
  • a large excess of methylation sensitive restriction enzyme for example, 500 times the amount of DNA (25 U) (10 U)
  • digestion may be carried out using a methylase sensitive restriction enzyme or more.
  • the third step of the measurement method of the present invention as a pre-step of each of the following steps, single-stranded DNA that is an undigested product obtained in the second step (methylation sensitivity protected with the masking oligonucleotide described above)
  • the generated single-stranded DNA (positive strand) and the single-stranded oligonucleotide are base-paired to select the generated single-stranded DNA in the above-mentioned manner.
  • a step of forming a DNA formed by base pairing of the single-stranded DNA and the single-stranded oligonucleotide (second (A) pre-step),
  • the DNA formed in the step (second (A) pre-step) is the DNA of the selected single-stranded state as a cage, and the single-stranded oligonucleotide is a primer.
  • the double-stranded DNA extended in the second pre-process (the double-stranded DNA containing no CpG pair in the methylated state at the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme protected by the masking oligonucleotide described above)
  • the generated single-stranded DNA (NA) (positive strand) and the single-stranded immobilized oligonucleotide (negative strand) are base-paired to form the single-stranded DNA (NA) in the single-stranded state.
  • 1st step to select the DNA, and the single-stranded DNA selected in the 1st A step is used as a cage, and the primer is extended once using the single-stranded immobilized oligonucleotide as a primer.
  • the first step A having the second step A in which the DNA in the single-stranded state is elongated as a double-stranded DNA, and
  • each of these steps is repeated once after the elongated double-stranded DNA obtained in each step is separated into a single-stranded state, and then the DNA region of interest is repeated. Amplify the methylated DNA in to a detectable amount and quantify the amount of amplified DNA.
  • the third step of the measurement method of the present invention first, as a first step among the following steps of each of the following steps, single-stranded DNA that is an undigested product obtained in the second step (the above-mentioned masking Once the oligonucleotide-protected methylation-sensitive restriction enzyme recognition site is separated from the single-stranded immobilized oligonucleotide and the masking oligonucleotide, the single-stranded DNA containing no CpG in the methylated state at the recognition site Make single-stranded DNA.
  • single-stranded DNA that is an undigested product obtained in the second step (the recognition site of the above-mentioned masking oligonucleotide-protected methylation-sensitive restriction enzyme does not contain an ammethyl CpG)
  • Single-stranded DNA is added to the annealing buffer to obtain a mixture.
  • the resulting mixture is then heated at 95 ° C. for several minutes.
  • pre-process specifically, for example, it may be carried out according to the first process of the combination process (ii), and the single-stranded DNA and single-stranded oligonucleotide in the methylated state are bases.
  • the second step (B) is carried out as follows when, for example, the single-stranded oligonucleotide is an immobilized oligonucleotide.
  • the elongated double-stranded DNA obtained in the second previous step (ammethylation at the recognition site of the above-mentioned masking oligonucleotide-protected methylation sensitive restriction enzyme)
  • the double-stranded DNA that does not contain the CpG pair in the state is temporarily separated into DNA (negative strand) that is single-stranded and DNA (negative strand) that is single-stranded.
  • an extended double-stranded DNA obtained in the second previous step an unmethylated CpG pair is added to the recognition site of the methylation sensitive restriction enzyme protected with the masking oligonucleotide). Add the annealing buffer to the stretched double-stranded DNA that does not contain the mixture to obtain a mixture.
  • the resulting mixture is then heated at 95 ° C for several minutes.
  • the single-stranded immobilized oligonucleotide (negative strand) is used. Immediately cool to a temperature about 0-20 ° C lower than the Tm value, and keep the temperature at that temperature for several minutes.
  • the DNA in the single-stranded state is elongated as double-stranded DNA (that is, the second step A in step A). Specifically, it may be carried out in accordance with, for example, the following description or the operation method in the extension reaction in the second (B) pre-process of the present invention measurement method described above.
  • each of the steps is repeated after separating the elongated double-stranded DNA obtained in each step into a single-stranded state (for example, step A and step B).
  • step A and step B a single-stranded state
  • the reaction from the first previous step to the present step can be carried out as one PCR reaction.
  • a method for amplifying the target DNA region ie, the target region
  • PCR can be used.
  • this immobilized oligonucleotide can be used as a primer on one side when amplifying the target region, an amplification product is obtained by adding only the other primer and performing PCR, and the amplification product is also immobilized. Will be. In this case, if a primer previously labeled with fluorescence or the like is used and the label is used as an index, the presence or absence of an amplification product can be evaluated without performing a cumbersome operation such as electrophoresis.
  • the PCR reaction solution include DNA obtained in the second step of the measurement method of the present invention, 0.15 1 of 50 ⁇ M primer solution, 2.5 zl of 2 mM dNTP, buffer solution (lOOmM Tris-HCl pH 8.3).
  • the reaction may be carried out by adding an appropriate amount of betaine, DMSO, etc. at times.
  • the above reaction solution is kept at 95 ° C for 10 minutes and then at 95 ° C for 30 seconds.
  • the condition is that the temperature is kept for 30 to 40 cycles at 55 to 65 for 30 seconds and then for 30 seconds as one cycle.
  • the obtained amplification product is detected. For example, if a pre-labeled primer is used, the same washing as before
  • the amount of the immobilized fluorescent label can be measured.
  • PCR is performed using a normal unlabeled primer, annealing is performed on gold colloid particles, probes labeled with fluorescence, etc., and the amount of the probe bound to the target region is measured. Can be detected.
  • real-time PCR may be used to obtain the amount of amplification product with higher accuracy.
  • Real-time PCR is a method of monitoring PCR in real time and analyzing the obtained monitoring results with kinetics. For example, it can detect even a slight difference of about twice the gene amount. This method is known as quantitative PCR.
  • Examples of the real-time PCR method include a method using a probe such as a saddle type-dependent nucleic acid polymerase probe, and a method using an intercalator such as Cyber Green. Commercially available equipment and kits for real-time PCR may be used.
  • the detection is not particularly limited, and detection by any known method can be performed. In these methods, operations up to detection can be performed without changing the reaction vessel.
  • a new pyotinylated oligonucleotide is designed on the 3 'end side of the primer or single-stranded immobilized oligonucleotide with the same base sequence as the single-stranded immobilized oligonucleotide.
  • the obtained amplification product is immobilized if there is a support coated with streptavidin.
  • streptavidin For example, when PCR is performed in a streptavidin-coated PCR tube, it is immobilized in the tube. Therefore, as described above, the amplification product can be easily detected by using a labeled primer. If the previous single-stranded immobilized oligonucleotide is immobilized by covalent bonds or the like, the solution containing the amplification product obtained by PCR is transferred to a container with a streptavidin-coated support, and the amplification product is transferred. Immobilize Is possible. The detection may be performed as described above.
  • the complementary primer that amplifies the target region must be a primer that can amplify a target region having one or more recognition sites for methylation-sensitive restriction enzymes and does not include the recognition site.
  • the reason is as follows. Methylation at the 3 'end of the DNA strand (new strand) of the double-stranded DNA obtained by the selection and single extension reaction on the final immobilized oligonucleotide side is methylated only at the recognition site of the sensitive restriction enzyme. If not, only that part will be digested with methylation sensitive restriction enzymes. After digestion, even if washing is performed as described above, double-stranded DNA that has lost only a part of the 3 ′ end of the nascent strand remains in an immobilized state.
  • the 3' end of the primer has several bases on the 3 'end of the nascent strand. This is because annealing with several bases may result in amplification of the target region by PCR.
  • the present invention provides a single-strand containing the above-mentioned DNA region before or after the first pre-step of the third step of the measurement method of the present invention or before or after the third pre-step of the third step.
  • a method further comprising:
  • Step C 1 The DNA in the single-stranded state selected in Step C 1 is used as a saddle type, the single-stranded oligonucleotide (negative strand) is used as a primer, and the primer is extended once, thereby
  • This step 1C Modification 2, which has the second step C to convert DNA in a single-stranded state into elongated double-stranded DNA
  • the method further comprises the following one step (hereinafter referred to as the present methylation ratio measurement method) There is also.)
  • Step C 1 DNA that is in a single-stranded state selected in Step C 1 is used as a saddle, and the primer is extended once by using the single-stranded oligonucleotide (negative strand) as a primer.
  • the second step C 2 which has a single-stranded state DN A as an elongated double-stranded DN A and the second step C 2
  • Each of the third steps of the measurement method of the present invention further comprises the following one step.
  • Step C 1 By using the DNA in the single-stranded state selected in Step C 1 as a saddle, using the single-stranded oligonucleotide (negative strand) as a primer, and extending the primer once,
  • the first step C (Modification 4) having the second step C 2 in which the double-stranded DN A is formed as an extension of the single-stranded state DN A.
  • Each of the third steps of the measurement method of the present invention further comprises the following one step.
  • DNA that is in a single-stranded state selected in Step C 1 is used as a saddle, and the primer is extended once by using the single-stranded oligonucleotide (negative strand) as a primer.
  • Double-stranded DN A formed by extending the single-stranded state of DN A
  • the part of the 3 ′ end of the single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region (provided that The target DNA region is not included.)
  • a single-stranded oligonucleotide (negative strand) having a base sequence complementary to) and in a free state is added to the reaction system, etc.
  • the single-stranded oligonucleotide (negative strand) added to the reaction system in the pre-addition step does not include the 3 and part of the end of the single-stranded DNA (however, the target DNA region is not included).
  • a 5 ′ end is a single-stranded oligonucleotide in a free state having a base sequence that is the same as the single-stranded immobilized oligonucleotide,
  • the base sequence may be the same as that of the single-stranded immobilized oligonucleotide, or may be a short base sequence, or a long sequence.
  • the reverse primer positive strand
  • the single-stranded oligonucleotide negative strand
  • the single-stranded oligonucleotide is used as a cage to extend. It is important that the single-stranded oligonucleotide is in a free state that cannot be used for the reaction of extending the primer.
  • the present immobilized oligonucleotide is used as a primer on one side and only the other primer is added to perform PCR.
  • the third step of the measurement method of the present invention has a repeating step.
  • the generated single-stranded DNA (positive strand)” in the first step A 1 means the first third step.
  • Operation This means “generated“ free ”single-stranded DNA (positive strand)” in both the operation and the repetition of the third step after the second round.
  • DNA (negative strand) in the generated single-strand state” in Step B means both the first step of the third step and the second and subsequent third steps.
  • the third step has an additional step C, the “generated“ fixed ”single-stranded DNA (positive strand)” in the first step of the third step operation
  • “generated“ fixed ”single-stranded state DNA NA (positive strand)” and “generated“ free ”single-stranded state It means both “D NA (positive chain)”.
  • the “stretched double-stranded DNA” obtained in each step of the third step is the same as that for the masking in the first step of the third step in the case of step A.
  • a double-stranded DNA formed by extension containing no CpG pair in the methylated state at the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme protected by the masking oligonucleotide and “the above-mentioned This means both a double-stranded DNA formed by extension containing a CpG pair in the methylated state at the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme protected by the masking oligonucleotide.
  • step B in both the first step operation and the second and subsequent third step repeat operations, “the recognition of the methylation-sensitive restriction enzyme protected by the masking oligonucleotide” is performed. In the region, it means “stretched double-stranded DNA NA that is an all-methyl CpG pair”.
  • the present invention also includes a methylation ratio measurement method (ie, the present invention methylation ratio measurement method) characterized by additionally comprising the following two steps as steps of the measurement method of the present invention.
  • the DNA (methyl) of the target DNA region is obtained.
  • the methylation ratio measurement method may be used in the following situations.
  • abnormal DNA methylation occurs in various diseases (for example, cancer), and it is considered that the degree of various diseases can be measured by detecting this abnormal DNA methylation. .
  • the present measurement method or the present methylation rate measurement method is performed on the DNA region.
  • the amount of methylated DNA will be large.
  • genomics contained in biological samples of healthy individuals There is a DNA region with a low methylation rate in genomic DNA and a genomic DNA contained in a biological specimen of a diseased patient with a high methylation rate, and for the DNA region, the measurement method of the present invention or the present methylation rate If the measurement method is carried out, in the case of a healthy person, the amount of methylated DNA shows a value close to 0, whereas in the case of a disease patient, the value is significantly greater than the value in the case of a healthy person. Since it shows a high value, the “degree of disease” can be determined based on the difference between the values. The “degree of disease” here has the same meaning as that generally used in this field.
  • the measurement method of the present invention or the methylation ratio measurement method of the present invention makes it possible to diagnose various diseases by examining methylation abnormality.
  • restriction enzymes and primers that can be used in various methods for measuring the amount of methylated DNA in the target region and measuring the methylation ratio
  • the probe is useful as a reagent for a detection kit.
  • the present invention also provides a detection kit containing these restriction enzymes, primers or probes as reagents, and a detection chip in which these primers or probes are immobilized on a carrier.
  • the scope of rights of the invention measurement method or the methylation ratio measurement method of the present invention includes use in the form of the detection kit or the detection chip as described above using the substantial principle of the method.
  • the methylated oligonucleotide GPR 7-2079-2176 / 98mer-M (7) and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18 and the recognition sequence of H pa II is unmethylated Nucleotides GPR 7 -2 0 7 9 -2 176 / 98me r-UM were synthesized to prepare 0.001 pmol / 10 / L TE buffer solutions for each.
  • the resulting mixture was heated at 95 T: for 5 minutes. Thereafter, it was quickly cooled to 50 and kept at that temperature for 5 minutes. Next, this was kept at 37 ° C. for 5 minutes and then returned to room temperature. Next, the pre-prepared mixture was added to the PCR tube coated with streptavidin as described above, and this was further incubated at 37 for 5 minutes.
  • IOOL wash buffer 1 [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (IraM K P0 3 mM Na 2 HP0-70, 15 mM NaCl H7.4)] The buffer was removed by pipetting. This operation was repeated two more times. The single-stranded DNA thus obtained was subjected to the following three treatments.
  • Group A (untreated group): 1 OX buffer (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM Mg0Ac2, 5 mM) Dithiothrei tol) and 3X of 10XBSA (Bovine serum albumin lmg / ml) are added, and sterilized ultrapure water is added to the mixture to a volume of 30 iL.
  • 1 OX buffer 330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM Mg0Ac2, 5 mM
  • Dithiothrei tol 3X of 10XBSA (Bovine serum albumin lmg / ml) are added, and sterilized ultrapure water is added to the mixture to a volume of 30 iL.
  • 10XBSA Bovine serum albumin lmg / ml
  • Group B (digested with Hpa II): The single-stranded DNA prepared above contains 15 U of Hpa II and 10 X buffer (330 Tris-Acetate) optimal for Hpal I and Hha I Add 3 L of pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM Mg0Ac2, 5 mM Di thiothrei tol) and 3 ⁇ L of 10 XB SA (Bovine serum albumin lmg / ml), and add sterile ultrapure water to the mixture. The liquid volume was 30 ⁇ L.
  • 10 XB SA Bovine serum albumin lmg / ml
  • Group C (addition of masking oligonucleotide and digestion with Hpa II): Single strand DNA prepared above, 15 U of Hp all, Hpa II and Hha 10 L buffer (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, lOOmM MgOAc2, 5 mM Dithiothreitol) 3 L, 10 XBSA (Bovine serum albumin lmg / ml) 3 L, SEQ ID NO: 20 5 pmo 1 of masking oligonucleotide MA consisting of the base sequence described above was added, and sterilized ultrapure water was added to the mixture to adjust the volume to 30 / L.
  • Hp all Single strand DNA prepared above, 15 U of Hp all, Hpa II and Hha 10 L buffer (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, lOOmM MgOAc2, 5 mM Dithiothreitol
  • a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 21 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 22 were added to the vertical DNA.
  • 3 each of the solutions prepared in 3 3 L each of 2 mM dNTPs, 3 L of buffer solution (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 raM KCK 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin), heat resistant DNA polymerase Z (AmpliTaq Gold) 0.15 L of 5UZ / iL and 6 L of 5 N alkaline water solution were mixed, and sterilized ultrapure water was added to adjust the volume to 30 zL. .
  • the reaction solution was kept at 95 ° C for 10 minutes, then kept at 95 ° C for 30 seconds, then at 59 ° C for 30 seconds, and further at 72 ° C for 45 seconds for one cycle.
  • PCR was performed.
  • Bio-GPR 7-2176 R consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 19 was synthesized to prepare 0.1 M TE buffer solution. did.
  • Annealing buffer (330 mM Tris- Acetate H 7.9, 660 mM K0Ac, 10 OmM gOAc2, 5mM Dithiothreiol) 2 L was added, and sterilized ultrapure water was added to the mixture to make the volume 20 and mixed.
  • Three methylated and unmethylated oligonucleotides were prepared. The resulting mixture was heated at 95 ° C. for 5 minutes. After that, it was quickly cooled to 50 ° C and kept at that temperature for 5 minutes. Next, this was kept at 37 ° C. for 5 minutes and then returned to room temperature. Next, to the PCR tube coated with streptavidin, the previously prepared mixture was added as described above, and this was further incubated at 37 ° C for 5 minutes.
  • Group A (untreated group): 1 OX buffer (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660raM K0Ac, lOOmM Mg0Ac2, 5 mM) that is optimal for Hpa II and Hha I. Dithiothreitol) and 10XBSA (Bovine serum albumin lmg / ml) and 3 £ L are added, and sterilized ultrapure water is added to the mixture to a volume of 30 L.
  • 1 OX buffer 330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660raM K0Ac, lOOmM Mg0Ac2, 5 mM
  • Dithiothreitol Dithiothreitol
  • 10XBSA Bovine serum albumin lmg / ml
  • Group B (digested with Hp al I): Single-stranded DNA prepared above, 15 U of Hp a II, and 10 X buffer (330 mM Tris-Acet optimal for Hp al I and Hha I) Add 3 L of ate pH 7.9, 66 OmM OAc, lOOmM Mg0Ac2, 5 mM Dithiothreitol) and 3 of 10 XBSA (Bovine serum albumin lmg / ml), and add sterilized ultrapure water to the mixture. 30 ⁇ L.
  • Group C Additional masking oligonucleotide and digestion with Hpa II: Single-stranded DNA prepared above, 15U of Hpal I, 10X buffer optimal for Hpal I and Hha I 3 iL of the solution (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc2, 5 mM Dithiothreitol), 3 L of 10XBSA (Bovine serum albumin lrng / ml), and oligonucleo 5 pmo 1 of leotide MA was added, and sterilized ultrapure water was further added to the mixture to adjust the volume to 30 ⁇ L.
  • 10XBSA Bovine serum albumin lrng / ml
  • the arrangement type number 22 prepared in 33 xxMM is prepared in DDNNAA, which is a vertical type. 11 from the base sequence sequence shown in 11 and from the base sequence sequence shown in sequence sequence number 2222
  • DDNNAA a slow buffer solution
  • the solution solutions of the Rupla Immerser, 33 LL each of the 22 mm MM ddNNTTPP, and a slow buffer solution ((110000 mm MM TTrriiss--HHCCll ppHH 88..33 , 550000mmMM KKCCKK 1155mmMM MMggCCll good 00..0011 %% GGeellaattiinn)) 33, and heat and heat resistant 55 DDNNAA poplar limelarase 1 ((AAmmpplliiTTaaqq GGoolldd)) 55UU // LL 00..11 55 // LL and 55 NN Bebetataiin water solution 66 X
  • the liquid liquid volume of 3300 LL was used.
  • the reaction solution is kept at 9955 ° CC for 1100 minutes, and then it is dispensed for 3300 seconds at 9955 ° CC.
  • HHpp aa II II processing group In the AA processing group ((Non-processing group)) and BB processing group ((HHpp aa II II processing group)), the HHpp aa ll II Metetylylated oligogononucleoeotide GGPPRR77—— 22007799—— 22117766 // 9988mmee rr—— MM ((77)) (( MM)), and the recognition sequence of HHpp aall II must be methethylylated, and the anemonmethitylated oligogononucleotide GGPPRR 77- -2200
  • CC processing group (Additional addition for tiger gokinuku clereo tide for mas skiing ++ group of digestion processing group by HHpp aa II II))
  • the HHpp aall II recognition / recognition sequence is methethylylated, and the methicylated group GGPPRR 77--22007799--22117766 // 9988mmee rr In MM ((77)) ((MM)), it is confirmed that DDNNAA's gain is increased.
  • Mammal breast cancer cell line M CF-7 (ATCC NO. HTB-22) purchased from ATCC is cultured until confluent in the special medium for the cell line described in the ATCC catalog. As a result, about 1 ⁇ 10 7 cells were obtained. After adding 10 times volume of SEDTA buffer [10 mM Tris-HCl pH 8.0, lOmM EDTA pH 8.0, lOOmM NaCl] to the obtained cells, this was homogenized. After adding proteinas e K (Sigma) to 500 gXm 1 and sodium dodecyl sulfate to 1% (w / v), the mixture was shaken at 55 ° C. for about 16 hours.
  • SEDTA buffer 10 mM Tris-HCl pH 8.0, lOmM EDTA pH 8.0, lOOmM NaCl
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 24 used as a test sample (shown in Genbank Accession No. M80343, etc.) DNA fragment containing the LINE1 sequence (region corresponding to base numbers 257 to 352) (DNA fragment XI, having the base sequence shown by SEQ ID NO: 25.
  • Base number of LI NE 1 sequence shown by Genbank Accession NO.M80343, etc. A region corresponding to 8 to 480 was amplified.
  • the PCR reaction solution consisted of 2 ng of genomic DNA in the form of ⁇ , a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 26 prepared in 100 pmo 1/1 and the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 Primer solution 0.125 w 1 each, 2 mM dNTP 2.5 1 and 10 X buffer (lOOmM Tris-HCl H 8.3, 500 mM KC1, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) 2.5 1 and thermostable DNA polymerase 5U 1 were mixed with 0.125 1 and sterilized ultrapure water was added to make the volume 25 1. The reaction solution is kept at 95 ° C for 10 minutes, then at 95 ° C for 30 seconds, then at 63 ° C for 60 seconds and then at 72 ° C for 45 seconds for one cycle for 50 cycles. PCR was performed under the conditions used.
  • DNA fragment Y 1 A part of the obtained DNA fragment X 1 was treated with methylase S ss I (NEB), and 5 -CG-3 'all of the DNA fragment (hereinafter referred to as DNA fragment Y 1) was methylated. Obtained. Again, as before, confirm amplification by 1.5% agarose gel electrophoresis, excise the DNA fragment of interest (473 bp, DNA fragment Yl) and use the QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). This was purified.
  • Group A (untreated group): About 25 ng of DNA fragment, 2 L of 10 X buffer (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc2, 5 mM Dithiothreitol) optimal for Hpa II and Hha I Then add 2 L of 10XBSA (Bovine serum albumin lmg / ml), and add sterile ultrapure water to the mixture to a volume of 20 L.
  • 10XBSA Bovine serum albumin lmg / ml
  • Group B (Hpall treatment group): About 25 ng of DN A fragment, 0.5 U of Hpa II, 10 X buffer solution suitable for Hpa II and Hha I (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 66 OmM KOAc lOOmM Mg0Ac2, 5 mM Dithiothreitol) 2 and 10XBSA (Bovine serum alb awakening in lmg / ml) 2 were added, and sterilized ultrapure water was added to the mixture to make the volume 20 L.
  • 10 X buffer solution suitable for Hpa II and Hha I 330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 66 OmM KOAc lOOmM Mg0Ac2, 5 mM Dithiothreitol
  • 10XBSA Bovine serum alb awakening in lmg / ml
  • Group C About 25 ng of DNA fragment, 0.5 U of Hh a I, and 10 X buffer (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, optimal for Hpa II and Hha I 10 OmM Mg0Ac2, 5 mM Dithiothreitol) and 10 XBSA (Bovine serum albumin lmg / ml) 2 are added, and sterilized ultrapure water is added to the mixture.
  • 10 X buffer 330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, optimal for Hpa II and Hha I 10 OmM Mg0Ac2, 5 mM Dithiothreitol
  • 10 XBSA Bovine serum albumin lmg / ml
  • Group D About 25 ng of DNA fragment, 0.5 U of Hpa II and HaI, respectively, and 10 X buffer (3 30 mM Tris Acetate) that is optimal for Hpa II and Hha I ⁇ 9, 660 mM K0Ac lOOmM MgOAc2, 5 mM Di thiothrei tol) 2 and 10XBSA (Bovine serum albumin lmg / ml) 2 L, add sterile ultrapure water to the mixture 20 XL. Each reaction solution was incubated at 37 ° C for 2 hours, and then sterilized ultrapure water was added to dilute it 100 times.
  • T 1 5'-CGAATATTGCGCTTTTCAGACCGGCTT-3 '(SEQ ID NO: 30)
  • a DNA fragment 62.5 pg in the form of ⁇ and the base represented by SEQ ID NO: 28 prepared in 3 p mo 1/1
  • a primer consisting of a sequence and a primer solution consisting of a base sequence shown in SEQ ID NO: 29 were prepared in 2.5 1 and 2.5 pmo 1 / xL, respectively.
  • 2 L 2 mM dNTP 2.5 1 each, 10X PCR buffer (lOOmM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCK 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) 2.
  • Heat resistant DNA polymerase (AmpliTaq Gold) 5U / 1 was mixed with 0.125 1 and sterilized ultrapure water was added to make the volume 25 1.
  • Real-time PCR was performed using the Gene Amp 5700 Sequence Detection System (Applied Biosystems). In order to amplify the region (DNA) consisting of the base sequence represented by base numbers 1 to 94 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 17, the reaction solution was incubated at 95 ° C for 10 minutes, Real-time PCR was performed with one cycle of 15 seconds at 60 and 60 seconds at 60. The real time; the amount of DNA in the region was quantified based on the PCR results. Three tests were conducted for each biological specimen.
  • FIG. 6 (“IV”) is a fragment with a methylation ratio of 50%, so the theoretical value in the B group, the C group and the D group is “0.5” and FIG. 7 (“V”) are fragments with a methylation ratio of 100%, so the theoretical value in Group B, Group C, and Group D is “1”.
  • FIGS. 3 to 7 it was found that the value closest to this theoretical value was obtained in Group D, and that digestion treatment with two or more methylation-sensitive restriction enzymes was preferable. It was. Industrial applicability
  • Designed oligonucleotide consisting of the desired DNA domain (GPR 7-2 0 7 9-2 1 7 6, methylated cytosine is also represented by C)
  • Oligonucleotide probes designed for real-time PCR designed for real-time PCR

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本発明は、生物由来検体に含まれるゲノムＤＮＡ中の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法等に関する。

Description

明細書
DNAメチル化測定方法 技術分野
本発明は、 生物由来検体に含まれるゲノム DNA中の目的とする DNA領域にお けるメチル化された DN Aの含量を測定する方法等に関する。 背景技術
生物由来検体に含まれるゲノム DN A中の目的とする DN A領域における DN A のメチル化状態を評価するための方法としては、 例えば、 ゲノム DNA中の目的と する D N A領域におけるメチル化された D N Aの含量を測定する方法がある （例え ば、 ucleic Acids Res. 1994 Aug 11 ;22 (15) :2990-7, 及び Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Mar 18;94(6) :2284-9参照） 。 当該測定方法では、 まず、 ゲノム DNA 由来の DN A試料から、 目的とする DN A領域を含む DN Aを抽出する必要があり 、 抽出操作が煩雑である。
また、 抽出された D N Aの目的領域におけるメチル化された D N Aの含量を測定 する方法としては、 例えば、 （1) 亜硫酸塩等を用いて当該 DNAを修飾した後、 DNAポリメラーゼによる DNA合成の連鎖反応 （Polymerase Chain Reaction;以 下、 PCRと記すこともある。 ) に供することにより目的領域を増幅する方法、 （ 2 ) メチル化感受性制限酵素を用いて当該 DNAを消化した後、 PCRに供するこ とにより、 目的領域を増幅する方法等が知られている。 これらのいずれの方法とも 、 メチル化の検出のための DN Aの修飾及びその後の生成物の精製、 PCRのため の反応系の調製、 DN Aの増幅の確認等に手間を要する。 発明の開示
本発明は、 生物由来検体に含まれるゲノム DNA中の目的とする DN A領域にお けるメチル化された D N Aの含量を簡便に測定する方法等を提供することを目的と する。 即ち、 本発明は、
1. 生物由来検体に含まれるゲノム DNA中の目的とする DNA領域におけるメチ ル化された D N Aの含量を測定する方法であって、
下記のいずれかの組み合わせ工程、
( i ) 組み合わせ工程 （ i ) ：
(1) 生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料から、 目的とする DNA領域を含むー本鎖DNA (正鎖） と、 メチル化感受性制限酵素の認識部位の 塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドとを混合す ることにより、 当該メチル化感受性制限酵素の認識部位が保護されてなる一本鎖 D NAを生成させる第一 （A) 工程と、
第一 （A) 工程で保護 ·生成された目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正 鎖） と当該一本鎖 DN Aの 3' 末端の一部 （但し、 前記の目的とする DN A領域を 含まない。 ） に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオ チドとを塩基対合させることにより、 前記の保護 ·生成された一本鎖 DNAを選択 する第一 （B) 工程と
を有する第一工程、 及び、
(2) 第一工程で選択された一本鎖 DNAを 1種類以上のメチル化感受性制限酵素 で消化処理した後、 生成した遊離の消化物 （前記のマスキング用オリゴヌクレオチ ドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位に 1つ以上のアンメチル状態の CpGを含む一本鎖 DNA) を除去する第二工程
からなる組み合わせ工程 （ i ) ；
または、
( i i ) 組み合わせ工程 （i O ：
(1) 生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の DN A試料から、 目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） と、 当該一本鎖 DNAの 3' 末端の一部 （ 伹し、 前記の目的とする DNA領域を含まない。 ） に対して相補性である塩基配列 を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを塩基対合させることにより、 前記の 一本鎖 DNAを選択する第一工程、 及び、 (2) 第一工程で選択された一本鎖 DNAと、 メチル化感受性制限酵素の認識部位 の塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドとを混合 することにより、 当該メチル化感受性制限酵素の認識部位が保護されてなる一本鎖 DNAを生成させる第二 （A) 工程と、
第二 （A) 工程で保護 '生成された一本鎖 DNAを 1種類以上のメチル化感受性制 限酵素で消化処理した後、 生成した遊離の消化物 （前記のマスキング用オリゴヌク レオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位に 1つ以上のアンメチル 状態の CpGを含む一本鎖 DNA) を除去する第二 （B) 工程と
を有する第二工程
からなる組み合わせ工程 （i i) ；
と、
(3) 下記の各本工程の前工程として、 第二工程で得られた未消化物である一本鎖 DNA (前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限 酵素の認識部位にアンメチル状態の C p Gを含まない一本鎖 DNA) を前記の一本 鎖固定化オリゴヌクレオチドと前記のマスキング用オリゴヌクレオチドとの両者か ら一旦分離する工程 （第一前工程） と、
生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と、 一本鎖オリゴヌクレオチドとを塩基 対合させることにより、 前記の生成した一本鎖状態である DNAを選択し、 選択さ れた一本鎖状態である D N Aと前記の一本鎖ォリゴヌクレオチドとが塩基対合して なる DN Aを形成させる工程 （第二 （A) 前工程） と、
当該工程 （第二 （A) 前工程） で形成された DNAを、 前記の選択された一本鎖状 態である DN Aを錶型として、 前記の一本鎖オリゴヌクレオチドをプライマ一とし て、 当該プライマ一を 1回伸長させることにより、 前記の選択された一本鎖状態で ある DNAを伸長形成された二本鎖 DNAとする工程 （第二 （B) 前工程） と を有する工程 （第二前工程） と、
第二前工程で伸長形成された二本鎖 DNA (前記のマスキング用オリゴヌクレオチ ドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態の C p G対を 含まない伸長形成された二本鎖 DNA) を、 一本鎖状態である DNA (正鎖） と一 本鎖状態である DNA (負鎖） に一旦分離する工程 （第三前工程） を有し、 且つ、 本工程として
(a) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と前記の一本鎖固定化オリゴヌク レオチド （負鎖） とを塩基対合させることにより、 前記の一本鎖状態である DNA を選択する第 A 1工程と、 第 A 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを铸型 として、 前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマ一として、 当該プライ マ一を 1回伸長させることにより、 前記の一本鎖状態である DN Aを二本鎖 DN A として伸長形成させる第 A 2工程とを有する本工程一 Aと、
(b) 生成した一本鎖状態である DNA (負鎖） を铸型として、 前記の一本鎖状態 である DNA (負鎖） が有する塩基配列の部分塩基配列 （負鎖） であって、 且つ、 前記の目的とする DNA領域の塩基配列 （正鎖） に対して相補性である塩基配列 （ 負鎖） の 3' 末端よりさらに 3' 末端側に位置する部分塩基配列 （負鎖） 、 に対し て相補性である塩基配列 （正鎖） を有する
伸長プライマ一 （リバース用プライマ一） を伸長プライマーとして、 当該伸長ブラ イマ一を 1回伸長させることにより、 前記の一本鎖状態である DN Aを伸長形成さ れたニ本鎖 DN Aとする本工程— Bとを有し、
さらにかかる各本工程を、 前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖 DN Aを 一本鎖状態に一旦分離した後、 繰り返すことにより、 前記の目的とする DNA領域 におけるメチル化された D N Aを検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された D N Aの量を定量する第三工程、
とを有することを特徴とする方法 （以下、 本発明測定方法と記すこともある。 ） ； 2. 第一工程において、 目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） と、 当 該一本鎖 DNAの 3' 末端の一部 （但し、 前記の目的とする DNA領域を含まない 。 ） に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを 塩基対合させる際に、 二価陽イオンを含有する反応系中で塩基対合させることを特 徴とする前項 1記載の方法；
3. 二価陽イオンがマグネシウムイオンであることを特徴とする前項 2記載の方法 4. 前項 1〜 3のいずれかに記載の第三工程の第一前工程の前に、
前記の目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） の 3' 末端の一部に対し て相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド （負 鎖） を反応系内に添加する工程 （追加前工程） を追加的に有し、 且つ、
前項 1記載の第三工程の各本工程として、 下記の 1つの工程をさらに追加的に有す ることを特徴とする方法。
(c) (i) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と、 上記の追加前工程で反 応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） とを塩基対合させることに より、 前記の一本鎖状態である DNAを選択する第 C 1工程と、
(i i) 第 C 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを铸型として、 前記の一 本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） をプライマ一として、 当該プライマーを 1回伸長 させることにより、 前記の一本鎖状態である D N Aを伸長形成されたニ本鎖 D N A とする第 C 2工程とを有する本工程一 C；
5. 前項 1〜 3のいずれかに記載の第三工程の第一前工程の後に、
前記の目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） の 3' 末端の一部に対し て相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖ォリゴヌクレオチド （負 鎖） を反応系内に添加する工程 （追加前工程） を追加的に有し、 且つ、
前項 1記載の第三工程の各本工程として、 下記の 1つの工程をさらに追加的に有す ることを特徴とする方法。
(c) ( i) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と、 上記の追加前工程で反 応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） とを塩基対合させることに より、 前記の一本鎖状態である DN Aを選択する第 C 1工程と、
( i i) 第 C 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを铸型として、 前記の一 本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） をプライマーとして、 当該プライマ一を 1回伸長 させることにより、 前記の一本鎖状態である DNAを伸長形成された二本鎖 DNA とする第 C 2工程とを有する本工程—C；
6. 前項 1〜 3のいずれかに記載の第三工程の第三前工程の前に、
前記の目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） の 3， 末端の一部に対し て相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド （負 鎖） を反応系内に添加する工程 （追加前工程） を追加的に有し、 且つ、
前項 1記載の第三工程の各本工程として、 下記の 1つの工程をさらに追加的に有す ることを特徴とする方法。
(c) (i) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と、 上記の追加前工程で反 応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） とを塩基対合させることに より、 前記の一本鎖状態である DNAを選択する第 C 1工程と、
(i i) 第 C 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを铸型として、 前記の一 本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） をプライマ一として、 当該プライマ一を 1回伸長 させることにより、 前記の一本鎖状態である DNAを伸長形成された二本鎖 DNA とする第 C 2工程とを有する本工程一 C；
7. 前項 1〜 3のいずれかに記載の第三工程の第三前工程の後に、
前記の目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） の 3' 末端の一部に対し て相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド （負 鎖） を反応系内に添加する工程 （追加前工程） を追加的に有し、 且つ、
前項 1記載の第三工程の各本工程として、 下記の 1つの工程をさらに追加的に有す ることを特徴とする方法。
(c) ( i) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と、 上記の追加前工程で反 応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） とを塩基対合させることに より、 前記の一本鎖状態である DNAを選択する第 C 1工程と、
(i i) 第 C 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを鎵型として、 前記の一 本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） をプライマーとして、 当該プライマ一を 1回伸長 させることにより、 前記の一本鎖状態である D N Aを伸長形成されたニ本鎖 D N A とする第 C 2工程とを有する本工程一 C；
8. 前項 1〜7のいずれかに記載の方法の工程として、 下記の 2つの工程をさらに 追加的に有することを特徴とするメチル化割合の測定方法 （以下、 本発明メチル化 割合測定方法と記すこともある。 ） 。
(4) 前項 1〜7のいずれかの前項記載の方法の第一工程を行った後、 前項 1〜7 のいずれかの前項記載の方法の組み合わせ工程 （ i ) の第二工程又は組み合わせェ 程 （i i) の第二 （B) 工程を行うことなく、 前項 1〜7のいずれかの前項記載の 方法における第三工程を行うことにより、 前記の目的とする DNA領域の DNA ( メチル化された DN A及びメチルされていない DN Aの総量） を検出可能な量にな るまで増幅し、 増幅された DN Aの量を定量する第四工程、 及び、
(5) 前項 1〜 7のいずれかの前項記載の第三工程により定量された D N Aの量と 、 第四工程により定量された DN Aの量とを比較することにより得られる差異に基 づき前記の目的とする DN A領域におけるメチル化された DN Aの割合を算出する 第五工程；
9. 生物由来検体が、 哺乳動物の血清又は血漿であることを特徴とする前項 1〜8 のいずれかぶ記載の方法；
10. 生物由来検体が、 哺乳動物の血液又は体液であることを特徴とする前項 1〜 8のいずれかに記載の方法；
11. 生物由来検体が、 細胞溶解液又は組織溶解液であることを特徴とする前項 1 〜 8のいずれかに記載の方法；
12. 生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料が、 当該ゲノム D NAが有する目的とする DN A領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処 理されてなる DNA試料であることを特徴とする前項 1〜 11のいずれかに記載の 方法；
13. 生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料が、 1種類以上の メチル化感受性制限酵素で消化処理されてなる D N A試料であることを特徴とする 前項 1〜 12のいずれかに記載の方法；
14. 生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料が、 予め精製され てなる DNA試料であることを特徴とする前項 1〜13のいずれかに記載の方法； 15. 1種類以上のメチル化感受性制限酵素が、 生物由来検体中に含まれるゲノム DN Aが有する目的とする DN A領域の中に認識切断部位を有する制限酵素である ことを特徴とする前項 1〜14のいずれかに記載の方法；及び
16. 1種類以上のメチル化感受性制限酵素が、 メチル化感受性制限酵素である Hpa I I、 又は Hhalであることを特徴とする前項 1〜1 5のいずれかに記載の方法； 等を提供するものである。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1において、 調製されたサンプルに、 「A (無処理） 」 、 「B (H pal l処理） 」 又は 「C (マスキング用オリゴヌクレオチド添加 +HpaI I処理） 」 のい ずれかの処理を施し、 配列番号 2 3で示された塩基配列からなる領域におけるメチ ル化された D NAを P C Rにて増幅し、 得られた増幅産物を 1 . 5 %ァガロースゲ ル電気泳動した結果を示した図である。 図中の一番左のレーンから、 Hpal lの認識配 列がメチル化されているメチル化オリゴヌクレオチド GPR7- 2079- 2176/98mer- M (7) ( M) の 「A」 処理が施されたサンプル、 Hpal lの認識配列がメチル化されているメチ ル化オリゴヌクレオチド GPR7-2079- 2176/98mer- M (7) (M) の 「B」 処理が施された サンプル、 Hpal Iの認識配列がメチル化されているメチル化ォリゴヌクレオチ GPR 7-2079-2176/98mer-M (7) (M) の 「C」 処理が施されたサンプル、 Hpal lの認識配列 がメチル化されていないアンメチル化ォリゴヌクレオチド GPR7-2079-2176/98mer - UM (U) の 「A」 処理が施されたサンプル、 Hpal lの認識配列がメチル化されていない アンメチル化オリゴヌクレオチド GPR7-2079-2176/98mer- UM (U) の 「B」 処理が施 されたサンプル、 Hpal lの認識配列がメチル化されていないアンメチル化オリゴヌク レオチド GPR7- 2079- 2176/98mer- UM (U) の 「C」 処理が施されたサンプルでの結果 を示している。
図 2は、 実施例 2において、 調製されたサンプルに、 「A (無処理） 」 、 「B (H pal l処理） 」 又は 「C (マスキング用オリゴヌクレオチド添加 +HpaI I処理） 」 のい ずれかの処理を施し、 配列番号 2 3で示された塩基配列からなる領域におけるメチ ル化された D NAを P C Rにて増幅し、 得られた増幅産物を 1 . 5 %ァガロースゲ ル電気泳動した結果を示した図である。 図中の一番左のレーンから、 Hpal lの認識 配列がメチル化されているメチル化ォリゴヌクレオチド GPR7-2079- 2176/98mer- M (7) (M) の 「A」 処理が施されたサンプル、 Hpal lの認識配列がメチル化されているメ チル化オリゴヌクレオチド GPR7-2079- 2176/98mer-M (7) (M) の 「B」 処理が施され R7-2079-2176/98mer-M (7) (M) の 「C」 処理が施されたサンプル、 Hpal lの認識配 列がメチル化されていないアンメチル化オリゴヌクレオチド GPR7- 2079- 2176/98mer- UM (U) の 「A」 処理が施されたサンプル、 Hpal Iの認識配列がメチル化されていな いアンメチル化オリゴヌクレオチド GPR7- 2079- 2176/98nier- UM (U) の 「B」 処理が 施されたサンプル、 Hpal lの認識配列がメチル化されていないアンメチル化オリゴヌ クレオチド GPR7- 2079- 2176/98mer- UM (U) の 「C」 処理が施されたサンプルでの結 果を示している。
図 3は、 実施例 3において、 調製されたサンプル Γ ( I ) 」 に、 「A (無処理） 」 、 「B (Hpal l処理） 」 、 「C (Hhal処理） 」 又は 「D (¾&11及ぴ¾1&1の同時処 理） 」 のいずれかの処理を施し、 配列番号 2 4で示された塩基配列からなる領域に おけるメチル化された D N Aの量をリアルタイム P C Rにて測定した結果を示した 図である。 図中の縦軸は、 「A」 処理が施されたサンプルでの D NAの量を 1と した場合の相対値を示している （3回の平均値土標準偏差） 。 また、 理論値とは、 B群、 C群、 D群で予想される計算値 （メチル化割合） を示している。
図 4は、 実施例 3において、 調製されたサンプル 「 （I I ) 」 に、 「A (無処理 ) 」 、 「B (Hpal l処理） 」 、 「C (Hhal処理） 」 又は 「D (¾^11及ぴ 1^1の同時 処理） 」 のいずれかの処理を施し、 配列番号 2 4で示された塩基配列からなる領域 におけるメチル化された D N Aの量をリアルタイム P C Rにて測定した結果を示し た図である。 図中の縦軸は、 「A」 処理が施されたサンプルでの D NAの量を 1 とした場合の相対値を示している （3回の平均値土標準偏差） 。 また、 理論値とは 、 B群、 C群、 D群で予想される計算値 (メチル化割合) を示している。
図 5は、 実施例 3において、 調製されたサンプル 「 （I I I ) 」 に、 「A (無処 理） 」 、 「B (Hpal l処理） 」 、 「C (Hhal処理） 」 又は 「D (Hpal l及ぴ halの同 時処理） 」 のいずれかの処理を施し、 配列番号 2 4で示された塩基配列からなる領 域におけるメチル化された D N Aの量をリアルタイム P C Rにて測定した結果を示 した図である。
図中の縦軸は、 「A」 処理が施されたサンプルでの D NAの量を 1とした場合の 相対値を示している （3回の平均値土標準偏差） 。 また、 理論値とは、 B群、 C群 、 D群で予想される計算値 （メチル化割合） を示している。
図 6は、 実施例 3において、 調製されたサンプル 「 （I V) 」 に、 「A (無処理 ) 」 、 「B (Hpal l処理） 」 、 「C (Hhal処理） 」 又は 「D (Hpal l及ぴ halの同時 処理） 」 のいずれかの処理を施し、 配列番号 2 4で示された塩基配列からなる領域 におけるメチル化された D N Aの量をリアルタイム P C Rにて測定した結果を示し た図である。 図中の縦軸は、 「A」 処理が施されたサンプルでの D NAの量を 1 とした場合の相対値を示している （3回の平均値土標準偏差） 。 また、 理論値とは 、 B群、 C群、 D群で予想される計算値 （メチル化割合） を示している。
図 7は、 実施例 3において、 調製されたサンプル 「 （V) 」 に、 「A (無処理） 」 、 「B (Hpal l処理） 」 、 「C (Hhal処理） 」 又は 「D (Hpal l及ぴ ¾halの同時処 理） 」 のいずれかの処理を施し、 配列番号 2 4で示された塩基配列からなる領域に おけるメチル化された D N Aの量をリアルタイム P C Rにて測定した結果を示した 図である。 図中の縦軸は、 「A」 処理が施されたサンプルでの D NAの量を 1と した場合の相対値を示している （3回の平均値土標準偏差） 。 また、 理論値とは、 B群、 C群、 D群で予想される計算値 （メチル化割合） を示している。 発明を実施するための形態
本発明における 「生物由来検体」 としては、 例えば、 細胞溶解液、 組織溶解液 （ ここでの組織とは、 血液、 リンパ節等を含む広義の意味である。 ） 若しくは、 哺乳 動物においては、 血漿、 血清、 リンパ液等の体液、 体分泌物 （尿や乳汁等） 等の生 体試料及びこれら生体試料から抽出して得られたゲノム D N Aをあげることができ る。 また当該生物由来検体としては、 例えば、 微生物、 ウィルス等由来の試料もあ げられ、 この場合には、 本発明測定方法における 「ゲノム D NA」 とは、 微生物、 ウィルス等のゲノム D NAを意味する。
哺乳動物由来の検体が血液である場合には、 定期健康診断や簡便な検査等での本 発明測定方法の利用が期待できる。
ゲノム D NAを哺乳動物由来の検体から得るには、 例えば、 市販の D NA抽出用 キット等を用いて DNAを抽出すればよい。
血液を検体として用いる場合には、 血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を 調製し、 調製された血漿又は血清を検体として、 その中に含まれる遊離 DNA (胃 癌細胞等の癌細胞由来の DN Aが含まれる） を分析すると、 血球由来の DNAを避 けて胃癌細胞等の癌細胞由来の DNAを解析することができ、 胃癌細胞等の癌細胞 、 それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。 通常、 遺伝子 （ゲノム DNA) を構成する塩基は 4種類である。 これらの塩基の うち、 シトシンのみがメチル化されるという現象が知られており、 このような DN Aのメチル化修飾は、 5' — CG— 3， で示される塩基配列 （Cはシトシンを表し 、 Gはグァニンを表す。 以下、 当該塩基配列を 「CpG」 と記すこともある。 ) 中 のシトシンに限られている。 シトシンにおいてメチル化される部位は、 その 5位で ある。 細胞分裂に先立つ DNA複製に際して、 複製直後は铸型鎖の 「CpG」 中の シトシンのみがメチル化された状態となるが、 メチル基転移酵素の働きにより即座 に新生鎖の 「CpG」 中のシトシンもメチル化される。 従って、 DNAのメチル化 の状態は、 DNA複製後も、 新しい 2組の DN Aにそのまま引き継がれることにな る。 本発明における 「メチル化された DNA」 とは、 このようなメチル化修飾によ り生じた DN Aを意味するものである。
本発明における 「CpG対」 とは、 CpGで示される塩基配列と、 これに相補す る C p Gが塩基対合してなる二本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。 本発明における 「目的とする DNA領域」 （以下、 目的領域と記すこともある。 ) は、 当該領域に含まれるシトシンのメチル化有無を調べようとする DNA領域で あって、 少なくとも 1種類のメチル化感受性制限酵素の認識部位を有する。 例えば 、 Lysyl oxidase, HRAS-like suppressor, bA305P22.2. K Gamma filamin, HAND1, Homologue of RIKEN 2210016F16, FLJ32130, PPARG angiopoietin-related protein 、 Thrombomodulin, p53 - responsive gene 2、 Fibrillin2、 Neurofilament 3、 disint egrin and metal loproteinase domain 23、 G protein-coupled receptor 7、 G-prot ein coupled somatostatin and angiotensin- 1 ike peptide receptor、 Solute carr ier family 6 neurotransmitter transporter noradrenal in member 2等の有用タン パク質遺伝子のプロモータ一領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシンを一つ以上含む D N Aの領域等を挙げることができる。 具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が Lysyl oxidase遺伝子である塲合には 、 そのプロモータ一領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配 列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒト 由来の Lysyl oxidase遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモーター 領域とが含まれるゲノム DN Aの塩基配列を挙げることができ、 より具体的には、 配列番号 1で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AF270645に記載される塩基 配列の塩基番号 16001〜18661で示される塩基配列に相当する。 ） が挙げられる。 配 列番号 1で示される塩基配列においては、 ヒト由来の Lysyl oxidaseタンパク質のァ ミノ末端のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 2031〜2033に示されてお り、 上記ェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1957〜2661に示されている。 配列番号 1で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、 とり わけ配列番号 1で示される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在す る CpG中のシトシンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 (即ち、 高メチル化状態 （hypermethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌 細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 1で示され る塩基配列において、 塩基番号 1539、 1560、 1574、 1600、 1623、 1635、 1644、 1654 、 1661、 1682、 1686、 1696、 1717、 1767、 1774、 1783、 1785、 1787、 1795等で示さ れるシトシンを挙げることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が HRAS- like suppressor遺伝子で ある場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領 域） の塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列と しては、 ヒト由来の HRAS-l ike suppres sor遺伝子のェクソン 1と、 その 5， 上流に 位置するプロモータ一領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることがで き、 より具体的には、 配列番号 2で示される塩基配列 （Genbank Access i on N0. ACO6 8162に記載される塩基配列の塩基番号 172001〜173953で示される塩基配列に相当す る。 ） があげられる。 配列番号 2で示される塩基配列においては、 ヒト由来の HRAS- l ike suppres sor遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1743〜1953に示されて いる。 配列番号 2で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中の シトシン、 とりわけ配列番号 2で示される塩基配列において C p Gが密に存在する 領域中に存在する C p G中のシトシンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高 いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 （hyperme thyl at i on) ) を示す。 さらに具 体的には、 胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列 番号 2で示される塩基配列において、 塩基番号 1316、 1341、 1357、 1359、 1362、 137 4、 1390、 1399、 1405、 1409、 1414、 1416、 1422、 1428、 1434、 1449、 1451、 1454、 1463、 1469、 1477、 1479、 1483、 1488、 1492、 1494、 1496、 1498、 1504、 1510、 151 3、 1518、 1520等で示されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 bA305P22. 2. 1遺伝子である場 合には、 そのプロモータ一領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の 塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては 、 ヒト由来の bA305P22. 2. 1遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモ 一夕一領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、 より具体的 には、 配列番号 3で示される塩基配列 （Genbank Acces s i on No. AL121673に記載され る塩基配列の塩基番号 13001〜 3889で示される塩基配列に相当する。 ） があげられ る。 配列番号 3で示される塩基配列においては、 ヒト由来の bA305P22. 2. 1タンパク 質のアミノ末端のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 849〜851に示され ており、 上記ェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 663〜889に示されている。 配列番 号 3で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、 と りわけ配列番号 3で示される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在 する C p G中のシトシンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻 度 （即ち、 高メチル化状態 （hype rme thy 1 at i on) ) を示す。 さらに具体的には、 胃 癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 3で示さ れる塩基配列において、 塩基番号 329、 335、 337、 351、 363、 373、 405、 424、 427、 446、 465、 472、 486等で示されるシ卜シンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Gamma Π l amin遺伝子である場 合には、 そのプロモータ一領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の 塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては 、 ヒト由来の Ga腿 a f i l amin遺伝子のェクソン 1と、 その 5， 上流に位置するプロモ 一夕一領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、 より具体的 には、 配列番号 4で示される塩基配列 （Genbank Acces s i on No. AC074373に記載され る塩基配列の塩基番号 63528〜64390で示される塩基配列の相補的配列に相当する。 ) があげられる。 配列番号 4で示される塩基配列においては、 ヒト由来の Gamma f i l aminタンパク質のァミノ末端のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 572 〜574に示されており、 上記ェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 463〜863に示されて いる。 配列番号 4で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中の シトシン、 とりわけ配列番号 4で示される塩基配列において C p Gが密に存在する 領域中に存在する C p G中のシトシンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高 いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 （hyperme thyl at i on) ) を示す。 さらに具 体的には、 胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列 番号 4で示される塩基配列において、 塩基番号 329、 333、 337、 350、 353、 360、 363 、 370、 379、 382、 384、 409、 414、 419、 426、 432、 434、 445、 449、 459、 472、 474 、 486、 490、 503、 505等で示されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 HAND1遺伝子である場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列 中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒト由 来の HAND1遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモータ一領域とが含 まれるゲノム DNAの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 5 で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AC026688に記載される塩基配列の塩基 番号 24303〜26500で示される塩基配列の相補的配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 5で示される塩基配列においては、 ヒト由来の HAND1タンパク質のアミノ末 端のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 1656〜1658に示されており、 上 記ェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1400〜2198に示されている。 配列番号 5で示 される塩基配列中に存在する CpGで示される塩基配列中のシトシン、 とりわけ配 列番号 5で示される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在する C p G中のシトシンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち 、 高メチル化状態 （hypermethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌細胞に おいてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 5で示される塩基 配列において、 塩基番号 1153、 1160、 1178、 1187、 1193、 1218、 1232、 1266、 1272 、 1292、 1305、 1307、 1316、 1356、 1377、 1399、 1401、 1422、 1434等で示されるシ トシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Homologue of RIKEN 2210016F 16遺伝子である場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コー ディング領域） の塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む 塩基配列としては、 ヒト由来の Homologue of RIKEN 2210016F16遺伝子のェクソン 1 と、 その 5 ' 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノム DN Aの塩基配 列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 6で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AL354733に記載される塩基配列の塩基番号 157056〜159000で示され る塩基配列の相補的塩基配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 6で示される 塩基配列においては、 ヒト由来の Homologue of RIKEN 2210016F16遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1392〜1945に示されている。 配列番号 6で示される塩基 配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、 とりわけ配列番号 6で 示される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在する C p G中のシト シンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル 化状態 （hypemethyl at ion) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌細胞においてメチ ル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 6で示される塩基配列におい て、 塩基番号 1172、 1175、 1180、 1183、 1189、 1204、 1209、 1267、 1271、 1278、 128 1、 1313、 1319、 1332、 1334、 1338、 1346、 1352、 1358、 1366、 1378、 1392、 1402、 1433、 1436、 1438等で示されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 FLJ32130遺伝子である場合に は、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基 配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒ ト由来の FLJ32130遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモータ一領 域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配 列番号 7で示される塩基配列 （Genbank Access i on No. AC002310に記載される塩基配 列の塩基番号 1〜2379で示される塩基配列の相補的塩基配列に相当する。 ) があげら れる。 配列番号 7で示される塩基配列においては、 ヒト由来の FU32130タンパク質 のアミノ酸末端のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 2136〜2138に示さ れており、 上記ェクソン 1と考えられる塩基配列は、 塩基番号 2136〜2379に示され ている。 配列番号 7で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中 のシトシン、 とりわけ配列番号 7で示される塩基配列において C p Gが密に存在す る領域中に存在する C p G中のシトシンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において 高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 （hypemethyl at i on) ) を示す。 さらに 具体的には、 胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配 列番号 7で示される塩基配列において、 塩基番号 1714、 1716、 1749、 1753、 1762、 1 795、 1814、 1894、 1911、 1915、 1925、 1940、 1955、 1968等で示されるシトシンをあ げることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 PPARG angi opoi et in-re l ated protein遺伝子である場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （ コーディング領域） の塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上 含む塩基配列としては、 ヒト由来の PPARG angiopoietin- related protein遺伝子の ェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモータ一領域とが含まれるゲノム DN Aの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 8で示される塩基配 列があげられる。 配列番号 8で示される塩基配列においては、 ヒト由来の PPARG ang iopoietin-related proteinタンパク質のァミノ末端のメチォニンをコードする ATG コドンが、 塩基番号 717〜719に示されており、 上記ェクソン 1の 5 ' 側部分の塩基 配列は、 塩基番号 1957〜2661に示されている。 配列番号 8で示される塩基配列中に 存在する CpGで示される塩基配列中のシトシン、 とりわけ配列番号 8で示される 塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在する C p G中のシトシンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 （h ypemethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌細胞においてメチル化頻度が 高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 8で示される塩基配列において、 塩基番 号 35、 43、 51、 54、 75、 85、 107、 127、 129、 143、 184、 194、 223、 227、 236、 251 、 258等で示されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Thrombomodulin遺伝子である 場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列として は、 ヒト由来の Thrombomodulin遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプ 口モータ一領域とが含まれるゲノム DN Aの塩基配列をあげることができ、 より具 体的には、 配列番号 9で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AF495471に記載 される塩基配列の塩基番号 1〜6096で示される塩基配列に相当する。 ） があげられる 。 配列番号 9で示される塩基配列においては、 ヒト由来の Thrombomodulinタンパク 質のアミノ末端のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 2590〜2592に示さ れており、 上記ェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 2048〜6096に示されている。 配 列番号 9で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン 、 とりわけ配列番号 9で示される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に 存在する CpG中のシトシンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル 化頻度 （即ち、 高メチル化状態 (hypermethylation) ) を示す。 さらに具体的には 、 胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 9で 示される塩基配列において、 塩基番号 1539、 1551、 1571、 1579、 1581、 1585、 1595 、 1598、 1601、 1621、 1632、 1638、 1645、 1648、 1665、 1667、 1680、 1698、 1710、 1 724、 1726、 1756等で示されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 p53- responsive gene 2遺伝子 である場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング 領域） の塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列 としては、 ヒト由来の p53 - responsive gene 2遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流 に位置するプロモータ一領域とが含まれるゲノム DN Aの塩基配列をあげることが でき、 より具体的には、 配列番号 1 0で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AC009471に記載される塩基配列の塩基番号 113501〜116000で示される塩基配列の相 補的配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 1 0で示される塩基配列において は、 ヒト由来の p53- responsive gene 2遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1558〜1808に示されている。 配列番号 1 0で示される塩基配列中に存在する C p G で示される塩基配列中のシトシンは、 例えば、 塍臓癌細胞等の癌細胞において高い メチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 （hypermethylation) ) を示す。 さらに具体 的には、 塍臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列 番号 1 0で示される塩基配列において、 塩基番号 1282、 1284、 1301、 1308、 1315、 1 319、 1349、 1351、 1357、 1361、 1365、 1378, 1383等で示されるシトシンをあげるこ とができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Fibrillin遺伝子である場合 には、 そのプロモ一夕一領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩 基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒト由来の Fibrillin遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモー夕 一領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、 より具体的には 、 配列番号 1 1で示される塩基配列 （Genbank Access i on No. AC113387に記載される 塩基配列の塩基番号 118801〜121000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。 ) があげられる。 配列番号 1 1で示される塩基配列においては、 ヒト由来の Fibr i l l in2遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1091〜1345に示されている。 配列番 号 1 1で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシンは 、 例えば、 勝臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状 態 (hype rme thy 1 at i on) ) を示す。 さらに具体的には、 勝臓癌細胞においてメチル 化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 1 1で示される塩基配列におい て、 塩基番号 679、 687、 690、 699、 746、 773、 777、 783、 795、 799、 812、 823、 830 、 834、 843等で示されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Neurof i l ament 3遺伝子である 場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列として は、 ヒト由来の Neurof i l ament s遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプ 口モータ一領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、 より具 体的には、 配列番号 1 2で示される塩基配列 (Genbank Access i on No. AF106564に記 載される塩基配列の塩基番号 28001〜30000で示される塩基配列の相補的配列に相当 する。 ） があげられる。 配列番号 1 2で示される塩基配列においては、 ヒト由来の N euro f i l ament 3遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 614〜1694に示されてい る。 配列番号 1 2で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中の シトシンは、 例えば、 塍臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高 メチル化状態 (hypermethyl at i on) ) を示す。 さらに具体的には、 勝臓癌細胞にお いてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 1 2で示される塩基 配列において、 塩基番号 428、 432、 443、 451、 471、 475、 482、 491、 499、 503、 506 、 514、 519、 532、 541、 544、 546、 563、 566、 572、 580等で示されるシトシンをあ げることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 disintegrin and metal loprot einase domain 23遺伝子である場合には、 そのプロモータ一領域、 非翻訳領域又は 翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列中に存在する CpGで示される塩基配列 を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒト由来の disintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモーター領域とが 含まれるゲノム DNAの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 13で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AC009225に記載される塩基配列の 塩基番号 21001〜23300で示される塩基配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 13で示される塩基配列においては、 ヒト由来の disintegrin and metal loproteina se domain 23遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1194〜1630に示されてい る。 配列番号 13で示される塩基配列中に存在する CpGで示される塩基配列中のシト シンは、 例えば、 膝臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高メチ ル化状態 (hypermet ylation) ) を示す。 さらに具体的には、 塍臓癌細胞において メチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 1 3で示される塩基配列 において、 塩基番号 998、 1003、 1007、 1011、 1016、 1018、 1020、 1026、 1028、 1031 、 1035、 1041、 1043、 1045、 1051、 1053、 1056、 1060、 1066、 1068、 1070、 1073、 1 093、 1096、 1106、 1112、 1120、 1124、 1126等で示されるシトシンをあげることがで さる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 G protein- coupled receptor 7遺伝子である場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーデ ィング領域） の塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩 基配列としては、 ヒト由来の G protein-coupled receptor 7遺伝子のェクソン 1と 、 その 5 ' 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノム DNAの塩基配列 をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 14で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AC009800に記載される塩基配列の塩基番号 75001〜78000で示される 塩基配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 14で示される塩基配列において は、 ヒト由来の G protein-coupled receptor 7遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1666〜2652に示されている。 配列番号 14で示される塩基配列中に存在す る CpGで示される塩基配列中のシトシンは、 例えば、 塍臓癌細胞等の癌細胞にお いて高いメチル化頻度 （即ち、 髙メチル化状態 (hypermethylation) ) を示す。 さ らに具体的には、 塍臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例え ば、 配列番号 14で示される塩基配列において、 塩基番号 1480、 1482、 1485, 1496 、 1513、 1526、 1542、 1560、 1564、 1568、 1570、 1580、 1590、 1603、 1613、 1620等 で示されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 G- protein coupled somatosta tin and angiotensin- 1 ike peptide receptor遺伝子である場合には、 そのフロモ一 ター領域、 のプロモータ一領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の 塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては 、 ヒト由来の G- protein coupled somatostatin and angiotensin- 1 ike peptide rec eptor遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモーター領域とが含まれ るゲノム DNAの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 1 5で 示される塩基配列 （Genbank Accession No. AC008971に記載される塩基配列の塩基番 号 57001〜60000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。 ） があげられる。 配 列番号 15で示される塩基配列においては、 ヒト由来の G- protein coupled somatos tatin and angiotensin- 1 ike peptide receptor遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 776〜2632に示されている。 配列番号 1 5で示される塩基配列中に存在する CpGで示される塩基配列中のシトシンは、 例えば、 塍臓癌細胞等の癌細胞におい て高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 （hypermethylation) ) を示す。 さら に具体的には、 膝臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば 、 配列番号 15で示される塩基配列において、 塩基番号 470、 472、 490、 497、 504、 506、 509、 514、 522、 540、 543、 552、 566、 582、 597、 610、 612等で示されるシト シンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Solute carrier family 6 neu rotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子である場合には、 そのプ 口モーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列中に存 在する CpGで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒト由来の Sol ute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2逭伝 子のェクソン 1と、 その 5' 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノム DN Aの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 16で示される 塩基配列 （Genbank Accession No. AC026802に記載される塩基配列の塩基番号 78801 〜81000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 1 6で示される塩基配列においては、 ヒト由来の Solute carrier family 6 neurotran smitter transporter noradrenalin member 2遺伝子のェクソン 1の: 基酉己列は、 塩 基番号 1479〜1804に示されている。 配列番号 16で示される塩基配列中に存在する CpGで示される塩基配列中のシトシンは、 例えば、 塍臓癌細胞等の癌細胞におい て高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 （hypermethylation) ) を示す。 さら に具体的には、 塍臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば 、 配列番号 1 6で示される塩基配列において、 塩基番号 1002、 1010、 1019、 1021、 1 051、 1056、 1061、 1063、 1080、 1099、 1110、 1139、 1141、 1164、 1169、 1184等で示 されるシトシンをあげることができる。 本発明における 「 （目的とする DNA領域におけるメチル化された DNAを検出 可能な量になるまで増幅し、 ） 増幅された DNAの量」 とは、 生物由来検体に含ま れるゲノム DNA中の目的領域におけるメチル化された D N Aの増幅後の量そのも の、 即ち、 本発明測定方法の第五工程で求めた量を意味するものである。 例えば、 生物由来検体が 1 m Lの血清であつた場合には、 血清 1 m L中に含まれる前記のメ チル化された D N Aに基づいて増幅された D N Aの量を意味する。 本発明 （特に、 本発明メチル化割合測定方法） における 「メチル化割合」 とは、 生物由来検体に含まれるゲノム DN A中の目的とする DN A領域におけるメチル化 された D N Aの増幅後の量とメチル化されていない D N Aの増幅後の量との合計量 で、 メチル化された D N Aの増幅後の量を除した数値を意味するものである。 本発明における 「メチル化感受性制限酵素」 とは、 例えば、 メチル化されたシト シンを含む認識配列を消化せず、 メチル化されていないシトシンを含む認識配列の みを消化することのできる制限酵素等を意味する。 即ち、 メチル化感受性制限酵素 が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されている D N Aの場合には、 当該メチル化感受性制限酵素を当該 D N Aに作用させても、 当該 D NAは切断されない。 これに対して、 メチル化感受性制限酵素が本来認識するこ とができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されていない D N Aの場合には 、 当該メチル化感受性制限酵素を当該 D NAに作用させれば、 当該 D NAは切断さ れる。 このようなメチル化感受性制限酵素の具体的な例としては、 例えば、 Hpal l, Bs tUI、 Narl、 Sac I I、 fflial等を挙げることができる。 尚、 前記のメチル化感受性制 限酵素は、 へミメチル状態の C p G対を含む二本鎖 D NA (即ち、 前記 C p G対の うち、 一方の鎖のシトシンがメチル化されており、 他方の鎖のシトシンがメチル化 されていないような二本鎖 D NA) を切断しないものであり、 すでに Gruenbaumらに より明らかにされている （Nucleic Ac id Research, 9、 2509-2515) 。 また、 メチ ル化感受性制限酵素の中には一本鎖 D N Aを消化するものもある。 かかる制限酵素 は、 一本鎖 D NA中のメチル化されたシトシンを含む認識配列を消化せず、 メチル 化されていないシトシンを含む認識配列のみを消化することができる。 一本鎖 D N Aを消化するメチル化感受性制限酵素としては、 例えば、 Hhal等を挙げることがで さる。 本発明における 「マスキング用オリゴヌクレオチド」 とは、 メチル化感受性制限 酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり 、 一本鎖 D N Aの中の目的とする D N A領域に含まれる数箇所あるメチル化感受性 制限酵素の認識配列のうち、 少なくとも 1箇所 （全ての個所でも良い） と相補的に 塩基対合することで二本鎖を形成し （即ち、 前記箇所を二本鎖状態にして） 、 二本 鎖 D N Aのみを基質とするメチル化感受性制限酵素でも前記箇所を消化できるよう に、 また、 一本鎖 D NAを消化できるメチル化感受性制限酵素 （一本鎖 D NAを消 化できるメチル化感受性制限酵素は二本鎖 D NAも消化でき、 その消化効率は、 二 本鎖 D NAに対する方が一本鎖 D NAに対するよりも高い。 ) での前記箇所の消化 効率を向上させることができるようにするためのオリゴヌクレオチドであり、 且つ 、 目的とする D N A領域を含む一本鎖 D N Aと一本鎖固定化ォリゴヌクレオチドと の二本鎖の形成を阻害しないオリゴヌクレオチドを意味する。 また、 当該マスキン グ用オリゴヌクレオチドは、 後述のリバース用プライマ一 （正鎖） を伸長プライマ 一として、 当該マスキング用オリゴヌクレオチド （負鎖） を铸型として、 伸長ブラ イマ一を伸長させる反応に利用できないオリゴヌクレオチドでなければならない。 尚、 塩基長としては、 8〜2 0 0塩基長が望ましい。
ゲノム D NA由来の D NA試料に含まれる目的とする D NA領域を含む一本鎖 D NA (正鎖） と混合させるマスキング用オリゴヌクレオチドは、 1種類でもよく複 数種類でも良い。 複数種類を用いると、 目的とする D NA領域を含む一本鎖 D NA のメチル化感受性制限酵素の認識部位の多くが二本鎖状態になり、 メチル化感受性 制限酵素での、 後述の 「D NAの切れ残し」 を最小限に抑えることができる。 マス キング用オリゴヌクレオチドは、 例えば、 目的とする D NA領域に含まれる数箇所 あるメチル化感受性制限酵素の認識配列のうち、 メチル化している場合には消化せ ずにメチル化していない場合には消化したい箇所 （例えば、 疾患患者検体では 100 メチル化されており、 健常者検体では 100 メチル化されていない箇所等） に応じて 設計し、 これを使用することが特に有用である。 本発明における 「前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化 感受性制限酵素の認識部位に 1つ以上のアンメチル状態の C p Gを含む一本鎖 D N A」 とは、 前記制限酵素の認識部位の中に存在している 1つ以上の C p Gにおける シトシンがメチル化されていないシトシンである一本鎖 D N Aを意味するものであ る。
また 「前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵 素の認識部位にアンメチル状態の C p Gを含まない伸長形成された一本鎖 DNAJ とは、 一本鎖 D N Aにおける前記制限酵素の認識部位の中に存在している全ての C PGにおけるシトシンがメチル化されている一本鎖 DNAを意味するものである。 本発明測定方法の組み合わせ工程 （i) の第一 （B) 工程、 及び、 組み合わせェ 程 （i i) の第一工程において、 生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の D N A試料から、 （マスキング用オリゴヌクレオチドによりメチル化感受性制限酵素 の認識部位が保護されてなる） 目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） と、 当該一本鎖 DNAの 3' 末端の一部 （但し、 前記の目的とする DNA領域を含 まない。 ） に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチ ドとを塩基対合させることにより選択する。
本発明測定方法の組み合わせ工程 （i) の第一 （B) 工程、 及び、 組み合わせェ 程 （i i) の第一工程における 「一本鎖固定化オリゴヌクレオチド」 は、 目的とす る DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） の 3' 末端の一部 （但し、 前記の目的と する DNA領域を含まない。 ） に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定 化オリゴヌクレオチド （以下、 本固定化オリゴヌクレオチドと記すこともある。 ） である。
本固定化オリゴヌクレオチドは、 生物由来検体中に含まれるゲノム DN A由来の DNA試料から、 目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） を選択するた めに用いられる。 本固定化オリゴヌクレオチドは、 5〜50塩基長であることが望 ましい。
本固定化オリゴヌクレオチドの 5' 末端側は、 担体と固定化され得るものであり 、 一方その 3' 末端側は、 後述する第二前工程及び第 A2工程により 5 ' 末端から 3 ' 末端に向かって進行する一回伸長反応が可能なようにフリーな状態であればよ い。 ここで 「担体と固定化され得るもの」 とは、 前記の目的とする DNA領域を含 む一本鎖 DNA (正鎖） を選択する際に本固定化オリゴヌクレオチドが担体に固定 化されていればよく、 （1) 当該一本鎖 DN A (正鎖） と本固定化オリゴヌクレオ チドとの塩基対合前の段階で、 本固定化オリゴヌクレオチドと担体との結合により 固定化されるものであってもよく、 また （2 ) 当該一本鎖 D NA (正鎖） と本固定 化ォリゴヌクレオチドとの塩基対合後の段階で、 本固定化ォリゴヌクレオチドと担 体との結合により固定化されるものであってもよい。
このような構造を得るには、 目的とする D NA領域を含む一本鎖 D NA (正鎖） の 3 '末端の一部 （但し、 前記の目的とする D NA領域を含まない。 ） に対して相補 性である塩基配列を有するオリゴヌクレオチド （以下、 本オリゴヌクレオチドと記 すこともある。 ） の 5 ' 末端を通常の遺伝子工学的な操作方法又は市販のキット - 装置等に従い、 担体に固定すればよい （固相への結合） 。 具体的には例えば、 本ォ リゴヌクレオチドの 5 ' 末端をピオチン化した後、 得られたピオチン化オリゴヌク レオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体 （例えば、 ストレプトアビジンで 被覆した P C Rチューブ、 ストレプトアビジンで被覆した磁気ピーズ等） に固定す る方法を挙げることができる。
また、 本オリゴヌクレオチドの 5 ' 末端側に、 アミノ基、 アルデヒド基、 チォー ル基等の活性官能基を有する分子を共有結合させた後、 これを表面がシランカップ リング剤等で活性化させたガラス、 シリカ若しくは耐熱性プラスチック製の支持体 に、 例えば、 トリグリセリドを 5個直列に連結したもの等のスぺーサ一、 クロスリ ンカ一等を介して共有結合させる方法も挙げられる。 またさらに、 ガラス若しくは シリコン製の支持体の上で直接、 本オリゴヌクレオチドの 5 ' 末端側から化学合成 させる方法も挙げられる。 本発明測定方法の組み合わせ工程 （ i ) の第一 （A) 工程、 及び、 組み合わせ工程 ( i i ) の第二 （A) 工程において、 目的とする D NA領域を含む一本鎖 D NA ( 正鎖） とメチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からな るマスキング用オリゴヌクレオチドとを混合する。
マスキング用オリゴヌクレオチドを混合することにより、 前述の通り、 一本鎖 D N Aの中の目的とする D N A領域に含まれる数箇所あるメチル化感受性制限酵素の認 識配列のうち、 少なくとも 1箇所 （全ての箇所でも良い） を保護する （その部分の み二本鎖状態にする） ことができ、 二本鎖 D NAのみを基質とするメチル化感受性 制限酵素でも前記箇所を消化できるように、 また、 一本鎖 DNAを消化できるメチ ル化感受性制限酵素 （一本鎖 D N Aを消化できるメチル化感受性制限酵素は二本鎖 DN Aも消化でき、 その消化効率は、 二本鎖 DN Aに対する方が一本鎖 DN Aに対 するよりも高い。 ） での前記篚所の消化効率を向上させることができるようにする 。 即ち、 本発明測定方法の組み合わせ工程 （i) の第二工程、 及び、 組み合わせェ 程 （i i) の第二 （B) 工程におけるメチル化感受性制限酵素による消化処理の前 に、 マスキング用オリゴヌクレオチドを一本鎖 DN Aの目的とする DN A領域に含 まれるメチル化感受性制限酵素の認識部位に塩基対合させて、 二本鎖 DN Aを基質 とするメチル化感受性制限酵素でも、 アンメチル状態の C p Gを有するメチル化感 受性制限酵素の認識配列を消化できるようにする。 マスキング用オリゴヌクレオチ ドは、 ゲノム DNAを一本鎖に分離する前と後とのいずれで混合してもよく、 また 、 組み合わせ工程 （i) の第一 （A) 工程でマスキング用オリゴヌクレオチドを混 合してもよく、 更に、 組み合わせ工程 （i i) の第二 （A) 工程でマスキング用ォ リゴヌクレオチドを混合してもよい。 即ち、 メチル化感受性制限酵素で処理する前 に、 当該メチル化感受性制限酵素が認識しうる塩基配列に塩基対合して二本鎖状態 を形成していれば良い。 本発明測定方法の組み合わせ工程 （ i ) の第二工程、 及び、 組み合わせ工程 （ i i) の第二 （B) 工程、 において、 組み合わせ工程 （i) の第一 （B) 工程、 又は 、 組み合わせ工程 （i i) の第一工程で選択された一本鎖 DNAを 1種類以上のメ チル化感受性制限酵素で消化処理した後、 生成した遊離の消化物 （前記のマスキン グ用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位に 1っ以 上のアンメチル状態の C p Gを含む一本鎖 DNA) を除去する。 当該メチル化感受性制限酵素による消化の有無を調べる方法としては、 具体的に は例えば、 前記 DNAを铸型とし、 解析対象とするシトシンを認識配列に含む DN Aを増幅可能なプライマ一対を用いて PCRを行い、 DNAの増幅 （増幅産物） の 有無を調べる方法をあげることができる。 解析対象とするシトシンがメチル化され ている場合には、 増幅産物が得られる。 一方、 解析対象とするシトシンがメチル化 されていない場合には、 増幅産物が得られない。 このようにして、 増幅された D N Aの量を比較することにより、 解析対象となるシトシンのメチル化されている割合 を測定することができる。
因みに、 組み合わせ工程 （i ) の第一 （B ) 工程、 又は、 組み合わせ工程 （i i ) の第一工程で選択された一本鎖 D NAにおいては、 マスキング用オリゴヌクレオ チドが添加されているので、 一本鎖固定化オリゴヌクレオチドと塩基対合している 部分と、 マスキング用オリゴヌクレオチドが塩基対合した目的とする D N A領域は 、 二本鎖状態になっている。 負鎖としての本固定化オリゴヌクレオチドは、 目的と する D N A領域とは塩基対合しないが、 メチル化感受性制限酵素の認識部位はマス キング用オリゴヌクレオチドが塩基対合して二本鎖状態である。 負鎖としてのマス キング用オリゴヌクレオチドに含まれるシトシンはメチルイ匕されていない状態であ り、 正鎖側の生物由来検体中に含まれるゲノム D N A由来の一本鎖 D N Aに含まれ るシトシンは、 生物由来検体中に含まれるゲノム D NAに含まれるシトシンがメチ ル化されていたか、 それともメチル化されていなかったかにより、 ゲノム D NA由 来の一本鎖 D N Aの状態がアンメチル状態であるか否かが決まる。 即ち、 生物由来 検体中に含まれるゲノム D N Aがメチル化されていれば、 マスキング用オリゴヌク レオチドが塩基対合した二本鎖 D N A部分はへミメチル状態 （アンメチル状態では ない状態。 負鎖：メチル化されていない状態、 正鎖：メチル化されている状態） で あり、 生物由来検体中に含まれるゲノム D NAがメチル化されていなければ、 マス キング用オリゴヌクレオチドが塩基対合した二本鎖 D N A部分はアンメチル状態 （ 負鎖：メチル化されていない状態、 正鎖：メチル化されていない状態） である。 従 つて、 前記のメチル化感受性制限酵素がへミメチル状態である二本鎖 D N Aを切断 しないという特性を利用することにより、 前記の生物由来検体中に含まれるゲノム D NAにおける前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している 1つ 以上の C p G対におけるシトシンがメチル化されていたか否かを区別することがで きる。 即ち、 前記のメチル化感受性制限酵素で消化処理することにより、 仮に生物 由来検体生物由来検体中に含まれるゲノム D N Aにおけるマスキング用オリゴヌク レオチドが塩基対合した二本鎖 DNA部分に存在している 1つ以上の C p G対にお けるシトシンがメチル化されていないのであれば、 マスキング用オリゴヌクレオチ ドが塩基対合した二本鎖 DNA部分はアンメチル状態であり、 当該メチル化感受性 制限酵素により切断される。 また仮に生物由来検体中に含まれるゲノム DNAにお けるマスキング用オリゴヌクレオチドが塩基対合した二本鎖 D N A部分の中に存在 している全ての C pG対におけるシトシンがメチル化されていたのであれば、 マス キング用ォリゴヌクレオチドが塩基対合した二本鎖 D N A部分はへミメチル状態で あり、 当該メチル化感受性制限酵素により切断されない。
従って、 目的とする DN A領域に含まれるメチル化感受性制限酵素の認識部位の 塩基配列とマスキング用オリゴヌクレオチドとを塩基対合させてから消化処理を実 施した後、 後述のように、 前記の目的とする DNA領域を増幅可能な一対のプライ マーを用いた PC Rを実施することにより、 生物由来検体中に含まれるゲノム DN Aにおけるマスキング用オリゴヌクレオチドが塩基対合した二本鎖 D N A部分に存 在している 1つ以上の C pG対におけるシトシンがメチル化されていないのであれ ば、 PCRによる増幅産物は得られず、 一方、 生物由来検体中に含まれるゲノム D N Aにおけるマスキング用オリゴヌクレオチドが塩基対合した二本鎖 DN A部分の 中に存在している全ての CpG対におけるシトシンがメチル化されていたのであれ ば、 P C Rによる増幅産物が得られることになる。
具体的には例えば、 メチル化感受性制限酵素として Hpall又は Hhalを使用し、 且つ 、 マスキング用オリゴヌクレオチドを使用することにより、 一本鎖 DN Aのメチル 化有無を判別することができる。 即ち、 上記の操作で得られた一本鎖固定化オリゴ ヌクレオチドが塩基対合した一本鎖 DN Aの Hpall又は Hhalの認識部位に含まれる C pGのシトシンがメチル化されていたならば、 Hpall又は Hhalは当該 DNAを消化す ることができない。 一方、 メチル化されていなければ、 Hpall又は Hhalは当該 DNA を消化することができる。 従って、 上記反応を実施した後、 目的とする DNA領域 を増幅可能な一対のプライマーを用いて PC R反応を実施すると、 生物由来検体中 に含まれるゲノム D N Aが有する目的とする D N A領域における D N Aがアンメチ ル化状態であれば増幅産物は得られず、 一方、 当該 DNAがメチル化状態であれば 増幅産物が得られることになる。 本発明測定方法の組み合わせ工程 （i ) の第二工程までは、 具体的には例えば、 本固定化オリゴヌクレオチドがピオチン化オリゴヌクレオチドの場合には、 以下の ように実施する。
(a) まず、 生物由来検体中に含まれるゲノム DN A由来の DN A試料に、 ァニ一 リングバッファー及びメチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩 基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドを混合する。
(b) 次いで、 得られた混合物を、 生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の D N A試料に存在する目的とする D N A領域を含む二本鎖 D N Aを一本鎖にするた めに、 95 °Cで数分間加熱する。 その後、 当該メチル化感受性制限酵素の認識部位 が保護されてなる目的とする D N A領域を含む一本鎖 D N Aを形成させるために （ マスキング用オリゴヌクレオチドとの一部二本鎖を形成させるために） 、 例えば、 マスキング用オリゴヌクレオチドの Tm値の約 0〜 20 °C低い温度まで速やかに冷 却し、 その温度で数分間保温する。
(c) 上記で得られた試料に、 ピオチン化オリゴヌクレオチド （当該一本鎖 DNA (正鎖） と本固定化オリゴヌクレオチドとの塩基対合後の段階で、 本固定化オリゴ ヌクレオチドと担体との結合により固定化されるものであるために、 現段階では遊 離状態にあるもの） を添加することにより、 混合物を得る。
(d) 次いで、 得られた混合物を、 95°Cで数分間加熱する。 その後、 目的とする
DNA領域を含むー本鎖DNA (正鎖） とピオチン化オリゴヌクレオチドとを塩基 対合させるために、 例えば、 ピオチン化オリゴヌクレオチドの Tm値の約 0〜20
°C低い温度まで速やかに冷却し、 その温度で数分間保温する。
(e) ストレプトアビジンで被覆した支持体に、 上記 （d) で得られた混合物を添 加し、 さらに、 これを 37 °Cで数分間保温することにより、 ピオチン化オリゴヌク レオチドをストレプトァビジンで被覆した支持体に固定する。
因みに、 前述の如く、 上記 （a) 〜 （e) では、 前記の目的とする DN A領域を 含む一本鎖 DNA (正鎖） と、 ピオチン化オリゴヌクレオチドとの塩基対合を、 ビ ォチン化オリゴヌクレオチドとストレプトアビジンで被覆した支持体との固定より も前段階で実施しているが、 この順番は、 どちらが先でも構わない。
また、 上述の （a ) を実施後 （b ) を実施せずに （c ) 以降の操作を実施しても よいし、 さらに、 上述の （c ) までの操作を実施後 ( d ) を実施せず （e ) の操作 を実施してもよい。
( f ) ピオチン化ォリゴヌクレオチドをストレプトァビジンで被覆した支持体に固 定した後、 残溶液の除去及び洗浄 （D NA精製） を行う。
より具体的には例えば、 ストレブトァビジンで被覆した P C Rチューブを使用す る場合には、 まず溶液をピベッティング又はデカンテーシヨンにより取り除いた後 、 これに生物由来検体の容量と略等量の洗浄バッファーを添加し、 その後当該洗浄 バッファ一をピベッティング又はデカンテ一ションにより取り除けばよい。 またス トレブトアビジンで被覆した磁気ビーズを使用する場合には、 磁石によりビーズを 固定した後、 まず溶液をピペッティング又はデカンテ一シヨンにより取り除いた後 、 生物由来検体の容量と略等量の洗浄バッファ一を添加し、 その後当該洗浄バッフ ァ一をピベッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。
次いで、 このような操作を数回実施することにより、 残溶液の除去及び洗浄 （D NA精製） を行う。
当該操作は、 固定化されていない D NA、 又は、 後述の制限酵素で消化された溶 液中に浮遊している D NA、 を反応溶液から取り除くため、 重要である。 これら操 作が不十分であれば、 反応溶液中に浮遊している D N Aが铸型となり、 増幅反応で 予期せぬ増幅産物が得られることとなる。 支持体と生物由来検体中 D N Aとの非特 異的結合を避けるためには、 目的領域とはまったく異なる塩基配列を有する D N A (例えば、 ヒトの生物由来検体の場合は、 ラット D NA等） を大量に生物由来検体 に添加し、 上記の操作を実施すればよい。
( g ) 上記 （f ) で得られた試料に、 1種類以上のメチル化感受性制限酵素を添加 し、 3 7 °Cで 1時間〜 1晚インキュベーションすることにより消化処理を行う。 具 体的には例えば、 以下のように実施すればよい。 上記 （e ) で得られた試料に、 最 適な緩衝液 (330mM Tris- Acetate pH 7. 9、 660mM K0Ac、 l OOmM Mg0Ac2、 5mM Di thio threi tol) を 3 L、 メチル化感受性制限酵素 Hpal I又は Hhal (10U/ U 等を夫々 1. 5 L加え、 その他、 必要に応じて B S A等を適量加え、 次いで当該混合物に滅菌超純 水を加えて液量を 30 Lとし、 37°Cで 1時間〜 1晚ィンキュベ一ションすればよい。 これにより、 目的とする D N A領域に含まれるマスキング用ォリゴヌクレオチドで 保護された当該メチル化感受性制限酵素の認識部位 （箇所） がメチル化されていな かった場合、 当該箇所は消化されることになる。
( h) このように 1種類以上のメチル化感受性制限酵素で消化処理した後、 生成し た遊離の消化物 （前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感 受性制限酵素の認識部位に 1つ以上のアンメチル状態の C p Gを含む一本鎖 D NA ) の除去及び洗浄 （D NA精製） を行う。 より具体的には例えば、 ストレプトアビ ジンで被覆した P C Rチューブを使用する場合には、 まず溶液をピベッティング又 はデカンテ一シヨンにより取り除いた後、 これに生物由来検体の容量と略等量の洗 浄バッファーを添加した後、 当該洗浄バッファ一をピベッティング又はデカンテー シヨンにより取り除けばよい。 またストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズを使 用する場合には、 磁石によりビーズを固定した後、 まず溶液をピペッティング又は デカンテーシヨンにより取り除いた後、 生物由来検体の容量と略等量の洗浄バッフ ァーを添加した後、 当該洗浄バッファ一をピベッティング又はデカンテ一ションに より取り除けばよい。 次いで、 このような操作を数回実施することにより、 消化物 (前記制限酵素の認識部位に 1つ以上のアンメチル状態の C p Gを含む一本鎖 D N A) の除去及び洗浄 （D NA精製） する。 また、 本発明測定方法の組み合わせ工程 （ i i ) の第二工程までは、 具体的には 例えば、 本固定化オリゴヌクレオチドがピオチン化オリゴヌクレオチドの場合には 、 以下のように実施する。
( a ) まず、 生物由来検体中に含まれるゲノム D NA由来の D NA試料に、 ァニー リングバッファー及びピオチン化オリゴヌクレオチド （当該一本鎖 D NA (正鎖） と本固定化オリゴヌクレオチドとの塩基対合後の段階で、 本固定化オリゴヌクレオ チドと担体との結合により固定化されるものであるために、 現段階では遊離状態に あるもの） を添加することにより、 混合物を得る。
( b ) 次いで、 得られた混合物を、 生物由来検体中に含まれるゲノム D NA由来の D N A試料に存在する目的とする D N A領域を含む二本鎖 D N Aを一本鎖にするた めに、 9 5 °Cで数分間加熱する。 その後、 目的とする D NA領域を含む一本鎖 D N A (正鎖） とピオチン化オリゴヌクレオチドとを塩基対合させるために、 例えば、 ピオチン化オリゴヌクレオチドの Tm値の約 0〜 2 0 °C低い温度まで速やかに冷却 し、 その温度で数分間保温する。
( c ) ストレプトアビジンで被覆した支持体に、 上記 （d ) で得られた混合物を添 加し、 さらに、 これを 3 7 °Cで数分間保温することにより、 ピオチン化オリゴヌク レオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体に固定する。
因みに、 前述の如く、 上記 （a ) 〜 （c ) では、 前記の目的とする D NA領域を 含む一本鎖 D N A (正鎖） と、 ピオチン化オリゴヌクレオチドとの塩基対合を、 ビ ォチン化オリゴヌクレオチドとストレプトアビジンで被覆した支持体との固定より も前段階で実施しているが、 この順番は、 どちらが先でも構わない。
( d ) ピオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体に固 定した後、 残溶液の除去及び洗浄 （D NA精製） を行う。
より具体的には例えば、 ストレプトアビジンで被覆した P C Rチューブを使用す る場合には、 まず溶液をピペッティング又はデカンテーシヨンにより取り除いた後 、 これに生物由来検体の容量と略等量の洗浄バッファーを添加し、 その後当該洗浄 バッファーをピペッティング又はデカンテーシヨンにより取り除けばよい。 またス トレブトアビジンで被覆した磁気ビーズを使用する場合には、 磁石によりビーズを 固定した後、 まず溶液をピベッティング又はデカンテ一シヨンにより取り除いた後 、 生物由来検体の容量と略等量の洗浄バッファ一を添加し、 その後当該洗浄バッフ ァーをピペッティング又はデカンテーシヨンにより取り除けばよい。 次いで、 この ような操作を数回実施することにより、 残溶液の除去及び洗浄 （D NA精製） を行 う。
当該操作は、 固定化されていない D NA、 又は、 後述の制限酵素で消化された溶 液中に浮遊している D NA、 を反応溶液から取り除くため、 重要である。 これら操 作が不十分であれば、 反応溶液中に浮遊している D NAが铸型となり、 増幅反応で 予期せぬ増幅産物が得られることとなる。 支持体と生物由来検体中 D N Aとの非特 異的結合を避けるためには、 目的領域とはまったく異なる塩基配列を有する D N A (例えば、 ヒトの生物由来検体の場合は、 ラット D NA等） を大量に生物由来検体 に添加し、 上記の操作を実施すればよい。
( e ) 上記 （d ) で得られた試料に、 マスキング用オリゴヌクレオチドと 1種類以 上のメチル化感受性制限酵素を添加し、 3 7 °Cで 1時間〜 1晚ィンキュベーション することにより消化処理を行う。 本操作では、 第二 （A) 工程と第二 （B) 工程を 同時に実施することができる。 具体的には例えば、 以下のように実施すればよい。 上記 （d ) で得られた試料に、 最適な緩衝液 （330mM Tr i s-Acetate H 7. 9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2, 5mM Di thiothrei tol) を 3 / L、 メチル化感受性制限酵素 Hpal I 又は fflial (10U/ X L) 等を夫々 1. 5 L、 前記メチル化感受性制限酵素の認識配列に対 するマスキング用オリゴヌクレオチドを夫々約 lOpmol加え、 その他、 必要に応じて B S A等を適量加え、 次いで当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 30 Lとし、 37 °Cで 1時間〜 1晚インキュベーションすればよい。 これにより、 目的とする D NA領 域に含まれるマスキング用オリゴヌクレオチドで保護された当該メチル化感受性制 限酵素の認識部位 （箇所） がメチル化されていなかった場合、 当該箇所は消化され ることになる。
( f ) このように 1種類以上のメチル化感受性制限酵素で消化処理した後、 生成し た遊離の消化物 （前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感 受性制限酵素の認識部位に 1つ以上のアンメチル状態の C p Gを含む一本鎖 D NA ) の除去及び洗浄 （D NA精製） を行う。 より具体的には例えば、 ストレプトアビ ジンで被覆した P C Rチューブを使用する場合には、 まず溶液をピベッティング又 はデカンテーシヨンにより取り除いた後、 これに生物由来検体の容量と略等量の洗 浄バッファーを添加した後、 当該洗浄バッファーをピペッティング又はデカンテー ションにより取り除けばよい。 またストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズを使 用する場合には、 磁石によりビーズを固定した後、 まず溶液をピペッティング又は デカンテ一シヨンにより取り除いた後、 生物由来検体の容量と略等量の洗浄バッフ ァ一を添加した後、 当該洗浄バッファーをピベッティング又はデカンテーションに より取り除けばよい。 次いで、 このような操作を数回実施することにより、 消化物 (前記制限酵素の認識部位に 1つ以上のアンメチル状態の C p Gを含む一本鎖 DN A) の除去及び洗浄 （DNA精製） する。 本発明測定方法の組み合わせ工程 （i) 及び （i i) の第二工程までの目的とす る DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） と、 当該一本鎖 DN Aの 3'末端の一部 （ 但し、 前記の目的とする DNA領域を含まない。 ） に対して相補性である塩基配列 を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを塩基対合させる際、 及び、 目的とす る DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） とマスキング用オリゴヌクレオチドとを 塩基対合させる際における好ましい態様としては、 二価陽イオンを含有する反応系 中で塩基対合させることを挙げることができる。 より好ましくは、 二価陽イオンが マグネシウムイオンであることが挙げられる。 ここで 「二価陽イオンを含有する反 応系」 とは、 前記一本鎖 DN A (正鎖） と前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドと を塩基対合させるために用いられるアニーリングバッファ一中に二価陽ィオンを含 有するような反応系を意味し、 具体的には例えば、 マグネシウムイオンを構成要素 とする塩 （例えば、 MgOAc 2、 MgC l 2等） を lmM〜60 OmMの濃度で 含まれることがよい。 尚、 本発明測定方法の組み合わせ工程 （i) の第二工程、 及び、 組み合わせ工程 (i i) の第二 （B) 工程におけるメチル化感受性制限酵素による消化処理での懸 念点として、 メチル化されていないシトシンを含む認識配列を完全に消化できない (所謂 「DNAの切れ残し」 ） 虞を挙げることができる。 このような虞が問題とな る場合には、 メチル化感受性制限酵素の認識部位が多く存在すれば、 「D N Aの切 れ残し」 を最小限に抑えることができるので、 目的とする DN A領域としては、 メ チル化感受性制限酵素の認識部位を 1つ以上有しており、 その認識部位が多ければ 多いほどよいと考えられる。
従って、 本発明測定方法の組み合わせ工程 （i) の第二工程、 及び、 組み合わせ 工程 （i i) の第二 （B) 工程において複数のメチル化感受性制限酵素による処理 を実施する場合には、 具体的には例えば、 以下のように行えばよい。 組み合わせェ 程 （i) の第一 （B) 工程、 又は、 組み合わせ工程 （i i) の第二 （A) 工程にお いて選択された一本鎖 DN Aに、 最適な緩衝液 （330mM Tr is- Acetate H 7.9、 660m M K0Ac、 lOOmM Mg0Ac2, 5mM Dithiothreitol) を 3 iL、 1種類以上のメチル化感受 性制限酵素 Hpall及び/又は Hhal (10U/ L) 等を夫々 1.5 L加え、 その他、 必要に応 じて B S A等を適量加え、 次いで当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 30 Lとし 、 37°Cで 1時間〜 1晚インキュベーションする。 目的とする DNA領域に含まれるマ スキング用オリゴヌクレオチドで保護された当該メチル化感受性制限酵素の認識部 位 （箇所） がメチル化されていなかった場合、 当該箇所は消化されることになる。 その後、 前記と同様な操作に準じて、 ピペッティング又はデカンテーシヨンにより 、 残溶液の除去及び洗浄 （DNA精製） を行う。 より具体的には例えば、 ストレブ トァビジンで被覆した P C Rチューブを使用する場合には、 まず溶液をピベッティ ング又はデカンテーションにより取り除いた後、 これに生物由来検体の容量と略等 量の洗浄バッファーを添加した後、 当該洗浄バッファーをピベッティング又はデカ ンテーションにより取り除けばよい。 またストレプトアビジンで被覆した磁気ビー ズを使用する場合には、 磁石によりビーズを固定した後、 まず溶液をピぺッティン グ又はデカンテーションにより取り除いた後、 生物由来検体の容量と略等量の洗浄 バッファーを添加した後、 当該洗浄バッファーをピベッティング又はデカンテ一シ ヨンにより取り除けばよい。 尚、 本発明測定方法又は後述のメチル化割合測定方法において、 「生物由来検体 中に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料」 が、 当該ゲノム DNAが有する目的 とする DN A領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなる DN A試料であることを好ましい態様の一つとして挙げることができる。 ここで、 生物 由来検体中に含まれるゲノム DN A (铸型 DNA) を本固定化オリゴヌクレオチド で選択する場合には、 短い錄型 DNAの方がより選択され易く、 また、 PCRで目 的領域を増幅する場合にも、 铸型 DNAが短い方がよいと考えられるので、 目的と する D NA領域を認識切断部位としない制限酵素を生物由来検体中に含まれるゲノ ム D N A由来の D NA試料に直接使用し消化処理を実施してもよい。 尚、 目的とす る D NA領域を認識切断部位としない制限酵素により消化処理する方法としては、 一般的な制限酵素処理法を用いればよい。
また、 「生物由来検体中に含まれるゲノム D NA由来の D NA試料」 が、 1種類 以上のメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなる D N A試料であることを好ま しい態様の一つとして挙げることができる。
これらの好ましい態様は、 生物由来検体そのものを予め上記のような制限酵素で 消化処理しておくことにより、 メチル化量を精度良く求めることができるためであ る。 当該方法は、 上記のような 「D NAの切れ残し」 を無くすのに有用である。 生物由来検体に含まれるゲノム D N A由来の試料をメチル化感受性制限酵素によ り消化する方法としては、 生物由来検体がゲノム D N A自体の場合には前記の方法 と同様な方法でよく、 生物由来検体が組織溶解液、 細胞溶解液等の場合には、 前記 の方法と同様な方法に準じて、 大過剰のメチル化感受性制限酵素、 例えば、 25ngの D NA量に対して 500倍量 （10U) 又はそれ以上のメチル化感受性制限酵素を用いて 消化処理を実施すればよい。
ゲノム D NAは二本鎖 D NAとして存在している。 したがって、 本操作において は、 一本鎖 D NAを消化できるメチル化感受性制限酵素 （例えば、 Hhal) だけでな く、 二本鎖 D N Aを消化できるメチル化感受性制限酵素 （例えば、 HpaI I、 Bs tUI, N arl、 SacI I、 Hhal等等） を用いることができる。 本発明測定方法の第三工程において、 下記の各本工程の前工程として、 第二工程 で得られた未消化物である一本鎖 D N A (前記のマスキング用オリゴヌクレオチド で保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態の C p Gを含ま ない一本鎖 D NA) を前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドと前記のマスキング 用オリゴヌクレオチドとの両者から一旦分離する工程 （第一前工程） と、
生成した一本鎖状態である D NA (正鎖） と、 一本鎖オリゴヌクレオチドとを塩基 対合させることにより、 前記の生成した一本鎖状態である D NAを選択し、 選択さ れた一本鎖状態である D N Aと前記の一本鎖ォリゴヌクレオチドとが塩基対合して なる D NAを形成させる工程 （第二 （A) 前工程） と、
当該工程 （第二 （A) 前工程） で形成された D NAを、 前記の選択された一本鎖状 態である D N Aを铸型として、 前記の一本鎖ォリゴヌクレオチドをプライマ一とし て、 当該プライマーを 1回伸長させることにより、 前記の選択された一本鎖状態で ある D N Aを伸長形成された二本鎖 D NAとする工程 （第二 （B ) 前工程） と を有する工程 （第二前工程） と、
第二前工程で伸長形成された二本鎖 D N A (前記のマスキング用オリゴヌクレオチ ドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態の C p G対を 含まない伸長形成された二本鎖 D NA) を、 一本鎖状態である D NA (正鎖） と一 本鎖状態である D NA (負鎖〉 に一旦分離する工程 （第三前工程） を有し、 且つ、 本工程として
( a ) 生成した一本鎖状態である D NA (正鎖） と前記の一本鎖固定化オリゴヌク レオチド （負鎖） とを塩基対合させることにより、 前記の一本鎖状態である D NA を選択する第 A 1工程と、 第 A 1工程で選択された一本鎖状態である D N Aを铸型 として、 前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、 当該プライ マ一を 1回伸長させることにより、 前記の一本鎖状態である D N Aを二本鎖 D N A として伸長形成させる第 A 2工程とを有する本工程一 Aと、
(b ) 生成した一本鎖状態である D NA (負鎖） を铸型として、 前記の一本鎖状態 である D NA (負鎖） が有する塩基配列の部分塩基配列 （負鎖） であって、 且つ、 前記の目的とする D NA領域の塩基配列 （正鎖） に対して相補性である塩基配列 ( 負鎖） の 3 ' 末端よりさらに 3 ' 末端側に位置する部分塩基配列 （負鎖） 、 に対し て相補性である塩基配列 （正鎖） を有する伸長プライマ一 （リバース用プライマー ) を伸長プライマーとして、 当該伸長プライマ一を 1回伸長させることにより、 前 記の一本鎖状態である D N Aを伸長形成された二本鎖 D N Aとする本工程一 Bとを 有し、
さらにかかる各本工程を、 前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖 D N Aを 一本鎖状態に一旦分離した後、 繰り返すことにより、 前記の目的とする D NA領域 におけるメチル化された D N Aを検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された D N Aの量を定量する。 本発明測定方法の第三工程では、 まず、 下記の各本工程の前工程のうち第一前ェ 程として、 第二工程で得られた未消化物である一本鎖 DNA (前記のマスキング用 オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル 状態の C p Gを含まない一本鎖 DNA) を前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドと 前記のマスキング用オリゴヌクレオチドから一旦分離して一本鎖状態 DNAにする 。 具体的には例えば、 第二工程で得られた未消化物である一本鎖 DNA (前記のマ スキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位に アンメチル状態の CpGを含まない一本鎖 DNA) に、 アニーリングバッファーを 添加することにより、 混合物を得る。 次いで、 得られた混合物を 9 5 °Cで数分間加 熱する。 その後、 第二 （A) 前工程では、 具体的に例えば、 組み合わせ工程 （i i ) の第一工程に準じて実施すれば良く、 メチル化状態の一本鎖 DNAと一本鎖オリ ゴヌクレオチドが塩基対合してなる DNAを形成させる。 第二 （B) 工程は、 具体 的には例えば、 一本鎖オリゴヌクレオチドが固定化オリゴヌクレオチドの場合には 、 以下のように実施する。
形成された DNAに、 滅菌超純水を 17.85 L、 最適な緩衝液 （lOOmM Tris-HCl H 8.3, 500πιΜ KCK 15mM MgCl2) を 3 L、 2m dNTPを 3 L、 5 ベ夕インを 6i Lカロ え、 次いで当該混合物に AmpliTaq (DN Aポリメラ一ゼの 1種： 5U/ L) を 0.15 /L 加えて液量を 30 Lとし、 37°Cで 2時間インキュベーションする。 その後、 インキュ ベ一ションされた溶液をピベッティング又はデカンテ一ションにより取り除いた後 、 これに生物由来検体の容量と略等量の洗浄バッファーを添加し、 当該洗浄バッフ ァーをピペッティング又はデカンテ一シヨンにより取り除けばよい。 次いで、 この ような操作を数回実施することにより、 残溶液の除去及び洗浄 （DNA精製） を行 ラ。
第二前工程において得られた伸長形成された二本鎖 DN A (前記のマスキング用 オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル 状態の CpG対を含まない伸長形成された二本鎖 DNA) を、 一本鎖状態である D NA (正鎖） と一本鎖状態である DNA (負鎖） に一旦分離する。 具体的には例え ば、 第二前工程において得られた伸長形成された二本鎖 DNA (前記のマスキング 用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチ ル状態の CpG対を含まない伸長形成された二本鎖 DNA) に、 アニーリングバッ ファーを添加することにより、 混合物を得る。
次いで、 得られた混合物を 95°Cで数分間加熱する。
その後、 本工程として、
(a)生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） を、 前記の一本鎖固定化オリゴヌク レオチド （負鎖） にアニーリングさせるために、 前記の一本鎖固定化オリゴヌクレ ォチド （負鎖） の Tm値の約 0〜20°C低い温度まで速やかに冷却し、 その温度で 数分間保温する。
(b)その後、 室温に戻す。 （本工程一 Aにおける第 A 1工程）
( c )上記（ a )で選択された一本鎖状態である D N Aを铸型として、 前記の一本鎖固 定化ォリゴヌクレオチドをプライマーとして、 当該プライマ一を 1回伸長させるこ とにより、 前記の一本鎖状態である DNAを二本鎖 DNAとして伸長形成させる （ 即ち、 本工程一 Aにおける第 A 2工程） 。 具体的には例えば、 後述の説明や前述の 本発明測定方法の第二 （B) 前工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施 すればよい。
(d)生成した一本鎖状態である DNA (負鎖） を铸型として、 前記の一本鎖状態で ある DNA (負鎖） が有する塩基配列の部分塩基配列 （負鎖） であって、 且つ、 前 記の目的とする DNA領域の塩基配列 （正鎖） に対して相補性である塩基配列 （負 鎖） の 3'末端よりさらに 3'末端側に位置する部分塩基配列 （負鎖） 、 に対して相 補性である塩基配列 （正鎖） を有する伸長プライマー （リバース用プライマー） を 伸長プライマーとして、 当該伸長プライマ一を 1回伸長させることにより、 前記の 一本鎖状態である DNAを伸長形成された二本鎖 DNAとする （即ち、 本工程一 B ) 。 具体的には例えば、 上記（c)と同様に、 後述の説明や前述の本発明測定方法の 第二 （B) 前工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよい。 ( e )さらにかかる各本工程を、 前記各本工程で得られた伸長形成されたニ本鎖 D N Aを一本鎖状態に一旦分離した後、 繰り返すこと （例えば、 第 A工程及び第 B工程 ) により、 前記の目的とする DNA領域におけるメチル化された DNAを検出可能 な量になるまで増幅し、 増幅された DNAの量を定量する。 具体的には例えば、 上 記と同様に、 後述の説明や前述の本発明測定方法の第三工程における第二 （B) 前 工程、 本工程一 A及び本工程二 Bでの操作方法等に準じて実施すればよい。 第三工程は、 具体的には、 第一前工程から開始して本工程に至るまでの反応を、 —つの PCR反応として実施することもできる。 また、 第一前工程から第三前工程 まで、 各々、 独立した反応としてを実施し、 本工程のみを PC R反応として実施す ることもできる。 上述の通り、 メチル化感受性制限酵素による消化処理の後 （第二工程終了後） に 目的とする DNA領域 （即ち、 目的領域） を増幅する方法 （第三工程を一度に実施 する方法) としては、 例えば、 PCRを用いることができる。 目的領域を増幅する 際に、 片側のプライマーとして本固定化オリゴヌクレオチドを用いることができる ので、 もう一方のプライマーのみ添加して PCRを行うことにより、 増幅産物が得 られ、 その増幅産物も固定化されることとなる。 この際、 予め蛍光等で標識された プライマーを使用してその標識を指標とすれば、 電気泳動等の煩わしい操作を実施 せずに増幅産物の有無を評価できる。 PCR反応液としては、 例えば、 本発明測定 方法の第二工程で得た DN Aに、 50 xMのプライマーの溶液を 0.15 1と、 2mM dNTP を 2.5 zlと、 緩衝液（lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCK 20mM MgCl2、 0.01% Gel atin)を 2.5wlと、 AmpliTaq Gold (耐熱性 DNAポリメラ一ゼの一種： 5U//zl)を 0. 2 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 25 1とした反応液をあげること ができる。
目的とする DNA領域 （即ち、 目的領域） は、 GCリッチな塩基配列が多いため 、 時に、 ベタイン、 DMSO等を適量加えて反応を実施してもよい。 反応条件とし ては、 例えば、 前記のような反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 95°Cにて 30秒 間次いで 55〜65 にて 30秒間さらに にて 30秒間を 1サイクルとする保温を 30〜4 0サイクル行う条件があげられる。 かかる P C Rを行った後、 得られた増幅産物を検 出する。 例えば、 予め標識されたプライマーを使用した場合には、 先と同様の洗浄
•精製操作を実施後、 固定化された蛍光標識体の量を測定することができる。 また 、 標識されていない通常のプライマーを用いた P C Rを実施した場合は、 金コロイ ド粒子、 蛍光等で標識したプローブ等をアニーリングさせ、 目的領域に結合した当 該プローブの量を測定することにより検出することができる。 また、 増幅産物の量 をより精度よく求めるには、 例えば、 リアルタイム P C R法を用いればよい。 リア ルタイム P C R法とは、 P C Rをリアルタイムでモニターし、 得られたモニター結 果をカイネティックス分析する方法であり、 例えば、 遺伝子量に関して 2倍程度の ほんのわずかな差異をも検出できる高精度の定量 P C R法として知られる方法であ る。 当該リアルタイム P C R法には、 例えば、 铸型依存性核酸ポリメラーゼプロー ブ等のプローブを用いる方法、 サイバーグリーン等のインターカレー夕—を用いる 方法等を挙げることができる。 リアルタイム P C R法のための装置及びキットは巿 販されるものを利用してもよい。 以上の如く、 検出については特に限定されること はなく、 これまでに周知のあらゆる方法による検出が可能である。 これら方法では 、 反応容器を移し換えることなく検出までの操作が可能となる。 さらに、 一本鎖固定化ォリゴヌクレオチドと同じ塩基配列のピオチン化ォリゴヌ クレオチドを片側のプライマー、 又は、 一本鎖固定化オリゴヌクレオチドより、 3 ' 端側に新しいピオチン化ォリゴヌクレオチドを設計しそれを片側のプライマ一と し、 その相補側プライマ一を用いて、 目的領域を増幅することもできる。 この場合 、 得られた増幅産物は、 ストレプトアビジンで被覆した支持体があれば固定化され るので、 例えば、 ストレプトアビジンコ一ト P C Rチューブで P C Rを実施した場 合には、 チューブ内に固定されるため、 上記の通り、 標識されたプライマ一を用い れば、 増幅産物の検出が容易である。 また、 先の一本鎖固定化オリゴヌクレオチド が共有結合等による固定化の場合であれば、 P C Rで得られた増幅産物を含む溶液 をストレプトアビジン被覆支持体が存在する容器に移し、 増幅産物を固定化するこ とが可能である。 検出については、 上述の通り実施すればよい。 目的領域を増幅す る相補側のプライマーは、 メチル化感受性制限酵素の認識部位を 1つ以上有する目 的領域を増幅でき、 かつ、 その認識部位を含まないプライマーでなければいけない 。 この理由は、 以下の通りである。 選択及び 1回伸長反応で得られた二本鎖 D N A の本固定化オリゴヌクレオチド側の D NA鎖 （新生鎖） の一番 3 ' 端側のメチル化 感受性制限酵素の認識部位のみがメチル化されていない場合には、 その部分だけが メチル化感受性制限酵素で消化されることになる。 消化後、 前述のように洗浄操作 を行っても、 新生鎖で言う 3 ' 端の一部だけを失った二本鎖 D NAが固定化された ままの状態で存在する。 相補側のプライマーが、 この一番 3 ' 端側のメチル化感受 性制限酵素の認識部位を含んでいた場合には、 当該プライマーの 3 ' 端側の数塩基 が、 新生鎖の 3 ' 端の数塩基とアニーリングし、 その結果、 目的領域が P C Rによ り増幅する可能性があるからである。 本発明は、 本発明測定方法の第三工程の第一前工程の前又は後に、 あるいは第三 工程の第三前工程の前又は後において、 前記の目的とする D NA領域を含む一本鎖 D NA (正鎖） の 3 '末端の一部 （伹し、 前記の目的とする D NA領域を含まない。 ) に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオ チド （負鎖） を反応系内に添加する工程 （追加前工程） を追加的に有するような変 法を含む。
即ち、
(変法 1 )
本発明測定方法の第三工程の第一前工程の前に、
前記の目的とする D NA領域を含む一本鎖 D NA (正鎖） の 3 '末端の一部 （但し、 前記の目的とする D NA領域を含まない。 ） に対して相補性である塩基配列を有し 且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） を反応系内に添加する工程
(追加前工程） を追加的に有し、 且つ、
本発明測定方法の第三工程の、 第二前工程と各本工程として、 下記の 1つの工程を さらに追加的に有することを特徴とする方法。
(c) ( i) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と、 上記の追加前工程で反 応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） とを塩基対合させることに より、 前記の一本鎖状態である DNAを選択する第 C 1工程と、
(i i) 第 C 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを鎵型として、 前記の一 本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） をプライマーとして、 当該プライマーを 1回伸長 させることにより、 前記の一本鎖状態である D N Aを伸長形成された二本鎖 D N A とする第 C 2工程とを有する本工程一 C (変法 2)
本発明測定方法の第三工程の第一前工程の後に、
前記の目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） の 3'末端の一部 （但し、 前記の目的とする； DNA領域を含まない。 ） に対して相補性である塩基配列を有し 且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） を反応系内に添加する工程 (追加前工程） を追加的に有し、 且つ、
本発明測定方法の第三工程の、 第二前工程と各本工程として、 下記の 1つの工程を さらに追加的に有することを特徴とする方法 （以下、 本発明メチル化割合測定方法 と記すこともある。 ）
(c) ( i) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と、 上記の追加前工程で反 応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） とを塩基対合させることに より、 前記の一本鎖状態である DN Aを選択する第 C 1工程と、
(i i) 第 C 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを鎵型として、 前記の一 本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） をプライマーとして、 当該プライマ一を 1回伸長 させることにより、 前記の一本鎖状態である DN Aを伸長形成された二本鎖 DN A とする第 C 2工程とを有する本工程一 C '
(変法 3 )
本発明測定方法の第三工程の第三前工程の前に、 前記の目的とする DN A領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） の 3'末端の一部 （伹し、 前記の目的とする DNA領域を含まない。 ) に対して相補性である塩基配列を有し 且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） を反応系内に添加する工程
(追加前工程） を追加的に有し、 且つ、
本発明測定方法の第三工程の各本工程として、 下記の 1つの工程をさらに追加的に 有することを特徴とする方法。
(c) (i) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と、 上記の追加前工程で反 応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） とを塩基対合させることに より、 前記の一本鎖状態である DNAを選択する第 C 1工程と、
(i i) 第 C 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを铸型として、 前記の一 本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） をプライマ一として、 当該プライマ一を 1回伸長 させることにより、 前記の一本鎖状態である DN Aを伸長形成された二本鎖 DN A とする第 C 2工程とを有する本工程一 C (変法 4)
本発明測定方法の第三工程の第三前工程の後に、
前記の目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） の 3'末端の一部 （但し、 前記の目的とする DNA領域を含まない。 ） に対して相補性である塩基配列を有し 且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） を反応系内に添加する工程 (追加前工程） を追加的に有し、 且つ、
本発明測定方法の第三工程の各本工程として、 下記の 1つの工程をさらに追加的に 有することを特徴とする方法。
(c) (i) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と、 上記の追加前工程で反 応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） とを塩基対合させることに より、 前記の一本鎖状態である DNAを選択する第 C 1工程と、
(i i) 第 C 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを錶型として、 前記の一 本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） をプライマーとして、 当該プライマ一を 1回伸長 させることにより、 前記の一本鎖状態である DN Aを伸長形成された二本鎖 DN A とする第 C 2工程とを有する本工程一 C 当該変法では、 外部から 「前記の目的とする D N A領域を含む一本鎖 D N A (正 鎖） の 3 '末端の一部 （但し、 前記の目的とする D NA領域を含まない。 ） に対して 相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖 ) 」 を反応系内に添加すること等により、 第三工程における前述の目的とする D N A領域の増幅効率を容易に向上させることが可能となる。 尚、 追加前工程で反応系 内に添加される一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） は、 一本鎖 D N Aの 3， 末端の 一部 （但し、 前記の目的とする D NA領域を含まない。 ） に対して相補性である塩 基配列であって、 5 ' 末端が、 前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドと同じである 塩基配列を有する遊離状態である一本鎖ォリゴヌクレオチドであれば、 前記一本鎖 固定化オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列であっても、 又は、 短い塩基配列であつ ても、 或いは、 長い配列であってもよい。 但し、 前記一本鎖固定化オリゴヌクレオ チドよりも長い配列の場合には、 前記リバース用プライマー （正鎖） を伸長プライ マーとし、 当該一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） を铸型として、 伸長プライマー を伸長させる反応に利用できない遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチドである ことが重要である。 目的領域を増幅する際に、 片側のプライマーとして本固定化オリゴヌクレオチド を用いて、 もう一方のプライマーのみ添加して P C Rを行う例を前記したが、 目的 産物の検出のために他の方法 （例えば、 P C Rで得られた各々の増幅産物の量を比 較することができる分析方法） を実施するのであれば、 上記の如く、 目的領域を増 幅する際に、 本固定化オリゴヌクレオチドを一方 （片側） のプライマーとして使用 せず、 一対のプライマーを添加して P C Rを実施してもよい。 かかる P C Rを行つ た後、 得られた増幅産物の量を求める。 本発明測定方法の第三工程は繰り返し工程を有するが、 例えば、 第 A 1工程にお ける 「生成した一本鎖状態である D NA (正鎖） 」 とは、 第 1回目の第三工程の操 作及び第 2回目以降の第三工程の繰り返し操作の両操作において 「生成した 『遊離 の』 一本鎖状態である D N A (正鎖） 」 を意味することになる。
また、 第 B工程における 「生成した一本鎖状態である D NA (負鎖） 」 とは、 第 1回目の第三工程の操作及び第 2回目以降の第三工程の繰り返し操作の両操作にお いて 「生成した 『固定の』 一本鎖状態である D NA (正鎖） 」 を意味する。 但し、 第三工程がさらに追加的に C工程を有する場合には、 第 1回目の第三工程の操作に おいて 「生成した 『固定の』 一本鎖状態である D NA (正鎖） 」 を意味し、 一方、 第 2回目以降の第三工程の繰り返し操作において 「生成した 『固定の』 一本鎖状態 である D NA (正鎖） 」 と 「生成した 『遊離の』 一本鎖状態である D NA (正鎖） 」 との両者を意味することになる。 また、 第三工程の各本工程で得られた 「伸長形成された二本鎖 D NA」 とは、 第 A工程の場合には、 第 1回目の第三工程の操作において 「前記のマスキング用オリ ゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位に、 アンメチル状 態の C p G対を含まない伸長形成された二本鎖 D NA」 を意味し、 一方、 第 2回目 以降の第三工程の繰り返し操作において 「前記のマスキング用オリゴヌクレオチド で保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位に、 アンメチル状態の C p G対を 含まない伸長形成された二本鎖 D NA」 と 「前記のマスキング用オリゴヌクレオチ ドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位に、 アンメチル状態の C p G対 を含む伸長形成された二本鎖 D NA」 との両者を意味することになる。 第 B工程の 場合には、 第 1回目の第 工程の操作及び第 2回目以降の第三工程の繰り返し操作 の両操作において 「前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化 感受性制限酵素の認識部位では全てがアンメチル状態の C p G対である伸長形成さ れたニ本鎖 D NA」 を意味することになる。
尚、 第三工程がさらに追加的に本工程一 Cを有する場合にも同様である。 また、 第三工程がさらに追加的に本工程一 Cを有する場合において、 第 C 1工程 における 「生成した一本鎖状態である D NA (正鎖） 」 とは、 第 1回目の第 Ξ工程 の操作及び第 2回目以降の第 S工程の繰り返し操作の両操作において 「生成した 『 遊離の』 一本鎖状態である D N A (正鎖） 」 を意味することになる。 また本発明は、 本発明測定方法の工程として、 下記の 2つの工程をさらに追加的 に有することを特徴とするメチル化割合の測定方法 （即ち、 本発明メチル化割合測 定方法） を含む。
( 4 ) 本発明測定方法 （前記の変法を含む） の第一工程を行った後、 本発明測定方 法 （前記の変法を含む） の組み合わせ工程 （ i ) の第二工程、 又は、 組み合わせェ 程 （i i ) の第二 （B) 工程を行うことなく、 本発明測定方法 （前記の変法を含む ) の第三工程を行うことにより、 前記の目的とする D N A領域の D N A (メチル化 された D N A及びメチルされていない D N Aの総量） を検出可能な量になるまで増 幅し、 増幅された D N Aの量を定量する第四工程、 及び、
( 5 ) 本発明測定方法 （前記の変法を含む） の第三工程により定量された D N Aの 量と、 第四工程により定量された D NAの量とを比較することにより得られる差異 に基づき前記の目的とする D N A領域におけるメチル化された D N Aの割合を算出 する第五工程
当該メチル化割合測定方法は、 下記のような場面において利用すればよい。
各種疾患 （例えば、 癌） において D NAのメチル化異常が起こることが知られて おり、 この D N Aメチル化異常を検出することにより、 各種疾患の度合いを測定す ることが可能と考えられている。
例えば、 疾患患者由来の検体中に含まれるゲノム D N Aにおいて 100 %メチル化さ れている D NA領域があり、 その D NA領域について、 本発明測定方法又は本発明 メチル化割合測定方法を実施すれば、 メチル化された D NAの量は多くなるであろ う。 また、 例えば、 疾患患者由来の検体中に含まれるゲノム D N Aにおいて 100%メ チル化されていない D N A領域があり、 その D N A領域について、 本発明測定方法 又は本発明メチル化割合測定方法を実施すれば、 メチル化された D N Aの量はほぼ 0に近い値となるであろう。 また、 例えば、 健常者の生物由来検体に含まれるゲノ ム D N Aにおいてメチル化割合が低く且つ疾患患者の生物由来検体に含まれるゲノ ム D NAにおいてメチル化割合が高い D NA領域があり、 その D NA領域について 、 本発明測定方法又は本発明メチル化割合測定方法を実施すれば、 健常者の場合に は、 メチル化された D NAの量は、 0に近い値を示し、 一方、 疾患患者の場合には 、 健常者の場合における値よりも有意に高い値を示すため、 この値の差異に基づき 、 「疾患の度合い」 を判定することができる。 ここでの 「疾患の度合い」 とは、 一 般に当該分野において使用される意味と同様であって、 具体的には、 例えば、 生物 由来検体が細胞である場合には当該細胞の悪性度を意味し、 また、 例えば、 生物由 来検体が組織である場合には当該組織における疾患細胞の存在量等を意味している 。 さらに、 生物由来検体が血漿 ·血清である場合にはその個体が疾患を有する確率 を意味している。 従って、 本発明測定方法又は本発明メチル化割合測定方法は、 メ チル化異常を調べることにより、 各種疾患を診断することを可能にする。 このような本発明測定方法又は本発明メチル化割合測定方法における、 目的領域 のメチル化された D NA量の測定、 メチル化割合の測定を行うための各種方法で使 用し得る制限酵素、 プライマー又はプローブは、 検出用キットの試薬として有用で ある。 本発明は、 これら制限酵素、 プライマー又はプローブ等を試薬として含有す る検出用キットゃ、 これらプライマ一又はプロ一ブ等が担体上に固定化されてなる 検出用チップも提供しており、 本発明測定方法又は本発明メチル化割合測定方法の 権利範囲は、 当該方法の実質的な原理を利用してなる前記のような検出用キットや 検出用チップのような形態での使用も含む。 実施例
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、 本発明はこれらに限定されるもの ではない。 実施例 1
配列番号 1 7で示される塩基配列からなり、 H p a I Iの認識配列がメチル化さ れているメチル化オリゴヌクレオチド GPR 7— 2079-2176/98me r- M ( 7 )、 及び、 配列番号 18で示される塩基配列からなり、 H p a I Iの認識配列 がメチル化されていないアンメチル化オリゴヌクレオチド GPR 7 - 2 0 7 9 - 2 176/98me r- UMを合成して、 夫々にっき 0. 001 pmo l/10 /L TEバッファー溶液を調製した。
Hp a I Iの認識配列がメチル化されているメチル化オリゴヌクレオチド GPR7 - 20 79 - 2176/98mer-M(7)、 ここで Nはメチル化シトシンを示す： TGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3' (配列番号 17 )
Hp a I Iの認識配列がメチル化されていないアンメチル化オリゴヌクレオチド PR7-2079-2176/98mer-UM：
5' - GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCGGCCGCACCTACAGCGCCGCGCGCGCGGTGAGCCTGG TGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3' (配列番号 18) また、 配列番号 1 9で示される塩基配列からなる 5 ' 末端ピオチン標識オリゴヌ クレオチド B i o— GPR 7— 2 1 7 6 Rを合成し、 0. I M TEバッファー溶 液を調製した。
5 ' 末端ビォチン標識オリゴヌクレオチド Bio- GPR7- 2176R：
5'- GCACGACGAGTGTGACGATC -3' (配列番号 1 9) 得られたメチル化ォリゴヌクレオチド、 又は、 アンメチル化ォリゴヌクレオチド の夫々の溶液各 10 に、 上記の 5' 末端ピオチン標識オリゴヌクレオチド溶液 を 1 L、 アニーリングバッファー （330mM Tris- Acetate pH 7.9、 660mM KOAc, 10 OmM Mg0Ac2, 5mM Di ihiothrei tol) を加え、 さらに当該混合物に滅菌超純水 を加えて液量を 20 とし、 混合した。 メチル化オリゴヌクレオチド及びアンメ チル化オリゴヌクレオチドにっき、 各々 3本ずつ作製した。 得られた混合物を、 9 5T:で 5分間加熱した。 その後、 50 まで速やかに冷却し、 その温度で 5分間保 温した。 次いで、 これを 37 °Cで 5分間保温した後、 室温に戻した。 次に、 ストレプトアビジンで被覆した PC Rチューブに、 上記のようにして、 前 調製された混合物を添加し、 さらに、 これを 37 で 5分間保温した。
次いで、 前記の PC Rチューブから溶液を除去した後、 I O O Lの洗浄バッファ 一 [0.05% Tween20含有リン酸バッファー (IraM K P0い 3mM Na2HP0 - 7 0、 15 mM N aCl H7.4) ]を添加し、 当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。 この 操作をさらに 2回繰り返した。 このようにして選択され得られた一本鎖 DNAについて、 以下の 3種の処理を施 した。 A群 （無処理群） ：上記で調製された一本鎖 DN Aに、 Hp a I I及び Hh a Iに 最適な 1 OX緩衝液 (330mM Tris- Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM Mg0Ac2、 5m M Dithiothrei tol) を と、 10XBSA (Bovine serum albumin lmg/ml) を 3 Lとを加えて、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 30 iLとした
B群 （Hp a I Iによる消化処理群） ：上記で調製された一本鎖 DNAに、 Hp a I Iを 15Uと、 Hp a l I及び Hh a Iに最適な 10 X緩衝液 （330 Tris-Acet ate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM Mg0Ac2、 5mM Di thiothrei tol) を 3 Lと、 10 XB S A (Bovine serum albumin lmg/ml) を 3^ Lとを加えて、 さらに当該混合物 に滅菌超純水を加えて液量を 30 ^ Lとした。
C群 （マスキング用オリゴヌクレオチド添加及び Hp a I Iによる消化処理群） ： 上記で調製された一本鎖 DN Aに、 Hp a l lを 15Uと、 Hp a I I及び H h a Iに最適な 10 X緩衝液 (330mM Tris- Acetate pH 7.9、 660mM KOAc、 lOOmM MgOAc2 、 5mM Dithiothreitol) を 3 Lと、 10 XBSA (Bovine serum albumin lmg/ml ) を 3 Lと、 配列番号 20で示される塩基配列からなるマスキング用オリゴヌク レオチド MAを 5 pmo 1加えて、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 30 / Lとした。 マスキング用オリゴヌクレオチド MA： 5' - GCCACCCGGCGCGA -3' (配列番号 20 ) 各々の混合物を 37°Cで 16時間インキュベーションした後、 上清を取り除き、 100 の洗浄バッファ一 [0.05% Tween20含有リン酸バッファ一 （ImM KH2P04、 3 mM Na2HP0 - 7 0、 15 m NaCl pH7.4) ]を添加し、 当該洗浄バッファーをピぺッテ ィングにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した。 次に、 上記の PCRチューブに、 配列番号 21で示される塩基配列からなるブラ イマ一及び配列番号 22で示される塩基配列からなるプライマ一 （PF 2及び PR
2) 及び、 下記の反応条件を用いて PCRを行う とにより、 目的とする DN A領 域 （GPR7- 2079-21 76、 配列番号 23 メチル化シトシンも Cで表す) に おけるメチル化された DN Aを増幅した。 プライマー PF2： 5' -GTTGGCCACTGCGGAGTCG-3' (配列番号 21)
'一 PR2： 5' -GCACGACGAGTGTGACGATC-3' (配列番号 22 ) 目的とする DNA領域 GPR7- 2079- 2176：
5'-
TGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3 (配列番号 23)
PCRの反応液としては、 鎵型とする DNAに、 配列番号 21で示される塩基配 列からなるプライマー及び配列番号 22で示される塩基配列からなるプライマーの 3 に調製された溶液各 3 と、 各々 2mMの dNTPを 3 Lと、 緩衝液（100m M Tris-HCl pH 8.3, 500raM KCK 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 3 Lと、 耐熱性 DNAポリメラ一ゼ （AmpliTaq Gold) 5UZ/iLを 0. 15 Lと、 5 Nベ夕イン水 溶液を 6 Lとを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 30 zLとしたものを用 いた。 当該反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 95 にて 30秒間次いで 59°Cにて 30秒間さらに 72°Cにて 45秒間を 1サイクルとする保温を 20サイ クル行う条件で P C Rを行った。
PCRを行った後、 1. 5%ァガロースゲル電気泳動により DN Aの増幅を確認 した。 その結果を図 1に示す。 A処理群 （無処理群） 及び B処理群 （Hp a I I処 理群） では、 Hp a l Iの認識配列がメチル化されているメチル化オリゴヌクレオ チド GPR7— 2079— 2176/98me r— M (7) (M) と、 Hp a l Iの
79 - 21 76/98me r -UM (U) ともに、 D N Aの増幅が確認されその増幅 産物 （目的とする DN A領域： GPR 7— 2079— 2176) が得られた。 C処 理群 （マスキング用オリゴヌクレオチド添加及び Hp a I Iによる消化処理群） で は、 Hp a l Iの認識配列がメチル化されているメチル化オリゴヌクレオチド GP R7— 2079— 2176/98me r一 M (7) (M) の場合は、 DNAの増幅が 確認されその増幅産物 （目的とする DNA領域： GPR7— 2079— 2176) が得られたが、 Hp a l Iの認識配列がメチルイ匕されていないアンメチル化オリゴ ヌクレオチド GPR 7 - 2079-2 176/98me r— UM (U) の場合は、 D N Aの増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。 以上より、 前記の目的とする DN A領域を含む一本鎖 DN Aを選択することが可 能であること、 且つ、 マスキング用オリゴヌクレオチドを添加しメチル化感受性制 限酵素で処理することにより、 前記の目的とする DNA領域においてメチル化され ていない D N Aを増幅することなく、 メチル化された DN Aのみを検出可能な量に なるまで増幅し、 増幅された D N Aの量を定量できることが確認された。 実施例 2
配列番号 17で示される塩基配列からなり Hp a I Iの認識配列がメチル化され ているメチル化オリゴヌクレオチド GPR 7 -2079-2176/98me r-M (7)、 及び、 配列番号 18で示される塩基配列からなり Hp a I Iの認識配列がメ チル化されていないアンメチル化オリゴヌクレオチド G P R 7— 2079 - 2 17 6Z98me r- UMを合成して、 夫々にっき 0. 00 1 pmo l/10 L ラッ ト血清溶液を調製した。
Hp a I Iの認識配列がメチル化されているメチル化オリゴヌクレオチド GPR7 - 20 79-2176/98mer-M(7), ここで、 Nはメチル化シトシンを示す：
5 ' - GTTGGCCACTGCGGAGTCGNGCNGGGTGGCNGGCCGCACCTACAGNGCCGNGNGNGCGGTGAGCCTGGCCG TGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3' (配列番号 17)
Hp a I Iの認識配列がメチル化されていないアンメチル化オリゴヌクレオチド G PR7-2079-2176/98mer-UM：
TGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3' (配列番号 18) また、 配列番号 19で示される塩基配列からなる 5' 末端ピオチン標識オリゴヌ クレオチド B i o— GPR 7— 2176 Rを合成し、 0. 1 M TEバッファー溶 液を調製した。
5 ' 末端ピオチン標識オリゴヌクレオチド Bio- GPR7- 2176R：
5' - GCACGACGAGTGTGACGATC -3' (配列番号 1 9 ) 得られたメチル化オリゴヌクレオチド、 又は、 アンメチル化オリゴヌクレオチド の夫々の溶液各 10 2 Lに、 上記の 5 ' 末端ピオチン標識オリゴヌクレオチド溶液 を l L、 アニーリングバッファー （330mM Tris- Acetate H 7.9、 660mM K0Ac、 10 OmM gOAc2, 5mM Di thiothrei iol) 2 Lを加え、 さらに当該混合物に滅菌超純水 を加えて液量を 20 しとし、 混合した。 メチル化オリゴヌクレオチド及びアンメ チル化オリゴヌクレオチドにっき、 各々 3本作製した。 得られた混合物を、 95°C で 5分間加熱した。 その後、 50°Cまで速やかに冷却し、 その温度で 5分間保温し た。 次いで、 これを 37 °Cで 5分間保温した後、 室温に戻した。 次に、 ストレプトアビジンで被覆した PC Rチューブに、 上記のようにして、 前 調製された混合物を添加し、 さらに、 これを 37 °Cで 5分間保温した。
次いで、 前記の PCRチューブから溶液を除去した後、 100 /Lの洗浄バッファ —[0.05% Tween20含有リン酸バッファー （ImM KH2P0い 3mM Na2HP0 · 7H20、 15 raM N aCl pH7.4) ]を添加し、 当該洗浄バッファ一をピペッティングにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した。 このようにして選択され得られた一本鎖 DNAについて、 以下の 3種の処理を施 した。
A群 （無処理群） ：上記で調製された一本鎖 DN Aに、 Hp a I I及び Hh a Iに 最適な 1 OX緩衝液 (330mM Tris- Acetate pH 7.9、 660raM K0Ac、 lOOmM Mg0Ac2、 5m M Dithiothreitol) を と、 10XBSA (Bovine serum albumin lmg/ml) を 3 £Lとを加えて、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 30 Lとした
B群 （Hp a l Iによる消化処理群） ：上記で調製された一本鎖 DN Aに、 Hp a I Iを 15Uと、 Hp a l I及び Hh a Iに最適な 10 X緩衝液 （330mM Tris-Acet ate pH 7.9、 66 OmM OAc, lOOmM Mg0Ac2、 5mM Dithiothreitol) を 3 Lと、 10 XBSA (Bovine serum albumin lmg/ml) を 3 とを加えて、 さらに当該混合物 に滅菌超純水を加えて液量を 30 ^ Lとした。 C群 （マスキング用オリゴヌクレオチド添加及び Hp a I Iによる消化処理群） ： 上記で調製された一本鎖 DN Aに、 Hp a l Iを 15Uと、 Hp a l I及び Hh a Iに最適な 10 X緩衝液 (330mM Tris-Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2 、 5mM Dithiothreitol) を 3 iLと、 10XBSA (Bovine serum albumin lrng/ml ) を 3 Lと、 配列番号 20で示される塩基配列からなるマスキング用ォリゴヌク レオチド MAを 5 pmo 1加えて、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 30 xLとした。 マスキング用オリゴヌクレオチド MA： 5' - GCCACCCGGCGCGA -3' (配列番号 20 ) 各々の混合物を 371で16時間インキュベーションした後、 上清を取り除き、 100 Lの洗浄バッファ一 [0.05% Tween20含有リン酸バッファー （ImM K P04、 3 mM Na2HP0 · 7 0、 154mM NaCl pH7.4) ]を添加し、 当該バッファーをピぺッティン グにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した。 次に、 上記の PCRチューブに、 配列番号 21で示される塩基配列からなるブラ イマ一及び配列番号 22で示される塩基配列からなるプライマー （PF2及び PR 2) 及び、 下記の反応条件を用いて PC Rを行うことにより、 目的とする DN A領 域 （GPR 7-2079- 2176、 配列番号 23、 メチル化シトシンも Cで表す） に おけるメチル化された DNAを増幅した。
PF2： 5' -GTTGGCCACTGCGGAGTCG-3' (配列番号 21 )
PR2： 5' -GCACGACGAGTGTGACGATC-3 ' (配列番号 22 ) 目的とする DN A領域 GPR7- 2079- 2176
5' - GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCG
TGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3' (配列番号 23) PPCCRRのの反反応応液液ととししててはは、、 铸铸型型ととすするる DDNNAAにに、、 33 xxMMにに調調製製さされれたた配配列列番番号号 22 11でで示示さされれるる塩塩基基配配列列かかららななるるププラライイママ一一及及びび配配列列番番号号 2222でで示示さされれるる塩塩基基配配列列かか ららななるるププラライイママーーのの溶溶液液各各 33 とと、、 各各々々 22mmMMのの ddNNTTPPをを 33 LLとと、、 緩緩衝衝液液（（110000mm MM TTrriiss--HHCCll ppHH 88..33、、 550000mmMM KKCCKK 1155mmMM MMggCCllいい 00..0011%% GGeellaattiinn))をを 33 とと、、 耐耐熱熱性性 55 DDNNAAポポリリメメララ一一ゼゼ （（AAmmpplliiTTaaqq GGoolldd)) 55UU// LLをを 00.. 11 55 //LLとと、、 55NNベベタタイインン水水 溶溶液液をを 66 XXLLととをを混混合合しし、、 ここれれにに滅滅菌菌超超純純水水をを加加ええてて液液量量をを 3300 LLととししたたももののをを用用 いいたた。。 当当該該反反応応液液をを、、 9955°°CCににてて 1100分分間間保保温温ししたた後後、、 9955°°CCににてて 3300秒秒間間次次いいでで 5599°°CCににてて 3300秒秒間間ささららにに 7722°°CCににてて 4455秒秒間間をを 11ササイイククルルととすするる保保温温をを 2200ササイイ ククルル行行うう条条件件でで PPCCRRをを行行っったた。。
1100 PPCCRRをを行行っったた後後、、 11.. 55 %%ァァガガロローーススゲゲルル電電気気泳泳動動にによよりり DDNN AAのの増増幅幅をを確確認認 ししたた。。 そそのの結結果果をを図図 22にに示示すす。。 AA処処理理群群 （（無無処処理理群群）） 及及びび BB処処理理群群 （（HHpp aa II II処処 理理群群）） でではは、、 HHpp aa ll IIのの認認識識配配列列ががメメチチルル化化さされれてていいるるメメチチルル化化オオリリゴゴヌヌククレレオオ チチドド GGPPRR77—— 22007799—— 22117766//9988mmee rr—— MM ((77)) ((MM)) とと、、 HHpp aa ll IIのの 認認識識配配列列ががメメチチルル化化さされれてていいなないいアアンンメメチチルル化化オオリリゴゴヌヌククレレオオチチドド GGPPRR 77 --2200
1155 7799 -- 22117766//9988mmee rr --UUMM ((UU)) ととももにに、、 DD NN AAのの増増幅幅がが確確認認さされれそそのの増増幅幅 産産物物 （（目目的的ととすするる DDNNAA領領域域：： GGPPRR 77—— 22007799—— 22117766)) がが得得らられれたた。。 CC処処 理理群群 （（ママススキキンンググ用用オオリリゴゴヌヌククレレオオチチドド添添加加 ++ HHpp aa II IIにによよるる消消化化処処理理群群）） でではは 、、 HHpp aa ll IIのの認認識識配配列列ががメメチチルル化化さされれてていいるるメメチチルル化化オオリリゴゴヌヌククレレオオチチドド GGPPRR 77--22007799--22117766//9988mmee rr一一 MM ((77)) ((MM)) でではは、、 DDNNAAのの増増幅幅がが確確認認ささ
2200 れれそそのの増増幅幅産産物物 （（目目的的ととすするる DDNNAA領領域域：： GGPPRR 77—— 22007799--2211 7766)) がが得得らら れれたたがが、、 HH pp aa II
Figure imgf000058_0001
ォチド GPR 7 - 2079-2176/98me r-UM (U) では、 DNAの増幅 が確認されずその増幅産物は得られなかつた。
25 以上より、 生物由来検体中に含まれるゲノム DN A由来の DN A試料として血清 溶液を用いても、 前記の実施例 1と同様に、 前記の目的とする DNA領域を含む一 本鎖 DNAを選択することが可能であること、 且つ、 マスキング用オリゴヌクレオ チドを添加しメチル化感受性制限酵素で処理することにより、 前記の目的とする D NA領域においてメチル化されていない DNAを増幅することなく、 メチル化され た DN Aのみを検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された DN Aの量を定量でき ることが確認された。 実施例 3
A T C Cより購入された哺乳動物由来の乳癌細胞株 M CF- 7 (ATCC NO. HTB-22) を、 AT CCのカタログに記載された当該細胞株のための専用培地でコンフルェン トになるまで培養することにより、 約 1 X 107個の細胞を得た。 得られた細胞に 、 SEDTAバッファー [10mM Tris-HCl pH 8.0、 lOmM EDTA pH 8.0、 lOOmM NaCl ] を 10倍容量加えた後、 これをホモジナイズした。 得られた混合物に、 proteinas e K (Sigma) を 500 gXm 1及びドデシル硫酸ナトリゥムを 1 % (w/v)になるよ うに加えた後、 これを 55°Cで約 16時間振とうした。 振とう終了後、 当該混合物 をフエノール [1M Tris-HCK pH 8.0 にて飽和] ·クロ口ホルム抽出処理した。 水 層を回収し、 これに NaC lを 0. 5Nとなるよう加えた後、 これをエタノール沈 澱処理して生じた沈澱を回収した。 回収された沈澱を TEバッファー （10mM Tris、 ImM EDTA、 pH 8.0) に溶解し、 これに 40 gZm 1になるように RN a s e A ( S i gma) を加えて 37 °Cで 1時間インキュベートした。 インキュベートされた 混合物をフエノール ·クロロホルム抽出処理した。 水層を回収し、 これに NaC l を 0. 5 Nとなるよう加えた後、 これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱 （ゲノ ム DNA) を回収した。 回収された沈澱を 70%エタノールでリンスすることによ り、 ゲノム DN Aを得た。
得られたゲノム D N Aを錶型として、 以下のプライマー及び反応条件を用いて P C Rを行うことにより、 供試サンプルとして用いられる配列番号 24で示される塩 基配列 (Genbank Accession No.M80343等に示される LINE1配列の塩基番号 257〜352 に相当する領域） を含む DN Aフラグメント (DNAフラグメント XI、 配列番号 25で示される塩基配列を有する。 Genbank Accession NO.M80343等に示される L I NE 1配列の塩基番号 8〜480に相当する領域） を増幅した。 PF1： 5' -GAGCCAAGATGGCCGAATAGG-3' (配列番号 26)
P 1： 5' -CTGCTTTGTTTACCTAAGCAAGC-3' (配列番号 27)
PCRの反応液としては、 铸型とするゲノム DNAを 2 n gと、 100 pmo 1 / 1に調製した配列番号 26で示される塩基配列からなるプライマ一及び配列番 号 27で示される塩基配列からなるプライマーの溶液各 0. 125 w 1と、 各々 2 mMの dNTPを 2. 5 1と、 10 X緩衝液（lOOmM Tris-HCl H 8.3、 500mM KC1 、 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 2. 5 1と、 耐熱性 DNAポリメラーゼ 5U 1を 0. 125 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 25 1と したものを用いた。 当該反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 95°Cにて 3 0秒間次いで 63°Cにて 60秒間さらに 72°Cにて 45秒間を 1サイクルとする保 温を 50サイクル行う条件で P C Rを行った。
PCRを行った後、 1. 5%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、 目的 の DNAフラグメント （473bp、 DNAフラグメント XI) を切り出し、 QIAGEN QI A quick Gel Extraction Kit (QIAGEN社） を用いてこれを精製した。
得られた DNAフラグメント X 1の一部をメチル化酵素 S s s I (NEB社） により 処理し、 5 -CG- 3 ' 全てをメチル化した DNAフラグメント (以下、 DNAフ ラグメント Y 1と記す) を得た。 これについても、 先と同様に、 1. 5%ァガロー スゲル電気泳動により増幅を確認し、 目的の DNAフラグメント （473bp、 DNAフ ラグメント Yl) を切り出し、 QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社） を用いてこれを精製した。
表 1
Figure imgf000061_0001
I〜V各々の DNAフラグメントを用いて、 以下の 4種の溶液を調製した。 A群 （無処理群） ： DNAフラグメント約 25 n gに、 Hp a I I及び Hh a Iに 最適な 10 X緩衝液 (330mM Tris- Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5m M Dithiothreitol) を 2 Lと、 10XBSA (Bovine serum albumin lmg/ml) を 2 Lとを加えて、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 20 Lとした
B群 （Hpall処理群） ： DN Aフラグメント約 25 n gに、 Hp a I Iを 0. 5Uと 、 Hp a I I及び H h a Iに最適な 10 X緩衝液 (330mM Tris- Acetate pH 7.9、 66 OmM KOAc. lOOmM Mg0Ac2、 5mM Dithiothreitol) を 2 と、 10XBSA (Bovin e serum alb醒 in lmg/ml) を 2 とを加えて、 さらに当該混合物に滅菌超純水を 加えて液量を 20 Lとした。
C群 （Hhal処理群） ： DNAフラグメント約 25 n gに、 Hh a Iを 0. 5Uと、 Hp a I I及び Hh a Iに最適な 10 X緩衝液 （330mM Tris- Acetate pH 7.9、 660m M KOAc, 10 OmM Mg0Ac2, 5mM Dithiothreitol) を と、 10 XBSA (Bovine serum albumin lmg/ml) を 2 とを加えて、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加 D群 （Hpall及び Hhal処理群） ： DNAフラグメント約 25 n gに、 Hp a I I及び H a Iをそれぞれ 0. 5Uと、 Hp a I I及び Hh a Iに最適な 10 X緩衝液 （3 30mM Tris Acetate ρΗ7· 9、 660mM K0Ac lOOmM MgOAc2、 5mM Di thiothrei tol) を 2 と、 10XBSA (Bovine serum albumin lmg/ml) を 2 Lとを加えて、 さら に当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 20 X Lとした。 各々の反応液を 37°Cで 2時間インキュベーションした後、 これに滅菌超純水を 加えて 100倍希釈した。
各希釈溶液 5 zL (DNAフラグメント 62.5pg相当量） を錶型とし、 配列番号 17で 示される塩基配列からなる領域の DNA量を求めるために、 下記のプライマ一 PF 2及び PR 2並びに 5' 末端がレポ一ター蛍光色素である F AM (6—力ルポキシ 一フルォレツセイン) 及び 3， 末端がクェンチヤ一蛍光色素である T AM R A (6 一力ルポキシーテトラメチル—ローダミン） で標識されたプローブ T 1を用いたリ アルタイム P CRを行った。
<プライマー >
P F 2 (フォワード側） ： 5' -CACCTGGAAAATCGGGTCACT-3 ' (配列番号 28 )
PR 2 (リバース側） ： 5' - CGAGCCAGGTGTGGGATATA - 3' (配列番号 29)
<プローブ >
T 1 ： 5' -CGAATATTGCGCTTTTCAGACCGGCTT-3' (配列番号 30) PCRの反応液としては、 铸型とする DNAフラグメント 62. 5 p gと、 3 p mo 1/ 1に調製した配列番号 28で示される塩基配列からなるプライマー及び 配列番号 29で示される塩基配列からなるプライマ一の溶液 2種を各 2. 5 1と 、 2. 5 pmo 1 / xLに調製した配列番号 30で示される塩基配列からなるプロ —ブを 2. 5 Lと、 各々 2mMの dNTPを 2. 5 1と、 10XPCR緩衝液（ lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCK 15mM MgCl2, 0.01% Gelatin)を 2. と 、 耐熱性 DNAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold) 5U/ 1を 0. 125 1とを混 合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 25 1としたものを用いた。 リアルタイ ム PCRは、 Gene Amp 5700 Sequence Detection System (Applied Biosystems)を用い て実施した。 配列番号 17で示される塩基配列のうち塩基番号 1〜94で示される塩基 配列からなる領域 （DNA) を増幅するために、 当該反応液を、 95°Cにて 10分 間保温した後、 95Tにて 15秒間、 60 にて 60秒間を 1サイクルとしてリア ルタイム PCRを行った。 当該リアルタイム； PCRの結果により、 当該領域の DN A量を 定量した。 各生物由来検体について 3回試験を実施した。
その結果を図 3〜図 7に示す。 A群での当該領域の DN A量を 1として、 他の群 での当該領域の DNA量を示した。 図 3 ( 「I」 ） は、 メチル化割合 0%のフラグ メント混合物であるため、 B群、 C群及び D群での理論値は 「0」 、 図 4 ( 「I I 」 ） は、 メチル化割合 10 %のフラグメントであるため、 B群、 C群及び D群での 理論値は 「0. 1」 、 図 5 ( 「I I I」 ） は、 メチル化割合 25 %のフラグメント であるため、 B群、 C群及び D群での理論値は 「0. 25」 、 図 6 ( 「I V」 ） は 、 メチル化割合 50%のフラグメントであるため、 B群、 C群及び D群での理論値 は 「0. 5」 、 図 7 ( 「V」 ） は、 メチル化割合 100%のフラグメントであるた め、 B群、 C群及び D群での理論値は 「1」 を示すことになる。 実験の結果、 図 3 〜図 7に示す通り、 D群で、 この理論値に最も近い値が得られており、 2種類以上 のメチル化感受性制限酵素での消化処理が好ましいことが明らかとなつた。 産業上の利用可能性
本発明により、 生物由来検体に含まれるゲノム DNA中の目的とする DNA領域 におけるメチル化された DNAの含量を簡便に測定する方法等を提供することが可 能となる。 配列表フリーテキスト
配列番号 1 7
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号 1 8
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号 1 9
支持体への固定化のために設計されたピオチン標識オリゴヌクレオチド 配列番号 2 0
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 2 1
PCRのために設計されたォリゴヌクレオチドプライマー
配列番号 2 2
PCRのために設計されたォリゴヌクレオチドプライマー
配列番号 2 3
目的とする D NA領域 （G P R 7 - 2 0 7 9 - 2 1 7 6、 メチル化シトシンも Cで表 す） からなる設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 2 6
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 2 7
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 2 8
リアルタイム PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 2 9
リアルタイム PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 3 0
リアルタイム PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプロ一ブ

Claims

請求の範囲
1. 生物由来検体に含まれるゲノム DNA中の目的とする DNA領域におけるメチ ル化された D N Aの含量を測定する方法であって、
下記のいずれかの組み合わせ工程、
( i ) 組み合わせ工程 （ i ) ：
(1) 生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料から、 目的とする DNA領域を含むー本鎖DNA (正鎖） と、 メチル化感受性制限酵素の認識部位の 塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドとを混合す ることにより、 当該メチル化感受性制限酵素の認識部位が保護されてなる一本鎖 D NAを生成させる第一 （A) 工程と、
第一 （A) 工程で保護 ·生成された目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正 鎖） と当該一本鎖 DNAの 3' 末端の一部 （但し、 前記の目的とする DNA領域を 含まない。 ） に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオ チドとを塩基対合させることにより、 前記の保護 ·生成された一本鎖 DN Aを選択 する第一 （B) 工程と
を有する第一工程、 及び、
(2) 第一工程で選択された一本鎖 DNAを 1種類以上のメチル化感受性制限酵素 で消化処理した後、 生成した遊離の消化物 （前記のマスキング用オリゴヌクレオチ ドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位に 1つ以上のアンメチル状態の CpGを含むー本鎖DNA) を除去する第二工程
からなる組み合わせ工程 （i) ；
または、
( i i ) 組み合わせ工程 （ i i ) ： ·
(1) 生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料から、 目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） と、 当該一本鎖 DNAの 3' 末端の一部 （ 但し、 前記の目的とする DNA領域を含まない。 ） に対して相補性である塩基配列 を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを塩基対合させることにより、 前記の 一本鎖 DN Aを選択する第一工程、 及び、
(2) 第一工程で選択された一本鎖 DNAと、 メチル化感受性制限酵素の認識部位 の塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドとを混合 することにより、 当該メチル化感受性制限酵素の認識部位が保護されてなる一本鎖 DNAを生成させる第二 （A) 工程と、
第二 （A) 工程で保護 ·生成された一本鎖 DN Aを 1種類以上のメチル化感受性制 限酵素で消化処理した後、 生成した遊離の消化物 （前記のマスキング用オリゴヌク レオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位に 1つ以上のアンメチル 状態の CpGを含む一本鎖 DNA) を除去する第二 （B) 工程と
を有する第二工程
からなる組み合わせ工程 （i ί ) ；
と、
(3) 下記の各本工程の前工程として、 第二工程で得られた未消化物である一本鎖 DNA (前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限 酵素の認識部位にアンメチル状態の CpGを含まない一本鎖 DNA) を前記の一本 鎖固定化ォリゴヌクレオチドと前記のマスキング用オリゴヌクレオチドとの両者か ら一旦分離する工程 （第一前工程） と、
生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と、 一本鎖オリゴヌクレオチドとを塩基 対合させることにより、 前記の生成した一本鎖状態である DNAを選択し、 選択さ れた一本鎖状態である D N Aと前記の一本鎖ォリゴヌクレオチドとが塩基対合して なる DNAを形成させる工程 （第二 （A) 前工程） と、
当該工程 （第二 （A) 前工程） で形成された DNAを、 前記の選択された一本鎖状 態である DN Aを銬型として、 前記の一本鎖オリゴヌクレオチドをプライマーとし て、 当該プライマーを 1回伸長させることにより、 前記の選択された一本鎖状態で ある DNAを伸長形成された二本鎖 DNAとする工程 （第二 （B) 前工程） と を有する工程 （第二前工程） と、
第二前工程で伸長形成された二本鎖 D N A (前記のマスキング用ォリゴヌクレオチ ドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態の C p G対を 含まない伸長形成された二本鎖 DNA) を、 一本鎖状態である DNA (正鎖） と一 本鎖状態である DNA (負鎖） に一旦分離する工程 （第三前工程） を有し、 且つ、 本工程として
(a) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と前記の一本鎖固定化オリゴヌク レオチド （負鎖） とを塩基対合させることにより、 前記の一本鎖状態である DNA を選択する第 A 1工程と、 第 A 1工程で選択された一本鎖状態である DN Aを铸型 として、 前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、 当該プライ マーを 1回伸長させることにより、 前記の一本鎖状態である DN Aを二本鎖 DN A として伸長形成させる第 A 2工程とを有する本工程一 Aと、
(b) 生成した一本鎖状態である DNA (負鎖） を錶型として、 前記の一本鎖状態 である DNA (負鎖） が有する塩基配列の部分塩基配列 （負鎖） であって、 且つ、 前記の目的とする DNA領域の塩基配列 （正鎖） に対して相補性である塩基配列 （ 負鎖） の 3' 末端よりさらに 3' 末端側に位置する部分塩基配列 （負鎖） 、 に対し て相補性である塩基配列 （正鎖） を有する
伸長プライマ一 （リバ一ス用プライマ一） を伸長プライマ一として、 当該伸長ブラ イマ一を 1回伸長させることにより、 前記の一本鎖状態である D N Aを伸長形成さ れたニ本鎖 DN Aとする本工程一 Bとを有し、
さらにかかる各本工程を、 前記各本工程で得られた伸長形成されたニ本鎖 D N Aを 一本鎖状態に一旦分離した後、 繰り返すことにより、 前記の目的とする DNA領域 におけるメチル化された DN Aを検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された DN Aの量を定量する第三工程、
とを有することを特徴とする方法。
2. 第一工程において、 目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） と、 当 該一本鎖 DNAの 3' 末端の一部 （但し、 前記の目的とする DNA領域を含まない 。 ） に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを 塩基対合させる際に、 二価陽イオンを含有する反応系中で塩基対合させることを特 徵とする請求項 1記載の方法。 67
3. 二価陽イオンがマグネシウムイオンであることを特徴とする請求項 2記載の方 法。
4. 請求項 1〜3のいずれかに記載の第三工程の第一前工程の前に、 前記の目的と する DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） の 3' 末端の一部に対して相補性であ る塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） を反応系 内に添加する工程 （追加前工程） を追加的に有し、 且つ、
請求項 1記載の第三工程の各本工程として、 下記の 1つの工程をさらに追加的に有 することを特徴とする方法。
(c) (i) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と、 上記の追加前工程で反 応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） とを塩基対合させることに より、 前記の一本鎖状態である DNAを選択する第 C 1工程と、
(i i) 第 C 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを铸型として、 前記の一 本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） をプライマ一として、 当該プライマーを 1回伸長 させることにより、 前記の一本鎖状態である D N Aを伸長形成された二本鎖 D N A とする第 C 2工程とを有する本工程一 C
5. 請求項 1〜3のいずれかに記載の第三工程の第一前工程の後に、 前記の目的と する DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） の 3， 末端の一部に対して相補性であ る塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） を反応系 内に添加する工程 （追加前工程） を追加的に有し、 且つ、
請求項 1記載の第三工程の各本工程として、 下記の 1つの工程をさらに追加的に有 することを特徴とする方法。
(c) ( i) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と、 上記の追加前工程で反 応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） とを塩基対合させることに より、 前記の一本鎖状態である DN Aを選択する第 C 1工程と、
(i i) 第 C 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを铸型として、 前記の一 本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） をプライマーとして、 当該プライマーを 1回伸長 させることにより、 前記の一本鎖状態である D N Aを伸長形成されたニ本鎖 D N A とする第 C 2工程とを有する本工程一 C
6. 請求項 1〜3のいずれかに記載の第三工程の第三前工程の前に、 前記の目的と する DN A領域を含む一本鎖 DN A (正鎖） の 3' 末端の一部に対して相補性であ る塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） を反応系 内に添加する工程 （追加前工程） を追加的に有し、 且つ、
請求項 1記載の第三工程の各本工程として、 下記の 1つの工程をさらに追加的に有 することを特徴とする方法。
(c) (i) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と、 上記の追加前工程で反 応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） とを塩基対合させることに より、 前記の一本鎖状態である DNAを選択する第 C 1工程と、
(i i) 第 C 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを铸型として、 前記の一 本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） をプライマーとして、 当該プライマーを 1回伸長 させることにより、 前記の一本鎖状態である D N Aを伸長形成されたニ本鎖 D N A とする第 C 2工程とを有する本工程一 C
7. 請求項 1〜3のいずれかに記載の第三工程の第三前工程の後に、 前記の目的と する DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） の 3' 末端の一部に対して相補性であ る塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） を反応系 内に添加する工程 （追加前工程） を追加的に有し、 且つ、
請求項 1記載の第三工程の各本工程として、 下記の 1つの工程をさらに追加的に有 することを特徴とする方法。
(c) (i) 生成した一本鎖状態である DNA (正鎖） と、 上記の追加前工程で反 応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） とを塩基対合させることに より、 前記の一本鎖状態である DNAを選択する第 C 1工程と、
(i i) 第 C 1工程で選択された一本鎖状態である DNAを錶型として、 前記の一 本鎖オリゴヌクレオチド （負鎖） をプライマーとして、 当該プライマ一を 1回伸長 させることにより、 前記の一本鎖状態である D N Aを伸長形成されたニ本鎖 D N A とする第 C 2工程とを有する本工程一 C
8. 請求項 1〜 7のいずれかに記載の方法の工程として、 下記の 2つの工程をさら に追加的に有することを特徴とするメチル化割合の測定方法。
(4) 請求項 1〜 7のいずれかの請求項記載の方法の第一工程を行った後、 請求項 1〜 7のいずれかの請求項記載の方法の組み合わせ工程 （ i ) の第二工程又は組み 合わせ工程 （i i) の第二 （B) 工程を行うことなく、 請求項 1〜7のいずれかの 請求項記載の方法における第三工程を行うことにより、 前記の目的とする DNA領 域の DNA (メチル化された DN A及びメチルされていない DN Aの総量） を検出 可能な量になるまで増幅し、 増幅された DNAの量を定量する第四工程、 及び、
(5) 請求項 1〜 7のいずれかの請求項記載の第三工程により定量された DN Aの 量と、 第四工程により定量された DN Aの量とを比較することにより得られる差異 に基づき前記の目的とする DNA領域におけるメチル化された DN Aの割合を算出 する第五工程
9. 生物由来検体が、 哺乳動物の血清又は血漿であることを特徴とする請求項 1〜 8のいずれかに記載の方法。
10. 生物由来検体が、 哺乳動物の血液又は体液であることを特徴とする請求項 1 〜 8のいずれかに記載の方法。
11. 生物由来検体が、 細胞溶解液又は組織溶解液であることを特徴とする請求項 1〜8のいずれかに記載の方法。
12. 生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料が、 当該ゲノム D N Aが有する目的とする D N A領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処 理されてなる DN A試料であることを特徴とする請求項 1〜 11のいずれかに記載 の方法。
13. 生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料が、 1種類以上の メチル化感受性制限酵素で消化処理されてなる D N A試料であることを特徴とする 請求項 1〜 12のいずれかに記載の方法。
14. 生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料が、 予め精製され てなる DN A試料であることを特徴とする請求項 1〜 13のいずれかに記載の方法 。
15. 1種類以上のメチル化感受性制限酵素が、 生物由来検体中に含まれるゲノム DN Aが有する目的とする DN A領域の中に認識切断部位を有する制限酵素である ことを特徴とする請求項 1〜 14のいずれかに記載の方法。
16. 1種類以上のメチル化感受性制限酵素が、 メチル化感受性制限酵素である Hpa II、 又は Hhalであることを特徴とする請求項 1〜15のいずれかに記載の方法。
PCT/JP2008/051995 2007-01-31 2008-01-31 Ｄｎａメチル化測定方法 WO2008099745A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12/525,089 US20100009376A1 (en) 2007-01-31 2008-01-31 Method for measuring dna methylation
AU2008215531A AU2008215531A1 (en) 2007-01-31 2008-01-31 Method for determination of DNA methylation
KR1020097018066A KR20090106420A (ko) 2007-01-31 2008-01-31 Ｄｎａ 메틸화 측정 방법

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2007021171A JP5151167B2 (ja) 2007-01-31 2007-01-31 Ｄｎａメチル化測定方法
JP2007-021171 2007-01-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2008099745A1 true WO2008099745A1 (ja) 2008-08-21

Family

ID=39689981

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2008/051995 WO2008099745A1 (ja) 2007-01-31 2008-01-31 Ｄｎａメチル化測定方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20100009376A1 (ja)
JP (1) JP5151167B2 (ja)
KR (1) KR20090106420A (ja)
AU (1) AU2008215531A1 (ja)
WO (1) WO2008099745A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2272974A1 (en) * 2008-03-25 2011-01-12 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for determination of dna methylation

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5277681B2 (ja) * 2007-03-26 2013-08-28 住友化学株式会社 Ｄｎａメチル化測定方法
JP4997650B2 (ja) * 2007-06-11 2012-08-08 国立大学法人京都工芸繊維大学 植物の加工方法
KR102524773B1 (ko) 2017-01-26 2023-04-21 싸이클라셀 리미티드 퓨린 유도체의 제조 방법

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6605432B1 (en) * 1999-02-05 2003-08-12 Curators Of The University Of Missouri High-throughput methods for detecting DNA methylation
US20050009059A1 (en) * 2003-05-07 2005-01-13 Affymetrix, Inc. Analysis of methylation status using oligonucleotide arrays
JP2006149334A (ja) * 2004-12-01 2006-06-15 Hitachi Software Eng Co Ltd メチル化検出方法
WO2006088978A1 (en) * 2005-02-16 2006-08-24 Epigenomics, Inc. Method for determining the methylation pattern of a polynucleic acid

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5641658A (en) * 1994-08-03 1997-06-24 Mosaic Technologies, Inc. Method for performing amplification of nucleic acid with two primers bound to a single solid support
US6686146B2 (en) * 1995-10-18 2004-02-03 California Pacific Medical Center Prognostic methods for prediction of progression of normal and hyperplastic mammary cells to carcinoma
US20010051341A1 (en) * 1997-03-04 2001-12-13 Isis Innovation Limited Non-invasive prenatal diagnosis
WO1998056952A1 (en) * 1997-06-09 1998-12-17 University Of Southern California A cancer diagnostic method based upon dna methylation differences
US20010006780A1 (en) * 1998-06-30 2001-07-05 Benjamin W. Boldt Process for detecting a known sequence in genomic dna
US6893820B1 (en) * 2001-01-31 2005-05-17 The Ohio State University Research Foundation Detection of methylated CpG rich sequences diagnostic for malignant cells
CA2438943C (en) * 2001-02-23 2019-05-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Hin-1, a tumor suppressor gene
EP1438416A4 (en) * 2001-09-26 2007-09-05 Epigenx Pharmaceutical Inc ASSAYS FOR CHANGES TO THE METHYLATION OF DNA
US20110151438A9 (en) * 2001-11-19 2011-06-23 Affymetrix, Inc. Methods of Analysis of Methylation
EP1649050A2 (en) * 2003-06-24 2006-04-26 Epigenomics AG Improved heavymethyl assay for the methylation analysis of the gstpi gene
ATE464397T1 (de) * 2004-02-18 2010-04-15 Camh Cpg-amplicon und array-protokoll
JP4541731B2 (ja) * 2004-03-12 2010-09-08 キヤノン株式会社 核酸検出方法
US20060188910A1 (en) * 2005-02-18 2006-08-24 Applera Corporation Compositions, methods, and kits for analyzing DNA methylation
US7439024B2 (en) * 2005-06-01 2008-10-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs Methods and kits for diagnosing or monitoring autoimmune and chronic inflammatory diseases
US20070037184A1 (en) * 2005-06-16 2007-02-15 Applera Corporation Methods and kits for evaluating dna methylation
EP2298932A1 (en) * 2005-09-29 2011-03-23 Epigenomics AG Methods and nucleic acids for the analysis of gene expression, in particular methylation of KAAG1, associated with tissue classification
US20070292866A1 (en) * 2005-12-08 2007-12-20 Ambergen, Inc. Diagnosing human diseases by detecting DNA methylation changes
US7906288B2 (en) * 2006-01-04 2011-03-15 The Johns Hopkins University Compare-MS: method rapid, sensitive and accurate detection of DNA methylation

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6605432B1 (en) * 1999-02-05 2003-08-12 Curators Of The University Of Missouri High-throughput methods for detecting DNA methylation
US20050009059A1 (en) * 2003-05-07 2005-01-13 Affymetrix, Inc. Analysis of methylation status using oligonucleotide arrays
JP2006149334A (ja) * 2004-12-01 2006-06-15 Hitachi Software Eng Co Ltd メチル化検出方法
WO2006088978A1 (en) * 2005-02-16 2006-08-24 Epigenomics, Inc. Method for determining the methylation pattern of a polynucleic acid

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALLEN R.C. ET AL.: "Methylation of HpaII and HhaI sites near the polymorphic CAG repeat in the human androgen-receptor gene correlates with X chromosome inactivation", AM. J. HUM. GENET., vol. 51, no. 6, 1992, pages 1229 - 1239 *
JANG S.J. ET AL.: "Methylation patterns in human androgen receptor gene and clonality analysis", CANCER RES., vol. 60, no. 4, 2000, pages 864 - 866, XP002467560 *
KASSIM S. ET AL.: "Androgen receptor gene methylation and exon one CAG repeat length in ovarian cancer: differences from breast cancer", IUBMB LIFE, vol. 56, no. 7, 2004, pages 417 - 426 *
SHOFFNER M.A. ET AL.: "Chip PCR. I. Surface passivation of microfabricated silicon-glass chips for PCR", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 24, no. 2, 1996, pages 375 - 379, XP000605272 *
WANG S.H. ET AL.: "Identification and characterization of Bacillus anthracis by multiplex PCR on DNA chip", BIOSENS. BIOELECTRON., vol. 20, no. 4, 2004, pages 807 - 813, XP004633829 *
WEN J.K. ET AL.: "A visual DNA chip for simultaneous detection of hepatitis B virus, hepatitis C virus and human immunodeficiency virus type-1", BIOSENS. BIOELECTRON., vol. 19, no. 7, 2004, pages 685 - 692, XP002449305 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2272974A1 (en) * 2008-03-25 2011-01-12 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for determination of dna methylation
EP2272974A4 (en) * 2008-03-25 2011-06-29 Sumitomo Chemical Co DETERMINATION METHOD FOR DNA METHYLATION

Also Published As

Publication number Publication date
US20100009376A1 (en) 2010-01-14
JP5151167B2 (ja) 2013-02-27
AU2008215531A1 (en) 2008-08-21
JP2008182985A (ja) 2008-08-14
KR20090106420A (ko) 2009-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6428964B1 (en) Method for alteration detection
EP2272975B1 (en) Method for determination of dna methylation
EP2305806A1 (en) Method for detecting or quantifying dna
JP2014223089A (ja) Ｄｎａメチル化分析方法
JP5206059B2 (ja) メチル化されたｄｎａの含量を測定する方法
JP4924014B2 (ja) Ｄｎａメチル化測定方法
WO2008099745A1 (ja) Ｄｎａメチル化測定方法
JP5303981B2 (ja) Ｄｎａメチル化測定方法
JP5277681B2 (ja) Ｄｎａメチル化測定方法
CN118284703A (zh) 胚胎核酸分析
JP4940939B2 (ja) Ｄｎａメチル化測定方法
JP4940940B2 (ja) Ｄｎａメチル化測定方法
US20100021971A1 (en) Method to remove repetitive sequences from human dna
WO2013047910A1 (ja) 癌化度評価方法
JP5151709B2 (ja) Ｄｎａを定量又は検出する方法
WO2005026352A1 (ja) 癌化度評価方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 08710891

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12525089

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2008215531

Country of ref document: AU

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2008215531

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20080131

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020097018066

Country of ref document: KR

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 08710891

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1