KR20110025965A - Ｄｎａ를 정량 또는 검출하는 방법 - Google Patents

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요시타카 도미가하라
히데오 사토
히로카즈 다루이
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수미토모 케미칼 컴퍼니 리미티드
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Abstract

본 발명은, 검체 중에 포함되는 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA를 정량 또는 검출하는 방법 등에 관한 것이다.

Description

ＤＮＡ를 정량 또는 검출하는 방법{METHOD FOR DETECTING OR QUANTIFYING DNA}
본 발명은, 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA를 정량 또는 검출하는 방법 등에 관한 것이다.
검체 중에 포함되는 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA를 정량 또는 검출하는 방법으로서는, 예를 들면, 검체로부터 DNA를 추출한 후, DNA 폴리머라아제에 의한 DNA 합성의 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction ; 이하, PCR라고 기재하는 경우도 있다)에 의해 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA를 증폭시켜 검출하는 방법이나, 검체 중의 DNA가 갖는 목적의 DNA 영역에 형광 표식한 올리고뉴클레오티드를 혼성화(hybridize)시켜 검출하는 방법 등이 알려져 있다(예를 들면, J. Cataract. Refract. Surg., 2007;33(4):635-641, Environ. Mol. Mutagen., 1991;18(4):259-262 참조).
본 발명은, 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA를 간편하게 정량 또는 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
즉, 본 발명은,
[발명 1]
검체 중에 포함되는 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA를 정량 또는 검출하는 방법으로서,
(1) 목적으로 하는 DNA 영역을 검출하고자 하는 DNA를 검체로부터 조제하는 제1 공정,
(2) 제1 공정에서 조제된 DNA를 DNA 메틸화 효소로 처리하는 제2 공정,
(3) 제2 공정에서 처리된 DNA로부터, 단일 사슬 메틸화 DNA를 조제하고, 이 단일 사슬 메틸화 DNA에 검출 올리고뉴클레오티드를 결합시켜 피검 DNA 복합체를 취득하는 제3 공정,
(4) 제3 공정에서 취득한 피검 DNA 복합체에 고정화 메틸화 DNA 항체를 결합시켜 검출 복합체를 취득하는 제4 공정, 및
(5) 제4 공정에서 얻어진 검출 복합체에 포함되는 검출 올리고뉴클레오티드를 그 식별 기능에 의해 정량 또는 검출함으로써, 상기 단일 사슬 DNA 중의 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA를 정량 또는 검출하는 제5 공정을 갖는 것을 특징으로 하는 방법(이하, 본 발명 방법이라고 기재하는 경우가 있다).
[발명 2]
제3 공정에서 피검 DNA 복합체를 취득할 때에 카운터 올리고뉴클레오티드를 첨가하는 발명 1에 기재된 방법.
[발명 3]
고정화 메틸화 DNA 항체가 메틸사이토신 항체인 발명 1 또는 2에 기재된 방법.
[발명 4]
DNA 메틸화 효소가 사이토신메틸화 효소 또는 Sss I 메틸라아제인 발명 1∼3 중 어느 하나에 기재된 방법.
[발명 5]
검체 중에 포함되는 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA가, RNA로부터 역전사 효소에 의해 생성된 DNA에 있어서의 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA인 발명 1∼4 중 어느 하나에 기재된 방법.
[발명 6]
검체가 하기 중 어느 하나의 생물 유래 검체인 발명 1∼5 중 어느 하나에 기재된 방법.
(a) 포유동물 유래의 혈액, 체액, 분뇨, 체분비물, 세포 용해액 또는 조직 용해액,
(b) 포유동물 유래의 혈액, 체액, 분뇨, 체분비물, 세포 용해액 및 조직 용해액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나에서 추출된 DNA,
(c) 포유동물 유래의 조직, 세포, 조직 용해액 및 세포 용해액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나에서 추출된 RNA를 주형으로 하여 제작된 DNA,
(e) 세균, 진균 또는 바이러스로부터 추출된 DNA, 또는
(f) 세균, 진균 또는 바이러스로부터 추출된 RNA를 주형으로 하여 제작된 DNA
[발명 7]
제1 공정에서 취득한 상기 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA가, 목적으로 하는 DNA 영역을 인식 절단 부위로 하지 않는 제한 효소로 미리 소화 처리되어 이루어지는 DNA, 합성 올리고뉴클레오티드, 또는 미리 정제되어 이루어지는 DNA인 발명 1∼6 중 어느 하나에 기재된 방법.
[발명 8]
검출 올리고뉴클레오티드의 식별 기능이 하기 중 어느 하나의 식별 기능인 발명 1∼7 중 어느 하나에 기재된 방법.
(a) FITC의 형광 검출, 또는
(b) FITC 항체에 의한 검출
[발명 9]
검출 올리고뉴클레오티드가, 인간 게놈 중의 반복 배열, 중복 유전자 또는 위(僞)유전자의 염기 배열 혹은 그 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 염기 배열로 이루어지는 발명 1∼8 중 어느 하나에 기재된 방법.
[발명 10]
인간 게놈 중의 반복 배열이 LINE 또는 SINE인 발명 9에 기재된 방법.
[발명 11]
검출 올리고뉴클레오티드가, 이하에 나타내어지는 어느 하나의 염기 배열과 상보적으로 결합할 수 있는 염기 배열로 이루어지는 발명 1∼10 중 어느 하나에 기재된 방법.
(1) 배열 번호 37로 표시되는 염기 배열 또는 그것과 80% 이상의 배열 동일성을 갖는 염기 배열,
(2) 배열 번호 37로 표시되는 염기 배열의 상보 배열 또는 그것과 80% 이상의 배열 동일성을 갖는 염기 배열,
(3) 배열 번호 39로 표시되는 염기 배열 또는 그것과 80% 이상의 배열 동일성을 갖는 염기 배열, 또는
(4) 배열 번호 39로 표시되는 염기 배열의 상보 배열 또는 그것과 80% 이상의 배열 동일성을 갖는 염기 배열
[발명 12]
검출 올리고뉴클레오티드가, 이하에 나타내어지는 어느 하나의 염기 배열로 이루어지는 발명 1∼10 중 어느 하나에 기재된 방법.
(1) 배열 번호 38로 표시되는 염기 배열 또는 그것과 80% 이상의 배열 동일성을 갖는 염기 배열,
(2) 배열 번호 38로 표시되는 염기 배열의 상보 배열 또는 그것과 80% 이상의 배열 동일성을 갖는 염기 배열,
(3) 배열 번호 40으로 표시되는 염기 배열 또는 그것과 80% 이상의 배열 동일성을 갖는 염기 배열, 또는
(4) 배열 번호 40으로 표시되는 염기 배열의 상보 배열 또는 그것과 80% 이상의 배열 동일성을 갖는 염기 배열
[발명 13]
제1 공정에서 검체로부터 DNA를 조제하기 위한 DNA 추출 조작에 있어서 이용되는 용액 중의 나트륨염의 농도가, 100mM 이상 1000mM 이하인 발명 1∼12 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[발명 14]
제1 공정에서 검체로부터 DNA를 조제하기 위한 DNA 추출 조작에 있어서 이용되는 용액 중의 나트륨염의 농도가, 100mM 이상 200mM 이하인 발명 1∼12 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[발명 15]
암 환자 유래의 검체를 선발하는 방법이며, 발명 1∼14 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 피험자 유래의 검체를 이용하여 정량 또는 검출된 DNA의 정량 결과 또는 검출 결과와, 그 방법에 의해 정상자 유래의 검체를 이용하여 정량 또는 검출된 DNA의 정량 결과 또는 검출 결과의 차이가 유의하면, 피험자 유래의 검체를 암 환자 유래의 검체로서 평가하고, 당해 평가의 결과에 의거하여 암 환자 유래의 검체를 특정하는 공정을 포함하는, 방법.
[발명 16]
검체가 포유동물 유래의 혈청인 발명 15에 기재된 방법.
[발명 17]
목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA가, 포유동물 유래의 혈청 중의 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 유리(遊離) DNA인 발명 15∼16 중 어느 한 항에 기재된 방법.
; 등을 제공하는 것이다.
도 1은, 실시예 1에 있어서, 비오틴 표식 메틸사이토신 항체 0.5μg/mL 및 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F1을 이용하여 실시한 결과를 도시한 도면이다. 오른쪽에서부터 순서대로, 용액 A(10ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 B(1ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.1ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0ng/10μL TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액))의 각각에 대해, DNA량을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 2는, 실시예 2에 있어서, 비오틴 표식 메틸사이토신 항체 0.5μg/mL 및 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F1을 이용하여 실시한 결과를 도시한 도면이다. 오른쪽에서부터 순서대로, 용액 MA(10ng each/20μL TE 버퍼 용액), 용액 MB(1ng each/20μL TE 버퍼 용액), 용액 MC(0.1ng each/20μL TE 버퍼 용액), 용액 MD(0ng each/20μL TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액))의 각각에 대해, DNA량을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 3은, 실시예 3에 있어서, 비오틴 표식 메틸사이토신 항체 0.5μg/mL 및 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F2를 이용하여 실시한 결과를 도시한 도면이다. 오른쪽에서부터 순서대로, 용액 MA(10ng each/20μL TE 버퍼 용액), 용액 MB(1ng each/20μL TE 버퍼 용액), 용액 MC(0.1ng each/20μL TE 버퍼 용액), 용액 MD(0ng each/20μL TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액))의 각각에 대해, DNA량을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 4는, 실시예 4에 있어서, 비오틴 표식 메틸사이토신 항체 0.5μg/mL 및 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F1 및 F2를 이용하여 실시한 결과를 도시한 도면이다. 오른쪽에서부터 순서대로, 용액 MA(10ng each/20μL TE 버퍼 용액), 용액 MB(1ng each/20μL TE 버퍼 용액), 용액 MC(0.1ng each/20μL TE 버퍼 용액), 용액 MD(0ng each/20μL TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액))의 각각에 대해, DNA량을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 5는, 실시예 5에 있어서, 비오틴 표식 메틸사이토신 항체 0.5μg/mL 및 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F3을 이용하여 실시한 결과를 도시한 도면이다. 오른쪽에서부터 순서대로, 용액 A(10ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 B(1ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.1ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0ng/10μL TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액))의 각각에 대해, DNA량을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 6은, 실시예 6에 있어서, 비오틴 표식 메틸사이토신 항체 0.5μg/mL 및 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F3을 이용하여 실시한 결과를 도시한 도면이다. 오른쪽에서부터 순서대로, 용액 MA(10ng each/20μL TE 버퍼 용액), 용액 MB(1ng each/20μL TE 버퍼 용액), 용액 MC(0ng each/20μL TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액))의 각각에 대해, DNA량을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 7은, 실시예 7에 있어서, 비오틴 표식 메틸사이토신 항체 0.5μg/mL 및 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F3 및 F4를 이용하여 실시한 결과를 도시한 도면이다. 오른쪽에서부터 순서대로, 용액 MA(10ng each/20μL TE 버퍼 용액), 용액 MB(1ng each/20μL TE 버퍼 용액), 용액 MC(0ng each/20μL TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액))의 각각에 대해, DNA량을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 8은, 실시예 8에 있어서, 비오틴 표식 메틸사이토신 항체 0.5μg/mL 및 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F5를 이용하여 실시한 결과를 도시한 도면이다. 오른쪽에서부터 순서대로, 용액 A(100ng/5μL TE 버퍼 용액), 용액 B(10ng/5μL TE 버퍼 용액), 용액 C(1ng/5μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0ng/5μL TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액))의 각각에 대해, DNA량을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 9는, 실시예 9에 있어서, 비오틴 표식 메틸사이토신 항체 0.5μg/mL 및 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F6을 이용하여 실시한 결과를 도시한 도면이다. 오른쪽에서부터 순서대로, 용액 A(100ng/5μL TE 버퍼 용액), 용액 B(10ng/5μL TE 버퍼 용액), 용액 C(1ng/5μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0ng/5μL TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액))의 각각에 대해, DNA량을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 10은, 실시예 10에 있어서, 비오틴 표식 메틸사이토신 항체 0.5μg/mL 및 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F3을 이용하여 실시한 결과를 도시한 도면이다. 오른쪽에서부터 순서대로, 용액 A(10ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 B(1ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.1ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0ng/10μL TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액))의 각각에 대해, DNA량을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 11은, 실시예 11에 있어서, 비오틴 표식 메틸사이토신 항체 0.5μg/mL 및 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F3을 이용하여 실시한 결과를 도시한 도면이다. 오른쪽에서부터 순서대로, 용액 MA(10ng each/20μL TE 버퍼 용액), 용액 MB(1ng each/20μL TE 버퍼 용액), 용액 MC(0ng each/20μL TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액))의 각각에 대해, DNA량을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 12는, 실시예 12에 있어서, 비오틴 표식 메틸사이토신 항체 0.5μg/mL 및 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F4를 이용하여 실시한 결과를 도시한 도면이다. 오른쪽에서부터 순서대로, 용액 MA(10ng each/20μL TE 버퍼 용액), 용액 MB(1ng each/20μL TE 버퍼 용액), 용액 MC(0ng each/20μL TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액))의 각각에 대해, DNA량을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 13은, 실시예 13에 있어서, 비오틴 표식 메틸사이토신 항체 0.5μg/mL 및 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F3 및 F4를 이용하여 실시한 결과를 도시한 도면이다. 오른쪽에서부터 순서대로, 용액 MA(10ng each/20μL TE 버퍼 용액), 용액 MB(1ng each/20μL TE 버퍼 용액), 용액 MC(0ng each/20μL TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액))의 각각에 대해, DNA량을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 14는, 실시예 14에 있어서, 비오틴 표식 메틸사이토신 항체 0.5μg/mL 및 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F5를 이용하여 실시한 결과를 도시한 도면이다. 오른쪽에서부터 순서대로, 용액 A(100ng/5μL TE 버퍼 용액), 용액 B(10ng/5μL TE 버퍼 용액), 용액 C(1ng/5μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0ng/5μL TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액))의 각각에 대해, DNA량을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 15는, 실시예 15에 있어서, 비오틴 표식 메틸사이토신 항체 0.5μg/mL 및 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F6을 이용하여 실시한 결과를 도시한 도면이다. 오른쪽에서부터 순서대로, 용액 A(100ng/5μL TE 버퍼 용액), 용액 B(10ng/5μL TE 버퍼 용액), 용액 C(1ng/5μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0ng/5μL TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액))의 각각에 대해, DNA량을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 16은, 실시예 16에 있어서, 처리 1을 행하여, 비오틴 표식 메틸사이토신 항체 및 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F6을 이용하여 DNA의 검출을 실시한 결과를 도시한 도면이다. 오른쪽에서부터 순서대로, 용액 A(10ng/10μL 래트 혈청 용액), 용액 B(1ng/10μL 래트 혈청 용액), 용액 C(0.1ng/10μL 래트 혈청 용액), 용액 D(래트 혈청(네거티브 컨트롤액))의 각각에 대해, 흡광도(450nm)를 측정한 값을 나타내고 있다.
도 17은, 실시예 16에 있어서, 처리 2를 행하여, 비오틴 표식 메틸사이토신 항체 및 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F6을 이용하여 DNA의 검출을 실시한 결과를 도시한 도면이다. 오른쪽에서부터 순서대로, 용액 A(10ng/10μL 래트 혈청 용액), 용액 B(1ng/10μL 래트 혈청 용액), 용액 C(0.1ng/10μL 래트 혈청 용액), 용액 D(래트 혈청(네거티브 컨트롤액))의 각각에 대해, 흡광도(450nm)를 측정한 값을 나타내고 있다.
도 18은, 실시예 17에 있어서, 비오틴 표식 메틸사이토신 항체 및 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F6을 이용하여 DNA의 검출을 실시한 결과를 도시한 도면이다. 오른쪽에서부터 순서대로, 용액 A(4ng/40μL 인간 혈청 용액), 용액 B(2ng/40μL 인간 혈청 용액), 용액 C(1ng/40μL 인간 혈청 용액), 용액 D(인간 혈청(네거티브 컨트롤액))의 각각에 대해, 흡광도(450nm)를 측정한 값을 나타내고 있다.
도 19는, 실시예 18에 있어서, 비오틴 표식 메틸사이토신 항체 및 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F6을 이용하여 검출한 결과와, 실시간 PCR에 의해 정량한 결과를 비교한 도면이다. 도면 중, 검출 결과를 세로축에, 실시간 PCR에 의한 정량 결과를 가로축에 취하여 플롯하였다. 또 그래프 중의 직선은 회귀 직선(굵은 선) 및 표준 오차 범위(가는 선)를 나타내고 있다.
도 20은, 실시예 18에 있어서, 57세 이하의 인간 혈청 샘플에 대해, 비오틴 표식 메틸사이토신 항체 및 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F6을 이용하여 DNA를 검출한 결과를, 암 환자와 정상자으로 나누어 플롯한 것이며, 각각에 대해 평균치 및 표준 편차를 나타내고 있다.
본 발명 방법에 있어서의 「검체」로서는, (a) 포유동물 유래의 혈액, 체액, 분뇨, 체분비물, 세포 용해액 또는 조직 용해액, (b) 포유동물 유래의 혈액, 체액, 분뇨, 체분비물, 세포 용해액 및 조직 용해액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나에서 추출된 DNA, (c) 포유동물 유래의 조직, 세포, 조직 용해액 및 세포 용해액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나에서 추출된 RNA를 주형으로 하여 제작된 DNA, (e) 세균, 진균 또는 바이러스로부터 추출된 DNA, (f) 세균, 진균 또는 바이러스로부터 추출된 RNA를 주형으로 하여 제작된 DNA 등을 들 수 있다. 상기 조직이란, 혈액, 림프절 등을 포함하는 광의의 의미이다.
「포유동물」이란, 동물계 척삭동물문 척추동물아문 포유강(Mammalia)으로 분류되는 동물이며, 구체적으로는, 인간, 원숭이, 마모셋, 마멋, 래트, 마우스, 소, 양, 개, 고양이 등을 들 수 있다.
「체액」이란, 개체를 구성하는 세포간에 존재하는 액체이며, 구체적으로는 형장과 간질액을 들 수 있으며, 보통의 경우, 개체의 항상성의 유지 기능을 달성한다. 보다 구체적으로는, 림프액, 조직액(조직간액, 세포간액, 간질액), 체강액, 장막강액, 흉수, 복수, 심낭액, 뇌척수액(수액), 관절액(활액), 안방수(방수), 뇌척수액, 등을 들 수 있다.
「체분비물」이란, 외분비선으로부터의 분비액이며, 구체적으로는, 타액, 위액, 담즙, 췌액, 장액, 땀, 눈물, 콧물, 정액, 질액, 양수, 젖 등을 들 수 있다.
검체가 인간의 혈액, 체액 또는 체분비물 등인 경우에는, 인간의 정기 건강 진단에 있어서의 임상 검사용으로 채취된 시료를 이용할 수 있다.
「세포 용해액」으로서는, 세포 배양용의 플레이트 등에서 배양된 세포, 예를 들면, 세포주나 초대 배양 세포, 또는 혈구 세포 등을 파쇄함으로써 얻어지는 세포내 액을 포함하는 용해액을 들 수 있다. 세포를 파쇄하는 방법으로서는, 초음파에 의한 방법, 계면활성제를 이용하는 방법, 알칼리 용액을 이용하는 방법 등을 들 수 있다. 세포를 용해하기 위해서는, 시판의 키트 등을 이용해도 된다.
예를 들면, 10cm 플레이트에서 컨플루언트(confluent)가 될 때까지 세포를 배양한 후, 배양액을 버리고, 0.6mL의 RIPA 버퍼(1x TBS, 1% nonidet P-40, 0.5% sodium deoxysholate, 0.1% SDS, 0.004% sodium azide)를 당해 플레이트에 더한다. 4℃로 15분간 플레이트를 천천히 흔들어 요동시킨 후, 당해 플레이트 상의 접착 세포를 스크레이퍼 등을 이용하여 벗겨내고, 당해 플레이트 상의 액을 마이크로 튜브로 옮긴다. 당해 액의 1/10 용량의 10mg/mL PMSF를 첨가한 후, 당해 튜브를 얼음 위에서 30∼60분간 방치한 후, 4℃로 10분간, 10,000xg로 원심하여, 상청을 세포 용해액으로서 취득한다.
「조직 용해액」으로서는, 포유동물 등의 동물로부터 채취한 조직 중의 세포를 파괴함으로써 취득되는, 세포내 액을 포함하는 용해액을 들 수 있다.
구체적으로는, 동물로부터 최득된 조직의 중량을 측정한 후, 면도기 등을 이용하여 당해 조직을 소편(小片)으로 재단한다. 동결 조직을 사용하는 경우는, 더욱 작은 소편으로 할 필요가 있다. 재단 후, 빙냉 RIPA 버퍼를 조직 1g당 3mL의 비율로 첨가하고, 4℃로 균질화(homogenize)한다. 여기에서, RIPA 퍼버에는, 프로테아제 인히비터, 포스파타아제 인히비터 등을 첨가해도 되며, 예를 들면, RIPA 버퍼의 1/10 용량의 10mg/mL PMSF를 첨가해도 된다. 균질화에는, 초음파 분쇄기(sonicator)나 가압형 세포 파쇄 장치를 이용한다. 균질화의 작업에서는, 균질화액을 항상 4℃로 유지하고, 발열을 억제하도록 한다. 균질화액을, 마이크로 튜브로 옮기고, 4℃로 10분간, 10,000xg로 원심하여, 상청을 조직 용해액으로서 취득한다.
본 발명 방법에 있어서의 「검체」로서는, 예를 들면 식품, 하천, 토양, 혹은 일반 시판 제품으로부터 채취된 시료나 표면 부착물 등을 들 수도 있으며, 진균, 세균, 바이러스 등의 미생물이나 이들의 핵산이 포함될 수 있다.
검체로서 사용되는 DNA로서는, 상기 생체 시료나 상기 미생물로부터 추출하여 얻어진 게놈 DNA, 게놈 DNA 유래의 DNA 단편(fragment), 혹은 RNA 등을 들 수 있다. 게놈 DNA를 포유동물 유래의 시료로부터 얻기 위해서는, 예를 들면 시판의 DNA 추출용 키트 등을 이용할 수 있다. 또, RNA로부터 DNA를 얻기 위해서는, 시판의 cDNA 제작 키트 등의 역전사 효소를 이용할 수 있다. 또, 검체로서는, 인공적으로 합성된 DNA여도 된다.
본 발명 방법에 있어서의 「목적으로 하는 DNA 영역」(이하, 목적 영역이라고 기재하는 경우도 있다)이란, 검체 중에 포함되는 DNA 중, 본 발명 방법에 의해 검출 또는 정량하고 싶은 DNA 영역이다. 목적으로 하는 DNA 영역은, 검체가 DNA인 경우에는, DNA 상의 염기 배열로 표시된다. 검체가 RNA인 경우에는, 목적으로 하는 DNA 영역은, RNA로부터 역전사 효소에 의해 제작된 DNA 상의 염기 배열로 표시되며, RNA 상의 검출 대상이 되는 소정의 염기 배열의 상보적 염기 배열이다. 본 발명 방법에 있어서, 사이토신을 메틸화하여 검출 또는 정량하는 경우에는, 목적 영역은 사이토신 혹은 후술의 CpG가 풍부한 영역을 포함하는 것이 바람직하다.
제1 공정은, 목적으로 하는 DNA 영역을 검출하고자 하는 DNA를 검체 중으로부터 조제하는 공정이다.
제1 공정에서 조제되는 DNA로서는, 예를 들면, 당해 DNA가 갖는 목적으로 하는 DNA 영역을 인식 절단 부위로 하지 않는 제한 효소로 미리 소화 처리된 DNA 시료, 미리 정제된 DNA 시료, 혈액 중의 유리 DNA, 미생물 게놈 유래의 DNA, 및 검체 중의 RNA로부터 역전사 효소에 의해 제작된 DNA 등을 들 수 있다. 제1 공정에서 조제되는 DNA로서는, 예를 들면 검체의 유전자 정보에 의거하여 설계되어 인공적으로 합성된 DNA를 들 수도 있다.
혈액을 검체로서 이용하는 경우에는, 혈액으로부터 통상의 방법에 준하여 혈장 또는 혈청을 조제하고, 조제된 혈장 또는 혈청을 검체로 하여, 그 중에 포함되는 유리 DNA(위암 세포 등의 암 세포 유래의 DNA가 포함된다)를 분석하면, 혈구 유래의 DNA를 피하여 위암 세포 등의 암 세포 유래의 DNA를 해석할 수 있으며, 위암 세포 등의 암 세포, 그것을 포함하는 조직 등을 검출하는 감도를 향상시킬 수 있다.
제1 공정에서 조제되는 DNA로서는, 그램 양성균, 그램 음성균 등의 세균, 진균, 바이러스, 병원성 원충 등의 미생물 등 유래의 DNA나, 그 미생물 등 유래의 RNA로부터 역전사 효소에 의해 취득한 DNA를 들 수 있다. 예를 들면, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma pneumoniae, Borrelia burgdorferi B31, Rickettsia prowazekii, Treponema pallidum, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Helicobacter pylori J99, Helicobacter pylori 26695, Haemophilus influenzae Rd, Mycobacterium tuberculosis H37Rv, Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Serratia marcescens, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella enterica, Campylobacter jejuni subsp. Jejuni, Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus, Bacillusu cereus, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberuculosis, Trichophyton ruburum, Trichophyton mentagrophytes, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Pneumocystis carinii, Coccidioides immitis, Cytomegalovirus, human herpesvirus 5, Epstein-Barr virus, Human Immunodeficiency Virus, Human Papilloma Virus, Enterovirus, Norovirus Influenza Virus, Toxoplasma gondii, Cryptosporidium parvum, Entamoeba histolytica의 게놈 DNA 혹은 RNA로부터 역전사 효소에 의해 제작된 DNA는, 검체 중의 감염증 원인균, 혹은 식품 중의 식중독 원인균 등의 검출에 이용할 수 있다.
게놈 DNA를 조제하기 위해서는, 예를 들면, 검체가 포유동물 유래의 시료인 경우는, 시판의 DNA 추출용 키트(Genfind v2 Kit(Backman·Coulter사제), FastPure DNA Kit(다카라 바이오 주식회사제)) 등을 이용할 수 있다.
검체가 진균 등의 미생물인 경우, Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory Press)에 기재되어 있는 바와 같은 일반적인 효모 게놈의 조제법 등으로 게놈 DNA를 조제할 수 있으며, 검체가 대장균과 같은 원핵 생물인 경우, Molecular Cloning-A Laboratory Manual-(Cold Spring Harbor Laboratory Press)에 기재되어 있는 바와 같은 일반적인 미생물 게놈 조제법 등을 이용할 수 있다.
또, 검체가 식품 시료인 경우, 식품으로부터 미생물 등을 분리한 후 DNA를 조제해도 되며, 식품에 포함되는 미생물 이외의 게놈 DNA와 미생물 유래의 게놈을 동시에 취득해도 된다. 또, 검체가 포유동물 유래의 조직이며, 목적으로 하는 DNA 영역이 바이러스 유래의 DNA인 경우는, 조직 중으로부터 시판의 RNA 추출용 키트(ISOGEN(311-02501)(NIPPON GENE사제), 혹은, FastRNA Pro Green Kit(후나코시사제), FastRNA Pro Blue Kit(후나코시사제), FastRNA Pro Red Kit(후나코시사제), 등) 등을 이용해 RNA를 추출하여, 역전사 효소에 의해 DNA를 취득해도 된다. 또, 검체가 포유동물 유래의 검체인 경우, 바이러스 입자를 추출한 후 바이러스의 DNA를 추출해도 되며, 혹은 바이러스 입자를 추출한 후 시판의 키트(QuickGene RNA tissue kit SⅠⅠ, 후지필름사제) 등을 이용해 바이러스 RNA를 추출하여, 역전사 효소에 의해 바이러스 유래의 DNA를 취득해도 된다. 바이러스가 감염된 조직으로부터 RNA를 추출하여 역전사 효소에 의해 바이러스 유래의 DNA를 취득해도 되며, 바이러스가 감염된 조직으로부터 DNA를 취득하여, 바이러스 유래의 DNA를 취득해도 된다. 또한, RNA로부터 역전사 효소에 의해 DNA를 취득하는 경우에는, 시판의 키트(트랜스크립터 Hi-Fi cDNA 합성 키트, Roche diagnostics사제) 등을 이용해도 된다.
「메틸화 DNA」에서는, 유전자(게놈 DNA)를 구성하는 4종류의 염기 중 어느 하나가 메틸화되어 있다. 예를 들면, 포유동물에서는, 5'-CG-3'로 표시되는 염기 배열(C는 사이토신을 나타내고, G는 구아닌을 나타낸다. 이하, 이 염기 배열을 「CpG」라고 기재하는 경우도 있다) 중의 사이토신만이 메틸화되는 현상이 알려져 있다. 사이토신의 메틸화 부위는 5위이다. 세포 분열에 앞선 DNA 복제 시에 신생 이중 사슬 DNA에서는, 친세포 유래의 주형 사슬 중의 「CpG」 중의 사이토신만이 메틸화된 상태이지만, 메틸기 전이 효소의 작용에 의해 즉석에서 신생된 DNA 사슬 중의 「CpG」 중의 사이토신도 메틸화된다. 이 사이토신 메틸화는, 친세포 유래의 DNA 사슬 중의 메틸화된 사이토신을 포함하는 CpG와 상보적으로 결합하는 신생 DNA 사슬의 CpG의 사이토신을 메틸화한다. 따라서, 친세포의 DNA의 메틸화 상태는, DNA 복제 후의, 새로운 2세트의 DNA에 그대로 이어지게 된다. 「CpG쌍」이란, CpG로 표시되는 염기 배열과, 이것에 상보하는 CpG가 결합되어 이루어지는 이중 사슬 DNA를 의미하는 것이다.
「단일 사슬 메틸화 DNA」란, 단일 사슬 DNA의 염기 배열 중의 5'-CG-3'로 표시되는 염기 배열 중의 사이토신의 5위가 메틸화된 단일 사슬 DNA이다.
「목적으로 하는 DNA 영역」으로서는, 예를 들면, Lysyl oxidase, HRAS-like suppressor, bA305P22.2.1, Gamma filamin, HAND1, Homologue of RIKEN 2210016F16, FLJ32130, PPARG angiopoietin-related protein, Thrombomodulin, P53-responsive gene 2, Fibrillin2, Neurofilament3, disintegrin and metalloproteinase domain 23, G protein-coupled receptor 7, G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor, Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2 등의 유용 단백질 유전자의 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역) 등을 들 수 있으며, 이들 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 1개 이상 포함하는 DNA 영역을 바람직하게 들 수 있다. 본 발명 방법에 있어서, 「목적으로 하는 DNA 영역」의 메틸화된 DNA를 개개로 검출 또는 정량해도 되지만, 예를 들면, 1개의 검출계에 있어서, 보다 많은 「목적으로 하는 DNA 영역」의 메틸화된 DNA를 검출하면, 그 만큼 정량 정밀도 및 검출 감도가 향상된다.
구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 Lysyl oxidase 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 Lysyl oxidase 유전자의 엑손(exon) 1과, 그 5' 상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있으며, 보다 구체적으로는, 배열 번호 1로 표시되는 염기 배열(Genbank Accession No.AF270645에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 16001∼18661로 표시되는 염기 배열에 상당한다)을 들 수 있다. 배열 번호 1로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 Lysyl oxidase 단백질의 아미노 말단의 메티오닌을 코딩하는 ATG 코돈(codon)이 염기 번호 2031∼2033으로 표시되어 있으며, 상기 엑손 1의 염기 배열은 염기 번호 1957∼2661로 표시되어 있다.
또 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 HRAS-like suppressor 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 HRAS-like suppressor 유전자의 엑손 1과, 그 5' 상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있으며, 보다 구체적으로는, 배열 번호 2로 표시되는 염기 배열(Genbank Accession No.AC068162에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 172001∼173953으로 표시되는 염기 배열에 상당한다)을 들 수 있다. 배열 번호 2로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 HRAS-like suppressor 유전자의 엑손 1의 염기 배열은, 염기 번호 1743∼1953으로 표시되어 있다.
또 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 bA305P22.2.1 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 bA305P22.2.1 유전자의 엑손 1과, 그 5' 상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있으며, 보다 구체적으로는, 배열 번호 3으로 표시되는 염기 배열(Genbank Accession No.AL121673에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 13001∼13889로 표시되는 염기 배열에 상당한다)을 들 수 있다. 배열 번호 3으로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 bA305P22.2.1 단백질의 아미노 말단의 메티오닌을 코딩하는 ATG 코돈이 염기 번호 849∼851로 표시되어 있으며, 상기 엑손 1의 염기 배열은 염기 번호 663∼889로 표시되어 있다.
또 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 Gamma filamin 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 Gamma filamin 유전자의 엑손 1과, 그 5' 상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있으며, 보다 구체적으로는, 배열 번호 4로 표시되는 염기 배열(Genbank Accession No.AC074373에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 63528∼64390으로 표시되는 염기 배열의 상보적 배열에 상당한다)을 들 수 있다. 배열 번호 4로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 Gamma filamin 단백질의 아미노 말단의 메티오닌을 코딩하는 ATG 코돈이 염기 번호 572∼574로 표시되어 있으며, 상기 엑손 1의 염기 배열은 염기 번호 463∼863으로 표시되어 있다.
또 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 HAND1 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 HAND1 유전자의 엑손 1과, 그 5' 상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있으며, 보다 구체적으로는, 배열 번호 5로 표시되는 염기 배열(Genbank Accession No.AC026688에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 24303∼26500으로 표시되는 염기 배열의 상보적 배열에 상당한다)을 들 수 있다. 배열 번호 5로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 HAND1 단백질의 아미노 말단의 메티오닌을 코딩하는 ATG 코돈이 염기 번호 1656∼1658로 표시되어 있으며, 상기 엑손 1의 염기 배열은 염기 번호 1400∼2198로 표시되어 있다.
또 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 Homologue of RIKEN 2210016F16 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 Homologue of RIKEN 2210016F16 유전자의 엑손 1과, 그 5' 상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있으며, 보다 구체적으로는, 배열 번호 6으로 표시되는 염기 배열(Genbank Accession No.AL354733에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 157056∼159000으로 표시되는 염기 배열의 상보적 염기 배열에 상당한다)을 들 수 있다. 배열 번호 6으로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 Homologue of RIKEN 2210016F16 단백질의 엑손 1의 염기 배열은 염기 번호 1392∼1945로 표시되어 있다.
또 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 FLJ32130 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 FLJ32130 유전자의 엑손 1과, 그 5' 상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있으며, 보다 구체적으로는, 배열 번호 7로 표시되는 염기 배열(Genbank Accession No.AC002310에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 1∼2379로 표시되는 염기 배열의 상보적 염기 배열에 상당한다)을 들 수 있다. 배열 번호 7로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 FLJ32130 단백질의 아미노산 말단의 메티오닌을 코딩하는 ATG 코돈이 염기 번호 2136∼2138로 표시되어 있으며, 상기 엑손 1로 생각되는 염기 배열은 염기 번호 2136∼2379로 표시되어 있다.
또 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 PPARG angiopoietin-related protein 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 PPARG angiopoietin-related protein 유전자의 엑손 1과, 그 5' 상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있으며, 보다 구체적으로는, 배열 번호 8로 표시되는 염기 배열을 들 수 있다. 배열 번호 8로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 PPARG angiopoietin-related protein 단백질의 아미노 말단의 메티오닌을 코딩하는 ATG 코돈이 염기 번호 717∼719로 표시되어 있으며, 상기 엑손 1의 5'측 부분의 염기 배열은 염기 번호 1957∼2661로 표시되어 있다.
또 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 Thrombomodulin 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 Thrombomodulin 유전자의 엑손 1과, 그 5' 상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있으며, 보다 구체적으로는, 배열 번호 9로 표시되는 염기 배열(Genbank Accession No.AF495471에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 1∼6096으로 표시되는 염기 배열에 상당한다)을 들 수 있다. 배열 번호 9로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 Thrombomodulin 단백질의 아미노 말단의 메티오닌을 코딩하는 ATG 코돈이 염기 번호 2590∼2592로 표시되어 있으며, 상기 엑손 1의 염기 배열은 염기 번호 2048∼6096으로 표시되어 있다.
또 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 p53-responsive gene 2 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 p53-responsive gene 2 유전자의 엑손 1과, 그 5' 상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있으며, 보다 구체적으로는, 배열 번호 10으로 표시되는 염기 배열(Genbank Accession No.AC009471에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 113501∼116000으로 표시되는 염기 배열의 상보적 배열에 상당한다)을 들 수 있다. 배열 번호 10으로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 p53-responsive gene 2 유전자의 엑손 1의 염기 배열은 염기 번호 1558∼1808로 표시되어 있다.
또 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 Fibrillin2 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 Fibrillin2 유전자의 엑손 1과, 그 5' 상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있으며, 보다 구체적으로는, 배열 번호 11로 표시되는 염기 배열(Genbank Accession No.AC113387에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 118801∼121000으로 표시되는 염기 배열의 상보적 배열에 상당한다)을 들 수 있다. 배열 번호 11로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 Fibrillin2 유전자의 엑손 1의 염기 배열은 염기 번호 1091∼1345로 표시되어 있다.
또 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 Neurofilament3 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 Neurofilament3 유전자의 엑손 1과, 그 5' 상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있으며, 보다 구체적으로는, 배열 번호 12로 표시되는 염기 배열(Genbank Accession No.AF106564에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 28001∼30000으로 표시되는 염기 배열의 상보적 배열에 상당한다)을 들 수 있다. 배열 번호 12로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 Neurofilament3 유전자의 엑손 1의 염기 배열은 염기 번호 614∼1694로 표시되어 있다.
또 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 disintegrin and metalloproteinase domain 23 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 disintegrin and metalloproteinase domain 23 유전자의 엑손 1과, 그 5' 상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있으며, 보다 구체적으로는, 배열 번호 13으로 표시되는 염기 배열(Genbank Accession No.AC009225에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 21001∼23300으로 표시되는 염기 배열에 상당한다)을 들 수 있다. 배열 번호 13으로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 disintegrin and metalloproteinase domain 23 유전자의 엑손 1의 염기 배열은 염기 번호 1194∼1630으로 표시되어 있다.
또 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 G protein-coupled receptor 7 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 G protein-coupled receptor 7 유전자의 엑손 1과, 그 5' 상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있으며, 보다 구체적으로는, 배열 번호 14로 표시되는 염기 배열(Genbank Accession No.AC009800에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 75001∼78000으로 표시되는 염기 배열에 상당한다)을 들 수 있다. 배열 번호 14로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 G protein-coupled receptor 7 유전자의 엑손 1의 염기 배열은 염기 번호 1666∼2652로 표시되어 있다.
또 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역의 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor 유전자의 엑손 1과, 그 5' 상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있으며, 보다 구체적으로는, 배열 번호 15로 표시되는 염기 배열(Genbank Accession No.AC008971에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 57001∼60000으로 표시되는 염기 배열의 상보적 배열에 상당한다)을 들 수 있다. 배열 번호 15로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor 유전자의 엑손 1의 염기 배열은 염기 번호 776∼2632로 표시되어 있다.
또 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG를 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2 유전자의 엑손 1과, 그 5' 상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있으며, 보다 구체적으로는, 배열 번호 16으로 표시되는 염기 배열(Genbank Accession No.AC026802에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 78801∼81000으로 표시되는 염기 배열의 상보적 배열에 상당한다)을 들 수 있다. 배열 번호 16으로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2 유전자의 엑손 1의 염기 배열은 염기 번호 1479∼1804로 표시되어 있다.
제2 공정은, 제1 공정에서 조제된 DNA를 DNA 메틸화 효소로 처리하는 공정이다.
「DNA 메틸화 효소」란, DNA 중의 염기를 메틸화하는 효소이며, 포유동물 세포, 세균 등으로부터, 다종의 DNA 메틸화 효소가 단리(單離)되어 있다. DNA 메틸화 효소는, 기질의 염기의 종류로부터, 아데닌메틸화 효소, 사이토신메틸화 효소 등, 복수 종류로 분류된다. 사이토신메틸화 효소는, DNA 염기 배열 중의 특정한 배열을 인식하고, 그 배열 근처의 사이토신을 메틸화하는 효소이며, 인식하는 염기 배열에 따라 상이한 사이토신메틸화 효소가 알려져 있다.
DNA 메틸화 효소가 촉매하는 DNA의 메틸화 반응은, 제한 수식계라고 불리는 원시적인 면역계로부터 다수 발견되고 있다. 제한 수식계란, 세균으로 기능하는 게놈 전체를 정기적으로 메틸화함으로써, 특정한 배열을 인식하는 제한 효소(제한 엔도뉴클레아제)에 의해 소화되지 않도록 한 다음, 외래 DNA(특히 박테리오파지)를 제한 효소에 의해 소화하는 기능으로, 박테리오파지 감염으로부터 미생물 게놈을 방어하는 시스템이다. 게놈의 메틸화에 기능하고 있는 효소는, 사이토신 또는 아데닌을 메틸화하고, 많게는 푸린 잔기의 6위의 질소(N6), 혹은 5위의 탄소(C5)를 메틸화하는 것이 알려져 있다. 이러한 효소 중, 사이토신의 C5를 메틸화하는 사이토신메틸화 효소로서는, SssI(M.SssI) 메틸라아제, AluI 메틸라아제, HpaI 메틸라아제, HpaII 메틸라아제, MspI 메틸라아제, HaeIII 메틸라아제 등이 알려져 있다. 또, 이들 사이토신의 C5위를 메틸화하는 효소는 인식하는 염기 배열이 상이하며, CpG를 인식하는 사이토신메틸화 효소는 SssI뿐이다.
인간 게놈 중의 DNA의 메틸화 반응으로서는, 후성 유전학(Epigenetics)(유전자 배열에 상관없는 유전자 발현의 다양성을 산출하는 구조)으로서, CpG의 사이토신의 5위(C5)의 메틸화가 알려져 있으며, 이러한 사이토신메틸화 효소로서 DNA 메틸트랜스퍼라제가 알려져 있다. DNA 메틸트랜스퍼라제로서는, DnmtI 메틸트랜스퍼라제가 알려져 있다.
인간 세포 중에서는 CpG 배열의 사이토신의 C5위가 메틸화되어 있으므로, 인위적으로 게놈을 메틸화하는 경우에는, SssI를 이용함으로써, 인간 세포 내에서의 메틸화와 동일한 배열(CpG)의, 동일한 사이토신의, 동일한 위치를 메틸화하는 것이 가능해진다.
사이토신메틸화 효소에 의해 DNA를 메틸화하기 위해서는, 구체적으로는 예를 들면, DNA 시료에, 최적인 10×완충액(NEBuffer2(NEB사제))을 5μL, S-adenosyl methionine(3.2mM, NEB사제)을 0.5μl, 사이토신메틸화 효소 SssI(NEB사제)를 각각 0.5μL 더하고, 다음에 그 혼합물에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μL로 하여, 37℃로 30분간 인큐베이션한다. 제2 공정에 있어서의 메틸화는, 목적으로 하는 DNA 영역을 메틸화 DNA 항체에 결합시킴으로써, 지지체에 결합하기 위해 실시하므로, 추출한 DNA 시료의 목적으로 하는 DNA 영역이 메틸화되어 있으면, 반드시 제2 공정을 실시할 필요는 없다.
제2 공정에 있어서, DNA 메틸화 효소에 의해 수식된 메틸화 DNA를 구성하는 메틸화 염기가, 후술의 검출 올리고뉴클레오티드가 갖는 메틸화 염기와 상이한 경우, 그 검출 올리고뉴클레오티드 상의 메틸화 염기는 식별 기능으로서 이용할 수 있다. 예를 들면, 검출 올리고뉴클레오티드가 6-메틸아데닌이며, 제2 공정에서 사이토신이 5-메틸사이토신에 수식할 수 있으면, 검출 올리고뉴클레오티드의 식별 기능으로서 6-메틸아데닌 항체를 이용하고, 지지체로의 고정은 메틸사이토신 항체를 이용할 수 있다. 구체적으로는, 제2 공정에서 SssI 메틸라아제로 수식한 경우, 지지체로의 고정은 메틸사이토신 항체를 이용할 수 있다. 즉, 검출 올리고뉴클레오티드가 메틸아데닌을 가지고 있으며, 메틸아데닌 항체로 검출 올리고뉴클레오티드를 검출하는 것은, 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA의 메틸사이토신을 검출하지 않고, 검출 올리고뉴클레오티드의 메틸아데닌만을 검출하는 것이 가능해진다.
제3 공정은, 제2 공정에서 취득한 DNA 메틸화 효소로 처리된 DNA로부터, 단일 사슬 메틸화 DNA를 조제하여, 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 단일 사슬 메틸화 DNA에 검출 올리고뉴클레오티드를 결합시켜 피검 DNA 복합체를 취득하는 공정이다.
본 발명 방법에 있어서의 「검출 올리고뉴클레오티드」란, 올리고뉴클레오티드를 구성하는 뉴클레오티드의 염기가, 당해 검출 올리고뉴클레오티드를 검출 또는 정량하기 위한 식별 기능과, 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA와 상보성에 의해 결합하기 위한 염기 배열인 검출용 접착 배열을 갖고 있는 올리고뉴클레오티드이다.
또, 본 발명에 있어서의 「검출 올리고뉴클레오티드」는, 후술하는 인간 게놈 중의 반복 배열, 중복 유전자 또는 위유전자의 염기 배열 혹은 그 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 염기 배열로 이루어져도 된다. 구체적으로 예를 들면, 배열 번호 38, 40으로 표시되는 염기 배열 또는 그들의 상보 배열을 갖는 염기 배열 등을 들 수 있다.
검출용 접착 배열은, 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 사슬 DNA와의 결합체(이중 사슬)를 형성하기 위해 필요한 염기 배열, 즉, 목적으로 하는 DNA 영역의 염기 배열의 일부에 상보적인 염기 대합(base-pairing)에 의해 결합할 수 있는 배열을 포함하는 염기 배열, 또는, 목적으로 하는 DNA 영역의 5' 말단보다 더 5' 말단측 DNA 영역의 염기 배열의 일부에 상보적인 염기 배열을 포함하는 염기 배열, 또는, 목적으로 하는 DNA 영역의 3' 말단보다 더 3' 말단측의 염기 배열의 일부에 상보적인 염기 배열을 포함하는 염기 배열이며, 또한, 메틸화 DNA 항체와 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA의 결합을 저해하지 않는 것이 바람직하다.
「메틸화 DNA 항체와 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA의 결합을 저해하지 않고」란, 메틸화 DNA 항체가 메틸화된 단일 사슬 DNA로의 결합에 요하는 점유 공간 내에서, 본 올리고뉴클레오티드와 상기 단일 사슬 DNA의 상보적인 결합이 일어나지 않는 것을 의미한다. 즉, 메틸화 DNA 항체가 메틸화된 염기(사이토신)에 결합하기 위해서는, 직접 결합하는 메틸화된 염기(사이토신)뿐만 아니라, 메틸화된 염기(사이토신)가 존재하는 주변 공간도 점유한다고 생각된다. 고로, 검출용 접착 배열은, 메틸화 DNA 항체가 메틸화된 DNA에 결합할 때에 요하는 점유 공간에서, 상기 단일 사슬 DNA와 상보적인 결합을 하지 않는 것이면 된다. 상기 단일 사슬 DNA에 결합시키는 검출용 접착 배열은, 1종류일 필요는 없으며, 메틸화 DNA 항체의 결합을 저해하지 않으면, 2종류 이상 이용해도 된다. 복수의 본 올리고뉴클레오티드를 사용하면, 정량 정밀도 및 검출 감도를 향상시킬 수 있다.
제3 공정에 있어서의 「목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 단일 사슬 메틸화 DNA를 취득하고, 그 단일 사슬 메틸화 DNA에 검출 올리고뉴클레오티드를 결합시켜 피검 DNA 복합체를 취득한다」란, 메틸화된 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA(이하, 단일 사슬 메틸화 DNA라고 기재하는 경우도 있다)와 검출 올리고뉴클레오티드가 상보적으로 결합하여 이루어지는 피검 DNA 복합체를 형성시키는 것을 의미한다. 구체적으로는, 상기 제2 공정에서 DNA 메틸화 효소에 의해 메틸화된 단일 사슬 메틸화 DNA를 Tris-HCl 버퍼(10mM)로 1ng/μL의 용액으로 조제하고, 그 단일 사슬 메틸화 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 검출 올리고뉴클레오티드를 Tris-HCl 버퍼(10mM)로 0.02μM의 용액으로 조제하여, 각각의 올리고뉴클레오티드 용액과 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 10μL와, 100mM MgCl2 용액 10μL와, 1mg/mL BSA 용액 10μL를 혼합하고, 또한 그 혼합물에 멸균 초순수를 더하여 액량을 100μL로 한다. 그 후, 95℃로 10분간 가열하고, 그 후 70℃까지 급속히 냉각하여 10분간 보온한 후, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하며, 또한 37℃로 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌림으로써, 단일 사슬 메틸화 DNA와 검출 올리고뉴클레오티드의 피검 DNA 복합체의 형성을 촉진하면 된다.
「상보적으로 결합」이란, 염기끼리의 수소 결합에 의한 염기 대합에 의해 이중 사슬 DNA를 형성하는 것을 의미한다. 예를 들면, DNA를 구성하는 이중 사슬의 각각 단일 사슬 DNA를 구성하는 염기가, 푸린과 피리미딘의 염기 대합에 의해 이중 사슬을 형성하는 것이며, 보다 구체적으로는, 복수의 연속된, 티민과 아데닌, 구아닌과 사이토신의 수소 결합에 의한 염기 결합에 의해, 이중 사슬 DNA를 형성하는 것을 의미한다. 상보성에 의해 결합하는 것을 「상보적인 결합」이라고 부르는 경우도 있다. 「상보적으로 결합」은, 「상보적으로 결합할 수 있다」, 「상보적으로 염기 대합할 수 있다」, 「상보성에 의해 결합」 또는 「상보성에 의해 결합(상보적인(염기 대합에 의한) 결합)한다」라고 표현하는 경우도 있다. 또, 상보적으로 결합할 수 있는 염기 배열을 서로 「상보성을 갖는다」[상보성이다]라고 표현하는 경우도 있다. 또한, 인공적으로 제작되는 올리고뉴클레오티드에 포함되는 이노신이, 사이토신, 아데닌, 또는 티민과 수소 결합에 의해 결합하는 경우도 의미한다.
본 발명 방법에 있어서, 단일 사슬 메틸화 DNA와 검출 올리고뉴클레오티드가 「상보성에 의해 결합」하는 경우, 검출 올리고뉴클레오티드의 검출용 접착 배열을 구성하는 염기 배열의 일부가 단일 사슬 메틸화 DNA와 염기 대합하지 않는 경우도 포함된다. 예를 들면, 검출용 접착 배열을 구성하는 염기 중, 적어도 75%, 바람직하게는 80% 이상의 염기가 단일 사슬 메틸화 DNA와 염기 대합하고 있으며, 또한, 피검 올리고뉴클레오티드와, 적어도 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖는 올리고뉴클레오티드와 검출용 접착 배열을 결합할 수 있는 경우도 포함된다.
본 발명 방법의 제3 공정에 있어서, 단일 사슬 메틸화 DNA와 검출 올리고뉴클레오티드의 피검 DNA 복합체를 형성시킬 때의 바람직한 양태로서는, 카운터 올리고뉴클레오티드를 첨가하는 것 등을 들 수 있다.
카운터 올리고뉴클레오티드란, 목적으로 하는 DNA 영역과 동일한 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 「짧은」 올리고뉴클레오티드로 분할한 것이다. 이 경우, 「짧은」이란, 10∼100염기, 보다 바람직하게는, 20∼50염기의 길이를 말한다. 또한, 카운터 올리고뉴클레오티드는, 검출 올리고뉴클레오티드와 단일 사슬 메틸화 DNA가 결합되는 염기 배열 상에는 설계하지 않는다. 카운터 올리고뉴클레오티드는, 목적으로 하는 DNA 영역에 비해 과잉으로 첨가한다. 목적으로 하는 DNA 영역이 플러스 사슬인 경우, 목적으로 하는 DNA 영역(플러스 사슬)을 단일 사슬로 한 후, 후술하는 고정화 메틸화 DNA 항체와 결합시킬 때에, 목적으로 하는 DNA 영역의 상보 사슬(마이너스 사슬)과 목적으로 하는 DNA 영역(플러스 사슬)이 상보성에 의해 재결합되는 것을 방해하기 위해 첨가한다. 메틸화된 목적으로 하는 DNA 영역에 메틸화 DNA 항체를 결합시켜, 목적으로 하는 DNA량 또는 그것에 상관 관계가 있는 지표치를 측정할 때에, 메틸화된 목적 영역이 단일 사슬인 쪽이 메틸화 DNA 항체에 결합되기 쉽기 때문이다. 또한, 카운터 올리고뉴클레오티드는, 목적으로 하는 DNA 영역에 비해, 적어도 10배, 바람직하게는 100배 이상의 양으로 첨가되는 것이 바람직하다.
제1 공정에서 조제된 DNA 시료 중의 목적으로 하는 DNA 영역이 단일 사슬 DNA인 경우에는, 제3 공정 중 「단일 사슬 메틸화 DNA를 조제」하기 위해서는, 특별한 작업을 하지 않아도 단일 사슬 메틸화 DNA를 DNA 시료로서 취득할 수 있다. 구체적으로는, DNA 시료로서, RNA로부터 역전사 효소 처리에 의해 합성된 단일 사슬 DNA, 바이러스로부터 추출된 DNA 중, 단일 사슬 DNA를 게놈으로 하는 바이러스로부터 취득된 단일 사슬 DNA를 들 수 있다. 또, 제1 공정에서 조제된 DNA 시료 중의 목적으로 하는 DNA 영역이 이중 사슬 DNA인 경우에는, 제3 공정 중 「단일 사슬 메틸화 DNA를 조제」하기 위해서는, 이중 사슬 DNA를 단일 사슬로 하기 위한 조작을 행하면 된다. 이 경우, 구체적으로는 95℃로 수분간 가열하고, 4℃ 이하로 급랭하면 된다.
검출 올리고뉴클레오티드에 있어서의 「검출용 접착 배열」이란, 목적으로 하는 DNA 영역이 갖는 염기 배열에 상보적인 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드이며, 검출용 접착 배열이 대합할 수 있는 목적으로 하는 DNA 영역의 염기 배열과 75% 이상, 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 배열인 것을 의미한다. 또, 검출용 접착 배열은, 후술하는 고정화 메틸화 DNA 항체와 피검 DNA 복합체의 결합을 저해하지 않는 것이면 된다. 또, 「검출용 접착 배열」은, 목적으로 하는 DNA 영역 또는 목적으로 하는 DNA 영역의 근방에 결합되는 염기 배열을 가지며, 후술하는 제4 공정에서 검출 복합체를 형성할 수 있도록 설정되어 있으면 된다. 또한, 검출용 접착 배열은 후술하는 동일 반복 배열 중(목적으로 하는 DNA 영역 중)에 1개여도 되며, 2개 이상 설계되어 있어도 된다. 2개 이상 설계하는 경우, 복수의 검출용 접착 배열과 후술하는 특정 접착 배열은, 서로 단일 사슬 메틸화 DNA와의 결합을 저해하지 않는 것이면 된다.
제4 공정은, 제3 공정에서 취득한 피검 DNA 복합체에 고정화 메틸화 DNA 항체를 결합시켜 검출 복합체를 취득하는 공정이다.
「고정화 메틸화 DNA 항체」란, DNA 중의 메틸화된 염기를 항원으로 하여 결합하는 메틸화 DNA 항체를 「지지체」에 고정화한 것이다. 항체로서, 바람직하게는 단일 사슬 DNA 중의 5위가 메틸화된 사이토신을 인식하여 결합하는 성질을 갖고 있는 항체이면 되고, 보다 바람직하게는, 메틸사이토신 항체여도 된다. 또, 시판되어 있는 메틸화 DNA 항체여도, 본 명세서에 기재된 메틸화 상태의 DNA를 특이적으로 인식하고, 특이적으로 결합할 수 있는 항체이면 된다.
「지지체」로서는, 메틸화 DNA 항체가 결합 가능한 지지체이면, 재질 및 형상은 무엇이어도 된다. 예를 들면, 형상은, 사용 목적에 적합한 것이면 되고, 튜브상, 테스트 플레이트상, 필터상, 디스크상, 비드상 등을 들 수 있다. 또, 재질로서는, 통상의 면역 측정법용 지지체로서 이용되는 것, 예를 들면, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴산메틸, 폴리설폰, 폴리아크릴로니트릴, 나일론 등의 합성 수지, 또는 상기 합성 수지에 설폰기, 아미노기 등의 반응성 관능기를 도입한 것이어도 된다. 또, 유리, 다당류, 또는 그 유도체(셀룰로오스, 니트로셀룰로오스 등), 실리카겔, 다공성 세라믹스, 금속 산화물 등이어도 된다.
「지지체」는 미립자여도 되고, 또한, 검출 올리고뉴클레오티드에는, 지지체와 동일한 미립자가 결합되어 있어도 상관없다. 미립자로서는, 라텍스 비드, 금 콜로이드(금 나노 입자) 등을 들 수 있다.
지지체와 검출 올리고뉴클레오티드에, 동일 종류의 미립자가 결합되어 있으면, 지지체인 미립자와 검출 올리고뉴클레오티드에 결합되어 있는 미립자는, 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 메틸화된 DNA 상에 동시 결합하여, 미립자끼리가 응집하는 것이 가능해진다. 즉, 고정화 메틸화 DNA 항체와, 검출 올리고뉴클레오티드와, 메틸화된 단일 사슬 DNA가 결합하여 검출 복합체를 형성함으로써, 지지체인 미립자와 검출 올리고뉴클레오티드에 결합된 미립자가 응집체가 되는 것을 의미한다. 이 경우, 미립자가 라텍스 비드이면, 응집체는 탁도의 변화에 따라 검출하는 것이 가능해진다. 또, 미립자가 금 콜로이드(금 나노 입자)이면, 응집체는, 색조 변화(핑크로부터 자색)에 의해 검출하는 것이 가능해진다.
하나의 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA 상에 동시에 복수의 지지체에 고정화된 메틸화 DNA 항체가 결합하는 경우에는, 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA 상의 복수의 메틸화 DNA에 미립자 상에 고정화된 메틸화 DNA 항체가 결합함으로써 미립자의 응집을 검출할 수 있다. 예를 들면, 지지체가 라텍스 비드인 경우, 미립자의 응집체는 탁도의 변화에 따라 검출하는 것이 가능해진다. 또, 지지체가 금 콜로이드(금 나노 입자)인 경우, 미립자의 응집체는, 색조 변화(핑크로부터 자색)에 의해 검출하는 것이 가능해진다. 또한, 이 경우, 검출 올리고뉴클레오티드를 부가하지 않고 실시해도 검출 올리고뉴클레오티드를 첨가한 경우와 동일한 검출 결과를 얻을 수 있다.
미립자의 응집체로 검출되는 양은, 제2 공정까지 메틸화되어 있는 DNA의 총합에 상관되는 값이 된다. 제1 공정에서 취득하는 DNA가 조직 중의 세포에 포함되는 DNA인 경우, 조직 중의 세포에 포함되는 DNA의 메틸화의 정도는 조직마다 상이하므로, 제2 공정에서 얻어지는 DNA의 메틸화의 정도는, 조직 중의 세포에서의 메틸화의 정도와, 제2 공정에서 메틸화되는 정도의 양쪽을 포함한다. 즉, 제2 공정에서 DNA 메틸화 효소 처리를 실시하지 않는 경우에 미립자의 응집체로 검출되는 양은, 조직 중의 세포에서의 메틸화의 정도에 상관되는 값이 된다.
「메틸화 DNA 항체」란, DNA 중의 메틸화된 염기를 항원으로 하여 결합하는 항체이다. 구체적으로는, 메틸사이토신 항체를 들 수 있으며, 단일 사슬 DNA 중의 5위가 메틸화된 사이토신을 인식하여 결합하는 성질을 갖고 있는 항체를 들 수 있다. 본 명세서에 기재된 메틸화 상태의 DNA를 특이적으로 인식하고, 특이적으로 결합할 수 있는 항체이면, 시판되어 있는 메틸화 DNA 항체를 이용할 수도 있다. 메틸화 DNA 항체는, 메틸화된 염기, 메틸화 DNA 등을 항원으로 하여 통상의 방법에 의해 제작할 수 있다. 구체적으로 메틸사이토신 항체를 작성하기 위해서는, 5-메틸시티딘, 5-메틸사이토신, 혹은, 5-메틸사이토신을 포함하는 DNA 등을 항원으로 하여 제작된 항체로부터 DNA 중의 메틸사이토신으로의 특이적인 결합을 지표로 하여 선발한다. 또한, 이러한 고정화 메틸화 DNA 항체의 성질(1개의 메틸화된 염기(사이토신)에 1개의 항체가 결합되는 것)에서 생각하면, 목적으로 하는 DNA 영역으로서는, 수많은 메틸화된 염기(사이토신), 즉 CpG가 존재하는 영역을 선발함으로써, 정량 정밀도 및 검출 감도의 향상을 기대할 수 있다.
동물에 항원을 접촉시켜 얻어지는 항체로서는, 동물에 항원을 면역하여 얻어지는 IgG 분획(fraction)의 항체(폴리크로날 항체), 단일한 클론을 생산하는 항체(모노크로날 항체)가 있다. 본 발명에서는 메틸화 DNA, 혹은 메틸사이토신을 특이적으로 인식할 수 있는 항체인 것이 바람직하므로, 모노크로날 항체를 이용하는 것이 바람직하다.
모노크로날 클론 항체를 제작하는 방법으로서는, 세포 융합법에 의한 방법을 들 수 있다. 예를 들면, 세포 융합법은 면역시킨 마우스(mouse) 유래의 비(脾)세포(B세포)와 골수종 세포를 세포 융합시킴으로써 하이브리도마(hybridoma)를 제작하고, 하이브리도마가 생산하는 항체를 선발하여, 메틸사이토신 항체(모노크로날 항체)를 제작한다. 세포 융합법으로 모노크로날 항체를 제작하는 경우에는, 항원을 정제할 필요가 없으며, 예를 들면, 5-메틸시티딘, 5-메틸사이토신, 또는 5-메틸사이토신을 포함하는 DNA 등의 혼합물을 항원으로 하여 면역에 이용하는 동물에 투여할 수 있다. 투여 방법으로서는, 5-메틸시티딘, 5-메틸사이토신, 또는 5-메틸사이토신을 포함하는 DNA 등을, 직접 항체를 산생(産生)시키는 마우스에 투입한다. 항체가 산생되기 어려운 경우에는 항원을 지지체에 결합시켜서 면역시켜도 된다. 또, 애쥬벤트(adjuvant) 용액(예를 들면, 유동 파라핀과 Aracel A를 혼합하고, 애쥬벤트로서 결핵균의 사균을 혼합한 것)과 항원을 잘 혼합하는 것이나, 리포솜에 넣어 면역시킴으로써 항원의 면역성을 높일 수 있다. 혹은, 항원을 포함하는 용액과 애쥬벤트 용액을 등량(等量) 첨가하여, 충분히 유액상으로 한 후, 마우스의 피하 또는 복강 내에 주사하는 방법이나, 명반수(alum water)와 잘 혼합한 후 백일해 사균을 애쥬벤트로서 첨가하는 방법이 있다. 또한, 최초의 면역을 하고 나서 적당한 기간 후, 마우스의 복강 내 또는 정맥 내에 추가 면역시킬 수도 있다. 또, 항원의 양이 적은 경우에는, 항원이 부유하는 용액을 직접 마우스 비장에 주입하여 면역시켜도 된다. 최종 면역으로부터 몇 일 후에 비장을 적출하여 지방 조직을 박리한 후, 비세포 부유액을 제작한다. 이 비세포와, 예를 들면, HGPRT 결손 골수종 세포를 세포 융합하여 하이브리도마를 제작한다. 세포 융합제로서는 비세포(B세포)와 골수종 세포를 효율적으로 융합할 수 있는 방법이라면 무엇이어도 되며, 예를 들면, 센다이 바이러스(HVJ), 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 이용하는 방법 등을 들 수 있다. 또, 고전압 펄스를 이용하는 방법으로 세포 융합을 해도 좋다. 세포 융합 조작 후, HAT 배지로 배양하고, 비세포와 골수종 세포가 융합된 하이브리도마의 클론을 선택하여, 스크리닝이 가능해질 때까지 세포가 성육(成育)하는 것을 기다린다. 목적으로 하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하기 위한 항체의 검출법이나 항체 역가(抗體力價)의 측정법에는, 항원 항체 반응계를 이용할 수 있다. 구체적으로는, 가용성 항원에 대한 항체 측정법으로, 방사성 동위 원소 면역 정량법(RIA), 효소 면역 정량법(ELISA) 등을 들 수 있다.
단일 사슬 DNA 중에 존재하는 CpG가 적어도 1개소 이상 메틸화되어 있으면 항메틸화 항체와 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 있어서의 「메틸화된」이란, DNA 중에 존재하는 CpG가 적어도 1개소 이상 메틸화되어 있는 DNA를 의미하고 있으며, DNA 중에 존재하는 CpG 모두가 메틸화되어 있는 DNA에 한정된 의미는 아니다.
제4 공정에 있어서의 「검출 복합체」란, 제3 공정에서 취득된 피검 DNA 복합체와 고정화 메틸화 DNA 항체가 결합된 복합체를 의미한다. 메틸화 DNA 항체는 지지체에 고정화될 수 있는 것으로서 사용되므로, 메틸화 DNA 항체가 최종적으로, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 사슬 DNA와 검출 올리고뉴클레오티드의 피검 DNA 복합체를 형성한 상태로 지지체에 고정화할 수 있으면 되고,
(1) 피검 DNA 복합체와 메틸화 DNA 항체의 결합 전의 단계에서, 메틸화 DNA 항체가 지지체에 고정화되어 있어도 되고, 또,
(2) 피검 DNA 복합체와 메틸화 DNA 항체의 결합 후의 단계에서, 메틸화 DNA 항체가 지지체에 고정화되어 있어도 된다.
메틸화 DNA 항체를 지지체에 고정시키기 위해서는, 구체적으로는, 메틸화 DNA 항체를 비오틴화하여 얻어진 비오틴화 메틸화 DNA 항체를 스트렙트아비딘으로 피복한 지지체(예를 들면, 스트렙트아비딘으로 피복한 PCR 튜브, 스트렙트아비딘으로 피복한 자기 비드, 스트렙트아비딘으로 일부를 피복한 크로마토스트립 등)에 고정하는 방법을 들 수 있다.
또, 메틸화 DNA 항체에, 아미노기, 티올기, 알데히드기 등의 활성 관능기를 갖는 분자를 공유 결합시킨 후, 이것을 실란 커플링제 등으로 표면을 활성화시킨 유리, 다당류 유도체, 실리카겔, 또는 상기 합성 수지 등 혹은 내열성 플라스틱제의 지지체에 공유 결합시키는 방법도 있다. 또한, 상기의 공유 결합은, 예를 들면, 메틸화 DNA 항체에 상기의 활성 관능기를 갖는 분자를, 트리글리세라이드를 5개 직렬로 연결하여 이루어지는 스페이서, 크로스 링커 등을 이용하여 공유 결합시키면 된다. 또, 메틸화 DNA 항체를 직접 지지체에 고정화해도 되고, 또, 메틸화 DNA 항체에 대한 항체(2차 항체)를 지지체에 고정화하고, 2차 항체에 메틸화 항체를 결합시킴으로써 지지체에 고정해도 된다.
제4 공정인 「피검 DNA 복합체에 고정화 메틸화 DNA 항체를 결합시켜 검출 복합체를 취득한다」란, 제3 공정에서 얻어진 피검 DNA 복합체에 포함되는 단일 사슬 메틸화 DNA를 고정화 메틸화 DNA 항체와 결합시켜 지지체에 고정화하는 것을 의미한다. 예를 들면, 「피검 DNA 복합체와 메틸화 DNA 항체의 결합 전의 단계에서, 메틸화 DNA 항체가 지지체에 고정화」하는 경우, 구체적으로는 예를 들면, 지지체에 고정화 가능한 메틸화 DNA 항체로서, 「비오틴 표식된 비오틴화 메틸화 DNA 항체」를 사용하고, 검체 유래의 DNA 시료가 생물 유래 검체 유래 검체 중에 포함되는 게놈 유래의 DNA 시료인 경우에는, 이하와 같이 실시하면 된다.
(a) 비오틴화 메틸화 DNA 항체를 적당량(예를 들면, 4μg／mL 용액을 100μL／웰) 아비딘 피복 플레이트에 첨가하고, 그 후, 실온에서 예를 들면, 약 2시간 정치(靜置)함으로써, 비오틴화 메틸화 DNA 항체와 스트렙트아비딘의 고정화를 촉진한다. 그 후, 잔용액의 제거 및 세정을 행한다. 세정 버퍼(예를 들면, 0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4))를 예를 들면, 300μL／웰의 비율로 첨가하고, 용액을 제거한다. 이 세정 조작을 수회 반복하고, 지지체에 고정화된 비오틴화 메틸사이토신 항체를 웰 상에 남긴다.
(b) 검체 유래의 DNA 시료가, 생물 유래 검체 유래 검체 중에 포함되는 게놈 유래의 DNA 시료에, NEBuffer2(NEB사제)를 5μL, S-adenosyl methionine(3.2mL, NEB사제)를 0.5μl, 사이토신메틸화 효소 SssI(NEB사제)를 각각 0.5μL 더하고, 다음에 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μL로 하여, 37℃로 30분간 인큐베이션 후, 이중 사슬 DNA를 분리시켜 얻어진 메틸화 단일 사슬 DNA와, 검출 올리고뉴클레오티드와, 어닐링 버퍼(예를 들면, 33mM Tris-Acetate pH 7.9, 66mM KOAc, 10mM MgOAc2, 0.5mM Dithothreitol)를 혼합하여, 95℃에서 예를 들면, 수분 간 가열한다. 그 후, 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 사슬 DNA와 검출 올리고뉴클레오티드의 결합체를 형성시키기 위해, 검출 올리고뉴클레오티드의 Tm값의 약 10∼20℃ 낮은 온도까지 급속히 냉각하고, 그 온도로 예를 들면, 수분 간 보온하며, 그 후, 실온으로 되돌린다(이 단계에서 형성된 결합체는, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 메틸화 단일 사슬 DNA와 검출 올리고뉴클레오티드의 결합체 외에, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하지 않는 단일 사슬 DNA와 검출 올리고뉴클레오티드의 결합체를 포함하고 있다).
(c) 형성된 메틸화 단일 사슬 DNA와 검출 올리고뉴클레오티드의 결합체를, 비오틴화 메틸화 DNA 항체가 고정화된 아비딘 피복 플레이트에 첨가하고, 그 후, 실온에서 약 3시간 정치하고, 비오틴화 메틸화 DNA 항체와, 상기 메틸화 단일 사슬 DNA 중 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 메틸화 단일 사슬 DNA와, 검출 올리고뉴클레오티드의 복합체의 형성을 촉진한다(복합체의 형성)(이 단계에서, 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 DNA 시료가 메틸화되어 있지 않으면, 단일 사슬 DNA와 검출 올리고뉴클레오티드의 결합체는, 메틸화 DNA 항체와의 복합체를 형성하지 않는다). 그 후, 잔용액의 제거 및 세정을 행한다. 세정 버퍼(예를 들면, 0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4))를, 예를 들면, 300μL／웰의 비율로 첨가하고, 용액을 제거한다. 이 세정 조작을 수회 반복함으로써, 복합체를 웰 상에 남긴다(복합체의 분리).
(b)에서 사용하는 어닐링 버퍼로서는, 검출 올리고뉴클레오티드와, 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 메틸화 단일 사슬 DNA를 결합시키는 데에 적합한 것이면 되고, 상기 어닐링 버퍼에 한정되는 것은 아니다. 2가 이온, 바람직하게는, 마그네슘 이온이 1∼600mM의 농도로 용해되어 있는 것을 사용하면 결합의 안정성이 증가한다.
(a) 및 (c)에 있어서의 세정 조작은, 용액 중에 부유하고 있는 고정화되어 있지 않은 메틸화 DNA 항체와, 메틸화 DNA 항체에 결합되지 않은 용액 중에 부유하고 있는 메틸화되어 있지 않은 단일 사슬 DNA와, 검출 올리고뉴클레오티드의 결합체를 형성하지 않은 목적으로 하는 DNA 영역 이외의 메틸화 단일 사슬 DNA 등을 반응 용액으로부터 제거하기 위해 중요하다. 또한, 세정 버퍼는, 상기의 유리 메틸화 DNA 항체, 용액 중에 부유하고 있는 메틸화 단일 사슬 DNA 등의 제거에 적합한 것이면 되고, 상기 세정 버퍼에 한정되지 않으며, DELFIA 버퍼(Perkin Elmer사제, Tris-HCl pH 7.8 with Tween 80), TE 버퍼 등이어도 된다.
상기 (a)∼(c)에서는, 상기의 목적으로 하는 DNA 영역을 메틸화하여 얻어진 메틸화 단일 사슬 DNA와, 검출 올리고뉴클레오티드의 결합 후, 생기는 결합체에 비오틴화 메틸화 DNA 항체를 결합시켜 복합체를 형성하고 있지만, 이 순서는 한정되는 것은 아니다. 즉, 상기의 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 메틸화 단일 사슬 DNA와 비오틴화 메틸화 DNA 항체를 결합시킨 후, 생기는 결합체에 검출 올리고뉴클레오티드를 결합시켜 복합체를 형성해도 된다. 예를 들면, 스트렙트아비딘으로 피복한 지지체에 고정화된 비오틴화 메틸화 DNA 항체에, 게놈 유래의 DNA 시료를, NEBuffer2(NEB사제)를 5μL, S-adenosyl methionine(3.2mL, NEB사제)을 0.5μl, 사이토신메틸화 효소 SssI(NEB사제)를 각각 0.5μL 더하고, 다음에 이 혼합물에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μL로 하여, 37℃로 30분간 인큐베이션 후, 이중 사슬 DNA로부터 분리하여 얻어진 메틸화 단일 사슬 DNA를 첨가함으로써, 지지체에 고정화된 비오틴화 메틸화 DNA 항체와 당해 메틸화 단일 사슬 DNA의 결합체를 형성시킨다(이 단계에서 형성된 결합체는, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 메틸화 단일 사슬 DNA와 메틸화 항체의 결합체 외에, 목적으로 하는 DNA 영역 이외의 메틸화된 메틸화 단일 사슬 DNA와 메틸화 항체의 결합체를 포함하고 있다). 그 후, 이것에 검출 올리고뉴클레오티드를 첨가하여, 상기 결합체 중 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 메틸화 단일 사슬 DNA를 갖는 결합체와의 복합체를 형성시켜, 분리해도 된다(이 단계에서, 목적으로 하는 DNA 영역 이외의 영역에 있어서의 메틸화된 DNA를 포함하는 메틸화 단일 사슬 DNA와 메틸화 항체의 결합체는 복합체를 형성하지 않는다).
상기 (a)∼(c)의 조작을 크로마토스트립을 이용하여 행하는 것도 가능하다. 그 경우에는, 구체적으로는 이하와 같이 실시한다. 예를 들면, 우선, 비오틴화 메틸화 DNA 항체의 적당량을, 스트렙트아비딘으로 일부를 피복한 크로마토스트립에 의해 전개한다. 이 조작에 의해, 비오틴화 메틸화 DNA 항체가, 스트렙트아비딘으로 피복된 부분에 고정화되게 된다. 다음에, (b)에서 얻어진 상기 메틸화 단일 사슬 DNA와 검출 올리고뉴클레오티드의 결합체(이 단계에서 형성된 결합체는, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 메틸화 단일 사슬 DNA와 검출 올리고뉴클레오티드의 결합체의 외에, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하지 않는 단일 사슬 DNA와 검출 올리고뉴클레오티드의 결합체를 포함하고 있다)를, 상기의 크로마토스트립에 의해 전개한다. 이들 조작에 의해, 게놈 DNA 유래의 DNA 시료를, NEBuffer2(NEB사제)를 5μL, S-adenosyl methionine(3.2mL, KEB사제)을 0.5μl, 사이토신메틸화 효소 SssI(NEB사제)를 각각 0.5μL 더하고, 다음에 이 혼합물에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μL로 하여, 37℃로 30분간 인큐베이션 후, 이중 사슬 DNA를 분해하여 얻어진 메틸화 단일 사슬 DNA와, 검출 올리고뉴클레오티드와, 비오틴화 메틸화 DNA 항체로 이루어지는 복합체가, 스트렙트아비딘으로 피복한 부분에 고정화된다(복합체의 형성·지지체로의 고정)(이 단계에서, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하지 않는 단일 사슬 DNA와 검출 올리고뉴클레오티드의 결합체는, 복합체를 형성하지 않는다). 복합체 형성을 위한 조작의 순서에 대해서는, 이들 조작의 순서에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 사슬 DNA와, 검출 올리고뉴클레오티드와, 비오틴화 메틸화 DNA 항체로 이루어지는 복합체를 형성시킨 후, 이것을 크로마토스트립으로 전개하여, 스트렙트아비딘으로 피복한 부분에, 당해 복합체를 고정화해도 된다. 이들 조작에서는, 용액을 크로마토스트립에 의해 전개함으로써 불필요한 성분을 제거할 수 있으며, 세정 조작을 생략하는 것이 가능해진다. 각 조작간에, 세정 조작(세정 버퍼(예를 들면, 0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4))에 의한 크로마토스트립의 전개)을 실시해도 된다.
제5 공정은, 제4 공정에서 얻어진 검출 복합체에 포함되는 검출 올리고뉴클레오티드를 그 식별 기능에 의해 정량 또는 검출함으로써, 상기 단일 사슬 DNA 중의 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA를 정량 또는 검출하는 공정이다.
여기에서 말하는 「검출」이란, 검출 올리고뉴클레오티드의 식별 기능에 의해, 제2 공정까지 메틸화되어 있는 DNA의 메틸화의 정도가 일정 정도 이상인지의 여부를 판별하는 것을 의미한다. 즉, 통상은, 후술의 식별 기능에 의해 유의한 값이 얻어지는 것을 의미한다.
또, 「정량」이란, 제5 공정에서 구한 식별 기능에 의해 검출되는 양의 수치화를 의미한다. 즉, 제1 공정에서 취득된 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA와 제2 공정에서 DNA 메틸화 효소 처리에 의해 메틸화된 메틸화 DNA의 총합량에 상관되는 값이 얻어지는 것을 의미한다. 예를 들면, 후술하는 식별 기능으로서 메틸화 DNA 항체 또는 본 올리고뉴클레오티드의 양을 정량한 값은, 검체 중에서의 목적으로 하는 DNA 영역의 DNA의 양과 상관되는 값이며, 예를 들면, 검체가 1mL의 혈청인 경우, 혈청 1mL 중에 포함되는 목적 영역의 DNA의, 제1 공정에서 취득된 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA와 제2 공정에서 DNA 메틸화 효소 처리에 의해 메틸화된 메틸화 DNA의 총합량에 상관되는 값을 취득하는 것을 의미한다.
제5 공정에 있어서의 「식별 기능」이란, 검출 올리고뉴클레오티드를 검출 또는 정량할 수 있는 기능이다. 이 식별 기능은 검출 올리고뉴클레오티드가 갖는 기능이면 무엇이어도 되고, 예를 들면, 검출 올리고뉴클레오티드의 표식에 의거한 식별 기능이나, 검출 올리고뉴클레오티드에 결합되는 검출 분자에 의해 검출 올리고뉴클레오티드에 부여되는 식별 기능을 들 수 있다. 구체적으로는, 검출 올리고뉴클레오티드에, 그 5' 말단 혹은 3' 말단에 유로퓸 표식, 금 콜로이드 표식, 라텍스 비드 표식, 방사성 동위체 표식, 형광 물질(FITC 등) 표식, horseradish Peroxidase(HRP) 표식, 알칼리포스파타아제 표식 등이 이루어진 검출 올리고뉴클레오티드의 형광ㆍ발색 등의 특성을 들 수 있다.
유로퓸의 검출을 위해서는, Enhancement Solution(PerkinElmer사제)을 첨가·혼합하고, 약 45분간 실온에서 정치한 후, 형광 검출기로 형광(여기 340nm/형광 612nm)을 측정하면 된다. 또, 검출 올리고뉴클레오티드가 메틸화 올리고뉴클레오티드인 경우에는, 검출 분자로서는, 구체적으로는, 메틸화 DNA 항체나, 오스뮴 착체(J. Am. Chem. Soc., 2007;129:5612-5620) 등을 들 수 있다. 메틸화 올리고뉴클레오티드란, 올리고뉴클레오티드를 구성하는 뉴클레오티드의 염기의 적어도 하나가 메틸화되어 있는 올리고뉴클레오티드를 의미하며, 보다 구체적으로는 5-메틸사이토신, 6-메틸아데닌 등을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 또한, 검출 올리고뉴클레오티드가 FITC 표식되어 있는 경우에는, 검출 분자로서 FITC 항체를 들 수 있다.
검출 분자가 메틸화 DNA 항체인 경우에는, 항체에 결합시켜 정량 또는 검출할 수 있는 기능이면, 식별 기능을 항체에 부여할 수 있다. 단, 고정화 메틸화 DNA 항체와 기질 교차성을 갖는 메틸화 DNA 항체는 이용할 수 없다. 예를 들면, 고정화 메틸화 DNA 항체가 메틸사이토신 항체를 사용하고 있는 경우, 메틸사이토신에 결합할 수 있는 메틸화 DNA 항체를 이용할 수는 없다. 구체적으로는, 유로퓸 표식, 금 콜로이드 표식, 라텍스 비드 표식, 방사성 동위체 표식, 형광 물질(FITC 등) 표식, horseradish Peroxidase(HRP) 표식, 알칼리포스파타아제 표식, 비오틴 표식 등, 표식이 형광·발색 등의 기능이다. 또한, 이들 검출 분자로서의 항체에 식별 기능을 부여하는 방법으로서는, 검출 분자인 항체에 직접 식별 기능을 결합시켜도 되고, 식별 기능을 가진 2차 항체 또는 3차 항체를 검출 분자인 항체에 결합시키는 방법을 들 수 있다. 구체적으로는, 형광 물질로 표식된 항체, horseradish Peroxidase(HRP) 표식된 항체, 알칼리포스파타아제 표식된 항체, 비오틴 표식된 항체, 유로퓸 표식된 항체는 시판되어 있으므로, 2차 항체 또는 3차 항체로서 이용할 수 있다. 또, 효소 사이클법으로 검출 가능한 기질을 결합한 항체여도 된다. 이들 기능의 정량 또는 검출 수단으로서는, 예를 들면, 방사선 검출기, 분광 광도계 등에 의한 측정, 또는 육안 확인 등을 들 수 있다. 예를 들면, 검출 올리고뉴클레오티드를, 그 식별 기능에 의해 검출 또는 정량하는 경우로서, 구체적으로 검출 또는 정량 가능한 기능으로서 유로퓸이 부가된 2차 항체를 사용하는 경우, 검출 복합체에 2차 항체를 결합시킨 후, Enhancement Solution(PerkinElmer사제)을 첨가·혼합하고, 약 45분간 실온에서 정치한다. 그 후, 형광 검출기로 형광(여기 340nm/형광 612nm)을 측정하면 된다.
검출 올리고뉴클레오티드 상의 메틸화 DNA에 메틸화 DNA 항체(고정화 메틸화 DNA 항체와 상이한 기질 특이성을 갖는 메틸화 DNA 항체)를 결합시키고, 그 기능에 의해 검출 또는 정량하는 경우에는, 구체적으로는 예를 들면, 항체 자신의 특성을 기능으로서 이용할 때에는, 이하와 같이 조작을 행하면 된다. 복합체에 메틸화 DNA 항체를 결합시킨 후, 메틸화 DNA 항체에 대한 2차 항체(예를 들면, Eu-N1 표식 마우스 IgG 항체 : PerkinElmer사제)를 첨가하여, 실온에서 약 1시간 정치하고, 2차 항체의 복합체로의 결합을 촉진한다. 그 후, Enhancement Solution(PerkinElmer사제)을 첨가·혼합하고, 예를 들면 약 45분간 실온에서 정치한다. 그 후, 형광 검출기로 형광(여기 340nm/형광 612nm)을 측정함으로써, 검출 또는 정량한다.
검출 올리고뉴클레오티드 상의 메틸화 DNA에 결합되는 메틸화 DNA 항체를 FITC로 표식하는 경우에는, 2차 항체로서 FITC를 결합시킨 항체를 이용할 수도 있다. 이 경우, 공지의 방법에 의해, FITC의 형광을 측정하여, 검출 또는 정량할 수도 있으며, 항FITC 항체를 2차 항체로서 검출 또는 정량할 수도 있다. 또한, 검출 올리고뉴클레오티드에 FITC를 직접 결합시킨 경우는, FITC를 식별 기능으로서 이용할 수도 있으며, horseradish Peroxidase(HRP) 표식된 FITC 항체, 알칼리포스파타아제 표식된 FITC 항체, 비오틴 표식된 FITC 항체, 유로퓸 표식된 FITC 항체 등에 의해 표식 기능을 부여할 수도 있다. 구체적으로는, 검출 올리고뉴클레오티드로서, FITC 표식한 올리고뉴클레오티드를 검출 올리고뉴클레오티드로서 사용하는 경우는, 이 검출 올리고뉴클레오티드를 포함하는 지지체에 고정화된 검출 복합체에, horseradish Peroxidase(HRP) 표식된 항체(예를 들면, HRP 표식 FITC 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories사제))를 첨가하여, 실온에서 약 1시간∼2시간 정치하고, FITC 항체의 검출 복합체로의 결합을 촉진한다. 그 후, FITC 항체 용액을 세정 제거한 후, 적절한 기질(예를 들면, Substrate Reagent Pack #DY999 : R&D SYSTEMS사제)을 첨가·혼합한다. 약 5∼60분간 실온에서 정치한 후, 스톱 용액(2N H2SO4 수용액)을 첨가하여 horseradish Peroxidase(HRP)의 반응을 정지시키고, 반응 정지 후 30분 이내에 450nm의 흡광도를 측정하면 된다.
메틸화 DNA 항체의 고정화에 비오틴을 이용하지 않는 경우, 비오틴화 검출 올리고뉴클레오티드를 검출 또는 정량에 이용할 수 있다. 비오틴화된 검출 올리고뉴클레오티드를 검출 또는 정량하는 경우에는, 예를 들면, HRP 표식 스트렙트아비딘을 고정화된 검출 복합체에 첨가·혼합하고, 비오틴화 검출 올리고뉴클레오티드와 HRP 표식 스트렙트아비딘의 결합체를 형성·분리한 후, 공지의 방법에 의해 HRP의 활성을 측정함으로써 비오틴화 메틸화 DNA 항체를 검출 또는 정량할 수 있다.
식별 기능으로서는, 효소 사이클법 등의 고감도 검출법에서 이용되는 기질 등을 이용하는 것이어도 된다. 구체적으로는, 효소 사이클법에서 이용되는 효소를 결합한 항체를 검출 분자로 하여, 검출 복합체에 결합시키면 된다. 또한, 본 발명 방법에서 검출 분자에 부여되는 식별 기능으로서는, 상기에 기재된 방법에 한정되는 것은 아니다.
「검출 분자」란, 검출 올리고뉴클레오티드를 검출 또는 정량하는 성질을 갖고 있으면 된다. 또, 검출 분자는, 검출 올리고뉴클레오티드의 검출 배열을 인식하는 것이어도 되고, 미리 검출 올리고뉴클레오티드에 결합되어 있어도 상관없다. 즉, 검출 분자는, 검출 올리고뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 성질을 가지며, 또한, 정량 또는 검출을 위해 이용되는 기능·특성인 「식별 기능」을 갖거나, 혹은 식별 기능이 부여될 수 있는 것이면 된다. 구체적으로는, 검출 분자는, 검출 배열이 메틸화 올리고뉴클레오티드인 경우, 당해 메틸화 올리고뉴클레오티드에 결합되어 당해 메틸화 올리고뉴클레오티드를 검출할 수 있는 것이면 되고, 당해 메틸화 올리고뉴클레오티드에 특이적으로 결합하여 식별 기능을 나타내는 것이면 된다(단, 고정화 메틸화 DNA 항체와 기질 교차성을 갖는 메틸화 DNA 항체는 이용할 수 없다. 예를 들면, 고정화 메틸화 DNA 항체가 메틸사이토신 항체를 사용하고 있는 경우, 메틸사이토신 항체를 검출 분자로서 이용할 수는 없다). 그 밖에 예를 들면, 검출 분자는 메틸화 DNA 항체여도 된다. 단, 고정화 메틸화 DNA 항체와 기질 교차성을 갖는 메틸화 DNA 항체는 이용할 수 없다. 예를 들면, 고정화 메틸화 DNA 항체가 메틸사이토신 항체를 사용하고 있는 경우, 메틸사이토신 항체를 검출 분자로서 이용할 수는 없다. 또, 검출 배열이 검출 분자 그 자체인 경우, 검출 올리고뉴클레오티드를 검출하기 위해, 새로운 검출 분자를 첨가하지 않아도 되며, 검출 올리고뉴클레오티드에 넣어진 검출 분자를 검출함으로써, 당해 검출 올리고뉴클레오티드의 검출이 가능해진다.
혈액, 소변 등의 생체 시료 중에 포함되는 미량 물질의 검출 또는 정량하는 방법으로서, 면역학적 측정 방법이 범용되고 있다. 이 면역학적 측정 방법 중, 크로마토그래피를 이용한 이른바 면역 크로마토법은 조작이 간단하고, 검정에 요하는 시간도 짧으므로, 현재, 예를 들면, 병원에 있어서의 임상 검사, 연구실에 있어서의 검정 시험 등의 많은 장면에서 널리 이용되고 있다. 또, 최근, 표식된 DNA(유전자)를 크로마토스트립 상에서 전개하고, 목적 DNA(유전자)를 포획할 수 있는 프로브를 이용하여 혼성화(hybridization)함으로써 목적 DNA(유전자)를 검출하는, 이른바 하이브리드 크로마토법이 이용되도록 되어져 왔었다. 이 방법도 조작이 간편하고, 검정에 요하는 시간도 짧으므로, 현재, 병원에 있어서의 임상 검사, 연구실에 있어서의 검정 시험 등의 장면에서 널리 이용되기 시작하고 있다. 본 발명 방법은 상기의 면역 크로마토법과 하이브리드 크로마토법을 혼합한 방법을 개념적으로 가능하게 하고 있다. 본 발명 방법에서는, 복합체 형성 및 복합체 취득에 관해, 그 순서는 특별히 한정되지 않으므로, 여러 가지 방법이 가능하다. 구체적으로는 예를 들면, 이하와 같이 실시하면 된다.
방법 1 : 제2 공정 종료 직후의 시료에, 식별 기능을 갖는 검출 올리고뉴클레오티드를 첨가하여, 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 메틸화된 단일 사슬 DNA와 식별 기능을 갖는 검출 올리고뉴클레오티드의 결합체를 형성시키고(이 단계에서 형성된 결합체는, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 사슬 DNA와 검출 올리고뉴클레오티드의 결합체 외에, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하지 않는 단일 사슬 DNA와 검출 올리고뉴클레오티드의 결합체를 포함하고 있다), 이어서, 비오틴화 메틸화 항체를 첨가하여, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 사슬 DNA와, 식별 기능을 갖는 검출 올리고뉴클레오티드와, 비오틴화 메틸화 DNA 항체가 결합된 복합체를 형성시킨다. 얻어진 시료를 크로마토스트립의 도입부에 적하(도입)하면, 상기 복합체가 전개부를 모세관 현상에 의해 이동하고, 미리 스트렙트아비딘으로 피복해 둔 부분에 포획된다. 그 후, 얻어진 복합체에 포함되는 검출 올리고뉴클레오티드를, 그 식별 기능에 의거하여 검출 또는 정량함으로써, 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA를 검출 또는 정량할 수 있다.
방법 2 : 제2 공정 종료 직후의 시료에, 비오틴화 메틸화 DNA 항체를 첨가하여, 메틸화된 사이토신을 갖는 메틸화된 단일 사슬 DNA(이 중에는, 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 사슬 DNA와 목적 이외의 단일 사슬 DNA가 존재한다)와 비오틴화 메틸화 DNA 항체의 결합체를 형성시킨다(이 단계에서 형성된 결합체는, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 사슬 DNA와 메틸화 항체의 결합체 외에, 목적으로 하는 DNA 영역 이외의 메틸화된 단일 사슬 DNA와 메틸화 항체의 결합체를 포함하고 있다). 얻어진 시료를 크로마토스트립의 도입부에 적하(도입)하면, 상기 결합체가 전개부를 모세관 현상에 의해 이동하고, 미리 스트렙트아비딘으로 피복해 둔 부분에 포획된다(이 단계에서도 결합체는, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 사슬 DNA와 메틸화 항체의 결합체 외에, 목적으로 하는 DNA 영역 이외의 메틸화된 단일 사슬 DNA와 메틸화 항체의 결합체를 포함하고 있다). 그 후, 식별 기능을 갖는 검출 올리고뉴클레오티드를 도입부에 적하(도입)하면, 전개부를 이동하고, 결합체 중 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 메틸화된 단일 사슬 DNA에만 결합하여, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 사슬 DNA와, 식별 기능을 갖는 검출 올리고뉴클레오티드와, 비오틴화 메틸화 DNA 항체가 결합된 복합체를 형성한다. 얻어진 복합체에 포함되는 검출 올리고뉴클레오티드를, 그 식별 기능에 의거하여 검출 또는 정량함으로써, 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA를 검출 또는 정량할 수 있다.
방법 3 : 비오틴화 메틸화 DNA 항체를 크로마토스트립의 도입부에 적하(도입)하면, 상기 메틸화 DNA 항체가 전개부를 모세관 현상에 의해 이동하고, 미리 스트렙트아비딘으로 피복해 둔 부분에 포획된다. 이어서, 제2 공정 종료 직후의 시료를 도입부에 적하(도입)하면, 전개부를 이동하고, 이미 포획되어 있는 메틸화 DNA 항체에 메틸화된 사이토신을 갖는 단일 사슬 DNA가 결합체로서 포획된다(이 단계에서 형성된 결합체는, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 사슬 DNA와 메틸화 항체의 결합체 외에, 목적으로 하는 DNA 영역 이외의 메틸화된 단일 사슬 DNA와 메틸화 항체의 결합체를 포함하고 있다). 그 후, 식별 기능을 갖는 검출 올리고뉴클레오티드를 도입부에 적하(도입)하면, 전개부를 이동하고, 결합체 중 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 메틸화된 단일 사슬 DNA에만 결합하여, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 사슬 DNA와, 식별 기능을 갖는 검출 올리고뉴클레오티드와, 비오틴화 메틸화 DNA 항체가 결합된 검출 복합체를 형성한다. 얻어진 복합체에 포함되는 검출 올리고뉴클레오티드를, 그 식별 기능에 의거하여 검출 또는 정량함으로써, 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA를 검출 또는 정량할 수 있다.
방법 4 : 비오틴화 메틸화 DNA 항체를 크로마토스트립의 도입부에 적하(도입)하면, 상기 메틸화 DNA 항체가 전개부를 모세관 현상에 의해 이동하고, 미리 스트렙트아비딘으로 피복해 둔 부분에 포획된다. 제2 공정 종료 직후의 시료에, 식별 기능을 갖는 검출 올리고뉴클레오티드를 첨가하여, 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 메틸화된 단일 사슬 DNA와 식별 기능을 갖는 검출 올리고뉴클레오티드의 결합체인 피검 DNA 복합체를 형성시킨다. 이어서, 얻어진 결합체를 도입부에 적하(도입)하면, 전개부를 이동하고, 이미 포획되어 있는 메틸화 DNA 항체에, 결합체 중 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 사슬 DNA만이 결합하여, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 사슬 DNA와, 식별 기능을 갖는 검출 올리고뉴클레오티드와, 비오틴화 메틸화 DNA 항체가 결합된 검출 복합체를 형성한다. 얻어진 복합체에 포함되는 검출 올리고뉴클레오티드를, 그 식별 기능에 의거하여 검출 또는 정량함으로써, 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA를 검출 또는 정량할 수 있다.
목적으로 하는 DNA 영역에 복수의 검출 부위(각각 상이한 목적으로 하는 DNA 영역과 상보적으로 결합할 수 있는 검출 올리고뉴클레오티드를 이용한다)를 존재시키고, 각 목적으로 하는 DNA 영역을 순차적으로 검출 또는 정량하는 것도 가능하며, 또, 복수의 목적으로 하는 DNA 영역과 복합체를 형성할 수 있도록, 게놈 중의 반복 배열이나 중복 유전자 혹은 복수의 상이한 유전자를 동시에 검출하는 것과 같은, 복수의 목적으로 하는 DNA 영역과 상보적으로 결합할 수 있는 검출 올리고뉴클레오티드를 이용해도, 검출 감도를 비약적으로 높일 수 있다. 또한, 1개의 목적 영역 중에서도, 수많은 검출 올리고뉴클레오티드를 설계하고, 그들을 지지체측 또는 검출측에서 이용해도, 검출 감도를 비약적으로 높일 수 있다.
검출 올리고뉴클레오티드, 비오틴화 메틸화 항체, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 단일 사슬 DNA의 복합체를 형성하여 지지체에 결합시키는 과정을 실시하는 방법으로서는, 상기의 방법 1∼방법 4에 한정되는 것은 아니며, 면역 항체법을 이용하는 방법이어도 된다. 예를 들면, ELISA법에서는, 크로마토스트립법과 동일한 원리를 이용하므로, 복합체를 형성하여 지지체에 결합시키는 과정을 방법 1∼4에 기재된 순서로 실시하는 것이 가능하다.
이러한 본 발명 방법에서 사용할 수 있는 DNA 메틸화 효소, 검출 올리고뉴클레오티드, 또는, 메틸화 DNA 항체는 검출용 키트의 시약으로서 유용하다. 본 발명 방법은, 이들 DNA 메틸화 효소, 특정 올리고뉴클레오티드, 또는, 메틸화 DNA 항체 등을 시약으로서 함유하는 검출용 키트나, 이들 본 올리고뉴클레오티드, 또는, 메틸화 DNA 항체 등이 지지체 상에 고정화되어 이루어지는 검출용 칩도 제공하고 있으며, 본 발명 방법의 권리 범위는, 당해 방법의 실질적인 원리를 이용하여 이루어지는 상기와 같은 검출용 키트나 검출용 칩과 같은 형태로의 사용도 포함한다.
통상, 생검 샘플이나 식품 중에 포함되는 병원성 미생물의 유무를 검사하는 경우, 각각 미생물 항원에 대해 면역법에 의한 검사에 의해, 당해 병원성 미생물의 유무를 조사하거나, 당해 병원성 미생물을 특정하거나 한다. 그러나, 이 면역법에 이용하는 항체의 제작은 용이하지 않으며, 또한 복수의 병원성 미생물을 검출하기 위해서는, 각각의 병원성 미생물의 항원에 대한 항체를 제작할 필요가 있다. 본 발명 방법을 이용함으로써, 이들 번잡한 항체 제작을 행하지 않고 병원성 미생물에 대한 간이한 검사가 가능해진다. 또, 본 발명 방법에서는, 상이한 병원성 미생물의 염기 배열을 동시에 검사할 수 있으므로, 하나의 검체 중에 포함되는 여러 종류의 병원성 미생물을 동시에 검출할 수 있게 된다. 구체적으로는, Listeria monocytogenes, Salmonella enterica, Campylobacter jejuni subsp. Jejuni, Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus, Bacillusu cereus, Clostridium botulinum, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberuculosis, Clostridium perfringens 등의 식중독균이 알려져 있지만, 이들 중 여러 종류의 식중독균을 동시에 검출하는 기술은 알려져 있지 않다. 그러나, 본 발명 방법을 이용함으로써 여러 종류의 식중독균의 염기 배열을 동시에 검출하는 것이 가능해진다. 또, 검출 대상의 염기 배열로서, CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 영역과 같이, 게놈 중에 복수 발견되는 염기 배열을 특정 올리고뉴클레오티드에 의해 선택하는 경우, 1게놈 중의 1유전자를 검출하는 경우보다도 고감도로의 검출이 가능해진다. 이러한 기술은, 감염증의 진단이나 식중독균의 신속 검출에도 유용하다. 또, 본 발명 방법은 환경 중의 미생물의 게놈을 검출함으로써, 산업상의 유용한 균의 동정(同定)이나 토양, 하천, 호소(湖沼)의 저질(底質) 등의 미생물군의 간이 조사에도 이용할 수 있다. 환경 중의 미생물 중, 예를 들면, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum deltaH, Aquifex aeolicus, Pyrococcus horikoshii OT3, Archaeoglobus fulgidus, Thermotoga maritima MSB8, Aeropyrum pernix K1, Haloferax mediterranei의 생식을 확인하는 것이 가능해진다. 또, Geobacter sulfurreducens와 같이 공업상 이용할 수 있는 세균이나 Streptococcus thermophilus와 같은 발효에 이용되는 미생물의 검출, 동정도 가능해진다.
본 발명 방법에 있어서의 목적으로 하는 DNA 영역이, 미생물 유래의 염기 배열인 경우, 검체 중에서 추출한 게놈 DNA 또는 DNA 단편, 혹은, 검체 중에서 추출한 RNA를 역전사 효소에 의해 DNA로 한 염기 배열을 의미한다. 따라서, 검출 올리고뉴클레오티드와의 상보적인 결합이 가능한 염기 배열로서는, 당해 미생물에 특이적인 영역을 선택하면 된다. 예를 들면, 본 발명에 있어서의 목적으로 하는 DNA 영역이 미생물의 염기 배열인 경우, 목적으로 하는 DNA 영역을 검체 중에서 선택적으로 추출하기 위해서는, 미생물 게놈 DNA, 혹은, 검체 중에서 추출한 RNA를 역전사 효소에 의해 DNA 등의 염기 배열 중, 목적으로 하는 DNA 영역 근방에 있는 미생물 특유의 염기 배열을 특정 올리고뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 염기 배열로 하면 된다.
예를 들면, 미생물 중의 게놈을 검출하기 위한 목적으로 하는 DNA 영역과 검출 올리고뉴클레오티드가 상보적으로 결합되는 영역으로서는, 구체적으로는 Genbank Accession No. NC_001139 등으로 표시되는 효모 염색체 Ⅶ의 염기 번호 271743-272083에 상당하는 영역(배열 번호 29), Genbank Accession No. NC_001139 등으로 표시되는 효모 염색체 Ⅶ의 염기 번호 384569-384685(배열 번호 34)와 같이 유전자를 코딩하지 않는 염기 배열이어도 된다. 또, 여러 가지의 병원성 미생물에 공통되는 특징적인 유전자의 병원성 미생물로 보존된 염기 배열을 검출 대상으로 하는 것은, 복수의 병원성 미생물을 동시에 검출하는 방법을 제공할 수 있는 것이므로 유용하다. 구체적으로는, mce-family 유전자(Micobacterium tuberculosis), 13번 염색체 상의 tRAN-Tyr 염기 배열(Cryptococcus neoformans), chitin synthase activator(Chs3)는, Aspergillus fumigatus 및 Neosartorya 속(genus)에 특유의 염기 배열을 가지므로, 인간의 담, 폐의 생검 샘플 중에서 추출한 DNA 중에 이들 미생물 유래의 DNA가 포함되는지의 여부를 검정함으로써 미생물에 의한 감염증의 검정에 이용할 수 있다. 또, actA(Listeria monocytogenes), pyrG(NC_002163, Campylobacter jejuni subsp. jejuni) 등은 식중독균에 특유 공통된 유전자이므로, 이들 유전자는 식중독에 있어서의 미생물 검정에 이용할 수 있다. 또, thrA는, Salmonella enterica, Yersinia enterocolitica, Escherichia coli로 보존된 배열을 갖고 있으며, 1개의 유전자로 복수의 미생물을 검출하는 것도 가능하다.
데이터베이스 상에서 공개되어 있는 염기 배열 중, 미생물 특유의 염기 배열을 검색하여, 미생물 특유의 염기 배열을 탐색할 수 있다. 예를 들면, PubMed 등의 공개 데이터베이스 상에 있는 염기 배열이면, 통상의 수속에 의해 취득하는 것이 가능하며, 취득한 염기 배열은, 통상의 수속에 의한 Blast 검색을 행함으로써, 특유의 염기 배열인지의 여부를 검토할 수 있다. 또한, 특유의 염기 배열이란, 검출 대상의 염기 배열이 검출 대상이 되는 미생물의 게놈 염기 배열 이외의 생물 유래의 염기 배열과 상동성을 나타내는 염기 배열을 갖지 않는 것을 의미한다.
특히, 검체가 인간 생검 샘플인 경우, 인간 유전자와 상보적인 결합을 하지 않는 특정 올리고뉴클레오티드를 설계하는 것은 중요하다. 또, 동일하게, 검체가 식품인 경우, 식품에 포함되는 검출 대상 이외의 생물 유래의 염기 배열과 상보적인 결합을 하지 않는 특정 올리고뉴클레오티드를 설계하는 것은 중요하다.
혈액 중의 유리 DNA를 검출하기 위해서는, 유리 DNA의 양과 상관되는 영역이면 무엇이어도 되고, 유리 DNA의 정량 또는 검출을 목적으로 하는 경우, 게놈 중의 동일한 배열이, 특히 몇 차례 이상 반복되어 나타내어지는, 이른바 반복 배열이 바람직하며, 단순 반복 배열(종렬(縱列) 반복 배열, 혹은, 탠덤 리피트(tandem repeat)라고 불린다)이나, 산재 반복 배열이면 더욱 좋다.
단순 반복 배열은, 동일한 배열이 동일한 방향으로 서로 이웃하여 존재하는 것을 특징으로 하며, 세틀라이트(satellite) DNA, 미니 세틀라이트, 마이크로 세틀라이트, 센트로미어(centromere), 텔로미어(telomere), 동원체(動原體), 리보솜 집단 유전자와 같은 일련의 염기 배열 등이 알려져 있다.
산재 반복 배열은, 동일한 배열이 서로 이웃하지 않고 산재하는 것을 특징으로 하며, 레트로 트랜스포손(retro transposon)에 유래하는 DNA라고 생각되고 있다. 산재 반복 배열은, 염기 배열의 길이에 따라, SINE(Short Interspersed Repetitive Element : 단사슬 산재 반복 배열)와 LINE(Long Interspersed Elements : 장사슬 산재 반복 배열)로 분류되고, 인간의 염기 배열로서는, 각각, Alu 배열이나 LINE-1 배열이 대표적인 반복 배열로서 알려져 있다. 또, RNA나 단백질로부터 역전이한 불활성인 프로세싱 완료의 위유전자, 유전자 중복에 의해 증폭된 유전자 배열도 알려져 있다.
중복 유전자란, 1개의 게놈 상에 복수의 높은 상동성을 갖는 유전자가 존재하는 경우를 가리키며, 보통의 경우는, 1유전자 근방에 탠덤으로 나열되어 존재하는 염기 배열이다. 또한, 위유전자도 중복 유전자의 하나인 경우가 많다.
반복 배열의 구체적인 예로서는, 예를 들면, 비교적 짧은 염기 배열로 이루어지는 반복으로서는, (A)n, (T)n, (GA)n, (CA)n, (TAA)n, (GGA)n, (CAGC)n, (CATA)n, (GAAA)n, (TATG)n, (TTTG)n, (TTTA)n, (TTTC)n, (TAAA)n, (TTCA)n, (TATAA)n, (TCTCC)n, (TTTCC)n, (TTTAA)n, (TTTTC)n, (TTTTA)n, (TTTTG)n, (CAAAA)n, (CACCC)n, (TATATG)n, (CATATA)n, (TCTCTG)n, (AGGGGG)n, (CCCCCA)n, (TGGGGG)n(n은 반복수를 의미한다) 등의 배열이 알려져 있으며, 전사 인자에 유래하는 배열로서는, hAT 그룹으로서, MER1-Charlie, Zaphod가 해당되고, Tc-1 그룹으로서, MER2-Tigger, Tc-1, Mariner이 해당된다. 그 밖에, 구체적으로는, Tigger1, Tigger2a, Tigger5, Charlie4a, Charlie7 등이 알려져 있다. 이들 배열은, 일반적으로 짧고 또한 단순한 염기 배열이며, 후술의 특정 접착 배열 및 검출용 접착 배열을 설정하는 것은 어렵지만, 본 발명 방법에 있어서의, 후술의 특정 접착 배열 및 검출용 접착 배열의 설정 대상과 설정 가능한 배열을 갖고 있으면, 본 발명 방법에도 이용 가능하므로, 반드시 본 발명 방법의 대상으로서 배제하는 것은 아니다. 또, 세틀라이트 DNA, 미니 세틀라이트, 마이크로 세틀라이트 등은 단순 반복 배열로 분류되는 반복 배열이다.
또, 유전자 중에 다수 카피 존재하는 배열로서는, 센트로미어에 존재하는 배열로서 ALR6, snRNA로서 U2나 U6, 그 밖에, tRNA나 rRNA와 같이 일반적으로 게놈 중에 다수 카피 존재하는 것이 알려져 있는 유전자 외에, 유전자 중복에 의해 게놈 중에 복수 카피 존재하는 유전자 등을 들 수 있다.
또한, 레트로 바이러스, 말단에 LTR(Lomg terminal repeat)을 갖는 레트로 트랜스포손, MaLRs(Mammalian apparent LTR-Retrotransposons)와 같은 바이러스 유래로 생각되는 내재 배열이나, 레트로 바이러스 유래의 LTR에 대해서도 1게놈 중에 복수 존재하는 것이 알려져 있다.
예를 들면, 레트로 바이러스 유래의 LTR로서는 구체적으로는, LTR1, LTR1B, LTR5, LTR7, LTR8, LTR16A1, LTR16A1, LTR16C, LTR26, LTR26E, MER48, MLT2CB 등의 서브 패밀리가 알려져 있다. 또, 레트로 트랜스포손 유래의 LTR은 ERV, ERVK, ERVL의 각 클래스로 분류되고, 구체적으로는, LTR8A, LTR28, MER21B, MER83, MER31B, MER49, MER66B, HERVH, ERVL, LTR16A1, LTR33A, LTR50, LTR52, MLT2A1, MLT2E, MER11C, MER11C 등의 서브 패밀리를 들 수 있다. 또한, MaLRs는 전형적인 레트로 트랜스포손과 동일하게 그 배열의 양단에 LTR을 포함하지만, LTR에 끼워진 내부 배열이 레트로 바이러스 유래가 아닌 배열의 DNA 인자를 가리킨다. 예를 들면, MLT1A1, MLT1A2, MLT1B, MLT1C, MLT1D, MLT1F, MLT1G, MLT1H, MLT1J, MLT1K, MLT1I, MLT2CB, MSTA, MSTA-int, MSTB, THE1A, THE1B, THE1B-internal, THE1 등의 서브 패밀리를 들 수 있다.
산재 반복 배열은 동일한 배열이 서로 이웃하지 않고 산재하는 것을 특징으로 하고 있으며, 레트로 트랜스포손에 유래한다고 생각되고 있다. 또, 산재 반복 배열은 그 길이에 따라 SINE(Short Interspersed Repetitive Element : 단사슬 산재 반복 배열)와 LINE(Long Interspersed Elements : 장사슬 산재 반복 배열)로 분류된다. SINE 중, 대부분은 Alu 패밀리에 속하는 배열이다. 특징으로서는, 7SL RNA의 3'측의 배열 또는 5'측의 배열을 가지며, 또한 Left-monomer와 Right-monomer라고 불리는 영역에 끼워진 AT-Rich 영역을 갖고 있다. Alu 패밀리의 서브 패밀리로서는, Alu, AluJb, AluJo, AluSc, AluSg, AluSp, AluSq, AluSx, AluY를, 또한, FAM(Fossil Alu Monomer)과, FAM의 배열을 갖는 FLAM(Free Left Alu Monomer)과 FRAM(Free Right Alu Monomer)을 들 수 있다. Alu 패밀리 이외의 SINE로서는, MIR 및 Ther/MIR3이 알려져 있으며, 각각 서브 패밀리로서 MIR, MIR3이 알려져 있다. 그 밖에, 다른 생물종의 Alu 패밀리의 서브 패밀리로서는, B1, B2, B4, PB1, PB1D 등이 알려져 있다. LINE로서는, LINE1로부터 Line23의 서브 패밀리가 보고되어 있지만, LINE-1, LINE2, LINE3이 게놈 중에 널리 존재하는 것이 알려져 있다. 또한, LINE-1에 대해서는 예를 들면, L1M1, L1M2, L1M3, L1M3d, L1M4, L1M4c, L1MA2, L1MA7, L1MA8, L1MA9, L1MB1, L1MB1, L1MB3, L1MB4, L1MB5, L1MB6, L1MB7, L1MCa, L1MCb, L1MC2, L1MC3, L1MC4, L1MC4a, L1MC5, L1MDa, L1ME, L1MEc, L1MEd, L1MEg, L1ME1, L1ME2, L1ME3, L1ME3A, L1ME3B, L1ME4a, L1PB3, L1P4, L1PA2, L1PA3, L1PA4, L1PA5, L1PA6, L1PA7, L1PA10, L1PA12, L1PA13, L1PA14, L1PA16, L1PB1, L1PB3, L1PB4, L1PREC2, HAL1의 서브 패밀리가 알려져 있으며, LINE-2로서는, L2, L2c의 서브 패밀리가 알려져 있다. 또한 예를 들면, Alu 패밀리 또는 Alu의 서브 패밀리에 공통인 배열, LINE-1 패밀리 혹은 LINE-1의 서브 패밀리에 공통인 배열에 대해, 후술의 특정 접착 배열 및 검출용 접착 배열을 설정할 수 있으면, 1게놈 중에 복수의 검출 대상을 설정할 수 있으므로, 게놈의 검출을 보다 고감도로 할 수 있다.
목적으로 하는 DNA 영역으로서는, 구체적으로 예를 들면 LINE-1의 부분 배열(배열 번호 37)이나 Alu의 부분 배열(배열 번호 39로 나타내는 염기 배열) 또는 그들의 상동성을 나타내는 염기 배열 등을 들 수 있다.
예를 들면 어떤 영역 중의 반복 배열을 조사하고 싶은 경우, PubMed 등의 일반적인 배열 검색의 데이터베이스로 검색하는 것은 어렵고, 통상은, Repbase(http://www.girinst.org/repbase/), RepeatMasker(http://www.repeatmasker.org/) 등의 데이터베이스를 이용하면 된다. 본 발명 방법의 특정 접착 배열 및 검출용 접착 배열을 설정할 수 있으면, 검출 감도를 높일 수 있다. 또한, 이들의 반복 배열을 측정하는 것은, 예를 들면, 혈액 중의 유리 DNA량의 대리 지표(surrogate marker)로서 취급하는 것이 가능하며, 생물종 특이적인 반복 배열에 주목하는 경우는, 생물종의 특정 등에 이용할 수 있다.
본 발명 방법에 있어서, 반복 배열을 측정하면, 1게놈 중에 복수 존재하는 염기 배열을 동시에 측정하게 된다. 예를 들면 배열 번호 37로 표시되는 염기 배열과 80% 이상의 배열 동일성을 갖는 염기 배열은, 인간 게놈 중에 약 280카피 있으며, 배열 번호 39로 표시되는 염기 배열과 80% 이상의 상동성을 갖는 염기 배열은, 인간 게놈 중에 약 820카피 있다. 따라서, 각각의 염기 배열 중에 검출용 접착 배열과 특정 접착 배열을 설정할 수 있으면, 1게놈 중에 한 종류밖에 없는 배열에 대해 검출용 접착 배열과 특정 접착 배열을 설정하는 경우에 비하면, 1게놈의 검출 감도를, 이론상으로 280∼820배 높이는 것이 가능해진다.
「중복 유전자」란, 유전자 중복에 의해, 게놈 중의 특정한 유전자 혹은 유전자 단편이 배가됨으로써 생긴 유전자 혹은 유전자 단편이다. 유전자 중복이란, 유전자를 포함하는 DNA가 있는 영역이 중복되는 현상을 말한다. 유전자 중복이 일어나는 원인으로서는, 유전적 재조합의 이상, 레트로 트랜스포손의 전이, 염색체 전체의 중복 등이 있다. 예를 들면, 1개의 유전자가 카피되어 게놈 DNA에 삽입되는 것을 의미하며, 상이한 염색체 위치에 삽입되는 경우와, 원래의 유전자 근방에 삽입되는 경우가 있다. 원래의 유전자 근방으로의 삽입에 의해, 카피된 유전자가 나열되어 있는 장소를 탠덤 리피트라고 부르며, 유전자 중복에 의해 만들어진 유전자의 그룹을 유전자족(혹은 유전자 패밀리)이라고 부른다.
「위유전자」란, DNA의 배열 중, 유전자 산물(특히 단백질)을 코딩하고 있었던 것을 상상시키는 특징이 있는 염기 배열을 갖고 있지만, 현재는 기능을 상실하고 있는 유전자를 말한다. 원래의 기능을 갖는 배열에 돌연변이가 발생한 결과 생겨났다고 생각되고 있다. 예를 들면, 돌연변이에 의해 스톱 코돈이 생겨 단백질의 펩티드 사슬이 짧아져 버려 단백질로서 기능을 할 수 없게 되는 경우나, 1염기 치환 등의 돌연변이에 의해 정상적인 전사에 필요한 조절 배열이 기능을 상실하는 경우 등이 있다. 위유전자는 원래의 정상적인 유전자가 따로 남아 있는 경우가 많지만, 단독으로 위유전자가 되는 것도 있다.
위유전자는, 유전자 배열의 특징에 따라 3타입으로 분류할 수 있다. mRNA로부터 레트로 트랜스포손의 역전사 효소에 의해 만들어진 DNA가 게놈에 삽입되는 경우(프로세스형 위유전자), 게놈 내에서 원래의 유전자 배열이 중복되고, 그 카피 중 일부가 돌연변이 등에 의해 기능을 상실하여 위유전자가 되는 경우(중복 위유전자 또는 비프로세스형 위유전자), 및, 게놈 내의 유전자가, (중복 유전자가 없이 단독 유전자인 채로) 기능을 상실함으로써 위유전자가 되는 경우가 있다.
또한, 현재, 위유전자로서 알려진 유전자 중에는, 전사되어 있는 예나, 유전자 기능을 갖는 예(위유전자라고 불러야하는지의 여부는 정해져 있지 않다)도 알려지도록 되어 있으므로, 본 발명 방법에 있어서의 「위유전자」란, 유전자 기능의 유무, 전사되는지의 여부가 아니라, 상기의 「프로세스형 위유전자」와 「중복 위유전자(비프로세스형 위유전자)」를 의미하는 것으로 한다.
목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA가 게놈 중의 반복 배열인 경우에는, 반복 배열이 상동성을 갖는 1군의 염기 배열이므로, 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA와 검출용 접착 배열의 상보적인 염기 대합은, 염기 배열의 모두가 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA와 염기 대합하지 않는 경우가 발생할 가능성이 있다. 구체적으로는 LINE 배열로서, 배열 번호 37에 대해서는, 80% 이상의 상동성을 갖는 염기 배열은 게놈 중에 약 280카피 있으며, SINE(Alu) 배열로서, 배열 번호 39에 대해서는, 80% 이상의 상동성을 갖는 염기 배열은 게놈 중에 약 820카피가 발견된다. 그러나, 이들 게놈 중에 발견되는 상동성을 갖는 염기 배열은, 배열 번호 37 및 배열 번호 39에 대해, 1염기로부터 복수 염기 상이한 것이 포함되어 있다.
본 발명 방법의 제1 공정에 있어서, 고농도의 나트륨염이 존재하는 계에 의해 검체로부터 DNA를 추출하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 본 발명 방법의 제1 공정에 있어서 검체 중으로부터 DNA를 취득하기 위한 DNA 추출 조작에서 이용되는 용액(예를 들면, 완충액) 중의 나트륨염의 농도로서는, 적어도 50mM 이상, 바람직하게는 100mM 이상을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 50mM 이상 1000mM 이하, 바람직하게는 100mM 이상 1000mM 이하, 보다 바람직하게는 100mM 이상 200mM 이하를 들 수 있다. 또, 나트륨 이온을 포함하는 염이면, NaCl, NaCO3, Na2SO4 등을 포함하는 어떠한 염이어도 상관없지만, 바람직하게는, NaCl을 들 수 있다.
본 발명은, 암 환자 유래의 검체를 선발하는 방법이며, 발명 1∼13 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 피험자 유래의 검체를 이용하여 정량 또는 검출된 DNA의 정량 결과 또는 검출 결과와, 이 방법에 의해 정상자 유래의 검체를 이용하여 정량 또는 검출된 DNA의 정량 결과 또는 검출 결과의 차이가 유의하면, 피험자 유래의 검체를 암 환자 유래의 검체로서 평가하고, 당해 평가의 결과에 의거하여 암 환자 유래의 검체를 특정하는 공정을 포함하는 방법을 포함한다. 당해 발명의 바람직한 양태로서는, 검체가 포유동물 유래의 혈청인 발명, 또한, 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA가 포유동물 유래의 혈청 중의 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 유리 DNA인 발명을 들 수 있다. 이들 발명을 이용하면, 혈액 검사에 의해, 암 환자를 간편하게 특정하는 것이 가능해질 것이다.
여기에서, 「암 환자」란, 암을 발증(發症)한 피험자를 의미하고 있으며 암으로서는, 폐암(비소세포 폐암, 소세포 폐암), 식도암, 위암, 십이지장암, 대장암, 직장암, 간암(간세포암, 담관세포암), 담낭암, 담관암, 췌암, 결장암, 항문암, 유방암, 자궁경암, 자궁암, 난소암, 외음암, 질암, 전립선암, 신장암, 요관암, 방광암, 전립선암, 음경암, 정소(고환)암, 상악암, 설암, (상, 중, 하) 인두암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 악성 림프종, 골수이형성 증후군, 갑상선암, 뇌종양, 골육종, 피부암(기저세포암, 유극세포암) 등의, 인간 및 포유류의 장기에서 발증하는 고형암과, 인간 및 포유류의 혈액에서 발증하는 비고형암의 어느 암이나 포함하는 것을 의미한다.
실시예
이하에 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
시판의 메틸사이토신 항체(Aviva Systems Biology사제)를, 시판 비오틴화 키트(Biotin Labeling Kit-NH2, 도진도 화학 연구소제)를 이용하여, 카탈로그에 기재된 방법에 준하여 비오틴 표식하였다. 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체를 0.25μg/μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액으로 하여 냉장 보존하였다.
합성하여 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체의 0.5μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액을 조제하고, 이것을 각 100μL의 비율로 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립(Perkin Elmer사제)에 첨가하여, 약 1시간 실온에서 방치하고 웰에 고정화하였다. 그 후, 용액을 피펫팅(pipetting)에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리(decantation)에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 방법에서 사용하는 고정화 메틸화 DNA 항체의 조제에 상당한다).
클론테크사로부터 구입된 인간 혈액 유래 게놈 DNA에 대해, 이하의 배열 번호 17 및 배열 번호 18로 표시되는 PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머(PF1 및 PR1) 및 반응 조건을 이용하여 PCR을 행함으로써, 공시(供試) 샘플로서 이용되는 DNA 프래그먼트(X, 배열 번호 19, Genbank Accession No. NT_029419 등으로 표시되는 염기 번호 25687390-25687775에 상당하는 영역)를 증폭시켰다.
<PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머>
Figure pct00001
<DNA 프래그먼트>
Figure pct00002
PCR의 반응액으로서는, 주형으로 하는 게놈 DNA를 10ng과, 5μM의 상기 프라이머 용액 각 3μl와, each 2mM dNTP를 5μl와, 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.01% Gelatin)을 5μl와, 내열성 DNA 폴리머라아제(AmpliTaq Gold) 5U/μl를 0.25μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 이용하였다. 이 반응액을, 95℃로 10분간 보온한 후, 95℃로 30초간 다음에 61℃로 30초간 또한 72℃로 45초간을 1사이클로 하는 보온을 40사이클 행하는 조건으로 PCR을 행하였다.
PCR을 행한 후, 2% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 증폭을 확인하고, Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해 DNA 프래그먼트 X를 정제하였다.
DNA 프래그먼트 X에 대해, 이하의 용액을 각각 2연속으로 조제하였다.
용액 A : DNA 프래그먼트 X 10ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 B : DNA 프래그먼트 X 1ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 C : DNA 프래그먼트 X 0.1ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 D : TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
얻어진 각각의 용액을 10μL와, SssI methylase(NEB사제)를 0.5μl와, 10xNEBuffer2(NEB사제)를 5μl와, 3.2mM S-adenosyl methionine(NEB사제)을 0.5μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 조제하였다. 이 반응액을, 37℃로 30분간 인큐베이션하였다(이상, 본 발명 방법의 제1 공정에 상당한다).
배열 번호 20으로 표시되는 목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 X'에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 21로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F1을 합성하여, 0.02μM의 Tris-HCl 버퍼(10mM) 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드〉
Figure pct00003
<5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00004
얻어진 각각의 반응액에 대해, 이하의 처리를 실시하였다.
PCR 튜브에, 상기에서 조제한 반응액 40μL와, 상기의 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL와, 100mM MgCl2 용액 10μL와, 1mg/mL BSA 용액 10μL를 첨가하고, 또한 이 혼합물에 멸균 초순수를 더하여 액량을 100μL로 하고, 혼합하였다. 그 후, 본 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속히 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 다음에, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 37℃로 10분간 더 보온한 후, 실온으로 되돌려, 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 DNA 프래그먼트의 결합체의 형성을 촉진하였다(이상, 본 발명 방법의 제2 공정에 상당한다).
상기의 비오틴 표식 메틸사이토신 항체가 고정화된 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립에, 상기에서 조제한 DNA 프래그먼트의 반응액 100μL를 더하여, 실온에서 1시간 방치하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 피펫팅에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 방법의 제3 공정에 상당한다).
그 후, HRP 표식 FITC 항체 용액[Jackson ImmunoResearch Laboratories사제, 0.005μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]을 각 웰에 100μL의 비율로 첨가 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 각 웰을 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
기질(R&D사제, #DY999)을, 각 웰에 100μL의 비율로 첨가·혼합하고, 반응을 개시하였다. 약 15분간 실온에서 방치하고, 스톱 용액(2N H2SO4 수용액)을 각 웰에 50μL의 비율로 첨가하고, 반응을 정지하였다. 반응 정지 후 30분 이내에 450nm의 흡광도를 측정하였다(이상, 본 발명 방법의 제4 공정에 상당한다). 그 결과를 도 1에 나타내었다. 용액 A, 용액 B, 및 용액 C에서는, 용액 D에 비해 흡광도의 증가가 보였다. 또 그 강도는 DNA 프래그먼트의 농도에 의존하여 증가하였다. 본 실험에 있어서, 메틸사이토신 항체와, 메틸화된 DNA 프래그먼트와, 고정화한 5' 말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·선택하고, 복합체 중의 FITC를, 그 기능에 의해 정량·검출함으로써, DNA 프래그먼트의 검출·정량이 가능한 것이 명확해졌다.
실시예 2
시판의 메틸사이토신 항체(Aviva Systems Biology사제)를, 시판 비오틴화 키트(Biotin Labeling Kit-NH2, 도진도 화학 연구소제)를 이용하여, 카탈로그에 기재된 방법에 준하여 비오틴 표식하였다. 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체를 0.25μg/μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액으로 하여 냉장 보존하였다.
합성하여 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체의 0.5μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액을 조제하고, 이것을 각 100μL의 비율로 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립(Perkin Elmer사제)에 첨가하여, 약 1시간 실온에서 방치하고 웰에 고정화하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 방법에서 사용하는 고정화 메틸화 DNA 항체의 조제에 상당한다).
클론테크사로부터 구입된 인간 혈액 유래 게놈 DNA에 대해, 이하의 배열 번호 17 및 배열 번호 18로 표시되는 PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머(PF1 및 PR1) 및 반응 조건을 이용하여 PCR을 행함으로써, 공시 샘플로서 이용되는 DNA 프래그먼트(X, 배열 번호 19, Genbank Accession No. NT_029419 등으로 표시되는 염기 번호 25687390-25687775에 상당하는 영역)를 증폭시켰다.
<PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머>
Figure pct00005
<DNA 프래그먼트>
Figure pct00006
PCR의 반응액으로서는, 주형으로 하는 게놈 DNA를 10ng과, 5μM의 상기 프라이머 용액 각 3μl와, each 2mM dNTP를 5μl와, 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.01% Gelatin)을 5μl와, 내열성 DNA 폴리머라아제(AmpliTaq Gold) 5U/μl를 0.25μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 이용하였다. 이 반응액을, 95℃로 10분간 보온한 후, 95℃로 30초간 다음에 61℃로 30초간 또한 72℃로 45초간을 1사이클로 하는 보온을 40사이클 행하는 조건으로 PCR을 행하였다.
PCR을 행한 후, 2% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 증폭을 확인하고, Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해 DNA 프래그먼트 X를 정제하였다.
DNA 프래그먼트 X에 대해, 이하의 용액을 조제하였다.
용액 A : DNA 프래그먼트 X 10ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 B : DNA 프래그먼트 X 1ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 C : DNA 프래그먼트 X 0.1ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 D : TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
또 클론테크사로부터 구입된 인간 혈액 유래 게놈 DNA에 대해, 이하의 배열 번호 22 및 배열 번호 23으로 표시되는 PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머(PF2 및 PR2) 및 반응 조건을 이용하여 PCR을 행함으로써, 공시 샘플로서 이용되는 DNA 프래그먼트(Y, 배열 번호 24, Genbank Accession No. AC009800 등으로 표시되는 염기 번호 76606-76726에 상당하는 영역)를 증폭시켰다.
<PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머>
Figure pct00007
<DNA 프래그먼트>
Figure pct00008
PCR의 반응액으로서는, 주형으로 하는 게놈 DNA를 10ng과, 5μM의 상기 프라이머 용액 각 3μl와, each 2mM dNTP를 5μl와, 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.01% Gelatin)을 5μl와, 내열성 DNA 폴리머라아제(AmpliTaq Gold) 5U/μl를 0.25μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 이용하였다. 이 반응액을, 95℃로 10분간 보온한 후, 95℃로 30초간 다음에 61℃로 30초간 또한 72℃로 45초간을 1사이클로 하는 보온을 50사이클 행하는 조건으로 PCR을 행하였다.
PCR을 행한 후, 2% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 증폭을 확인하고, Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해 DNA 프래그먼트 Y를 정제하였다.
DNA 프래그먼트 Y에 대해, 이하의 용액을 조제하였다.
용액 A : DNA 프래그먼트 Y 10ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 B : DNA 프래그먼트 Y 1ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 C : DNA 프래그먼트 Y 0.1ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 D : TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
상기에 조제한 DNA 프래그먼트 X의 용액 A와 DNA 프래그먼트 Y의 용액 A를, DNA 프래그먼트 X의 용액 B와 DNA 프래그먼트 Y의 용액 B를, DNA 프래그먼트 X의 용액 C와 DNA 프래그먼트 Y의 용액 C를, DNA 프래그먼트 X의 용액 D와 DNA 프래그먼트 Y의 용액 D를 각각 혼합하여, 이하에 나타내는 DNA 프래그먼트 혼합 용액 MA∼MD를 각각 2연속으로 조제하였다.
용액 MA : 10ng/20μL TE 버퍼 용액
용액 MB : 1ng/20μL TE 버퍼 용액
용액 MC : 0.1ng/20μL TE 버퍼 용액
용액 MD : TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
얻어진 각각의 용액을 20μL와, SssI methylase(NEB사제)를 0.5μl와, 10xNEBuffer2(NEB사제)를 5μl와, 3.2mM S-adenosyl methionine(NEB사제)을 0.5μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 조제하였다. 이 반응액을, 37℃로 30분간 인큐베이션하였다(이상, 본 발명 방법의 제1 공정에 상당한다).
배열 번호 20으로 표시되는 목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 X'에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 21로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F1을 합성하여, 0.02μM의 Tris-HCl 버퍼(10mM) 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00009
<5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00010
얻어진 각각의 반응액에 대해, 이하의 처리를 실시하였다.
PCR 튜브에, 상기에서 조제한 반응액 40μL와, 상기의 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL와, 100mM MgCl2 용액 10μL와, 1mg/mL BSA 용액 10μL를 첨가하고, 또한 이 혼합물에 멸균 초순수를 더하여 액량을 100μL로 하고, 혼합하였다. 그 후, 본 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속히 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 다음에, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 37℃로 10분간 더 보온한 후, 실온으로 되돌려, 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 DNA 프래그먼트의 결합체의 형성을 촉진하였다(이상, 본 발명 방법의 제2 공정에 상당한다).
상기의 비오틴 표식 메틸사이토신 항체가 고정화된 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립에, 상기에서 조제한 DNA 프래그먼트의 반응액 100μL를 더하여, 실온에서 1시간 방치하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 피펫팅에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 방법의 제3 공정에 상당한다).
그 후, HRP 표식 FITC 항체 용액[Jackson ImmunoResearch Laboratories사제, 0.005μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]을 각 웰에 100μL의 비율로 첨가 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 각 웰을 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
기질(R&D사제, #DY999)을, 각 웰에 100μL의 비율로 첨가·혼합하고, 반응을 개시하였다.
약 30분간 실온에서 방치하고, 스톱 용액(2N H2SO4 수용액)을 각 웰에 50μL의 비율로 첨가하고, 반응을 정지하였다. 반응 정지 후 30분 이내에 450nm의 흡광도를 측정하였다(이상, 본 발명 방법의 제4 공정에 상당한다).
그 결과를 도 2에 나타내었다. 용액 MA, 용액 MB, 및 용액 MC에서는, 용액 MD에 비해 흡광도의 증가가 보였다. 또 그 강도는 DNA 프래그먼트의 농도에 의존하여 증가하였다.
본 실험에 있어서, 메틸사이토신 항체와, 메틸화된 DNA 프래그먼트와, 고정화한 5' 말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·선택하고, 복합체 중의 FITC를, 그 기능에 의해 정량·검출함으로써, DNA 프래그먼트의 검출·정량이 가능한 것이 명확해졌다.
실시예 3
시판의 메틸사이토신 항체(Aviva Systems Biology사제)를, 시판 비오틴화 키트(Biotin Labeling Kit-NH2, 도진도 화학 연구소제)를 이용하여, 카탈로그에 기재된 방법에 준하여 비오틴 표식하였다. 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체를 0.25μg/μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액으로 하여 냉장 보존하였다.
합성하여 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체의 0.5μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액을 조제하고, 이것을 각 100μL의 비율로 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립(Perkin Elmer사제)에 첨가하여, 약 1시간 실온에서 방치하고 웰에 고정화하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 방법에서 사용하는 고정화 메틸화 DNA 항체의 조제에 상당한다).
클론테크사로부터 구입된 인간 혈액 유래 게놈 DNA에 대해, 이하의 배열 번호 17 및 배열 번호 18로 표시되는 PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머(PF1 및 PR1) 및 반응 조건을 이용하여 PCR을 행함으로써, 공시 샘플로서 이용되는 DNA 프래그먼트(X, 배열 번호 19, Genbank Accession No. NT_029419 등으로 표시되는 염기 번호 25687390-25687775에 상당하는 영역)를 증폭시켰다.
<PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머>
Figure pct00011
<DNA 프래그먼트>
Figure pct00012
PCR의 반응액으로서는, 주형으로 하는 게놈 DNA를 10ng과, 5μM의 상기 프라이머 용액 각 3μl와, each 2mM dNTP를 5μl와, 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.01% Gelatin)을 5μl와, 내열성 DNA 폴리머라아제(AmpliTaq Gold) 5U/μl를 0.25μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 이용하였다. 이 반응액을, 95℃로 10분간 보온한 후, 95℃로 30초간 다음에 61℃로 30초간 또한 72℃로 45초간을 1사이클로 하는 보온을 40사이클 행하는 조건으로 PCR을 행하였다.
PCR을 행한 후, 2% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 증폭을 확인하고, Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해 DNA 프래그먼트 X를 정제하였다.
DNA 프래그먼트 X에 대해, 이하의 용액을 조제하였다.
용액 A : DNA 프래그먼트 X 10ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 B : DNA 프래그먼트 X 1ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 C : DNA 프래그먼트 X 0.1ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 D : TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
또 클론테크사로부터 구입된 인간 혈액 유래 게놈 DNA에 대해, 이하의 배열 번호 22 및 배열 번호 23으로 표시되는 PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머(PF2 및 PR2) 및 반응 조건을 이용하여 PCR을 행함으로써, 공시 샘플로서 이용되는 DNA 프래그먼트(Y, 배열 번호 24, Genbank Accession No. AC009800 등으로 표시되는 염기 번호 76606-76726에 상당하는 영역)를 증폭시켰다.
<PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머>
Figure pct00013
<DNA 프래그먼트>
Figure pct00014
PCR의 반응액으로서는, 주형으로 하는 게놈 DNA를 10ng과, 5μM의 상기 프라이머 용액 각 3μl와, each 2mM dNTP를 5μl와, 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.01% Gelatin)을 5μl와, 내열성 DNA 폴리머라아제(AmpliTaq Gold) 5U/μl를 0.25μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 이용하였다. 이 반응액을, 95℃로 10분간 보온한 후, 95℃로 30초간 다음에 60℃로 30초간 또한 72℃로 45초간을 1사이클로 하는 보온을 50사이클 행하는 조건으로 PCR을 행하였다.
PCR을 행한 후, 2% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 증폭을 확인하고, Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해 DNA 프래그먼트 Y를 정제하였다.
DNA 프래그먼트 Y에 대해, 이하의 용액을 조제하였다.
용액 A : DNA 프래그먼트 Y 10ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 B : DNA 프래그먼트 Y 1ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 C : DNA 프래그먼트 Y 0.1ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 D : TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
상기에 조제한 DNA 프래그먼트 X의 용액 A와 DNA 프래그먼트 Y의 용액 A를, DNA 프래그먼트 X의 용액 B와 DNA 프래그먼트 Y의 용액 B를, DNA 프래그먼트 X의 용액 C와 DNA 프래그먼트 Y의 용액 C를, DNA 프래그먼트 X의 용액 D와 DNA 프래그먼트 Y의 용액 D를 각각 혼합하여, 이하에 나타내는 DNA 프래그먼트 혼합 용액 MA∼MD를 각각 2연속으로 조제하였다.
용액 MA : 10ng/20μL TE 버퍼 용액
용액 MB : 1ng/20μL TE 버퍼 용액
용액 MC : 0.1ng/20μL TE 버퍼 용액
용액 MD : TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
얻어진 각각의 용액을 20μL와, SssI methylase(NEB사제)를 0.5μl와, 10xNEBuffer2(NEB사제)를 5μl와, 3.2mM S-adenosyl methionine(NEB사제)을 0.5μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 조제하였다. 이 반응액을, 37℃로 30분간 인큐베이션하였다(이상, 본 발명 방법의 제1 공정에 상당한다).
배열 번호 25로 표시되는 목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 Y'에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 26으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F2를 합성하여, 0.02μM의 Tris-HCl 버퍼(10mM) 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00015
<5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00016
얻어진 각각의 반응액에 대해, 이하의 처리를 실시하였다.
PCR 튜브에, 상기에서 조제한 반응액 40μL와, 상기의 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL와, 100mM MgCl2 용액 10μL와, 1mg/mL BSA 용액 10μL를 첨가하고, 또한 이 혼합물에 멸균 초순수를 더하여 액량을 100μL로 하고, 혼합하였다. 그 후, 본 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속히 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 다음에, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 37℃로 10분간 더 보온한 후, 실온으로 되돌려, 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 DNA 프래그먼트의 결합체의 형성을 촉진하였다(이상, 본 발명 방법의 제2 공정에 상당한다).
상기의 비오틴 표식 메틸사이토신 항체가 고정화된 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립에, 상기에서 조제한 DNA 프래그먼트의 반응액 100μL를 더하여, 실온에서 1시간 방치하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 피펫팅에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 방법의 제3 공정에 상당한다).
그 후, HRP 표식 FITC 항체 용액[Jackson ImmunoResearch Laboratories사제, 0.005μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]을 각 웰에 100μL의 비율로 첨가 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 각 웰을 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
기질(R&D사제, #DY999)을, 각 웰에 100μL의 비율로 첨가·혼합하고, 반응을 개시하였다.
약 30분간 실온에서 방치하고, 스톱 용액(2N H2SO4 수용액)을 각 웰에 50μL의 비율로 첨가하고, 반응을 정지하였다. 반응 정지 후 30분 이내에 450nm의 흡광도를 측정하였다(이상, 본 발명 방법의 제4 공정에 상당한다).
그 결과를 도 3에 나타내었다. 용액 MA 및 용액 MB에서는, 용액 MD에 비해 흡광도의 증가가 보였다. 또 그 강도는 DNA 프래그먼트의 농도에 의존하여 증가하였다.
본 실험에 있어서, 메틸사이토신 항체와, 메틸화된 DNA 프래그먼트와, 고정화한 5' 말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·선택하고, 복합체 중의 FITC를, 그 기능에 의해 정량·검출함으로써, DNA 프래그먼트의 검출·정량이 가능한 것이 명확해졌다.
실시예 4
시판의 메틸사이토신 항체(Aviva Systems Biology사제)를, 시판 비오틴화 키트(Biotin Labeling Kit-NH2, 도진도 화학 연구소제)를 이용하여, 카탈로그에 기재된 방법에 준하여 비오틴 표식하였다. 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체를 0.25μg/μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액으로 하여 냉장 보존하였다.
합성하여 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체의 0.5μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액을 조제하고, 이것을 각 100μL의 비율로 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립(Perkin Elmer사제)에 첨가하여, 약 1시간 실온에서 방치하고 웰에 고정화하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 방법에서 사용하는 고정화 메틸화 DNA 항체의 조제에 상당한다).
클론테크사로부터 구입된 인간 혈액 유래 게놈 DNA에 대해, 이하의 배열 번호 17 및 배열 번호 18로 표시되는 PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머(PF1 및 PR1) 및 반응 조건을 이용하여 PCR을 행함으로써, 공시 샘플로서 이용되는 DNA 프래그먼트(X, 배열 번호 19, Genbank Accession No. NT_029419 등으로 표시되는 염기 번호 25687390-25687775에 상당하는 영역)를 증폭시켰다.
<PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머>
Figure pct00017
<DNA 프래그먼트>
Figure pct00018
PCR의 반응액으로서는, 주형으로 하는 게놈 DNA를 10ng과, 5μM의 상기 프라이머 용액 각 3μl와, each 2mM dNTP를 5μl와, 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.01% Gelatin)을 5μl와, 내열성 DNA 폴리머라아제(AmpliTaq Gold) 5U/μl를 0.25μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 이용하였다. 이 반응액을, 95℃로 10분간 보온한 후, 95℃로 30초간 다음에 61℃로 30초간 또한 72℃로 45초간을 1사이클로 하는 보온을 40사이클 행하는 조건으로 PCR을 행하였다.
PCR을 행한 후, 2% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 증폭을 확인하고, Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해 DNA 프래그먼트 X를 정제하였다.
DNA 프래그먼트 X에 대해, 이하의 용액을 조제하였다.
용액 A : DNA 프래그먼트 X 10ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 B : DNA 프래그먼트 X 1ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 C : DNA 프래그먼트 X 0.1ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 D : TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
또, 클론테크사로부터 구입된 인간 혈액 유래 게놈 DNA에 대해, 이하의 배열 번호 22 및 배열 번호 23으로 표시되는 PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머(PF2 및 PR2) 및 반응 조건을 이용하여 PCR을 행함으로써, 공시 샘플로서 이용되는 DNA 프래그먼트(Y, 배열 번호 24, Genbank Accession No. AC009800 등으로 표시되는 염기 번호 76606-76726에 상당하는 영역)를 증폭시켰다.
<PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머>
Figure pct00019
<DNA 프래그먼트>
Figure pct00020
PCR의 반응액으로서는, 주형으로 하는 게놈 DNA를 10ng과, 5μM의 상기 프라이머 용액 각 3μl와, each 2mM dNTP를 5μl와, 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.01% Gelatin)을 5μl와, 내열성 DNA 폴리머라아제(AmpliTaq Gold) 5U/μl를 0.25μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 이용하였다. 이 반응액을, 95℃로 10분간 보온한 후, 95℃로 30초간 다음에 60℃로 30초간 또한 72℃로 45초간을 1사이클로 하는 보온을 50사이클 행하는 조건으로 PCR을 행하였다.
PCR을 행한 후, 2% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 증폭을 확인하고, Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해 DNA 프래그먼트 Y를 정제하였다.
DNA 프래그먼트 Y에 대해, 이하의 용액을 조제하였다.
용액 A : DNA 프래그먼트 Y 10ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 B : DNA 프래그먼트 Y 1ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 C : DNA 프래그먼트 Y 0.1ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 D : TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
상기에 조제한 DNA 프래그먼트 X의 용액 A와 DNA 프래그먼트 Y의 용액 A를, DNA 프래그먼트 X의 용액 B와 DNA 프래그먼트 Y의 용액 B를, DNA 프래그먼트 X의 용액 C와 DNA 프래그먼트 Y의 용액 C를, DNA 프래그먼트 X의 용액 D와 DNA 프래그먼트 Y의 용액 D를 각각 혼합하여, 이하에 나타내는 DNA 프래그먼트 혼합 용액 MA∼MD를 각각 2연속으로 조제하였다.
용액 MA : 10ng/20μL TE 버퍼 용액
용액 MB : 1ng/20μL TE 버퍼 용액
용액 MC : 0.1ng/20μL TE 버퍼 용액
용액 MD : TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
얻어진 각각의 용액을 10μL와, SssI methylase(NEB사제)를 0.5μl와, 10xNEBuffer2(NEB사제)를 5μl와, 3.2mM S-adenosyl methionine(NEB사제)을 0.5μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 조제하였다. 이 반응액을, 37℃로 30분간 인큐베이션하였다(이상, 본 발명 방법의 제1 공정에 상당한다).
배열 번호 20으로 표시되는 목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 X'에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 21로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F1을 합성하고, 또, 배열 번호 25로 표시되는 목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 Y'에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 26으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F2를 합성하여, 각각의 농도가 0.02μM인 Tris-HCl 버퍼(10mM) 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00021
<5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00022
Figure pct00023
얻어진 각각의 반응액에 대해, 이하의 처리를 실시하였다.
PCR 튜브에, 상기에서 조제한 반응액 40μL와, 상기의 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL와, 100mM MgCl2 용액 10μL와, 1mg/mL BSA 용액 10μL를 첨가하고, 또한 이 혼합물에 멸균 초순수를 더하여 액량을 100μL로 하고, 혼합하였다. 그 후, 본 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속히 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 다음에, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 37℃로 10분간 더 보온한 후, 실온으로 되돌려, 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 DNA 프래그먼트의 결합체의 형성을 촉진하였다(이상, 본 발명 방법의 제2 공정에 상당한다).
상기의 비오틴 표식 메틸사이토신 항체가 고정화된 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립에, 상기에서 조제한 DNA 프래그먼트의 반응액 100μL를 더하여, 실온에서 1시간 방치하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 피펫팅에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 방법의 제3 공정에 상당한다).
그 후, HRP 표식 FITC 항체 용액[Jackson ImmunoResearch Laboratories사제, 0.005μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]을 각 웰에 100μL의 비율로 첨가 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 각 웰을 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
기질(R&D사제, #DY999)을, 각 웰에 100μL의 비율로 첨가·혼합하고, 반응을 개시하였다.
약 30분간 실온에서 방치하고, 스톱 용액(2N H2SO4 수용액)을 각 웰에 50μL의 비율로 첨가하고, 반응을 정지하였다. 반응 정지 후 30분 이내에 450nm의 흡광도를 측정하였다(이상, 본 발명 방법의 제4 공정에 상당한다).
그 결과를 도 4에 나타내었다. 용액 MA, 용액 MB, 및 용액 MC에서는, 용액 MD에 비해 흡광도의 증가가 보였다. 또 그 강도는 DNA 프래그먼트의 농도에 의존하여 증가하였다.
본 실험에 있어서, 메틸사이토신 항체와, 메틸화된 DNA 프래그먼트와, 고정화한 5' 말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·선택하고, 복합체 중의 FITC를, 그 기능에 의해 정량·검출함으로써, DNA 프래그먼트의 검출·정량이 가능한 것이 명확해졌다.
실시예 5
시판의 메틸사이토신 항체(Aviva Systems Biology사제)를, 시판 비오틴화 키트(Biotin Labeling Kit-NH2, 도진도 화학 연구소제)를 이용하여, 카탈로그에 기재된 방법에 준하여 비오틴 표식하였다. 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체를 0.25μg/μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액으로 하여 냉장 보존하였다.
합성하여 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체의 0.5μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액을 조제하고, 이것을 각 100μL의 비율로 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립(Perkin Elmer사제)에 첨가하여, 약 1시간 실온에서 방치하고 웰에 고정화하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 방법에서 사용하는 고정화 메틸화 DNA 항체의 조제에 상당한다).
빵 효모 효모주 X2180-1A를 YPD 배지(1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6.0)로 탁도가 OD600 0.6-1.0이 될 때까지 배양하고, 10,000xg로 10분간 원심하여, 1×107의 효모 세포를 조제하였다. 조제한 효모 세포로부터, Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)에 기재되어 있는 바와 같은 일반적인 효모 게놈의 조제법을 이용하여 효모 게놈을 취득하였다.
조제한 효모 세포를, 버퍼 A(1M 소르비톨, 0.1M EDTA, pH 7.4)에 현탁하고, 0.1% 2-메르캅토 에탄올(최종 농도 14mM) 및 100U zymolase(10mg/ml)를 첨가하여, 용액이 투명해질 때까지 30℃로 1시간 교반하면서 인큐베이트하였다. 550xg로 10분간 원심하여 프로토플라스트를 회수 후, 버퍼 B(50mM Tris-HCl, pH 7.4, 20mM EDTA)에 현탁하고 나서, 도데실황산나트륨을 1%(w/v)가 되도록 더한 후, 65℃로 30분간 인큐베이트하였다. 이어서, 체적비 2/5량의 5M CH3COOK를 첨가하여 혼화(混和)하고 나서 30분간 빙냉 후, 15,000xg로 30분간 원심하여 상청을 회수하였다. 회수한 상청에 체적비 1/10량의 3M CH3COONa와 등량인 이소프로판올을 더하여 잘 혼화하고, 15,000xg 4℃로 30분간 원심하여 얻어진 침전을 70% 에탄올로 린스하여 회수하였다. 침전을 건조시킨 후, 1ml의 TE 버퍼(10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)에 용해하고, 40μg/ml가 되도록 RNase A(Sigma사제)를 더하여 37℃로 1시간 인큐베이트하고, 이어서, 혼합액에 proteinase K(Sigma사제)를 500μg/ml 및 도데실황산나트륨을 1%(w/v)가 되도록 더한 후, 이것을 55℃로 약 16시간 진탕하였다. 진탕 종료 후, 이 혼합물을 페놀[1M Tris-HCl(pH 8.0)로 포화]·클로로포름 추출 처리하였다. 수층을 회수하여, 이것에 NaCl을 0.5N이 되도록 더한 후, 이것을 에탄올 침전 처리하여 생긴 침전을 회수하였다. 회수된 침전을 70% 에탄올로 린스함으로써, 게놈 DNA를 얻었다.
얻어진 효모 게놈 DNA로부터, 이하의 배열 번호 27 및 배열 번호 28로 표시되는 PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머(PF3 및 PR3) 및 반응 조건을 이용하여 PCR을 행함으로써, 공시 샘플로서 이용되는 DNA 프래그먼트(S, 배열 번호 29, Genbank Accession No. NC_001139 등으로 표시되는 효모 염색체 Ⅶ의 염기 번호 271743-272083에 상당하는 영역)를 증폭시켰다.
<PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머>
Figure pct00024
<DNA 프래그먼트>
Figure pct00025
PCR의 반응액으로서는, 주형으로 하는 게놈 DNA를 10ng과, 5μM의 상기 프라이머 용액 각 3μl와, each 2mM dNTP를 5μl와, 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.01% Gelatin)을 5μl와, 내열성 DNA 폴리머라아제(AmpliTaq Gold) 5U/μl를 0.25μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 이용하였다. 이 반응액을, 95℃로 10분간 보온한 후, 95℃로 20초간 다음에 58℃로 30초간 또한 72℃로 30초간을 1사이클로 하는 보온을 40사이클 행하는 조건으로 PCR을 행하였다.
PCR을 행한 후, 2% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 증폭을 확인하고, Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해 DNA 프래그먼트 S를 정제하였다.
DNA 프래그먼트 S에 대해, 이하의 용액을 각각 2연속으로 조제하였다.
용액 A : DNA 프래그먼트 S 10ng/20μL TE 버퍼 용액
용액 B : DNA 프래그먼트 S 1ng/20μL TE 버퍼 용액
용액 C : DNA 프래그먼트 S 0.1ng/20μL TE 버퍼 용액
용액 D : TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
얻어진 각각의 용액을 20μL와, SssI methylase(NEB사제)를 0.5μl와, 10xNEBuffer2(NEB사제)를 5μl와, 3.2mM S-adenosyl methionine(NEB사제)을 0.5μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 조제하였다. 이 반응액을, 37℃로 30분간 인큐베이션하였다(이상, 본 발명 방법의 제1 공정에 상당한다).
배열 번호 30으로 표시되는 목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 S'에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 31로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F3을 합성하여, 0.02μM의 Tris-HCl 버퍼(10mM)를 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00026
<5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00027
얻어진 각각의 반응액에 대해, 이하의 처리를 실시하였다.
PCR 튜브에, 상기에서 조제한 반응액 40μL와, 상기의 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL와, 100mM MgCl2 용액 10μL와, 1mg/mL BSA 용액 10μL를 첨가하고, 또한 이 혼합물에 멸균 초순수를 더하여 액량을 100μL로 하고, 혼합하였다. 그 후, 본 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속히 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 다음에, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 37℃로 10분간 더 보온한 후, 실온으로 되돌려, 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 DNA 프래그먼트의 결합체의 형성을 촉진하였다(이상, 본 발명 방법의 제2 공정에 상당한다).
상기의 비오틴 표식 메틸사이토신 항체가 고정화된 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립에, 상기에서 조제한 DNA 프래그먼트의 반응액 100μL를 더하여, 실온에서 1시간 방치하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 피펫팅에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 방법의 제3 공정에 상당한다).
그 후, HRP 표식 FITC 항체 용액[Jackson ImmunoResearch Laboratories사제, 0.005μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]을 각 웰에 100μL의 비율로 첨가 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 각 웰을 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
기질(R&D사제, #DY999)을, 각 웰에 100μL의 비율로 첨가·혼합하고, 반응을 개시하였다.
약 30분간 실온에서 방치하고, 스톱 용액(2N H2SO4 수용액)을 각 웰에 50μL의 비율로 첨가하고, 반응을 정지하였다. 반응 정지 후 30분 이내에 450nm의 흡광도를 측정하였다(이상, 본 발명 방법의 제4 공정에 상당한다).
그 결과를 도 5에 나타내었다. 용액 A, 용액 B 및 용액 C에서는, 용액 D에 비해 흡광도의 증가가 보였다. 또 그 강도는 DNA 프래그먼트의 농도에 의존하여 증가하였다.
본 실험에 있어서, 메틸사이토신 항체와, 메틸화된 DNA 프래그먼트와, 고정화한 5' 말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·선택하고, 복합체 중의 FITC를, 그 기능에 의해 정량·검출함으로써, DNA 프래그먼트의 검출·정량이 가능한 것이 명확해졌다.
실시예 6
시판의 메틸사이토신 항체(Aviva Systems Biology사제)를, 시판 비오틴화 키트(Biotin Labeling Kit-NH2, 도진도 화학 연구소제)를 이용하여, 카탈로그에 기재된 방법에 준하여 비오틴 표식하였다. 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체를 0.25μg/μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액으로 하여 냉장 보존하였다.
합성하여 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체의 0.5μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액을 조제하고, 이것을 각 100μL의 비율로 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립(Perkin Elmer사제)에 첨가하여, 약 1시간 실온에서 방치하고 웰에 고정화하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 방법에서 사용하는 고정화 메틸화 DNA 항체의 조제에 상당한다).
빵 효모주 X2180-1A를 YPD 배지(1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6.0)로 탁도가 OD600 0.6-1.0이 될 때까지 배양하고, 10,000xg로 10분간 원심하여, 1×107의 효모 세포를 조제하였다. 조제한 효모 세포로부터, Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)에 기재되어 있는 바와 같은 일반적인 효모 게놈의 조제법을 이용하여 효모 게놈을 취득하였다.
조제한 효모 세포를, 버퍼 A(1M 소르비톨, 0.1M EDTA, pH 7.4)에 현탁하고, 0.1% 2-메르캅토 에탄올(최종 농도 14mM) 및 100U zymolase(10mg/ml)를 첨가하여, 용액이 투명해질 때까지 30℃로 1시간 교반하면서 인큐베이트하였다. 550xg로 10분간 원심하여 프로토플라스트를 회수 후, 버퍼 B(50mM Tris-HCl, pH 7.4, 20mM EDTA)에 현탁하고 나서, 도데실황산나트륨을 1%(w/v)가 되도록 더한 후, 65℃로 30분간 인큐베이트하였다. 이어서, 체적비 2/5량의 5M CH3COOK를 첨가하여 혼화하고 나서 30분간 빙냉 후, 15,000xg로 30분간 원심하여 상청을 회수하였다. 회수한 상청에 체적비 1/10량의 3M CH3COONa와 등량인 이소프로판올을 더하여 잘 혼화하고, 15,000xg 4℃로 30분간 원심하여 얻어진 침전을 70% 에탄올로 린스하여 회수하였다. 침전을 건조시킨 후, 1ml의 TE 버퍼(10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)에 용해하고, 40μg/ml가 되도록 RNase A(Sigma사제)를 더하여 37℃로 1시간 인큐베이트하고, 이어서, 혼합액에 proteinase K(Sigma사제)를 500μg/ml 및 도데실황산나트륨을 1%(w/v)가 되도록 더한 후, 이것을 55℃로 약 16시간 진탕하였다. 진탕 종료 후, 이 혼합물을 페놀[1M Tris-HCl(pH 8.0)로 포화]·클로로포름 추출 처리하였다. 수층을 회수하여, 이것에 NaCl을 0.5N이 되도록 더한 후, 이것을 에탄올 침전 처리하여 생긴 침전을 회수하였다. 회수된 침전을 70% 에탄올로 린스함으로써, 게놈 DNA를 얻었다.
얻어진 효모 게놈 DNA로부터, 이하의 배열 번호 27 및 배열 번호 28로 표시되는 PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머(PF3 및 PR3) 및 반응 조건을 이용하여 PCR을 행함으로써, 공시 샘플로서 이용되는 DNA 프래그먼트(S, 배열 번호 29, Genbank Accession No. NC_001139 등으로 표시되는 효모 염색체 Ⅶ의 염기 번호 271743-272083에 상당하는 영역)를 증폭시켰다.
<PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머>
Figure pct00028
<DNA 프래그먼트>
Figure pct00029
PCR의 반응액으로서는, 주형으로 하는 게놈 DNA를 10ng과, 5μM의 상기 프라이머 용액 각 3μl와, each 2mM dNTP를 5μl와, 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.01% Gelatin)을 5μl와, 내열성 DNA 폴리머라아제(AmpliTaq Gold) 5U/μl를 0.25μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 이용하였다. 이 반응액을, 95℃로 10분간 보온한 후, 95℃로 20초간 다음에 58℃로 30초간 또한 72℃로 30초간을 1사이클로 하는 보온을 40사이클 행하는 조건으로 PCR을 행하였다.
PCR을 행한 후, 2% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 증폭을 확인하고, Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해 DNA 프래그먼트 S를 정제하였다.
DNA 프래그먼트 S에 대해, 이하의 용액을 조제하였다.
용액 A : DNA 프래그먼트 S 10ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 B : DNA 프래그먼트 S 1ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 C : TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
또, 얻어진 효모 게놈 DNA로부터, 이하의 배열 번호 32 및 배열 번호 33으로 표시되는 PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머(PF4 및 PR4) 및 반응 조건을 이용하여 PCR을 행함으로써, 공시 샘플로서 이용되는 DNA 프래그먼트(T, 배열 번호 34, Genbank Accession No. NC_001139 등으로 표시되는 효모 염색체 Ⅶ의 염기 번호 384569-384685에 상당하는 영역)를 증폭시켰다.
<PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머>
Figure pct00030
<DNA 프래그먼트>
Figure pct00031
PCR의 반응액으로서는, 주형으로 하는 게놈 DNA를 10ng과, 5μM의 상기 프라이머 용액 각 3μl와, each 2mM dNTP를 5μl와, 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.01% Gelatin)을 5μl와, 내열성 DNA 폴리머라아제(AmpliTaq Gold) 5U/μl를 0.25μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 이용하였다. 이 반응액을, 95℃로 10분간 보온한 후, 95℃로 20초간 다음에 58℃로 30초간 또한 72℃로 30초간을 1사이클로 하는 보온을 40사이클 행하는 조건으로 PCR을 행하였다.
PCR을 행한 후, 2% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 증폭을 확인하고, Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해 DNA 프래그먼트 T를 정제하였다.
DNA 프래그먼트 T에 대해, 이하의 용액을 조제하였다.
용액 A : DNA 프래그먼트 T 10ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 B : DNA 프래그먼트 T 1ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 C : TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
상기에 조제한 DNA 프래그먼트 S의 용액 A와 DNA 프래그먼트 T의 용액 A를, DNA 프래그먼트 S의 용액 B와 DNA 프래그먼트 T의 용액 B를, DNA 프래그먼트 S의 용액 C와 DNA 프래그먼트 T의 용액 C를 각각 혼합하여, 이하에 나타내는 DNA 프래그먼트 혼합 용액 MA∼MC를 각각 2연속으로 조제하였다.
용액 MA : 10ng/20μL TE 버퍼 용액
용액 MB : 1ng/20μL TE 버퍼 용액
용액 MC : TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
얻어진 각각의 용액을 20μL와, SssI methylase(NEB사제)를 0.5μl와, 10xNEBuffer2(NEB사제)를 5μl와, 3.2mM S-adenosyl methionine(NEB사제)을 0.5μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 조제하였다. 이 반응액을, 37℃로 30분간 인큐베이션하였다(이상, 본 발명 방법의 제1 공정에 상당한다).
배열 번호 30으로 표시되는 목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 S'에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 31로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F3을 합성하여, 0.02μM의 Tris-HCl 버퍼(10mM) 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00032
<5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00033
얻어진 각각의 반응액에 대해, 이하의 처리를 실시하였다.
PCR 튜브에, 상기에서 조제한 반응액 40μL와, 상기의 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL와, 100mM MgCl2 용액 10μL와, 1mg/mL BSA 용액 10μL를 첨가하고, 또한 이 혼합물에 멸균 초순수를 더하여 액량을 100μL로 하고, 혼합하였다. 그 후, 본 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속히 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 다음에, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 37℃로 10분간 더 보온한 후, 실온으로 되돌려, 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 DNA 프래그먼트의 결합체의 형성을 촉진하였다(이상, 본 발명 방법의 제2 공정에 상당한다).
상기의 비오틴 표식 메틸사이토신 항체가 고정화된 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립에, 상기에서 조제한 DNA 프래그먼트의 반응액 100μL를 더하여, 실온에서 1시간 방치하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 피펫팅에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 방법의 제3 공정에 상당한다).
그 후, HRP 표식 FITC 항체 용액[Jackson ImmunoResearch Laboratories사제, 0.005μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]을 각 웰에 100μL의 비율로 첨가 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 각 웰을 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
기질(R&D사제, #DY999)을, 각 웰에 100μL의 비율로 첨가·혼합하고, 반응을 개시하였다.
약 60분간 실온에서 방치하고, 스톱 용액(2N H2SO4 수용액)을 각 웰에 50μL의 비율로 첨가하고, 반응을 정지하였다. 반응 정지 후 30분 이내에 450nm의 흡광도를 측정하였다(이상, 본 발명 방법의 제4 공정에 상당한다).
그 결과를 도 6에 나타내었다. 용액 MA, 및 용액 MB에서는, 용액 MC에 비해 흡광도의 증가가 보였다. 또 그 강도는 DNA 프래그먼트의 농도에 의존하여 증가하였다.
본 실험에 있어서, 메틸사이토신 항체와, 메틸화된 DNA 프래그먼트와, 고정화한 5' 말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·선택하고, 복합체 중의 FITC를, 그 기능에 의해 정량·검출함으로써, DNA 프래그먼트의 검출·정량이 가능한 것이 명확해졌다.
실시예 7
시판의 메틸사이토신 항체(Aviva Systems Biology사제)를, 시판 비오틴화 키트(Biotin Labeling Kit-NH2, 도진도 화학 연구소제)를 이용하여, 카탈로그에 기재된 방법에 준하여 비오틴 표식하였다. 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체를 0.25μg/μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액으로 하여 냉장 보존하였다.
합성하여 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체의 0.5μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액을 조제하고, 이것을 각 100μL의 비율로 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립(Perkin Elmer사제)에 첨가하여, 약 1시간 실온에서 방치하고 웰에 고정화하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 방법에서 사용하는 고정화 메틸화 DNA 항체의 조제에 상당한다).
빵 효모주 X2180-1A를 YPD 배지(1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6.0)로 탁도가 OD600 0.6-1.0이 될 때까지 배양하고, 10,000xg로 10분간 원심하여, 1×107의 효모 세포를 조제하였다. 조제한 효모 세포로부터, Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)에 기재되어 있는 바와 같은 일반적인 효모 게놈의 조제법을 이용하여 효모 게놈을 취득하였다.
조제한 효모 세포를, 버퍼 A(1M 소르비톨, 0.1M EDTA, pH 7.4)에 현탁하고, 0.1% 2-메르캅토 에탄올(최종 농도 14mM) 및 100U zymolase(10mg/ml)를 첨가하여, 용액이 투명해질 때까지 30℃로 1시간 교반하면서 인큐베이트하였다. 550xg로 10분간 원심하여 프로토플라스트를 회수 후, 버퍼 B(50mM Tris-HCl, pH 7.4, 20mM EDTA)에 현탁하고 나서, 도데실황산나트륨을 1%(w/v)가 되도록 더한 후, 65℃로 30분간 인큐베이트하였다. 이어서, 체적비 2/5량의 5M CH3COOK를 첨가하여 혼화하고 나서 30분간 빙냉 후, 15,000xg로 30분간 원심하여 상청을 회수하였다. 회수한 상청에 체적비 1/10량의 3M CH3COONa와 등량인 이소프로판올을 더하여 잘 혼화하고, 15,000xg 4℃로 30분간 원심하여 얻어진 침전을 70% 에탄올로 린스하여 회수하였다. 침전을 건조시킨 후, 1ml의 TE 버퍼(10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)에 용해하고, 40μg/ml가 되도록 RNase A(Sigma사제)를 더하여 37℃로 1시간 인큐베이트하고, 이어서, 혼합액에 proteinase K(Sigma사제)를 500μg/ml 및 도데실황산나트륨을 1%(w/v)가 되도록 더한 후, 이것을 55℃로 약 16시간 진탕하였다. 진탕 종료 후, 이 혼합물을 페놀[1M Tris-HCl(pH 8.0)로 포화]·클로로포름 추출 처리하였다. 수층을 회수하여, 이것에 NaCl을 0.5N이 되도록 더한 후, 이것을 에탄올 침전 처리하여 생긴 침전을 회수하였다. 회수된 침전을 70% 에탄올로 린스함으로써, 게놈 DNA를 얻었다.
얻어진 효모 게놈 DNA로부터, 이하의 배열 번호 27 및 배열 번호 28로 표시되는 PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머(PF3 및 PR3) 및 반응 조건을 이용하여 PCR을 행함으로써, 공시 샘플로서 이용되는 DNA 프래그먼트(S, 배열 번호 29, Genbank Accession No. NC_001139 등으로 표시되는 효모 염색체 Ⅶ의 염기 번호 271743-272083에 상당하는 영역)를 증폭시켰다.
<PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머>
Figure pct00034
<DNA 프래그먼트>
Figure pct00035
PCR의 반응액으로서는, 주형으로 하는 게놈 DNA를 10ng과, 5μM의 상기 프라이머 용액 각 3μl와, each 2mM dNTP를 5μl와, 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.01% Gelatin)을 5μl와, 내열성 DNA 폴리머라아제(AmpliTaq Gold) 5U/μl를 0.25μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 이용하였다. 이 반응액을, 95℃로 10분간 보온한 후, 95℃로 20초간 다음에 58℃로 30초간 또한 72℃로 30초간을 1사이클로 하는 보온을 40사이클 행하는 조건으로 PCR을 행하였다.
PCR을 행한 후, 2% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 증폭을 확인하고, Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해 DNA 프래그먼트 S를 정제하였다.
DNA 프래그먼트 S에 대해, 이하의 용액을 조제하였다.
용액 A : DNA 프래그먼트 S 10ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 B : DNA 프래그먼트 S 1ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 C : TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
또 얻어진 효모 게놈 DNA로부터, 이하의 배열 번호 32 및 배열 번호 33으로 표시되는 PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머(PF4 및 PR4) 및 반응 조건을 이용하여 PCR을 행함으로써, 공시 샘플로서 이용되는 DNA 프래그먼트(T, 배열 번호 34, Genbank Accession No. NC_001139 등으로 표시되는 효모 염색체 Ⅶ의 염기 번호 384569-384685에 상당하는 영역)를 증폭시켰다.
<PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머>
Figure pct00036
<DNA 프래그먼트>
Figure pct00037
PCR의 반응액으로서는, 주형으로 하는 게놈 DNA를 10ng과, 5μM의 상기 프라이머 용액 각 3μl와, each 2mM dNTP를 5μl와, 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.01% Gelatin)을 5μl와, 내열성 DNA 폴리머라아제(AmpliTaq Gold) 5U/μl를 0.25μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 이용하였다. 이 반응액을, 95℃로 10분간 보온한 후, 95℃로 20초간 다음에 58℃로 30초간 또한 72℃로 30초간을 1사이클로 하는 보온을 40사이클 행하는 조건으로 PCR을 행하였다.
PCR을 행한 후, 2% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 증폭을 확인하고, Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해 DNA 프래그먼트 T를 정제하였다.
DNA 프래그먼트 T에 대해, 이하의 용액을 조제하였다.
용액 A : DNA 프래그먼트 T 10ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 B : DNA 프래그먼트 T 1ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 C : TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
상기에 조제한 DNA 프래그먼트 S의 용액 A와 DNA 프래그먼트 T의 용액 A를, DNA 프래그먼트 S의 용액 B와 DNA 프래그먼트 T의 용액 B를, DNA 프래그먼트 S의 용액 C와 DNA 프래그먼트 T의 용액 C를 각각 혼합하여, 이하에 나타내는 DNA 프래그먼트 혼합 용액 MA∼MC를 각각 2연속으로 조제하였다.
용액 MA : 10ng/20μL TE 버퍼 용액
용액 MB : 1ng/20μL TE 버퍼 용액
용액 MC : TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
얻어진 각각의 용액을 20μL와, SssI methylase(NEB사제)를 0.5μl와, 10xNEBuffer2(NEB사제)를 5μl와, 3.2mM S-adenosyl methionine(NEB사제)을 0.5μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 조제하였다. 이 반응액을, 37℃로 30분간 인큐베이션하였다(이상, 본 발명 방법의 제1 공정에 상당한다).
배열 번호 30으로 표시되는 목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 S'에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 31로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F3을 합성하고, 또, 배열 번호 35로 표시되는 목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 T'에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 36으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F4를 합성하여, 각각의 농도가 0.02μM인 Tris-HCl 버퍼(10mM) 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00038
<5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00039
얻어진 각각의 반응액에 대해, 이하의 처리를 실시하였다.
PCR 튜브에, 상기에서 조제한 반응액 40μL와, 상기의 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL와, 100mM MgCl2 용액 10μL와, 1mg/mL BSA 용액 10μL를 첨가하고, 또한 이 혼합물에 멸균 초순수를 더하여 액량을 100μL로 하고, 혼합하였다. 그 후, 본 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속히 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 다음에, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 37℃로 10분간 더 보온한 후, 실온으로 되돌려, 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 DNA 프래그먼트의 결합체의 형성을 촉진하였다(이상, 본 발명 방법의 제2 공정에 상당한다).
상기의 비오틴 표식 메틸사이토신 항체가 고정화된 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립에, 상기에서 조제한 DNA 프래그먼트의 반응액 100μL를 더하여, 실온에서 1시간 방치하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 피펫팅에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 방법의 제3 공정에 상당한다).
그 후, HRP 표식 FITC 항체 용액[Jackson ImmunoResearch Laboratories사제, 0.005μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]을 각 웰에 100μL의 비율로 첨가 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 각 웰을 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
기질(R&D사제, #DY999)을, 각 웰에 100μL의 비율로 첨가·혼합하고, 반응을 개시하였다.
약 60분간 실온에서 방치하고, 스톱 용액(2N H2SO4 수용액)을 각 웰에 50μL의 비율로 첨가하고, 반응을 정지하였다. 반응 정지 후 30분 이내에 450nm의 흡광도를 측정하였다(이상, 본 발명 방법의 제4 공정에 상당한다).
그 결과를 도 7에 나타내었다. 용액 MA, 및 용액 MB에서는, 용액 MC에 비해 흡광도의 증가가 보였다. 또 그 강도는 DNA 프래그먼트의 농도에 의존하여 증가하였다.
본 실험에 있어서, 메틸사이토신 항체와, 메틸화된 DNA 프래그먼트와, 고정화한 5' 말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·선택하고, 복합체 중의 FITC를, 그 기능에 의해 정량·검출함으로써, DNA 프래그먼트의 검출·정량이 가능한 것이 명확해졌다.
실시예 8
시판의 메틸사이토신 항체(Aviva Systems Biology사제)를, 시판 비오틴화 키트(Biotin Labeling Kit-NH2, 도진도 화학 연구소제)를 이용하여, 카탈로그에 기재된 방법에 준하여 비오틴 표식하였다. 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체를 0.25μg/μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액으로 하여 냉장 보존하였다.
합성하여 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체의 0.5μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액을 조제하고, 이것을 각 100μL의 비율로 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립(Perkin Elmer사제)에 첨가하여, 약 1시간 실온에서 방치하고 웰에 고정화하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 방법에서 사용하는 고정화 메틸화 DNA 항체의 조제에 상당한다).
클론테크사로부터 구입된 인간 혈액 유래 게놈 DNA에 대해, 이하의 용액을 각각 2연속으로 조제하였다.
용액 A : 인간 혈액 유래 게놈 DNA 100ng/5μL TE 버퍼 용액
용액 B : 인간 혈액 유래 게놈 DNA 10ng/5μL TE 버퍼 용액
용액 C : 인간 혈액 유래 게놈 DNA 1ng/5μL TE 버퍼 용액
용액 D : TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
상기의 조제한 각각의 용액을 5μL와, 제한 효소 XspI를 10U와, XspI에 최적인 10×완충액(200mM Tris-HCl pH 8.5, 100mM MgCl2, 10mM Dithiothreitol, 1000mM KCl) 2μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 20μl로 한 것을 조제하였다. 이 반응액을, 37℃로 1시간 인큐베이션하였다.
얻어진 각각의 반응액을 20μL와, SssI methylase(NEB사제)를 0.5μl와, 10xNEBuffer2(NEB사제)를 5μl와, 3.2mM S-adenosyl methionine(NEB사제)을 0.5μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 조제하였다. 이 반응액을, 37℃로 30분간 인큐베이션하였다(이상, 본 발명 방법의 제1 공정에 상당한다).
인간 트랜스포손으로서 알려진 LINE1 영역에 설계된 배열 번호 37로 표시되는 목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 Z(Genbank Accession No. M80340 등으로 표시되는 염기 번호 115-386에 상당하는 영역)와 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 38로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F5를 합성하여, 0.02μM의 Tris-HCl 버퍼(10mM) 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00040
<5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00041
얻어진 각각의 반응액에 대해, 이하의 처리를 실시하였다.
PCR 튜브에, 상기에서 조제한 반응액 40μL와, 상기의 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL와, 100mM MgCl2 용액 10μL와, 1mg/mL BSA 용액 10μL를 첨가하고, 또한 이 혼합물에 멸균 초순수를 더하여 액량을 100μL로 하고, 혼합하였다. 그 후, 본 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속히 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 다음에, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 37℃로 10분간 더 보온한 후, 실온으로 되돌려, 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 DNA 프래그먼트의 결합체의 형성을 촉진하였다(이상, 본 발명 방법의 제2 공정에 상당한다).
상기의 비오틴 표식 메틸사이토신 항체가 고정화된 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립에, 상기에서 조제한 DNA 프래그먼트의 반응액 100μL를 더하여, 실온에서 1시간 방치하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 피펫팅에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 방법의 제3 공정에 상당한다).
그 후, HRP 표식 FITC 항체 용액[Jackson ImmunoResearch Laboratories사제, 0.005μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]을 각 웰에 100μL의 비율로 첨가 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 각 웰을 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
기질(R&D사제, #DY999)을, 각 웰에 100μL의 비율로 첨가·혼합하고, 반응을 개시하였다.
약 10분간 실온에서 방치하고, 스톱 용액(2N H2SO4 수용액)을 각 웰에 50μL의 비율로 첨가하고, 반응을 정지하였다. 반응 정지 후 30분 이내에 450nm의 흡광도를 측정하였다(이상, 본 발명 방법의 제4 공정에 상당한다).
그 결과를 도 8에 나타내었다. 용액 A, 용액 B, 및 용액 C에서는, 용액 D에 비해 흡광도의 증가가 보였다. 또 그 강도는 게놈 DNA의 농도에 의존하여 증가하였다.
본 실험에 있어서, 메틸사이토신 항체와, 메틸화된 DNA 프래그먼트와, 고정화한 5' 말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·선택하고, 복합체 중의 FITC를, 그 기능에 의해 정량·검출함으로써, DNA 프래그먼트의 검출·정량이 가능한 것이 명확해지며, 게놈 DNA의 검출·정량이 가능한 것이 명확해졌다.
실시예 9
시판의 메틸사이토신 항체(Aviva Systems Biology사제)를, 시판 비오틴화 키트(Biotin Labeling Kit-NH2, 도진도 화학 연구소제)를 이용하여, 카탈로그에 기재된 방법에 준하여 비오틴 표식하였다. 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체를 0.25μg/μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액으로 하여 냉장 보존하였다.
합성하여 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체의 0.5μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액을 조제하고, 이것을 각 100μL의 비율로 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립(Perkin Elmer사제)에 첨가하여, 약 1시간 실온에서 방치하고 웰에 고정화하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 방법에서 사용하는 고정화 메틸화 DNA 항체의 조제에 상당한다).
클론테크사로부터 구입된 인간 혈액 유래 게놈 DNA에 대해, 이하의 용액을 각각 2연속으로 조제하였다.
용액 A : 인간 혈액 유래 게놈 DNA 100ng/5μL TE 버퍼 용액
용액 B : 인간 혈액 유래 게놈 DNA 10ng/5μL TE 버퍼 용액
용액 C : 인간 혈액 유래 게놈 DNA 1ng/5μL TE 버퍼 용액
용액 D : TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
상기의 조제한 각각의 용액을 5μL와, 제한 효소 MspI를 4U와, MspI에 최적인 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 7.5, 100mM MgCl2, 10mM Dithiothreitol, 500mM NaCl) 2μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 20μl로 한 것을 조제하였다. 이 반응액을, 37℃로 1시간 인큐베이션하였다.
얻어진 각각의 반응액을 20μL와, SssI methylase(NEB사제)를 0.5μl와, 10xNEBuffer2(NEB사제)를 5μl와, 3.2mM S-adenosyl methionine(NEB사제)을 0.5μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 조제하였다. 이 반응액을, 37℃로 30분간 인큐베이션하였다(이상, 본 발명 방법의 제1 공정에 상당한다).
인간 트랜스포손으로서 알려진 Alu 영역에 설계된 배열 번호 39로 표시되는 목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 W(Genbank Accession No. AF458110 등으로 표시되는 염기 번호 178-262에 상당하는 영역)와 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 40으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F6을 합성하여, 0.02μM의 Tris-HCl 버퍼(10mM) 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00042
<5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00043
얻어진 각각의 반응액에 대해, 이하의 처리를 실시하였다.
PCR 튜브에, 상기에서 조제한 반응액 40μL와, 상기의 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL와, 100mM MgCl2 용액 10μL와, 1mg/mL BSA 용액 10μL를 첨가하고, 또한 이 혼합물에 멸균 초순수를 더하여 액량을 100μL로 하고, 혼합하였다. 그 후, 본 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속히 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 다음에, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 37℃로 10분간 더 보온한 후, 실온으로 되돌려, 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 DNA 프래그먼트의 결합체의 형성을 촉진하였다(이상, 본 발명 방법의 제2 공정에 상당한다).
상기의 비오틴 표식 메틸사이토신 항체가 고정화된 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립에, 상기에서 조제한 DNA 프래그먼트의 반응액 100μL를 더하여, 실온에서 1시간 방치하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 피펫팅에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 방법의 제3 공정에 상당한다).
그 후, HRP 표식 FITC 항체 용액[Jackson ImmunoResearch Laboratories사제, 0.005μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]을 각 웰에 100μL의 비율로 첨가 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 각 웰을 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
기질(R&D사제, #DY999)을, 각 웰에 100μL의 비율로 첨가·혼합하고, 반응을 개시하였다.
약 8분간 실온에서 방치하고, 스톱 용액(2N H2SO4 수용액)을 각 웰에 50μL의 비율로 첨가하고, 반응을 정지하였다. 반응 정지 후 30분 이내에 450nm의 흡광도를 측정하였다(이상, 본 발명 방법의 제4 공정에 상당한다).
그 결과를 도 9에 나타내었다. 용액 A, 용액 B, 및 용액 C에서는, 용액 D에 비해 흡광도의 증가가 보였다. 또 그 강도는 게놈 DNA의 농도에 의존하여 증가하였다.
본 실험에 있어서, 메틸사이토신 항체와, 메틸화된 DNA 프래그먼트와, 고정화한 5' 말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·선택하고, 복합체 중의 FITC를, 그 기능에 의해 정량·검출함으로써, DNA 프래그먼트의 검출·정량이 가능한 것이 명확해지며, 게놈 DNA의 검출·정량이 가능한 것이 명확해졌다.
실시예 10
시판의 메틸사이토신 항체(Aviva Systems Biology사제)를, 시판 비오틴화 키트(Biotin Labeling Kit-NH2, 도진도 화학 연구소제)를 이용하여, 카탈로그에 기재된 방법에 준하여 비오틴 표식하였다. 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체를 0.25μg/μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액으로 하여 냉장 보존하였다.
합성하여 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체의 0.5μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액을 조제하고, 이것을 각 100μL의 비율로 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립(Perkin Elmer사제)에 첨가하여, 약 1시간 실온에서 방치하고 웰에 고정화하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 방법에서 사용하는 고정화 메틸화 DNA 항체의 조제에 상당한다).
빵 효모 효모주 X2180-1A를 YPD 배지(1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6.0)로 탁도가 OD600 0.6-1.0이 될 때까지 배양하고, 10,000xg로 10분간 원심하여, 1×107의 효모 세포를 조제하였다. 조제한 효모 세포로부터, Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)에 기재되어 있는 바와 같은 일반적인 효모 게놈의 조제법을 이용하여 효모 게놈을 취득하였다.
조제한 효모 세포를, 버퍼 A(1M 소르비톨, 0.1M EDTA, pH7.4)에 현탁하고, 0.1% 2-메르캅토 에탄올(최종 농도 14mM) 및 100U zymolase(10mg/ml)를 첨가하여, 용액이 투명해질 때까지 30℃로 1시간 교반하면서 인큐베이트하였다. 550xg로 10분간 원심하여 프로토플라스트를 회수 후, 버퍼 B(50mM Tris-HCl, pH 7.4, 20mM EDTA)에 현탁하고 나서, 도데실황산나트륨을 1%(w/v)가 되도록 더한 후, 65℃로 30분간 인큐베이트하였다. 이어서, 체적비 2/5량의 5M CH3COOK를 첨가하여 혼화하고 나서 30분간 빙냉 후, 15,000xg로 30분간 원심하여 상청을 회수하였다. 회수한 상청에 체적비 1/10량의 3M CH3COONa와 등량인 이소프로판올을 더하여 잘 혼화하고, 15,000xg 4℃로 30분간 원심하여 얻어진 침전을 70% 에탄올로 린스하여 회수하였다. 침전을 건조시킨 후, 1ml의 TE 버퍼(10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)에 용해하고, 40μg/ml가 되도록 RNase A(Sigma사제)를 더하여 37℃로 1시간 인큐베이트하고, 이어서, 혼합액에 proteinase K(Sigma사제)를 500μg/ml 및 도데실황산나트륨을 1%(w/v)가 되도록 더한 후, 이것을 55℃로 약 16시간 진탕하였다. 진탕 종료 후, 이 혼합물을 페놀[1M Tris-HCl(pH 8.0)로 포화]·클로로포름 추출 처리하였다. 수층을 회수하여, 이것에 NaCl을 0.5N이 되도록 더한 후, 이것을 에탄올 침전 처리하여 생긴 침전을 회수하였다. 회수된 침전을 70% 에탄올로 린스함으로써, 게놈 DNA를 얻었다.
얻어진 효모 게놈 DNA로부터, 이하의 배열 번호 27 및 배열 번호 28로 표시되는 PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머(PF3 및 PR3) 및 반응 조건을 이용하여 PCR을 행함으로써, 공시 샘플로서 이용되는 DNA 프래그먼트(S, 배열 번호 29, Genbank Accession No. NC_001139 등으로 표시되는 효모 염색체 Ⅶ의 염기 번호 271743-272083에 상당하는 영역)를 증폭시켰다.
<PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머>
Figure pct00044
<DNA 프래그먼트>
Figure pct00045
PCR의 반응액으로서는, 주형으로 하는 게놈 DNA를 10ng과, 5μM의 상기 프라이머 용액 각 3μl와, each 2mM dNTP를 5μl와, 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.01% Gelatin)을 5μl와, 내열성 DNA 폴리머라아제(AmpliTaq Gold) 5U/μl를 0.25μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 이용하였다. 이 반응액을, 95℃로 10분간 보온한 후, 95℃로 20초간 다음에 58℃로 30초간 또한 72℃로 30초간을 1사이클로 하는 보온을 40사이클 행하는 조건으로 PCR을 행하였다.
PCR을 행한 후, 2% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 증폭을 확인하고, Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해 DNA 프래그먼트 S를 정제하였다.
DNA 프래그먼트 S에 대해, 이하의 용액을 각각 2연속으로 조제하였다.
용액 A : DNA 프래그먼트 S 10ng/20μL TE 버퍼 용액
용액 B : DNA 프래그먼트 S 1ng/20μL TE 버퍼 용액
용액 C : DNA 프래그먼트 S 0.1ng/20μL TE 버퍼 용액
용액 D : TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
얻어진 각각의 용액을 20μL와, SssI methylase(NEB사제)를 0.5μl와, 10xNEBuffer2(NEB사제)를 5μl와, 3.2mM S-adenosyl methionine(NEB사제)을 0.5μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 조제하였다. 이 반응액을, 37℃로 30분간 인큐베이션하였다(이상, 본 발명 방법의 제1 공정에 상당한다).
배열 번호 30으로 표시되는 목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 S'에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 31로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F3을 합성하여, 0.02μM의 Tris-HCl 버퍼(10mM)를 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00046
<5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00047
또, 배열 번호 30으로 표시되는 목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 S'의 마이너스 사슬에 대해 상보성에 의해 결합 가능한, 배열 번호 41, 배열 번호 42, 배열 번호 43, 배열 번호 44, 배열 번호 45, 배열 번호 46, 배열 번호, 47, 배열 번호 48, 배열 번호 49, 및 배열 번호 50으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 카운터 올리고뉴클레오티드 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, 및 C10을 합성하여, 각각의 농도가 0.01μM인 TE 버퍼 용액을 조제하였다.
<카운터 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00048
얻어진 각각의 반응액에 대해, 이하의 처리를 실시하였다.
PCR 튜브에, 상기에서 조제한 반응액 40μL와, 상기의 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 상기의 카운터 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL와, 100mM MgCl2 용액 10μL와, 1mg/mL BSA 용액 10μL를 첨가하고, 또한 이 혼합물에 멸균 초순수를 더하여 액량을 100μL로 하고, 혼합하였다. 그 후, 본 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속히 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 다음에, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 37℃로 10분간 더 보온한 후, 실온으로 되돌려, 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 DNA 프래그먼트의 결합체의 형성을 촉진하였다(이상, 본 발명 방법의 제2 공정에 상당한다).
상기의 비오틴 표식 메틸사이토신 항체가 고정화된 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립에, 상기에서 조제한 DNA 프래그먼트의 반응액 100μL를 더하여, 실온에서 1시간 방치하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 피펫팅에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 방법의 제3 공정에 상당한다).
그 후, HRP 표식 FITC 항체 용액[Jackson ImmunoResearch Laboratories사제, 0.005μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]을 각 웰에 100μL의 비율로 첨가 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 각 웰을 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
기질(R&D사제, #DY999)을, 각 웰에 100μL의 비율로 첨가·혼합하고, 반응을 개시하였다.
약 30분간 실온에서 방치하고, 스톱 용액(2N H2SO4 수용액)을 각 웰에 50μL의 비율로 첨가하고, 반응을 정지하였다. 반응 정지 후 30분 이내에 450nm의 흡광도를 측정하였다(이상, 본 발명 방법의 제4 공정에 상당한다).
그 결과를 도 10에 나타내었다. 용액 A, 용액 B, 및 용액 C에서는, 용액 D에 비해 흡광도의 증가가 보였다. 또 그 강도는 DNA 프래그먼트의 농도에 의존하여 증가하였다.
본 실험에 있어서, 메틸사이토신 항체와, 메틸화된 DNA 프래그먼트와, 고정화한 5' 말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·선택하고, 복합체 중의 FITC를, 그 기능에 의해 정량·검출함으로써, DNA 프래그먼트의 검출·정량이 가능한 것이 명확해졌다.
실시예 11
시판의 메틸사이토신 항체(Aviva Systems Biology사제)를, 시판 비오틴화 키트(Biotin Labeling Kit-NH2, 도진도 화학 연구소제)를 이용하여, 카탈로그에 기재된 방법에 준하여 비오틴 표식하였다. 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체를 0.25μg/μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액으로 하여 냉장 보존하였다.
합성하여 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체의 0.5μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액을 조제하고, 이것을 각 100μL의 비율로 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립(Perkin Elmer사제)에 첨가하여, 약 1시간 실온에서 방치하고 웰에 고정화하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 방법에서 사용하는 고정화 메틸화 DNA 항체의 조제에 상당한다).
빵 효모주 X2180-1A를 YPD 배지(1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6.0)로 탁도가 OD600 0.6-1.0이 될 때까지 배양하고, 10,000xg로 10분간 원심하여, 1×107의 효모 세포를 조제하였다. 조제한 효모 세포로부터, Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)에 기재되어 있는 바와 같은 일반적인 효모 게놈의 조제법을 이용하여 효모 게놈을 취득하였다.
조제한 효모 세포를, 버퍼 A(1M 소르비톨, 0.1M EDTA, pH7.4)에 현탁하고, 0.1% 2-메르캅토 에탄올(최종 농도 14mM) 및 100U zymolase(10mg/ml)를 첨가하여, 용액이 투명해질 때까지 30℃로 1시간 교반하면서 인큐베이트하였다. 550xg로 10분간 원심하여 프로토플라스트를 회수 후, 버퍼 B(50mM Tris-HCl, pH 7.4, 20mM EDTA)에 현탁하고 나서, 도데실황산나트륨을 1%(w/v)가 되도록 더한 후, 65℃로 30분간 인큐베이트하였다. 이어서, 체적비 2/5량의 5M CH3COOK를 첨가하여 혼화하고 나서 30분간 빙냉 후, 15,000xg로 30분간 원심하여 상청을 회수하였다. 회수한 상청에 체적비 1/10량의 3M CH3COONa와 등량인 이소프로판올을 더하여 잘 혼화하고, 15,000xg 4℃로 30분간 원심하여 얻어진 침전을 70% 에탄올로 린스하여 회수하였다. 침전을 건조시킨 후, 1ml의 TE 버퍼(10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)에 용해하고, 40μg/ml가 되도록 RNase A(Sigma사제)를 더하여 37℃로 1시간 인큐베이트하고, 이어서, 혼합액에 proteinase K(Sigma사제)를 500μg/ml 및 도데실황산나트륨을 1%(w/v)가 되도록 더한 후, 이것을 55℃로 약 16시간 진탕하였다. 진탕 종료 후, 이 혼합물을 페놀[1M Tris-HCl(pH 8.0)로 포화]·클로로포름 추출 처리하였다. 수층을 회수하여, 이것에 NaCl을 0.5N이 되도록 더한 후, 이것을 에탄올 침전 처리하여 생긴 침전을 회수하였다. 회수된 침전을 70% 에탄올로 린스함으로써, 게놈 DNA를 얻었다.
얻어진 효모 게놈 DNA로부터, 이하의 배열 번호 27 및 배열 번호 28로 표시되는 PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머(PF3 및 PR3) 및 반응 조건을 이용하여 PCR을 행함으로써, 공시 샘플로서 이용되는 DNA 프래그먼트(S, 배열 번호 29, Genbank Accession No. NC_001139 등으로 표시되는 효모 염색체 Ⅶ의 염기 번호 271743-272083에 상당하는 영역)를 증폭시켰다.
<PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머>
Figure pct00049
<DNA 프래그먼트>
Figure pct00050
PCR의 반응액으로서는, 주형으로 하는 게놈 DNA를 10ng과, 5μM의 상기 프라이머 용액 각 3μl와, each 2mM dNTP를 5μl와, 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.01% Gelatin)을 5μl와, 내열성 DNA 폴리머라아제(AmpliTaq Gold) 5U/μl를 0.25μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 이용하였다. 이 반응액을, 95℃로 10분간 보온한 후, 95℃로 20초간 다음에 58℃로 30초간 또한 72℃로 30초간을 1사이클로 하는 보온을 40사이클 행하는 조건으로 PCR을 행하였다.
PCR을 행한 후, 2% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 증폭을 확인하고, Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해 DNA 프래그먼트 S를 정제하였다.
DNA 프래그먼트 S에 대해, 이하의 용액을 조제하였다.
용액 A : DNA 프래그먼트 S 10ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 B : DNA 프래그먼트 S 1ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 C : TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
또, 얻어진 효모 게놈 DNA로부터, 이하의 배열 번호 32 및 배열 번호 33으로 표시되는 PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머(PF4 및 PR4) 및 반응 조건을 이용하여 PCR을 행함으로써, 공시 샘플로서 이용되는 DNA 프래그먼트(T, 배열 번호 34, Genbank Accession No. NC_001139 등으로 표시되는 효모 염색체 Ⅶ의 염기 번호 384569-384685에 상당하는 영역)를 증폭시켰다.
<PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머>
Figure pct00051
<DNA 프래그먼트>
Figure pct00052
PCR의 반응액으로서는, 주형으로 하는 게놈 DNA를 10ng과, 5μM의 상기 프라이머 용액 각 3μl와, each 2mM dNTP를 5μl와, 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.01% Gelatin)을 5μl와, 내열성 DNA 폴리머라아제(AmpliTaq Gold) 5U/μl를 0.25μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 이용하였다. 이 반응액을, 95℃로 10분간 보온한 후, 95℃로 20초간 다음에 58℃로 30초간 또한 72℃로 30초간을 1사이클로 하는 보온을 40사이클 행하는 조건으로 PCR을 행하였다.
PCR을 행한 후, 2% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 증폭을 확인하고, Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해 DNA 프래그먼트 T를 정제하였다.
DNA 프래그먼트 T에 대해, 이하의 용액을 조제하였다.
용액 A : DNA 프래그먼트 T 10ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 B : DNA 프래그먼트 T 1ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 C : TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
상기에 조제한 DNA 프래그먼트 S의 용액 A와 DNA 프래그먼트 T의 용액 A를, DNA 프래그먼트 S의 용액 B와 DNA 프래그먼트 T의 용액 B를, DNA 프래그먼트 S의 용액 C와 DNA 프래그먼트 T의 용액 C를 각각 혼합하여, 이하에 나타내는 DNA 프래그먼트 혼합 용액 MA∼MC를 각각 2연속으로 조제하였다.
용액 MA : 10ng/20μL TE 버퍼 용액
용액 MB : 1ng/20μL TE 버퍼 용액
용액 MC : TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
얻어진 각각의 용액을 20μL와, SssI methylase(NEB사제)를 0.5μl와, 10xNEBuffer2(NEB사제)를 5μl와, 3.2mM S-adenosyl methionine(NEB사제)을 0.5μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 조제하였다. 이 반응액을, 37℃로 30분간 인큐베이션하였다(이상, 본 발명 방법의 제1 공정에 상당한다).
배열 번호 30으로 표시되는 목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 S'에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 31로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F3을 합성하여, 0.02μM의 Tris-HCl 버퍼(10mM) 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00053
<5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00054
또, 배열 번호 30으로 표시되는 목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 S'의 마이너스 사슬에 대해 상보성에 의해 결합 가능한, 배열 번호 41, 배열 번호 42, 배열 번호 43, 배열 번호 44, 배열 번호 45, 배열 번호 46, 배열 번호, 47, 배열 번호 48, 배열 번호 49, 및 배열 번호 50으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 카운터 올리고뉴클레오티드 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, 및 C10을 합성하여, 각각의 농도가 0.01μM인 TE 버퍼 용액을 조제하였다.
<카운터 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00055
얻어진 각각의 반응액에 대해, 이하의 처리를 실시하였다.
PCR 튜브에, 상기에서 조제한 반응액 40μL와, 상기의 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 상기의 카운터 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL와, 100mM MgCl2 용액 10μL와, 1mg/mL BSA 용액 10μL를 첨가하고, 또한 이 혼합물에 멸균 초순수를 더하여 액량을 100μL로 하고, 혼합하였다. 그 후, 본 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속히 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 다음에, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 37℃로 10분간 더 보온한 후, 실온으로 되돌려, 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 DNA 프래그먼트의 결합체의 형성을 촉진하였다(이상, 본 발명 방법의 제2 공정에 상당한다).
상기의 비오틴 표식 메틸사이토신 항체가 고정화된 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립에, 상기에서 조제한 DNA 프래그먼트의 반응액 100μL를 더하여, 실온에서 1시간 방치하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 피펫팅에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 방법의 제3 공정에 상당한다).
그 후, HRP 표식 FITC 항체 용액[Jackson ImmunoResearch Laboratories사제, 0.005μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]을 각 웰에 100μL의 비율로 첨가 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 각 웰을 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
기질(R&D사제, #DY999)을, 각 웰에 100μL의 비율로 첨가·혼합하고, 반응을 개시하였다.
약 60분간 실온에서 방치하고, 스톱 용액(2N H2SO4 수용액)을 각 웰에 50μL의 비율로 첨가하고, 반응을 정지하였다. 반응 정지 후 30분 이내에 450nm의 흡광도를 측정하였다(이상, 본 발명 방법의 제4 공정에 상당한다).
그 결과를 도 11에 나타내었다. 용액 MA 및 용액 MB에서는, 용액 MC에 비해 흡광도의 증가가 보였다. 또 그 강도는 DNA 프래그먼트의 농도에 의존하여 증가하였다.
본 실험에 있어서, 메틸사이토신 항체와, 메틸화된 DNA 프래그먼트와, 고정화한 5' 말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·선택하고, 복합체 중의 FITC를, 그 기능에 의해 정량·검출함으로써, DNA 프래그먼트의 검출·정량이 가능한 것이 명확해졌다.
실시예 12
시판의 메틸사이토신 항체(Aviva Systems Biology사제)를, 시판 비오틴화 키트(Biotin Labeling Kit-NH2, 도진도 화학 연구소제)를 이용하여, 카탈로그에 기재된 방법에 준하여 비오틴 표식하였다. 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체를 0.25μg/μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액으로 하여 냉장 보존하였다.
합성하여 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체의 0.5μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액을 조제하고, 이것을 각 100μL의 비율로 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립(Perkin Elmer사제)에 첨가하여, 약 1시간 실온에서 방치하고 웰에 고정화하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 방법에서 사용하는 고정화 메틸화 DNA 항체의 조제에 상당한다).
빵 효모 효모주 X2180-1A를 YPD 배지(1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6.0)로 탁도가 OD600 0.6-1.0이 될 때까지 배양하고, 10,000xg로 10분간 원심하여, 1×107의 효모 세포를 조제하였다. 조제한 효모 세포로부터, Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)에 기재되어 있는 바와 같은 일반적인 효모 게놈의 조제법을 이용하여 효모 게놈을 취득하였다.
조제한 효모 세포를, 버퍼 A(1M 소르비톨, 0.1M EDTA, pH 7.4)에 현탁하고, 0.1% 2-메르캅토 에탄올(최종 농도 14mM) 및 100U zymolase(10mg/ml)를 첨가하여, 용액이 투명해질 때까지 30℃로 1시간 교반하면서 인큐베이트하였다. 550xg로 10분간 원심하여 프로토플라스트를 회수 후, 버퍼 B(50mM Tris-HCl, pH7.4, 20mM EDTA)에 현탁하고 나서, 도데실황산나트륨을 1%(w/v)가 되도록 더한 후, 65℃로 30분간 인큐베이트하였다. 이어서, 체적비 2/5량의 5M CH3COOK를 첨가하여 혼화하고 나서 30분간 빙냉 후, 15,000xg로 30분간 원심하여 상청을 회수하였다. 회수한 상청에 체적비 1/10량의 3M CH3COONa와 등량인 이소프로판올을 더하여 잘 혼화하고, 15,000xg 4℃로 30분간 원심하여 얻어진 침전을 70% 에탄올로 린스하여 회수하였다. 침전을 건조시킨 후, 1ml의 TE 버퍼(10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)에 용해하고, 40μg/ml가 되도록 RNase A(Sigma사제)를 더하여 37℃로 1시간 인큐베이트하고, 이어서, 혼합액에 proteinase K(Sigma사제)를 500μg/ml 및 도데실황산나트륨을 1%(w/v)가 되도록 더한 후, 이것을 55℃로 약 16시간 진탕하였다. 진탕 종료 후, 이 혼합물을 페놀[1M Tris-HCl(pH 8.0)로 포화]·클로로포름 추출 처리하였다. 수층을 회수하여, 이것에 NaCl을 0.5N이 되도록 더한 후, 이것을 에탄올 침전 처리하여 생긴 침전을 회수하였다. 회수된 침전을 70% 에탄올로 린스함으로써, 게놈 DNA를 얻었다.
얻어진 효모 게놈 DNA로부터, 이하의 배열 번호 27 및 배열 번호 28로 표시되는 PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머(PF3 및 PR3) 및 반응 조건을 이용하여 PCR을 행함으로써, 공시 샘플로서 이용되는 DNA 프래그먼트(S, 배열 번호 29, Genbank Accession No. NC_001139 등으로 표시되는 효모 염색체 Ⅶ의 염기 번호 271743-272083에 상당하는 영역)를 증폭시켰다.
<PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머>
Figure pct00056
<DNA 프래그먼트>
Figure pct00057
PCR의 반응액으로서는, 주형으로 하는 게놈 DNA를 10ng과, 5μM의 상기 프라이머 용액 각 3μl와, each 2mM dNTP를 5μl와, 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.01% Gelatin)을 5μl와, 내열성 DNA 폴리머라아제(AmpliTaq Gold) 5U/μl를 0.25μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 이용하였다. 이 반응액을, 95℃로 10분간 보온한 후, 95℃로 20초간 다음에 58℃로 30초간 또한 72℃로 30초간을 1사이클로 하는 보온을 40사이클 행하는 조건으로 PCR을 행하였다.
PCR을 행한 후, 2% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 증폭을 확인하고, Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해 DNA 프래그먼트 S를 정제하였다.
DNA 프래그먼트 S에 대해, 이하의 용액을 조제하였다.
용액 A : DNA 프래그먼트 S 10ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 B : DNA 프래그먼트 S 1ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 C : DNA 프래그먼트 S TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
또, 얻어진 효모 게놈 DNA로부터, 이하의 배열 번호 32 및 배열 번호 33으로 표시되는 PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머(PF4 및 PR4) 및 반응 조건을 이용하여 PCR을 행함으로써, 공시 샘플로서 이용되는 DNA 프래그먼트(T, 배열 번호 34, Genbank Accession No. NC_001139 등으로 표시되는 효모 염색체 Ⅶ의 염기 번호 384569-384685에 상당하는 영역)를 증폭시켰다.
<PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머>
Figure pct00058
<DNA 프래그먼트>
Figure pct00059
PCR의 반응액으로서는, 주형으로 하는 게놈 DNA를 10ng과, 5μM의 상기 프라이머 용액 각 3μl와, each 2mM dNTP를 5μl와, 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.01% Gelatin)을 5μl와, 내열성 DNA 폴리머라아제(AmpliTaq Gold) 5U/μl를 0.25μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 이용하였다. 이 반응액을, 95℃로 10분간 보온한 후, 95℃로 20초간 다음에 58℃로 30초간 또한 72℃로 30초간을 1사이클로 하는 보온을 40사이클 행하는 조건으로 PCR을 행하였다.
PCR을 행한 후, 2% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 증폭을 확인하고, Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해 DNA 프래그먼트 T를 정제하였다.
DNA 프래그먼트 T에 대해, 이하의 용액을 조제하였다.
용액 A : DNA 프래그먼트 T 10ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 B : DNA 프래그먼트 T 1ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 C : TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
상기에 조제한 DNA 프래그먼트 S의 용액 A와 DNA 프래그먼트 T의 용액 A를, DNA 프래그먼트 S의 용액 B와 DNA 프래그먼트 T의 용액 B를, DNA 프래그먼트 S의 용액 C와 DNA 프래그먼트 T의 용액 C를 각각 혼합하여, 이하에 나타내는 DNA 프래그먼트 혼합 용액 MA∼MC를 각각 2연속으로 조제하였다.
용액 MA : 10ng/20μL TE 버퍼 용액
용액 MB : 1ng/20μL TE 버퍼 용액
용액 MC : TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
얻어진 각각의 용액을 20μL와, SssI methylase(NEB사제)를 0.5μl와, 10xNEBuffer2(NEB사제)를 5μl와, 3.2mM S-adenosyl methionine(NEB사제)을 0.5μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 조제하였다. 이 반응액을, 37℃로 30분간 인큐베이션하였다(이상, 본 발명 방법의 제1 공정에 상당한다).
배열 번호 35로 표시되는 목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 T'에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 36으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F4를 합성하여, 0.02μM의 Tris-HCl 버퍼(10mM) 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00060
<5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00061
또, 배열 번호 35로 표시되는 목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 T'의 마이너스 사슬에 대해 상보성에 의해 결합 가능한, 배열 번호 51, 배열 번호 52, 배열 번호 53, 및 배열 번호 54로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 카운터 올리고뉴클레오티드 C11, C12, C13 및 C14를 합성하여, 각각의 농도가 0.01μM인 TE 버퍼 용액을 조제하였다.
<카운터 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00062
얻어진 각각의 반응액에 대해, 이하의 처리를 실시하였다.
PCR 튜브에, 상기에서 조제한 반응액 40μL와, 상기의 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 상기의 카운터 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL와, 100mM MgCl2 용액 10μL와, 1mg/mL BSA 용액 10μL를 첨가하고, 또한 이 혼합물에 멸균 초순수를 더하여 액량을 100μL로 하고, 혼합하였다. 그 후, 본 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속히 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 다음에, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 37℃로 10분간 더 보온한 후, 실온으로 되돌려, 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 DNA 프래그먼트의 결합체의 형성을 촉진하였다(이상, 본 발명 방법의 제2 공정에 상당한다).
상기의 비오틴 표식 메틸사이토신 항체가 고정화된 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립에, 상기에서 조제한 DNA 프래그먼트의 반응액 100μL를 더하여, 실온에서 1시간 방치하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 피펫팅에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 방법의 제3 공정에 상당한다).
그 후, HRP 표식 FITC 항체 용액[Jackson ImmunoResearch Laboratories사제, 0.005μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]을 각 웰에 100μL의 비율로 첨가 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 각 웰을 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
기질(R&D사제, #DY999)을, 각 웰에 100μL의 비율로 첨가·혼합하고, 반응을 개시하였다.
약 60분간 실온에서 방치하고, 스톱 용액(2N H2SO4 수용액)을 각 웰에 50μL의 비율로 첨가하고, 반응을 정지하였다. 반응 정지 후 30분 이내에 450nm의 흡광도를 측정하였다(이상, 본 발명 방법의 제4 공정에 상당한다).
그 결과를 도 12에 나타내었다. 용액 MA 및 용액 MB에서는, 용액 MC에 비해 흡광도의 증가가 보였다. 또 그 강도는 DNA 프래그먼트의 농도에 의존하여 증가하였다.
본 실험에 있어서, 메틸사이토신 항체와, 메틸화된 DNA 프래그먼트와, 고정화한 5' 말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·선택하고, 복합체 중의 FITC를, 그 기능에 의해 정량·검출함으로써, DNA 프래그먼트의 검출·정량이 가능한 것이 명확해졌다.
실시예 13
시판의 메틸사이토신 항체(Aviva Systems Biology사제)를, 시판 비오틴화 키트(Biotin Labeling Kit-NH2, 도진도 화학 연구소제)를 이용하여, 카탈로그에 기재된 방법에 준하여 비오틴 표식하였다. 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체를 0.25μg/μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액으로 하여 냉장 보존하였다.
합성하여 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체의 0.5μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액을 조제하고, 이것을 각 100μL의 비율로 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립(Perkin Elmer사제)에 첨가하여, 약 1시간 실온에서 방치하고 웰에 고정화하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 방법에서 사용하는 고정화 메틸화 DNA 항체의 조제에 상당한다).
빵 효모주 X2180-1A를 YPD 배지(1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6.0)로 탁도가 OD600 0.6-1.0이 될 때까지 배양하고, 10,000xg로 10분간 원심하여, 1×107의 효모 세포를 조제하였다. 조제한 효모 세포로부터, Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)에 기재되어 있는 바와 같은 일반적인 효모 게놈의 조제법을 이용하여 효모 게놈을 취득하였다.
조제한 효모 세포를, 버퍼 A(1M 소르비톨, 0.1M EDTA, pH7.4)에 현탁하고, 0.1% 2-메르캅토 에탄올(최종 농도 14mM) 및 100U zymolase(10mg/ml)를 첨가하여, 용액이 투명해질 때까지 30℃로 1시간 교반하면서 인큐베이트하였다. 550xg로 10분간 원심하여 프로토플라스트를 회수 후, 버퍼 B(50mM Tris-HCl, pH 7.4, 20mM EDTA)에 현탁하고 나서, 도데실황산나트륨을 1%(w/v)가 되도록 더한 후, 65℃로 30분간 인큐베이트하였다. 이어서, 체적비 2/5량의 5M CH3COOK를 첨가하여 혼화하고 나서 30분간 빙냉 후, 15,000xg로 30분간 원심하여 상청을 회수하였다. 회수한 상청에 체적비 1/10량의 3M CH3COONa와 등량인 이소프로판올을 더하여 잘 혼화하고, 15,000xg 4℃로 30분간 원심하여 얻어진 침전을 70% 에탄올로 린스하여 회수하였다. 침전을 건조시킨 후, 1ml의 TE 버퍼(10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)에 용해하고, 40μg/ml가 되도록 RNase A(Sigma사제)를 더하여 37℃로 1시간 인큐베이트하고, 이어서, 혼합액에 proteinase K(Sigma사제)를 500μg/ml 및 도데실황산나트륨을 1%(w/v)가 되도록 더한 후, 이것을 55℃로 약 16시간 진탕하였다. 진탕 종료 후, 이 혼합물을 페놀[1M Tris-HCl(pH 8.0)로 포화]·클로로포름 추출 처리하였다. 수층을 회수하여, 이것에 NaCl을 0.5N이 되도록 더한 후, 이것을 에탄올 침전 처리하여 생긴 침전을 회수하였다. 회수된 침전을 70% 에탄올로 린스함으로써, 게놈 DNA를 얻었다.
얻어진 효모 게놈 DNA로부터, 이하의 배열 번호 27 및 배열 번호 28로 표시되는 PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머(PF3 및 PR3) 및 반응 조건을 이용하여 PCR을 행함으로써, 공시 샘플로서 이용되는 DNA 프래그먼트(S, 배열 번호 29, Genbank Accession No. NC_001139 등으로 표시되는 효모 염색체 Ⅶ의 염기 번호 271743-272083에 상당하는 영역)를 증폭시켰다.
<PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머>
Figure pct00063
<DNA 프래그먼트>
Figure pct00064
PCR의 반응액으로서는, 주형으로 하는 게놈 DNA를 10ng과, 5μM의 상기 프라이머 용액 각 3μl와, each 2mM dNTP를 5μl와, 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.01% Gelatin)을 5μl와, 내열성 DNA 폴리머라아제(AmpliTaq Gold) 5U/μl를 0.25μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 이용하였다. 이 반응액을, 95℃로 10분간 보온한 후, 95℃로 20초간 다음에 58℃로 30초간 또한 72℃로 30초간을 1사이클로 하는 보온을 40사이클 행하는 조건으로 PCR을 행하였다.
PCR을 행한 후, 2% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 증폭을 확인하고, Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해 DNA 프래그먼트 S를 정제하였다.
DNA 프래그먼트 S에 대해, 이하의 용액을 조제하였다.
용액 A : DNA 프래그먼트 S 10ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 B : DNA 프래그먼트 S 1ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 C : TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
또, 얻어진 효모 게놈 DNA로부터, 이하의 배열 번호 32 및 배열 번호 33으로 표시되는 PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머(PF4 및 PR4) 및 반응 조건을 이용하여 PCR을 행함으로써, 공시 샘플로서 이용되는 DNA 프래그먼트(T, 배열 번호 34, Genbank Accession No. NC_001139 등으로 표시되는 효모 염색체 Ⅶ의 염기 번호 384569-384685에 상당하는 영역)를 증폭시켰다.
<PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머>
Figure pct00065
<DNA 프래그먼트>
Figure pct00066
PCR의 반응액으로서는, 주형으로 하는 게놈 DNA를 10ng과, 5μM의 상기 프라이머 용액 각 3μl와, each 2mM dNTP를 5μl와, 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.01% Gelatin)을 5μl와, 내열성 DNA 폴리머라아제(AmpliTaq Gold) 5U/μl를 0.25μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 이용하였다. 이 반응액을, 95℃로 10분간 보온한 후, 95℃로 20초간 다음에 58℃로 30초간 또한 72℃로 30초간을 1사이클로 하는 보온을 40사이클 행하는 조건으로 PCR을 행하였다.
PCR을 행한 후, 2% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 증폭을 확인하고, Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해 DNA 프래그먼트 T를 정제하였다.
DNA 프래그먼트 T에 대해, 이하의 용액을 조제하였다.
용액 A : DNA 프래그먼트 T 10ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 B : DNA 프래그먼트 T 1ng/10μL TE 버퍼 용액
용액 C : TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
상기에 조제한 DNA 프래그먼트 S의 용액 A와 DNA 프래그먼트 T의 용액 A를, DNA 프래그먼트 S의 용액 B와 DNA 프래그먼트 T의 용액 B를, DNA 프래그먼트 S의 용액 C와 DNA 프래그먼트 T의 용액 C를 각각 혼합하여, 이하에 나타내는 DNA 프래그먼트 혼합 용액 MA∼MC를 각각 2연속으로 조제하였다.
용액 MA : 10ng/20μL TE 버퍼 용액
용액 MB : 1ng/20μL TE 버퍼 용액
용액 MC : TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
얻어진 각각의 용액을 20μL와, SssI methylase(NEB사제)를 0.5μl와, 10xNEBuffer2(NEB사제)를 5μl와, 3.2mM S-adenosyl methionine(NEB사제)을 0.5μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 조제하였다. 이 반응액을, 37℃로 30분간 인큐베이션하였다(이상, 본 발명 방법의 제1 공정에 상당한다).
배열 번호 30으로 표시되는 목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 S'에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 31로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F3을 합성하고, 또, 배열 번호 35로 표시되는 목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 T'에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 36으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F4를 합성하여, 각각의 농도가 0.02μM인 Tris-HCl 버퍼(10mM) 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00067
<5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00068
또, 배열 번호 30으로 표시되는 목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 S'의 마이너스 사슬에 대해 상보성에 의해 결합 가능한, 배열 번호 41, 배열 번호 42, 배열 번호 43, 배열 번호 44, 배열 번호 45, 배열 번호 46, 배열 번호, 47, 배열 번호 48, 배열 번호 49, 및 배열 번호 50으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 카운터 올리고뉴클레오티드 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, 및 C10을 합성하고, 또, 배열 번호 35로 표시되는 목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 T'의 마이너스 사슬에 대해 상보성에 의해 결합 가능한, 배열 번호 51, 배열 번호 52, 배열 번호 53 및 배열 번호 54로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 카운터 올리고뉴클레오티드 C11, C12, C13 및 C14를 합성하여, 각각의 농도가 0.01μM인 TE 버퍼 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00069
<카운터 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00070
얻어진 각각의 반응액에 대해, 이하의 처리를 실시하였다.
PCR 튜브에, 상기에서 조제한 반응액 40μL와, 상기의 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 상기의 카운터 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL와, 100mM MgCl2 용액 10μL와, 1mg/mL BSA 용액 10μL를 첨가하고, 또한 이 혼합물에 멸균 초순수를 더하여 액량을 100μL로 하고, 혼합하였다. 그 후, 본 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속히 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 다음에, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 37℃로 10분간 더 보온한 후, 실온으로 되돌려, 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 DNA 프래그먼트의 결합체의 형성을 촉진하였다(이상, 본 발명 방법의 제2 공정에 상당한다).
상기의 비오틴 표식 메틸사이토신 항체가 고정화된 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립에, 상기에서 조제한 DNA 프래그먼트의 반응액 100μL를 더하여, 실온에서 1시간 방치하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 피펫팅에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 방법의 제3 공정에 상당한다).
그 후, HRP 표식 FITC 항체 용액[Jackson ImmunoResearch Laboratories사제, 0.005μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]을 각 웰에 100μL의 비율로 첨가 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 각 웰을 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
기질(R&D사제, #DY999)을, 각 웰에 100μL의 비율로 첨가·혼합하고, 반응을 개시하였다.
약 60분간 실온에서 방치하고, 스톱 용액(2N H2SO4 수용액)을 각 웰에 50μL의 비율로 첨가하고, 반응을 정지하였다. 반응 정지 후 30분 이내에 450nm의 흡광도를 측정하였다(이상, 본 발명 방법의 제4 공정에 상당한다).
그 결과를 도 13에 나타내었다. 용액 MA 및 용액 MB에서는, 용액 MC에 비해 흡광도의 증가가 보였다. 또 그 강도는 DNA 프래그먼트의 농도에 의존하여 증가하였다.
본 실험에 있어서, 메틸사이토신 항체와, 메틸화된 DNA 프래그먼트와, 고정화한 5' 말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·선택하고, 복합체 중의 FITC를, 그 기능에 의해 정량·검출함으로써, DNA 프래그먼트의 검출·정량이 가능한 것이 명확해졌다.
실시예 14
시판의 메틸사이토신 항체(Aviva Systems Biology사제)를, 시판 비오틴화 키트(Biotin Labeling Kit-NH2, 도진도 화학 연구소제)를 이용하여, 카탈로그에 기재된 방법에 준하여 비오틴 표식하였다. 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체를 0.25μg/μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액으로 하여 냉장 보존하였다.
합성하여 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체의 0.5μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액을 조제하고, 이것을 각 100μL의 비율로 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립(Perkin Elmer사제)에 첨가하여, 약 1시간 실온에서 방치하고 웰에 고정화하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 방법에서 사용하는 고정화 메틸화 DNA 항체의 조제에 상당한다).
클론테크사로부터 구입된 인간 혈액 유래 게놈 DNA에 대해, 이하의 용액을 각각 2연속으로 조제하였다.
용액 A : 인간 혈액 유래 게놈 DNA 100ng/5μL TE 버퍼 용액
용액 B : 인간 혈액 유래 게놈 DNA 10ng/5μL TE 버퍼 용액
용액 C : 인간 혈액 유래 게놈 DNA 1ng/5μL TE 버퍼 용액
용액 D : TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
상기의 조제한 각각의 용액을 5μL와, 제한 효소 XspI를 10U와, XspI에 최적인 10×완충액(200mM Tris-HCl pH 8.5, 100mM MgCl2, 10mM Dithiothreitol, 1000mM KCl) 2μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 20μl로 한 것을 조제하였다. 이 반응액을, 37℃로 1시간 인큐베이션하였다.
얻어진 각각의 반응액을 20μL와, SssI methylase(NEB사제)를 0.5μl와, 10xNEBuffer2(NEB사제)를 5μl와, 3.2mM S-adenosyl methionine(NEB사제)을 0.5μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 조제하였다. 이 반응액을, 37℃로 30분간 인큐베이션하였다(이상, 본 발명 방법의 제1 공정에 상당한다).
인간 트랜스포손으로서 알려진 LINE1 영역에 설계된 배열 번호 37로 표시되는 목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 Z(Genbank Accession No. M80340 등으로 표시되는 염기 번호 115-386에 상당하는 영역)와 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 38로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F5를 합성하여, 0.02μM의 Tris-HCl 버퍼(10mM) 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00071
<5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00072
또, 배열 번호 39로 표시되는 목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 W의 마이너스 사슬과 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 55, 배열 번호 56, 배열 번호 57, 배열 번호 58, 및 배열 번호 59로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 카운터 올리고뉴클레오티드 C15, C16, C17, C18 및 C19를 합성하여, 각각의 농도가 0.01μM인 TE 버퍼 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00073
<카운터 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00074
얻어진 각각의 반응액에 대해, 이하의 처리를 실시하였다.
PCR 튜브에, 상기에서 조제한 반응액 40μL와, 상기의 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 상기의 카운터 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL와, 100mM MgCl2 용액 10μL와, 1mg/mL BSA 용액 10μL를 첨가하고, 또한 이 혼합물에 멸균 초순수를 더하여 액량을 100μL로 하고, 혼합하였다. 그 후, 본 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속히 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 다음에, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 37℃로 10분간 더 보온한 후, 실온으로 되돌려, 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 DNA 프래그먼트의 결합체의 형성을 촉진하였다(이상, 본 발명 방법의 제2 공정에 상당한다).
상기의 비오틴 표식 메틸사이토신 항체가 고정화된 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립에, 상기에서 조제한 DNA 프래그먼트의 반응액 100μL를 더하여, 실온에서 1시간 방치하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 피펫팅에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 방법의 제3 공정에 상당한다).
그 후, HRP 표식 FITC 항체 용액[Jackson ImmunoResearch Laboratories사제, 0.005μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]을 각 웰에 100μL의 비율로 첨가 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 각 웰을 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
기질(R&D사제, #DY999)을, 각 웰에 100μL의 비율로 첨가·혼합하고, 반응을 개시하였다.
약 9분간 실온에서 방치하고, 스톱 용액(2N H2SO4 수용액)을 각 웰에 50μL의 비율로 첨가하고, 반응을 정지하였다. 반응 정지 후 30분 이내에 450nm의 흡광도를 측정하였다(이상, 본 발명 방법의 제4 공정에 상당한다).
그 결과를 도 14에 나타내었다. 용액 A 및 용액 B 및 용액 C에서는, 용액 D에 비해 흡광도의 증가가 보였다. 또 그 강도는 DNA 프래그먼트의 농도에 의존하여 증가하였다.
본 실험에 있어서, 메틸사이토신 항체와, 메틸화된 DNA 프래그먼트와, 고정화한 5' 말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·선택하고, 복합체 중의 FITC를, 그 기능에 의해 정량·검출함으로써, DNA 프래그먼트의 검출·정량이 가능한 것이 명확해지며, 게놈 DNA의 검출·정량이 가능한 것이 명확해졌다.
실시예 15
시판의 메틸사이토신 항체(Aviva Systems Biology사제)를, 시판 비오틴화 키트(Biotin Labeling Kit-NH2, 도진도 화학 연구소제)를 이용하여, 카탈로그에 기재된 방법에 준하여 비오틴 표식하였다. 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체를 0.25μg/μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액으로 하여 냉장 보존하였다.
합성하여 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체의 0.5μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액을 조제하고, 이것을 각 100μL의 비율로 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립(Perkin Elmer사제)에 첨가하여, 약 1시간 실온에서 방치하고 웰에 고정화하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 방법에서 사용하는 고정화 메틸화 DNA 항체의 조제에 상당한다).
클론테크사로부터 구입된 인간 혈액 유래 게놈 DNA에 대해, 이하의 용액을 각각 2연속으로 조제하였다.
용액 A : 인간 혈액 유래 게놈 DNA 100ng/5μL TE 버퍼 용액
용액 B : 인간 혈액 유래 게놈 DNA 10ng/5μL TE 버퍼 용액
용액 C : 인간 혈액 유래 게놈 DNA 1ng/5μL TE 버퍼 용액
용액 D : TE 버퍼 용액(네거티브 컨트롤액)
상기의 조제한 각각의 용액을 5μL와, 제한 효소 MspI를 4U와, MspI에 최적인 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 7.5, 100mM MgCl2, 10mM Dithiothreitol, 500mM NaCl) 2μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 20μl로 한 것을 조제하였다. 이 반응액을, 37℃로 1시간 인큐베이션하였다.
얻어진 각각의 반응액을 20μL와, SssI methylase(NEB사제)를 0.5μl와, 10xNEBuffer2(NEB사제)를 5μl와, 3.2mM S-adenosyl methionine(NEB사제)을 0.5μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μl로 한 것을 조제하였다. 이 반응액을, 37℃로 30분간 인큐베이션하였다(이상, 본 발명 방법의 제1 공정에 상당한다).
인간 트랜스포손으로서 알려진 Alu 영역에 설계된 배열 번호 39로 표시되는 목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 W(Genbank Accession No. AF458110 등으로 표시되는 염기 번호 178-262에 상당하는 영역)와 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 40으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F6을 합성하여, 0.02μM의 Tris-HCl 버퍼(10mM) 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00075
<5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00076
또, 배열 번호 39로 표시되는 목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 W의 마이너스 사슬과 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 60 및 배열 번호 61로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 카운터 올리고뉴클레오티드 C20 및 C21을 합성하여, 각각의 농도가 0.01μM인 TE 버퍼 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00077
<카운터 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00078
얻어진 각각의 반응액에 대해, 이하의 처리를 실시하였다.
PCR 튜브에, 상기에서 조제한 반응액 40μL와, 상기의 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 상기의 카운터 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL와, 100mM MgCl2 용액 10μL와, 1mg/mL BSA 용액 10μL를 첨가하고, 또한 이 혼합물에 멸균 초순수를 더하여 액량을 100μL로 하고, 혼합하였다. 그 후, 본 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속히 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 다음에, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 37℃로 10분간 더 보온한 후, 실온으로 되돌려, 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 DNA 프래그먼트의 결합체의 형성을 촉진하였다(이상, 본 발명 방법의 제2 공정에 상당한다).
상기의 비오틴 표식 메틸사이토신 항체가 고정화된 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립에, 상기에서 조제한 DNA 프래그먼트의 반응액 100μL를 더하여, 실온에서 1시간 방치하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 피펫팅에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 방법의 제3 공정에 상당한다).
그 후, HRP 표식 FITC 항체 용액[Jackson ImmunoResearch Laboratories사제, 0.005μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]을 각 웰에 100μL의 비율로 첨가 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 각 웰을 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
기질(R&D사제, #DY999)을, 각 웰에 100μL의 비율로 첨가·혼합하고, 반응을 개시하였다.
약 8분간 실온에서 방치하고, 스톱 용액(2N H2SO4 수용액)을 각 웰에 50μL의 비율로 첨가하고, 반응을 정지하였다. 반응 정지 후 30분 이내에 450nm의 흡광도를 측정하였다(이상, 본 발명 방법의 제4 공정에 상당한다).
그 결과를 도 15에 나타내었다. 용액 A, 용액 B 및 용액 C에서는, 용액 D에 비해 흡광도의 증가가 보였다. 또 그 강도는 게놈 DNA의 농도에 의존하여 증가하였다.
본 실험에 있어서, 메틸사이토신 항체와, 메틸화된 DNA 프래그먼트와, 고정화한 5' 말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·선택하고, 복합체 중의 FITC를, 그 기능에 의해 정량·검출함으로써, DNA 프래그먼트의 검출·정량이 가능한 것이 명확해지며, 게놈 DNA의 검출·정량이 가능한 것이 명확해졌다.
실시예 16
혈청 샘플로서, 인간 혈액 유래 게놈 DNA(Human Genomic DNA, #636401, Clontech사)의 TE 버퍼 용액과 래트(Wistar Hannover)로부터 채취한 혈청의 혼합액을 이하와 같이 각각 4연속으로 조제하였다.
혈청 샘플 A : 인간 혈액 유래 게놈 DNA 10ng/10μL TE 버퍼 용액+래트 혈청 10μL
혈청 샘플 B : 인간 혈액 유래 게놈 DNA 1ng/10μL TE 버퍼 용액+래트 혈청 10μL
혈청 샘플 C : 인간 혈액 유래 게놈 DNA 0.1ng/10μL TE 버퍼 용액+래트 혈청 10μL
혈청 샘플 D : 인간 혈액 유래 게놈 DNA 0ng/10μL TE 버퍼 용액+래트 혈청 10μL(네커티브 컨트롤액)
상기에 조제한 혈청 샘플 A∼D에 대해, 이하에 나타내는 처리 1 또는 처리 2를 각각 2연속으로 행하였다.
처리 1 :
혈청 샘플 20μL와, 완충액(500mM Tris-HCl(pH 7.5), 100mM MgCl2, 10mM DTT, 1000mM NaCl)을 4μL와, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더하여 액량을 40μL로 하고, 혼합하였다. 그 후, 본 PCR 튜브를 95℃로 10분간 보온하고, 4℃로 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌렸다. 9100xg로 10분간 원심하고 나서 상청을 회수하였다.
처리 2 :
혈청 샘플 20μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate(pH 7.9), 100mM Mg(OAc)2, 5mM DTT, 660mM KOAc)을 4μL와, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더하여 액량을 40μL로 하고, 혼합하였다. 그 후, 본 PCR 튜브를 95℃로 10분간 보온하고, 4℃로 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌렸다. 9100xg로 10분간 원심하고 나서 상청을 회수하였다.
상기의 처리 1 또는 처리 2에 의해 조제한 각각의 용액을 20μL와, 제한 효소 MspI를 2U와, MspI에 최적인 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 7.5, 100mM MgCl2, 10mM Dithiothreitol, 500mM NaCl) 5μL를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μL로 한 것을 조제하였다. 당해 반응액을, 37℃로 1시간 인큐베이션하였다.
상기의 효소 처리에 의해 얻어진 용액 30μL와, SssI methylase(NEB사제)를 0.5μL와, 10xNEBuffer2(NEB사제)를 5μL와, 3.2mM S-adenosyl methionine(NEB사제)을 0.5μL를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μL로 한 것을 조제하였다. 이 반응액을, 37℃로 30분간 인큐베이션하였다.
인간 트랜스포손으로서 알려진 Alu 영역에 설계된 배열 번호 39로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 목적으로 하는 DNA 영역(W, 배열 번호 39, Genbank Accession No. AF458110으로 표시되는 염기 번호 178-262에 상당하는 영역)을 취득하기 위해 이용하는 특정 올리고뉴클레오티드로서, 목적으로 하는 DNA 영역 W의 플러스 사슬과 상보성에 의해 결합하는 배열 번호 40으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F1을 합성하여, 0.02μM의 Tris-HCl 버퍼(10mM) 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역>
Figure pct00079
<5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00080
상기에서 얻은 반응액 50μL와, 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL와, 100mM MgCl2 용액 10μL와, 1mg/mL BSA 용액 10μL를 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더하여 액량을 100μL로 하고, 혼합하였다. 그 후, 목적으로 하는 DNA 영역과 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드의 이중 사슬을 형성시키기 위해, 본 PCR 튜브를 95℃로 10분간 보온하고, 70℃까지 급속히 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 다음에, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 37℃로 10분간 더 보온한 후, 실온으로 되돌렸다.
시판의 메틸사이토신 항체(Aviva Systems Biology사제)를, 시판 비오틴화 키트(Biotin Labeling Kit-NH2, 도진도 화학 연구소제)를 이용하여, 프로토콜에 기재된 방법에 따라 비오틴 표식하였다. 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체를 0.25μg/μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH 7.4) 용액으로 하여 냉장 보존하였다.
상기의 열 처리에 의해 얻어진 반응액 100μL에, 상기의 비오틴 표식 메틸사이토신 항체 용액을 5배 희석해(0.05μg/μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH 7.4) 용액) 1μL를 첨가하여, 1시간 실온에서 방치하고, 목적으로 하는 DNA 영역과 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 비오틴 표식 메틸사이토신 항체로 이루어지는 검출 복합체를 형성시켰다.
상기에 얻어진 반응액을 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립(StreptaWell, #11645692001, Roche사)으로 옮기고, 약 60분간 실온에서 방치하여, 8웰 스트립에 목적으로 하는 DNA 영역과 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 비오틴 표식 메틸사이토신 항체로 이루어지는 검출 복합체를 비오틴-스트렙트아비딘 결합을 통해 고정화하였다. 그 후, 용액을 경사 분리로 제거하고, 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4·7H2O, 154mM NaCl pH 7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
그 후, HRP 표식 FITC 항체 용액[Jackson ImmunoResearch Laboratories사제, 0.005μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH 7.4) 용액]을 각 웰에 100μL의 비율로 첨가 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 각 웰을 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH 7.4)]를 첨가한 후, 이 버퍼를 경사 분리에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
기질(R&D사제, #DY999)을, 각 웰에 100μL의 비율로 첨가·혼합하고, 반응을 개시하였다.
약 30분간 실온에서 방치하고, 스톱 용액(2N H2SO4 수용액)을 각 웰에 50μL의 비율로 첨가하고, 반응을 정지하였다. 반응 정지 후 30분 이내에 450nm의 흡광도를 측정하고, 얻어진 측정치에 대해 2연속의 평균치를 산출하였다.
그 결과를 도 16 및 도 17에 나타내었다. 처리 1에서는 인간 혈액 유래 게놈 DNA의 용액 A(10ng), 용액 B(1ng) 및 용액 C(0.1ng)에서, 용액 D(0ng : 컨트롤 용액)에 비해 흡광도가 농도 의존적으로 증가하였다(도 16). 한편 처리 2에서는, 인간 혈액 유래 게놈 DNA의 용액 A(10ng)에서, 용액 D(0ng : 컨트롤 용액)에 비해 흡광도가 증가하였지만, 용액 B(1ng) 및 용액 C(0.1ng)에서, 흡광도의 증가는 보이지 않았다(도 17).
본 실험에 있어서, 고정화한 비오틴 표식 메틸사이토신 항체와, 메틸화된 DNA 프래그먼트와, 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·선택하고, 복합체 중의 FITC를, 그 기능에 의해 정량·검출함으로써, 혈청 중 인간 게놈 DNA를 감도 좋게 검출·정량하는 것이 가능한 것이 나타났다. 또 처리 2에 비해 처리 1에서는 혈청 중 인간 게놈 DNA가 감도 좋게 검출되었다.
실시예 17
혈청 샘플로서, 인간 혈액 유래 게놈 DNA(Human Genomic DNA, #636401, Clontech사)의 TE 버퍼 용액과 고진바이오사로부터 구입한 인간 혈청(개체별 Human Serum)의 혼합액을 이하와 같이 각각 2연속으로 조제하였다.
혈청 샘플 A : 인간 혈액 유래 게놈 DNA 4ng/10μL TE 버퍼 용액+인간 혈청 40μL
혈청 샘플 B : 인간 혈액 유래 게놈 DNA 2ng/10μL TE 버퍼 용액+인간 혈청 40μL
혈청 샘플 C : 인간 혈액 유래 게놈 DNA 1ng/10μL TE 버퍼 용액+인간 혈청 40μL
혈청 샘플 D : 인간 혈액 유래 게놈 DNA 0ng/10μL TE 버퍼 용액+인간 혈청 40μL(네커티브 컨트롤액)
상기에 조제한 혈청 샘플 A∼D에 대해, 이하에 나타내는 처리를 각각 2연속으로 행하였다.
PCR 튜브에 혈청 샘플 50μL와, 완충액(500mM Tris-HCl(pH 7.5), 100mM MgCl2, 10mM DTT, 1000mM NaCl)을 20μL와, 또한 당해 혼합액을 멸균 초순수를 더하여 액량을 100μL로 하고, 혼합하였다. 그 후, 본 PCR 튜브를 95℃로 10분간 보온하고, 4℃로 냉각한 후, 실온으로 되돌렸다. 이어서 9100xg로 10분간 원심하고 나서 상청 20μL를 회수하였다.
상기의 처리에 의해 조제한 용액을 20μL와, 제한 효소 MspI를 2U와, MspI에 최적인 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 7.5, 100mM MgCl2, 10mM Dithiothreitol, 500mM NaCl) 5μL를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μL로 한 것을 조제하였다. 당해 반응액을, 37℃로 1시간 인큐베이션하였다.
상기의 효소 처리에 의해 얻어진 용액 30μL와, SssI methylase(NEB사제)를 0.5μL와, 10xNEBuffer2(NEB사제)를 5μL와, 3.2mM S-adenosyl methionine(NEB사제)을 0.5μL를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μL로 한 것을 조제하였다. 이 반응액을, 37℃로 30분간 인큐베이션하였다.
인간 트랜스포손으로서 알려진 Alu 영역에 설계된 목적으로 하는 DNA 영역(W, 배열 번호 39, Genbank Accession No. AF458110으로 표시되는 염기 번호 178-262에 상당하는 영역)과 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 40으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F1을 합성하여, 0.02μM의 Tris-HCl 버퍼(10mM) 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역>
Figure pct00081
<5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00082
상기에서 얻은 반응액 50μL와, 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL와, 100mM MgCl2 용액 10μL와, 1mg/mL BSA 용액 10μL를 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더하여 액량을 100μL로 하고, 혼합하였다. 그 후, 목적으로 하는 DNA 영역과 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드의 이중 사슬을 형성시키기 위해, 본 PCR 튜브를 95℃로 10분간 보온하고, 70℃까지 급속히 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 다음에, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 37℃로 10분간 더 보온한 후, 실온으로 되돌렸다.
시판의 메틸사이토신 항체(Aviva Systems Biology사제)를, 시판 비오틴화 키트(Biotin Labeling Kit-NH2, 도진도 화학 연구소제)를 이용하여, 프로토콜에 기재된 방법에 준하여 비오틴 표식하였다. 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체를 0.25μg/μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH 7.4) 용액으로 하여 냉장 보존하였다.
상기의 열 처리에 의해 얻어진 반응액 100μL에, 상기의 비오틴 표식 메틸사이토신 항체 용액을 5배 희석해(0.05μg/μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH 7.4) 용액) 1μL를 첨가하여, 1시간 실온에서 방치하고, 목적으로 하는 DNA 영역과 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 비오틴 표식 메틸사이토신 항체로 이루어지는 검출 복합체를 형성시켰다.
상기에 얻어진 반응액을 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립(StreptaWell, #11645692001, Roche사)으로 옮기고, 1시간 실온에서 방치하여, 8웰 스트립에 목적으로 하는 DNA 영역과 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 비오틴 표식 메틸사이토신 항체로 이루어지는 검출 복합체를 비오틴-스트렙트아비딘 결합을 통해 고정화하였다. 그 후, 용액을 피펫팅으로 제거하고, 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
그 후, HRP 표식 FITC 항체 용액[Jackson ImmunoResearch Laboratories사제, 0.005μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH 7.4) 용액]을 각 웰에 100μL의 비율로 첨가 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 용액을 피펫팅으로 제거하고, 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4·7H2O, 154mM NaCl pH 7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
기질(R&D사제, #DY999)을, 각 웰에 100μL의 비율로 첨가·혼합하고, 반응을 개시하였다.
20분간 실온에서 방치하고, 스톱 용액(2N H2SO4 수용액)을 각 웰에 50μL의 비율로 첨가하고, 반응을 정지하였다. 반응 정지 후 30분 이내에 450nm의 흡광도를 측정하였다.
그 결과를 도 18에 나타내었다. 인간 혈액 유래 게놈 DNA의 용액 A(4ng), 용액 B(2ng) 및 용액 C(1ng)에서, 용액 D(0ng : 컨트롤 용액)에 비해 흡광도가 농도 의존적으로 증가하였다.
본 실험에 있어서, 금회 발명한 수법에 의해 추출된 DNA 샘플을 이용하여, 목적으로 하는 DNA 영역과 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 비오틴 표식 메틸사이토신 항체로 이루어지는 검출 복합체를 형성하고, 비오틴-스트렙트아비딘 결합을 통해 고정화함으로써 선택하고, 복합체 중의 FITC를, 그 기능에 의해 검출함으로써, 인간 혈청 중 인간 게놈 DNA의 검출·정량이 가능한 것이 명확해졌다.
실시예 18
혈청 샘플로서, 이하에 나타내는 인간 혈청을 이용하였다.
고진바이오사로부터 구입한 인간 혈청(개체별 Human Serum)
Lot No. :
N51438(정상자)
N51439(정상자)
N51441(정상자)
ProMedDx사로부터 구입한 인간 혈청(개체별 Human Serum)
Lot No. :
11171268(정상자, 56세, 남성)
11171292(정상자, 62세, 남성)
11171297(정상자, 67세, 남성)
11202510(정상자, 67세, 여성)
11202522(정상자, 64세, 여성)
11202527(정상자, 52세, 여성)
11202615(정상자, 75세, 여성)
11202618(정상자, 78세, 여성)
10958886(정상자, 56세, 남성)
10958979(정상자, 39세, 남성)
10958980(정상자, 45세, 남성)
10960268(정상자, 37세, 남성)
10960272(정상자, 50세, 남성)
10960276(정상자, 30세, 남성)
10960285(정상자, 39세, 남성)
11003457(정상자, 38세, 남성)
11003479(정상자, 51세, 남성)
11003480(정상자, 48세, 남성)
11324997(정상자, 59세, 남성)
11325001(정상자, 61세, 남성)
10325022(정상자, 61세, 남성)
10870623(유방암 환자, 33세, 여성)
10929521(유방암 환자, 55세, 여성)
10989644(유방암 환자, 45세, 여성)
11209430(유방암 환자, 80세, 여성)
10929514(유방암 환자, 57세, 여성)
10843055(유방암 환자, 59세, 여성)
10984680(유방암 환자, 64세, 여성)
10840414(폐암 환자, 54세, 여성)
10929506(폐암 환자, 55세, 남성)
11091955(폐암 환자, 76세, 여성)
11103346(폐암 환자, 66세, 여성)
11142322(폐암 환자, 62세, 여성)
11152564(폐암 환자, 67세, 남성)
11152571(폐암 환자, 67세, 남성)
11153198(폐암 환자, 69세, 여성)
11209435(폐암 환자, 61세, 남성)
11230621(폐암 환자, 71세, 여성)
11153192(폐암 환자, 59세, 남성)
10715942(폐암 환자, 64세, 남성)
10840422(폐암 환자, 78세, 여성)
10935547(전립선암 환자, 83세, 남성)
11000243(전립선암 환자, 78세, 남성)
11071226(전립선암 환자, 84세, 남성)
상기의 혈청 샘플에 대해, 이하에 나타내는 처리를 2연속으로 행하였다.
처리 1 :
PCR 튜브에 혈청 샘플 40μL와, 완충액(500mM Tris-HCl(pH 7.5), 100mM MgCl2, 10mM DTT, 1000mM NaCl)을 20μL와, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더하여 액량을 100μL로 하고, 혼합하였다. 그 후, 본 PCR 튜브를 95℃로 10분간 보온하고, 4℃로 냉각한 후, 실온으로 되돌렸다. 이어서 9100xg로 10분간 원심하고 나서 상청 20μL를 회수하였다.
상기의 처리에 의해 조제한 용액을 20μL와, 제한 효소 MspI를 2U와, MspI에 최적인 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 7.5, 100mM MgCl2, 10mM Dithiothreitol, 500mM NaCl) 5μL를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μL로 한 것을 조제하였다. 당해 반응액을, 37℃로 1시간 인큐베이션하였다.
상기의 효소 처리에 의해 얻어진 용액 30μL와, SssI methylase(NEB사제)를 0.5μL와, 10xNEBuffer2(NEB사제)를 5μL와, 3.2mM S-adenosyl methionine(NEB사제)을 0.5μL를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μL로 한 것을 조제하였다. 이 반응액을, 37℃로 30분간 인큐베이션하였다.
인간 트랜스포손으로서 알려진 Alu 영역에 설계된 목적으로 하는 DNA 영역(W, 배열 번호 39, Genbank Accession No. AF458110으로 표시되는 염기 번호 178-262에 상당하는 영역)과 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 40으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F6을 합성하여, 0.02μM의 Tris-HCl 버퍼(10mM) 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역>
Figure pct00083
<5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드>
Figure pct00084
상기에서 얻은 반응액 50μL와, 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol)을 10μL와, 100mM MgCl2 용액 10μL와, 1mg/mL BSA 용액 10μL를 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더하여 액량을 100μL로 하고, 혼합하였다. 그 후, 목적으로 하는 DNA 영역과 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드의 이중 사슬을 형성시키기 위해, 95℃로 10분간 보온하고, 70℃로 급속히 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 다음에, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 37℃로 10분간 더 보온한 후, 실온으로 되돌렸다.
시판의 메틸사이토신 항체(Aviva Systems Biology사제)를, 시판 비오틴화 키트(Biotin Labeling Kit-NH2, 도진도 화학 연구소제)를 이용하여, 프로토콜에 기재된 방법에 따라 비오틴 표식하였다. 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체를 0.25μg/μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH 7.4) 용액으로 하여 냉장 보존하였다.
상기의 열 처리에 의해 얻어진 반응액 100μL에, 상기의 비오틴 표식 메틸사이토신 항체 용액을 5배 희석해(0.05μg/μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH 7.4) 용액) 1μL를 첨가하여, 1시간 실온에서 방치하고, 목적으로 하는 DNA 영역과 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 비오틴 표식 메틸사이토신 항체로 이루어지는 검출 복합체를 형성시켰다.
상기에 얻어진 반응액을 스트렙트아비딘 피복 완료 8웰 스트립(StreptaWell, #11645692001, Roche사)으로 옮기고, 1시간 실온에서 방치하여, 8웰 스트립에 목적으로 하는 DNA 영역과 5' 말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 비오틴 표식 메틸사이토신 항체로 이루어지는 검출 복합체를 비오틴-스트렙트아비딘 결합을 통해 고정화하였다. 그 후, 용액을 피펫팅으로 제거하고, 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4·7H2O, 154mM NaCl pH 7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
그 후, HRP 표식 FITC 항체 용액[Jackson ImmunoResearch Laboratories사제, 0.005μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H2O, 154mM NaCl pH 7.4) 용액]을 각 웰에 100μL의 비율로 첨가 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 용액을 피펫팅으로 제거하고, 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4·7H2O, 154mM NaCl pH 7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
기질(R&D사제, #DY999)을, 각 웰에 100μL의 비율로 첨가·혼합하고, 반응을 개시하였다.
약 25분간 실온에서 방치하고, 스톱 용액(2N H2SO4 수용액)을 각 웰에 50μL의 비율로 첨가하고, 반응을 정지하였다. 반응 정지 후 30분 이내에 450nm의 흡광도를 측정하고, 얻어진 측정치에 대해 2연속의 평균치를 산출하였다.
한편, 상기의 효소 처리(MspI)에 의해 얻어진 용액 중의 DNA를 실시간 PCR에 의해 정량하였다.
농도 측정용 표준 시료로서 MspI 처리 인간 게놈 DNA 용액을 이하와 같이 조제하였다. 인간 혈액 유래 게놈 DNA(Human Genomic DNA, #636401, Clontech사)의 TE 버퍼 용액의 5ng/μL TE 버퍼 용액을 조제하고, 이 용액을 20μL와, 제한 효소 MspI를 2U와, MspI에 최적인 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 7.5, 100mM MgCl2, 10mM Dithiothreitol, 500mM NaCl) 5μL를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 50μL로 한 것을 각각의 처리에 대해 조제하였다. 당해 반응액을, 37℃로 1시간 인큐베이션하였다. 얻어진 반응액에 대해, TE 버퍼에 의한 희석에 의해, 10-5, 10-4, 10-3, 10-2, 10-1, 1, 10ng/5μL 용액을 조제하였다.
인간 트랜스포손으로서 알려진 Alu 영역에 설계된 목적으로 하는 DNA 영역(W, 배열 번호 39, Genbank Accession No. AF458110으로 표시되는 염기 번호 178-262에 상당하는 영역)을 증폭시켜 실시간 PCR로 정량하기 위해 배열 번호 62로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머(F) 및 배열 번호 63으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머(R)를 설계하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역>
Figure pct00085
<포워드 프라이머>
Figure pct00086
<리버스 프라이머>
Figure pct00087
PCR의 반응액으로서는, 주형으로 하는 상기에 조제한 MspI 처리 인간 게놈 DNA 용액 5μL 혹은 상기에 조제한 농도 측정용 표준 시료와, 배열 번호 62 및 배열 번호 63으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 프라이머의 5μM 용액을 각각 1.5μL와, SYBR® Green I(Lonza사)를 0.1x분과, each 2mM dNTP를 2.5μL와, 10×PCR 완충액(100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.01% Gelatin)을 2.5μL와, 내열성 DNA 폴리머라아제(AmpliTaq Gold, 5U/μL, ABI사)를 0.125μL를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더하여 액량을 25μL로 한 것을 이용하였다. 실시간 PCR은, Mx3005P(Stratagene사)를 이용하여 실시하였다. 당해 반응액을, 95℃로 10분간 보온한 후, 95℃로 30초간, 61℃로 30초간, 72℃로 45초간을 1사이클로 하여 40사이클 반복함으로써, 목적으로 하는 DNA 영역을 증폭시켰다. 당해 실시간 PCR의 결과에 의해, 혈청 샘플 중의 DNA를 정량하였다.
그 결과를 도 19 및 도 20에 나타내었다. 본 수법에 의한 측정치와, 실시간 PCR에 의해 정량한 값을 비교한 바, 상관이 있는 것이 나타났다(상관계수 : R=0.62)(도 19). 또, 57세 이하의 인간 혈청 샘플에 대해 정량한 결과를, 암 환자와 정상자로 비교한 바, 정상자와 비교하여 암 환자에서는 혈청 중 DNA 농도가 상승하고 있는 것이 나타났다(도 20).
본 실험에 있어서, 메틸사이토신 항체와, 메틸화된 DNA 프래그먼트와, 5' 말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·선택하고, 복합체 중의 메틸사이토신 항체를, 그 기능에 의해 검출함으로써, 인간 혈청 중 유리 DNA를 감도 좋게 검출·정량하는 것이 가능한 것이 나타났다. 또, 57세 이하의 암 환자와 정상자에서 혈청 중 DNA 농도가 상이하며, 또한 본 수법에 의해 간편하게 그 차이를 검출할 수 있는 것이 나타났다.
본 발명에 의해, 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA를 간편하게 정량 또는 검출하는 방법을 제공하는 것이 가능해진다. 또, 피험자 유래의 검체(바람직하게는 혈청)를 이용하여, 당해 검체에서의 결과와 정상자 유래의 검체에서의 결과의 비교에 의거하여 암 환자 유래의 검체를 선발하는 방법 등을 제공하는 것이 가능해진다.
배열표 프리 텍스트
배열 번호 17∼63
설계된 올리고뉴클레오티드
SEQUENCE LISTING <110> Sumitomo Chemical Co., Ltd. <120> Method for determining or detecting DNA <130> S21066WO01 <150> JP2008-152619 <151> 2008-06-11 <160> 63 <210> 1 <211> 2661 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 acagacatgt gccaccatgc ccagctaatt ttttgtttgt ttgtttgttt gtttgtattt 60 ttagtagaga tggggttttg ccatgttggc caggctggtc tcgaactcct gacctcgaat 120 gataatgatc cgccgcttgg cctccaaagt gctaggatta caggtgtgag ccactgcgcc 180 aggcctgggc actttcttta gtagtttgag gagcaacatt tttgacagtg tccttctgct 240 caagattcaa gatcccagat aaaattaaac catctagaga gatggcttga ttggccaaac 300 ctggatctca tgaccacttc ttgaagtggg taagtctcat aaatgctcag tccttccact 360 atgcaactga gtggggtggg tgggaagccc ctcaaaggaa aatccggttg ttcttactag 420 aaagaaaagg aaaatggatg tgaggcagtc aaaatcagca gaggtccacc acaccaccaa 480 aatgtggtga ttaaatatgg agagacagag actaacagag gtatgtgaat attgaagtat 540 gtctggacaa tagcccaatg atgagaccaa taaaatggtt accaaaatct ggttttgagt 600 agtagtgtta aatcagacca tttagtaacc attttttgtt gcaaagtttc tagcactgcc 660 caaaccctga 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gtctcaggat gtgtgttccg ttttgttctt tccccttaac 1560 gctccctgtg caacgtgtct ggggggagga gggcagggac gggagagagg gaggggcaga 1620 ggcgaggagc tgtccgcctt gcacgtttcc aatcgcatta cgtgaacaaa tagctgaggg 1680 gcggccgggc cagaacggct tgtgtaactt tgcaaacgtg ccagaaagtt taaatctctc 1740 ctccttcctt cactccagac actgcccgct ctccgggact gccgcgcggc tccccgttgc 1800 cttccaggac tgagaaaggg gaaagggaag ggtgccacgt ccgagcagcc gccttgactg 1860 gggaagggtc tgaatcccac ccttggcatt gcttggtgga gactgagata cccgtgctcc 1920 gctcgcctcc ttggttgaag atttctcctt ccctcacgtg atttgagccc cgtttttatt 1980 ttctgtgagc cacgtcctcc tcgagcgggg tcaatctggc aaaaggagtg atgcgcttcg 2040 cctggaccgt gctcctgctc gggcctttgc agctctgcgc gctagtgcac tgcgcccctc 2100 ccgccgccgg ccaacagcag cccccgcgcg agccgccggc ggctccgggc gcctggcgcc 2160 agcagatcca atgggagaac aacgggcagg tgttcagctt gctgagcctg ggctcacagt 2220 accagcctca gcgccgccgg gacccgggcg ccgccgtccc tggtgcagcc aacgcctccg 2280 cccagcagcc ccgcactccg atcctgctga tccgcgacaa ccgcaccgcc gcggcgcgaa 2340 cgcggacggc cggctcatct 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accgttggcc ccgctcctat ggggcagcag ggaccgacgt cagcagggtg 240 gggcgggcac ccgagtggta tgccccgccc tgccccgcct gcccgccctg gtggccgtct 300 gggggcgaca agtcctgaga gaaccagacg gaagcgcgct gggactgaca cgtggacttg 360 ggcggtgctg cccgggtggg tcagcctggg ctgggaggca gccccgggac acagctgtgc 420 ccacgccgtc tgagcacccc aagcccgatg cagccacccc cagacgaggc ccgcagggac 480 atggccgggg acacccagtg gtccaggtgt ggcgggggtg aggggagggg gggtgggagc 540 ggtggagatg gggccgtggg gagggagctg agatactgcc acgtgggacg atgctaggtg 600 gggagggctg agctgggcgg gctcctctgg ctgtggggcc ccctgtgttc cttgtgggag 660 gtggaaggaa gtgagtgccc tgtccttcct ccctgccatg agattccagg accggacctg 720 gcaagtgccc tatcccagcc agtgttcctg gggctcttcc aggcagggct atgttcccca 780 ggccaggggc attgtcctgg acagtcagga ggcatacccc tcgccaggtg gaaccaccct 840 gtgtatgcat gaccctgaca agcaggcgcc aggacagtca ggaggccag 889 <210> 4 <211> 863 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gttgttgggt gtgaatggag aactgtgggc cctccccgac accttccagc gggacggcaa 60 cgggggccca gggggtgggc gccatcaacc ccgtcccacc gccaggacgg 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<223> Designed oligonucleotide <400> 17 ctcagcaccc aggcggcc 18 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 18 ctggccaaac tggagatcgc 20 <210> 19 <211> 386 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 19 ctcagcaccc aggcggccgc gatcatgagg cgcgagcggc gcgcgggctg ttgcagagtc 60 ttgagcgggt ggcacaccgc gatgtagcgg tcggctgtca tgactaccag catgtaggcc 120 gacgcaaaca tgccgaacac ctgcaggtgc ttcaccacgc ggcacagcca gtcggggccg 180 cggaagcggt aggtgatgtc ccagcacatt tgcggcagca cctggaagaa tgccacggcc 240 aggtcggcca ggctgaggtg tcggatgaag aggtgcatgc gggacgtctt gcgcggcgtc 300 cggtgcagag ccagcagtac gctgctgttg cccagcacgg ccaccgcgaa agtcaccgcc 360 agcacggcga tctccagttt ggccag 386 <210> 20 <211> 386 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 20 ctcagcaccc aggcggccgc gatcatgagg cgcgagcggc gcgcgggctg ttgcagagtc 60 ttgagcgggt ggcacaccgc gatgtagcgg tcggctgtca tgactaccag catgtaggcc 120 gacgcaaaca tgccgaacac ctgcaggtgc ttcaccacgc ggcacagcca gtcggggccg 180 cggaagcggt aggtgatgtc ccagcacatt tgcggcagca cctggaagaa tgccacggcc 240 aggtcggcca ggctgaggtg tcggatgaag aggtgcatgc gggacgtctt gcgcggcgtc 300 cggtgcagag ccagcagtac gctgctgttg cccagcacgg ccaccgcgaa agtcaccgcc 360 agcacggcga tctccagttt ggccag 386 <210> 21 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 21 ctggccaaac tggagat 17 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 22 tgagctccgt agggcgtcc 19 <210> 23 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 23 gcgccgggtc cgggccc 17 <210> 24 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 24 gcgccgggtc cgggcccgat gcgttggcgg gccagggctc cgagaacgag gcgttgtcca 60 tctcaacgag ggcagaggag ccggcgacct ggcgtccccc aaggacgccc tacggagctc 120 a 121 <210> 25 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 25 gcgccgggtc cgggcccgat gcgttggcgg gccagggctc cgagaacgag gcgttgtcca 60 tctcaacgag ggcagaggag ccggcgacct ggcgtccccc aaggacgccc tacggagctc 120 a 121 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 26 gacaacgcct cgttctcgg 19 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 27 aggtgagcta cgtgtgtttg g 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 28 agacatgtgc tcacgtacgg t 21 <210> 29 <211> 391 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 29 aggtgagcta cgtgtgtttg ggcgtcgtgc actggctcac ttgtacgcgc agaaatggca 60 gcttgtacga ttggtgaccc gccttttcga cactggaccg ctatggacgt ggcggcggtg 120 tggcggcggc tcaatgacct gtggcgcccg tttgtggcgt gcgatagtcg agccgcctgt 180 cacgtgcgcg gccgccctgc tccgtttgac gcgatgcata gcatgcgacc acccagtaat 240 catactgctg acgctattgg tcacgtggtt atggcagctg ctgttgactg cggtggcgtc 360 ccgtttccac accgtacgtg agcacatgtc t 391 <210> 30 <211> 391 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 30 aggtgagcta cgtgtgtttg ggcgtcgtgc actggctcac ttgtacgcgc agaaatggca 60 gcttgtacga ttggtgaccc gccttttcga cactggaccg ctatggacgt ggcggcggtg 120 tggcggcggc tcaatgacct gtggcgcccg tttgtggcgt gcgatagtcg agccgcctgt 180 cacgtgcgcg gccgccctgc tccgtttgac gcgatgcata gcatgcgacc acccagtaat 240 catactgctg acgctattgg tcacgtggtt atggcagctg ctgttgactg cggtggcgtc 360 ccgtttccac accgtacgtg agcacatgtc t 391 <210> 31 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 31 ctggccaaac tggagat 17 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 32 ggacctgtgt ttgacgggta t 21 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 33 agtacagatc tggcgttctc g 21 <210> 34 <211> 117 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 34 ggacctgtgt ttgacgggta taacactaag ttgcgcaatt tgctgtattg cgaaatccgc 60 ccggacgata tcactcttga gcgcatgtgc cgtttccgag aacgccagat ctgtact 117 <210> 35 <211> 117 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 35 ggacctgtgt ttgacgggta taacactaag ttgcgcaatt tgctgtattg cgaaatccgc 60 ccggacgata tcactcttga gcgcatgtgc cgtttccgag aacgccagat ctgtact 117 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 36 agtacagatc tggcgttctc g 21 <210> 37 <211> 271 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 37 tagggagtgc cagacagtgg gcgcaggcca gtgtgtgtgc gcaccgtgcg cgagccgaag 60 cagggcgagg cattgcctca cctgggaagc gcaaggggtc agggagttcc ctttctgagt 120 caaagaaagg ggtgacggtc gcacctggaa aatcgggtca ctcccacccg aatattgcgc 180 ttttcagacc ggcttaagaa acggcgcacc acgagactat atcccacacc tggctcggag 240 ggtcctacgc ccacggaatc tcgctgattg c 271 <210> 38 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 38 ctggccaaac tggagat 17 <210> 39 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 39 cgggcgcggt ggctcacgcc tgtaatccca gcactttggg aggccgaggt gggcggatca 60 cgaggtcagg agatcgagac catcc 85 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 40 ggatggtctc gatctcctga c 21 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 41 aggtgagcta cgtgtgtttg g 21 <210> 42 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 42 gcgtcgtgca ctggctcact tgtacgcgca 30 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 43 cttgtacgat tggtgacccg ccttttcgac 30 <210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 44 actggaccgc tatggacgtg gcggcggtgt 30 <210> 45 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 45 ggcggcggct caatgacctg tggcgcccgt 30 <210> 46 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 46 ttgtggcgtg cgatagtcga gccgcctgtc 30 <210> 47 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 47 acgtgcgcgg ccgccctgct ccgtt 25 <210> 48 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 48 tgacgcgatg catagcatgc gaccacccag 30 <210> 49 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 49 actgctgacg ctattggtca cgtggttatg 30 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 50 ctgctgttga ctgcggtggc gtcccgtttc 30 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 51 ggacctgtgt ttgacgggta t 21 <210> 52 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 52 aacactaagt tgcgcaattt gctgt 25 <210> 53 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 53 attgcgaaat ccgcccggac gatat 25 <210> 54 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 54 cactcttgag cgcatgtgcc gtttc 25 <210> 55 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 55 cagtgtgtgt gcgcaccgtg cgcgagccga 30 <210> 56 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 56 ggcgaggcat tgcctcacct gggaagcgca 30 <210> 57 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 57 ggtgacggtc gcacctggaa aatcgggtca 30 <210> 58 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 58 acccgaatat tgcgcttttc agaccggctt 30 <210> 59 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 59 tcggagggtc ctacgcccac ggaatctcgc 30 <210> 60 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 60 cgggcgcggt ggctcacgcc tgtaatccca 30 <210> 61 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 61 tttgggaggc cgaggtgggc ggatcacgag 30 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 62 ggtggctcac gcctgtaatc 20 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 63 ggatggtctc gatctcctga c 21

Claims (17)

  1. 검체 중에 포함되는 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA를 정량 또는 검출하는 방법으로서,
    (1) 목적으로 하는 DNA 영역을 검출하고자 하는 DNA를 검체로부터 조제하는 제1 공정,
    (2) 제1 공정에서 조제된 DNA를 DNA 메틸화 효소로 처리하는 제2 공정,
    (3) 제2 공정에서 처리된 DNA로부터, 단일 사슬 메틸화 DNA를 조제하고, 이 단일 사슬 메틸화 DNA에 검출 올리고뉴클레오티드를 결합시켜 피검 DNA 복합체를 취득하는 제3 공정,
    (4) 제3 공정에서 취득한 피검 DNA 복합체에 고정화 메틸화 DNA 항체를 결합시켜 검출 복합체를 취득하는 제4 공정, 및
    (5) 제4 공정에서 얻어진 검출 복합체에 포함되는 검출 올리고뉴클레오티드를 그 식별 기능에 의해 정량 또는 검출함으로써, 상기 단일 사슬 DNA 중의 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA를 정량 또는 검출하는 제5 공정을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    제3 공정에서 피검 DNA 복합체를 취득할 때에 카운터 올리고뉴클레오티드를 첨가하는, 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    고정화 메틸화 DNA 항체가 메틸사이토신 항체인, 방법.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    DNA 메틸화 효소가 사이토신메틸화 효소 또는 Sss I 메틸라아제인, 방법.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    검체 중에 포함되는 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA가, RNA로부터 역전사 효소에 의해 생성된 DNA에 있어서의 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA인, 방법.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    검체가 하기 중 어느 하나의 생물 유래 검체인, 방법.
    (a) 포유동물 유래의 혈액, 체액, 분뇨, 체분비물, 세포 용해액 또는 조직 용해액,
    (b) 포유동물 유래의 혈액, 체액, 분뇨, 체분비물, 세포 용해액 및 조직 용해액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나에서 추출된 DNA,
    (c) 포유동물 유래의 조직, 세포, 조직 용해액 및 세포 용해액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나에서 추출된 RNA를 주형으로 하여 제작된 DNA,
    (e) 세균, 진균 또는 바이러스로부터 추출된 DNA, 또는
    (f) 세균, 진균 또는 바이러스로부터 추출된 RNA를 주형으로 하여 제작된 DNA.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 공정에서 취득한 상기 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA가, 목적으로 하는 DNA 영역을 인식 절단 부위로 하지 않는 제한 효소로 미리 소화 처리되어 이루어지는 DNA, 합성 올리고뉴클레오티드, 또는 미리 정제되어 이루어지는 DNA인, 방법.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    검출 올리고뉴클레오티드의 식별 기능이 하기 중 어느 하나의 식별 기능인, 방법.
    (a) FITC의 형광 검출, 또는
    (b) FITC 항체에 의한 검출.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    검출 올리고뉴클레오티드가, 인간 게놈 중의 반복 배열, 중복 유전자 또는 위(僞)유전자의 염기 배열 혹은 그 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 염기 배열로 이루어지는, 방법.
  10. 청구항 9에 있어서,
    인간 게놈 중의 반복 배열이 LINE 또는 SINE인, 방법.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    검출 올리고뉴클레오티드가, 이하에 나타내어지는 어느 하나의 염기 배열과 상보적으로 결합할 수 있는 염기 배열로 이루어지는, 방법.
    (1) 배열 번호 37로 표시되는 염기 배열 또는 그것과 80% 이상의 배열 동일성을 갖는 염기 배열,
    (2) 배열 번호 37로 표시되는 염기 배열의 상보 배열 또는 그것과 80% 이상의 배열 동일성을 갖는 염기 배열,
    (3) 배열 번호 39로 표시되는 염기 배열 또는 그것과 80% 이상의 배열 동일성을 갖는 염기 배열, 또는
    (4) 배열 번호 39로 표시되는 염기 배열의 상보 배열 또는 그것과 80% 이상의 배열 동일성을 갖는 염기 배열.
  12. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    검출 올리고뉴클레오티드가, 이하에 나타내어지는 어느 하나의 염기 배열로 이루어지는, 방법.
    (1) 배열 번호 38로 표시되는 염기 배열 또는 그것과 80% 이상의 배열 동일성을 갖는 염기 배열,
    (2) 배열 번호 38로 표시되는 염기 배열의 상보 배열 또는 그것과 80% 이상의 배열 동일성을 갖는 염기 배열,
    (3) 배열 번호 40으로 표시되는 염기 배열 또는 그것과 80% 이상의 배열 동일성을 갖는 염기 배열, 또는
    (4) 배열 번호 40으로 표시되는 염기 배열의 상보 배열 또는 그것과 80% 이상의 배열 동일성을 갖는 염기 배열.
  13. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 공정에서 검체로부터 DNA를 조제하기 위한 DNA 추출 조작에 있어서 이용되는 용액 중의 나트륨염의 농도가, 100mM 이상 1000mM 이하인, 방법.
  14. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 공정에서 검체로부터 DNA를 조제하기 위한 DNA 추출 조작에 있어서 이용되는 용액 중의 나트륨염의 농도가, 100mM 이상 200mM 이하인, 방법.
  15. 암 환자 유래의 검체를 선발하는 방법이며, 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 피험자 유래의 검체를 이용하여 정량 또는 검출된 DNA의 정량 결과 또는 검출 결과와, 그 방법에 의해 정상자 유래의 검체를 이용하여 정량 또는 검출된 DNA의 정량 결과 또는 검출 결과의 차이가 유의하면, 피험자 유래의 검체를 암 환자 유래의 검체로서 평가하고, 당해 평가의 결과에 의거하여 암 환자 유래의 검체를 특정하는 공정을 포함하는, 방법.
  16. 청구항 15에 있어서,
    검체가 포유동물 유래의 혈청인, 방법.
  17. 청구항 15 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서,
    목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 DNA가, 포유동물 유래의 혈청 중의 목적으로 하는 DNA 영역을 갖는 유리(遊離) DNA인, 방법.
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