JP2009225760A - メチル化されたdnaの含量を測定する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(1)生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料をメチル化感受性制限酵素による消化処理を行う第一工程、(2)第一工程で得られた消化処理が行われたDNA試料からメチル化された一本鎖DNAを取得し、該一本鎖DNAと、固定化メチル化DNA抗体とを結合させて一本鎖DNAを選択する第二工程、及び、本工程の前工程として第二工程で選択された一本鎖DNAを、固定化メチル化DNA抗体から分離して一本鎖状態であるDNA(正鎖)にする工程(第一前工程)等から構成される生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの含量を測定する方法等を提供する。
【選択図】図1
Description
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、簡便にDNAを定量又は検出する方法を提供することを目的とする。
[発明1]
生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの含量を測定する方法であって、
(1)生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料をメチル化感受性制限酵素による消化処理を行う第一工程、
(2)第一工程で得られた消化処理が行われたDNA試料からメチル化された一本鎖DNAを取得し、該一本鎖DNAと、固定化メチル化DNA抗体とを結合させて一本鎖DNAを選択する第二工程、及び、(3)下記の各本工程の前工程として第二工程で選択された一本鎖DNAを、固定化固定化メチル化DNA抗体から分離して一本鎖状態であるDNA(正鎖)にする工程(第一前工程)と、
第一前工程で一本鎖状態にされたゲノム由来のDNA(正鎖)を、一本鎖状態であるDNA(正鎖)が有する塩基配列の部分塩基配列(正鎖)であって、且つ、前記の目的とするDNA領域の塩基配列(正鎖)の3’ 末端より更に3’ 末端側に位置する部分塩基配列(正鎖)、に対して相補性である塩基配列(負鎖)を有する伸長プライマー(フォーワード用プライマー)を伸長プライマーとして、該伸長プライマーを1回伸長させることにより、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)を二本鎖DNAに伸長形成させる工程(第二前工程)と、
第二前工程で伸長形成された二本鎖DNAを、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)と目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)に一旦分離する工程(第三前工程)を有し、且つ、本工程として
(a)生成した目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)を鋳型として、前記フォワード用プライマーを伸長プライマーとして、該伸長プライマーを一回伸長させることにより、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第A工程(本工程)と、
(b)生成した目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)を鋳型として、前記の目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)が有する塩基配列の部分塩基配列(負鎖)であって、且つ、前記の目的とするDNA領域の塩基配列(正鎖)に対して相補性である塩基配列(負鎖)の3’ 末端より更に3’ 末端側に位置する部分塩基配列(負鎖)、に対して相補性である塩基配列(正鎖)を有する伸長プライマー(リバース用プライマー)を伸長プライマーとして、該伸長プライマーを1回伸長させることにより、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第B工程(本工程)とを有し、
更に第三工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する第三工程、を有することを特徴とする方法。
[発明2]
固定化固定化メチル化DNA抗体がメチルシトシン抗体である発明1に記載の方法。
[発明3]
生物由来検体が哺乳動物の血液、体液、血清、血漿、細胞溶解液又は組織溶解液である発明1又は2に記載の方法。
[発明4]
生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料が、該ゲノムDNAが有する目的とするDNA領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるDNA試料、又は予め精製されてなるDNA試料である発明1〜3のいずれか一に記載の方法。
[発明5]
第一工程が、
目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)と、メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドと、を混合することにより、該メチル化感受性制限酵素の認識部位が保護されてなる一本鎖DNAを選択する第一(A)工程と、
第一(A)工程で選択された一本鎖DNAをメチル化感受性制限酵素で消化処理する第一(B)工程と、から構成される発明1〜4のいずれか一に記載の方法。
[発明6]
メチル化感受性制限酵素が、生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域の中に認識切断部位を有する制限酵素、又はHhaIである発明1〜5のいずれか一に記載の方法。
[発明7]
第一工程におけるメチル化感受性制限酵素による消化処理を行わずに第二工程を行う発明1〜6のいずれかの請求項記載の方法。
[発明8]
第二工程が、
第一工程で得られた消化処理が行われたDNA試料に含まれるメチル化された二本鎖DNAをメチル化された一本鎖DNAに分離する第二(A)工程と、
第二(A)工程で得られたメチル化一本鎖DNAと固定化メチル化DNA抗体と結合させる第二(B)工程とからなり、
第二(A)工程でメチル化された二本鎖DNAをメチル化一本鎖DNAに分離する際に、カウンターオリゴヌクレオチドを添加する発明1〜7のいずれか一項に記載の方法。
本発明における「生物由来検体」としては、例えば、細胞溶解液、組織溶解液(ここでの組織とは、血液、リンパ節等を含む広義の意味である。)若しくは、哺乳動物においては、血漿、血清、リンパ液等の体液、体分泌物(尿や乳汁等)等の生体試料及びこれら生体試料から抽出して得られたゲノムDNAを挙げることができる。また該生物由来検体としては、例えば、微生物、ウイルス等由来の試料も挙げられ、この場合には、本発明における「ゲノムDNA」とは、微生物、ウイルスのゲノムDNAを意味するものである。哺乳動物由来の検体が血液である場合には、定期健康診断や簡便な検査等での本発明の利用が期待できる。
ゲノムDNAを哺乳動物由来の検体から得るには、例えば、市販のDNA抽出用キット等を用いてDNAを抽出すればよい。
因みに、血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体として、その中に含まれる遊離DNA(胃癌細胞等の癌細胞由来のDNAが含まれる)を分析すると、血球由来のDNAを避けて胃癌細胞等の癌細胞由来のDNAを解析することができ、胃癌細胞等の癌細胞、それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
尚、前記ゲノムDNA由来のDNA試料は、該ゲノムDNAが有する後述する目的とするDNA領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるDNA試料であってもよく、又は所定の方法により予め精製されてなるDNA試料であってもよい。
本発明における「CpG対」とは、CpGで示される塩基配列と、これに相補するCpGが結合してなる二本鎖オリゴヌクレオチドを意味するものである。
メチル化DNA抗体は、メチル化された塩基、メチル化DNA等を抗原として、通常の方法により作成できる。具体的にメチルシトシン抗体を作成するためには、5−メチルシチジン、5−メチルシトシン、或いは、5−メチルシトシンを含むDNA等を抗原として作製された抗体からDNA中のメチルシトシンへの特異的な結合を指標として選抜することで作製できる。
動物に抗原を免疫して得られる抗体としては、精製した抗原を免疫した後、IgG画分の抗体(ポリクローナル抗体)を利用する方法と、単一のクローンを生産する抗体(モノクローナル抗体)を利用する方法がある。本特許ではメチル化DNA、或いはメチルシトシンを特異的に認識できる抗体であることが望ましいため、モノクローナル抗体を利用することが望ましい。
最終免疫から数日後に脾臓を摘出し脂肪組織を剥離してから、脾細胞浮遊液を作製する。この脾細胞と、例えばHGPRT欠損骨髄腫細胞とを細胞融合してハイブリドーマを作製する。細胞融合剤としては脾細胞(B細胞)と骨髄腫細胞を効率的に融合できる方法ならば何でもよく、例えば、センダイウイルス(HVJ)、ポリエチレングリコール(PEG)を用いる方法などが挙げられる。また、高電圧パルスを用いる方法で細胞融合をしても良い。
細胞融合操作の後、HAT培地で培養し、脾細胞と骨髄腫細胞が融合したハイブリドーマのクローンを選択し、スクリーニングが可能になるまで細胞が成育するのを待つ。目的とする抗体を生産するハイブリドーマを選択するための抗体の検出法や抗体力価の測定法には、抗原抗体反応系を利用できる。具体的には、可溶性抗原に対する抗体測定法で、放射性同位元素免疫定量法(RIA)、酵素免疫定量法(ELISA)などが挙げられる。
「目的とするDNA領域(に対して相補性である塩基配列)を含む一本鎖DNA」とは、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAとの結合体(二本鎖)を形成するために必要な塩基配列、即ち、目的とするDNA領域の塩基配列の一部に相補的な塩基配列を含む塩基配列であることを意味し、「相補的塩基配列」と表現することもある。また、相補的塩基配列は、「相補的」と表現することもある。
「メチル化感受性制限酵素」とは、例えば、メチル化されたシトシンを含む認識配列を消化せず、メチル化されていないシトシンを含む認識配列のみを消化することのできる制限酵素等を意味する。即ち、メチル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されているDNAの場合には、該メチル化感受性制限酵素を該DNAに作用させても、該DNAは切断されない。これに対して、メチル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されていないDNAの場合には、該メチル化感受性制限酵素を該DNAに作用させれば、該DNAは切断される。このようなメチル化感受性酵素の具体的な例としては、例えば、生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域の中に認識切断部位を有する制限酵素であるHpaII、BstUI、NarI、SacII、HhaI等を挙げることができる。尚、前記のメチル化感受性制限酵素は、すでにGruenbaumらにより明らかにされている(Nucleic Acid Research, 9、 2509-2515)。
即ち、生物由来検体中に含まれるゲノムDNAがメチル化されていれば、前記のメチル化感受性制限酵素がメチル化状態であるDNAを切断しないという特性を利用することにより、前記の生物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおける前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも1つ以上のCpG対におけるシトシンがメチル化されていたか否かを区別することができる。即ち、前記のメチル化感受性制限酵素で消化処理することにより、仮に生物由来検体生物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおける前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも1つ以上のCpG対におけるシトシンがメチル化されていないのであれば、該メチル化感受性制限酵素により切断される。また仮に生物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおける前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している全てのCpG対におけるシトシンがメチル化されていたのであれば、該メチル化感受性制限酵素により切断されない。従って、消化処理を実施した後、後述のように、前記の目的とするDNA領域を増幅可能な一対のプライマーを用いたPCRを実施することにより、生物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおける前記制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも1つ以上のCpG対におけるシトシンがメチル化されていないのであれば、PCRによる増幅産物は得られず、一方、生物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおける前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している全てのCpG対におけるシトシンがメチル化されていたのであれば、PCRによる増幅産物が得られることになる。
この第一(A)工程と第一(B)工程とを経ることによって、生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料が一本鎖DNAであっても、二本鎖DNAのみを基質とするメチル化感受性制限酵素により消化することができる。また、第一(A)工程と第一(B)工程は連続して実施しても構わないし、同時に実施しても構わない。
これらの好ましい態様は、生物由来検体そのものを予め上記のような制限酵素で消化処理しておくことにより、メチル化量を精度良く求めることができるためである。該方法は、上記のような「DNAの切れ残し」を無くすのに有用である。
ゲノムDNAは、基本的には二本鎖DNAとして存在している。したがって、本操作においては、一本鎖を消化できるメチル化感受性制限酵素(例えば、HhaI)だけでなく、二本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素(例えば、HpaII、BstUI、NarI、SacII、HhaI等)を用いることができる。
また、固定化メチル化DNA抗体を、アミノ基、チオール基、アルデヒド基等の活性官能基を有する分子を共有結合させた後、シランカップリング剤等で表面を活性化させたガラス、多糖類誘導体、シリカゲル、或いは前記合成樹脂等、若しくは耐熱性プラスチック製の支持体に共有結合させる方法もある。尚、共有結合には、例えば、トリグリセライドを5個直列に連結して成るようなスペーサー、クロスリンカー等により共有結合させる方法も挙げられる。
更に、固定化メチル化DNA抗体を直接支持体に固定化してもよく、また、固定化メチル化DNA抗体に対する抗体(二次抗体)を支持体に固定化し、二次抗体にメチル化抗体を結合させることで支持体に固定してもよい。
尚、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)を選択する際に本固定化固定化メチル化DNA抗体が支持体に固定化されていればよく、(1)該一本鎖DNA(正鎖)と本固定化固定化メチル化DNA抗体との結合前の段階で、本固定化固定化メチル化DNA抗体と支持体との結合により固定化されるものであってもよく、また(2)該一本鎖DNA(正鎖)と本固定化固定化メチル化DNA抗体との結合後の段階で、本固定化固定化メチル化DNA抗体と支持体との結合により固定化されるものであってもよい。
(a)ビオチン化メチルシトシン抗体を適当量(例えば、0.1μg/50μL)アビジン被覆PCRチューブに添加し、その後、室温で約1時間静置し、ビオチン化メチルシトシン抗体とストレプトアビジンの固定化を促す。その後、残溶液の除去及び洗浄を行う。洗浄バッファー[例えば、0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を、100μL/チューブの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返し、支持体に固定化されたビオチン化メチルシトシン抗体をPCRチューブ内に残す。
(b)生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来の二本鎖DNAをバッファー(例えば、33mM Tris-Acetate pH 7.9、66mM KOAc、10mM MgOAc2、0.5mM Dithothreitol)とを混合して、95℃で数分間加熱する。その後、約0〜4℃の温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温し、一本鎖DNAを形成させる。その後、室温に戻す。
(c)形成された前記一本鎖DNAを、ビオチン化メチルシトシン抗体が固定化されたアビジン被覆PCRチューブに添加し、その後、室温で約1時間静置し、ビオチン化メチルシトシン抗体と、前記一本鎖DNAのうちメチル化された一本鎖DNAとの結合を促す(結合体の形成)(この段階で、少なくともメチル化されてないDNA領域を含む一本鎖DNAは、結合体を形成しない。)。その後、残溶液の除去及び洗浄を行う。洗浄バッファー[例えば、0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を、100μL/チューブの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返し、結合体をPCRチューブ内に残す(結合体の選択)。
(b)において使用するバッファーとしては、生物試料由来のゲノムDNA由来の二本鎖DNAを一本鎖DNAへ分離するために適していれば良く、前記バッファーに限ったわけではない。
(a)及び(c)における洗浄操作は、溶液中に浮遊している固定化されていない固定化メチル化DNA抗体、固定化メチル化DNA抗体に結合しなかった溶液中に浮遊しているメチル化されていない一本鎖DNA、または、後述の制限酵素で消化された溶液中に浮遊しているDNA等を反応溶液から取り除くため重要である。尚、洗浄バッファーは、上記の遊離の固定化メチル化DNA抗体、溶液中に浮遊している一本鎖DNA等の除去に適していれば良く、前記洗浄バッファーに限らず、DELFIAバッファー(PerkinElmer社製、Tris-HCl pH 7.8 with Tween 80)、TEバッファー等でも良い。
第一前工程で遊離の一本鎖状態にされたゲノム由来のDNA(正鎖)と、一本鎖状態であるDNA(正鎖)が有する塩基配列の部分塩基配列(正鎖)であって、且つ、前記の目的とするDNA領域の塩基配列(正鎖)の3’ 末端より更に3’ 末端側に位置する部分塩基配列(正鎖)、に対して相補性である塩基配列(負鎖)を有する伸長プライマー(フォーワード用プライマー)を伸長プライマーとして、該伸長プライマーを1回伸長させることにより、遊離の一本鎖状態であるDNA(正鎖)を二本鎖DNAに伸長形成させる工程(第二前工程)と、
第二前工程で伸長形成された二本鎖DNAを、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)と目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)に一旦分離する工程(第三前工程)を有し、且つ、本工程として
(a)生成した目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)を鋳型として、前記フォワード用プライマーを伸長プライマーとして、該伸長プライマーを一回伸長させることにより、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第A工程(本工程)と、
(b)生成した目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)を鋳型として、前記の目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)が有する塩基配列の部分塩基配列(負鎖)であって、且つ、前記の目的とするDNA領域の塩基配列(正鎖)に対して相補性である塩基配列(負鎖)の3’ 末端より更に3’ 末端側に位置する部分塩基配列(負鎖)、に対して相補性である塩基配列(正鎖)を有する伸長プライマー(リバース用プライマー)を伸長プライマーとして、該伸長プライマーを1回伸長させることにより、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第B工程(本工程)とを有し、
更に第三工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する。
その後、本工程として、
(i) 生成した目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)に、前記のフォワード用プライマーをアニーリングさせるために、例えば、前記のフォワード用プライマーのTm値の約0〜20℃低い温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温する。
(ii)その後、室温に戻す。
(iii)上記(i)でアニーリングさせた前記の一本鎖状態であるDNAを鋳型として、前記のフォワード用プライマーを伸長プライマーとして、該プライマーを1回伸長させることにより、前記の目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる(即ち、第A工程)。具体的には例えば、後述の説明や前述の本発明の第二前工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよい。
(iv)生成した目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)を鋳型として、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(負鎖)が有する塩基配列の部分塩基配列(負鎖)であって、且つ、前記の目的とするDNA領域の塩基配列(正鎖)に対して相補性である塩基配列(負鎖)の3’ 末端より更に3’ 末端側に位置する部分塩基配列(負鎖)、に対して相補性である塩基配列(正鎖)を有する伸長プライマー(リバース用プライマー)を伸長プライマーとして、該伸長プライマーを1回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるDNAを伸長形成された二本鎖DNAとする(即ち、第B工程)。具体的には例えば、上記(iii)のA工程と同様に、第二前工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよい。
(v)更に第三工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すこと(例えば、第A工程及び第B工程)により、前記の目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する。
目的とするDNA領域(即ち、目的領域)は、GCリッチな塩基配列が多いため、時に、ベタイン、DMSO等を適量加えて反応を実施してもよい。反応条件としては、例えば、前記のような反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて30秒間次いで55〜65℃にて30秒間更に72℃にて30秒間を1サイクルとする保温を30〜40サイクル行う条件が挙げられる。かかるPCRを行った後、得られた増幅産物を検出する。例えば、予め標識されたプライマーを使用した場合には、先と同様の洗浄・精製操作を実施後、蛍光標識体の量の測定によりPCR反応での増幅量を評価することができる。また、標識されていない通常のプライマーを用いたPCRを実施した場合は、金コロイド粒子、蛍光等で標識したプローブ等をアニーリングさせ、目的領域に結合した該プローブの量を測定することにより検出することができる。また、増幅産物の量をより精度よく求めるには、例えば、リアルタイムPCR法を用いればよい。リアルタイムPCR法とは、PCRをリアルタイムでモニターし、得られたモニター結果をカイネティックス分析する方法であり、例えば、遺伝子量に関して2倍程度のほんのわずかな差異をも検出できる高精度の定量PCR法として知られる方法である。該リアルタイムPCR法には、例えば、鋳型依存性核酸ポリメラーゼプローブ等のプローブを用いる方法、サイバーグリーン等のインターカレーターを用いる方法等を挙げることができる。リアルタイムPCR法のための装置及びキットは市販されるものを利用してもよい。以上の如く、検出については特に限定されることはなく、これまでに周知のあらゆる方法による検出が可能である。これら方法では、反応容器を移し換えることなく検出までの操作が可能となる。
各種疾患(例えば、癌)においてDNAのメチル化異常が起こることが知られており、このDNAメチル化異常を検出することにより、各種疾患の度合いを測定することが可能と考えられている。
例えば、疾患由来の生物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおいて100%メチル化されているDNA領域があり、そのDNA領域について、本発明を実施すれば、メチル化されたDNAの量は多くなり、例えば、疾患由来の生物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおいて100%メチル化されていないDNA領域があり、そのDNA領域について、本発明を実施すれば、メチル化されたDNAの量はほぼ0に近い値となるであろう。また、例えば、健常者の生物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおいて低メチル化状態(hypomethylation)で、且つ、疾患患者の生物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおいて高メチル化状態(hypermethylation)であるDNA領域があり、そのDNA領域について、本発明を実施すれば、健常者の場合には、メチル化されたDNAの量は、0に近い値を示し、一方、疾患患者の場合には、健常者の場合における値よりも有意に高い値を示すため、この値の差異に基づき、「疾患の度合い」を判定することができる。ここでの「疾患の度合い」とは、一般に該分野において使用される意味と同様であって、具体的には、例えば、生物由来検体が細胞である場合には該細胞の悪性度を意味し、また、例えば、生物由来検体が組織である場合には該組織における疾患細胞の存在量等を意味している。更に、生物由来検体が血漿・血清である場合にはその個体が疾患を有する確率を意味している。従って、本発明は、メチル化異常を調べることにより、各種疾患を診断することを可能にする。
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.1μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
Nは5-メチルシトシンを示す。
GPR7-2079-2176/98mer-M(7):
5’ - GTTGGCCACTGCGGAGTCGNGCNGGGTGGCNGGCCGCACCTACAGNGCCGNGNGNGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3’ (配列番号17)
<HpaIIの認識配列がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチド>
Nは5-メチルシトシンを示す。
GPR7-2079-2176/98mer-HM(5):
5’ - GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCNGGCCGCACCTACAGNGCCGNGNGNGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3’ (配列番号18)
<アンメチル化オリゴヌクレオチド>
GPR7-2079-2176/98mer-UM:
5’ - GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCGGCCGCACCTACAGCGCCGCGCGCGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3’ (配列番号19)
MA:5’ - GCCACCCGGCGCGA -3’ (配列番号20)
PF1:5’ -GTTGGCCACTGCGGAGTCG-3’ (配列番号21)
PR1:5’ -GCACGACGAGTGTGACGATC-3’ (配列番号22)
GPR7-2079-2176:5’ - GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCGGCCGCACCTACAGCGCCGCGCGCGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3’ (配列番号23)
PCRを行った後、2%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった(以上、本発明の第三工程に相当する。)。
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
PF2:5’ - CTCAGCACCCAGGCGGCC -3’ (配列番号24)
PR2:5’ - CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3’ (配列番号25)
X:5’ - CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3’(配列番号26)
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA社)により、DNAフラグメントXを精製した。
MX:5’ - CTCAGCACCCAGGNGGCNGNGATCATGAGGNGNGAGNGGNGNGNGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGNGGGTGGCACACNGNGATGTAGNGGTNGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCNGANGCAAACATGCNGAACACCTGCAGGTGCTTCACCANGNGGCACAGCCAGTNGGGGCNGNGGAAGNGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGNGGCAGCACCTGGAAGAATGCCANGGCCAGGTNGGCCAGGCTGAGGTGTNGGATGAAGAGGTGCATGNGGGANGTCTTGNGNGGNGTCNGGTGCAGAGCCAGCAGTANGCTGCTGTTGCCCAGCANGGCCACNGNGAAAGTCACNGCCAGCANGGNGATCTCCAGTTTGGCCAG -3’ (配列番号27)
溶液A:100pg/5μL TE溶液
溶液B:10pg/5μL TE溶液
溶液C:1pg/5μL TE溶液
溶液D:TE溶液(ネガティブコントロール液)
溶液MA:100pg/5μL TE溶液
溶液MB:10pg/5μL TE溶液
溶液MC:1pg/5μL TE溶液
溶液MD:TE溶液(ネガティブコントロール液)
X’ :5’ - CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3’ (配列番号28)
C1:5’ - GCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCG -3’ (配列番号29)
C2:5’ - GCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACG -3’ (配列番号30)
C3:5’ - CGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGA -3’ (配列番号31)
C4:5’ - AGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATG -3’ (配列番号32)
C5:5’ - ACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCC -3’ (配列番号33)
C6:5’ - TAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGC -3’ (配列番号34)
C7:5’ - CGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGG -3’ (配列番号35)
C8:5’ - ATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACG -3’ (配列番号36)
C9:5’ - ATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAAC -3’ (配列番号37)
C10:5’ - TGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTC -3’ (配列番号38)
C11:5’ - CGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGG -3’ (配列番号39)
C12:5’ - CAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGG -3’ (配列番号40)
PF2:5’ - CTCAGCACCCAGGCGGCC -3’ (配列番号24)
PR2:5’ - CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3’ (配列番号25)
X’ :5’ - CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3’ (配列番号28)
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった(以上、本発明測定方法の第四工程に相当する。)。
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
PF3:5’ - TGAGCTCCGTAGGGCGTCC -3’ (配列番号41)
PR3:5’ - GCGCCGGGTCCGGGCCC -3’ (配列番号42)
Y:5’ - GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3’ (配列番号43)
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA社)により、DNAフラグメントYを精製した。
MY:5’ - GNGCNGGGTCNGGGCCNGATGNGTTGGNGGGCCAGGGCTCNGAGAANGAGGNGTTGTCCATCTCAANGAGGGCAGAGGAGCNGGNGACCTGGNGTCCCCCAAGGANGCCCTANGGAGCTCA -3’ (配列番号44)
溶液A:100pg/5μL TE溶液
溶液B:10pg/5μL TE溶液
溶液C:1pg/5μL TE溶液
溶液D:TE溶液(ネガティブコントロール液)
溶液MA:100pg/5μL TE溶液
溶液MB:10pg/5μL TE溶液
溶液MC:1pg/5μL TE溶液
溶液MD:TE溶液(ネガティブコントロール液)
Y’ :5’ - GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3’ (配列番号45)
C13:5’ - GCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3’ (配列番号46)
C14:5’ - CTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTG -3’ (配列番号47)
C15:5’ - CGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGG -3’ (配列番号48)
PF3:5’ - TGAGCTCCGTAGGGCGTCC -3’ (配列番号41)
PR3:5’ - GCGCCGGGTCCGGGCCC -3’ (配列番号42)
Y’ :5’ - GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3’ (配列番号45)
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
調製した酵母細胞を、バッファーA(1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4)に懸濁し、0.1% 2-メルカプトエタノール(終濃度14mM)及び100U zymolase(10 mg/ml)を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で1時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーB(50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA)に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g 4℃で30分間遠心して得られた沈澱を70%エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、1ml のTEバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA)に溶解し、40μg/mlになるようにRNase A(Sigma社製)を加えて37℃で1時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K(Sigma社製)を500μg/ml及びドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、これを55℃で約16時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl(pH 8.0)にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにNaClを0.5Nとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を70%エタノールでリンスすることにより、ゲノムDNAを得た。
得られたゲノムDNAから、以下の配列番号49及び配列番号50で示されるPCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー(PF4及びPR4)及び反応条件を用いてPCRを行うことにより、供試サンプルとして用いられるDNAフラグメント(T、配列番号51、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384569-384685に相当する領域)を増幅した。
PF4:5’ - GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’ (配列番号49)
PR4:5’ - AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’ (配列番号50)
T:5’ - GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’ (配列番号51)
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA社)により、DNAフラグメントTを精製した。
MT:5’ - GGACCTGTGTTTGANGGGTATAACACTAAGTTGNGCAATTTGCTGTATTGNGAAATCNGCCNGGANGATATCACTCTTGAGNGCATGTGCNGTTTCNGAGAANGCCAGATCTGTACT -3’ (配列番号52)
溶液A:100pg/5μL TE溶液
溶液B:10pg/5μL TE溶液
溶液C:1pg/5μL TE溶液
溶液D:TE溶液(ネガティブコントロール液)
溶液MA:100pg/5μL TE溶液
溶液MB:10pg/5μL TE溶液
溶液MC:1pg/5μL TE溶液
溶液MD:TE溶液(ネガティブコントロール液)
T’ :5’ - GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’ (配列番号53)
C16:5’ - GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’ (配列番号54)
C17:5’ - AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3’ (配列番号55)
C18:5’ - ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3’ (配列番号56)
C19:5’ - CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC -3’ (配列番号57)
PF4:5’ - GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’ (配列番号49)
PR4:5’ - AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’ (配列番号50)
T’ :5’ - GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’ (配列番号53)
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった(以上、本発明測定方法の第四工程に相当する。)。
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
調製した酵母細胞を、バッファーA(1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4)に懸濁し、0.1% 2-メルカプトエタノール(終濃度14mM)及び100U zymolase(10 mg/ml)を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で1時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーB(50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA)に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g 4℃で30分間遠心して得られた沈澱を70%エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、1ml のTEバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA)に溶解し、40μg/mlになるようにRNase A(Sigma社製)を加えて37℃で1時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K(Sigma社製)を500μg/ml及びドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、これを55℃で約16時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl(pH 8.0)にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにNaClを0.5Nとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を70%エタノールでリンスすることにより、ゲノムDNAを得た。
溶液A:10ng/5μL TE溶液
溶液B:1ng/5μL TE溶液
溶液C:0.1ng/5μL TE溶液
溶液D:TE溶液(ネガティブコントロール液)
溶液MA:10ng/5μL TE溶液
溶液MB:1ng/5μL TE溶液
溶液MC:0.1ng/5μL TE溶液
溶液MD:TE溶液(ネガティブコントロール液)
T’:5’ - TAGGAAATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCCTATTATTAGAGGGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACTGCGATCGCACACGAGGAGACACAGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGACAAATGAACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC -3’ (配列番号58)
C16:5’ - GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’ (配列番号54)
C17:5’ - AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3’ (配列番号55)
C18:5’ - ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3’ (配列番号56)
C19:5’ - CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC -3’ (配列番号57)
C20:5’ - AATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCC -3’ (配列番号59)
C21:5’ - GCGATCGCACACGAGGAGACA -3’ (配列番号60)
C22:5’ - AGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGAC -3’ (配列番号61)
C23:5’ - AAATGAACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC -3’ (配列番号62)
PF4:5’ - GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’ (配列番号49)
PR4:5’ - AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’ (配列番号50)
T’ :5’ - GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’ (配列番号53)
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった(以上、本発明測定方法の第四工程に相当する。)。
配列番号17
実験のために設計された部分メチル化オリゴヌクレオチド
配列番号18
実験のために設計された部分メチル化オリゴヌクレオチド
配列番号19
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号20
実験のために設計されたマスキング用オリゴヌクレオチド
配列番号21
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号22
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号23
目的とするDNA領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号24
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号25
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号26
実験のために設計されたDNAフラグメント
配列番号27
実験のために設計されたメチル化DNAフラグメント
配列番号28
目的とするDNA領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号29
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号30
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号31
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号32
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号33
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号34
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号35
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号36
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号37
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号38
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号39
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号40
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号41
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号42
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号43
実験のために設計されたDNAフラグメント
配列番号44
実験のために設計されたメチル化DNAフラグメント
配列番号45
目的とするDNA領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号46
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号47
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号48
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号49
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号50
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号51
実験のために設計されたDNAフラグメント
配列番号52
実験のために設計されたメチル化DNAフラグメント
配列番号53
目的とするDNA領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号54
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号55
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号56
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号57
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号58
目的とするDNA領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号59
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号60
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号61
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号62
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
Claims (8)
- 生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの含量を測定する方法であって、
(1)生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料をメチル化感受性制限酵素による消化処理を行う第一工程、
(2)第一工程で得られた消化処理が行われたDNA試料からメチル化された一本鎖DNAを取得し、該一本鎖DNAと、固定化メチル化DNA抗体とを結合させて一本鎖DNAを選択する第二工程、及び、
(3)下記の各本工程の前工程として第二工程で選択された一本鎖DNAを、固定化メチル化DNA抗体から分離して一本鎖状態であるDNA(正鎖)にする工程(第一前工程)と、
第一前工程で一本鎖状態にされたゲノム由来のDNA(正鎖)を、一本鎖状態であるDNA(正鎖)が有する塩基配列の部分塩基配列(正鎖)であって、且つ、前記の目的とするDNA領域の塩基配列(正鎖)の3’末端よりさらに3’末端側に位置する部分塩基配列(正鎖)、に対して相補性である塩基配列(負鎖)を有する伸長プライマー(フォーワード用プライマー)を伸長プライマーとして、該伸長プライマーを1回伸長させることにより、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)を二本鎖DNAに伸長形成させる工程(第二前工程)と、
第二前工程で伸長形成された二本鎖DNAを、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)と目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)に一旦分離する工程(第三前工程)を有し、且つ、本工程として
(a)生成した目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)を鋳型として、前記フォワード用プライマーを伸長プライマーとして、該伸長プライマーを一回伸長させることにより、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第A工程(本工程)と、
(b)生成した目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)を鋳型として、前記の目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)が有する塩基配列の部分塩基配列(負鎖)であって、且つ、前記の目的とするDNA領域の塩基配列(正鎖)に対して相補性である塩基配列(負鎖)の3’末端よりさらに3’末端側に位置する部分塩基配列(負鎖)、に対して相補性である塩基配列(正鎖)を有する伸長プライマー(リバース用プライマー)を伸長プライマーとして、該伸長プライマーを1回伸長させることにより、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第B工程(本工程)とを有し、
さらに第三工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する第三工程、を有することを特徴とする方法。 - 固定化メチル化DNA抗体がメチルシトシン抗体である請求項1に記載の方法。
- 生物由来検体が哺乳動物の血液、体液、血清、血漿、細胞溶解液又は組織溶解液である請求項1又は2に記載の方法。
- 生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料が、該ゲノムDNAが有する目的とするDNA領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるDNA試料、又は予め精製されてなるDNA試料である請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 第一工程が、
目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)と、メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドと、を混合することにより、該メチル化感受性制限酵素の認識部位が保護されてなる一本鎖DNAを選択する第一(A)工程と、
第一(A)工程で選択された一本鎖DNAをメチル化感受性制限酵素で消化処理する第一(B)工程と、から構成される請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。 - メチル化感受性制限酵素が、生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域の中に認識切断部位を有する制限酵素、又はHhaIである請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 第一工程におけるメチル化感受性制限酵素による消化処理を行わずに第二工程を行う請求項1〜6のいずれかの請求項記載の方法。
- 第二工程が、
第一工程で得られた消化処理が行われたDNA試料に含まれるメチル化された二本鎖DNAをメチル化された一本鎖DNAに分離する第二(A)工程と、
第二(A)工程で得られたメチル化一本鎖DNAと固定化メチル化DNA抗体と結合させる第二(B)工程とからなり、
第二(A)工程でメチル化された二本鎖DNAをメチル化一本鎖DNAに分離する際に、カウンターオリゴヌクレオチドを添加する請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
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