JP3854943B2 - Ｄｎａメチル化率の測定方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、DNAメチル化率の測定方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、癌細胞の悪性度の評価や、あるいは in vitro細胞の分化状態の評価等に有用なDNAメチル化の測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
多細胞生物における細胞の分化や機能発現には、遺伝子情報が正しく発現されることが不可欠であるが、その発現制御には、転写調節因子のネットワークだけでなく、DNAのメチル化やクロマチン動態の変化といったエピジェネティック機構の関与が重要視されている。特に、ゲノムDNA中のシトシンのメチル化は、遺伝子発現を負に制御していることが知られている。また、ゲノム上でのメチル化のパターンの差異が、ゲノムインプリンティングやX染色体不活性化現象との関連を示すことや、さらには癌やICF（immunodeficiency, centromeric instability and facial anomalies）症候群、Rett症候群、脆弱X症候群などの疾患にも関係することが報告されている（例えば非特許文献1参照）。
【０００３】
DNA鎖のメチルシトシンを測定する方法としては、メチル化感受性の制限酵素による切断片を比較する方法、bisulfite法、methylation-specificPCR法、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いる方法等が知られている（非特許文献１参照）。また、特許文献１にはメチル化の対象となるCG連続配列（CpGアイランド）を含むDNA鎖を特異的にPCR増幅する方法が、特許文献２にはメチルシトシンを含むDNA鎖に特異的にハイブリダイズする標識DNA断片を用いる方法が開示されている。
【０００４】
【特許文献１】
特表平11-511776号公報
【特許文献２】
特表2002-535998号公報
【非特許文献１】
波平昌一 他 実験医学 20(7):1-19-1024, 2002
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
前記のとおり、DNA鎖のメチル化は、癌をはじめとする様々な疾患の重要な指標であり、また遺伝子発現の制御に関係することから、例えば細胞の分化の程度を把握するための指標ともなり、これまでにその測定方法が様々に検討されている。
【０００６】
一方、例えば医療の現場においてDNAメチル化を測定する場合には、迅速かつ正確に判定結果が得られることが求められている。しかしながら、このような観点からは従来の各方法は、必ずしも好ましい方法ではなかった。例えば、制限酵素を用いる方法の場合にはサザンブロッティング等による断片の比較手続が必須であり、bisulfite法や特許文献１の方法ではPCR法とその産物のDNA配列分析等の面倒な作業を必要とする。特に、従来の方法では、被験サンプルとしてのDNA鎖に対して必要な処理を不可欠とするため、判定結果を得るまでに多大な時間と労力を要するという問題点を有していた。
【０００７】
この出願の発明は以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、簡便かつ正確にDNAメチル化の程度を測定する方法を提供することを課題としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決する発明として、5-メチルシトシンと特異的に結合する抗体を1本鎖DNAと接触させ、DNA鎖に結合した抗体量を測定することを特徴とするDNAメチル化率の測定方法を提供する。
【０００９】
またこの発明の方法においては、１価結合した抗体をDNA鎖から分離し、２価結合した抗体量を測定することによって、5-メチルシトシンの密集領域を特定することを好ましい態様の一つとしている。
【００１０】
さらにこの発明の方法においては、１本鎖DNAの任意領域以外を２本鎖とし、１本鎖の領域についてDNAメチル化率を測定することを別の好ましい態様としている。
【００１１】
なお、この発明において「DNA鎖」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ-N-グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）がホスホジエステル結合した分子を言い、特にゲノムDNA鎖を意味する。また、この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はSambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている。
【００１２】
以下、各発明について、実施形態を詳しく説明する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
この出願の発明は、前記のとおり、5-メチルシトシンと特異的に結合する抗体を1本鎖DNAと接触させ、DNA鎖に結合した抗体量を測定し、この抗体量によってDNAメチル化率を決定することを特徴としている。
【００１４】
5-メチルシトシンと特異的に結合する抗体（以下、「抗5-メチルシトシン抗体」と記載することがある）は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、5-メチルシトシンに結合することができる全体分子、およびFab、F(ab')2、Fv断片等であるが、特に、モノクローナル抗体の全体分子であることが好ましい。モノクローナル抗5-メチルシトシン抗体は、5-メチルシトシンを免疫原として、公知のモノクローナル抗体作製法（例えば、「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、1990年； "Monoclonal Antibody" James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996）に従い作製することができる。また、5-メチルシトシンを特異的に認識するモノクローナル抗体は、文献（例えば、Reynaud C. et al., Cancer Lett, 1992 Jan 31;61(3):255-62; Mizugaki M. et al., Biol Pharm Bull. 1996 Dec;19(12):1537-40; Podesta A. et al., Int J Biochem, 1993 Jun;25(6):929-33）等が知られており、これらを使用することもできる。
【００１５】
DNA鎖に結合した（すなわち、DNA鎖中の5-メチルシトシンに結合した）抗体量の測定は、例えば、抗5-メチルシトシン抗体を標識化し、この標識シグナル量を測定することによって行うことができる。また、抗体に結合する２次抗体（例えば抗IgG抗体）を標識化し、DNA鎖に結合した抗5-メチルシトシン抗体（１次抗体）に２次抗体を結合させ、その標識シグナルを測定する方法（いわゆる「サンドイッチ法」）によって行うこともできる。標識は、酵素、放射性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素は、turnover numberが大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常のEIAに用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、3,3',5,5'−テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。放射性同位体としては、125Ｉや3Ｈ等の通常のRIAで用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルオレッセンスイソチオシアネート（FITC）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。また、このような標識シグナルの測定は、標識として酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。放射生同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。また、蛍光色素を用いる場合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。
【００１６】
この発明の方法は、液相系で行うこともでき、固相系で行うこともできるが、安定した測定値を得るためには、固相系で行うことが好ましい。すなわち、被験試料であるDNA鎖を固相に固定化し、この固定化DNA鎖に抗5-メチルシトシン抗体を反応させる。DNA鎖（特にゲノムDNA）を固相に固定化するには、例えば、固相に2本鎖リンカーDNAを固定化し、このリンカーの端部と一致させて制限酵素切断した2本鎖ゲノムDNAをリガーゼを用いて連結させる方法等を採用することができる。リンカーDNAを固相に固定化するには、リンカーDNAの一端を公知の方法によりビオチン化し、これをアビジンコートした固相に固定化することによって行うことができる。あるいは、官能基を導入したリンカーDNAを合成し、表面処理した固相担体表面にリンカーDNAを点着し、共有結合させる方法（例えば、Lamture, J.B. et al. Nucl. Acids Res. 22:2121-2125, 1994; Guo, Z. et al. Nucl. Acids Res. 22:5456-5465, 1994）を採用することもできる。さらに、以上の方法により固定化した2本鎖DNAは、例えば塩酸溶液等によって変性処理することによって1本鎖DNAとすることができる。
【００１７】
この発明の方法は、また、１価結合した抗5-メチルシトシン抗体をDNA鎖から分離し、２価結合した抗体量を測定することによって、5-メチルシトシンの密集領域を特定することを好ましい態様の一つとしている。すなわち、抗体（IgG）分子は、1本のFc部分と２本のFab部分とからなっており、対象のエピトーブに対してFab部分の先端が結合する。従って、図1に示したように、DNA鎖の5-メチルシトシンが１個の場合には、抗5-メチルシトシン抗体の１本のFab部分が結合し（１価結合：図1B）、一方、適当な距離に２個の5-メチルシトシンが存在する場合には、２本のFabがそれぞれの5-メチルシトシンに結合する（２価結合：図1A）。抗体の２価結合は、１価結合に比べて約103（M-1）倍も強い親和性を持つことが知られているため、１価結合した抗体を除去し、２価結合した抗体を測定することによって、5-メチルシトシンが密集する領域を高精度で検出することができる。
【００１８】
ここで抗体分子とDNA分子の分子サイズについて論ずる。IgG分子構造はおよそアルファベットのＴに似た構造を呈しており、２つのFabの両端間、すなわち２つの抗原結合部位の距離はおよそ14.2nmであることが明らかとなっている（Sarma V.R. et al., J.Bio.Chem., vol.246,pp3753-3759, 1971）。また、WatsonとCrickが提唱したDNAの２重らせん構造のB型DNAでは、１塩基対ごとに0.34nmの間隔で並び、DNAのらせんが１回転する間隔であるピッチは3.4nmである。これから換算すると、IgG分子に存在する２カ所の抗原結合部位の約14nmは、塩基数に換算すると約42塩基の距離に相当する。従って、抗5-メチルシトシン抗体は、同一DNA上に存在する異なる２つの5-メチルシトシン間の距離がおよそ40塩基以内に存在すれば、DNAに対して２価結合することができる。
【００１９】
後記実施例４、５に示したように、１本鎖DNA中の5-メチルシトシン含有率が例えばおよそ4.4%に上った場合には、抗5-メチルシトシン抗体は複数個の5-メチルシトシンを含む１本鎖DNAに２価結合できるようになり、それは、同一１本鎖DNA上の異なる２つの5-メチルシトシン分子間の平均距離が約14nm以下になると推察される。
【００２０】
この原理を利用して、抗5-メチルシトシン抗体をnano-scale-rod、すなわちおよそ14nmを測定する「ナノものさし」として利用することができる。具体的には、同一１本鎖DNA分子上の異なる２つの5-メチルシトシン分子間の距離を測る場合、抗体（IgG）が1価結合しかできない場合には5-メチルシトシン分子間の距離はおよそ14nm以上で、2価結合できる場合には14nm以内の距離にあると言える。これを利用して、DNA中の5-メチルシトシン含有率を求めることが可能である。
【００２１】
なお、１価結合抗体を除去するには、例えば、アルカリ性または酸性の緩衝液、高塩濃度の緩衝液を作用させる方法、抗原（5-メチルシトシン）の過剰量を共存させて拮抗させる方法、あるいは溶液温度を上昇させる方法等を採用することができる。またこの発明の方法においては、抗5-メチルシトシン抗体を反応させ、１価結合および２価結合のそれぞれの抗体をDNA鎖に結合させた後、上記の方法によって１価結合抗体を除去（解離）させてもよく、あるいは、上記の緩衝液等を用いて、２価結合の抗体だけをDNA鎖に結合させるようにしてもよい。
【００２２】
さらにこの発明の方法においては、１本鎖DNAの任意領域以外を２本鎖とし、１本鎖の領域についてDNAメチル化率を測定することを別の好ましい態様としている（図3参照）。この方法は、特にDNAのメチル化が重要な意味をもつ領域（例えば遺伝子の発現制御領域等）のみを対象として5-メチルシトシンの存在量やその密度を測定する場合に特に好ましい。測定対象領域以外を２本鎖とするには、２本鎖とする領域のDNA配列に対して相補的な１本鎖オリゴヌクレオチド断片をアニールさせる方法等を採用することができる。
【００２３】
以下、実施例を示してこの出願の発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００２４】
【実施例】
実施例１：抗体の作成
5-methylcytidine-KLH（KLH＝キーホールリンペットヘモシアニン）コンジュゲート（100mg）をFCA（フロイント・コンプリート・アジュバント）と共にマウス足掌に投与し、9日目にリンパ節を取り、マウスミエローマ細胞（SP2/0）と融合させた。得られた融合細胞を96穴培養プレート3枚に撒き、常法に従ってHAT培地を用いたハイブリドーマの選択的育成を行った。培養開始から約10日から2週間後に、育成してきたハイブリドーマの培養上精について抗体活性をスクリーニングした。具体的には、抗原［5-methylcytidineをBSA（牛血清アルブミン）に結合させた5-methylcytidine-BSAコンジュゲート］を10mg/mlの濃度でPBSに溶解し、これを96穴ELISA用プレートにコーティングし、その後、BSAで常法に従ってブロッキングした後、これに前記ハイブリドーマの培養上清を反応させ、抗体反応陽性を呈したハイブリドーマを取得した。さらに、cytidineをBSAに結合させたcytidine-BSAコンジュゲートに対する抗体反応性も同様に測定し、cytidine-BSAに対して交差性の見られない、あるいは低い抗体を産生するハイブリドーマを選択し、最終的にこのハイブリドーマから常法に従い、抗5-メチルシトシン抗体を得た。
実施例２：抗体の特異性の検討(1)
実施例１で作製した抗5-メチルシトシン抗体の反応特異性を調べるため、以下の実験を行った。
【００２５】
マウスfocal adhesion kinase（GenBank/M95408）のcDNA塩基配列のうち、1966番目から2190番目の塩基にあたる225塩基のDNA断片（図3、配列番号１）をPCR法により増幅した。この時、PCR用センス鎖プライマーは、5'位をビオチン化したオリゴDNAを使用した。鋳型DNAにはマウス脳cDNAを用い、以下の条件でPCRを行った。
【００２６】
なお、PCR産物である2本鎖DNAのセンス鎖には50塩基のシトシン塩基が存在するが、PCRプライマー部分を除く46塩基のうちの20塩基のシトシンがランダムに5-メチルシトシンに置換されるように（図3参照）、PCR反応溶液中に5-methyl-2'-deoxycytidine-5'-triphosphate (5m-dCTP)を混入させた。具体的には、下記のデオキシヌクレオチド・ストックA液とストックB液を26対20の比率で混合した溶液を用いてPCR反応を行った。
PCR用プライマー：
センスプライマー：5'-Biotin-CGTGAAGCCTTTTCAAGGAG-3'（配列番号２）
アンチセンスプライマー：5'-TCCATCCTCATCCGTTCTTC-3'（配列番号３）
使用酵素：
Expand High-Fidelity PCR System（ロッシュ・ダイアグノスティクス社製）
デオキシヌクレオチド：
ストックA液（0.5mM dATP, 0.5mM dTTP, 0.5mM dGTP, 0.5mM dCTP）
ストックB液（0.5mM dATP, 0.5mM dTTP, 0.5mM dGTP, 0.5mM 5m-dCTP）
上記デオキシヌクレオチド・ストック溶液は、PCR反応液50μl中に、A液とB液の合計が5μlになるように添加した。それぞれの割合は作製するPCR産物にどれだけの割合で5-メチルシトシンを取り込ませるかによって任意に設定できる。
反応条件：
(1)94.5, 2min x 1サイクル
(2)[94.5, 30sec/58℃, 30sec/72℃, 40sec ] x 28サイクル
(3)72℃, 8min x 1サイクル
PCR反応はサーマルサイクラーＭＰ（宝酒造社）を用いて行った。
【００２７】
PCR反応後、PCR産物から常法に従ってDNAを精製し、アビジンコートした96穴マイクロタイタープレートに固定化した。次いで、この2本鎖DNAを、50mM塩酸で２分間処理して１本鎖化した。この処理後にウェルをPBS/1mM EDTAで数回洗浄して、アビジンに捕獲された１本鎖DNAのみをウェルに固定化した。
【００２８】
この固定化した1本鎖DNAに対して、実施例１で作製した抗5-メチルシトシン抗体（１次抗体）と、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識抗マウスIgG抗体（２次抗体）を用いて、常法に従いELISAを行った。ただし、マイクロタイタープレートの通常の洗浄は、10mM Tris-HCl（pH7.6）/0.15M NaCl/0.05% Tween20 を含む緩衝液で行い、基質にはパラニトロフェニルリン酸(シグマ社，N-1891)を用い、基質と反応させてから一定時間後に405nmの吸光度を測定した。
【００２９】
ウェル上に固定化した１本鎖DNA中に含まれる５-メチルシトシン含量を任意に変え、その時の抗5-メチルシトシン抗体の反応性を検討した。そのELISA測定結果を図４に示す。
【００３０】
図4に示したとおり、抗５-メチルシトシン抗体はウェル上に固定化したDNA中の５-メチルシトシン含量が増加するに従い、抗体結合性が増加した。塩酸処理により１本鎖化せずに２本鎖のままウェル上に固定化した場合、その２本鎖DNAは合計で約43個の５-メチルシトシンを含む２本鎖DNAとなるが、この２本鎖DNAに抗５-メチルシトシン抗体は結合しなかった。すなわち、抗5-メチルシトシン抗体は、５-メチルシトシンを含む２本鎖DNAには結合せず、５-メチルシトシンを含む１本鎖DNAにのみ特異的に結合することが確認された。
実施例３：抗体の特異性の検討(2)
20個の5-メチルシトシンをランダムに有するDNA鎖を対象とし、抗5-メチルシトシン抗体（１次抗体）の反応後、異なる濃度のNaClを含むウェル洗浄緩衝液で10分間処理することを除き、実施例２と同様の方法によりELISAを実施した。また、１次抗体反応後に0.15M NaClを含む通常のウェル洗浄に使用する緩衝液[10mM Tris-HCl（pH7.6）/0.15M NaCl/0.05% Tween20]で10分間処理したものを比較対照（100%）とした。
【００３１】
結果は図5に示したとおりである。NaClの濃度に依存して、抗5-メチルシトシン抗体のメチルシトシンへの結合が阻害されるが、0.5から1MのNaCl処理（10分）でも抗原抗体結合がある程度保持される事が確認された。
実施例４：抗体の特異性の検討(3)
96穴マイクロタイタープレートに固定化する１本鎖DNAあたりに含まれる5-メチルシトシン含量を変化させた場合の、NaCl処理に対する感受性を測定した。すなわち、１次抗体結合後、0.5N NaClを含むウェル洗浄緩衝液（10mM Tris-HCl（pH7.6）/0.5M NaCl/0.05% Tween20）でウェルを10分間処理することを除き、実施例３と同様に実施した。
【００３２】
結果は図６に示したとおりである。なお、10mM Tris-HCl（pH7.6）/0.5M NaCl/0.05% Tween20を用いた処理の代わりに、通常のウェル洗浄緩衝液（10mM Tris-HCl（pH7.6）/0.15M NaCl/0.05% Tween20）で同様に10分間処理したものを比較対照とした。
【００３３】
図6にも示したとおり、抗5-メチルシトシン抗体は、96穴マイクロタイタープレートのウェルに固定化してある１本鎖DNA(225塩基)中に平均４個の5-メチルシトシンが含まれる場合には、0.5M NaCl処理で抗原抗体反応は解離しやすいが、ウェル上に固定化された１本鎖DNA(225塩基)中に平均10個の5-メチルシトシンが存在すると、抗原に対する抗体の結合性は安定化し、0.5M NaCl洗浄に対する抵抗性が急に増加することが確認された。
実施例５：抗体の特異性の検討(4)
実施例１で作成した抗5-メチルシトシン抗体はマウスIgG2a、κ鎖の抗体であるが、この抗体のFabフラグメントを作製し、FabフラグメントとIgG全体分子のNaCl処理に対する結合抵抗性を比較検討した。ELISAプロトコールは実施例４に従った。
【００３４】
結果は図７に示したとおりである。一般的に、抗原との結合部位を２カ所持つIgG分子と、結合部位が１カ所のFabフラグメントとでは、抗原と抗体のアフィニティー（平衡定数：M-1）はおよそ1000倍の開きがあり、抗原と２価結合できるIgG分子の方がより強い親和性を持つ。図７から明らかなように、抗5-メチルシトシン抗体のIgG分子は、このIgGから派生したFab分子より高塩濃度（NaCl）処理に対する抵抗性が強い。すなわち、同じNaCl濃度で比較すると、FabフラグメントはIgG分子より抗原から早く解離することが確認された。
【００３５】
以上の結果は、実施例４の結果と併せて、以下のとおり考察される。実施例４では、１本鎖DNA中の5-メチルシトシン含有率がおよそ1.8%の場合には高濃度のNaCl（ここでは0.5MのNaCl）による処理で、抗原抗体反応の大部分が解離するが、１本鎖DNA中の5-メチルシトシン含有率がおよそ4.4%に上った場合には高濃度のNaCl処理によっても、抗原抗体結合を維持するIgG分子の割合が急に増加した。
【００３６】
これはすなわち、実施例５のFabフラグメントを用いた試験結果からも明らかなように、１本鎖DNA中の5-メチルシトシン含有率がDNA分子の特定領域内に置いて約1.8%から約4.4%に移行することによって、抗5-メチルシトシン抗体（IgG分子）が１価結合から２価結合に移行することを意味している。言い換えれば、抗原（5-メチルシトシン）が一定密度以上存在することによって、抗5-メチルシトシン抗体１分子（IgG）が同一DNA分子上に存在する複数個の5-メチルシトシン塩基に２価結合できるようになることを意味している。
実施例６：特定領域の5-メチルシトシン含量の測定例
抗5-メチルシトシン抗体は2本鎖DNAと反応しないことを利用し、2本鎖DNA中の特定の領域を限定的に1本鎖化し、この1本鎖を測定対象領域として5-メチルシトシン含量を測定した。
【００３７】
実施例２の方法に従い、図３（配列番号１）に塩基配列を示した2本鎖DNAのセンス鎖DNA中に20塩基の5-メチルシトシンを含むようにPCR法で２本鎖DNAを合成した。なお、PCRプライマーは、実施例２と同一とした。
【００３８】
次に、変性用緩衝液[10mM Tris-HCl(pH 8.1)/50mM KCl/1.5mM MgCl2]に２本鎖DNA約500ngと、50pmoleの合成オリゴDNA（図８の３種類：それぞれ配列番号４、５、６）を加えて全量50μlとし、これをPCR用チューブ（200μl容量）に入れ、PCR用サーマルサイクラーにセットした。この反応液を98℃、2分間の変性処理後、直ちに65℃、30分の処理を行い、DNAの再会合を誘導した。これにより、２本鎖DNAの一部の領域が、加えた合成オリゴDNAインサートの妨害より、限定した領域において１本鎖化した状態で安定する。すなわち合成オリゴDNAインサートが２本鎖DNAにサンドイッチされた状態で安定化する。得られたPCR産物を、アビジンコートした96穴マイクロタイタープレートの基質上に、オリゴインサートがサンドイッチされた状態のまま固定化した。ここでは前記のPCRチューブ内の全反応溶液50μlのうち、5μlを96穴マイクロタイタープレートの１ウェルに加えて固定化した。これより以降の操作は、前記の実施例４と同様のELISAプロトコールに従って行った。ただし、２次抗体としてHRP標識抗マウスIgG抗体を用い、基質としてはテトラメチルベンチジン（SIGMA社 cat♯ T-0440）を用い、室温において30分間の発色反応後、基質100μlに対して0.3M硫酸を20μl加えて反応を停止し、450nmにおける吸光度を測定した。
【００３９】
結果は図９に示したとおりである。被験対象である２本鎖DNA（225bp）にはセンス鎖あたり約20塩基の5-メチルシトシンを含有している。２本鎖DNAの端部に近い領域にハイブリダイズするオリゴインサート＃１を使用した場合に最も吸光度が高く、オリゴインサートのハイブリダイズする領域が２本鎖DNAの中央領域に入るにつれて吸光度が低くなっていく。使用したオリゴインサートは全て30merである。従ってこのとき、オリゴインサート＃１、＃２および＃３が２本鎖DNAに結合した場合には、それぞれ3塩基、6塩基および11塩基のシトシンが１本鎖として露出することになり、このうちのおよそ50%の割合のシトシンが5-メチルシトシンに置き換わっている。２本鎖DNAから露出するシトシン数が少ないオリゴインサート＃１の吸光度の方が高く、露出するシトシン数がより多いオリゴインサート＃２、＃３では吸光度が低くなっている。すなわちこれは、２本鎖DNA上のオリゴインサートがハイブリダイズする位置は２本鎖DNAの末端部分の方が安定し、中央部分に行くに従って２本鎖DNAから排除され易いことを意味している。これを解消する方法としては、DNA同士の結合より強固に結合する１本鎖RNAか、あるいは同じくDNA同士の結合より強固に結合するペプチド核酸（DNAやRNAとは異なりリン酸結合ではなくペプチド結合で骨格を形成しているオリゴDNA。PNAと略す。）を用いることにより、標的２本鎖の中央部分であっても効率よく、かつ限局的に１本鎖化を行うことができる。これらに限らず、DNA同士の結合より強く、なおかつDNAとハイブリダイズする物質であれば、前記のオリゴインサートの場合と同様の結果が得られる。
【００４０】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、DNA鎖の5-メチルシトシンを簡便かつ正確に測定することが可能となり、例えば癌の悪性度の診断等に新たな手段が提供される。
【００４１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 (A)は、5-メチルシトシンを含む1本鎖DNAに対する抗5-メチルシトシン抗体の２価結合を示し、(B)は１価結合を示す。
【図２】部分的に１本鎖としたDNA鎖の5-メチルシトシンに対する抗5-メチルシトシン抗体の結合状態を示す。
【図３】実施例で使用したDNA鎖の塩基配列である。四角で囲ったシトシンが任意の割合でランダムに5-メチルシトシンに置換する。
【図４】 DNA鎖に含まれる5-メチルシトシンの個数と、抗5-メチルシトシン抗体の結合の程度の関係を示したグラフである。
【図５】１次抗体（5-メチルシトシン抗体）反応後にNaCl処理した場合の、NaCl濃度と抗5-メチルシトシン抗体の結合の程度の関係を示したグラフである。
【図６】１次抗体（5-メチルシトシン抗体）反応後に0.15Mまたは0.5MのNaClで処理した場合の、DNA鎖に含まれる5-メチルシトシンの個数と、抗5-メチルシトシン抗体の結合の程度の関係を示したグラフである。
【図７】各濃度のNaClで処理した場合の、5-メチルシトシン抗体（IgG分子）とそのFab分子の5-メチルシトシン結合状態を示したグラフである。
【図８】実施例で１本鎖DNA領域を形成するために使用した合成オリゴDNAインサート＃1〜3の塩基配列と、これらのインサートがハイブリダイズするDNA鎖の塩基配列である。インサートのハイブリダイズ領域を枠で示した。
【図９】合成オリゴDNAインサート＃1〜3をハイブリダイズした２本鎖DNAに対する抗5-メチルシトシン抗体の結合の程度を示したグラフである。
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、DNAメチル化率の測定方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、癌細胞の悪性度の評価や、あるいは in vitro細胞の分化状態の評価等に有用なDNAメチル化の測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
多細胞生物における細胞の分化や機能発現には、遺伝子情報が正しく発現されることが不可欠であるが、その発現制御には、転写調節因子のネットワークだけでなく、DNAのメチル化やクロマチン動態の変化といったエピジェネティック機構の関与が重要視されている。特に、ゲノムDNA中のシトシンのメチル化は、遺伝子発現を負に制御していることが知られている。また、ゲノム上でのメチル化のパターンの差異が、ゲノムインプリンティングやX染色体不活性化現象との関連を示すことや、さらには癌やICF（immunodeficiency, centromeric instability and facial anomalies）症候群、Rett症候群、脆弱X症候群などの疾患にも関係することが報告されている（例えば非特許文献1参照）。
【０００３】
DNA鎖のメチルシトシンを測定する方法としては、メチル化感受性の制限酵素による切断片を比較する方法、bisulfite法、methylation-specificPCR法、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いる方法等が知られている（非特許文献１参照）。また、特許文献１にはメチル化の対象となるCG連続配列（CpGアイランド）を含むDNA鎖を特異的にPCR増幅する方法が、特許文献２にはメチルシトシンを含むDNA鎖に特異的にハイブリダイズする標識DNA断片を用いる方法が開示されている。
【０００４】
【特許文献１】
特表平11-511776号公報
【特許文献２】
特表2002-535998号公報
【非特許文献１】
波平昌一 他 実験医学 20(7):1-19-1024, 2002
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
前記のとおり、DNA鎖のメチル化は、癌をはじめとする様々な疾患の重要な指標であり、また遺伝子発現の制御に関係することから、例えば細胞の分化の程度を把握するための指標ともなり、これまでにその測定方法が様々に検討されている。
【０００６】
一方、例えば医療の現場においてDNAメチル化を測定する場合には、迅速かつ正確に判定結果が得られることが求められている。しかしながら、このような観点からは従来の各方法は、必ずしも好ましい方法ではなかった。例えば、制限酵素を用いる方法の場合にはサザンブロッティング等による断片の比較手続が必須であり、bisulfite法や特許文献１の方法ではPCR法とその産物のDNA配列分析等の面倒な作業を必要とする。特に、従来の方法では、被験サンプルとしてのDNA鎖に対して必要な処理を不可欠とするため、判定結果を得るまでに多大な時間と労力を要するという問題点を有していた。
【０００７】
この出願の発明は以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、簡便かつ正確にDNAメチル化の程度を測定する方法を提供することを課題としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決する発明として、5-メチルシトシンと特異的に結合する抗体を1本鎖DNAと接触させ、DNA鎖に結合した抗体量を測定することを特徴とするDNAメチル化率の測定方法を提供する。
【０００９】
またこの発明の方法においては、１価結合した抗体をDNA鎖から分離し、２価結合した抗体量を測定することによって、5-メチルシトシンの密集領域を特定することを好ましい態様の一つとしている。
【００１０】
さらにこの発明の方法においては、１本鎖DNAの任意領域以外を２本鎖とし、１本鎖の領域についてDNAメチル化率を測定することを別の好ましい態様としている。
【００１１】
なお、この発明において「DNA鎖」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ-N-グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）がホスホジエステル結合した分子を言い、特にゲノムDNA鎖を意味する。また、この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はSambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている。
【００１２】
以下、各発明について、実施形態を詳しく説明する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
この出願の発明は、前記のとおり、5-メチルシトシンと特異的に結合する抗体を1本鎖DNAと接触させ、DNA鎖に結合した抗体量を測定し、この抗体量によってDNAメチル化率を決定することを特徴としている。
【００１４】
5-メチルシトシンと特異的に結合する抗体（以下、「抗5-メチルシトシン抗体」と記載することがある）は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、5-メチルシトシンに結合することができる全体分子、およびFab、F(ab')2、Fv断片等であるが、特に、モノクローナル抗体の全体分子であることが好ましい。モノクローナル抗5-メチルシトシン抗体は、5-メチルシトシンを免疫原として、公知のモノクローナル抗体作製法（例えば、「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、1990年； "Monoclonal Antibody" James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996）に従い作製することができる。また、5-メチルシトシンを特異的に認識するモノクローナル抗体は、文献（例えば、Reynaud C. et al., Cancer Lett, 1992 Jan 31;61(3):255-62; Mizugaki M. et al., Biol Pharm Bull. 1996 Dec;19(12):1537-40; Podesta A. et al., Int J Biochem, 1993 Jun;25(6):929-33）等が知られており、これらを使用することもできる。
【００１５】
DNA鎖に結合した（すなわち、DNA鎖中の5-メチルシトシンに結合した）抗体量の測定は、例えば、抗5-メチルシトシン抗体を標識化し、この標識シグナル量を測定することによって行うことができる。また、抗体に結合する２次抗体（例えば抗IgG抗体）を標識化し、DNA鎖に結合した抗5-メチルシトシン抗体（１次抗体）に２次抗体を結合させ、その標識シグナルを測定する方法（いわゆる「サンドイッチ法」）によって行うこともできる。標識は、酵素、放射性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素は、turnover numberが大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常のEIAに用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、3,3',5,5'−テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。放射性同位体としては、125Ｉや3Ｈ等の通常のRIAで用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルオレッセンスイソチオシアネート（FITC）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。また、このような標識シグナルの測定は、標識として酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。放射生同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。また、蛍光色素を用いる場合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。
【００１６】
この発明の方法は、液相系で行うこともでき、固相系で行うこともできるが、安定した測定値を得るためには、固相系で行うことが好ましい。すなわち、被験試料であるDNA鎖を固相に固定化し、この固定化DNA鎖に抗5-メチルシトシン抗体を反応させる。DNA鎖（特にゲノムDNA）を固相に固定化するには、例えば、固相に2本鎖リンカーDNAを固定化し、このリンカーの端部と一致させて制限酵素切断した2本鎖ゲノムDNAをリガーゼを用いて連結させる方法等を採用することができる。リンカーDNAを固相に固定化するには、リンカーDNAの一端を公知の方法によりビオチン化し、これをアビジンコートした固相に固定化することによって行うことができる。あるいは、官能基を導入したリンカーDNAを合成し、表面処理した固相担体表面にリンカーDNAを点着し、共有結合させる方法（例えば、Lamture, J.B. et al. Nucl. Acids Res. 22:2121-2125, 1994; Guo, Z. et al. Nucl. Acids Res. 22:5456-5465, 1994）を採用することもできる。さらに、以上の方法により固定化した2本鎖DNAは、例えば塩酸溶液等によって変性処理することによって1本鎖DNAとすることができる。
【００１７】
この発明の方法は、また、１価結合した抗5-メチルシトシン抗体をDNA鎖から分離し、２価結合した抗体量を測定することによって、5-メチルシトシンの密集領域を特定することを好ましい態様の一つとしている。すなわち、抗体（IgG）分子は、1本のFc部分と２本のFab部分とからなっており、対象のエピトーブに対してFab部分の先端が結合する。従って、図1に示したように、DNA鎖の5-メチルシトシンが１個の場合には、抗5-メチルシトシン抗体の１本のFab部分が結合し（１価結合：図1B）、一方、適当な距離に２個の5-メチルシトシンが存在する場合には、２本のFabがそれぞれの5-メチルシトシンに結合する（２価結合：図1A）。抗体の２価結合は、１価結合に比べて約103（M-1）倍も強い親和性を持つことが知られているため、１価結合した抗体を除去し、２価結合した抗体を測定することによって、5-メチルシトシンが密集する領域を高精度で検出することができる。
【００１８】
ここで抗体分子とDNA分子の分子サイズについて論ずる。IgG分子構造はおよそアルファベットのＴに似た構造を呈しており、２つのFabの両端間、すなわち２つの抗原結合部位の距離はおよそ14.2nmであることが明らかとなっている（Sarma V.R. et al., J.Bio.Chem., vol.246,pp3753-3759, 1971）。また、WatsonとCrickが提唱したDNAの２重らせん構造のB型DNAでは、１塩基対ごとに0.34nmの間隔で並び、DNAのらせんが１回転する間隔であるピッチは3.4nmである。これから換算すると、IgG分子に存在する２カ所の抗原結合部位の約14nmは、塩基数に換算すると約42塩基の距離に相当する。従って、抗5-メチルシトシン抗体は、同一DNA上に存在する異なる２つの5-メチルシトシン間の距離がおよそ40塩基以内に存在すれば、DNAに対して２価結合することができる。
【００１９】
後記実施例４、５に示したように、１本鎖DNA中の5-メチルシトシン含有率が例えばおよそ4.4%に上った場合には、抗5-メチルシトシン抗体は複数個の5-メチルシトシンを含む１本鎖DNAに２価結合できるようになり、それは、同一１本鎖DNA上の異なる２つの5-メチルシトシン分子間の平均距離が約14nm以下になると推察される。
【００２０】
この原理を利用して、抗5-メチルシトシン抗体をnano-scale-rod、すなわちおよそ14nmを測定する「ナノものさし」として利用することができる。具体的には、同一１本鎖DNA分子上の異なる２つの5-メチルシトシン分子間の距離を測る場合、抗体（IgG）が1価結合しかできない場合には5-メチルシトシン分子間の距離はおよそ14nm以上で、2価結合できる場合には14nm以内の距離にあると言える。これを利用して、DNA中の5-メチルシトシン含有率を求めることが可能である。
【００２１】
なお、１価結合抗体を除去するには、例えば、アルカリ性または酸性の緩衝液、高塩濃度の緩衝液を作用させる方法、抗原（5-メチルシトシン）の過剰量を共存させて拮抗させる方法、あるいは溶液温度を上昇させる方法等を採用することができる。またこの発明の方法においては、抗5-メチルシトシン抗体を反応させ、１価結合および２価結合のそれぞれの抗体をDNA鎖に結合させた後、上記の方法によって１価結合抗体を除去（解離）させてもよく、あるいは、上記の緩衝液等を用いて、２価結合の抗体だけをDNA鎖に結合させるようにしてもよい。
【００２２】
さらにこの発明の方法においては、１本鎖DNAの任意領域以外を２本鎖とし、１本鎖の領域についてDNAメチル化率を測定することを別の好ましい態様としている（図3参照）。この方法は、特にDNAのメチル化が重要な意味をもつ領域（例えば遺伝子の発現制御領域等）のみを対象として5-メチルシトシンの存在量やその密度を測定する場合に特に好ましい。測定対象領域以外を２本鎖とするには、２本鎖とする領域のDNA配列に対して相補的な１本鎖オリゴヌクレオチド断片をアニールさせる方法等を採用することができる。
【００２３】
以下、実施例を示してこの出願の発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００２４】
【実施例】
実施例１：抗体の作成
5-methylcytidine-KLH（KLH＝キーホールリンペットヘモシアニン）コンジュゲート（100mg）をFCA（フロイント・コンプリート・アジュバント）と共にマウス足掌に投与し、9日目にリンパ節を取り、マウスミエローマ細胞（SP2/0）と融合させた。得られた融合細胞を96穴培養プレート3枚に撒き、常法に従ってHAT培地を用いたハイブリドーマの選択的育成を行った。培養開始から約10日から2週間後に、育成してきたハイブリドーマの培養上精について抗体活性をスクリーニングした。具体的には、抗原［5-methylcytidineをBSA（牛血清アルブミン）に結合させた5-methylcytidine-BSAコンジュゲート］を10mg/mlの濃度でPBSに溶解し、これを96穴ELISA用プレートにコーティングし、その後、BSAで常法に従ってブロッキングした後、これに前記ハイブリドーマの培養上清を反応させ、抗体反応陽性を呈したハイブリドーマを取得した。さらに、cytidineをBSAに結合させたcytidine-BSAコンジュゲートに対する抗体反応性も同様に測定し、cytidine-BSAに対して交差性の見られない、あるいは低い抗体を産生するハイブリドーマを選択し、最終的にこのハイブリドーマから常法に従い、抗5-メチルシトシン抗体を得た。
実施例２：抗体の特異性の検討(1)
実施例１で作製した抗5-メチルシトシン抗体の反応特異性を調べるため、以下の実験を行った。
【００２５】
マウスfocal adhesion kinase（GenBank/M95408）のcDNA塩基配列のうち、1966番目から2190番目の塩基にあたる225塩基のDNA断片（図3、配列番号１）をPCR法により増幅した。この時、PCR用センス鎖プライマーは、5'位をビオチン化したオリゴDNAを使用した。鋳型DNAにはマウス脳cDNAを用い、以下の条件でPCRを行った。
【００２６】
なお、PCR産物である2本鎖DNAのセンス鎖には50塩基のシトシン塩基が存在するが、PCRプライマー部分を除く46塩基のうちの20塩基のシトシンがランダムに5-メチルシトシンに置換されるように（図3参照）、PCR反応溶液中に5-methyl-2'-deoxycytidine-5'-triphosphate (5m-dCTP)を混入させた。具体的には、下記のデオキシヌクレオチド・ストックA液とストックB液を26対20の比率で混合した溶液を用いてPCR反応を行った。
PCR用プライマー：
センスプライマー：5'-Biotin-CGTGAAGCCTTTTCAAGGAG-3'（配列番号２）
アンチセンスプライマー：5'-TCCATCCTCATCCGTTCTTC-3'（配列番号３）
使用酵素：
Expand High-Fidelity PCR System（ロッシュ・ダイアグノスティクス社製）
デオキシヌクレオチド：
ストックA液（0.5mM dATP, 0.5mM dTTP, 0.5mM dGTP, 0.5mM dCTP）
ストックB液（0.5mM dATP, 0.5mM dTTP, 0.5mM dGTP, 0.5mM 5m-dCTP）
上記デオキシヌクレオチド・ストック溶液は、PCR反応液50μl中に、A液とB液の合計が5μlになるように添加した。それぞれの割合は作製するPCR産物にどれだけの割合で5-メチルシトシンを取り込ませるかによって任意に設定できる。
反応条件：
(1)94.5, 2min x 1サイクル
(2)[94.5, 30sec/58℃, 30sec/72℃, 40sec ] x 28サイクル
(3)72℃, 8min x 1サイクル
PCR反応はサーマルサイクラーＭＰ（宝酒造社）を用いて行った。
【００２７】
PCR反応後、PCR産物から常法に従ってDNAを精製し、アビジンコートした96穴マイクロタイタープレートに固定化した。次いで、この2本鎖DNAを、50mM塩酸で２分間処理して１本鎖化した。この処理後にウェルをPBS/1mM EDTAで数回洗浄して、アビジンに捕獲された１本鎖DNAのみをウェルに固定化した。
【００２８】
この固定化した1本鎖DNAに対して、実施例１で作製した抗5-メチルシトシン抗体（１次抗体）と、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識抗マウスIgG抗体（２次抗体）を用いて、常法に従いELISAを行った。ただし、マイクロタイタープレートの通常の洗浄は、10mM Tris-HCl（pH7.6）/0.15M NaCl/0.05% Tween20 を含む緩衝液で行い、基質にはパラニトロフェニルリン酸(シグマ社，N-1891)を用い、基質と反応させてから一定時間後に405nmの吸光度を測定した。
【００２９】
ウェル上に固定化した１本鎖DNA中に含まれる５-メチルシトシン含量を任意に変え、その時の抗5-メチルシトシン抗体の反応性を検討した。そのELISA測定結果を図４に示す。
【００３０】
図4に示したとおり、抗５-メチルシトシン抗体はウェル上に固定化したDNA中の５-メチルシトシン含量が増加するに従い、抗体結合性が増加した。塩酸処理により１本鎖化せずに２本鎖のままウェル上に固定化した場合、その２本鎖DNAは合計で約43個の５-メチルシトシンを含む２本鎖DNAとなるが、この２本鎖DNAに抗５-メチルシトシン抗体は結合しなかった。すなわち、抗5-メチルシトシン抗体は、５-メチルシトシンを含む２本鎖DNAには結合せず、５-メチルシトシンを含む１本鎖DNAにのみ特異的に結合することが確認された。
実施例３：抗体の特異性の検討(2)
20個の5-メチルシトシンをランダムに有するDNA鎖を対象とし、抗5-メチルシトシン抗体（１次抗体）の反応後、異なる濃度のNaClを含むウェル洗浄緩衝液で10分間処理することを除き、実施例２と同様の方法によりELISAを実施した。また、１次抗体反応後に0.15M NaClを含む通常のウェル洗浄に使用する緩衝液[10mM Tris-HCl（pH7.6）/0.15M NaCl/0.05% Tween20]で10分間処理したものを比較対照（100%）とした。
【００３１】
結果は図5に示したとおりである。NaClの濃度に依存して、抗5-メチルシトシン抗体のメチルシトシンへの結合が阻害されるが、0.5から1MのNaCl処理（10分）でも抗原抗体結合がある程度保持される事が確認された。
実施例４：抗体の特異性の検討(3)
96穴マイクロタイタープレートに固定化する１本鎖DNAあたりに含まれる5-メチルシトシン含量を変化させた場合の、NaCl処理に対する感受性を測定した。すなわち、１次抗体結合後、0.5N NaClを含むウェル洗浄緩衝液（10mM Tris-HCl（pH7.6）/0.5M NaCl/0.05% Tween20）でウェルを10分間処理することを除き、実施例３と同様に実施した。
【００３２】
結果は図６に示したとおりである。なお、10mM Tris-HCl（pH7.6）/0.5M NaCl/0.05% Tween20を用いた処理の代わりに、通常のウェル洗浄緩衝液（10mM Tris-HCl（pH7.6）/0.15M NaCl/0.05% Tween20）で同様に10分間処理したものを比較対照とした。
【００３３】
図6にも示したとおり、抗5-メチルシトシン抗体は、96穴マイクロタイタープレートのウェルに固定化してある１本鎖DNA(225塩基)中に平均４個の5-メチルシトシンが含まれる場合には、0.5M NaCl処理で抗原抗体反応は解離しやすいが、ウェル上に固定化された１本鎖DNA(225塩基)中に平均10個の5-メチルシトシンが存在すると、抗原に対する抗体の結合性は安定化し、0.5M NaCl洗浄に対する抵抗性が急に増加することが確認された。
実施例５：抗体の特異性の検討(4)
実施例１で作成した抗5-メチルシトシン抗体はマウスIgG2a、κ鎖の抗体であるが、この抗体のFabフラグメントを作製し、FabフラグメントとIgG全体分子のNaCl処理に対する結合抵抗性を比較検討した。ELISAプロトコールは実施例４に従った。
【００３４】
結果は図７に示したとおりである。一般的に、抗原との結合部位を２カ所持つIgG分子と、結合部位が１カ所のFabフラグメントとでは、抗原と抗体のアフィニティー（平衡定数：M-1）はおよそ1000倍の開きがあり、抗原と２価結合できるIgG分子の方がより強い親和性を持つ。図７から明らかなように、抗5-メチルシトシン抗体のIgG分子は、このIgGから派生したFab分子より高塩濃度（NaCl）処理に対する抵抗性が強い。すなわち、同じNaCl濃度で比較すると、FabフラグメントはIgG分子より抗原から早く解離することが確認された。
【００３５】
以上の結果は、実施例４の結果と併せて、以下のとおり考察される。実施例４では、１本鎖DNA中の5-メチルシトシン含有率がおよそ1.8%の場合には高濃度のNaCl（ここでは0.5MのNaCl）による処理で、抗原抗体反応の大部分が解離するが、１本鎖DNA中の5-メチルシトシン含有率がおよそ4.4%に上った場合には高濃度のNaCl処理によっても、抗原抗体結合を維持するIgG分子の割合が急に増加した。
【００３６】
これはすなわち、実施例５のFabフラグメントを用いた試験結果からも明らかなように、１本鎖DNA中の5-メチルシトシン含有率がDNA分子の特定領域内に置いて約1.8%から約4.4%に移行することによって、抗5-メチルシトシン抗体（IgG分子）が１価結合から２価結合に移行することを意味している。言い換えれば、抗原（5-メチルシトシン）が一定密度以上存在することによって、抗5-メチルシトシン抗体１分子（IgG）が同一DNA分子上に存在する複数個の5-メチルシトシン塩基に２価結合できるようになることを意味している。
実施例６：特定領域の5-メチルシトシン含量の測定例
抗5-メチルシトシン抗体は2本鎖DNAと反応しないことを利用し、2本鎖DNA中の特定の領域を限定的に1本鎖化し、この1本鎖を測定対象領域として5-メチルシトシン含量を測定した。
【００３７】
実施例２の方法に従い、図３（配列番号１）に塩基配列を示した2本鎖DNAのセンス鎖DNA中に20塩基の5-メチルシトシンを含むようにPCR法で２本鎖DNAを合成した。なお、PCRプライマーは、実施例２と同一とした。
【００３８】
次に、変性用緩衝液[10mM Tris-HCl(pH 8.1)/50mM KCl/1.5mM MgCl2]に２本鎖DNA約500ngと、50pmoleの合成オリゴDNA（図８の３種類：それぞれ配列番号４、５、６）を加えて全量50μlとし、これをPCR用チューブ（200μl容量）に入れ、PCR用サーマルサイクラーにセットした。この反応液を98℃、2分間の変性処理後、直ちに65℃、30分の処理を行い、DNAの再会合を誘導した。これにより、２本鎖DNAの一部の領域が、加えた合成オリゴDNAインサートの妨害より、限定した領域において１本鎖化した状態で安定する。すなわち合成オリゴDNAインサートが２本鎖DNAにサンドイッチされた状態で安定化する。得られたPCR産物を、アビジンコートした96穴マイクロタイタープレートの基質上に、オリゴインサートがサンドイッチされた状態のまま固定化した。ここでは前記のPCRチューブ内の全反応溶液50μlのうち、5μlを96穴マイクロタイタープレートの１ウェルに加えて固定化した。これより以降の操作は、前記の実施例４と同様のELISAプロトコールに従って行った。ただし、２次抗体としてHRP標識抗マウスIgG抗体を用い、基質としてはテトラメチルベンチジン（SIGMA社 cat♯ T-0440）を用い、室温において30分間の発色反応後、基質100μlに対して0.3M硫酸を20μl加えて反応を停止し、450nmにおける吸光度を測定した。
【００３９】
結果は図９に示したとおりである。被験対象である２本鎖DNA（225bp）にはセンス鎖あたり約20塩基の5-メチルシトシンを含有している。２本鎖DNAの端部に近い領域にハイブリダイズするオリゴインサート＃１を使用した場合に最も吸光度が高く、オリゴインサートのハイブリダイズする領域が２本鎖DNAの中央領域に入るにつれて吸光度が低くなっていく。使用したオリゴインサートは全て30merである。従ってこのとき、オリゴインサート＃１、＃２および＃３が２本鎖DNAに結合した場合には、それぞれ3塩基、6塩基および11塩基のシトシンが１本鎖として露出することになり、このうちのおよそ50%の割合のシトシンが5-メチルシトシンに置き換わっている。２本鎖DNAから露出するシトシン数が少ないオリゴインサート＃１の吸光度の方が高く、露出するシトシン数がより多いオリゴインサート＃２、＃３では吸光度が低くなっている。すなわちこれは、２本鎖DNA上のオリゴインサートがハイブリダイズする位置は２本鎖DNAの末端部分の方が安定し、中央部分に行くに従って２本鎖DNAから排除され易いことを意味している。これを解消する方法としては、DNA同士の結合より強固に結合する１本鎖RNAか、あるいは同じくDNA同士の結合より強固に結合するペプチド核酸（DNAやRNAとは異なりリン酸結合ではなくペプチド結合で骨格を形成しているオリゴDNA。PNAと略す。）を用いることにより、標的２本鎖の中央部分であっても効率よく、かつ限局的に１本鎖化を行うことができる。これらに限らず、DNA同士の結合より強く、なおかつDNAとハイブリダイズする物質であれば、前記のオリゴインサートの場合と同様の結果が得られる。
【００４０】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、DNA鎖の5-メチルシトシンを簡便かつ正確に測定することが可能となり、例えば癌の悪性度の診断等に新たな手段が提供される。
【００４１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 (A)は、5-メチルシトシンを含む1本鎖DNAに対する抗5-メチルシトシン抗体の２価結合を示し、(B)は１価結合を示す。
【図２】部分的に１本鎖としたDNA鎖の5-メチルシトシンに対する抗5-メチルシトシン抗体の結合状態を示す。
【図３】実施例で使用したDNA鎖の塩基配列である。四角で囲ったシトシンが任意の割合でランダムに5-メチルシトシンに置換する。
【図４】 DNA鎖に含まれる5-メチルシトシンの個数と、抗5-メチルシトシン抗体の結合の程度の関係を示したグラフである。
【図５】１次抗体（5-メチルシトシン抗体）反応後にNaCl処理した場合の、NaCl濃度と抗5-メチルシトシン抗体の結合の程度の関係を示したグラフである。
【図６】１次抗体（5-メチルシトシン抗体）反応後に0.15Mまたは0.5MのNaClで処理した場合の、DNA鎖に含まれる5-メチルシトシンの個数と、抗5-メチルシトシン抗体の結合の程度の関係を示したグラフである。
【図７】各濃度のNaClで処理した場合の、5-メチルシトシン抗体（IgG分子）とそのFab分子の5-メチルシトシン結合状態を示したグラフである。
【図８】実施例で１本鎖DNA領域を形成するために使用した合成オリゴDNAインサート＃1〜3の塩基配列と、これらのインサートがハイブリダイズするDNA鎖の塩基配列である。インサートのハイブリダイズ領域を枠で示した。
【図９】合成オリゴDNAインサート＃1〜3をハイブリダイズした２本鎖DNAに対する抗5-メチルシトシン抗体の結合の程度を示したグラフである。
Claims (2)
- 5-メチルシトシンと特異的に結合する抗体を1本鎖DNAと接触させ、DNA鎖に結合した抗体量を測定することによって、 DNA メチル化率を測定する方法であって、１価結合した抗体を DNA 鎖から分離し、２価結合した抗体量を測定することによって、 5- メチルシトシンの密集領域を特定することを特徴とするDNAメチル化率の測定方法。
- １本鎖DNAの任意領域以外を２本鎖とし、１本鎖の領域についてDNAメチル化率を測定する請求項１の方法。
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