KR20100015873A - Ｄｎａ 메틸화 측정 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 생물 유래 검체에 포함되는 게놈 DNA 중의 목적으로 하는 DNA 영역에서의 메틸화된 DNA의 함량을 측정하는 방법 등에 관한 것이다.
Description
본 발명은, 생물 유래 검체(檢體)에 포함되는 게놈 DNA 중의 목적으로 하는 DNA 영역에서의 메틸화된 DNA의 함량을 측정하는 방법 등에 관한 것이다.
생물 유래 검체에 포함되는 게놈 DNA 중의 목적으로 하는 DNA 영역에서의 DNA의 메틸화 상태를 평가하기 위한 방법으로서는, 예를 들면, 게놈 DNA 중의 목적으로 하는 DNA 영역에서의 메틸화된 DNA의 함량을 측정하는 방법이 있다(예를 들면, Nucleic Acids Res. 1994 Aug 11;22(15):2990-7, 및 Proc Natl Acad Sci USA. 1997 Mar 18;94(6):2284-9 참조). 당해 측정 방법에서는, 우선, 게놈 DNA 유래의 DNA 시료로부터, 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 DNA를 추출할 필요가 있어, 추출 조작이 번잡하다.
또, 추출된 DNA의 목적 영역에 있어서의 메틸화된 DNA의 함량을 측정하는 방법으로서는, 예를 들면, (1) 아황산염 등을 이용하여 당해 DNA를 수식한 후, DNA 폴리머라아제에 의한 DNA 합성의 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction ; 이하, PCR로 표기하는 경우도 있다)에 제공함으로써 목적 영역을 증폭시키는 방법, (2) 메틸화 감수성 제한 효소를 이용하여 당해 DNA를 소화(消化)한 후, PCR에 제공함으로써, 목적 영역을 증폭시키는 방법 등이 알려져 있다. 이들의 어떠한 방법이라 도, 메틸화의 검출을 위한 DNA의 수식 및 그 후의 생성물의 정제, PCR을 위한 반응계의 조제, DNA의 증폭의 확인 등에 수고를 요한다.
본 발명은, 생물 유래 검체에 포함되는 게놈 DNA 중의 목적으로 하는 DNA 영역에서의 메틸화된 DNA의 함량을 간편하게 측정하는 방법 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.
즉, 본 발명은,
1. 생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA가 갖는, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 검출 혹은 정량하는 방법으로서,
(1) 생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA 유래의 DNA 시료에 포함되는 이중 가닥(double-stranded) DNA를 단일 가닥(single-stranded) DNA로 분리하는 제1 공정,
(2) (i) 제1 공정에서 분리된 단일 가닥 DNA, (ii) 메틸화 DNA 항체, 및 (iii) 상기의 메틸화 DNA 항체와 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA의 결합을 저해하지 않고 또한 상기의 단일 가닥 DNA와 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드(이하, 본 올리고뉴클레오티드로 표기하는 경우도 있다)를 혼합함으로써 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와, 메틸화 DNA 항체와, 상기의 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성시키는 동시에 혹은 형성시킨 후, 당해 복합체를 분리하는 제2 공정, 및
(3) 분리된 복합체에 포함되는 상기의 메틸화 DNA 항체, 또는 상기의 올리고뉴클레오티드를, 당해 메틸화 DNA 항체 또는 당해 올리고뉴클레오티드가 갖는, 검출에 이용할 수 있는 식별 기능에 의거하여 검출 혹은 정량함으로써, 생물 유래 검체 중에 포함되는 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 검출 혹은 정량하는 제3 공정을 갖는 것을 특징으로 하는 방법(이하, 본 발명 측정 방법으로 표기하는 경우도 있다) ;
2. 제2 공정에서 혼합되는, 메틸화 DNA 항체와 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA 중에 존재하는 메틸화된 염기의 결합을 저해하지 않는 올리고뉴클레오티드로서, 2종류 이상의 올리고뉴클레오티드가 이용되는 것을 특징으로 하는 전항 1에 기재된 방법 ;
3. 제2 공정에서 형성되는 복합체, 또는 제2 공정의 복합체를 형성시키는 과정에서 생기는 제1 공정에서 분리된 단일 가닥 DNA와, 메틸화 DNA 항체와 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA 중에 존재하는 메틸화된 염기의 결합을 저해하지 않는 올리고뉴클레오티드의 결합체를 2가 양이온을 함유하는 반응계 중에서 형성시키는 것을 특징으로 하는 전항 1에 기재된 방법 ;
4. 2가 양이온이 마그네슘 이온인 것을 특징으로 하는 전항 3에 기재된 방법 ;
5. 제2 공정에 있어서의 복합체의 분리 조작으로서, 형성된 복합체에 포함되는 메틸화 DNA 항체를 지지체에 결합시키는 공정을 갖는 것을 특징으로 하는 전항 1 내지 4 중 어느 한 항에 기재된 방법 ;
6. 제2 공정에 있어서의 복합체의 분리 조작으로서, 형성된 복합체에 포함되는 상기의 올리고뉴클레오티드를 지지체에 결합시키는 공정을 갖는 것을 특징으로 하는 전항 1 내지 4 중 어느 한 항에 기재된 방법 ;
7. 제1 공정의 종료 직후부터 제3 공정의 개시 직전까지의 사이에, 제1 공정에서 분리된 단일 가닥 DNA를, 적어도 1종류의 단일 가닥 DNA를 소화할 수 있는 메틸화 감수성 제한 효소에 의해 소화하는 공정을 추가적으로 갖는 것을 특징으로 하는 전항 1 내지 6 중 어느 한 항에 기재된 방법 ;
8. 제1 공정의 종료 직후부터 제3 공정의 개시 직전까지의 사이에, (i) 제1 공정에서 분리된 단일 가닥 DNA, 및 적어도 1종류의 메틸화 감수성 제한 효소의 인식 배열을 그 일부로서 갖는 마스킹용 올리고뉴클레오티드를 혼합하는 공정, 및 (ii) 이전 공정에 의해 얻어진 혼합물(중에 존재하는 목적으로 하는 DNA 영역에서 DNA가 메틸화되어 있지 않은 단일 가닥 DNA)을 상기의 메틸화 감수성 제한 효소에 의해 소화하는 공정을 추가적으로 갖는 것을 특징으로 하는 전항 1 내지 6 중 어느 한 항에 기재된 방법 ;
9. 적어도 1종류의 단일 가닥 DNA를 소화할 수 있는 메틸화 감수성 제한 효소가, 단일 가닥 DNA를 소화할 수 있는 메틸화 감수성 제한 효소인 HhaI인 것을 특징으로 하는 전항 7에 기재된 방법 ;
10. 적어도 1종류의 메틸화 감수성 제한 효소가, 메틸화 감수성 제한 효소인 HpaII 또는 HhaI인 것을 특징으로 하는 전항 8에 기재된 방법 ;
11. 메틸화 DNA 항체가, 메틸사이토신 항체인 것을 특징으로 하는 전항 1 내지 10 중 어느 한 항에 기재된 방법 ;
12. 생물 유래 검체가, 포유동물의 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 전항 1 내지 11 중 어느 한 항에 기재된 방법 ;
13. 생물 유래 검체가, 포유동물의 혈액 또는 체액인 것을 특징으로 하는 전항 1 내지 11 중 어느 한 항에 기재된 방법 ;
14. 생물 유래 검체가, 세포 용해액 또는 조직 용해액인 것을 특징으로 하는 전항 1 내지 11 중 어느 한 항에 기재된 방법 ;
15. 생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA 유래의 DNA 시료가, 당해 게놈 DNA가 갖는 목적으로 하는 DNA 영역을 인식 절단 부위로 하지 않는 제한 효소로 미리 소화 처리되어 이루어지는 DNA 시료인 것을 특징으로 하는 전항 1 내지 14 중 어느 한 항에 기재된 방법 ;
16. 생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA 유래의 DNA 시료가, 적어도 1종류의 메틸화 감수성 제한 효소로 소화 처리되어 이루어지는 DNA 시료인 것을 특징으로 하는 전항 1 내지 15 중 어느 한 항에 기재된 방법 ;
17. 생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA 유래의 DNA 시료가, 마스킹용 올리고뉴클레오티드를 첨가한 후에, 적어도 1종류의 메틸화 감수성 제한 효소로 소화 처리되어 이루어지는 DNA 시료인 것을 특징으로 하는 전항 1 내지 15 중 어느 한 항에 기재된 방법 ;
18. 적어도 1종류의 메틸화 감수성 제한 효소가, 메틸화 감수성 제한 효소인 HpaII 또는 HhaI인 것을 특징으로 하는 전항 16 또는 17에 기재된 방법 ;
19. 생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA 유래의 DNA 시료가, 미리 정제되어 이루어지는 DNA 시료인 것을 특징으로 하는 전항 1 내지 18 중 어느 한 항에 기재된 방법 ;
20. 게놈 DNA가 갖는 목적으로 하는 DNA 영역이, 적어도 1종류의 메틸화 감수성 제한 효소가 인식하는 절단 부위를 갖는 DNA 영역인 것을 특징으로 하는 전항 1 내지 19 중 어느 한 항에 기재된 방법 ;
21. 제1 공정에서 게놈 DNA 유래의 DNA 시료에 포함되는 이중 가닥 DNA를 단일 가닥 DNA로 분리할 때에, 카운터 올리고뉴클레오티드를 첨가하는 전항 1 내지 20 중 어느 한 항에 기재된 방법.
22. 제1 공정에서의, 게놈 DNA 유래의 DNA 시료에 포함되는 이중 가닥 DNA의 단일 가닥 DNA로의 분리가, 2가 양이온 혹은 마그네슘 이온을 함유하는 반응계 중에서 행해지는 전항 1 내지 21 중 어느 한 항에 기재된 방법 ;
등을 제공하는 것이다.
도 1은, 실시예 1에 있어서, 메틸화 사이토신 항체 1μg/mL를 이용하여 실시한 결과를 도시한 도면이다. 용액 A(2.5pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 B(0.25pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.025pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0.0025pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 E(0.00025pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 F(0pmol/100μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로, 메틸화 올리고뉴클레오티드의 잔존량, 비메틸화 올리고뉴클레오티드의 잔존량을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 2는, 실시예 1에 있어서, 메틸화 사이토신 항체 10μg/mL를 이용하여 실시한 결과를 도시한 도면이다. 용액 A(2.5pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 B(0.25pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.025pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0.0025pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 E(0.00025pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 F(0pmol/100μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로, 메틸화 올리고뉴클레오티드의 잔존량, 비메틸화 올리고뉴클레오티드의 잔존량을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 3은, 실시예 2의 결과를 도시한 도면이다. 용액 A(0.1pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 B(0.01pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.001pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0pmol/100μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로, 배열 번호 25로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M8의 잔존량(복합체의 형성량), 배열 번호 26으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-UM8의 잔존량(복합체의 형성량)을 형광(612nm)으로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 4는, 실시예 3에 있어서의 A군(무처리군)에 대한 결과를 도시한 도면이다. 용액 A(0.1pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 B(0.01pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.001pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0pmol/100μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로, 배열 번호 28로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M의 잔존량(복합체 형성량), 배열 번호 29로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 부분 메틸화 올리고뉴클 레오티드 UBC-HM의 잔존량(복합체 형성량), 및 배열 번호 30으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-UM의 잔존량(복합체 형성량)을 형광(612nm)으로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 5는, 실시예 3에 있어서의 B군(Hha 처리군)에 대한 결과를 도시한 도면이다. 용액 A(0.1pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 B(0.01pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.001pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0pmol/100μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로, 배열 번호 28로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M의 잔존량(복합체 형성량), 배열 번호 29로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 부분 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-HM의 잔존량(복합체 형성량), 및 배열 번호 30으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-UM의 잔존량(복합체 형성량)을 형광(612nm)으로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 6은, 실시예 4에 있어서의 A군(무처리군)에 대한 결과를 도시한 도면이다. 용액 A(0.1pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 B(0.01pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.001pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0pmol/100μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로, 배열 번호 33으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC86-M의 잔존량(복합체 형성량), 및 배열 번호 34로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 부분 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC118-HM의 잔존량(복합체 형성량)을 형광(612nm)으로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 7은, 실시예 4에 있어서의 B군(HhaI 처리군)에 대한 결과를 도시한 도면이다. 용액 A(0.1pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 B(0.01pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.001pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0pmol/100μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로, 배열 번호 33으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC86-M의 잔존량(복합체 형성량), 및 배열 번호 34로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 부분 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC118-HM의 잔존량(복합체 형성량)을 형광(612nm)으로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 8은, 실시예 5에 있어서의, 배열 번호 43으로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 UBC를 이용한 실험에 대한 결과를 도시한 도면이다. 용액 A(0.1pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 B(0.01pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.001pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0pmol/100μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로, 메틸화 올리고뉴클레오티드 혼합 용액에서의 복합체 형성량, 비메틸화 올리고뉴클레오티드 혼합 용액에서의 복합체 형성량을 형광(612nm)으로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 9는, 실시예 5에 있어서의, 배열 번호 44로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 FBN을 이용한 실험에 대한 결과를 도시한 도면이다. 용액 A(0.1pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 B(0.01pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.001pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0pmol/100μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로, 메틸화 올리고뉴클 레오티드 혼합 용액에서의 복합체 형성량, 비메틸화 올리고뉴클레오티드 혼합 용액에서의 복합체 형성량을 형광(612nm)으로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 10은, 실시예 5에 있어서의, 배열 번호 45로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 GPR을 이용한 실험에 대한 결과를 도시한 도면이다. 용액 A(0.1pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 B(0.01pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.001pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0pmol/100μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로, 메틸화 올리고뉴클레오티드 혼합 용액에서의 복합체 형성량, 비메틸화 올리고뉴클레오티드 혼합 용액에서의 복합체 형성량을 형광(612nm)으로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 11은, 실시예 5에 있어서의, 배열 번호 43으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 UBC, 배열 번호 44로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 FBN, 배열 번호 45로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 GPR의 혼합 용액을 이용한 실험에 대한 결과를 도시한 도면이다. 용액 A(0.1pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 B(0.01pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.001pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0pmol/100μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로, 메틸화 올리고뉴클레오티드 혼합 용액에서의 복합체 형성량, 비메틸화 올리고뉴클레오티드 혼합 용액에서의 복합체 형성량을 형광(612nm)으로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 12는, 실시예 6에 있어서의, 배열 번호 46으로 표시되는 염기 배열로 이 루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M8, 및 배열 번호 49로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-U8을 이용한 실험에 대한 결과를 도시한 도면이다. 용액 A(0.1pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 B(0.01pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.001pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0pmol/100μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로 배열 번호 46으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M8의 잔존량(복합체 형성량), 배열 번호 49로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-U8의 잔존량(복합체 형성량)을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 13은, 실시예 6에 있어서의, 배열 번호 47로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 GPR-M8, 및 배열 번호 50으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 GPR-U8을 이용한 실험에 대한 결과를 도시한 도면이다. 용액 A(0.1pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 B(0.01pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.001pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0pmol/100μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로 배열 번호 47로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 GPR-M8의 잔존량(복합체 형성량), 배열 번호 50으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 GPR-U8의 잔존량(복합체 형성량)을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 14는, 실시예 6에 있어서의, 배열 번호 48로 표시되는 염기 배열로 이루 어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-M8, 및 배열 번호 51로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-U8을 이용한 실험에 대한 결과를 도시한 도면이다. 용액 A(0.1pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 B(0.01pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.001pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0pmol/100μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로 배열 번호 48로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-M8의 잔존량(복합체 형성량), 배열 번호 51로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-U8의 잔존량(복합체 형성량)을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 15는, 실시예 7에 있어서의 A군(무처리군)의 결과를 도시한 도면이다. 용액 A(0.1pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 B(0.01pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.001pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0pmol/100μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로 배열 번호 55로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M의 잔존량(복합체 형성량), 배열 번호 56으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 부분 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-HM의 잔존량(복합체 형성량), 및 배열 번호 57로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-UM의 잔존량(복합체 형성량)을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 16은, 실시예 7에 있어서의 B군(HhaI 처리군)의 결과를 도시한 도면이다. 용액 A(0.1pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 B(0.01pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용 액 C(0.001pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0pmol/100μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로 배열 번호 55로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M의 잔존량(복합체 형성량), 배열 번호 56으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 부분 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-HM의 잔존량(복합체 형성물), 및 배열 번호 57로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-UM의 잔존량(복합체 형성량)을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 17은, 실시예 8에 있어서의, 배열 번호 62로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단을 FITC 표식한 올리고뉴클레오티드 UBC를 이용한 실험에 대한 결과를 도시한 도면이다. 용액 A(0.1pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 B(0.01pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.001pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0pmol/100μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로 배열 번호 60으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC/GPR/FBN-M의 복합체 형성량, 및 배열 번호 61로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC/GPR/FBN-UM의 복합체 형성량을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 18은, 실시예 8에 있어서의, 배열 번호 63으로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단을 FITC 표식한 올리고뉴클레오티드 GPR을 이용한 실험에 대한 결과를 도시한 도면이다. 용액 A(0.1pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 B(0.01pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.001pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0pmol/100μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로 배열 번호 60으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC/GPR/FBN-M의 복합체 형성량, 및 배열 번호 61로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC/GPR/FBN-UM의 복합체 형성량을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 19는, 실시예 8에 있어서의, 배열 번호 64로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단을 FITC 표식한 올리고뉴클레오티드 FBN을 이용한 실험에 대한 결과를 도시한 도면이다. 용액 A(0.1pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 B(0.01pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.001pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0pmol/100μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로 배열 번호 60으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC/GPR/FBN-M의 복합체 형성량, 및 배열 번호 61로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC/GPR/FBN-UM의 복합체 형성량을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 20은, 실시예 8에 있어서의, 배열 번호 62로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단을 FITC 표식한 올리고뉴클레오티드 UBC, 배열 번호 63으로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단을 FITC 표식한 올리고뉴클레오티드 GPR, 배열 번호 64로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단을 FITC 표식한 올리고뉴클레오티드 FBN의 혼합 용액을 이용한 실험에 대한 결과를 도시한 도면이다. 용액 A(0.1pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 B(0.01pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.001pmol/100μL TE 버 퍼 용액), 용액 D(0pmol/100μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로 배열 번호 60으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC/GPR/FBN-M의 복합체 형성량, 및 배열 번호 61로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC/GPR/FBN-UM의 복합체 형성량을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 21은, 실시예 9에 있어서의, 배열 번호 71로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단을 FITC 표식한 올리고뉴클레오티드 UBC를 이용한 실험에 대한 결과를 도시한 도면이다. 용액 A(0.1pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 B(0.01pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.001pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0pmol/100μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로 메틸화 올리고뉴클레오티드 혼합 용액 M0에서의 복합체 형성량, 비메틸화 올리고뉴클레오티드 혼합 용액 U0에서의 복합체 형성량을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 22는, 실시예 9에 있어서의, 배열 번호 73으로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단을 FITC 표식한 올리고뉴클레오티드 FBN을 이용한 실험에 대한 결과를 도시한 도면이다. 용액 A(0.1pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 B(0.01pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.001pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0pmol/100μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로 메틸화 올리고뉴클레오티드 혼합 용액 M0에서의 복합체 형성량, 비메틸화 올리고뉴클레오티드 혼합 용액 U0에서의 복합체 형성량을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 23은, 실시예 9에 있어서의, 배열 번호 72로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단을 FITC 표식한 올리고뉴클레오티드 GPR을 이용한 실험에 대한 결과를 도시한 도면이다. 용액 A(0.1pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 B(0.01pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.001pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0pmol/100μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로 메틸화 올리고뉴클레오티드 혼합 용액 M0에서의 복합체 형성량, 비메틸화 올리고뉴클레오티드 혼합 용액 U0에서의 복합체 형성량을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 24는, 실시예 9에 있어서의, 배열 번호 71로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단을 FITC 표식한 올리고뉴클레오티드 UBC, 배열 번호 72로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단을 FITC 표식한 올리고뉴클레오티드 GPR, 배열 번호 73으로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단을 FITC 표식한 올리고뉴클레오티드 FBN의 혼합 용액을 이용한 실험에 대한 결과를 도시한 도면이다. 용액 A(0.1pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 B(0.01pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.001pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0pmol/100μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로 메틸화 올리고뉴클레오티드 혼합 용액 M0에서의 복합체 형성량, 비메틸화 올리고뉴클레오티드 혼합 용액 U0에서의 복합체 형성량을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 25는, 실시예 10의 결과를 도시한 도면이다. 도면의 왼쪽에서부터 순서대로, 배열 번호 74로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M8의 용액을 이용해 실험하여 전개한 크로마토스트립(M), 배열 번호 75로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-U8의 용액을 이용해 실험하여 전개한 크로마토스트립(U), TE 버퍼 용액을 이용해 실험하여 전개한 크로마토스트립(O)을 나타내고 있다.
도 26은, 실시예 11에 있어서의 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드로서, 배열 번호 84로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 UBC를 이용한 경우의 결과를 도시한 도면이다. 도면의 왼쪽에서부터 순서대로, 배열 번호 78로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M8의 용액을 이용해 실험하여 전개한 크로마토스트립(M), 배열 번호 81로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-U8의 용액을 이용해 실험하여 전개한 크로마토스트립(U), TE 버퍼 용액을 이용해 실험하여 전개한 크로마토스트립(O)을 나타내고 있다.
도 27은, 실시예 11에 있어서의 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드로서, 배열 번호 85로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 FBN을 이용한 경우의 결과를 도시한 도면이다. 도면의 왼쪽에서부터 순서대로, 배열 번호 79로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-M8의 용액을 이용해 실험하여 전개한 크로마토스트립(M), 배열 번호 82로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-U8의 용액을 이용해 실험하여 전개한 크로마토스트립(U), TE 버퍼 용액을 이용해 실험하여 전개한 크로마토스트립(O)을 나타내고 있다.
도 28은, 실시예 11에 있어서의 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드로서, 배열 번호 86으로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티 드 GPR을 이용한 경우의 결과를 도시한 도면이다. 도면의 왼쪽에서부터 순서대로, 배열 번호 80으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 GPR-M8의 용액을 이용해 실험하여 전개한 크로마토스트립(M), 배열 번호 83으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 GPR-U8의 용액을 이용해 실험하여 전개한 크로마토스트립(U), TE 버퍼 용액을 이용해 실험하여 전개한 크로마토스트립(O)을 나타내고 있다.
도 29는, 실시예 12에 있어서의 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드로서, 배열 번호 94로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 UBC를 이용한 경우의 결과를 도시한 도면이다. 도면의 왼쪽에서부터 순서대로, 배열 번호 88로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M8의 용액을 이용해 실험하여 전개한 크로마토스트립(M), 배열 번호 91로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-U8의 용액을 이용해 실험하여 전개한 크로마토스트립(U), TE 버퍼 용액을 이용해 실험하여 전개한 크로마토스트립(O)을 나타내고 있다.
도 30은, 실시예 12에 있어서의 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드로서, 배열 번호 95로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 FBN을 이용한 경우의 결과를 도시한 도면이다. 도면의 왼쪽에서부터 순서대로, 배열 번호 89로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-M8의 용액을 이용해 실험하여 전개한 크로마토스트립(M), 배열 번호 92로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-U8의 용액을 이용해 실 험하여 전개한 크로마토스트립(U), TE 버퍼 용액을 이용해 실험하여 전개한 크로마토스트립(O)을 나타내고 있다.
도 31은, 실시예 12에 있어서의 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드로서, 배열 번호 96으로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 GPR를 이용한 경우의 결과를 도시한 도면이다. 도면의 왼쪽에서부터 순서대로, 배열 번호 90으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 GPR-M8의 용액을 이용해 실험하여 전개한 크로마토스트립(M), 배열 번호 93으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 GPR-U8의 용액을 이용해 실험하여 전개한 크로마토스트립(U), TE 버퍼 용액을 이용해 실험하여 전개한 크로마토스트립(O)을 나타내고 있다.
도 32는, 실시예 13에 있어서의 완충액 1을 이용한 실험에 대한 결과를 도시한 도면이다. 용액 A(0.1pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 B(0.01pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.001pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0pmol/100μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로 배열 번호 98로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-M8의 잔존량(복합체 형성량), 및 배열 번호 99로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-U8의 잔존량(복합체 형성량)을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 33은, 실시예 13에 있어서의 완충액 2를 이용한 실험에 대한 결과를 도시한 도면이다. 용액 A(0.1pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 B(0.01pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.001pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0pmol/100μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로 배열 번호 98로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-M8의 잔존량(복합체 형성량), 및 배열 번호 99로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-U8의 잔존량(복합체 형성량)을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 34는, 실시예 13에 있어서의 완충액 3을 이용한 실험에 대한 결과를 도시한 도면이다. 용액 A(0.1pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 B(0.01pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.001pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0pmol/100μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로 배열 번호 98로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-M8의 잔존량(복합체 형성량), 및 배열 번호 99로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-U8의 잔존량(복합체 형성량)을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 35는, 실시예 13에 있어서의 완충액 4를 이용한 실험에 대한 결과를 도시한 도면이다. 용액 A(0.1pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 B(0.01pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.001pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0pmol/100μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로 배열 번호 98로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-M8의 잔존량(복합체 형성량), 및 배열 번호 99로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리 고뉴클레오티드 FBN-U8의 잔존량(복합체 형성량)을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 36은, 실시예 13에 있어서의 완충액 5를 이용한 실험에 대한 결과를 도시한 도면이다. 용액 A(0.1pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 B(0.01pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.001pmol/100μL TE 버퍼 용액), 용액 D(0pmol/100μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로 배열 번호 98로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-M8의 잔존량(복합체 형성량), 및 배열 번호 99로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-U8의 잔존량(복합체 형성량)을 흡광도(450nm)로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 37은, 실시예 14의 결과를 도시한 도면이다. 금속염 용액 Mg(100mM MgCl2 수용액), 금속염 용액 Ba(100mM BaCl2 수용액), 금속염 용액 H2O(초순수(超純水))의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로 배열 번호 102로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M8의 잔존량(복합체 형성량), 배열 번호 103으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-U8의 잔존량(복합체 형성량)을 형광(612nm)으로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 38은, 실시예 15의 결과를 도시한 도면이다. 10, 16, 22, 28, 34, 46, 58, 70mM MgCl2 용액(최종 농도)의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로 배열 번호 105로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-M8의 잔존 량(복합체 형성량), 배열 번호 106으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-U8의 잔존량(복합체 형성량)을 형광(612nm)으로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 39는, 실시예 16의 결과를 도시한 도면이다. 10, 70, 130, 190, 250, 370, 490, 610mM MgCl2 용액(최종 농도)의 각각에 대해, 왼쪽에서부터 순서대로 배열 번호 108로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-M8의 잔존량(복합체 형성량), 배열 번호 109로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-U8의 잔존량(복합체 형성량)을 형광(612nm)으로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 40은, 실시예 17의 결과를 도시한 도면이다. 왼쪽에서부터 순서대로, 용액 MA(10ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 A(10ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 MB(1ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 B(1ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 MC(0ng/10μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액)), 용액 C(0ng/10μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 복합체의 형성량을 형광(여기 340nm/검출 612nm)으로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 41은, 실시예 18의 결과를 도시한 도면이다. 왼쪽에서부터 순서대로, 용액 MA(10ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 A(10ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 MB(0ng/10μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액)), 용액 B(0ng/10μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 복합체의 형성량을 형광(여기 340nm/검출 612nm)으로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 42는, 실시예 19의 결과를 도시한 도면이다. 왼쪽에서부터 순서대로, 용액 MA(10ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 A(10ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 MB(1ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 B(1ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 MC(0.1ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.1ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 MD(0ng/10μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액)), 용액 D(0ng/10μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 복합체의 형성량을 형광(여기 340nm/검출 612nm)으로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 43은, 실시예 20의 결과를 도시한 도면이다. 왼쪽에서부터 순서대로, 용액 MA(10ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 A(10ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 MB(1ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 B(1ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 MC(0.1ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.1ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 MD(0ng/10μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액)), 용액 D(0ng/10μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 복합체의 형성량을 형광(여기 340nm/검출 612nm)으로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 44는, 실시예 21의 결과를 도시한 도면이다. 왼쪽에서부터 순서대로, 용액 MA(10ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 A(10ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 MB(1ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 B(1ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 MC(0.1ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.1ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 MD(0ng/10μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액)), 용액 D(0ng/10μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각 에 대해, 복합체의 형성량을 발색(흡광 450nm)으로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 45는, 실시예 22의 결과를 도시한 도면이다. 왼쪽에서부터 순서대로, 용액 MA(10ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 A(10ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 MB(1ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 B(1ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 MC(0.1ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.1ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 MD(0ng/10μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액)), 용액 D(0ng/10μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 복합체의 형성량을 발색(흡광 450nm)으로 측정한 값을 나타내고 있다.
도 46은, 실시예 23의 결과를 도시한 도면이다. 왼쪽에서부터 순서대로, 용액 MA(10ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 A(10ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 MB(1ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 B(1ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 MC(0.1ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 C(0.1ng/10μL TE 버퍼 용액), 용액 MD(0ng/10μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액)), 용액 D(0ng/10μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액))의 각각에 대해, 복합체의 형성량을 발색(흡광 450nm)으로 측정한 값을 나타내고 있다.
각종 질환(예를 들면, 암)에 있어서 DNA의 메틸화 이상이 일어나는 것이 알려져 있고, 이 DNA 메틸화 이상을 검출함으로써, 각종 질환의 정도를 측정하는 것이 가능하다고 생각되고 있다.
예를 들면, 질환 환자 유래의 검체 중에서 100% 메틸화되어 있는 영역이 있고, 그 영역에 대해, 본 발명 측정 방법을 실시하면, 메틸화 DNA량은 많아지며, 예를 들면, 질환 환자 유래의 검체 중에서 100% 메틸화되어 있지 않은 영역이 있고, 그 영역에 대해, 본 발명 측정 방법을 실시하면, 메틸화 DNA량은 거의 0에 가까운 값이 될 것이다. 또, 예를 들면, 정상인의 검체에서, 메틸화 비율이 낮고, 질환 환자의 검체에서, 메틸화 비율이 높은 영역이 있고, 그 영역에 대해, 본 발명 측정 방법을 실시하면, 정상인에서는, 메틸화 DNA량은 0에 가까운 값을 나타내고, 질환 환자에서는, 정상인의 값보다 유의하게 높은 값을 나타내므로, 이 값의 차이에 의거하여, 「질환의 정도」를 판정할 수 있다. 여기에서의 「질환의 정도」란, 일반적으로 당해 분야에 있어서 사용되는 의미와 동일하고, 구체적으로는, 예를 들면, 검체가 세포인 경우에는 당해 세포의 악성도(惡性度)를 의미하며, 또, 예를 들면, 검체가 조직인 경우에는 당해 조직에 있어서의 질환 세포의 존재량 등을 의미하고 있다. 또한, 검체가 혈장·혈청인 경우에는 그 개체가 질환을 가질 확률을 의미하고 있다. 따라서, 본 발명 측정 방법은, 메틸화 이상을 조사함으로써, 각종 질환을 진단하는 것을 가능하게 한다.
본 발명에 있어서의 「생물 유래 검체」로서는, 예를 들면, 세포 용해액, 조직 용해액(여기에서의 조직이란, 혈액, 림프절 등을 포함하는 넓은 의미이다) 혹은, 포유동물에 있어서는, 혈장, 혈청, 림프액 등의 체액, 신체 분비물(소변이나 젖 등) 등의 생체 시료 및 이들 생체 시료로부터 추출하여 얻어진 게놈 DNA를 들 수 있다. 또한 당해 생물 유래 검체로서는, 예를 들면, 미생물, 바이러스 등 유래의 시료도 들 수 있고, 이 경우에는, 본 발명 측정 방법에 있어서의 「게놈 DNA」란, 미생물, 바이러스 등의 게놈 DNA를 의미한다.
포유동물 유래의 검체가 혈액인 경우에는, 정기 건강 진단이나 간편한 검사 등에서의 본 발명 측정 방법의 이용을 기대할 수 있다.
게놈 DNA를 포유동물 유래의 검체로부터 얻기 위해서는, 예를 들면, 시판의 DNA 추출용 키트 등을 이용하여 DNA를 추출하면 된다.
혈액을 검체로서 이용하는 경우에는, 혈액으로부터 통상의 방법에 준하여 혈장 또는 혈청을 조제하고, 조제된 혈장 또는 혈청을 검체로 하여, 그 안에 포함되는 유리(遊離) DNA(위암 세포 등의 암 세포 유래의 DNA가 포함된다)를 분석하면, 혈구 유래의 DNA를 피하여 위암 세포 등의 암 세포 유래의 DNA를 해석할 수 있고, 위암 세포 등의 암 세포, 이를 포함하는 조직 등을 검출하는 감도를 향상시킬 수 있다.
통상, 유전자(게놈 DNA)를 구성하는 염기는 4종류이다. 이들 염기 중, 사이토신만이 메틸화되는 현상이 알려져 있고, 이러한 DNA의 메틸화 수식은, 5’-CG-3’으로 표시되는 염기 배열(C는 사이토신을 나타내고, G는 구아닌을 나타낸다. 이하, 당해 염기 배열을 「CpG」로 표기하는 경우도 있다) 중의 사이토신에 한정되어 있다. 사이토신에 있어서 메틸화되는 부위는, 그 5위치이다. 세포 분열에 앞서는 DNA 복제에 임하여, 복제 직후는 주형 가닥의 「CpG」중의 사이토신만이 메틸화된 상태가 되지만, 메틸기 전이 효소의 작용에 의해 즉각 신생 가닥의 「CpG」중의 사이토신도 메틸화된다. 따라서, DNA의 메틸화 상태는, DNA 복제 후에도, 새로운 2세트의 DNA에 그대로 이어지게 된다. 본 발명에 있어서의 「메틸화된 DNA」란, 이러한 메틸화 수식에 의해 생긴 DNA를 의미하는 것이다.
본 발명에 있어서의 「목적으로 하는 DNA 영역」(이하, 목적 영역으로 표기 하는 경우도 있다)은, 당해 영역에 포함되는 사이토신의 메틸화 유무를 조사하고자 하는 DNA 영역으로서, 적어도 1종류의 메틸화 감수성 제한 효소의 인식 부위를 갖는다. 예를 들면, Lysyl oxidase, HRAS-like suppressor, bA305P22.2.1, Gamma filamin, HAND1, Homologue of RIKEN 2210016F16, FLJ32130, PPARG angiopoietin-related protein, Thrombomodulin, p53-responsive gene 2, Fibrillin2, Neurofilament3, disintegrin and metalloproteinase domain 23, G protein-coupled receptor 7, G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor, Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2 등의 유용 단백질 유전자의 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열 중의 사이토신을 1개 이상 포함하는 DNA의 영역 등을 들 수 있다.
구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 Lysyl oxidase 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열을 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 Lysyl oxidase 유전자의 엑손(exon) 1과, 그 5’ 상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 배열 번호 1로 표시되는 염기 배열(Genbank Accession No.AF270645에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 16001∼18661로 표시되는 염기 배열에 상당한다)을 들 수 있다. 배열 번호 1로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 Lysyl oxidase 단백질의 아미노 말단의 메티오닌을 코딩하는 ATG 코돈(codon)이, 염기 번호 2031 ∼2033에 표시되어 있고, 상기 엑손 1의 염기 배열은, 염기 번호 1957∼2661에 표시되어 있다. 배열 번호 1로 표시되는 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열 중의 사이토신, 특히 배열 번호 1로 표시되는 염기 배열에 있어서 CpG가 조밀하게 존재하는 영역 내에 존재하는 CpG 중의 사이토신은, 예를 들면, 위암 세포 등의 암 세포에 있어서 높은 메틸화 빈도(즉, 고 메틸화 상태(hypermethylation))를 나타낸다. 더욱 구체적으로는, 위암 세포에 있어서 메틸화 빈도가 높은 사이토신으로서는, 예를 들면, 배열 번호 1로 표시되는 염기 배열에 있어서, 염기 번호 1539, 1560, 1574, 1600, 1623, 1635, 1644, 1654, 1661, 1682, 1686, 1696, 1717, 1767, 1774, 1783, 1785, 1787, 1795 등으로 표시되는 사이토신을 들 수 있다.
또 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가 HRAS-like suppressor 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열을 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 HRAS-like suppressor 유전자의 엑손 1과, 그 5’상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 배열 번호 2로 표시되는 염기 배열(Genbank Accession No.AC068162에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 172001∼173953으로 표시되는 염기 배열에 상당한다)을 들 수 있다. 배열 번호 2로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 HRAS-like suppressor 유전자의 엑손 1의 염기 배열은, 염기 번호 1743∼1953에 표시되어 있다. 배열 번호 2로 표시되는 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열 중의 사이토신, 특히 배열 번호 2로 표시되는 염기 배열에 있어서 CpG가 조밀하게 존재하는 영역 내에 존재하는 CpG 중의 사이토신은, 예를 들면, 위암 세포 등의 암 세포에 있어서 높은 메틸화 빈도(즉, 고 메틸화 상태(hypermethylation))를 나타낸다. 더욱 구체적으로는, 위암 세포에 있어서 메틸화 빈도가 높은 사이토신으로서는, 예를 들면, 배열 번호 2로 표시되는 염기 배열에 있어서, 염기 번호 1316, 1341, 1357, 1359, 1362, 1374, 1390, 1399, 1405, 1409, 1414, 1416, 1422, 1428, 1434, 1449, 1451, 1454, 1463, 1469, 1477, 1479, 1483, 1488, 1492, 1494, 1496, 1498, 1504, 1510, 1513, 1518, 1520 등으로 표시되는 사이토신을 들 수 있다.
또 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가, bA305P22.2.1 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열을 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 bA305P22.2.1 유전자의 엑손 1과, 그 5’상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 배열 번호 3으로 표시되는 염기 배열(Genbank Accession No.AL121673에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 13001∼13889로 표시되는 염기 배열에 상당한다)을 들 수 있다. 배열 번호 3으로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 bA305P22.2.1 단백질의 아미노 말단의 메티오닌을 코딩하는 ATG 코돈이, 염기 번호 849∼851에 표시되어 있고, 상기 엑손 1의 염기 배열은, 염기 번호 663∼889에 표시되어 있다. 배열 번호 3으로 표시되는 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열 중의 사이 토신, 특히 배열 번호 3으로 표시되는 염기 배열에 있어서 CpG가 조밀하게 존재하는 영역 내에 존재하는 CpG 중의 사이토신은, 예를 들면, 위암 세포 등의 암 세포에 있어서 높은 메틸화 빈도(즉, 고 메틸화 상태(hypermethylation))를 나타낸다. 더욱 구체적으로는, 위암 세포에 있어서 메틸화 빈도가 높은 사이토신으로서는, 예를 들면, 배열 번호 3으로 표시되는 염기 배열에 있어서, 염기 번호 329, 335, 337, 351, 363, 373, 405, 424, 427, 446, 465, 472, 486 등으로 표시되는 사이토신을 들 수 있다.
또 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가, Gamma filamin 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열을 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 Gamma filamin 유전자의 엑손 1과, 그 5’상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는 배열 번호 4로 표시되는 염기 배열(Genbank Accession No.AC074373에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 63528∼64390으로 표시되는 염기 배열의 상보적 배열에 상당한다)을 들 수 있다. 배열 번호 4로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 Gamma filamin 단백질의 아미노 말단의 메티오닌을 코딩하는 ATG 코돈이, 염기 번호 572∼574에 표시되어 있고, 상기 엑손 1의 염기 배열은, 염기 번호 463∼863에 표시되어 있다. 배열 번호 4로 표시되는 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열 중의 사이토신, 특히 배열 번호 4로 표시되는 염기 배열에 있어서 CpG가 조밀하게 존재하는 영역 내에 존재하는 CpG 중의 사이토신은, 예를 들면, 위암 세포 등 의 암 세포에 있어서 높은 메틸화 빈도(즉, 고 메틸화 상태(hypermethylation))를 나타낸다. 더욱 구체적으로는, 위암 세포에 있어서 메틸화 빈도가 높은 사이토신으로서는, 예를 들면, 배열 번호 4로 표시되는 염기 배열에 있어서, 염기 번호 329, 333, 337, 350, 353, 360, 363, 370, 379, 382, 384, 409, 414, 419, 426, 432, 434, 445, 449, 459, 472, 474, 486, 490, 503, 505 등으로 표시되는 사이토신을 들 수 있다.
또 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가, HAND1 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 내에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열을 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 HAND1 유전자의 엑손 1과, 그 5’상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 배열 번호 5로 표시되는 염기 배열(Genbank Accession No.AC026688에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 24303∼26500으로 표시되는 염기 배열의 상보적 배열에 상당한다)을 들 수 있다. 배열 번호 5로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 HAND1 단백질의 아미노 말단의 메티오닌을 코딩하는 ATG 코돈이, 염기 번호 1656∼1658에 표시되어 있고, 상기 엑손 1의 염기 배열은, 염기 번호 1400∼2198에 표시되어 있다. 배열 번호 5로 표시되는 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열 중의 사이토신, 특히 배열 번호 5로 표시되는 염기 배열에 있어서 CpG가 조밀하게 존재하는 영역 내에 존재하는 CpG 중의 사이토신은, 예를 들면, 위암 세포 등의 암 세포에 있어서 높은 메틸화 빈도(즉, 고 메틸화 상태(hypermethylation))를 나타낸다. 더욱 구체적으로는, 위암 세포에 있어서 메틸화 빈도가 높은 사이토신으로서는, 예를 들면, 배열 번호 5로 표시되는 염기 배열에 있어서, 염기 번호 1153, 1160, 1178, 1187, 1193, 1218, 1232, 1266, 1272, 1292, 1305, 1307, 1316, 1356, 1377, 1399, 1401, 1422, 1434 등으로 표시되는 사이토신을 들 수 있다.
또 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가, Homologue of RIKEN 2210016F16 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열을 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 Homologue of RIKEN 2210016F16 유전자의 엑손 1과, 그 5’상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 배열 번호 6으로 표시되는 염기 배열(Genbank Accession No.AL354733에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 157056∼159000으로 표시되는 염기 배열의 상보적 염기 배열에 상당한다)을 들 수 있다. 배열 번호 6으로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 Homologue of RIKEN 2210016F16 유전자의 엑손 1의 염기 배열은, 염기 번호 1392∼1945에 표시되어 있다. 배열 번호 6으로 표시되는 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열 중의 사이토신, 특히 배열 번호 6으로 표시되는 염기 배열에 있어서 CpG가 조밀하게 존재하는 영역 내에 존재하는 CpG 중의 사이토신은, 예를 들면, 위암 세포 등의 암 세포에 있어서 높은 메틸화 빈도(즉, 고 메틸화 상태(hypermethylation))를 나타낸다. 더욱 구체적으로는, 위암 세포에 있어서 메틸화 빈도가 높은 사이토신으로서는, 예를 들면, 배열 번호 6으로 표시되는 염기 배열에 있어서, 염기 번호 1172, 1175, 1180, 1183, 1189, 1204, 1209, 1267, 1271, 1278, 1281, 1313, 1319, 1332, 1334, 1338, 1346, 1352, 1358, 1366, 1378, 1392, 1402, 1433, 1436, 1438 등으로 표시되는 사이토신을 들 수 있다.
또 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가, FLJ32130 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열을 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 FLJ32130 유전자의 엑손 1과, 그 5’상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 배열 번호 7로 표시되는 염기 배열(Genbank Accession No.AC002310에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 1∼2379로 표시되는 염기 배열의 상보적 염기 배열에 상당한다)을 들 수 있다. 배열 번호 7로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 FLJ32130 단백질의 아미노산 말단의 메티오닌을 코딩하는 ATG 코돈이, 염기 번호 2136∼2138에 표시되어 있고, 상기 엑손 1로 생각되는 염기 배열은, 염기 번호 2136∼2379에 표시되어 있다. 배열 번호 7로 표시되는 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열 중의 사이토신, 특히 배열 번호 7로 표시되는 염기 배열에 있어서 CpG가 조밀하게 존재하는 영역 내에 존재하는 CpG 중의 사이토신은, 예를 들면, 위암 세포 등의 암 세포에 있어서 높은 메틸화 빈도(즉, 고 메틸화 상태(hypermethylation))를 나타낸다. 더욱 구체적으로는, 위암 세포에 있어서 메틸화 빈도가 높은 사이토신으로서는, 예를 들면, 배열 번호 7로 표시되는 염기 배열에 있어서, 염기 번호 1714, 1716, 1749, 1753, 1762, 1795, 1814, 1894, 1911, 1915, 1925, 1940, 1955, 1968 등으로 표시되는 사이토신을 들 수 있다.
또 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가, PPARG angiopoietin-related protein 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열을 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 PPARG angiopoietin-related protein 유전자의 엑손 1과, 그 5’상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 배열 번호 8로 표시되는 염기 배열을 들 수 있다. 배열 번호 8로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 PPARG angiopoietin-related protein 단백질의 아미노 말단의 메티오닌을 코딩하는 ATG 코돈이, 염기 번호 717∼719에 표시되어 있고, 상기 엑손 1의 5’측 부분의 염기 배열은, 염기 번호 1957∼2661에 표시되어 있다. 배열 번호 8로 표시되는 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열 중의 사이토신, 특히 배열 번호 8로 표시되는 염기 배열에 있어서 CpG가 조밀하게 존재하는 영역 내에 존재하는 CpG 중의 사이토신은, 예를 들면, 위암 세포 등의 암 세포에 있어서 높은 메틸화 빈도(즉, 고 메틸화 상태(hypermethylation))를 나타낸다. 더욱 구체적으로는, 위암 세포에 있어서 메틸화 빈도가 높은 사이토신으로서는, 예를 들면, 배열 번호 8로 표시되는 염기 배열에 있어서, 염기 번호 35, 43, 51, 54, 75, 85, 107, 127, 129, 143, 184, 194, 223, 227, 236, 251, 258 등으로 표시되는 사이토신을 들 수 있다.
또 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가, Thrombomodulin 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열을 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 Thrombomodulin 유전자의 엑손 1과, 그 5’상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 배열 번호 9로 표시되는 염기 배열(Genbank Accession No.AF495471에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 1∼6096으로 표시되는 염기 배열에 상당한다)을 들 수 있다. 배열 번호 9로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 Thrombomodulin 단백질의 아미노 말단의 메티오닌을 코딩하는 ATG 코돈이, 염기 번호 2590∼2592에 표시되어 있고, 상기 엑손 1의 염기 배열은, 염기 번호 2048∼6096에 표시되어 있다. 배열 번호 9로 표시되는 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열 중의 사이토신, 특히 배열 번호 9로 표시되는 염기 배열에 있어서 CpG가 조밀하게 존재하는 영역 내에 존재하는 CpG 중의 사이토신은, 예를 들면, 위암 세포 등의 암 세포에 있어서 높은 메틸화 빈도(즉, 고 메틸화 상태(hypermethylation))를 나타낸다. 더욱 구체적으로는, 위암 세포에 있어서 메틸화 빈도가 높은 사이토신으로서는, 예를 들면, 배열 번호 9로 표시되는 염기 배열에 있어서, 염기 번호 1539, 1551, 1571, 1579, 1581, 1585, 1595, 1598, 1601, 1621, 1632, 1638, 1645, 1648, 1665, 1667, 1680, 1698, 1710, 1724, 1726, 1756 등으로 표시되는 사이토신을 들 수 있다.
또 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가, p53-responsive gene 2 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열을 1개 이상 포함하는 염기 배 열로서는, 인간 유래의 p53-responsive gene 2 유전자의 엑손 1과, 그 5’상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 배열 번호 10으로 표시되는 염기 배열(Genbank Accession No.AC009471에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 113501∼116000으로 표시되는 염기 배열의 상보적 배열에 상당한다)을 들 수 있다. 배열 번호 10으로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 p53-responsive gene 2 유전자의 엑손 1의 염기 배열은, 염기 번호 1558∼1808에 표시되어 있다. 배열 번호 10으로 표시되는 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열 중의 사이토신은, 예를 들면, 췌장암 세포 등의 암 세포에 있어서 높은 메틸화 빈도(즉, 고 메틸화 상태(hypermethylation))를 나타낸다. 더욱 구체적으로는, 췌장암 세포에 있어서 메틸화 빈도가 높은 사이토신으로서는, 예를 들면, 배열 번호 10으로 표시되는 염기 배열에 있어서, 염기 번호 1282, 1284, 1301, 1308, 1315, 1319, 1349, 1351, 1357, 1361, 1365, 1378, 1383 등으로 표시되는 사이토신을 들 수 있다.
또 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가, Fibrillin2 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열을 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 Fibrillin2 유전자의 엑손 1과, 그 5’상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 배열 번호 11로 표시되는 염기 배열(Genbank Accession No.AC113387에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 118801∼121000으로 표시되는 염기 배열의 상보적 배열에 상당한다)을 들 수 있다. 배열 번호 11로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 Fibrillin2 유전자의 엑손 1의 염기 배열은, 염기 번호 1091∼1345에 표시되어 있다. 배열 번호 11로 표시되는 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열 중의 사이토신은, 예를 들면, 췌장암 세포 등의 암 세포에 있어서 높은 메틸화 빈도(즉, 고 메틸화 상태(hypermethylation))를 나타낸다. 더욱 구체적으로는, 췌장암 세포에 있어서 메틸화 빈도가 높은 사이토신으로서는, 예를 들면, 배열 번호 11로 표시되는 염기 배열에 있어서, 염기 번호 679, 687, 690, 699, 746, 773, 777, 783, 795, 799, 812, 823, 830, 834, 843 등으로 표시되는 사이토신을 들 수 있다.
또 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가, Neurofilament3 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열을 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 Neurofilament3 유전자의 엑손 1과, 그 5’상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 배열 번호 12로 표시되는 염기 배열(Genbank Accession No.AF106564에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 28001∼30000으로 표시되는 염기 배열의 상보적 배열에 상당한다)을 들 수 있다. 배열 번호 12로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 Neurofilament3 유전자의 엑손 1의 염기 배열은, 염기 번호 614∼1694에 표시되어 있다. 배열 번호 12로 표시되는 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열 중의 사이토신은, 예를 들면, 췌장암 세포 등의 암 세포에 있어서 높은 메틸화 빈도(즉, 고 메틸화 상태(hypermethylation))를 나타낸다. 더욱 구체적으로는, 췌 장암 세포에 있어서 메틸화 빈도가 높은 사이토신으로서는, 예를 들면, 배열 번호 12로 표시되는 염기 배열에 있어서, 염기 번호 428, 432, 443, 451, 471, 475, 482, 491, 499, 503, 506, 514, 519, 532, 541, 544, 546, 563, 566, 572, 580 등으로 표시되는 사이토신을 들 수 있다.
또 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가, disintegrin and metalloproteinase domain 23 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열을 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 disintegrin and metalloproteinase domain 23 유전자의 엑손 1과, 그 5’상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 배열 번호 13으로 표시되는 염기 배열(Genbank Accession No.AC009225에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 21001∼23300으로 표시되는 염기 배열에 상당한다)을 들 수 있다. 배열 번호 13으로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 disintegrin and metalloproteinase domain 23 유전자의 엑손 1의 염기 배열은, 염기 번호 1194∼1630에 표시되어 있다. 배열 번호 13으로 표시되는 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열 중의 사이토신은, 예를 들면, 췌장암 세포 등의 암 세포에 있어서 높은 메틸화 빈도(즉, 고 메틸화 상태(hypermethylation))를 나타낸다. 더욱 구체적으로는, 췌장암 세포에 있어서 메틸화 빈도가 높은 사이토신으로서는, 예를 들면, 배열 번호 13으로 표시되는 염기 배열에 있어서, 염기 번호 998, 1003, 1007, 1011, 1016, 1018, 1020, 1026, 1028, 1031, 1035, 1041, 1043, 1045, 1051, 1053, 1056, 1060, 1066, 1068, 1070, 1073, 1093, 1096, 1106, 1112, 1120, 1124, 1126 등으로 표시되는 사이토신을 들 수 있다.
또 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가, G protein-coupled receptor 7 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열을 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 G protein-coupled receptor 7 유전자의 엑손 1과, 그 5’상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 배열 번호 14로 표시되는 염기 배열(Genbank Accession No.AC009800에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 75001∼78000으로 표시되는 염기 배열에 상당한다)을 들 수 있다. 배열 번호 14로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 G protein-coupled receptor 7 유전자의 엑손 1의 염기 배열은, 염기 번호 1666∼2652에 표시되어 있다. 배열 번호 14로 표시되는 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열 중의 사이토신은, 예를 들면, 췌장암 세포 등의 암 세포에 있어서 높은 메틸화 빈도(즉, 고 메틸화 상태(hypermethylation))를 나타낸다. 더욱 구체적으로는, 췌장암 세포에 있어서 메틸화 빈도가 높은 사이토신으로서는, 예를 들면, 배열 번호 14로 표시되는 염기 배열에 있어서, 염기 번호 1480, 1482, 1485, 1496, 1513, 1526, 1542, 1560, 1564, 1568, 1570, 1580, 1590, 1603, 1613, 1620 등으로 표시되는 사이토신을 들 수 있다.
또 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가, G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역의 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열을 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor 유전자의 엑손 1과, 그 5’상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 배열 번호 15로 표시되는 염기 배열(Genbank Accession No.AC008971에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 57001∼60000으로 표시되는 염기 배열의 상보적 배열에 상당한다)을 들 수 있다. 배열 번호 15로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor 유전자의 엑손 1의 염기 배열은, 염기 번호 776∼2632에 표시되어 있다. 배열 번호 15로 표시되는 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열 중의 사이토신은, 예를 들면, 췌장암 세포 등의 암 세포에 있어서 높은 메틸화 빈도(즉, 고 메틸화 상태(hypermethylation))를 나타낸다. 더욱 구체적으로는, 췌장암 세포에 있어서 메틸화 빈도가 높은 사이토신으로서는, 예를 들면, 배열 번호 15로 표시되는 염기 배열에 있어서, 염기 번호 470, 472, 490, 497, 504, 506, 509, 514, 522, 540, 543, 552, 566, 582, 597, 610, 612 등으로 표시되는 사이토신을 들 수 있다.
또 구체적으로는 예를 들면, 유용 단백질 유전자가, Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2 유전자인 경우에는, 그 프로모터 영역, 비번역 영역 또는 번역 영역(코딩 영역)의 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열을 1개 이상 포함하는 염기 배열로서는, 인간 유래의 Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2 유전자의 엑손 1과, 그 5’상류에 위치하는 프로모터 영역이 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 배열 번호 16으로 표시되는 염기 배열(Genbank Accession No.AC026802에 기재되는 염기 배열의 염기 번호 78801∼81000으로 표시되는 염기 배열의 상보적 배열에 상당한다)을 들 수 있다. 배열 번호 16으로 표시되는 염기 배열에 있어서는, 인간 유래의 Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2 유전자의 엑손 1의 염기 배열은, 염기 번호 1479∼1804에 표시되어 있다. 배열 번호 16으로 표시되는 염기 배열 중에 존재하는 CpG로 표시되는 염기 배열 중의 사이토신은, 예를 들면, 췌장암 세포 등의 암 세포에 있어서 높은 메틸화 빈도(즉, 고 메틸화 상태(hypermethylation))를 나타낸다. 더욱 구체적으로는, 췌장암 세포에 있어서 메틸화 빈도가 높은 사이토신으로서는, 예를 들면, 배열 번호 16으로 표시되는 염기 배열에 있어서, 염기 번호 1002, 1010, 1019, 1021, 1051, 1056, 1061, 1063, 1080, 1099, 1110, 1139, 1141, 1164, 1169, 1184 등으로 표시되는 사이토신을 들 수 있다.
본 발명 측정 방법에 있어서의 「메틸화된 DNA를 검출 혹은 정량」의 검출이란, 메틸화 DNA 항체 또는 본 올리고뉴클레오티드가 검출되었는지의 여부에 따라, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA가 존재하고 있는지의 여부의 판별이 가능하다는 것이고, 메틸화 DNA 항체 또는 본 올리고뉴클레오티드가 검출된 경우, 검 체 중에, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA가 존재하고 있었던 것을 나타내고 있으며, 메틸화 DNA 항체 또는 본 올리고뉴클레오티드가 검출되지 않은 경우, 검체 중에, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA의 존재량이 검출 한계 미만인 것을 나타내고 있다.
본 발명 측정 방법에 있어서의 「메틸화된 DNA를 검출 혹은 정량」의 정량이란, 정량된 메틸화 DNA 항체 또는 본 올리고뉴클레오티드의 양으로부터, 검체 중에서의 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA의 양을 어림잡아 계산한 것이고, 예를 들면, 검체가 1mL의 혈청인 경우, 혈청 1mL 중에 포함되는 메틸화된 목적 영역의 DNA의 양을 의미한다.
본 발명 측정 방법의 제1 공정에 있어서, 생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA 유래의 DNA 시료에 포함되는 이중 가닥 DNA를 단일 가닥 상태로 분리한다. 구체적으로는 예를 들면, 이중 가닥 DNA에 어닐링 버퍼를 첨가함으로써, 혼합물을 얻는다. 다음에, 얻어진 혼합물을 95℃로 약 30초간 보일하고, 그 후, 몇 분간, 빙냉수(氷冷水) 상에서 급랭한다. 예를 들면, 혈액 등에 포함되는 유리 DNA가 단일 가닥 DNA일 가능성이 있다. 따라서, 생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA가 단일 가닥 DNA인 경우에는, 이 조작은 필요하지 않다.
본 발명 측정 방법의 제2 공정에 있어서의 「메틸화 DNA 항체」란, DNA 중의 메틸화된 염기를 항원으로 하여 결합하는 항체를 의미한다. 예를 들면, 단일 가닥 DNA 중의 5위치가 메틸화된 사이토신을 인식하여 결합하는 성질을 갖고 있는 항체를 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 메틸사이토신 항체를 들 수 있다.
메틸화 DNA 항체는, 메틸화된 염기를 항원으로 하여, 통상의 면역학적 수법에 의해 제작할 수 있다. 구체적으로는, 5-메틸시티딘, 5-메틸사이토신 또는 5-메틸사이토신을 포함하는 DNA 등을 항원으로 하여 제작된 항체로부터 DNA 중의 메틸사이토신에 대한 특이적인 결합을 지표로 하여 선발함으로써 얻을 수 있다.
동물에 항원을 면역하여 얻어지는 항체로서는, IgG 분획의 항체(폴리클로날 항체)와, 단일한 클론이 생산하는 항체(모노클로날 항체)가 있다. 본 발명 측정 방법에서는 메틸화 염기를 특이적으로 인식할 수 있는 항체인 것이 바람직하므로, 모노클로날 항체를 이용하는 것이 바람직하다.
모노클로날 항체를 제작하는 방법으로서는, 세포 융합법에 의한 방법을 들 수 있다. 예를 들면, 세포 융합법은 면역한 마우스 유래의 비세포(脾細胞)(B세포)와 골수종 세포를 세포 융합시킴으로써 하이브리도마를 제작하고, 제작된 하이브리도마가 생산하는 항체를 선발하여, 메틸사이토신 항체(모노클로날 항체)를 제작하면 된다. 세포 융합법으로 모노클로날 항체를 제작하는 경우에는, 항원을 정제할 필요가 없고, 예를 들면, 5-메틸시티딘, 5-메틸사이토신 또는 5-메틸사이토신을 포함하는 DNA 등의 혼합물을 항원으로 하여, 면역에 이용하는 동물에 투여할 수 있다. 투여 방법으로서는, 5-메틸시티딘, 5-메틸사이토신 또는 5-메틸사이토신을 포함하는 DNA 등을, 직접, 항체를 생산시키는 마우스에 투여한다. 항체가 생산되기 어려운 경우에는, 항원을 지지체에 결합시켜 면역해도 된다. 또, 어쥬번트 용액(예를 들면, 유동 파라핀과 Aracel A를 혼합하고, 어쥬번트로서 결핵균의 사균(死菌)을 혼합한 것)과 항원을 잘 혼합하거나, 리포솜에 넣어 면역함으로써, 항원의 면역성을 향상시킬 수 있다. 또, 항원을 포함하는 용액과 어쥬번트 용액을 등량 첨가하여, 충분히 유액형상으로 한 후, 당해 혼합물을 마우스의 피하 혹은 복강 내에 주사하는 방법이나, 명반수와 잘 혼합한 후 백일해 사균을 어쥬번트로서 첨가하는 방법이 있다. 또한, 최초의 면역을 한 후 적당한 기간 후, 마우스의 복강 내 또는 정맥 내에 추가 면역할 수도 있다. 또, 항원의 양이 적은 경우에는, 항원이 부유하는 용액을 직접 마우스 비장에 주입하여 면역해도 된다.
최종 면역으로부터 몇일 후에 비장을 적출하여 지방 조직을 박리한 후, 비세포 부유액을 제작한다. 이 비세포와, 예를 들면, HGPRT 결손 골수종 세포를 세포 융합하여 하이브리도마를 제작한다. 세포 융합제로서는 비세포(B세포)와 골수종 세포를 효과적으로 융합할 수 있는 방법이라면 무엇이어도 되고, 예를 들면, 센다이 바이러스(HVJ), 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 이용하는 방법 등을 들 수 있다. 또, 고 전압 펄스를 이용하는 방법으로 세포 융합을 해도 된다.
세포 융합 조작 후, HAT 배지에서 배양하고, 비세포와 골수종 세포가 융합된 하이브리도마의 클론을 선택하여, 스크리닝이 가능해질 때까지 세포가 성육하는 것을 기다린다. 목적으로 하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하기 위한 항체의 검출법이나 항체역가의 측정법에는, 항원 항체 반응계를 이용할 수 있다. 구체적으로는, 가용성 항원에 대한 항체 측정법으로, 방사성 동위 원소 면역 정량법(RIA), 효소 면역 정량법(ELISA) 등을 들 수 있다.
메틸화 DNA 항체의 성질(1개의 메틸화된 염기(사이토신)에 1개의 항체가 결합하는 것)에서 생각하면, 목적으로 하는 DNA 영역으로서는, 수많은 메틸화된 염 기(사이토신), 즉 CpG가 존재하는 영역을 선발하는 것이 바람직하고, 정량 정밀도 및 검출 감도의 향상을 기대할 수 있다.
본 발명 측정 방법의 제2 공정에 있어서의 「본 올리고뉴클레오티드」는, 메틸화 DNA 항체와 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA의 결합을 저해하지 않고 또한 상기의 단일 가닥 DNA와 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드이고, 예를 들면, 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA와 결합할 수 있는 염기 배열을 갖고 있으며, 또한, 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA와 결합했을 때, 메틸화 DNA 항체의 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA 중의 메틸화된 염기(사이토신)로의 결합을 저해하지 않는 올리고뉴클레오티드이다.
「목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA와 결합할 수 있는 염기 배열」이란, 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA와의 결합체(이중 가닥)를 형성하기 위해 필요한 염기 배열, 즉, 목적으로 하는 DNA 영역의 염기 배열의 일부에 상보적인 염기 배열을 포함하는 염기 배열, 또는 목적으로 하는 DNA 영역의 5’말단으로부터 또한 5’말단측 DNA 영역의 염기 배열의 일부에 상보적인 염기 배열을 포함하는 염기 배열, 또는 목적으로 하는 DNA 영역의 3’말단으로부터 또한 3’말단측의 염기 배열의 일부에 상보적인 염기 배열을 포함하는 염기 배열인 것을 의미한다.
또 「메틸화 DNA 항체와 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA의 결합을 저해하지 않고」란, 본 올리고뉴클레오티드의 염기 배열이, 메틸화 DNA 항체가 메틸화된 단일 가닥 DNA로의 결합에 요하는 점유 공간 내에서, 본 올리고뉴클레오티 드와 상기 단일 가닥 DNA의 상보적인 결합이 일어나지 않는 염기 배열인 것을 의미한다. 즉, 메틸화 DNA 항체가 메틸화된 염기(사이토신)에 결합하기 위해서는, 직접 결합하는 메틸화된 염기(사이토신)뿐만 아니라, 메틸화된 염기(사이토신)가 존재하는 주변 공간도 점유한다고 생각된다. 그러므로, 본 올리고뉴클레오티드는, 메틸화 DNA 항체가 메틸화된 DNA에 결합할 때에 요하는 점유 공간에서, 상기 단일 가닥 DNA와 상보적인 결합을 하지 않는 것이면 된다. 상기 단일 가닥 DNA에 결합시키는 본 올리고뉴클레오티드는, 1종류일 필요는 없고, 메틸화 DNA 항체의 결합을 저해하지 않으면, 2종류 이상 이용해도 된다. 복수의 본 올리고뉴클레오티드를 사용하면, 정량 정밀도 및 검출 감도를 향상시킬 수 있다.
본 발명 측정 방법의 제2 공정에서 형성되는 복합체, 또는 제2 공정의 복합체를 형성시키는 과정에서 생기는 제1 공정에서 분리된 단일 가닥 DNA와, 메틸화 DNA 항체와 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA 중에 존재하는 메틸화된 염기의 결합을 저해하지 않는 올리고뉴클레오티드의 결합체를 형성시킬 때의 바람직한 양태로서는, 2가 양이온을 함유하는 반응계 중에서 형성시키는 것을 들 수 있다. 보다 바람직하게는, 2가 양이온이 마그네슘 이온인 것을 들 수 있다. 여기에서 「2가 양이온을 함유하는 반응계」란, 본 발명 측정 방법의 제2 공정에서 형성되는 복합체, 또는 제2 공정의 복합체를 형성시키는 과정에서 생기는 제1 공정에서 분리된 단일 가닥 DNA와, 메틸화 DNA 항체와 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA 중에 존재하는 메틸화된 염기의 결합을 저해하지 않는 올리고뉴클레오티드의 결합체를 형성시키기 위해 이용되는 어닐링 버퍼 중에 2가 양이온 을 함유하는 반응계를 의미하고, 구체적으로는 예를 들면, 마그네슘 이온을 구성 요소로 하는 염(예를 들면, MgOAc2, MgCl2 등)을 1mM∼600mM 범위의 농도로 포함하는 것이 좋다.
본 발명 측정 방법의 제2 공정에 있어서의 「복합체를 형성」이란, 제1 공정에서 분리된 단일 가닥 DNA와, 본 올리고뉴클레오티드와, 메틸화 DNA 항체가 결합된 상태의 혼합물의 형성을 의미한다.
본 발명 측정 방법의 제2 공정에 있어서의 「복합체를 분리하기」위해서는, 상기의 복합체를 지지체에 결합시켜 고정함으로써 가능해진다. 지지체로서는, 복합체가 결합 가능한 지지체이면, 재질 및 형상은 무엇이어도 된다. 예를 들면, 형상은, 사용 목적에 적합하면 되고, 튜브형상, 테스트 플레이트형상, 필터형상, 디스크형상, 비즈형상 등을 들 수 있다. 또, 재질로서는, 통상의 면역 측정법용 지지체로서 이용되는 것, 예를 들면, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴산메틸, 폴리설폰, 폴리아크릴로니트릴, 나일론 등의 합성 수지, 또는 상기 합성 수지에 설폰기, 아미노기 등의 반응성 관능기를 도입한 것이어도 된다. 또, 글라스, 다당류 혹은 그 유도체(셀룰로오스, 니트로셀룰로오스 등), 실리카겔, 다공성 세라믹스, 금속 산화물 등이어도 된다.
복합체를 분리하기 위한, 복합체를 지지체에 결합시켜 고정하는 방법으로서는, 메틸화 DNA 항체를 지지체에 고정화하는 방법과, 본 올리고뉴클레오티드를 지지체에 고정화하는 방법의 2종류를 들 수 있다. 따라서, 본 발명 측정 방법의 제2 공정에 있어서의 「복합체를 형성시키는 동시에 혹은 형성시킨 후, 당해 복합체를 분리하는」이란, 구체적으로는, 「목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와, 본 올리고뉴클레오티드와, 지지체에 고정화 가능한 메틸화 DNA 항체를 동시 혹은 순차적으로 결합시켜, 복합체를 형성시키는 동시에 혹은 형성시킨 후, 당해 복합체에 포함되는, 지지체에 고정화 가능한 메틸화 DNA 항체를 지지체에 고정화하고, 복합체를 분리하는」것이나, 또는 「목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와, 지지체에 고정화 가능한 본 올리고뉴클레오티드와, 메틸화 DNA 항체를 동시 혹은 순차적으로 결합시켜, 복합체를 형성시키는 동시에 혹은 형성시킨 후, 당해 복합체에 포함되는 지지체에 고정화 가능한 본 올리고뉴클레오티드를 지지체에 고정화하고, 복합체를 분리하는」 것을 의미한다. 또한, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA를 메틸화 DNA 항체를 통해 지지체에 결합하는 경우에는, 본 올리고뉴클레오티드를 그 기능(후술)에 의해 검출 혹은 정량하고, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA를 본 올리고뉴클레오티드를 통해 지지체에 결합한 경우에는, 메틸화 DNA 항체를 그 기능(후술)에 의해 검출 혹은 정량하게 된다.
메틸화 DNA 항체가 지지체에 고정화될 수 있는 것으로서 사용되는 경우에는, 메틸화 DNA 항체가, 최종적으로, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와, 본 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성한 상태에서 지지체에 고정화할 수 있으면 되고,
(1) 상기 단일 가닥 DNA와 메틸화 DNA 항체의 결합 전의 단계에서, 메틸화 DNA 항체가 지지체에 고정화되어 있어도 되며, 또
(2) 상기 단일 가닥 DNA와 메틸화 DNA 항체의 결합 후의 단계에서, 메틸화 DNA 항체가 지지체에 고정화되어 있어도 된다.
메틸화 DNA 항체를 지지체에 고정하기 위해서는, 구체적으로는, 메틸화 DNA 항체를 비오틴화하여 얻어진 비오틴화 메틸화 DNA 항체를 스트렙트아비딘으로 피복한 지지체(예를 들면, 스트렙트아비딘으로 피복한 PCR 튜브, 스트렙트아비딘으로 피복한 자기 비즈, 스트렙트아비딘으로 일부를 피복한 크로마토스트립 등)에 고정하는 방법을 들 수 있다.
또, 메틸화 DNA 항체에, 아미노기, 티올기, 알데히드기 등의 활성 관능기를 갖는 분자를 공유 결합시킨 후, 이것을 실란 커플링제 등으로 표면을 활성화시킨 글라스, 다당류 유도체, 실리카겔, 또는 상기 합성 수지 등 혹은 내열성 플라스틱제의 지지체에 공유 결합시키는 방법도 있다. 또한, 상기의 공유 결합은, 예를 들면, 메틸화 DNA 항체에 상기의 활성 관능기를 갖는 분자를, 트리글리세리드를 5개 직렬로 연결하여 이루어지는 스페이서, 크로스 링커 등을 이용하여 공유 결합시키면 된다.
또한, 메틸화 DNA 항체를 직접 지지체에 고정화해도 되고, 또, 메틸화 DNA 항체에 대한 항체(2차 항체)를 지지체에 고정화하고, 2차 항체에 메틸화 항체를 결합시킴으로써 지지체에 고정해도 된다.
본 올리고뉴클레오티드가 지지체에 고정화될 수 있는 것으로서 사용되는 경 우에는, 본 올리고뉴클레오티드가, 최종적으로, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와 메틸화 DNA 항체의 복합체를 형성한 상태로 지지체에 고정화할 수 있으면 되고,
(1) 상기 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합 전의 단계에서, 본 올리고뉴클레오티드가 지지체에 고정화되어 있어도 되며, 또,
(2) 상기 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합 후의 단계에서, 본 올리고뉴클레오티드가 지지체에 고정화되어도 된다.
본 올리고뉴클레오티드를 지지체에 고정화하기 위해서는, 구체적으로는, 본 올리고뉴클레오티드의 5’말단 혹은 3’말단을 비오틴화하여 얻어진 비오틴화 올리고뉴클레오티드를 스트렙트아비딘으로 피복한 지지체(예를 들면, 스트렙트아비딘으로 피복한 PCR 튜브, 스트렙트아비딘으로 피복한 자기 비즈, 스트렙트아비딘으로 일부를 피복한 크로마토스트립 등)에 고정하는 방법을 들 수 있다.
또, 본 올리고뉴클레오티드의 5’말단 혹은 3’말단에, 아미노기, 티올기, 알데히드기 등의 활성 관능기를 갖는 분자를 공유 결합시킨 후, 이것을 실란 커플링제 등으로 표면을 활성화시킨 글라스, 다당류 유도체, 실리카겔, 또는 상기 합성 수지 등 혹은 내열성 플라스틱제의 지지체에 공유 결합시키는 방법도 있다. 또한, 상기의 공유 결합은, 예를 들면, 트리글리세리드를 5개 직렬로 연결하여 이루어지는 스페이서, 크로스 링커 등을 이용하여 공유 결합시키면 된다. 또한, 글라스 혹은 실리콘제의 지지체 상에서 직접, 본 올리고뉴클레오티드의 말단측으로부터 화학 합성시키는 방법이어도 된다.
본 발명 측정 방법의 제2 공정에 있어서 「복합체를 형성시키는 동시에 혹은 형성시킨 후, 당해 복합체를 분리하기」위해서는, 「목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와, 본 올리고뉴클레오티드와, 지지체에 고정화 가능한 메틸화 DNA 항체를 결합시켜, 복합체를 형성시키는 동시에 혹은 형성시킨 후, 지지체에 고정화 가능한 메틸화 DNA 항체를 지지체에 고정화하고, 복합체를 분리하는」경우, 구체적으로는 예를 들면, 지지체에 고정화 가능한 메틸화 DNA 항체로서, 「비오틴 표식된 비오틴화 메틸화 DNA 항체」를 사용하여, 이하와 같이 실시하면 된다.
(a) 비오틴화 메틸화 DNA 항체를 적당량(예를 들면, 4μg/mL 용액을 100μL/웰) 아비딘 피복 플레이트에 첨가하고, 그 후, 실온에서, 예를 들면, 약 2시간 정치(靜置)함으로써, 비오틴화 메틸화 DNA 항체와 스트렙트아비딘의 고정화를 촉진한다. 그 후, 잔여 용액의 제거 및 세정을 행한다. 세정 버퍼(예를 들면, 0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4))를, 예를 들면 300μL/웰의 비율로 첨가하고, 용액을 제거한다. 이 세정 조작을 몇 차례 반복하여, 지지체에 고정화된 비오틴화 메틸화 사이토신 항체를 웰 상에 남긴다.
(b) 생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA 유래의 DNA 시료에 포함되는 이중 가닥 DNA를 분리시켜 얻어진 단일 가닥 DNA와, 본 올리고뉴클레오티드와, 어닐링 버퍼(예를 들면, 33mM Tris-Acetate pH 7.9, 66mM KOAc, 10mM MgOAc2, 0.5mM Dithiothreitol)를 혼합하여, 95℃로 예를 들면 몇 분간 가열한다. 그 후, 목적으 로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체를 형성시키기 위해, 본 올리고뉴클레오티드의 Tm값의 약 10∼20℃ 낮은 온도까지 급속하게 냉각하고, 그 온도로 예를 들면 몇 분간 보온하며, 그 후, 실온으로 되돌린다(이 단계에서 형성된 결합체는, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체 외에, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하지 않는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체를 포함하고 있다).
(c) 형성된 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체를, 비오틴화 메틸화 DNA 항체가 고정화된 아비딘 피복 플레이트에 첨가하고, 그 후, 실온에서 약 3시간 정치하여, 비오틴화 메틸화 DNA 항체와, 상기 단일 가닥 DNA 중 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와, 본 올리고뉴클레오티드의 복합체의 형성을 촉진한다(복합체의 형성)(이 단계에서, 메틸화되어 있지 않은 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체는, 복합체를 형성하지 않는다). 그 후, 잔여 용액의 제거 및 세정을 행한다. 세정 버퍼(예를 들면, 0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4))를, 예를 들면 300μL/웰의 비율로 첨가하고, 용액을 제거한다. 이 세정 조작을 몇 차례 반복함으로써, 복합체를 웰 상에 남긴다(복합체의 분리).
(b)에 있어서 사용하는 어닐링 버퍼로서는, 본 올리고뉴클레오티드와, 목적 으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA를 결합시키는데 적합하면 되고, 상기 어닐링 버퍼에 한정되는 것은 아니다. 2가 이온, 바람직하게는 마그네슘 이온이 1∼600mM의 농도로 용해되어 있는 것을 사용하면 결합의 안정성이 증가한다.
(a) 및 (c)에 있어서의 세정 조작은, 용액 중에 부유하고 있는 고정화되어 있지 않은 메틸화 DNA 항체와, 메틸화 DNA 항체에 결합되지 않은 용액 중에 부유하고 있는 메틸화되어 있지 않은 단일 가닥 DNA와, 본 올리고뉴클레오티드의 결합체를 형성하지 않은 목적으로 하는 영역 이외의 단일 가닥 DNA, 또는 후술의 제한 효소로 소화된 용액 중에 부유하고 있는 DNA 등을 반응 용액으로부터 제거하기 위해 중요하다. 또한, 세정 버퍼는, 상기의 유리된 메틸화 DNA 항체, 용액 중에 부유하고 있는 단일 가닥 DNA 등의 제거에 적합하면 되고, 상기 세정 버퍼에 한정되지 않으며, DELFIA 버퍼(Perkin Elmer사제, Tris-HCl pH 7.8 with Tween 80), TE 버퍼 등이어도 된다.
전술한 바와 같이, 상기 (a)∼(c)에서는, 상기의 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA와, 본 올리고뉴클레오티드의 결합 후, 생기는 결합체에 비오틴화 메틸화 DNA 항체를 결합시켜, 복합체를 형성하고 있지만, 이 순서에 한정되는 것은 아니다. 즉, 상기의 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA와 비오틴화 메틸화 DNA 항체를 결합시킨 후, 생성된 결합체에 본 올리고뉴클레오티드를 결합시켜, 복합체를 형성해도 된다. 예를 들면, 스트렙트아비딘으로 피복한 지지체에 고정화된 비오틴화 메틸화 DNA 항체에, 생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA 유래의 DNA 시료에 포함되는 이중 가닥 DNA를 분리하여 얻어진 단일 가닥 DNA 를 첨가함으로써, 지지체에 고정화된 비오틴화 메틸화 DNA 항체와 당해 단일 가닥 DNA의 결합체를 형성시킨다(이 단계에서 형성된 결합체는, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와 메틸화 항체의 결합체 외에, 목적으로 하는 DNA 영역 이외의 메틸화된 단일 가닥 DNA와 메틸화 항체의 결합체를 포함하고 있다). 그 후, 이것에 본 올리고뉴클레오티드를 첨가하여, 상기 결합체 중 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA를 갖는 결합체와의 복합체를 형성시켜, 분리해도 된다(이 단계에서, 목적으로 하는 DNA 영역 이외의 영역에서의 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와 메틸화 항체의 결합체는 복합체를 형성하지 않는다).
상기 (a)∼(c)의 조작을, 크로마토스트립을 이용하여 행하는 것도 가능하다. 그 경우에는, 구체적으로는 이하와 같이 실시한다. 예를 들면, 우선, 비오틴화 메틸화 DNA 항체의 적당량을, 스트렙트아비딘으로 일부를 피복한 크로마토스트립에 의해 전개한다. 당해 조작에 의해, 비오틴화 메틸화 DNA 항체가, 스트렙트아비딘으로 피복된 부분에 고정화되게 된다. 다음에, (b)에서 얻어진 상기 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체(이 단계에서 형성된 결합체는, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체 외에, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하지 않는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체를 포함하고 있다)를, 상기의 크로마토스트립에 의해 전개한다. 이들 조작에 의해, 생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA 유래의 DNA 시료에 포함되는 이중 가닥 DNA를 분해하여 얻어진 단일 가닥 DNA 와, 본 올리고뉴클레오티드와, 비오틴화 메틸화 DNA 항체로 이루어지는 복합체가, 스트렙트아비딘으로 피복한 부분에 고정화되게 된다(복합체의 형성·선택)(이 단계에서, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하지 않는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체는, 복합체를 형성하지 않는다). 복합체 형성의 순서에 대해서는, 이들 조작의 순서에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와, 본 올리고뉴클레오티드와, 비오틴화 메틸화 DNA 항체로 이루어지는 복합체를 형성시킨 후, 이것을 크로마토스트립으로 전개하여, 스트렙트아비딘으로 피복한 부분에, 당해 복합체를 고정화해도 된다. 이들 조작에서는, 용액을 크로마토스트립에 의해 전개함으로써 불필요한 성분을 제거할 수 있고, 세정 조작을 생략하는 것이 가능해진다. 물론, 각 조작 사이에, 세정 조작(세정 버퍼(예를 들면, 0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)에 의한 크로마토스트립의 전개)을 실시해도 문제는 없다.
또 그밖에, 본 발명 측정 방법의 제2 공정에 있어서 「복합체를 형성시키는 동시에 혹은 형성시킨 후, 당해 복합체를 분리하기」위해서는, 「목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와, 본 올리고뉴클레오티드와, 지지체에 고정화 가능한 메틸화 DNA 항체를 결합시켜, 복합체를 형성시키는 동시에 혹은 형성시킨 후, 지지체에 고정화 가능한 메틸화 DNA 항체를 지지체에 고정화하고, 복합체를 분리하는」경우, 구체적으로는 예를 들면, 지지체에 고정화 가능 한 메틸화 DNA 항체로서, 「비오틴 표식된 비오틴화 메틸화 DNA 항체」를 사용하여, 이하와 같이 실시하면 된다.
(a) 생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA 유래의 DNA 시료에, 어닐링 버퍼(예를 들면, 33mM Tris-Acetate pH 7.9, 66mM KOAc, 10mM MgOAc2, 0.5mM Dithiothreitol) 및 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드를 첨가함으로써, 혼합물을 얻는다. 다음에, 얻어진 혼합물을, 생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA 유래의 DNA 시료에 포함되는 이중 가닥 DNA를 분리하여 단일 가닥 DNA를 얻기 위해, 95℃로 예를 들면 몇 분간 가열한다. 그 후, 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA와 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드의 결합체를 형성시키기 위해, 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드의 Tm값의 약 10∼20℃ 낮은 온도까지 급속하게 냉각하고, 그 온도로 예를 들면 몇 분간 보온하며, 그 후, 실온으로 되돌린다(이 단계에서 형성된 결합체는, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체 외에, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하지 않는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체를 포함하고 있다).
(b) 스트렙트아비딘으로 피복한 지지체에, 상기 (a)에서 얻어진 혼합물을 첨가하고, 또한, 이것을 37℃로 예를 들면 몇 분간 보온함으로써, 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA와 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드의 결합체를 스트렙트아비딘으로 피복한 지지체에 고정한다. 그 후, 잔여 용액의 제거 및 세정을 행한다. 세정 버퍼(예를 들면, 0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4))를, 예를 들면 300μL/웰의 비율로 첨가하고, 용액을 제거한다. 이 세정 조작을 몇 차례 반복하여, 지지체에 고정화된 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드와 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA의 결합체를 웰 상에 남긴다(이 단계에서도 결합체는, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체 외에, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하지 않는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체를 포함하고 있다).
(c) 메틸화 DNA 항체를 적당량(예를 들면, 4μg/mL 용액을 100μL/웰) 웰에 첨가하고, 그 후, 실온에서, 예를 들면, 약 3시간 정치함으로써, 메틸화 DNA 항체와, 상기 단일 가닥 DNA 중 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와, 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드의 복합체의 형성을 촉진한다(복합체의 형성)(이 단계에서, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하지 않는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체는, 복합체를 형성하지 않는다). 그 후, 잔여 용액의 제거 및 세정을 행한다. 세정 버퍼(예를 들면, 0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4))를, 예를 들면 300μL/웰의 비율로 첨가하고, 용액을 제거한다. 이 세정 조작을 몇 차례 반복함으로써, 복합체를 웰 상에 남긴다(복합체의 분리).
(a)에 있어서 사용하는 어닐링 버퍼로서는, 본 올리고뉴클레오티드와, 목적 으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA를 결합시키는데 적합하면 되고, 상기 어닐링 버퍼에 한정되는 것은 아니다. 2가 이온, 바람직하게는 마그네슘 이온이 1∼600mM의 농도로 용해되어 있는 것을 사용하면 결합의 안정성이 증가한다.
(b) 및 (c)에 있어서의 세정 조작은, 용액 중에 부유하고 있는 고정화되어 있지 않은 메틸화 DNA 항체, 메틸화 DNA 항체에 결합되지 않은 용액 중에 부유하고 있는 메틸화되어 있지 않은 단일 가닥 DNA, 또는 후술의 제한 효소로 소화된 용액 중에 부유하고 있는 DNA 등을 반응 용액으로부터 제거하기 위해 중요하다. 또한, 세정 버퍼는, 상기의 유리된 메틸화 DNA 항체, 용액 중에 부유하고 있는 단일 가닥 DNA 등의 제거에 적합하면 되고, 상기 세정 버퍼에 한정되지 않으며, DELFIA 버퍼(PerkinElmer사제, Tris-HCl pH 7.8 with Tween 80), TE 버퍼 등이어도 된다.
전술한 바와 같이, 상기 (a)∼(c)에서는, 상기의 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA와, 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드의 결합 후, 생기는 결합체에 포함되는 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드와 스트렙트아비딘으로 피복한 지지체를 결합시켜, 복합체를 형성하고 있지만, 이 순서에 한정되는 것은 아니다. 즉, 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드와 스트렙트아비딘으로 피복한 지지체를 결합시킨 후, 생기는 결합체에 상기의 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA를 결합시켜, 복합체를 형성해도 된다. 예를 들면, 스트렙트아비딘으로 피복한 지지체에 고정화된 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드에, 생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA 유래의 DNA 시료에 포함되는 이중 가닥 DNA를 첨가함으로써, 지지체에 고정화된 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드와 당해 이중 가닥 DNA의 혼합물을 얻 는다. 얻어진 혼합물에 포함되는 당해 이중 가닥 DNA를 분리하여 단일 가닥 DNA를 얻기 위해, 당해 혼합물을 95℃로, 예를 들면, 몇 분간 가열한다. 얻어진 단일 가닥 DNA와 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드의 결합체를 형성시키기 위해, 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드의 Tm값의 약 10∼20℃ 낮은 온도까지 급속하게 냉각하고, 그 온도로, 예를 들면, 몇 분간 보온한다. 그 후, (c)의 조작을 실시하여 복합체를 형성·분리해도 된다(이 단계에서, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하지 않는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체는, 복합체를 형성하지 않는다).
상기 (a)∼(c)의 조작을, 크로마토스트립을 이용하여 행하는 것도 가능하다. 그 경우에는, 구체적으로는, 이하와 같이 실시한다. 예를 들면, 우선, 생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA 유래의 DNA 시료에 포함되는 이중 가닥 DNA를 분해하여 얻어진 단일 가닥 DNA와 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드의 결합체를 포함하는 용액을, 스트렙트아비딘으로 일부를 피복한 크로마토스트립에 의해 전개한다. 당해 조작에 의해, 생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA 유래의 DNA 시료에 포함되는 이중 가닥 DNA를 분해하여 얻어진 단일 가닥 DNA와 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드의 결합체가, 스트렙트아비딘으로 피복된 부분에 고정화되게 된다(이 단계에서 형성된 결합체는, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와 메틸화 항체의 결합체 외에, 목적으로 하는 DNA 영역 이외의 메틸화된 단일 가닥 DNA와 메틸화 항체의 결합체를 포함하고 있다). 다음에, 메틸화 DNA 항체의 적당량을, 상기의 크로마토스트립에 의해 전개한다. 당해 조작에 의해, 생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA 유래의 DNA 시료에 포함되는 이중 가닥 DNA를 분해하여 얻어진 단일 가닥 DNA와, 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드와, 메틸화 DNA 항체로 이루어지는 복합체가, 스트렙트아비딘으로 피복한 부분에 고정화되게 된다(복합체의 형성·선택)(이 단계에서, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하지 않는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체는, 복합체를 형성하지 않는다). 복합체 형성의 순서에 대해서는, 이들 조작의 순서에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와, 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드와, 메틸화 DNA 항체로 이루어지는 복합체를 형성시킨 후, 이것을 크로마토스트립으로 전개하여, 스트렙트아비딘으로 피복한 부분에, 당해 복합체를 고정화해도 된다. 이들 조작에서는, 용액을 크로마토스트립에 의해 전개함으로써, 불필요한 성분을 제거할 수 있고, 세정 조작을 생략하는 것이 가능해진다. 물론, 각 조작 사이에, 세정 조작(세정 버퍼(예를 들면, 0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)에 의한 크로마토스트립의 전개)을 실시해도 문제는 없다.
본 발명 측정 방법의 제3 공정에 있어서의 「식별 기능」이란, 검출 혹은 정량을 위해 이용되는 표식에 의거한 기능이며, 구체적으로는, 메틸화 DNA 항체의 경우에는, 유로퓸 표식, 금 콜로이드 표식, 라텍스 비즈 표식, 방사성 동위체 표식, 형광물질(FITC 등) 표식, horseradish Peroxidase(HRP) 표식, 알칼리 포스파타아제 표식, 비오틴 표식 등이 이루어진 메틸화 DNA 항체의 형광·발색 등의 특성을 들 수 있고, 또, 항체 자신의 특성(항체 자신이 2차 항체와 결합하는 특성 등) 등도 당해 기능으로서 들 수 있다. 한편, 본 올리고뉴클레오티드의 경우에는, 그 5’말단 혹은 3’말단에 유로퓸 표식, 금 콜로이드 표식, 라텍스 비즈 표식, 방사성 동위체 표식, 형광물질(FITC 등) 표식, horseradish Peroxidase(HRP) 표식, 알칼리 포스파타아제 표식 등이 이루어진 본 올리고뉴클레오티드의 형광·발색 등의 특성을 들 수 있다. 이들 기능에 의거한 검출 혹은 정량에는, 예를 들면, 방사선 검출기, 분광 광도계 등에 의한 측정 또는 눈으로 확인하는 것 등을 이용하면 된다.
메틸화 DNA 항체의 경우, 상기한 바와 같이, 항체 자신의 특성을 기능으로서 생각해도 되고, 항체 자신이 표식되어 있지 않아도, 검출 혹은 정량 가능한 기능이 부가된 2차 항체를 사용함으로써, 메틸화 DNA 항체를 간접적으로 검출 혹은 정량할 수 있다.
목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA를 메틸화 DNA 항체를 통해 지지체에 결합하는 경우에는, 본 올리고뉴클레오티드를, 그 기능에 의해 검출 혹은 정량하고, 또 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA를 본 올리고뉴클레오티드를 통해 지지체에 결합한 경우에는, 메틸화 DNA 항체를, 그 기능에 의해 검출 혹은 정량하게 된다.
메틸화 DNA 항체를, 그 기능에 의해 검출 혹은 정량하는 경우에는, 구체적으로는 예를 들면, 항체 자신의 특성을 기능으로서 이용할 때에는, 이하와 같이 조작을 행하면 된다. 복합체에 메틸화 DNA 항체에 대한 2차 항체(예를 들면, Eu-N1 표식 마우스 IgG 항체 : PerkinElmer사제)를 첨가하여, 실온에서 약 1시간 정치하고, 2차 항체의 복합체로의 결합을 촉진한다. 그 후, Enhancement Solution(PerkinElmer사제)을 첨가·혼합하여, 예를 들면 약 45분간 실온에서 정치한다. 그 후, 형광 검출기로 형광(여기 340nm/형광 612nm)을 측정함으로써, 메틸화 DNA 항체를 검출 혹은 정량한다.
2차 항체로서 FITC를 결합시킨 항체를 이용하는 경우, 공지의 방법에 의해, FITC의 형광을 측정하여, 메틸화 DNA 항체를 검출 혹은 정량할 수도 있다.
또, 예를 들면, 본 올리고뉴클레오티드의 고정화에 비오틴을 이용하지 않는 경우, 비오틴화 메틸화 DNA 항체를 검출 혹은 정량에 이용할 수 있다. 비오틴화 메틸화 DNA 항체를 검출 혹은 정량하는 경우에는, 예를 들면, HRP 표식 스트렙트아비딘을 비오틴화 메틸화 DNA 항체에 첨가·혼합하고, 비오틴화 메틸화 DNA 항체와 HRP 표식 스트렙트아비딘의 결합체를 형성·분리한 후, 공지의 방법에 의해 HRP의 활성을 측정함으로써 비오틴화 메틸화 DNA 항체를 검출 혹은 정량할 수 있다.
본 올리고뉴클레오티드를, 그 기능에 의해 검출 혹은 정량하는 경우에는, 구체적으로는 예를 들면, 복합체를 형성하기 위해 필요한 본 올리고뉴클레오티드로서, FITC 표식한 FITC화 올리고뉴클레오티드를 이용해, 전술한 방법에 준하여, 복합체를 형성시키고, 복합체를 분리한다. 얻어진 복합체에 대해, 공지의 방법에 의해, FITC의 형광을 측정하고, 본 올리고뉴클레오티드를 검출 혹은 정량한다. 또, FITC에 대한 2차 항체(예를 들면, HRP 표식 항 FITC 항체 : Jackson ImmunoResearch Laboratories사제)를 첨가하여, 실온에서 약 2시간 정치하고, 2차 항체의 복합체로의 결합을 촉진한다. 그 후, 적절한 기질(예를 들면, Substrate Reagent Pack #DY999 : R&D SYSTEMS사제)을 첨가·혼합하여, 예를 들면 5∼20분간 실온에서 정치한다. 그 후, Stop Solution(1N H2SO4)을 첨가한다. 첨가 후, 30분 이내에, 흡광도 검출기로 450nm의 흡광도를 측정하고, 본 올리고뉴클레오티드를 검출 혹은 정량하는 방법도 가능하다.
또, 메틸화 DNA 항체의 고정화에 비오틴을 이용하지 않는 경우, 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드를 검출 혹은 정량에 이용할 수 있다. 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드를 검출 혹은 정량하는 경우에는, 예를 들면, HRP 표식 스트렙트아비딘을 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드를 첨가·혼합하고, 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드와 HRP 표식 스트렙트아비딘의 결합체를 형성·분리한 후, 공지의 방법에 의해 HRP의 활성을 측정함으로써 비오틴화 메틸화 DNA 항체를 검출 혹은 정량할 수 있다.
본 발명은, 본 발명 측정 방법의 제1 공정의 종료 직후부터, 제3 공정의 개시 직전까지의 사이에, 제1 공정에서 분리된 단일 가닥 DNA를, 적어도 1종류의 단일 가닥 DNA를 소화할 수 있는 메틸화 감수성 제한 효소에 의해 소화하는 공정을, 추가적으로 갖는 변법(변법 1), 및 본 발명 측정 방법의 제1 공정의 종료 직후부터, 제3 공정의 개시 직전까지의 사이에, 추가적으로 갖는 변법(변법 2)을 포함한다.
당해 변법(변법 1 및 변법 2)에 있어서의 「메틸화 감수성 제한 효소」란, 예를 들면, 메틸화된 사이토신을 포함하는 인식 배열을 소화하지 않고, 메틸화되어 있지 않은 사이토신을 포함하는 인식 배열만을 소화할 수 있는 제한 효소 등을 의미한다. 즉, 메틸화 감수성 제한 효소를 본래 인식할 수 있는 인식 배열에 포함되는 사이토신이 메틸화되어 있는 DNA의 경우에는, 당해 메틸화 감수성 제한 효소를 당해 DNA에 작용시켜도, 당해 DNA는 절단되지 않는다. 이에 반해, 메틸화 감수성 제한 효소를 본래 인식할 수 있는 인식 배열에 포함되는 사이토신이 메틸화되어 있지 않은 DNA의 경우에는, 당해 메틸화 감수성 제한 효소를 당해 DNA에 작용시키면, 당해 DNA는 절단된다. 이러한 메틸화 감수성 효소의 구체적인 예로서는, 예를 들면, HpaII, BstUI, NarI, SacII, HhaI 등을 들 수 있다. 또한, 상기의 메틸화 감수성 제한 효소는, 헤미메틸 상태의 CpG를 포함하는 이중 가닥 DNA(즉, 상기 CpG 중, 한 쪽 가닥의 사이토신이 메틸화되어 있고, 다른 쪽 가닥의 사이토신이 메틸화되어 있지 않은 이중 가닥 DNA)를 절단하지 않는 것이고, 이미 Gruenbaum들에 의해 밝혀져 있다(Nucleic Acid Research, 9, 2509-2515). 또, 「단일 가닥 DNA를 소화할 수 있는 메틸화 감수성 제한 효소」란, 예를 들면, 단일 가닥 DNA 중의, 메틸화된 사이토신을 포함하는 인식 배열을 소화하지 않고, 메틸화되어 있지 않은 사이토신을 포함하는 인식 배열만을 소화할 수 있는 제한 효소 등을 의미한다. 즉, 메틸화 감수성 제한 효소 중에는, 단일 가닥 DNA를 소화하는 것도 있다. 예를 들면, HhaI 등을 들 수 있다.
메틸화 감수성 제한 효소에 의한 소화 처리에서의 염려점으로서, 메틸화되어 있지 않은 사이토신을 포함하는 인식 배열을 완전히 소화할 수 없을(소위 「DNA의 남은 조각」) 우려를 들 수 있다. 이러한 우려가 문제가 되는 경우에는, 메틸화 감수성 제한 효소의 인식 부위가 많이 존재하면, 「DNA의 남은 조각」을 최소한으로 억제할 수 있으므로, 목적으로 하는 DNA 영역으로서는, 메틸화 감수성 제한 효소의 인식 부위를 적어도 1개 이상 갖고 있고, 그 인식 부위가 많으면 많을수록 좋다고 생각된다.
상기한 바와 같이, 목적으로 하는 DNA 영역으로서는, 메틸화 DNA 항체의 성질(1개의 메틸화된 염기(사이토신)에 1개의 항체가 결합하는 것)에서 생각하면, 목적으로 하는 DNA 영역으로서는, 수많은 메틸화된 염기(사이토신, CpG)가 존재하는 영역을, 또 「DNA의 남은 조각」을 최소한으로 억제한다는 관점에서, 메틸화 감수성 제한 효소의 인식 부위가 많이 존재하는 영역을 선발하는 것이 바람직하다.
변법 2에 있어서의 「마스킹용 올리고뉴클레오티드」란, 메틸화 감수성 제한 효소의 인식 부위의 염기 배열과 상보적인 염기로 이루어지는 올리고뉴클레오티드이며, 단일 가닥 DNA 중의 목적으로 하는 DNA 영역에 포함되는 몇 개소 존재하는 메틸화 감수성 제한 효소의 인식 배열 중, 적어도 1개소(모든 개소여도 되고, 목적으로 하는 영역의 염기 배열에 따라서는, 하기의 8∼30 염기 길이에, 1개소 이상이 동시에 포함되는 경우도 있다)와 상보적으로 결합함으로써 이중 가닥 DNA를 형성하고(즉, 상기 개소를 이중 가닥 DNA 상태로 하고), 이중 가닥 DNA만을 기질로 하는 메틸화 감수성 효소여도 상기 개소를 소화할 수 있도록, 또, 단일 가닥 DNA를 소화할 수 있는 메틸화 감수성 제한 효소(단일 가닥 DNA를 소화할 수 있는 메틸화 감수성 제한 효소는 이중 가닥 DNA도 소화할 수 있고, 그 소화 효율은, 이중 가닥 DNA에 대한 쪽이 단일 가닥 DNA에 대한 쪽보다 높다)로의 상기 개소의 소화 효율을 향 상시킬 수 있도록 하기 위한 올리고뉴클레오티드이며, 또한, 목적으로 하는 영역의 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체의 형성을 저해하지 않는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
마스킹용 올리고뉴클레오티드로서는, 더욱 구체적으로는, 단일 가닥 DNA 중의 목적 DNA 영역에 포함되는 몇 개소 존재하는 메틸화 감수성 제한 효소의 인식 배열 중 1개소의 특정 개소(목적 영역의 염기 배열에 따라서는, 하기의 8∼30 염기 길이에, 1개소 이상이 동시에 포함되는 경우도 있다)를 포함한 8∼30 염기 길이의 염기 배열에 대해, 상보성이 있는 염기 배열을 갖고, 또한, 목적으로 하는 영역의 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체의 형성을 저해하지 않는 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.
게놈 DNA 유래의 DNA 시료에 포함되는 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA(플러스 가닥)와 혼합시키는 마스킹용 올리고뉴클레오티드는, 1종류여도 되고 복수 종류여도 된다. 복수 종류를 이용하면, 목적으로 하는 영역의 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA의 메틸화 감수성 제한 효소의 인식 부위의 대부분이 이중 가닥 DNA 상태가 되고, 메틸화 감수성 제한 효소로의, 상기의 「DNA의 남은 조각」을 최소한으로 억제할 수 있다. 단, 마스킹용 올리고뉴클레오티드가 이중 가닥 DNA를 형성한 개소에는, 메틸화 DNA 항체를 결합할 수 없어지므로, 마스킹용 올리고뉴클레오티드를, 너무 많은 메틸화 감수성 제한 효소 인식 부위에 대해 이용하는 것은 적절하지 않으며, 적당한 종류를 이용하는 것이 바람직하다. 만일, 목적으로 하는 DNA 영역에 포함되는 모든 메틸화 감수성 제한 효소의 인식 부위에 마스 킹용 올리고뉴클레오티드를 사용하면, 당해 인식 부위에 있어서의 메틸화되어 있는 염기(사이토신)와 메틸화 DNA 항체의 결합이 저해되어, 원하는 복합체의 형성 확립이 낮아질 가능성이 있다(당해 인식 부위 이외의 CpG에, 메틸화 DNA 항체는 물론 결합되지만, 메틸화 DNA 항체를 검출 혹은 정량하는 경우, 그 검출 감도 및 정량 정밀도는 낮아진다). 마스킹용 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 목적으로 하는 DNA 영역에 포함되는 몇 개소 존재하는 메틸화 감수성 제한 효소의 인식 배열 중, 메틸화되어 있는 경우에는 소화하지 않고 메틸화되어 있지 않은 경우에는 소화하고 싶은 개소(예를 들면, 질환 환자 검체에서는 100% 메틸화되어 있고, 정상인 검체에서는 100% 메틸화되어 있지 않은 개소 등)에 따라 설계하며, 이것을 사용하는 것이 특히 유용하다.
당해 변법(변법 1 및 변법 2)에 있어서, 제1 공정 후로부터, 제3 공정의 개시 직전까지의 사이에, 제1 공정에서 분리된 단일 가닥 DNA를, 적어도 1종류의 단일 가닥 DNA를 소화할 수 있는 메틸화 감수성 제한 효소에 의해 소화하는 공정을 추가적으로 실시함으로써, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하지 않는 단일 가닥 DNA(플러스 가닥)를 갖는 복합체의 형성을 최소한으로 억제(배제한다)할 수 있고, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA의 검출 감도 및 정량 정밀도가 향상한다.
변법 1에 있어서의, 제1 공정의 종료 직후부터 제3 공정의 개시 직전까지의 사이에 추가적으로 실시하는, 제1 공정에서 분리된 단일 가닥 DNA를, 적어도 1종류의 단일 가닥 DNA를 소화할 수 있는 메틸화 감수성 제한 효소에 의해 소화 처리하 는 공정은, 구체적으로는 예를 들면, 이하와 같이 실시하면 된다. 제1 공정에서 분리된 단일 가닥 DNA를 포함하는 용액 10μL에, 최적인 10×완충액을 3μL, 단일 가닥을 소화할 수 있는 메틸화 감수성 효소(HhaI)를 15U, 그밖에, 필요에 따라 BSA 등을 적당량 더하고, 다음에 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 30μL로 하여, 37℃로 예를 들면 1시간∼하룻밤 인큐베이션한다. 이에 의해, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화되어 있지 않은 HhaI 인식 부위는 소화되게 된다(처리 용액). 예를 들면, 당해 공정을 복합체 형성 전에 실시하는 경우에는, 복합체 형성 및/또는 분리 시에 세정 조작을 실시하므로, 상기의 처리 용액을 복합체 형성에 직접 사용하면 된다. 또 당해 공정을 복합체 분리 후에 실시하는 경우에는, 처리 용액 중에 존재하는 부유의 단일 가닥 DNA(당해 메틸화 감수성 제한 효소의 인식 부위가 메틸화되어 있지 않고, 그 때문에 소화되어 생성된 단일 가닥 DNA)를 처리 용액 중으로부터 제거할 필요가 있으므로, 복합체 형성 및/또는 분리 시에 실시하는 세정 조작과 동일한 세정 조작을, 당해 공정 종료 후에 재차 실시할 필요가 있다.
변법 2에 있어서의, 제1 공정의 종료 직후부터 제3 공정의 개시 직전까지의 사이에, 추가적으로 실시하는, (i) 제1 공정에서 분리된 단일 가닥 DNA, 및 적어도 1종류의 메틸화 감수성 제한 효소의 인식 배열을 그 일부로서 갖는 마스킹용 올리고뉴클레오티드를 혼합하는 공정, 및 (ii) 이전 공정에 의해 얻어진 혼합물(중에 존재하는 목적으로 하는 DNA 영역에서 DNA가 메틸화되어 있지 않은 단일 가닥 DNA)을 상기의 메틸화 감수성 제한 효소에 의해 소화하는 공정은, 구체적으로는 예를 들면, 이하와 같이 실시하면 된다. 제1 공정에서 분리된 단일 가닥 DNA를 포함하 는 용액 10μL에, 최적인 10×완충액을 3μL, 메틸화 감수성 효소(HhaI, HhaI 등)를 15U, 상기 메틸화 감수성 효소의 인식 배열 중 1개소의 특정 개소에 대한 마스킹용 올리고뉴클레오티드를 약 10pmol, 그밖에, 필요에 따라 BSA 등을 적당량 더하고, 다음에 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 30μL로 하여, 37℃로 예를 들면 1시간∼하룻밤 인큐베이션한다. 이에 의해, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화되어 있지 않은 당해 개소는 소화되게 된다(처리 용액). 예를 들면, 당해 조작을 복합체 형성 전에 실시하는 경우에는, 복합체 형성 및/또는 분리 시에 세정 조작을 실시하므로, 상기의 처리 용액을 복합체 형성에 직접 사용하면 된다. 또, 당해 조작을 복합체 분리 후에 실시하는 경우에는, 처리 용액 중에 존재하는 부유의 단일 가닥 DNA(당해 메틸화 감수성 제한 효소의 인식 부위가 메틸화되어 있지 않고, 그 때문에 소화되어 생성된 단일 가닥 DNA)를 처리 용액 중으로부터 제거할 필요가 있으므로, 복합체 형성 및/또는 분리 시에 실시하는 세정 조작과 동일한 세정 조작을, 당해 공정 종료 후에 재차 실시할 필요가 있다.
또 본 발명 측정 방법에 있어서, 「생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA 유래의 DNA 시료」가, 당해 게놈 DNA가 갖는 목적으로 하는 DNA 영역을 인식 절단 부위로 하지 않는 제한 효소로 미리 소화 처리되어 이루어지는 DNA 시료인 것을 바람직한 양태의 하나로서 들 수 있다. 제1 공정에서 분리된 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체를 형성시키는 경우에는, 당해 단일 가닥 DNA는, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하고 있으면 짧은 쪽이 보다 복합체를 형성시키기 쉬울 뿐만 아니라, 조작성도 좋다고 생각된다. 당해 단일 가닥 DNA를 짧게 하기 위해서는, 본래의 게놈 DNA의 시점에서 짧게 해 두는 것이 효율적이다. 따라서, 목적으로 하는 DNA 영역을 인식 절단 부위로 하지 않는 제한 효소를 생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA 유래의 DNA 시료에 직접 사용하여 소화 처리를 이전 처리로서 실시해 두는 것이 좋다. 목적으로 하는 DNA 영역을 인식 절단 부위로 하지 않는 제한 효소에 의해 소화 처리하는 방법으로서는, 일반적인 제한 효소 처리법을 이용하면 된다. 또한, 상기 DNA 시료가 미리 정제되어 이루어지는 DNA 시료인 경우에는, 일반적으로 이용되는 양의 제한 효소를 이용하여 소화 처리를 실시하면 되고, 생물 유래 검체가, 조직 용해액, 세포 용해액 등인 경우에는, 대과잉의 제한 효소, 예를 들면, DNA량에 대해 500배량 또는 그 이상의 제한 효소를 이용하여 소화 처리를 실시하면 된다.
또 「생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA 유래의 DNA 시료」가, 적어도 1종류 이상의 메틸화 감수성 제한 효소로 소화 처리되어 이루어지는 DNA 시료인 것을 바람직한 양태의 하나로서 들 수 있다. 생물 유래 검체 그 자체를 미리 메틸화 감수성 제한 효소로 소화 처리해 둠으로써, 제3 공정의 메틸화된 DNA의 검출 혹은 정량을 정밀도 좋게 할 수 있다. 당해 방법은, 상기한 바와 같은 「DNA의 남은 조각」을 없애는데 유용하다. 생물 유래 검체 그 자체를 메틸화 감수성 제한 효소에 의해 소화 처리하는 방법으로서는, 생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA가 이중 가닥 DNA로서 존재하고 있는 경우에는, 메틸화 감수성 제한 효소를 이용하여, 일반적인 제한 효소 처리를 실시하면 된다. 또 생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA가 단일 가닥 DNA로서 존재하고 있는 경우 또는 생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA가 이중 가닥 DNA와 단일 가닥 DNA의 양자로서 혼재하고 있는 경우에는, 변법 1 및 변법 2에 준한 방법으로 소화 처리를 실시하면 된다. 구체적으로는 예를 들면, 검체액 10μL에, 최적인 10×완충액을 5μL, 단일 가닥 DNA를 소화할 수 있는 메틸화 감수성 제한 효소(HhaI)를 15U, 그밖에, 필요에 따라 BSA 등을 적당량 더하고, 다음에 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 50μL로 하여, 37℃로 예를 들면 1시간∼하룻밤 인큐베이션한다. 또는, 검체액 10μL에, 최적인 10×완충액을 5μL, 메틸화 감수성 제한 효소(HpaII, HhaI)를 15U, 상기 메틸화 감수성 효소의 인식 배열 중 1개소의 특정 개소에 대한 마스킹용 올리고뉴클레오티드를 약 15pmol, 그밖에, 필요에 따라 BSA 등을 적당량 더하고, 다음에 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 50μL로 하여, 37℃로 예를 들면 1시간∼하룻밤 인큐베이션한다. 또한, 생물 유래 검체가, 미리 정제되어 이루어지는 검체인 경우에는, 일반적으로 이용되는 양의 제한 효소를 이용하여 소화 처리를 실시하면 되고, 생물 유래 검체가, 조직 용해액, 세포 용해액 등인 경우에는, 대과잉의 메틸화 감수성 제한 효소, 예를 들면, DNA량에 대해 500배량 또는 그 이상의 메틸화 감수성 제한 효소를 이용하여 소화 처리를 실시하면 된다.
그밖에 제1 공정에 있어서, 게놈 DNA 유래의 DNA 시료에 포함되는 이중 가닥 DNA를 단일 가닥 DNA로 분리할 때의 바람직한 양태로서는, 카운터 올리고뉴클레오티드를 첨가하는 것 등을 들 수 있다. 카운터 올리고뉴클레오티드란, 목적으로 하는 DNA 영역과 동일한 염기 배열을 짧은 올리고뉴클레오티드로 분할한 것이다. 통상 10∼100 염기, 보다 바람직하게는, 20∼50 염기의 길이로 설계한 것이면 된다. 또한, 카운터 올리고뉴클레오티드는, 상기 메틸화된 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA와, 상기의 올리고뉴클레오티드가 상보적으로 결합하기 위해 필요한 상기 올리고뉴클레오티드 상의 염기 배열과 상보적으로 결합하는 염기 배열을 포함하지 않도록 설계하는 것이 바람직하다. 카운터 올리고뉴클레오티드는, 게놈 DNA에 비해, 대과잉으로 첨가되고, 목적으로 하는 DNA 영역을 단일 가닥(플러스 가닥)으로 한 후, 고정화 메틸화 DNA 항체와 결합시킬 때에, 목적으로 하는 DNA 영역의 상보 가닥(마이너스 가닥)과 목적으로 하는 DNA 영역을 단일 가닥(플러스 가닥)이 상보성에 의해 재결합하는 것을 방해하기 위해 첨가한다. 또한, 카운터 올리고뉴클레오티드는, 목적으로 하는 DNA 영역에 비해, 적어도 10배, 통상은 100배 이상의 양이 첨가되는 것이 바람직하다.
「제1 공정에서 게놈 DNA 유래의 DNA 시료에 포함되는 이중 가닥 DNA를 단일 가닥 DNA로 분리할 때에, 카운터 올리고뉴클레오티드를 첨가한다」란, 구체적으로는, 생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA 유래의 DNA 시료를 카운터 올리고뉴클레오티드와 혼합하여, 목적으로 하는 DNA 영역의 상보 가닥과 카운터 올리고뉴클레오티드가 이중 가닥을 형성함으로써, 목적으로 하는 DNA 영역을 단일 가닥으로 하는 것을 목적으로 하여 첨가되는 것이다. 목적으로 하는 DNA 영역이 단일 가닥 상태이면, 제2 공정에서, (ii) 메틸화 DNA 항체, 및 (iii) 상기의 메틸화 DNA 항체와 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA의 결합을 저해하지 않고 또한 상기의 단일 가닥 DNA와 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드와 결합하기 쉽게 하는 것을 목적으로 한다. 또한, 카운터 올리고뉴클레오티드는, (iii) 상기의 메틸화 DNA 항체 와 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA의 결합을 저해하지 않고 또한 상기의 단일 가닥 DNA와 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드가 상기 메틸화된 DNA와 상보적으로 결합하는 염기 배열 상에는 설계하지 않는다.
즉, 카운터 올리고뉴클레오티드는, (i) 제1 공정에서 분리된 단일 가닥 DNA, (ii) 메틸화 DNA 항체, 및 (iii) 상기의 메틸화 DNA 항체와 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA의 결합을 저해하지 않고 또한 상기의 단일 가닥 DNA와 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 혼합함으로써 메틸화된 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA와, 메틸화 DNA 항체와, 상기의 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성하기 쉽게 하는 것으로서, 제1 공정에서 단일 가닥 DNA를 분리할 때에 첨가해도 상관없고, 제2 공정에서 상기 복합체를 형성시킬 때에 첨가해도 상관없다.
카운터 올리고뉴클레오티드를, 예를 들면, 제1 공정에서 첨가하는 경우에는, 생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA 유래의 DNA 시료에 포함되는 이중 가닥 DNA를 단일 가닥 DNA로 분리하는 제1 공정에서 첨가하면 된다. 구체적으로는, 상기 DNA 시료와, 상기 카운터 올리고뉴클레오티드를, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 5μL와, 100mM의 MgCl2 용액 5μL와, 1mg/mL의 BSA 용액 5μL를 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 50μL로 하여 혼합하며, 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속하게 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하며, 다음에, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 37℃로 10분간 더 보온한 후, 실온으로 되돌리면 된다.
카운터 올리고뉴클레오티드를 첨가할 때의 바람직한 양태로서는, 2가 양이온을 함유하는 반응계 중에서 결합시키는 것을 들 수 있다. 보다 바람직하게는, 2가 양이온이 마그네슘 이온인 것을 들 수 있다. 여기에서 「2가 양이온을 함유하는 반응계」란, 상기 단일 가닥 DNA(플러스 가닥)와 상기 단일 가닥 고정화 올리고뉴클레오티드를 결합시키기 위해 이용되는 어닐링 버퍼 중에 2가 양이온을 함유하는 반응계를 의미하고, 구체적으로는 예를 들면, 마그네슘 이온을 구성 요소로 하는 염(예를 들면, MgOAc2, MgCl2 등)이 1mM∼600mM의 농도로 포함되는 것이 좋다.
혈액, 소변 등의 생체 시료 중에 포함되는 미량 물질의 검출 혹은 정량하는 방법으로서, 면역학적 측정 방법이 범용되고 있다. 당해 면역학적 측정 방법 중, 크로마토그래피를 이용한 소위 면역크로마토법은 조작이 간단하고, 검정에 요하는 시간도 짧으므로, 현재, 예를 들면, 병원에 있어서의 임상 검사, 연구실에 있어서의 검정 시험 등의 많은 상황에서 널리 이용되고 있다. 또, 최근, 표식된 DNA(유전자)를 크로마토스트립 상에서 전개하여, 목적 DNA(유전자)를 포획할 수 있는 프로브를 이용해 하이브리다이제이션함으로써, 목적 DNA(유전자)를 검출하는, 소위 하이브리드 크로마토법이 이용되게 되고 있다. 이 방법도 조작이 간편하고, 검정에 요하는 시간도 짧으므로, 현재, 병원에 있어서의 임상 검사, 연구실에 있어서의 검정 시험 등의 상황 이용되기 시작하고 있다. 본 발명 측정 방법은, 상기의 면역크로마토법과 하이브리드 크로마토법을 혼합한 방법을 개념적으로 가능하게 하고 있다. 본 발명 측정 방법에서는, 복합체 형성 및 복합체 분리에 관해, 그 순서는 특별히 한정되지 않으므로, 여러 가지의 방법이 가능하다. 구체적으로는 예를 들면, 이하와 같이 실시하면 된다.
방법 1 : 제1 공정 종료 직후의 시료에, 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드를 첨가하여, 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA와 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드의 결합체를 형성시키고(이 단계에서 형성된 결합체는, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체 외에, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하지 않는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체를 포함하고 있다), 다음에, 식별 기능을 갖는 메틸화 항체를 첨가하여, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와, 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드와, 식별 기능을 갖는 메틸화 DNA 항체가 결합된 복합체를 형성시킨다(이 단계에서, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하지 않는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체는, 복합체를 형성하지 않는다). 얻어진 시료를, 크로마토스트립의 도입부에 적하(도입)하면, 상기 복합체가, 전개부를 모세관 현상에 의해 이동하여, 미리 스트렙트아비딘으로 피복해 둔 부분에 포획된다. 그 후, 분리된 복합체에 포함되는 메틸화 DNA 항체를, 그 식별 기능에 의거하여 검출 혹은 정량함으로써, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 검출 혹은 정량할 수 있다.
방법 2 : 제1 공정 종료 직후의 시료에, 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드를 첨가하여, 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA와 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드의 결합체를 형성시킨다(이 단계에서 형성된 결합체는, 목적으로 하 는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체 외에, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하지 않는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체를 포함하고 있다). 얻어진 시료를, 크로마토스트립의 도입부에 적하(도입)하면, 상기 결합체가, 전개부를 모세관 현상에 의해 이동하여, 미리 스트렙트아비딘으로 피복해 둔 부분에 포획된다(이 단계에서도 결합체는, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체 외에, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하지 않는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체를 포함하고 있다). 그 후, 식별 기능을 갖는 메틸화 항체를 도입부에 적하(도입)하면, 전개부를 이동하여, 결합체의 메틸화된 사이토신에 결합하고, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와, 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드와, 식별 기능을 갖는 메틸화 DNA 항체가 결합된 복합체를 형성한다(이 단계에서, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하지 않는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체는, 복합체를 형성하지 않는다). 얻어진 복합체에 포함되는 메틸화 DNA 항체를, 그 식별 기능에 의거하여 검출 혹은 정량함으로써, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 검출 혹은 정량할 수 있다.
방법 3 : 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드를 크로마토스트립의 도입부에 적하(도입)하면, 상기 올리고뉴클레오티드가, 전개부를 모세관 현상에 의해 이동하여, 미리 스트렙트아비딘으로 피복해 둔 부분에 포획된다. 다음에, 제1 공정 종료 직후의 시료를 도입부에 적하(도입)하면, 전개부를 이동하여, 이미 포획되어 있는 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드에, 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA가 결합체를 형성한 형태로 포획된다(이 단계에서 형성된 결합체는, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체 외에, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하지 않는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체를 포함하고 있다). 그 후, 식별 기능을 갖는 메틸화 항체를 도입부에 적하(도입)하면, 전개부를 이동하여, 결합체의 메틸화된 사이토신에 결합하고, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와, 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드와, 식별 기능을 갖는 메틸화 DNA 항체가 결합된 복합체를 형성한다(이 단계에서, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하지 않는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체는, 복합체를 형성하지 않는다). 얻어진 복합체에 포함되는 메틸화 DNA 항체를, 그 식별 기능에 의거하여 검출 혹은 정량함으로써, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 검출 혹은 정량할 수 있다.
방법 4 : 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드를 크로마토스트립의 도입부에 적하(도입)하면, 상기 올리고뉴클레오티드가, 전개부를 모세관 현상에 의해 이동하여, 미리 스트렙트아비딘으로 피복해 둔 부분에 포획된다. 제1 공정 종료 직후의 시료에, 식별 기능을 갖는 메틸화 DNA 항체를 첨가하여, 메틸화된 사이토신을 갖는 단일 가닥 DNA(이 중에는, 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA와 목적 이외의 단일 가닥 DNA가 존재한다)와 식별 기능을 갖는 메틸화 DNA 항체의 결합체를 형성시킨다(이 단계에서 형성된 결합체는, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸 화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와 메틸화 항체의 결합체 외에, 목적으로 하는 DNA 영역 이외의 메틸화된 단일 가닥 DNA와 메틸화 항체의 결합체를 포함하고 있다). 얻어진 결합체를 도입부에 적하(도입)하면, 전개부를 이동하여, 이미 포획되어 있는 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드에, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA가 결합되고, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와, 비오틴화 본 올리고뉴클레오티드와, 식별 기능을 갖는 메틸화 DNA 항체가 결합된 복합체를 형성한다(이 단계에서, 목적으로 하는 DNA 영역 이외의 메틸화된 단일 가닥 DNA와 메틸화 항체의 결합체는, 복합체를 형성하지 않는다). 얻어진 복합체에 포함되는 메틸화 DNA 항체를, 그 식별 기능에 의거하여 검출 혹은 정량함으로써, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 검출 혹은 정량할 수 있다.
방법 5 : 제1 공정 종료 직후의 시료에, 식별 기능을 갖는 본 올리고뉴클레오티드를 첨가하여, 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA와 식별 기능을 갖는 본 올리고뉴클레오티드의 결합체를 형성시키고(이 단계에서 형성된 결합체는, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체 외에, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하지 않는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체를 포함하고 있다), 다음에, 비오틴화 메틸화 항체를 첨가하여, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와, 식별 기능을 갖는 본 올리고뉴클레오티드와, 비오틴화 메틸화 DNA 항체가 결합된 복합체를 형성시킨다(이 단계에서, 목적으 로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하지 않는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체는, 복합체를 형성하지 않는다). 얻어진 시료를, 크로마토스트립의 도입부에 적하(도입)하면, 상기 복합체가, 전개부를 모세관 현상에 의해 이동하여, 미리 스트렙트아비딘으로 피복해 둔 부분에 포획된다. 그 후, 얻어진 복합체에 포함되는 본 올리고뉴클레오티드를, 그 식별 기능에 의거하여 검출 혹은 정량함으로써, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 검출 혹은 정량할 수 있다.
방법 6 : 제1 공정 종료 직후의 시료에, 비오틴화 메틸화 DNA 항체를 첨가하여, 메틸화된 사이토신을 갖는 단일 가닥 DNA(이 중에는, 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA와 목적 이외의 단일 가닥 DNA가 존재한다)와 비오틴화 메틸화 DNA 항체의 결합체를 형성시킨다(이 단계에서 형성된 결합체는, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와 메틸화 항체의 결합체 외에, 목적으로 하는 DNA 영역 이외의 메틸화된 단일 가닥 DNA와 메틸화 항체의 결합체를 포함하고 있다). 얻어진 시료를, 크로마토스트립의 도입부에 적하(도입)하면, 상기 결합체가, 전개부를 모세관 현상에 의해 이동하여, 미리 스트렙트아비딘으로 피복해 둔 부분에 포획된다(이 단계에서도 결합체는, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와 메틸화 항체의 결합체 외에, 목적으로 하는 DNA 영역 이외의 메틸화된 단일 가닥 DNA와 메틸화 항체의 결합체를 포함하고 있다). 그 후, 식별 기능을 갖는 본 올리고뉴클레오티드를 도입부에 적하(도입)하면, 전개부를 이동하여, 결합체 중 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 메틸화된 단일 가닥 DNA에만 결합하고, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와, 식별 기능을 갖는 본 올리고뉴클레오티드와, 비오틴화 메틸화 DNA 항체가 결합된 복합체를 형성한다(이 단계에서, 목적으로 하는 DNA 영역 이외의 메틸화된 단일 가닥 DNA와 메틸화 항체의 결합체는, 복합체를 형성하지 않는다). 얻어진 복합체에 포함되는 본 올리고뉴클레오티드를, 그 식별 기능에 의거하여 검출 혹은 정량함으로써, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 검출 혹은 정량할 수 있다.
방법 7 : 비오틴화 메틸화 DNA 항체를 크로마토스트립의 도입부에 적하(도입)하면, 상기 메틸화 DNA 항체가, 전개부를 모세관 현상에 의해 이동하여, 미리 스트렙트아비딘으로 피복해 둔 부분에 포획된다. 다음에, 제1 공정 종료 직후의 시료를 도입부에 적하(도입)하면, 전개부를 이동하여, 이미 포획되어 있는 메틸화 DNA 항체에, 메틸화된 사이토신을 갖는 단일 가닥 DNA가 결합체로서 포획된다(이 단계에서 형성된 결합체는, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와 메틸화 항체의 결합체 외에, 목적으로 하는 DNA 영역 이외의 메틸화된 단일 가닥 DNA와 메틸화 항체의 결합체를 포함하고 있다). 그 후, 식별 기능을 갖는 본 올리고뉴클레오티드를 도입부에 적하(도입)하면, 전개부를 이동하여, 결합체 중 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 메틸화된 단일 가닥 DNA에만 결합하고, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와, 식별 기능을 갖는 본 올리고뉴클레오티드와, 비오틴화 메틸화 DNA 항체가 결합된 복합체를 형성한다(이 단계에서, 목적으로 하는 DNA 영역 이외의 메틸화된 단일 가닥 DNA 와 메틸화 항체의 결합체는, 복합체를 형성하지 않는다). 얻어진 복합체에 포함되는 본 올리고뉴클레오티드를, 그 식별 기능에 의거하여 검출 혹은 정량함으로써, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 검출 혹은 정량할 수 있다.
방법 8 : 비오틴화 메틸화 DNA 항체를 크로마토스트립의 도입부에 적하(도입)하면, 상기 메틸화 DNA 항체가, 전개부를 모세관 현상에 의해 이동하여, 미리 스트렙트아비딘으로 피복해 둔 부분에 포획된다. 제1 공정 종료 직후의 시료에, 식별 기능을 갖는 본 올리고뉴클레오티드를 첨가하여, 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA와 식별 기능을 갖는 본 올리고뉴클레오티드의 결합체를 형성시킨다(이 단계에서 형성된 결합체는, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체 외에, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하지 않는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체를 포함하고 있다). 다음에, 얻어진 결합체를 도입부에 적하(도입)하면, 전개부를 이동하여, 이미 포획되어 있는 메틸화 DNA 항체에, 결합체 중 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA만이 결합하고, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하는 단일 가닥 DNA와, 식별 기능을 갖는 본 올리고뉴클레오티드와, 비오틴화 메틸화 DNA 항체가 결합된 복합체를 형성한다(이 단계에서, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 포함하지 않는 단일 가닥 DNA와 본 올리고뉴클레오티드의 결합체는, 복합체를 형성하지 않는다). 얻어진 복합체에 포함되는 본 올리고뉴클레오티드를, 그 식별 기능에 의거하여 검출 혹은 정량함으로써, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 검출 혹 은 정량할 수 있다.
1개의 크로마토스트립 상에 복수의 검출 부위(각각 다른 목적으로 하는 DNA 영역을 포획할 수 있는 본 올리고뉴클레오티드를 지지체에 고정한다)를 존재시키고, 각 목적으로 하는 DNA 영역을 순차적으로 검출 혹은 정량하는 것도 가능하며, 또, 1개의 검출 부위에 복수의 목적으로 하는 DNA 영역을 포획할 수 있도록, 즉, 1개의 검출 부위에, 복수의 목적으로 하는 DNA 영역을 포획할 수 있는 본 올리고뉴클레오티드를 많이 고정화해 두면, 검출 감도를 비약적으로 올릴 수 있다. 또, 복수의 목적으로 하는 DNA 영역과 복합체를 형성할 수 있도록, 복수의 목적으로 하는 DNA 영역을 포획할 수 있는 식별 기능을 갖는 본 올리고뉴클레오티드를 많이 이용해도, 검출 감도를 비약적으로 올릴 수 있다. 또한, 1개의 목적 영역 중에서도, 수많은 본 올리고뉴클레오티드를 설계하고, 이들을 지지체측 또는 검출측에서 이용해도, 검출 감도를 비약적으로 올릴 수 있다.
이러한 본 발명 측정 방법에서 사용할 수 있는 제한 효소, 본 올리고뉴클레오티드 또는, 메틸화 DNA 항체는, 검출용 키트의 시약으로서 유용하다. 본 발명 측정 방법은, 이들 제한 효소, 본 올리고뉴클레오티드, 또는 메틸화 DNA 항체 등을 시약으로서 함유하는 검출용 키트나, 이들 본 올리고뉴클레오티드, 또는 메틸화 DNA 항체 등이 지지체 상에 고정화되어 이루어지는 검출용 칩도 제공하고 있고, 본 발명 측정 방법의 권리 범위는, 당해 방법의 실질적인 원리를 이용하여 이루어지는 상기와 같은 검출용 키트나 검출용 칩과 같은 형태로의 사용도 포함하는 것이다.
실시예
이하에 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
5’말단을 비오틴 표식한 배열 번호 17, 18, 19, 20으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 M1, M2, M3, M4, 및 배열 번호 21, 22, 23, 24로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 U1, U2, U3, U4를 합성하여, 각각에 대해, 이하의 TE 버퍼(10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8.0) 용액을 조제하였다.
용액 A : 2.5pmol/100μL TE 버퍼 용액
용액 B : 0.25pmol/100μL TE 버퍼 용액
용액 C : 0.025pmol/100μL TE 버퍼 용액
용액 D : 0.0025pmol/100μL TE 버퍼 용액
용액 E : 0.00025pmol/100μL TE 버퍼 용액
용액 F : 0pmol/100μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액)
다음에, 각각의 용액(용액 A∼용액 F)에 대해, 상기의 메틸화 올리고뉴클레오티드 M1, M2, M3, M4의 각각의 용액을 등량씩 혼합한 메틸화 올리고뉴클레오티드 혼합 용액 M0, 및 상기의 비메틸화 올리고뉴클레오티드 U1, U2, U3, U4의 각각의 용액을 등량씩 혼합한 메틸화 올리고뉴클레오티드 혼합 용액 U0을 조제하였다.
<5’말단 비오틴 표식 메틸화 올리고뉴클레오티드> N은 메틸화 사이토신을 나타낸다.
M1 : 5’-ANGAANGTANGGANGC-3’(배열 번호 17)
M2 : 5’-TNGATNGTTNGGTNGC-3’(배열 번호 18)
M3 : 5’-GNGAGNGTGNGGGNGC-3’(배열 번호 19)
M4 : 5’-CNGACNGTCNGGCNGC-3’(배열 번호 20)
<5’말단 비오틴 표식 비메틸화 올리고뉴클레오티드>
U1 : 5’-ACGAACGTACGGACGC-3’(배열 번호 21)
U2 : 5’-TCGATCGTTCGGTCGC-3’(배열 번호 22)
U3 : 5’-GCGAGCGTGCGGGCGC-3’(배열 번호 23)
U4 : 5’-CCGACCGTCCGGCCGC-3’(배열 번호 24)
얻어진 각각의 용액에 대해, 이하의 처리를 실시하였다(각 용액에 대해 2개씩 조제).
상기에서 조제한 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 혼합 용액(M0 및 U0의 용액 A∼용액 F) 각 100μL를, 스트렙트아비딘 피복이 끝난 96 웰 플레이트에 첨가한 후, 플레이트 셰이커에 약 10초 제공하고, 다음에 약 30분간 실온에서 방치함으로써, 당해 플레이트에 상기 5’말단 비오틴 표식 메틸화 올리고뉴클레오티드, 또는, 5’말단 비오틴 표식 비메틸화 올리고뉴클레오티드를 고정화하였다. 방치 후, 상기 플레이트 내의 용액을 디켄테이션으로 제거하고, 다음에, 상기 플레이트 내의 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 300μL로 3회 세정하였다.
상기의 각 웰에 메틸화 사이토신 항체[Aviva Systems Biology사제, 1 또는 10μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액] 100μL를 첨가한 후, 2시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 당해 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 300μL로 3회 세정하였다.
다음에, HRP 표식 마우스 IgG 항체[Santa Cruz Biotechnology사제, 0.05μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액] 100μL를 상기의 각 웰에 첨가한 후, 2시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 당해 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 300μL로 3회 세정하고, 다음에 기질(R&D사제, #DY999) 100μL를, 상기의 각 웰에 첨가·혼합함으로써, 반응을 개시하였다.
다음에 약 20분간 실온에서 방치한 후, 당해 각 웰에 스톱 용액(1N H2SO4 수용액) 50μL를 첨가함으로써, 반응을 정지하였다. 반응 정지 후 30분 이내에 얻어진 시료의 450nm의 흡광도를 측정하였다.
그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다. 고정화한 5’말단 비오틴 표식 메틸화 올리고뉴클레오티드 M0이, 고정화한 5’말단 비오틴 표식 비메틸화 올리고뉴클레오티드 U0보다 매우 감도 좋게 검출·정량되는 것이 확인되었다. 또, 사용하는 메틸화 항체량을 너무 많게 하면(10μg/mL, 도 2), 고정화한 5’말단 비오틴 표식 비메틸화 올리고뉴클레오티드의 양이 많은 용액 A 및 용액 B에서, 비특이적인 결합이 일어나는 것이 시사되었다.
이상으로부터, 메틸화 사이토신 항체를 이용한 본 발명 측정 방법에 있어서, 메틸화된 DNA 프래그먼트의 검출·정량이 가능한 것이 확인되었다.
실시예 2
배열 번호 25로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M8, 및 배열 번호 26으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-UM8을 합성하여, 각각에 대해, 이하의 TE 버퍼 용액을 조제하였다.
용액 A : 0.1pmol/10μL TE 버퍼 용액
용액 B : 0.01pmol/10μL TE 버퍼 용액
용액 C : 0.001pmol/10μL TE 버퍼 용액
용액 D : 0pmol/10μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액)
<메틸화 올리고뉴클레오티드> N은 메틸화 사이토신을 나타낸다.
UBC-M8 : 5’-ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA-3’(배열 번호 25)
<비메틸화 올리고뉴클레오티드>
UBC-U8 : 5’-ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA-3’(배열 번호 26)
또, 배열 번호 27로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 B1을 합성하여, 0.002μM TE 버퍼 용액을 조제하였다.
<5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드>
B1 : 5’-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3’(배열 번호 27)
얻어진 메틸화 올리고뉴클레오티드, 또는 비메틸화 올리고뉴클레오티드의 각각의 용액에 대해, 이하의 처리를 실시하였다(각 용액에 대해 1개씩 조제).
PCR 튜브에, 상기에서 조제한 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 상기의 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 용액 50μ와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 10μL를 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 100μL로 하여, 혼합하였다. 다음에, 당해 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속하게 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 또한 이것을 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 다음에 37℃로 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌림으로써, 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 결합체의 형성을 촉진하였다.
얻어진 혼합물 모두를 스트렙트아비딘 피복이 끝난 96 웰 플레이트로 옮기고, 약 30분간 실온에서 방치함으로써, 당해 플레이트에 상기 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 결합체를 고정화하였다. 방치 후, 상기 플레이트 내의 용액을 디켄테이션으로 제거하고, 다음에 상기의 플레이트 내의 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
상기의 각 웰에 메틸화 사이토신 항체[Aviva Systems Biology사제, 1μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액] 100μL를 첨가한 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 당해 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
다음에, Eu-N1 표식 마우스 IgG 항체[Perkin Elmer사제, 0.25μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액] 100μL를 상기의 각 웰에 첨가한 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 당해 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
Enhancement Solution(Perkin Elmer사제) 200μL를 상기의 각 웰에 첨가·혼합함으로써, 반응을 개시하였다. 다음에, 약 3분간 실온에서 방치한 후, 얻어진 시료의 형광을 여기 340nm/형광 612nm로 측정하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다. 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M8이, 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-U8보다, 고정화한 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 B1에 의해 정밀도 좋게 선택되고, 감도 좋게 검출·정량되는 것이 확인되었다.
이상으로부터, 메틸화 사이토신 항체와, 메틸화된 DNA 프래그먼트와, 고정화한 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·분리하고, 복합체 중의 메틸화 사이토신 항체를, 그 식별 기능에 의거하여 검출·정량이 가능하며, 본 발명 측정 방법에 있어서 메틸화된 DNA 프래그먼트의 검출·정량이 가능한 것이 확인되었다.
실시예 3
배열 번호 28로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M, 배열 번호 29로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 부분 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-HM, 및 배열 번호 30으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-UM을 합성하여, 각각에 대해, 이하의 TE 버퍼 용액을 조제하였다.
용액 A : 0.1pmoL/10μL TE 버퍼 용액
용액 B : 0.01pmoL/10μL TE 버퍼 용액
용액 C : 0.001pmoL/10μL TE 버퍼 용액
용액 D : TE 버퍼 용액(음성 대조군액)
<메틸화 올리고뉴클레오티드> N은 메틸화 사이토신을 나타낸다.
UBC-M : 5’-
AGTGACACCATNGAGAATGTCAGATCNGGATCAGAGNGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGACTACAACATCCAGA-3’(배열 번호 28)
<부분 메틸화 올리고뉴클레오티드> N은 메틸화 사이토신을 나타낸다.
UBC-HM : 5’-
AGTGACACCATNGAGAATGTCAGATCCGGATCAGAGCGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGACTACA ACATCCAGA-3’(배열 번호 29)
<비메틸화 올리고뉴클레오티드>
UBC-UM : 5’-
AGTGACACCATCGAGAATGTCAGATCCGGATCAGAGCGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGACTACAACATCCAGA-3’(배열 번호 30)
얻어진 각각의 용액에 대해, 이하의 처리를 실시하였다(각 용액에 대해 1개씩 조제).
A군(무처리군) : PCR 튜브에, 상기에서 조제한 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 5μL와, BSA(Bovine serum albumin 1mg/mL) 5μL를 첨가한 후, 이것에 배열 번호 31로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 MA를 마스킹용 올리고뉴클레오티드로서 5pmol 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 50μL로 하여, 혼합하였다.
B군(HhaI 처리군) : PCR 튜브에, 상기에서 조제한 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, HhaI 5U와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 5μL와, BSA(Bovine serum albumin 1mg/mL) 5μL를 첨가한 후, 이것에 배열 번호 31로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 MA를 마스킹용 올리고뉴클레오티드로서 5pmol 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 50μL로 하여, 혼합하였다.
<마스킹용 올리고뉴클레오티드>
MA : 5’-GATGGCGCTCTG-3’(배열 번호 31)
각각의 반응액을 37℃로 15시간 인큐베이션한 후, 이들에 배열 번호 32로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 B1의 0.002μM TE 버퍼 용액 50μL를 첨가하여 혼합하였다.
<5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드>
B1 : 5’-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3’(배열 번호 32)
다음에, 당해 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속하게 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 또한, 이것을 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 다음에 37℃로 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌림으로써, 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 결합체의 형성을 촉진하였다.
얻어진 혼합물 모두를 스트렙트아비딘 피복이 끝난 96 웰 플레이트로 옮기고, 약 30분간 실온에서 방치함으로써, 당해 플레이트에 상기 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 결합체를 고정화하였다. 방치 후, 상기 플레이트 내의 용액을 디켄테이션으로 제거하고, 다음에 상기 플레이트 내의 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
상기의 각 웰에 메틸화 사이토신 항체[Aviva Systems Biology사제, 1μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액] 100μL를 첨가한 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 당해 각 웰로부터 용액을 디켄테이션으로 제거한 후, 당해 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
다음에, Eu-N1 표식 마우스 IgG 항체[Perkin Elmer사제, 0.25μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액] 100μL를 상기의 각 웰에 첨가한 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 당해 각 웰로부터 용액을 디켄테이션으로 제거하고, 다음에 당해 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
Enhancement Solution(Perkih Elmer사제) 200μL를 상기의 각 웰에 첨가·혼합함으로써, 반응을 개시하였다. 약 45분간 실온에서 방치한 후, 얻어진 시료의 형광을 여기 340nm/형광 612nm로 측정하였다.
그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다. A군(무처리군)의 경우(도 4), CG 배열의 3개소 중 3개소 모두 메틸화되어 있는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M에서는, 고정화한 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 B1과, 메틸화 사이토신 항체의 복합체를 형성·분리하고, 복합체 중의 비오틴 표식에 의해, 대단히 감도 좋게 검출·정량되는 것이 확인되었다. 한편, CG 배열의 3개소 중 1개소만 메틸화되어 있는 부분 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-HM에서는, 고정화한 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 B1과 메틸화 사이토신 항체의 복합체를 형성·분리하고, 상기의 UBC-M에 있어서의 감도의 약 1/3의 감도로 검출·정량되는 것이 확인되었다. CG 배열의 3개소 중 1개소도 메틸화되어 있지 않은 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-UM에서는, 고정화한 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 B1과 메틸화 사이토신 항체의 복합체를 형성·분리하지 않으므로, 대략 백그라운드값(용액 D의 데이터)과 동일한 값을 나타내었다. B군(HhaI 처리군)의 경우(도 5), CG 배열의 3개소 중 3개소 모두 메틸화되어 있는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M에서는, 메틸화 감수성 제한 효소(HhaI)로 소화되지 않으므로, 고정화한 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 B1과 메틸화 사이토신 항체의 복합체를 형성·분리하고, 복합체 중의 비오틴 표식에 의해 A군(무처리군)과 대략 동일하게, 감도 좋게 검출·정량되는 것이 확인되었다. CG 배열의 3개소 중 1개소만 메틸화되어 있는 부분 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-HM에서는, 메틸화 감수성 제한 효소(HhaI)에 의한 소화에 의해, 메틸화된 CG 배열은 없어져 버린다. 따라서, 복합체를 형성·분리하지 않으므로, 백그라운드값(용액 D의 데이터)과 대략 동일한 값이었다. CG 배열의 3개소 중 1개소도 메틸화되어 있지 않은 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-UM에서는, A처리군(무처리군)과 동일하게, 복합체를 형성·분리하지 않으므로, 백그라운드값과 대략 동일한 값이었다.
이상으로부터, 메틸화 감수성 제한 효소로 소화 처리함으로써, 부분적으로 메틸화되어 있는 DNA 프래그먼트를 소화할 수 있는 것, 또한, 메틸화 사이토신 항체와 메틸화된 DNA 프래그먼트와 고정화한 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·분리하고, 복합체 중의 메틸화 사이토신 항체를, 그 식별 기 능에 의거하여 검출·정량함으로써, 메틸화된 DNA 프래그먼트의 검출·정량이 가능한 것이 확인되었다.
실시예 4
배열 번호 33으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC86-M, 및 배열 번호 34로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 부분 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC118-HM을 합성하여, 각각에 대해, 이하의 TE 버퍼 용액 용액을 조제하였다.
용액 A : 0.1pmoL/10μL TE 버퍼 용액
용액 B : 0.01pmoL/10μL TE 버퍼 용액
용액 C : 0.001pmoL/10μL TE 버퍼 용액
용액 D : TE 버퍼 용액(음성 대조군액)
<메틸화 올리고뉴클레오티드> N은 메틸화 사이토신을 나타낸다.
UBC86-M : 5’-
AGTGACACCATNGAGAATGTCAGATCNGGATCAGAGNGCCATCTACNGGATGGACATGNGCTCACTGTCTGACTACAACATCCAGA-3’(배열 번호 33)
<부분 메틸화 올리고뉴클레오티드> N은 메틸화 사이토신을 나타낸다.
UBC118-HM : 5’-
AGTGACACCATNGAGAATGTCAGANGATNGATNGTANGTANGGANGCTNGGTNGCATCNGGATCAGAGCGCCATCTACNGGATGGACATGNGCTCACTGTCTGACTACAACATCCAGA-3’(배열 번호 34)
얻어진 각각의 용액에 대해, 이하의 처리를 실시하였다(각 용액에 대해 1개 씩 조제).
A군(무처리군) : PCR 튜브에, 상기에서 조제한 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 5μL와, BSA(Bovine serum albumin 1mg/mL) 5μL를 첨가한 후, 이것에 배열 번호 35로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 MA를 마스킹용 올리고뉴클레오티드로서 5pmol 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 50μL로 하여, 혼합하였다.
B군(HhaI 처리군) : PCR 튜브에, 상기에서 조제한 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, HhaI 5U와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 5μL와, BSA(Bovine serum albumin 1mg/mL) 5μL를 첨가한 후, 이것에 배열 번호 35로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 MA를 마스킹용 올리고뉴클레오티드로서 5pmol 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 50μL로 하여, 혼합하였다.
<마스킹용 올리고뉴클레오티드>
MA : 5’-GATGGCGCTCTG-3’(배열 번호 35)
각각의 반응액을 37℃로 16시간 인큐베이션한 후, 이것에 배열 번호 36으로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 B1의 0.002μM TE 버퍼 용액 50μL를 첨가하여 혼합하였다.
<5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드>
B1 : 5’-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3’(배열 번호 36)
다음에, 당해 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속하게 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 또한, 이것을 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 다음에 37℃로 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌림으로써, 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 결합체의 형성을 촉진하였다.
얻어진 혼합물 모두를 스트렙트아비딘 피복이 끝난 96 웰 플레이트로 옮기고, 약 30분간 실온에서 방치함으로써, 당해 플레이트에 상기 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 결합체를 고정화하였다. 방치 후, 상기 플레이트 내의 용액을 디켄테이션으로 제거하고, 다음에 상기 플레이트 내의 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
상기의 각 웰에 메틸화 사이토신 항체[Aviva Systems Biology사제, 1μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액] 100μL를 첨가한 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 당해 각 웰로부터 용액을 디켄테이션으로 제거한 후, 당해 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
다음에, Eu-N1 표식 마우스 IgG 항체[Perkin Elmer사제, 0.25μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액] 100μL를 상기의 각 웰에 첨가한 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 당해 각 웰 로부터 용액을 디켄테이션으로 제거하고, 다음에 당해 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
Enhancement Solution(Perkin Elmer사제) 200μL를 상기의 각 웰에 첨가·혼합함으로써, 반응을 개시하였다. 그 후, 약 45분간 실온에서 방치한 후, 얻어진 시료의 형광을 여기 340nm/형광 612nm로 측정하였다.
그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다. A군(무처리군)의 경우(도 6), CG 배열의 5개소 중 5개소 모두 메틸화되어 있는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC86-M에서는, 고정화한 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드와 메틸화 사이토신 항체의 복합체를 형성·분리하고, 복합체 중의 비오틴 표식에 의해, 감도 좋게 검출·정량되는 것이 확인되었다. 한편, CG 배열의 13개소 중 12개소만 메틸화되어 있는 부분 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC118-HM에서는, UBC86-M에 있어서의 감도의 약 1.4배의 감도로 검출·정량되는 것이 확인되었다. B군(HhaI 처리군)의 경우(도 7), CG 배열의 5개소 중 5개소 모두 메틸화되어 있는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC86-M에서는, 메틸화 감수성 제한 효소(HhaI)로 소화되지 않으므로, 고정화한 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드와 메틸화 사이토신 항체의 복합체를 형성·분리하고, 복합체 중의 비오틴 표식에 의해, A군(무처리군)과 대략 동일하게, 감도 좋게 검출·정량되는 것이 확인되었다. 한편, CG 배열의 13개소 중 12개소만 메틸화되어 있는 부분 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC118-HM에서는, 메틸화 감수성 제한 효소(HhaI)에 의한 소화에 의해, 메틸화된 CG는 2개소밖에 남아 있지 않다. 따라서, UBC118-HM의 검출·정량 결과는, UBC86-M보다 낮은 결과가 되었다.
이상으로부터, 메틸화 감수성 제한 효소로 처리함으로써, 부분적으로 메틸화되어 있는 DNA 프래그먼트를 소화할 수 있는 것, 또한, 메틸화 사이토신 항체와, 메틸화된 DNA 프래그먼트와, 고정화한 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·분리하고, 복합체 중의 메틸화 사이토신 항체를, 그 식별 기능에 의거하여 검출·정량함으로써, 메틸화된 DNA 프래그먼트의 검출·정량이 가능한 것이 확인되었다.
실시예 5
배열 번호 37로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M8, 배열 번호 38로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-M8, 배열 번호 39로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 GPR-M8, 배열 번호 40으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-U8, 배열 번호 41로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-U8, 및 배열 번호 42로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 GPR-U8을 합성하여, 메틸화 올리고뉴클레오티드 및 비메틸화 올리고뉴클레오티드 각각에 대해 이하의 TE 버퍼 용액을 조제하였다.
용액 A : 0.3pmol/10μL TE 버퍼 용액
용액 B : 0.03pmol/10μL TE 버퍼 용액
용액 C : 0.003pmol/10μL TE 버퍼 용액
용액 D : 0pmol/10μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액)
다음에, 각각의 용액(용액 A∼용액 D)에 대해, 상기의 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M8, FBN-M8, GPR-M8의 각각의 용액을 등량씩 혼합한 메틸화 올리고뉴클레오티드 혼합 용액 M0, 및 상기의 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-U8, FBN-U8, GPR-U8의 각각의 용액을 등량씩 혼합한 메틸화 올리고뉴클레오티드 혼합 용액 U0을 조제하였다.
<메틸화 올리고뉴클레오티드> N은 메틸화 사이토신을 나타낸다.
UBC-M8 : 5’-ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA-3’(배열 번호 37)
FBN-M8 : 5’-ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG-3’(배열 번호 38)
GPR-M8 : 5’- ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCTGCCGAGAACGAGGCGTTGTC-3’(배열 번호 39)
<비메틸화 올리고뉴클레오티드>
UBC-U8 : 5’-ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA-3’(배열 번호 40)
FBN-U8 : 5’-ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG-3’(배열 번호 41)
GPR-U8 : 5’- ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCTGCCGAGAACGAGGCGTTGTC-3 ’(배열 번호 42)
배열 번호 43, 배열 번호 44, 및 배열 번호 45로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 UBC, FBN, 및 GPR의 0.1pmol/50μL TE 버퍼 용액을 조제하였다(각각, UBC-B 용액, FBN-B 용액, 및 GPR-B 용액). 또, 배열 번호 43, 배열 번호 44, 및 배열 번호 45로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 UBC, FBN, 및 GPR을 등량씩 혼합한(각 0.1pmol/50μL) TE 버퍼 용액인 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 용액(비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 혼합 용액)을 조제하였다.
<5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드>
UBC : 5’-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3’(배열 번호 43)
FBN : 5’-CTAATAAGCCCTTCGTCGGCT-3’(배열 번호 44)
GPR : 5’-GACAACGCCTCGTTCTCGG-3’(배열 번호 45)
상기의 메틸화 올리고뉴클레오티드 혼합 용액 M0, 및 비메틸화 올리고뉴클레오티드 혼합 용액 U0의 각각의 용액(용액 A∼용액 D)에 대해, 이하의 처리를 실시하였다(각 4개씩 조제).
PCR 튜브에, 상기에서 조제한 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 10μL를 첨가한 후, 상기의 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드의 각 용액(UBC-B 용액, FBN-B 용액, GPR-B 용액, 및 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 혼합 용액) 을 각 반응액에 50μL를 첨가한 후, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 100μL로 하여, 혼합하였다.
다음에, 당해 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속하게 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 또한, 이것을 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 다음에 37℃로 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌림으로써, 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 결합체의 형성을 촉진하였다.
얻어진 용액 중 혼합물 모두를 스트렙트아비딘 피복이 끝난 96 웰 플레이트로 옮기고, 약 30분간 실온에서 방치함으로써, 당해 플레이트에 상기 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 결합체를 고정화하였다. 방치 후, 상기 플레이트 내의 용액을 디켄테이션으로 제거하고, 다음에 상기 플레이트 내의 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
상기의 각 웰에 메틸화 사이토신 항체[Aviva Systems Biology사제, 1μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액] 100μL를 첨가한 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 그 후, 당해 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
다음에, Eu-N1 표식 마우스 IgG 항체[Perkin Elmer사제, 0.25μg/μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액] 100μL를 상기의 각 웰에 첨가한 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 당해 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
Enhancement Solution(Perkih Elmer사제) 200μL를 상기의 각 웰에 첨가·혼합함으로써, 반응을 개시하였다. 그 후, 약 45분간 실온에서 방치한 후, 얻어진 시료의 형광을 여기 340nm/형광 612nm로 측정하였다.
그 결과를 도 8∼도 11에 나타내었다. 메틸화 올리고뉴클레오티드 혼합 용액 M0에서는, 고정화한 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 UBC(도 8), FBN(도 9), GPR(도 10), 및 상기 3종을 혼합한 올리고뉴클레오티드(도 11)와, 메틸화 사이토신 항체의 복합체를 형성·분리하고, 복합체 중의 비오틴 표식에 의해, 감도 좋게 검출·정량되는 것이 확인되었다. 특히 3종의 올리고뉴클레오티드를 혼합한 경우(도 11)에서는, 단독 올리고뉴클레오티드로의 검출(도 8∼도 10)에 비해 감도 좋게 검출·정량되는 것이 확인되었다. 비메틸화 올리고뉴클레오티드 혼합 용액 U0에서는, 고정화한 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 UBC(도 8), FBN(도 9), GPR(도 10), 및 상기 3종을 혼합한 올리고뉴클레오티드(도 11)와, 메틸화 사이토신 항체의 복합체를 형성하지 않으므로, 어느 것에 있어서나, 대략 백그라운드값과 동일한 값을 나타내었다.
이상으로부터, 메틸화 사이토신 항체와, 메틸화된 DNA 프래그먼트와, 고정화 한 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·분리하고, 복합체 중의 메틸화 사이토신 항체를, 그 식별 기능에 의거하여 검출·정량함으로써, 메틸화된 DNA 프래그먼트의 검출·정량이 가능한 것이 확인되었다. 또한 복수의 고정화한 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드를 이용함으로써 1종의 고정화한 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드를 이용하는 경우보다(즉, 1개의 목적으로 하는 DNA 영역을 이용할 뿐만 아니라, 동시에 복수의 목적으로 하는 DNA 영역을 이용함으로써), 감도 좋게 검출·정량할 수 있는 것이 확인되었다.
실시예 6
시판의 메틸화 사이토신 항체(Aviva Systems Biology사제)를, 시판 비오틴화 키트(Biotin Labeling Kit-NH2, 도진도 화학 연구소제)를 이용해, 카탈로그에 기재된 방법에 준하여, 비오틴 표식하였다. 얻어진 비오틴 표식 메틸화 사이토신 항체를 용액[항체 약 0.1μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]으로서 냉장 보존하였다.
합성하여 얻어진 비오틴 표식 메틸화 사이토신 항체 용액을, 스트렙트아비딘 피복이 끝난 96 웰 플레이트에 100μL/웰을 첨가한 후, 약 1시간 실온에서 방치함으로써 웰에 고정화하였다. 방치 후, 당해 각 웰로부터 용액을 디켄테이션에 의해 제거하고, 다음에, 상기의 각 웰에 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 당해 각 웰로부터 당해 버퍼를 디켄테이션에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
배열 번호 46으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M8, 배열 번호 47로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-M8, 배열 번호 48로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 GPR-M8, 배열 번호 49로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-U8, 배열 번호 50으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-U8, 및 배열 번호 51로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 GPR-U8을 합성하여 각각에 대해 이하의 용액을 조제하였다.
용액 A : 0.1pmoL/10μL TE 버퍼 용액
용액 B : 0.01pmoL/10μL TE 버퍼 용액
용액 C : 0.001pmoL/10μL TE 버퍼 용액
용액 D : 0pmoL/10μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액)
<메틸화 올리고뉴클레오티드> N은 메틸화 사이토신을 나타낸다.
UBC-M8 : 5’-ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA-3’(배열 번호 46)
GPR-M8 : 5’-ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCTGCCGAGAACGAGGCGTTGTC-3’(배열 번호 47)
FBN-M8 : 5’-ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG-3’(배열 번호 48)
<비메틸화 올리고뉴클레오티드>
UBC-UM8 : 5’-ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA-3’(배열 번호 49)
GPR-UM8 : 5’-ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCTGCCGAGAACGAGGCGTTGTC-3’(배열 번호 50)
FBN-UM8 : 5’-ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG-3’(배열 번호 51)
다음에, 5’말단을 FITC 표식한 배열 번호 52로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 UBC, 5’말단을 FITC 표식한 배열 번호 53으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 GPR, 및 5’말단을 FITC 표식한 배열 번호 54로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 FBN을 합성하여, 1pmol/50μL TE 버퍼 용액을 조제하였다(각각, UBC-FITC 용액, FBN-FITC 용액, 및 GPR-FITC 용액).
<5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드>
UBC : 5’-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3’(배열 번호 52)
GPR : 5’-GACAACGCCTCGTTCTCGG-3’(배열 번호 53)
FBN : 5’-CTAATAAGCCCTTCGTCGGCT-3’(배열 번호 54)
얻어진 각각의 용액에 대해, 이하의 처리를 실시하였다(각 용액에 대해 1개씩 조제).
UBC 혼합 용액의 조제 : PCR 튜브에, 상기에서 조제한 올리고뉴클레오티드 용액(UBC-M8 또는 UBC-U8 용액) 10μL와, 상기에서 조제한 5’말단 FITC 표식 올리 고뉴클레오티드 용액(UBC-FITC 용액) 50μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 5μL를 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 100μL로 하여, 혼합하였다.
FBN 혼합 용액의 조제 : PCR 튜브에, 상기에서 조제한 올리고뉴클레오티드 용액(FBN-M8 또는 FBN-U8 용액) 10μL와, 상기에서 조제한 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액(FBN-FITC 용액) 50μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 5μL를 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 100μL로 하여, 혼합하였다.
GPR 혼합 용액의 조제 : PCR 튜브에, 상기에서 조제한 올리고뉴클레오티드 용액(GPR-M8 또는 GPR-U8 용액) 10μL와, 상기에서 조제한 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액(GPR-FITC 용액) 50μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 5μL를 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 100μL로 하여, 혼합하였다.
각각의 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속하게 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 또한, 이것을 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 다음에 37℃로 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌림으로써, 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 메틸화 또는 비메틸화 올리고뉴클레오티드의 결합체의 형성을 촉진하였다.
5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 메틸화 또는 비메틸화 올리고뉴클 레오티드의 결합체가 들어간 PCR 튜브의 용액 전량을, 먼저 조제해 둔 비오틴 표식 메틸화 사이토신 항체가 고정화된 플레이트로 옮기고, 실온에서 약 1시간 방치하였다. 방치 후, 상기 플레이트 내의 용액을 디켄테이션에 의해 제거하고, 다음에, 상기 플레이트 내의 각 웰에 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 당해 각 웰로부터 당해 버퍼를 디켄테이션에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
그 후, HRP 표식 FITC 항체 용액[Jackson ImmunoResearch Laboratories사제, 0.01μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액] 100μL를 상기의 각 웰에 첨가한 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 각 웰에 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 당해 각 웰로부터 당해 버퍼를 디켄테이션에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
다음에, 기질(R&D사제, #DY999) 100μL를, 각 웰에 첨가·혼합함으로써, 반응을 개시하였다.
다음에, 약 5분간 실온에서 방치한 후, 당해 각 웰에 스톱 용액(1N H2SO4 수용액) 50μL를 각 웰에 첨가하여 혼합함으로써, 반응을 정지하였다. 반응 정지 후 30분 이내에 얻어진 시료의 450nm의 흡광도를 측정하였다.
그 결과를 도 12∼도 14에 나타내었다. UBC(도 12), GPR(도 13), 및 FBN(도 14)의 모든 경우에 있어서, 메틸화 프래그먼트 UBC-M8, GPR-M8, 및 FBN-M8에서는, 고정화한 메틸화 사이토신 항체와, 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·분리하고, 복합체 중의 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드를, 그 식별 기능에 의거하여 검출·정량함으로써, 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M8, GPR-M8, 및 FBN-M8이, 어느 농도에 있어서나 감도 좋게 검출·정량되는 것이 확인되었다. 비메틸화 프래그먼트 UBC-U8, GPR-U8, 및 FBN-MU에서는, 고정화한 메틸화 사이토신 항체와, 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·분리하지 않으므로, 어느 것에 있어서나, 대략 백그라운드값과 동일한 값을 나타내었다.
이상으로부터, 고정화한 메틸화 사이토신 항체와, 메틸화된 DNA 프래그먼트와, 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·분리하고, 복합체 중의 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드를, 그 식별 기능에 의거하여 검출·정량함으로써, 메틸화된 DNA 프래그먼트의 검출·정량이 가능한 것이 확인되었다.
실시예 7
시판의 메틸화 사이토신 항체(Aviva Systems Biology사제)를, 시판 비오틴화 키트(Biotin Labeling Kit-NH2, 도진도 화학 연구소제)를 이용해, 카탈로그에 기재된 방법에 준하여, 비오틴 표식하였다. 얻어진 비오틴 표식 메틸화 사이토신 항체를 용액[항체 약 0.1μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]으로서 냉장 보존하였다.
합성하여 얻어진 비오틴 표식 메틸화 사이토신 항체 용액을, 스트렙트아비딘 피복이 끝난 96 웰 플레이트에 100μL/웰을 첨가한 후, 약 1시간 실온에서 방치함으로써 웰에 고정화하였다. 방치 후, 당해 각 웰로부터 용액을 디켄테이션에 의해 제거하고, 다음에 300μL의 멸균 초순수로 25배 희석된 DELFIA Wash Concentrate(Perkin Elmer사제, Tris-HCl pH 7.8 with Tween 80)를 첨가한 후, 당해 각 웰로부터 당해 버퍼를 디켄테이션에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
배열 번호 55로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M, 배열 번호 56으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 부분 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-HM, 및 배열 번호 57로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-UM을 합성하여, 각각에 대해, 이하의 용액을 조제하였다.
용액 A : 0.1pmoL/10μL TE 버퍼 용액
용액 B : 0.01pmoL/10μL TE 버퍼 용액
용액 C : 0.001pmoL/10μL TE 버퍼 용액
용액 D : 0pmoL/10μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액)
<메틸화 올리고뉴클레오티드> N은 메틸화 사이토신을 나타낸다.
UBC-M : 5’-
AGTGACACCATNGAGAATGTCAGATCNGGATCAGAGNGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGACTACAACATCCAGA-3’(배열 번호 55)
<부분 메틸화 올리고뉴클레오티드> N은 메틸화 사이토신을 나타낸다.
UBC-HM : 5’-
AGTGACACCATNGAGAATGTCAGATCCGGATCAGAGCGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGACTACAACATCCAGA-3’(배열 번호 56)
<비메틸화 올리고뉴클레오티드>
UBC-UM : 5’-
AGTGACACCATCGAGAATGTCAGATCCGGATCAGAGCGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGACTACAACATCCAGA-3’(배열 번호 57)
얻어진 각각의 용액에 대해, 이하의 처리를 실시하였다(각 용액에 대해 2개씩 조제).
A군(무처리군) : 얻어진 용액 10μL에, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 5μL와, BSA(Bovine serum albumin 1mg/ml) 5μL를 첨가한 후, 이것에 배열 번호 58로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 CA1을 마스킹용 올리고뉴클레오티드로서 10pmol을 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 50μL로 하여, 혼합하였다.
B군(HhaI 처리군) : 얻어진 용액 10μL에, HhaI를 6U와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 5μL와, 10×BSA(Bovine serum albumin 1mg/ml) 5μL를 첨가한 후, 이것에 배열 번호 58로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 CA1을 마스킹용 올리고뉴클레오티드로서 10pmol을 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 50μ L로 하여, 혼합하였다.
<마스킹용 올리고뉴클레오티드>
CA1 : 5’-GATGGCGCTCTG-3’(배열 번호 58)
각각의 반응액을 37℃로 3시간 인큐베이션한 후, 미리 합성된 5’말단이 FITC 표식되어 이루어지는 배열 번호 59로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 UBC의 1pmol/50μL TE 버퍼 용액 50μL를 상기의 PCR 튜브에 첨가하였다.
<5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드>
UBC : 5’-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3’(배열 번호 59)
다음에, 당해 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속하게 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 또한, 이것을 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 다음에 37℃로 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌림으로써, 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 결합체의 형성을 촉진하였다.
5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 결합체가 들어간 PCR 튜브의 용액 전량을, 먼저 조제해 둔 비오틴 표식 메틸화 사이토신 항체가 고정화된 플레이트로 옮기고, 실온에서 약 1시간 방치하였다. 방치 후, 상기 플레이트 내의 용액을 디켄테이션에 의해 제거하고, 다음에 상기 플레이트 내의 각 웰에 300μL의 멸균 초순수로 25배 희석된 DELFIA Wash Concentrate(Perkin Elmer사제, Tris-HCl pH 7.8 with Tween 80)를 첨가한 후, 당해 각 웰로부터 당해 버퍼를 디켄테이션에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
그 후, HRP 표식 FITC 항체 용액[Jackson ImmunoResearch Laboratories사제, 0.01μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액] 100μL를 상기의 각 웰에 첨가한 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 각 웰에 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 당해 각 웰로부터 당해 버퍼를 디켄테이션에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
다음에, 기질(R&D사제, #DY999) 100μL를, 각 웰에 첨가·혼합함으로써, 반응을 개시하였다.
다음에, 약 10분간 실온에서 방치한 후, 당해 각 웰에 스톱 용액(1N H2SO4 수용액) 50μL를 각 웰에 첨가하여 혼합함으로써, 반응을 정지하였다. 반응 정지 후 30분 이내에 얻어진 시료의 450nm의 흡광도를 측정하였다.
그 결과를 도 15 및 도 16에 나타내었다. A군(무처리군)의 경우(도 15), CG 배열의 3개소 중 3개소 모두 메틸화되어 있는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M에서는, 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 UBC와, 고정화한 메틸화 사이토신 항체의 복합체를 형성·분리하고, 감도 좋게 검출·정량되는 것이 확인되었다. 한편, CG 배열의 3개소 중 1개소만 메틸화되어 있는 부분 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-HM에서는, 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 UBC와, 고정화한 메틸화 사이토신 항체의 복합체를 형성·분리하지만, 메틸화되어 있는 부분이 1개소뿐이므로 복합체 형성률이 UBC-M에 비해 낮은 것으로 생각되어, UBC-M보다 낮은 검출·정량 결과가 되었다. CG 배열의 3개소 중 1개소도 메틸화되어 있지 않은 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-UM에서는 복합체를 형성·분리하지 않으므로, 대략 백그라운드값(용액 D의 데이터)과 동일한 값을 나타내었다. B군(HhaI 처리군)의 경우(도 16), CG 배열의 3개소 중 3개소 모두 메틸화되어 있는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M에서는, 메틸화 감수성 제한 효소(HhaI)로 소화되지 않으므로, 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 UBC와, 고정화한 메틸화 사이토신 항체의 복합체를 형성·분리하고, 대략 A군(무처리군)에서의 값과 동일하게, 감도 좋게 검출·정량되는 것이 확인되었다. CG 배열의 3개소 중 1개소만 메틸화되어 있는 부분 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-HM에서는, 메틸화 감수성 제한 효소(HhaI)에 의한 소화에 의해, 메틸화된 CG 배열은 없어져 버린다. 따라서, 복합체를 형성·분리하지 않으므로, 백그라운드값(용액 D의 데이터)과 동일한 값을 나타내었다. CG 배열의 3개소 중 1개소도 메틸화되어 있지 않은 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-UM에서는, 대략 A처리군(무처리군)에서의 값과 동일하게, 복합체를 형성·분리하지 않으므로, 대략 백그라운드값과 동일한 값을 나타내었다.
이상으로부터, 메틸화 감수성 제한 효소로 처리함으로써, 부분적으로 메틸화되어 있는 DNA 프래그먼트를 소화할 수 있는 것, 또한, 고정화한 메틸화 사이토신 항체와, 메틸화된 DNA 프래그먼트와, 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·분리하고, 복합체 중의 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드를, 그 식별 기능에 의거하여 검출·정량함으로써, 메틸화된 DNA 프래그먼트의 검출·정량이 가능한 것이 확인되었다.
실시예 8
시판의 메틸화 사이토신 항체(Aviva Systems Biology사제)를, 시판 비오틴화 키트(Biotin Labeling Kit-NH2, 도진도 화학 연구소제)를 이용해, 카탈로그에 기재된 방법에 준하여, 비오틴 표식하였다. 얻어진 비오틴 표식 메틸화 사이토신 항체를 용액[항체 약 0.1μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]으로서 냉장 보존하였다.
합성하여 얻어진 비오틴 표식 메틸화 사이토신 항체 용액을, 스트렙트아비딘 피복이 끝난 96 웰 플레이트에 100μL/웰을 첨가한 후, 약 1시간 실온에서 방치함으로써 웰에 고정화하였다. 방치 후, 당해 각 웰로부터 용액을 디켄테이션에 의해 제거하고, 다음에, 상기의 각 웰에 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 당해 각 웰로부터 당해 버퍼를 디켄테이션에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
배열 번호 60으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC/GPR/FBN-M, 및 배열 번호 61로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC/GPR/FBN-UM을 합성하여, 각각에 대해, 이하의 용액을 조제하였다.
용액 A : 0.1pmoL/10μL TE 버퍼 용액
용액 B : 0.01pmoL/10μL TE 버퍼 용액
용액 C : 0.001pmoL/10μL TE 버퍼 용액
용액 D : 0pmoL/10μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액)
<메틸화 올리고뉴클레오티드> N은 메틸화 사이토신을 나타낸다.
UBC/GPR/FBN-M : 5’-
CTGTCTGACTACAACATCCAGANGCCGAGAACGAGGCGTTGTCNGAGCCGACGAAGGGCTTATTAG-3’(배열 번호 60)
<비메틸화 올리고뉴클레오티드>
UBC/GPR/FBN-UM : 5’-
CTGTCTGACTACAACATCCAGACGCCGAGAACGAGGCGTTGTCCGAGCCGACGAAGGGCTTATTAG-3’(배열 번호 61)
다음에, 배열 번호 62, 배열 번호 63, 및 배열 번호 64로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단을 FITC 표식한 올리고뉴클레오티드 UBC, FBN, 및 GPR의 1pmol/50μL TE 버퍼 용액을 조제하였다(UBC-FITC 용액, FBN-FITC 용액, 및 GPR-FITC 용액). 또, 배열 번호 62, 배열 번호 63, 및 배열 번호 64로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 UBC, FBN, 및 GPR의 TE 버퍼 용액을 혼합한 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액(FITC 표식 올리고뉴클레오티드 혼합 용액)을 조제하였다(각 1pmol/50μL).
<5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드>
UBC : 5’-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3’(배열 번호 62)
GPR : 5’-GACAACGCCTCGTTCTCGG-3’(배열 번호 63)
FBN : 5’-CTAATAAGCCCTTCGTCGGCT-3’(배열 번호 64)
얻어진 각각의 용액에 대해, 이하의 처리를 실시하였다.
새로운 PCR 튜브에, 상기에서 조제한 메틸화 올리고뉴클레오티드 용액 또는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 용액 10μL(각 용액에 대해 8개씩 조제)와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 10μL와, 상기에서 조제한 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액(UBC-FITC 용액, FBN-FITC 용액, GPR-FITC 용액, 및 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 혼합 용액) 50μL와, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 100μL로 하여, 혼합하였다.
다음에, 당해 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속하게 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 또한, 이것을 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 다음에 37℃로 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌림으로써, 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 결합체의 형성을 촉진하였다.
5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 결합체가 들어간 PCR 튜브의 용액 전량을, 먼저 조제해 둔 비오틴 표식 메틸화 사이토신 항체가 고정화된 플레이트로 옮기고, 실온에서 약 2시간 방치하였다. 방치 후, 상기 플레이트 내의 용액을 디켄테이션에 의해 제거하고, 다음에, 상기 플레이트 내의 각 웰에 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 당해 각 웰로부터 당해 버퍼를 디켄테이션에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
그 후, HRP 표식 FITC 항체 용액[Jackson ImmunoResearch Laboratories사제, 0.01μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액] 100μL를 상기의 각 웰에 첨가한 후, 약 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 각 웰에 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 당해 각 웰로부터 당해 버퍼를 디켄테이션에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
다음에, 기질(R&D사제, #DY999) 100μL를, 각 웰에 첨가·혼합함으로써, 반응을 개시하였다.
다음에, 약 5분간 실온에서 방치한 후, 당해 각 웰에 스톱 용액(1N H2SO4 수용액) 50μL를 각 웰에 첨가하여 혼합함으로써, 반응을 정지하였다. 반응 정지 후 30분 이내에 얻어진 시료의 450nm의 흡광도를 측정하였다.
그 결과를 도 17∼도 20에 나타내었다. 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC/GPR/FBN-M, 및 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC/GPR/FBN-U에서는, 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 UBC, GPR, 및 FBN이 이중 가닥을 형성할 수 있는(각각 상보하는 염기 배열을 올리고뉴클레오티드 내에 갖는다) 올리고뉴클레오티드이다. 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 UBC(도 17), GPR(도 18), 및 FBN(도 19), 상기 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드의 혼합(도 20)을 이용한 모든 경우에 있어서, 메틸화 프래그먼트 UBC/GPR/FBN-M에서는, 고정화한 메틸화 사이토신 항체와, 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·분리하고, 복합 체 중의 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드를, 그 식별 기능에 의거하여 검출·정량함으로써, 메틸화 올리고뉴클레오티드/GPR/FBN-M이, 어느 농도에 있어서나 감도 좋게 검출·정량되는 것이 확인되었다. 비메틸화 프래그먼트 UBC/GPR/FBN-U에서는, 고정화한 메틸화 사이토신 항체와, 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·분리하지 않으므로, 대략 백그라운드값과 동일한 값을 나타내었다. 또한, 복수의 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드를 이용함으로써(도 20), 1종(단독)의 고정화한 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드를 이용하는 경우(도 17∼도 19)보다, 감도 좋게 검출·정량할 수 있는 것이 확인되었다.
이상으로부터, 고정화한 메틸화 사이토신 항체와, 메틸화된 DNA 프래그먼트와, 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·분리하고, 복합체 중의 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드를, 그 식별 기능에 의거하여 검출·정량함으로써, 메틸화된 DNA 프래그먼트의 검출·정량이 가능한 것이 확인되었다. 또, 1개의 목적으로 하는 DNA 영역에 대해, 복수의 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드를 이용함으로써, 1종(단독)의 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드를 이용하는 경우보다(즉, 1개의 목적으로 하는 DNA 영역에 대해, 동시에 복수의 본 올리고뉴클레오티드를 이용한 쪽이), 보다 감도 좋게 검출·정량할 수 있는 것이 확인되었다.
실시예 9
시판의 메틸화 사이토신 항체(Aviva Systems Biology사제)를, 시판 비오틴화 키트(Biotin Labeling Kit-NH2, 도진도 화학 연구소제)를 이용해, 카탈로그에 기재된 방법에 준하여, 비오틴 표식하였다. 얻어진 비오틴 표식 메틸화 사이토신 항체를 용액[항체 약 0.1μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]으로서 냉장 보존하였다.
합성하여 얻어진 비오틴 표식 메틸화 사이토신 항체 용액을, 스트렙트아비딘 피복이 끝난 96 웰 플레이트에 100μL/웰을 첨가한 후, 약 1시간 실온에서 방치함으로써 웰에 고정화하였다. 방치 후, 당해 각 웰로부터 용액을 디켄테이션에 의해 제거하고, 다음에, 상기의 각 웰에 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 당해 각 웰로부터 당해 버퍼를 디켄테이션에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
배열 번호 65로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M8, 배열 번호 66으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-M8, 배열 번호 67로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 GPR-M8, 배열 번호 68로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-U8, 배열 번호 69로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-U8, 및 배열 번호 70으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 GPR-U8을 합성하여, 메틸화 올리고뉴클레오티드 및 비메틸화 올리고뉴클레오티드 각각에 대해 이하의 용액을 조제하였다.
용액 A : 0.3pmol/10μL TE 버퍼 용액
용액 B : 0.03pmol/10μL TE 버퍼 용액
용액 C : 0.003pmol/10μL TE 버퍼 용액
용액 D : TE 버퍼 용액(음성 대조군액)
다음에, 각각의 용액(용액 A∼용액 D)에 대해, 상기의 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M8, FBN-M8, GPR-M8의 각각의 용액을 등량씩 혼합한 메틸화 올리고뉴클레오티드 혼합 용액 M0, 및 상기의 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-U8, FBN-U8, GPR-U8의 각각의 용액을 등량씩 혼합한 메틸화 올리고뉴클레오티드 혼합 용액 U0을 조제하였다.
<메틸화 올리고뉴클레오티드> N은 메틸화 사이토신을 나타낸다.
UBC-M8 : 5’-ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA-3’(배열 번호 65)
FBN-M8 : 5’-ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG-3’(배열 번호 66)
GPR-M8 : 5’-ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCTGCCGAGAACGAGGCGTTGTC-3’(배열 번호 67)
<비메틸화 올리고뉴클레오티드>
UBC-U8 : 5’-ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA-3’(배열 번호 68)
FBN-U8 : 5’-ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG-3’(배열 번호 69)
GPR-U8 : 5’-ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCTGCCGAGAACGAGGCGTTGTC-3’(배열 번호 70)
배열 번호 71, 배열 번호 72, 및 배열 번호 73으로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단을 FITC 표식한 올리고뉴클레오티드 UBC, FBN, 및 GPR의 1pmol/50μL TE 버퍼 용액을 조제하였다(UBC-FITC 용액, FBN-FITC 용액, 및 GPR-FITC 용액). 또, 배열 번호 71, 배열 번호 72, 배열 번호 73으로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 UBC, FBN, 및 GPR을 등량씩 혼합한 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액(FITC 표식 올리고뉴클레오티드 혼합 용액)을 조제하였다(각 1pmol/50μL).
<5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드>
UBC : 5’-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3’(배열 번호 71)
GPR : 5’-GACAACGCCTCGTTCTCGG-3’(배열 번호 72)
FBN : 5’-CTAATAAGCCCTTCGTCGGCT-3’(배열 번호 73)
얻어진 각각의 용액에 대해, 이하의 처리를 실시하였다.
새로운 PCR 튜브에, 상기에서 조제한 올리고뉴클레오티드 용액(MA, MB, MC, MD, UA, UB, UC, UD)을 10μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 10μL와, 상기에서 조제한 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액(UBC-FITC 용액, FBN-FITC 용액, GPR-FITC 용액, 및 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 혼합 용액) 50μL와, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 100μL로 하여, 혼합하였다.
다음에, 당해 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속하게 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 또한, 이것을 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고 다음에 37℃로 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌림으로써, 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 결합체의 형성을 촉진하였다.
5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 결합체가 들어간 PCR 튜브의 용액 전량을, 먼저 조제해 둔 비오틴 표식 메틸화 사이토신 항체가 고정화된 플레이트로 옮기고, 실온에서 약 1시간 방치하였다. 방치 후, 상기 플레이트 내의 용액을 디켄테이션에 의해 제거하고, 다음에, 상기 플레이트 내의 각 웰에 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 당해 각 웰로부터 당해 버퍼를 디켄테이션에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
그 후, HRP 표식 FITC 항체 용액[Jackson ImmunoResearch Laboratories사제, 0.01μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액] 100μL를 각 웰에 첨가한 후, 약 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 당해 각 웰로부터 용액을 디켄테이션에 의해 제거하고, 다음에, 상기의 각 웰에 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 당해 각 웰로부터 당해 버퍼를 디켄테이션 에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
다음에, 기질(R&D사제, #DY999) 100μL를, 각 웰에 첨가·혼합함으로써, 반응을 개시하였다.
다음에, 약 5분간 실온에서 방치한 후, 당해 각 웰에 스톱 용액(1N H2SO4 수용액) 50μL를 각 웰에 첨가하여 혼합함으로써, 반응을 정지하였다. 반응 정지 후 30분 이내에 얻어진 시료의 450nm의 흡광도를 측정하였다.
그 결과를 도 21∼도 24에 나타내었다. 메틸화 올리고뉴클레오티드 혼합 용액 M0에서는, 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 UBC(도 21), FBN(도 22), GPR(도 23), 및 상기 3종을 혼합한 올리고뉴클레오티드(도 24)와, 메틸화 사이토신 항체의 복합체를 형성·분리하고, 감도 좋게 검출·정량되는 것이 확인되었다. 특히 3종의 올리고뉴클레오티드를 혼합한 경우(도 24)에서는, 단독 올리고뉴클레오티드로의 검출(도 21∼도 23)에 비해 감도 좋게 검출·정량되는 것이 확인되었다. 비메틸화 올리고뉴클레오티드 혼합 용액 U0에서는, 고정화한 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 UBC(도 21), FBN(도 22), GPR(도 23), 및 상기 3종을 혼합한 올리고뉴클레오티드(도 24)와, 메틸화 사이토신 항체의 복합체를 형성하지 않으므로, 어느 것에 있어서나, 대략 백그라운드값과 동일한 값을 나타내었다.
이상으로부터, 고정화한 메틸화 사이토신 항체와, 메틸화된 DNA 프래그먼트와, 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·분리하고, 복합체 중의 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드를, 그 식별 기능에 의거하여 검출·정량 함으로써, 메틸화된 DNA 프래그먼트의 검출·정량이 가능한 것이 확인되었다. 또한 복수의 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드를 이용함으로써 1종의 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드를 이용하는 경우보다(즉, 1개의 목적으로 하는 DNA 영역을 이용할 뿐만 아니라, 동시에 복수의 목적으로 하는 DNA 영역을 이용함으로써), 감도 좋게 검출·정량할 수 있는 것이 확인되었다.
실시예 10
시판되어 있는 다카라바이오사의 Bed-Side ICAN(TM) Legionella Detection Kit의 스트렙트아비딘 피복 크로마토스트립, 컨쥬게이트(금 나노입자 표식 FITC 항체) 용액을 이용하여, 이하의 실험을 실시하였다.
배열 번호 74로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M8, 및 배열 번호 75로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-U8을 합성하여 각각에 대해, 0.1pmol/μL TE 버퍼 용액을 조제하였다. 또, 음성 대조군로서 TE 버퍼 용액을 준비하였다.
<메틸화 올리고뉴클레오티드> N은 메틸화 사이토신을 나타낸다.
UBC-M8 : 5’-ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA-3’(배열 번호 74)
<비메틸화 올리고뉴클레오티드>
UBC-U8 : 5’- ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA-3’(배열 번호 75)
배열 번호 76으로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴 클레오티드 UBC의 0.5pmol/μL TE 버퍼 용액을 조제하였다(UBC 용액).
<5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드>
UBC : 5’-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3’(배열 번호 76)
상기의 메틸화 올리고뉴클레오티드 용액, 및 비메틸화 올리고뉴클레오티드 용액을 이용하여, 이하의 처리를 실시하였다(각 1개씩 조제).
PCR 튜브에, 상기에서 조제한 올리고뉴클레오티드 용액(UBC-M8, UBC-U8 용액, TE 버퍼 용액) 2μL와, 상기에서 조제한 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 용액(UBC-B 용액) 2μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 2μL와, BSA(Bovine serum albumin 1mg/mL) 2μL를 첨가한 후, 이것에 배열 번호 77로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 CA1을 캐리어 DNA로서 5pmol 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 20μL로 하여, 혼합하였다.
<캐리어 DNA>
CA1 : 5’-GATGGCGCTCTG-3’(배열 번호 77)
다음에, 당해 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속하게 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 또한, 이것을 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 다음에 37℃로 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌림으로써, 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 결합체의 형성을 촉진하였다.
얻어진 반응 용액 모두를, 각각, 바닥이 평평한 플레이트의 웰로 옮기고, 스 트렙트아비딘 피복 크로마토스트립의 선단을 각 웰의 바닥까지 끼워넣어, 전개하였다(용액 전부를 스트립에 흡수시켰다).
다른 바닥이 평평한 플레이트의 웰에, 메틸화 사이토신 항체[Aviva Systems Biology사제, 0.1μg/20μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액] 20μL를 넣어 두고, 거기에 상기에서 얻어진 스트렙트아비딘 피복 크로마토스트립의 선단을 각 웰의 바닥까지 끼워넣어, 더 전개하였다.
다른 바닥이 평평한 플레이트의 웰에, FITC 표식 마우스 IgG 항체(Medical & Biological Laboratories사제) 용액[0.2μg/20μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 20μL를 넣어 두고, 거기에 상기에서 얻어진 스트렙트아비딘 피복 크로마토스트립의 선단을 각 웰의 바닥까지 끼워넣어, 더 전개하였다.
다음에, 다른 바닥이 평평한 플레이트의 각 웰에 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액] 20μL를 넣어 두고, 거기에 상기에서 얻어진 스트렙트아비딘 피복 크로마토스트립의 선단을 각 웰의 바닥까지 끼워넣어, 더 전개하였다.
그 후, 다른 바닥이 평평한 플레이트의 웰에 컨쥬게이트 용액(금 나노입자 표식 FITC 항체 용액) 20μL를 넣어 두고, 거기에 상기에서 얻어진 스트렙트아비딘 피복 크로마토스트립의 선단을 각 웰의 바닥까지 끼워넣어, 더 전개하였다.
전개 종료 후, 스트렙트아비딘 피복 크로마토스트립을 육안으로 보고, 적자 색 라인의 유무를 확인하였다.
그 결과를 도 25에 나타내었다. 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M8의 경우, 스트렙트아비딘 피복 크로마토스트립 상에, 적자색의 라인이 확인되었다. 따라서, 메틸화 DNA 항체와, 고정화한 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드와, 메틸화된 DNA 프래그먼트의 복합체를 형성·분리하는 것이 확인되었다. 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-U8, 및 음성 대조군(TE 버퍼 용액)에서는, 복합체를 형성하지 않으므로, 적자색의 라인은 확인할 수 없었다.
이상으로부터, 메틸화 사이토신 항체와, 메틸화된 DNA 프래그먼트와, 고정화한 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·분리하고, 복합체 중의 메틸화 사이토신 항체를, 그 식별 기능에 의거하여 검출·정량함으로써, 메틸화된 DNA 프래그먼트의 검출·정량이 가능한 것이, 크로마토스트립 상에서 가능한 것이 확인되었다.
실시예 11
시판되어 있는 다카라바이오사의 Bed-Side ICAN(TM) Legionella Detection Kit의 스트렙트아비딘 피복 크로마토스트립, 컨쥬게이트(금 나노입자 표식 FITC 항체) 용액을 이용하여, 이하의 실험을 실시하였다.
시판의 메틸화 사이토신 항체(Aviva Systems Biology사제)를, 시판 비오틴화 키트(Biotin Labeling Kit-NH2, 도진도 화학 연구소제)를 이용해, 카탈로그에 기재된 방법에 준하여, 비오틴 표식하였다. 얻어진 비오틴 표식 메틸화 사이토신 항체 를 용액[항체 약 0.1μg/20μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]으로서 냉장 보존하였다.
배열 번호 78로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M8, 배열 번호 79로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-M8, 배열 번호 80으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 GPR-M8, 배열 번호 81로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-U8, 배열 번호 82로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-U8, 및 배열 번호 83으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 GPR-U8을 합성하여 각각에 대해 0.1pmol/μL TE 버퍼 용액을 조제하였다. 또, 음성 대조군로서 TE 버퍼 용액을 이용하였다.
<메틸화 올리고뉴클레오티드> N은 메틸화 사이토신을 나타낸다.
UBC-M8 : 5’-ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA-3’(배열 번호 78)
FBN-M8 : 5’-ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG-3’(배열 번호 79)
GPR-M8 : 5’-ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCTGCCGAGAACGAGGCGTTGTC-3’(배열 번호 80)
<비메틸화 올리고뉴클레오티드>
UBC-U8 : 5’-ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA-3 ’(배열 번호 81)
FBN-U8 : 5’-ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG-3’(배열 번호 82)
GPR-U8 : 5’-ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCTGCCGAGAACGAGGCGTTGTC-3’(배열 번호 83)
배열 번호 84, 배열 번호 85, 및 배열 번호 86으로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 UBC, FBN, 및 GPR의 0.5pmol/μL TE 용액을 조제하였다(각각, UBC-FITC 용액, FBN-FITC 용액, 및 GPR-FITC 용액).
<5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드>
UBC : 5’-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3’(배열 번호 84)
FBN : 5’-CTAATAAGCCCTTCGTCGGCT-3’(배열 번호 85)
GPR : 5’-GACAACGCCTCGTTCTCGG-3’(배열 번호 86)
상기의 메틸화 올리고뉴클레오티드 용액, 및 비메틸화 올리고뉴클레오티드 용액의 각각의 용액에 대해, 이하의 처리를 실시하였다(각 1개씩 조제).
UBC 혼합 용액의 조제 : PCR 튜브에, 상기에서 조제한 올리고뉴클레오티드 용액(UBC-M8 또는 UBC-U8 용액) 2μL와, 상기에서 조제한 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액(UBC-FITC 용액) 2μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 2μL와, BSA(Bovine serum albumin 1mg/mL) 2μL를 첨가한 후, 이것에 배열 번호 87로 표시되는 염기 배열로 이루어지 는 올리고뉴클레오티드 CA1을 캐리어 DNA로서 5pmol 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 20μL로 하여, 혼합하였다.
FBN 혼합 용액의 조제 : PCR 튜브에, 상기에서 조제한 올리고뉴클레오티드 용액(FBN-M8 또는 FBN-U8 용액) 2μL와, 상기에서 조제한 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액(FBN-FITC 용액) 2μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 2μL와, BSA(Bovine serum albumin 1mg/mL) 2μL를 첨가한 후, 이것에 배열 번호 87로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 CA1을 캐리어 DNA로서 5pmol 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 20μL로 하여, 혼합하였다.
GPR 혼합 용액의 조제 : PCR 튜브에, 상기에서 조제한 올리고뉴클레오티드 용액(GPR-M8 또는 GPR-U8 용액) 2μL와, 상기에서 조제한 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액(GPR-FITC 용액) 2μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 2μL와, BSA(Bovine serum albumin 1mg/mL) 2μL를 첨가한 후, 이것에 배열 번호 87로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 CA1을 캐리어 DNA로서 5pmol 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 20μL로 하여, 혼합하였다.
<캐리어 DNA>
CA1 : 5’-GATGGCGCTCTG-3’(배열 번호 87)
다음에, 당해 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속하게 냉각 하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 또한, 이것을 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 다음에 37℃로 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌림으로써, 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 결합체의 형성을 촉진하였다.
다른 바닥이 평평한 플레이트의 웰에 비오틴 표식 메틸화 사이토신 항체 용액 20μL를 넣고, 스트렙트아비딘 피복 크로마토스트립의 선단을 각 웰의 바닥까지 끼워넣어, 전개하였다(용액 전부를 스트립에 흡수시켰다).
5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 결합체를 형성시킨 반응 용액 모두를, 각각, 바닥이 평평한 플레이트의 웰로 옮기고, 거기에 상기에서 얻어진 스트렙트아비딘 피복 크로마토스트립의 선단을 각 웰의 바닥까지 끼워넣어, 전개하였다(용액 전부를 스트립에 흡수시켰다).
다른 바닥이 평평한 플레이트의 웰에 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액 20μL를 넣어 두고, 거기에 상기에서 얻어진 스트렙트아비딘 피복 크로마토스트립의 선단을 각 웰의 바닥까지 끼워넣어, 더 전개하였다.
다른 바닥이 평평한 플레이트의 웰에 컨쥬게이트 용액(금 나노입자 표식 FITC 항체 용액) 20μL를 넣어 두고, 거기에 상기에서 얻어진 스트렙트아비딘 피복 크로마토스트립의 선단을 각 웰의 바닥까지 끼워넣어, 더 전개하였다.
전개 종료 후, 스트렙트아비딘 피복 크로마토스트립을 육안으로 보고, 적자색 라인의 유무를 확인하였다.
그 결과를 도 26∼도 28에 나타내었다. 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M8, FBN-M8, 및 GPR-M8의 경우, 스트렙트아비딘 피복 크로마토스트립 상에, 적자색의 라인이 확인되었다. 따라서, 고정화한 메틸화 DNA 항체와, 5’말단 FITC 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드와, 메틸화된 DNA 프래그먼트의 복합체를 형성·분리하는 것이 확인되었다. 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-U8, FBN-M8, 및 GPR-M8, 및 음성 대조군(TE 버퍼 용액)에서는, 복합체를 형성하지 않으므로, 적자색의 라인은 확인할 수 없었다.
이상으로부터, 고정화한 메틸화 사이토신 항체와, 메틸화된 DNA 프래그먼트와, 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·분리하고, 복합체 중의 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드를, 그 식별 기능에 의거하여 검출·정량함으로써, 메틸화된 DNA 프래그먼트의 검출·정량이 가능한 것이, 크로마토스트립 상에서 가능한 것이 확인되었다.
실시예 12
시판되어 있는 다카라바이오사의 Bed-Side ICAN(TM) Legionella Detection Kit의 스트렙트아비딘 피복 크로마토스트립, 컨쥬게이트(금 나노입자 표식 FITC 항체) 용액을 이용하여, 이하의 실험을 실시하였다.
시판의 메틸화 사이토신 항체(Aviva Systems Biology사제)를, 시판 비오틴화 키트(Biotin Labeling Kit-NH2, 도진도 화학 연구소제)를 이용해, 카탈로그에 기재된 방법에 준하여, 비오틴 표식하였다. 얻어진 비오틴 표식 메틸화 사이토신 항체 를 용액[항체 약 0.1μg/10μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]으로서 냉장 보존하였다.
배열 번호 88로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M8, 배열 번호 89로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-M8, 배열 번호 90으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 GPR-M8, 배열 번호 91로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-U8, 배열 번호 92로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-U8, 및 배열 번호 93으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 GPR-U8을 합성하여 각각에 대해 0.2pmol/μL TE 버퍼 용액을 조제하였다. 또, 음성 대조군로서 TE 용액을 이용하였다.
<메틸화 올리고뉴클레오티드> N는 메틸화 사이토신을 나타낸다.
UBC-M8 : 5’-ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA-3’(배열 번호 88)
FBN-M8 : 5’-ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG-3’(배열 번호 89)
GPR-M8 : 5’-ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCTGCCGAGAACGAGGCGTTGTC-3’(배열 번호 90)
<비메틸화 올리고뉴클레오티드>
UBC-U8 : 5’-ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA-3 ’(배열 번호 91)
FBN-U8 : 5’-ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG-3’(배열 번호 92)
GPR-U8 : 5’-ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCTGCCGAGAACGAGGCGTTGTC-3’(배열 번호 93)
배열 번호 94, 배열 번호 95, 및 배열 번호 96으로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 UBC, FBN, 및 GPR의 0.5pmol/μL TE 용액을 조제하였다(UBC-FITC 용액, FBN-FITC 용액, 및 GPR-FITC 용액).
<5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드>
UBC : 5’-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3’(배열 번호 94)
FBN : 5’-CTAATAAGCCCTTCGTCGGCT-3’(배열 번호 95)
GPR : 5’-GACAACGCCTCGTTCTCGG-3’(배열 번호 96)
상기의 메틸화 올리고뉴클레오티드 용액, 및 비메틸화 올리고뉴클레오티드 용액의 각각의 용액에 대해, 이하의 처리를 실시하였다(각 1개씩 조제).
UBC 혼합 용액의 조제 : PCR 튜브에, 상기에서 조제한 올리고뉴클레오티드 용액(UBC-M8 또는 UBC-U8 용액) 2μL와, 상기에서 조제한 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액(UBC-FITC 용액) 2μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 1μL와, BSA(Bovine serum albumin 1mg/mL) 1μL를 첨가한 후, 이것에 배열 번호 97로 표시되는 염기 배열로 이루어지 는 올리고뉴클레오티드 CA1을 캐리어 DNA로서 5pmol 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 10μL로 하여, 혼합하였다.
FBN 혼합 용액의 조제 : PCR 튜브에, 상기에서 조제한 올리고뉴클레오티드 용액(FBN-M8 또는 FBN-U8 용액) 2μL와, 상기에서 조제한 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액(FBN-FITC 용액) 2μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 1μL와, BSA(Bovine serum albumin 1mg/mL) 1μL를 첨가한 후, 이것에 배열 번호 97로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 CA1을 캐리어 DNA로서 5pmol 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 10μL로 하여, 혼합하였다.
GPR 혼합 용액의 조제 : PCR 튜브에, 상기에서 조제한 올리고뉴클레오티드 용액(GPR-M8 또는 GPR-U8 용액) 2μL와, 상기에서 조제한 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액(GPR-FITC 용액) 2μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 1μL와, BSA(Bovine serum albumin 1mg/mL) 1μL를 첨가한 후, 이것에 배열 번호 97로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 CA1을 캐리어 DNA로서 5pmol 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 10μL로 하여, 혼합하였다.
<캐리어 DNA>
CA1 : 5’-GATGGCGCTCTG-3’(배열 번호 97)
다음에, 당해 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속하게 냉각 하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 또한, 이것을 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 다음에 37℃로 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌림으로써, 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 결합체의 형성을 촉진하였다.
얻어진 용액에, 비오틴 표식 메틸화 사이토신 항체 용액 10μL를 첨가한 후, 실온에서 1시간 방치하였다.
얻어진 반응 용액 모두를, 각각, 바닥이 평평한 플레이트의 웰로 옮기고, 스트렙트아비딘 피복 크로마토스트립의 선단을 각 웰의 바닥까지 끼워넣어, 전개하였다(용액 전부를 스트립에 흡수시켰다).
다른 바닥이 평평한 플레이트의 웰에 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액 20μL를 넣어 두고, 거기에 상기에서 얻어진 스트렙트아비딘 피복 크로마토스트립의 선단을 각 웰의 바닥까지 끼워넣어, 더 전개하였다.
다른 바닥이 평평한 플레이트의 웰에 컨쥬게이트 용액(금 나노입자 표식 FITC 항체 용액) 20μL를 넣어 두고, 거기에 상기에서 얻어진 스트렙트아비딘 피복 크로마토스트립의 선단을 각 웰의 바닥까지 끼워넣어, 더 전개하였다.
전개 종료 후, 스트렙트아비딘 피복 크로마토스트립을 육안으로 보고, 적자색 라인의 유무를 확인하였다.
그 결과를 도 29∼도 31에 나타내었다. 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M8, FBN-M8, 및 GPR-M8의 경우, 스트렙트아비딘 피복 크로마토스트립 상에, 적자색의 라인이 확인되었다. 따라서, 고정화한 메틸화 DNA 항체와, 5’말단 FITC 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드와, 메틸화된 DNA 프래그먼트의 복합체를 형성·분리하는 것이 확인되었다. 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-U8, FBN-M8, 및 GPR-M8, 및 음성 대조군(TE 버퍼 용액)에서는, 복합체를 형성하지 않으므로, 적자색의 라인은 확인할 수 없었다.
이상으로부터, 고정화한 메틸화 사이토신 항체와, 메틸화된 DNA 프래그먼트와, 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성·분리하고, 복합체 중의 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드를, 그 식별 기능에 의거하여 검출·정량함으로써, 메틸화된 DNA 프래그먼트의 검출·정량이 가능한 것이, 크로마토스트립 상에서 가능한 것이 확인되었다.
실시예 13
시판의 메틸화 사이토신 항체(Aviva Systems Biology사제)를, 시판 비오틴화 키트(Biotin Labeling Kit-NH2, 도진도 화학 연구소제)를 이용해, 카탈로그에 기재된 방법에 준하여, 비오틴 표식하였다. 얻어진 비오틴 표식 메틸화 사이토신 항체를 용액[항체 약 0.1μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]으로서 냉장 보존하였다.
합성하여 얻어진 비오틴 표식 메틸화 사이토신 항체 용액을, 스트렙트아비딘 피복이 끝난 96 웰 플레이트에 100μL/웰을 첨가한 후, 약 1시간 실온에서 방치함으로써 웰에 고정화하였다. 방치 후, 당해 각 웰로부터 용액을 디켄테이션에 의해 제거하고, 다음에 각 웰에 300μL의 멸균 초순수로 25배 희석된 DELFIA Wash Concentrate(Perkin Elmer사제, Tris-HCl pH 7.8 with Tween 80)를 첨가한 후, 당해 각 웰로부터 당해 버퍼를 디켄테이션에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
배열 번호 98로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-M8, 및 배열 번호 99로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-U8을 합성하여, 각각에 대해 이하의 TE 버퍼 용액을 조제하였다.
용액 A : 0.1pmol/10μL TE 버퍼 용액
용액 B : 0.01pmol/10μL TE 버퍼 용액
용액 C : 0.001pmol/10μL TE 버퍼 용액
용액 D : 0pmol/10μL TE 버퍼 용액(음성 대조군액)
<메틸화 올리고뉴클레오티드> N은 메틸화 사이토신을 나타낸다.
FBN-M8 : 5’-ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG-3’(배열 번호 98)
<비메틸화 올리고뉴클레오티드>
FBN-U8 : 5’-ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG-3’(배열 번호 99)
배열 번호 100으로 표시되는 염기 배열을 갖는 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 FBN의 1pmol/50μL TE 버퍼 용액을 조제하였다(UBC-FITC 용액).
<5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드>
FBN : 5’-CTAATAAGCCCTTCGTCGGCT-3’(배열 번호 100)
또, 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 결합체의 형성을 촉진하는 용액으로서, 이하의 완충 용액을 준비하였다.
완충액 1 : 100mM Tris-HCl pH 7.5, 100mM MgCl2, 10mM Dithiothreitol
완충액 2 : 1mM KH2PO4 pH7.4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl
완충액 3 : 10mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA
완충액 4 : 330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol
완충액 5 : 초순수
상기의 메틸화 올리고뉴클레오티드 용액, 및 비메틸화 올리고뉴클레오티드 용액의 각각의 용액에 대해, 이하의 처리를 실시하였다(각 1개씩 조제).
PCR 튜브에, 상기에서 조제한 올리고뉴클레오티드 용액(FBN-M8 또는 FBN-U8 용액) 10μL와, 상기에서 조제한 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액(FBN-FITC 용액) 50μL와, 완충 용액 1∼5 중 어느 1종의 완충액을 5μL와, BSA(Bovine serum albumin 1mg/mL) 5μL를 첨가한 후, 이것에 배열 번호 101로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 CA1을 캐리어 DNA로서 5pmol 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 50μL로 하여, 혼합하였다.
<캐리어 DNA>
CA1 : 5’-GATGGCGCTCTG-3’(배열 번호 101)
다음에, 당해 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속하게 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 또한, 이것을 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 다음에 37℃로 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌림으로써, 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 결합체의 형성을 촉진하였다.
5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 결합체가 들어간 PCR 튜브의 용액 전량을, 먼저 조제해 둔 비오틴 표식 메틸화 사이토신 항체가 고정화된 플레이트로 옮기고, 실온에서 약 2시간 방치하였다. 방치 후, 상기 플레이트 내의 용액을 디켄테이션에 의해 제거하고, 다음에 상기 플레이트 내의 각 웰에 300μL의 멸균 초순수로 25배 희석된 DELFIA Wash Concentrate(Perkin Elmer사제, Tris-HCl pH 7.8 with Tween 80)를 첨가한 후, 당해 각 웰로부터 당해 버퍼를 디켄테이션에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
그 후, HRP 표식 FITC 항체 용액[Jackson ImmunoResearch Laboratories사제, 0.01μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액] 100μL를 상기의 각 웰에 첨가한 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 각 웰에 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 당해 각 웰로부터 당해 버퍼를 디켄테이션에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
다음에, 기질(R&D사제, #DY999) 100μL를, 각 웰에 첨가·혼합함으로써, 반응을 개시하였다.
다음에, 약 10분간 실온에서 방치한 후, 당해 각 웰에 스톱 용액(1N H2SO4 수용액) 50μL를 각 웰에 첨가하여 혼합함으로써, 반응을 정지하였다. 반응 정지 후 30분 이내에 얻어진 시료의 450nm의 흡광도를 측정하였다.
그 결과를 도 32∼도 36에 나타내었다. 마그네슘 이온을 함유하는 완충액 중(완충액 1 및 완충액 4, 도 32 및 도 35)에 있어서, 메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-M이, 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 FBN과의 결합체를 형성하기 쉽고, 이들 완충액을 이용한 검체에서는, 고정화한 메틸화 DNA 항체와, 5’말단 FITC 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드와, 메틸화된 DNA 프래그먼트의 복합체를 형성·분리하고, 감도 좋게 검출·정량되는 것이 확인되었다.
이상으로부터, 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA와, 본 올리고뉴클레오티드의 결합체를 형성시킬 때에는, 마그네슘 이온을 함유하는 반응계를 이용하는 것이 바람직한 것이 확인되었다.
실시예 14
배열 번호 102로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M8, 및 배열 번호 103으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-U8을 합성하여, 각각에 대해, 0.01pmol/10μL TE 버퍼 용액을 조제하였다.
<메틸화 올리고뉴클레오티드> N은 메틸화 사이토신을 나타낸다.
UBC-M8 : 5’-ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA-3 ’(배열 번호 102)
<비메틸화 올리고뉴클레오티드>
UBC-U8 : 5’-ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA-3’(배열 번호 103)
또, 배열 번호 104로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 B1을 합성하여, 0.02μM TE 버퍼 용액을 조제하였다.
<5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드>
B1 : 5’-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3’(배열 번호 104)
또, 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 결합체의 형성을 촉진하는 용액 조제용으로서, 이하의 금속염 수용액을 준비하였다.
금속염 용액 Mg : 100mM MgC12 수용액
금속염 용액 Ba : 100mM BaCl2 수용액
금속염 용액 H2O : 초순수
상기의 메틸화 올리고뉴클레오티드, 또는 비메틸화 올리고뉴클레오티드의 각각의 용액에 대해, 이하의 처리를 실시하였다(각 1개씩 조제).
PCR 튜브에, 상기에서 조제한 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 상기의 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 용액 5μL와, 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 10μL와, 금속염 용액(금속염 용액 Mg, 금속염 용 액 Ba 또는 금속염 용액 H2O) 60μL를 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 100μL로 하여, 혼합하였다. 다음에, 당해 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속하게 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 또한, 이것을 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 다음에 37℃로 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌림으로써, 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 결합체의 형성을 촉진하였다.
얻어진 혼합물 모두를 스트렙트아비딘 피복이 끝난 96 웰 플레이트로 옮기고, 약 30분간 실온에서 방치함으로써, 당해 플레이트에 상기 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 결합체를 고정화하였다. 방치 후, 상기 플레이트 내의 용액을 디켄테이션으로 제거하고, 다음에 상기 플레이트 내의 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
상기의 각 웰에 메틸화 사이토신 항체[Aviva Systems Biology사제, 1μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액] 100μL를 첨가한 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 그 후, 당해 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
다음에, Eu-N1 표식 마우스 IgG 항체[Perkin Elmer사제, 0.25μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액] 100μL를 상기의 각 웰에 첨가한 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 당해 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
Enhancement Solution(Perkin Elmer사제) 200μL를 상기의 각 웰에 첨가·혼합함으로써, 반응을 개시하였다. 그 후, 약 3분간 실온에서 방치한 후, 얻어진 시료의 형광을 여기 340nm/형광 612nm로 측정하였다.
그 결과를 도 37에 나타내었다. 2가 양이온을 함유하는 금속염 용액 중(금속염 용액 Mg 및 금속염 용액 Ba)에 있어서, 메틸화 올리고뉴클레오티드 UBC-M이, 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 UBC와의 결합체를 형성하기 쉽고, 이들 금속염 용액을 이용한 검체에서는, 고정화한 메틸화 DNA 항체와, 5’말단 FITC 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드와, 메틸화된 DNA 프래그먼트의 복합체를 형성·분리하고, 감도 좋게 검출·정량되는 것이 확인되었다.
이상으로부터, 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA와, 본 올리고뉴클레오티드의 결합체를 형성시킬 때에는, 2가 양이온을 함유하는 반응계를 이용하는 것이 바람직한 것이 확인되었다.
실시예 15
배열 번호 105로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-M8, 및 배열 번호 106으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리 고뉴클레오티드 FBN-U8을 합성하여, 각각에 대해, 0.01pmol/10μL TE 버퍼 용액을 조제하였다.
<메틸화 올리고뉴클레오티드> N은 메틸화 사이토신을 나타낸다.
FBN-M8 : 5’-ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG-3’(배열 번호 105)
<비메틸화 올리고뉴클레오티드>
FBN-U8 : 5’-ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG-3’(배열 번호 106)
또, 배열 번호 107로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 FBN을 합성하여, 0.02μM TE 버퍼 용액을 조제하였다(FBN-B 용액).
<5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드>
FBN : 5’-CTAATAAGCCCTTCGTCGGCT-3’(배열 번호 107)
또, 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 결합체의 형성을 촉진하는 용액 조제용으로서, 이하의 0, 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100mM MgC12 수용액을 준비하였다.
상기의 메틸화 올리고뉴클레오티드, 또는 비메틸화 올리고뉴클레오티드의 각각의 용액에 대해, 이하의 처리를 실시하였다(각 1개씩 조제).
PCR 튜브에, 상기에서 조제한 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 상기의 5’ 말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 용액 5μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 10μL와, MgCl2 수용액(0∼1000mM) 60μL를 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 100μL로 하여, 혼합하였다.
다음에, 당해 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속하게 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 또한, 이것을 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 다음에 37℃로 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌림으로써, 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 결합체의 형성을 촉진하였다.
얻어진 혼합물 모두를 스트렙트아비딘 피복이 끝난 96 웰 플레이트로 옮기고, 약 30분간 실온에서 방치함으로써, 당해 플레이트에 상기 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 결합체를 고정화하였다. 방치 후, 상기 플레이트 내의 용액을 디켄테이션으로 제거하고, 다음에 상기 플레이트 내의 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
상기의 각 웰에 메틸화 사이토신 항체[Aviva Systems Biology사제, 1μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액] 100μL를 첨가한 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 그 후, 당해 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
다음에, Eu-N1 표식 마우스 IgG 항체[Perkin Elmer사제, 0.25μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액] 100μL를 상기의 각 웰에 첨가한 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 당해 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
Enhancement Solution(Perkin Elmer사제) 200μL를 상기의 각 웰에 첨가·혼합함으로써, 반응을 개시하였다. 그 후, 약 3분간 실온에서 방치한 후, 얻어진 시료의 형광을 여기 340nm/형광 612nm로 측정하였다.
그 결과를 도 38에 나타내었다. 마그네슘 이온을 최종 농도 10mM∼70mM 함유하는 완충액에 있어서, 메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-M이, 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 FBN과의 결합체를 형성하기 쉽고, 이들 완충액을 이용한 검체에서는, 고정화한 메틸화 DNA 항체와, 5’말단 FITC 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드와, 메틸화된 DNA 프래그먼트의 복합체를 형성·분리하고, 감도 좋게 검출·정량되는 것이 확인되었다. 특히, 마그네슘 이온의 최종 농도가 58mM 이상에서, 보다 메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-M이, 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 FBN과의 결합체를 형성하기 쉬운 것으로 생각되었다.
이상으로부터, 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA와, 본 올리고뉴클레오티드의 결합체를 형성시킬 때에는, 마그네슘 이온을 함유하는 반응계를 이용하는 것이 바람직한 것이 확인되었다.
실시예 16
배열 번호 108로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-M8, 및 배열 번호 109로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 비메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-U8을 합성하여, 각각에 대해, 0.01pmol/10μL TE 버퍼 용액을 조제하였다.
<메틸화 올리고뉴클레오티드> N은 메틸화 사이토신을 나타낸다.
FBN-M8 : 5’-ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG-3’(배열 번호 108)
<비메틸화 올리고뉴클레오티드>
FBN-U8 : 5’-ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG-3’(배열 번호 109)
또, 배열 번호 110으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 FBN을 합성하여, 0.02μM TE 버퍼 용액을 조제하였다(FBN-B 용액).
<5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드>
FBN : 5’-CTAATAAGCCCTTCGTCGGCT-3’(배열 번호 110)
또, 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 결합체의 형성을 촉진하는 용액 조제용으로서, 이하의 0, 100, 200, 300, 400, 600, 800, 1000mM MgCl2 수용액을 준비하였다.
상기의 메틸화 올리고뉴클레오티드, 또는 비메틸화 올리고뉴클레오티드의 각각의 용액에 대해, 이하의 처리를 실시하였다(각 1개씩 조제).
PCR 튜브에, 상기에서 조제한 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 상기의 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 용액 5μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 10μL와, MgCl2 수용액(0∼1000mM) 60μL를 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 100μL로 하여, 혼합하였다.
다음에, 당해 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속하게 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 또한, 이것을 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 다음에 37℃로 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌림으로써, 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 결합체의 형성을 촉진하였다.
얻어진 혼합물 모두를 스트렙트아비딘 피복이 끝난 96 웰 플레이트로 옮기고, 약 30분간 실온에서 방치함으로써, 당해 플레이트에 상기 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드의 결합체를 고정화하였다. 방치 후, 상기 플레이트 내의 용액을 디켄테이션으로 제거하고, 다음에 상기 플레이트 내의 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
상기의 각 웰에 메틸화 사이토신 항체[Aviva Systems Biology사제, 1μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액] 100μL를 첨가한 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 그 후, 당해 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
다음에, Eu-N1 표식 마우스 IgG 항체[Perkin Elmer사제, 0.25μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액] 100μL를 상기의 각 웰에 첨가한 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 당해 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
Enhancement Solution(Perkin Elmer사제) 200μL를 상기의 각 웰에 첨가·혼합함으로써, 반응을 개시하였다. 그 후, 약 3분간 실온에서 방치한 후, 얻어진 시료의 형광을 여기 340nm/형광 612nm로 측정하였다.
그 결과를 도 39에 나타내었다. 마그네슘 이온을 최종 농도 10mM∼610mM 함유하는 완충액에 있어서, 메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-M이, 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 FBN과의 결합체를 형성하기 쉽고, 이들 완충액을 이용한 검체에서는, 고정화한 메틸화 DNA 항체와, 5’말단 FITC 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드와, 메틸화된 DNA 프래그먼트의 복합체를 형성·분리하고, 감도 좋게 검출·정량되는 것이 확인되었다. 마그네슘 이온의 최종 농도가 70mM∼610mM에서, 보다 메틸화 올리고뉴클레오티드 FBN-M이, 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 FBN과의 결합체를 형성하기 쉬운 것으로 생각되었다.
실시예 17
클론테크사로부터 구입된 사람 혈액 유래 게놈 DNA에 대해, 이하의 배열 번호 111 및 배열 번호 112로 표시되는 PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머(PF1 및 PR1) 및 반응 조건을 이용하여 PCR을 행함으로써, 공시 샘플로서 이용되는 DNA 프래그먼트(X, 배열 번호 113, Genbank Accession No. NT_029419 등으로 표시되는 염기 번호 25687390-25687775에 상당하는 영역)를 증폭하였다.
<PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머>
PF1 : 5’-CTCAGCACCCAGGCGGCC-3’(배열 번호 111)
PR1 : 5’-CTGGCCAAACTGGAGATCGC-3’(배열 번호 112)
<DNA 프래그먼트>
X : 5’-
CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG (배열 번호 113)
PCR의 반응액으로서는, 주형으로 하는 게놈 DNA를 5ng과, 5μM로 조제된 올리고뉴클레오티드 프라이머 용액 각 3μl와, each 2mM dNTP를 5μl와, 10×완충 액(100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.01% Gelatin)을 5μl와, 내열성 DNA 폴리머라아제(AmpliTaq Gold, ABI사제) 5U/μl를 0.25μl를 혼합하여, 이것에 멸균 초순수를 더해 액량을 50μl로 한 것을 이용하였다. 당해 반응액을, 95℃로 10분간 보온한 후, 95℃로 30초간 다음에 61℃로 30초간 또한 72℃로 45초간을 1사이클로 하는 보온을 40사이클 행하는 조건으로 PCR을 행하였다.
PCR을 행한 후, 1/5% 아가로스 겔 전기 영동에 의해 증폭을 확인하고, Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해, DNA 프래그먼트 X를 정제하였다.
얻어진 DNA 프래그먼트 용액의 일부에 대해, SssI methylase(NEB사제)를 1μl와, 10×NEBuffer2(NEB사제)를 10μl와, S-adenosyl methionine(3.2mM, NEB사제)을 1μl를 혼합하여, 이것에 멸균 초순수를 더해 액량을 100μl로 한 것을 조제하였다. 당해 반응액을, 37℃로 15-30분간 인큐베이션하고, 또한 S-adenosyl methionine(3.2mM, NEB사제)을 1μl를 추가하여 37℃로 15-30분간 인큐베이션하였다. 이것을 Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해 정제하였다. 이들의 조작을 5회 더 반복하여, 메틸화한 DNA 프래그먼트(MX, 배열 번호 114)를 얻었다.
<DNA 프래그먼트> (N은 5-메틸사이토신을 나타낸다)
MX : 5’-
CTCAGCACCCAGGNGGCNGNGATCATGAGGNGNGAGNGGNGNGNGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGNGGGTGGCACACNGNGATGTAGNGGTNGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCNGANGCAAACATGCNGAACACCTGCAGGTGCTTCACCANGNGGCACAGCCAGTNGGGGCNGNGGAAGNGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGNGGCAGCACCTGG AAGAATGCCANGGCCAGGTNGGCCAGGCTGAGGTGTNGGATGAAGAGGTGCATGNGGGANGTCTTGNGNGGNGTCNGGTGCAGAGCCAGCAGTANGCTGCTGTTGCCCAGCANGGCCACNGNGAAAGTCACNGCCAGCANGGNGATCTCCAGTTTGGCCAG-3’(배열 번호 114)
얻어진 DNA 프래그먼트 X에 대해, 이하의 용액을 각각 2부로 조제하였다.
용액 A : 10ng/10μL TE 용액
용액 B : 1ng/10μL TE 용액
용액 C : TE 용액(음성 대조군액)
얻어진 DNA 프래그먼트 MX에 대해, 이하의 용액을 각각 2련으로 조제하였다.
용액 MA : 10ng/10μL TE 용액
용액 MB : 1ng/10μL TE 용액
용액 MC : TE 용액(음성 대조군액)
또, 배열 번호 115로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 목적으로 하는 DNA 영역 X’에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 116으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 B1을 합성하여, 그 농도가 0.02μM인 TE 버퍼 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역> (5-메틸사이토신도 C로 표시한다)
X’ : 5’-
CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGG AAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG-3’(배열 번호 115)
<5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드>
B1 : 5’Biotin-CTGGCCAAACTGGAGATCGC-3’(배열 번호 116)
또, 배열 번호 115로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 목적으로 하는 DNA 영역 X’의 마이너스 가닥에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 117∼배열 번호 128로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 카운터 올리고뉴클레오티드 C1∼C12를 합성하여, 각각의 농도가 0.01μM인 TE 버퍼 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역> (5-메틸사이토신도 C로 표시한다)
X’ : 5’-
CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG-3’(배열 번호 115)
<카운터 올리고뉴클레오티드>
C1 : 5’-GCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCG-3’(배열 번호 117)
C2 : 5’-GCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACG-3’(배열 번호 118)
C3 : 5’-CGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGA-3’(배열 번호 119)
C4 : 5’-AGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATG-3’(배열 번호 120)
C5 : 5’-ACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCC-3’(배열 번호 121)
C6 : 5’-TAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGC-3’(배열 번호 122)
C7 : 5’-CGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGG-3’(배열 번호 123)
C8 : 5’-ATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACG-3’(배열 번호 124)
C9 : 5’-ATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAAC-3’(배열 번호 125)
C10 : 5’-TGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTC-3’(배열 번호 126)
C11: 5’-CGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGG-3’(배열 번호 127)
C12 : 5’-CAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGG-3’(배열 번호 128)
상기의 DNA 프래그먼트 X의 용액 및 메틸화한 DNA 프래그먼트 MX의 용액의 각각에 대해, 이하의 처리를 실시하였다.
PCR 튜브에, 상기에서 조제한 DNA 프래그먼트 용액 10μL와, 상기에서 조제한 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 상기에서 조제한 카운터 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 10μL와, 100mM의 MgC12 용액 10μL와, 1mg/mL의 BSA 용액 10μL를 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 100μL로 하여, 혼합하였다. 그 후, 본 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속하게 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 다음에, 50℃까지 냉 각하여 10분간 보온하고, 또한 37℃로 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌렸다(이상, 본 발명 측정 방법의 제1 공정에 상당한다).
상기에서 조제한 DNA 프래그먼트의 반응액 100μL를, 스트렙트아비딘 피복이 끝난 8 웰 스트립(Perkin Elmer사제, 합계 12 웰)에 첨가하고, 30분간 실온에서 방치하여 웰에 고정화하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 당해 버퍼를 디켄테이션에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 측정 방법의 제2 공정에 상당한다).
배열 번호 116으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 B1에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 129로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 마스킹 올리고뉴클레오티드 M1을 합성하여, 그 농도가 0.1μM인 TE 버퍼 용액을 조제하였다.
<5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드>
B1 : 5’Biotin-CTGGCCAAACTGGAGATCGC-3’(배열 번호 116)
<마스킹 올리고뉴클레오티드>
M1 : 5’-ATCTCCAGTTTGGCCAG-3’(배열 번호 129)
각 웰에 메틸화 사이토신 항체[Aviva Systems Biology사제, 0.5μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]를 100μL와 상기의 마스킹 올리고뉴클레오티드 용액 1μL를 첨가하고, 1시간 실온에서 방치하였다. 그 후, 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
그 후, Eu-N1 표식 마우스 IgG 항체[Perkin Elmer사제, 0.05μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]를 각 웰에 100μL의 비율로·첨가 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 그 후, 용액을 디켄테이션으로 제거하고, 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
Enhancement Solution(Perkin Elmer사제)을 각 웰에 150μL의 비율로 첨가하고, 5분간 교반 후, 15분간 실온에서 방치하였다. 그 후, 여기 340nm/형광 612nm로 형광을 측정하였다(이상, 본 발명 측정 방법의 제3 공정에 상당한다).
그 결과를 도 40에 나타내었다. 메틸화된 DNA 프래그먼트 MX의 용액 MA 및 MB에서는, 형광 강도의 증가가 확인되고, 그 강도는 농도 의존적이었다. 음성 대조군 용액 MC에서는, 형광 강도의 증가가 확인되지 않았다. 메틸화되어 있지 않은 DNA 프래그먼트 X의 용액 A, B 및 C에서는, 형광 강도의 증가가 확인되지 않았다.
이상으로부터, 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 및 메틸사이토신 항체로, 메틸화된 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 DNA를 선택하여 고정화하는 것이 가능한 것, 또, 메틸화된 DNA를 고감도로 검출·정량할 수 있는 것이 확인되었다.
실시예 18
클론테크사로부터 구입된 사람 혈액 유래 게놈 DNA에 대해, 이하의 배열 번호 130 및 배열 번호 131로 표시되는 PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머(PF2 및 PR2) 및 반응 조건을 이용하여 PCR을 행함으로써, 공시 샘플로서 이용되는 DNA 프래그먼트(Y, 배열 번호 132, Genbank Accession No. ac009800 등으로 표시되는 염기 번호 76606-76726에 상당하는 영역)를 증폭하였다.
<PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머>
PF2 : 5’-TGAGCTCCGTAGGGCGTCC-3’(배열 번호 130)
PR2 : 5’-GCGCCGGGTCCGGGCCC-3’(배열 번호 131)
<DNA 프래그먼트>
Y : 5’-
GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA-3’(배열 번호 132)
PCR의 반응액으로서는, 주형으로 하는 게놈 DNA를 5ng과, 5μM로 조제된 올리고뉴클레오티드 프라이머 용액 각 3μl와, each 2mM dNTP를 5μl와, 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.01% Gelatin)을 5μl와, 내열성 DNA 폴리머라아제(AmpliTaq Gold, ABI사제) 5U/μl를 0.25μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더해 액량을 50μl로 한 것을 이용하였다. 당해 반응액을, 95℃로 10분간 보온한 후, 95℃로 30초간 다음에 60℃로 30초간 또한 72℃로 45초간을 1사이클로 하는 보온을 50사이클 행하는 조건으로 PCR을 행하였다.
PCR을 행한 후, 1.5% 아가로스 겔 전기 영동에 의해 증폭을 확인하고, Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해, DNA 프래그먼트 Y를 정제하였다.
얻어진 DNA 프래그먼트 용액의 일부에 대해, SssI methylase(NEB사제)를 1μl와, 10×NEBuffer2(NEB사제)를 10μl와, S-adenosyl methionine(3.2mM, NEB사제)을 1μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더해 액량을 100μl로 한 것을 조제하였다. 당해 반응액을, 37℃로 15-30분간 인큐베이션하고, 또한 S-adenosyl methionine(3.2mM, NEB사제)을 1μl를 추가하여 37℃로 15-30분간 인큐베이션하였다. 이것을 Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해 정제하였다. 이 조작을 5회 더 반복하여, 메틸화 DNA 프래그먼트(MY, 배열 번호 133)를 얻었다.
<메틸화 DNA 프래그먼트> (N은 5-메틸사이토신을 나타낸다)
MY : 5’-
GNGCNGGGTCNGGGCCNGATGNGTTGGNGGGCCAGGGCTCNGAGAANGAGGNGTTGTCCATCTCAANGAGGGCAGAGGAGCNGGNGACCTGGNGTCCCCCAAGGANGCCCTANGGAGCTCA-3’(배열 번호 133)
얻어진 DNA 프래그먼트 Y에 대해, 이하의 용액을 각각 2련으로 조제하였다.
용액 A : 10ng/10μL TE 용액
용액 B : TE 용액(음성 대조군액)
얻어진 DNA 프래그먼트 MY에 대해, 이하의 용액을 각각 2련으로 조제하였다.
용액 MA : 10ng/10μL TE 용액
용액 MB : TE 용액(음성 대조군액)
또, 배열 번호 134로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 목적으로 하는 DNA 영역 Y’에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 135로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 B2를 합성하여, 그 농도가 0.02μM인 TE 버퍼 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역> (5-메틸사이토신도 C로 표시한다)
Y’ : 5’-
GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA-3’(배열 번호 134)
<5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드>
B2 : 5’Biotin-GACAACGCCTCGTTCTCGG-3’(배열 번호 135)
또, 배열 번호 134로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 목적으로 하는 DNA 영역 Y’의 마이너스 가닥에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 136, 염기 배열 27 및 배열 번호 138로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 카운터 올리고뉴클레오티드 C13, C14, 및 C15를 합성하여, 각각의 농도가 0.01μM인 TE 버퍼 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역> (5-메틸사이토신도 C로 표시한다)
Y’ : 5’-
GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA-3’(배열 번호 134)
<카운터 올리고뉴클레오티드>
C13 : 5’-GCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA-3’(배열 번호 136)
C14 : 5’-CTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTG-3’(배열 번호 137)
C15 : 5’-CGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGG-3’(배열 번호 138)
상기의 DNA 프래그먼트 Y의 용액 및 메틸화한 DNA 프래그먼트 MY의 용액의 각각에 대해, 이하의 처리를 실시하였다.
PCR 튜브에, 상기에서 조제한 DNA 프래그먼트 용액 10μL와, 상기에서 조제한 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 상기에서 조제한 카운터 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 10μL와, 100mM의 MgCl2 용액 10μL와, 1mg/mL의 BSA 용액 10μL를 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 100μL로 하여, 혼합하였다. 그 후, 본 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속하게 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 다음에, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 또한 37℃로 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌렸다(이상, 본 발명 측정 방법의 제1 공정에 상당한다).
상기에서 조제한 DNA 프래그먼트의 반응액 100μL를, 스트렙트아비딘 피복이 끝난 8 웰 스트립(Perkin Elmer사제, 합계 8 웰)에 첨가하고, 30분간 실온에서 방치하여 웰에 고정화하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 당해 버퍼를 디켄테이션에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 측정 방법의 제2 공정에 상당한다).
배열 번호 135로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 B2에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 139로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 마스킹 올리고뉴클레오티드 M2를 합성하여, 그 농도가 0.1μM인 TE 버퍼 용액을 조제하였다.
<5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드>
B2 : 5’Biotin-GACAACGCCTCGTTCTCGG-3’(배열 번호 135)
<마스킹 올리고뉴클레오티드>
M2 : 5’-CCGAGAACGAGGCGTTGTCT-3’(배열 번호 139)
각 웰에 메틸화 사이토신 항체[Aviva Systems Biology사제, 0.5μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]를 100μL와 상기의 마스킹 올리고뉴클레오티드 용액 1μL를 첨가하고, 1시간 실온에서 방치하였다. 그 후, 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
그 후, Eu-N1 표식 마우스 IgG 항체[Perkin Elmer사제, 0.05μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]를 각 웰에 100μL의 비율로 첨가 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 그 후, 용액을 디켄테이션으로 제거하고, 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
Enhancement Solution(Perkin Elmer사제)을 각 웰에 150μL의 비율로 첨가하고, 5분간 교반 후, 15분간 실온에서 방치하였다. 그 후, 여기 340nm/형광 612nm로 형광을 측정하였다(이상, 본 발명 측정 방법의 제3 공정에 상당한다).
그 결과를 도 41에 나타내었다. 메틸화된 DNA 프래그먼트 MY의 용액 MA에서는, 형광 강도의 증가가 확인되었다. 음성 대조군 용액 MB에서는, 형광 강도의 증가가 확인되지 않았다. 메틸화되어 있지 않은 DNA 프래그먼트 Y의 용액 A 및 B에서는, 형광 강도의 증가가 확인되지 않았다.
이상으로부터, 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 및 메틸사이토신 항체로, 메틸화된 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 DNA를 선택하여 고정화하는 것이 가능한 것, 또, 메틸화된 DNA를 고감도로 검출할 수 있는 것이 확인되었다.
실시예 19
빵 효모 효모주 X2180-1A를 YPD 배지(1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6.0)에서, 탁도가 OD600 0.6-1.0이 될 때까지 배양하고, 10,000g으로 10분간 원심하여, 1×107의 효모 세포를 조제하였다. 조제한 효모 세포로부터, Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)에 기재되어 있는, 일반적인 효모 게놈의 조제법을 이용하여 효모 게놈을 취득하였다.
조제한 효모 세포를, 버퍼 A(1M 소르비톨, 0.1M EDTA, pH 7.4)에 현탁하고, 2-메르캅토 에탄올(최종 농도 14mM) 및 100U zymolase(10mg/ml)를 첨가하여, 용액이 투명해질 때까지 30℃로 1시간, 교반하면서 인큐베이트하였다. 550g으로 10분 간 원심하여 프로토플래스트를 회수 후, 버퍼 B(50mM Tris-HCl, pH 7.4, 20mM EDTA)에 현탁한 다음, 도데실 황산나트륨을 1%(w/v)가 되도록 더한 후, 65℃로 30분간 인큐베이트하였다. 이어서, 체적비 2/5량의 5M CH3COOK를 첨가하여 혼합한 다음 30분간 빙랭 후, 15,000g으로 30분간 원심하여 상청액을 회수하였다. 회수한 상청액에 체적비 1/10량의 3M CH3COONa와 등량의 이소프로판올을 더해 잘 섞고, 15,000g 4℃로 30분간 원심하여 얻어진 침전을 70% 에탄올로 린스하여 회수하였다. 침전을 건조시킨 후, 1ml의 TE 버퍼(10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)에 용해하고, 40μg/ml가 되도록 RNa se A(Sigma사제)를 더해 37℃로 1시간 인큐베이트하고, 이어서, 혼합액에 proteinase K(Sigma사제)를 500μg/ml 및 도데실 황산나트륨을 1%(w/v)가 되도록 더한 후, 이것을 55℃로 약 16시간 진탕하였다. 진탕이 끝난 후, 당해 혼합물을 페놀[1M Tris-HCl(pH 8.0)로 포화]·클로로포름 추출 처리하였다. 수층(水層)을 회수하고, 이것에 NaCl을 0.5N이 되도록 더한 후, 이것을 에탄올 침전 처리하여 생긴 침전을 회수하였다. 회수된 침전을 70% 에탄올로 린스함으로써, 게놈 DNA를 얻었다.
얻어진 게놈 DNA로부터, 이하의 배열 번호 140 및 배열 번호 141로 표시되는 프라이머(PF3 및 PR3) 및 반응 조건을 이용하여 PCR을 행함으로써, 공시 샘플로서 이용되는 DNA 프래그먼트(S, 배열 번호 142, Genbank Accession No. NC_001139 등으로 표시되는 효모 염색체 VII의 염기 번호 271743-272083에 상당하는 영역)를 증폭하였다.
PF3 : 5’-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3’(배열 번호 140)
PR3 : 5’-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3’(배열 번호 141)
<DNA 프래그먼트>
S : 5’-
AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3’(배열 번호 142)
PCR의 반응액으로서는, 주형으로 하는 게놈 DNA를 10ng과, 5μM의 상기 프라이머 용액 각 3μl와, each 2mM dNTP를 5μl와, 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.01% Gelatin)을 5μl와, 내열성 DNA 폴리머라아제(AmpliTaq Gold) 5U/μl를 0.25μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더해 액량을 50μl로 한 것을 이용하였다. 당해 반응액을, 95℃로 10분간 보온한 후, 95℃로 20초간 다음에 58℃로 30초간 또한 72℃로 30초간을 1사이클로 하는 보온을 40사이클 행하는 조건으로 PCR을 행하였다.
PCR을 행한 후, 2% 아가로스 겔 전기 영동에 의해 증폭을 확인하고, Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해, DNA 프래그먼트 S를 정제하였다.
얻어진 DNA 프래그먼트 용액의 일부에 대해, SssI methylase(NEB사제)를 1μ l와, 10×NEBuffer2(NEB사제)를 10μl와, S-adenosyl methionine(3.2mM, NEB사제)을 1μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더해 액량을 100μl로 한 것을 조제하였다. 당해 반응액을, 37℃로 15-30분간 인큐베이션하고, 또한 S-adenosyl methionine(3.2mM, NEB사제)을 1μl를 추가하여 37℃로 15-30분간 인큐베이션하였다. 이것을 Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해 정제하였다. 이 조작을 5회 더 반복하여, 메틸화 DNA 프래그먼트(MS, 배열 번호 143)를 얻었다.
<메틸화 DNA 프래그먼트> (N은 5-메틸사이토신을 나타낸다)
MS : 5’-
AGGTGAGCTANGTGTGTTTGGGNGTNGTGCACTGGCTCACTTGTANGNGCAGAAATGGCAGCTTGTANGATTGGTGACCNGCCTTTTNGACACTGGACNGCTATGGANGTGGNGGNGGTGTGGNGGNGGCTCAATGACCTGTGGNGCCNGTTTGTGGNGTGNGATAGTNGAGCNGCCTGTCANGTGNGNGGCNGCCCTGCTCNGTTTGANGNGATGCATAGCATGNGACCACCCAGTAATCATACTGCTGANGCTATTGGTCANGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGNGGTGGNGTCCNGTTTCCACACNGTAOGTGAGCACATGTCT-3’(배열 번호 143)
얻어진 DNA 프래그먼트 S에 대해, 이하의 용액을 각각 2련으로 조제하였다.
용액 A : 10ng/10μL TE 용액
용액 B : 1ng/10μL TE 용액
용액 C : 0.1ng/10μL TE 용액
용액 D : TE 용액(음성 대조군액)
얻어진 DNA 프래그먼트 MS에 대해, 이하의 용액을 각각 2련으로 조제하였다.
용액 MA : 10ng/10μL TE 용액
용액 MB : 1ng/10μL TE 용액
용액 MC : 0.1ng/10μL TE 용액
용액 MD : TE 용액(음성 대조군액)
또, 배열 번호 144로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 목적으로 하는 DNA 영역 S’에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 145로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 B3을 합성하여, 그 농도가 0.02μM인 TE 버퍼 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역> (5-메틸사이토신도 C로 표시한다)
S’ : 5’-
AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3’(배열 번호 144)
<5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드>
B3 : 5’Biotin-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3’(배열 번호 145)
또, 배열 번호 144로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 목적으로 하는 DNA 영역 S’의 마이너스 가닥에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 146∼배열 번호 155로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 카운터 올리고뉴클레오티드 C16∼C25를 합성하여, 각각의 농도가 0.01μM인 TE 버퍼 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역> (5-메틸사이토신도 C로 표시한다)
S’ : 5’-
AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3’(배열 번호 144)
<카운터 올리고뉴클레오티드>
C16 : 5’-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3’(배열 번호 146)
C17 : 5’-GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA-3’(배열 번호 147)
C18 : 5’-CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC-3’(배열 번호 148)
C19 : 5’-ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT-3’(배열 번호 149)
C20 : 5’-GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT-3’(배열 번호 150)
C21 : 5’-TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC-3’(배열 번호 151)
C22 : 5’-ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT-3’(배열 번호 152)
C23 : 5’-TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG-3’(배열 번호 153)
C24 : 5’-ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG-3’(배열 번호 154)
C25 : 5’-CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC-3’(배열 번호 155)
상기의 DNA 프래그먼트 S의 용액 및 메틸화한 DNA 프래그먼트 MS의 용액의 각각에 대해, 이하의 처리를 실시하였다.
PCR 튜브에, 상기에서 조제한 DNA 프래그먼트 용액 10μL와, 상기에서 조제한 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 상기에서 조제한 카운터 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 10μL와, 100mM의 MgCl2 용액 10μL와, 1mg/mL의 BSA 용액 10μL를 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 100μL로 하여, 혼합하였다. 그 후, 본 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속하게 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 다음에, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 또한 37℃로 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌렸다(이상, 본 발명 측정 방법의 제1 공정에 상당한다).
배열 번호 145로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 B3에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 156으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 마스킹 올리고뉴클레오티드 M3을 합성하여, 그 농도가 0.02μM인 TE 버퍼 용액을 조제하였다.
상기에서 조제한 DNA 프래그먼트의 반응액 100μL를, 스트렙트아비딘 피복이 끝난 8 웰 스트립(Perkin Elmer사제)에 첨가하고, 30분간 실온에서 방치하여 웰에 고정화하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 당해 버퍼를 디켄테이션에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 측정 방법의 제2 공정에 상당한다).
<5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드>
B3 : 5’Biotin-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3’(배열 번호 145)
<마스킹 올리고뉴클레오티드>
M3 : 5’-ACCGTACGTGAGCACATGTCT-3’(배열 번호 156)
각 웰에 메틸화 사이토신 항체[Aviva Systems Biology사제, 0.5μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]를 100μL와 상기의 마스킹 올리고뉴클레오티드 용액 1μL를 첨가하고, 1시간 실온에서 방치하였다. 그 후, 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
그 후, Eu-N1 표식 마우스 IgG 항체[Perkin Elmer사제, 0.05μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]를 각 웰에 100μL의 비율로 첨가 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 그 후, 용액을 디켄테이션으로 제거하고, 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
Enhancement Solution(Perkin Elmer사제)을 각 웰에 150μL의 비율로 첨가하고, 혼합하여, 약 45분간 실온에서 방치하였다. 그 후, 여기 340nm/형광 612nm로 형광을 측정하였다(이상, 본 발명 측정 방법의 제3 공정에 상당한다).
그 결과를 도 42에 나타내었다. 메틸화된 DNA 프래그먼트 MS의 용액 MA, MB 및 MC에서는, 형광 강도의 증가가 확인되고, 그 강도는 농도 의존적이었다. 음성 대조군 용액 MD에서는, 형광 강도의 증가가 확인되지 않았다. 메틸화되어 있지 않은 DNA 프래그먼트 S의 용액 A, B, C 및 D에서는, 형광 강도의 증가가 확인되지 않았다.
이상으로부터, 비오틴화 올리고뉴클레오티드 및 메틸사이토신 항체로, 메틸화된 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 DNA를 선택하여 고정화하는 것이 가능한 것, 또, 메틸화된 DNA를 고감도로 검출·정량할 수 있는 것이 확인되었다.
실시예 20
빵 효모 효모주 X2180-1A를 YPD 배지(1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6.0)에서, 탁도가 OD600 0.6-1.0이 될 때까지 배양하고, 10,000g으로 10분간 원심하여, 1×107의 효모 세포를 조제하였다. 조제한 효모 세포로부터, Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)에 기재되어 있는, 일반적인 효모 게놈의 조제법을 이용하여 효모 게놈을 취득하였다.
조제한 효모 세포를, 버퍼 A(1M 소르비톨, 0.1M EDTA, pH 7.4)에 현탁하고, 2-메르캅토 에탄올(최종 농도 14mM) 및 100U zymolase(10mg/ml)를 첨가하여, 용액이 투명해질 때까지 30℃로 1시간, 교반하면서 인큐베이트하였다. 550g으로 10분간 원심하여 프로토플래스트를 회수 후, 버퍼 B(50mM Tris-HCl, pH 7.4, 20mM EDTA)에 현탁한 다음, 도데실 황산나트륨을 1%(w/v)가 되도록 더한 후, 65℃로 30분간 인큐베이트하였다. 이어서, 체적비 2/5량의 5M CH3COOK를 첨가하여 혼합한 다 음 30분간 빙랭 후, 15,000g으로 30분간 원심하여 상청액을 회수하였다. 회수한 상청액에 체적비 1/10량의 3M CH3COONa와 등량의 이소프로판올을 더해 잘 섞고, 15,000g 4℃로 30분간 원심하여 얻어진 침전을 70% 에탄올로 린스하여 회수하였다. 침전을 건조시킨 후, 1ml의 TE 버퍼(10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)에 용해하고, 40μg/ml가 되도록 RNa se A(Sigma사제)를 더해 37℃로 1시간 인큐베이트하고, 이어서, 혼합액에 proteinase K(Sigma사제)를 500μg/ml 및 도데실 황산나트륨을 1%(w/v)가 되도록 더한 후, 이것을 55℃로 약 16시간 진탕하였다. 진탕이 끝난 후, 당해 혼합물을 페놀[1M Tris-HCl(pH 8.0)로 포화]·클로로포름 추출 처리하였다. 수층을 회수하고, 이것에 NaCl을 0.5N이 되도록 더한 후, 이것을 에탄올 침전 처리하여 생긴 침전을 회수하였다. 회수된 침전을 70% 에탄올로 린스함으로써, 게놈 DNA를 얻었다.
얻어진 게놈 DNA로부터, 이하의 배열 번호 157 및 배열 번호 158로 표시되는 PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머(PF4 및 PR4) 및 반응 조건을 이용하여 PCR을 행함으로써, 공시 샘플로서 이용되는 DNA 프래그먼트(T, 배열 번호 159, Genbank Accession No. NC_001139 등으로 표시되는 효모 염색체 VII의 염기 번호 384569-384685에 상당하는 영역)를 증폭하였다.
<PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머>
PF4 : 5’-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3’(배열 번호 157)
PR4 : 5’-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3’(배열 번호 158)
<DNA 프래그먼트>
T : 5’-
GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3’(배열 번호 159)
PCR의 반응액으로서는, 주형으로 하는 게놈 DNA를 10ng과, 5μM로 조제된 올리고뉴클레오티드 프라이머 용액 각 3μl와, each 2mM dNTP를 5μl와, 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.01% Gelatin)을 5μl와, 내열성 DNA 폴리머라아제(AmpliTaq Gold, ABI사제) 5U/μl를 0.25μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더해 액량을 50μl로 한 것을 이용하였다. 당해 반응액을, 95℃로 10분간 보온한 후, 95℃로 20초간 다음에 58℃로 30초간 또한 72℃로 30초간을 1사이클로 하는 보온을 40사이클 행하는 조건으로 PCR을 행하였다.
PCR을 행한 후, 1.5% 아가로스 겔 전기 영동에 의해 증폭을 확인하고, Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해, DNA 프래그먼트 T를 정제하였다.
얻어진 DNA 프래그먼트 용액의 일부에 대해, SssI methylase(NEB사제)를 1μl와, 10×NEBuffer2(NEB사제)를 10μl와, S-adenosyl methionine(3.2mM, NEB사제)을 1μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더해 액량을 100μl로 한 것을 조제하였다. 당해 반응액을, 37℃로 15-30분간 인큐베이션하고, 또한 S-adenosyl methionine(3.2mM, NEB사제)을 1μl를 추가하여 37℃로 15-30분간 인큐베이션하였다. 이것을 Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해 정제하였다. 이 조작을 5 회 더 반복하여, 메틸화 DNA 프래그먼트(MT, 배열 번호 160)를 얻었다.
<메틸화 DNA 프래그먼트> (N은 5-메틸사이토신을 나타낸다)
MT : 5’-
GGACCTGTGTTTGANGGGTATAACACTAAGTTGNGCAATTTGCTGTATTGNGAAATCNGCCNGGANGATATCACTCTTGAGNGCATGTGCNGTTTCNGAGAANGCCAGATCTGTACT-3’(배열 번호 160)
얻어진 DNA 프래그먼트 T에 대해, 이하의 용액을 조제하였다.
용액 A : 10ng/10μL TE 용액
용액 B : 1ng/10μL TE 용액
용액 C : 0.1ng/10μL TE 용액
용액 D : TE 용액(음성 대조군액)
얻어진 DNA 프래그먼트 MT에 대해, 이하의 용액을 조제하였다.
용액 MA : 10ng/10μL TE 용액
용액 MB : 1ng/10μL TE 용액
용액 MC : 0.1ng/10μL TE 용액
용액 MD : TE 용액(음성 대조군액)
또, 배열 번호 161로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 목적으로 하는 DNA 영역 T’에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 162로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 B4를 합성하여, 그 농도가 0.02μM인 TE 버퍼 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역> (5-메틸사이토신도 C로 표시한다)
T’ : 5’-
GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3’(배열 번호 161)
<5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드>
B4 : 5’Biotin-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3’(배열 번호 162)
또, 배열 번호 161로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 목적으로 하는 DNA 영역 T’의 마이너스 가닥에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 163, 배열 번호 164, 배열 번호 165, 및 배열 번호 166으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 카운터 올리고뉴클레오티드 C26, C27, C28, 및 C29를 합성하여, 각각의 농도가 0.01μM인 TE 버퍼 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역> (메틸사이토신도 C로 표시한다)
T’ : 5’-
GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3’(배열 번호 161)
<카운터 올리고뉴클레오티드>
C26 : 5’-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3’(배열 번호 163)
C27 : 5’-AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT-3’(배열 번호 164)
C28 : 5’-ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT-3’(배열 번호 165)
C29 : 5’-CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC-3’(배열 번호 166)
상기의 DNA 프래그먼트 T의 용액 및 메틸화한 DNA 프래그먼트 MT의 용액의 각각에 대해, 이하의 처리를 실시하였다.
PCR 튜브에, 상기에서 조제한 DNA 프래그먼트 용액 10μL와, 상기에서 조제한 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 상기에서 조제한 카운터 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 10μL와, 100mM의 MgCl2 용액 10μL와, 1mg/mL의 BSA 용액 10μL를 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 100μL로 하여, 혼합하였다. 그 후, 본 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속하게 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 다음에, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 또한 37℃로 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌렸다(이상, 본 발명 측정 방법의 제1 공정에 상당한다).
상기에서 조제한 DNA 프래그먼트의 반응액 100μL를, 스트렙트아비딘 피복이 끝난 8 웰 스트립(Perkin Elmer사제)에 첨가하고, 30분간 실온에서 방치하여 웰에 고정화하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 당해 버퍼를 디켄테이션에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 측정 방법의 제2 공정에 상당한다).
배열 번호 162로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드 B4에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 167으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 마스킹 올리고뉴클레오티드 M4를 합성하여, 그 농도가 0.02 μM인 TE 버퍼 용액을 조제하였다.
<5’말단 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드>
B4 : 5’Biotin-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3’(배열 번호 162)
<마스킹 올리고뉴클레오티드>
M4 : 5’-CGAGAACGCCAGATCTGTACT-3’(배열 번호 167)
각 웰에 메틸화 사이토신 항체[Aviva Systems Biology사제, 0.5μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]를 100μL와 상기의 마스킹 올리고뉴클레오티드 용액 1μL를 첨가하고, 1시간 실온에서 방치하였다. 그 후, 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
그 후, Eu-N1 표식 마우스 IgG 항체[Perkin Elmer사제, 0.05μg/mL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]를 각 웰에 100μL의 비율로 첨가 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 그 후, 용액을 디켄테이션으로 제거하고, 각 웰을 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)] 200μL로 3회 세정하였다.
Enhancement Solution(Perkin Elmer사제)을 각 웰에 150μL의 비율로 첨가하고, 5분간 교반 후, 15분간 실온에서 방치하였다. 그 후, 여기 340nm/형광 612nm로 형광을 측정하였다(이상, 본 발명 측정 방법의 제3 공정에 상당한다).
그 결과를 도 43에 나타내었다. 메틸화된 DNA 프래그먼트 MT의 용액 MA, MB 및 MC에서는, 형광 강도의 증가가 확인되고, 그 강도는 농도 의존적이었다. 음성 대조군 용액 MD에서는, 형광 강도의 증가가 확인되지 않았다. 메틸화되어 있지 않은 DNA 프래그먼트 T의 용액 A, B, C 및 D에서는, 형광 강도의 증가가 확인되지 않았다.
이상으로부터, 비오틴화 올리고뉴클레오티드 및 메틸사이토신 항체로, 메틸화된 목적으로 하는 DNA 영역 T’를 포함하는 DNA를 선택하여 고정화하는 것이 가능한 것, 또, 메틸화된 DNA를 고감도로 검출·정량할 수 있는 것이 확인되었다.
실시예 21
시판의 메틸사이토신 항체(Aviva Systems Biology사제)를, 시판 비오틴화 키트(Biotin Labeling Kit-NH2, 도진도 화학 연구소제)를 이용해, 카탈로그에 기재된 방법에 준하여, 비오틴 표식하였다. 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체를 용액[항체 약 0.1μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]으로서 냉장 보존하였다.
합성하여 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체의 0.5μg/mL 용액을 조제하고, 이것을 각 100μL의 비율로 스트렙트아비딘 피복이 끝난 8 웰 스트립(Perkin Elmer사제)에 첨가하고, 약 1시간 실온에서 방치하여 웰에 고정화하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 당해 버퍼를 디 켄테이션에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 측정 방법에서 사용하는 고정화 메틸화 DNA 항체의 조제에 상당한다).
클론테크사로부터 구입된 사람 혈액 유래 게놈 DNA에 대해, 이하의 배열 번호 111 및 배열 번호 112로 표시되는 PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머 프라이머(PF1 및 PR1) 및 반응 조건을 이용하여 PCR을 행함으로써, 공시 샘플로서 이용되는 DNA 프래그먼트(X, 배열 번호 113, Genbank Accession No. NT_029419 등으로 표시되는 염기 번호 25687390-25687775에 상당하는 영역)를 증폭하였다.
<PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머>
PF1 : 5’-CTCAGCACCCAGGCGGCC-3’(배열 번호 111)
PR1 : 5’-CTGGCCAAACTGGAGATCGC-3’(배열 번호 112)
<DNA 프래그먼트>
X : 5’-
CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG (배열 번호 113)
PCR의 반응액으로서는, 주형으로 하는 게놈 DNA를 5ng과, 5μM로 조제된 올 리고뉴클레오티드 프라이머 용액 각 3μl와, each 2mM dNTP를 5μl와, 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.01% Gelatin)을 5μl와, 내열성 DNA 폴리머라아제(AmpliTaq Gold, ABI사제) 5U/μl를 0.25μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더해 액량을 50μl로 한 것을 이용하였다. 당해 반응액을, 95℃로 10분간 보온한 후, 95℃로 30초간 다음에 61℃로 30초간 또한 72℃로 45초간을 1사이클로 하는 보온을 40사이클 행하는 조건으로 PCR을 행하였다.
PCR을 행한 후, 1.5% 아가로스 겔 전기 영동에 의해 증폭을 확인하고, Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해, DNA 프래그먼트 X를 정제하였다.
얻어진 DNA 프래그먼트 용액의 일부에 대해, SssI methylase(NEB사제)를 1μl와, 10×NEBuffer2(NEB사제)를 10μl와, S-adenosyl methionine(3.2mM, NEB사제)을 1μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더해 액량을 100μl로 한 것을 조제하였다. 당해 반응액을, 37℃로 15-30분간 인큐베이션하고, 또한 S-adenosyl methionine(3.2mM, NEB사제)을 1μl를 추가하여 37℃로 15-30분간 인큐베이션하였다. 이것을 Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해 정제하였다. 이들의 조작을 5회 더 반복하여, 메틸화한 DNA 프래그먼트(MX, 배열 번호 114)를 얻었다.
<DNA 프래그먼트> (N은 5-메틸사이토신을 나타낸다)
MX : 5’-
CTCAGCACCCAGGNGGCNGNGATCATGAGGNGNGAGNGGNGNGNGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGNGGGTGGCACACNGNGATGTAGNGGTNGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCNGANGCAAACATGCNGAACACCTGCAGGT GCTTCACCANGNGGCACAGCCAGTNGGGGCNGNGGAAGNGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGNGGCAGCACCTGGAAGAATGCCANGGCCAGGTNGGCCAGGCTGAGGTGTNGGATGAAGAGGTGCATGNGGGANGTCTTGNGNGGNGTCNGGTGCAGAGCCAGCAGTANGCTGCTGTTGCCCAGCANGGCCACNGNGAAAGTCACNGCCAGCANGGNGATCTCCAGTTTGGCCAG-3’(배열 번호 114)
얻어진 DNA 프래그먼트 X에 대해, 이하의 용액을 조제하였다.
용액 A : 10ng/10μL TE 용액
용액 B : 1ng/10μL TE 용액
용액 C : 0.1ng/10μL TE 용액
용액 D : TE 용액(음성 대조군액)
얻어진 DNA 프래그먼트 MX에 대해, 이하의 용액을 조제하였다.
용액 MA : 10ng/10μL TE 용액
용액 MB : 1ng/10μL TE 용액
용액 MC : 0.1ng/10μL TE 용액
용액 MD : TE 용액(음성 대조군액)
또, 배열 번호 115로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 목적으로 하는 DNA 영역 X’에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 168로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F1을 합성하여, 그 농도가 0.02μM인 10mM의 Tris-HCl 버퍼 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역> (5-메틸사이토신도 C로 표시한다)
X’ : 5’-
CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG-3’(배열 번호 115)
<5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드>
F1 : 5’FITC-CTGGCCAAACTGGAGATCGC-3’(배열 번호 168)
또, 배열 번호 115로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 목적으로 하는 DNA 영역 X’의 마이너스 가닥에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 117∼배열 번호 128로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 카운터 올리고뉴클레오티드 C1∼C12를 합성하여, 각각의 농도가 0.01μM인 TE 버퍼 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역> (5-메틸사이토신도 C로 표시한다)
X’ : 5’-
CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG-3’(배열 번호 115)
<카운터 올리고뉴클레오티드>
C1 : 5’-GCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCG-3’(배열 번호 117)
C2 : 5’-GCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACG-3’(배열 번호 118)
C3 : 5’-CGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGA-3’(배열 번호 119)
C4 : 5’-AGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATG-3’(배열 번호 120)
C5 : 5’-ACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCC-3’(배열 번호 121)
C6 : 5’-TAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGC-3’(배열 번호 122)
C7 : 5’-CGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGG-3’(배열 번호 123)
C8 : 5’-ATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACG-3’(배열 번호 124)
C9 : 5’-ATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAAC-3’(배열 번호 125)
C10 : 5’-TGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTC-3’(배열 번호 126)
C11 : 5’-CGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGG-3’(배열 번호 127)
C12 : 5’-CAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGG-3’(배열 번호 128)
상기의 DNA 프래그먼트 X의 용액 및 메틸화한 DNA 프래그먼트 MX의 용액의 각각에 대해, 이하의 처리를 실시하였다.
PCR 튜브에, 상기에서 조제한 DNA 프래그먼트 용액 10μL와, 상기에서 조제한 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 상기에서 조제한 카운터 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 10μL와, 100mM의 MgC12 용액 10μL와, 1mg/mL의 BSA 용액 10μL를 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 100μL로 하여, 혼합하였다. 그 후, 본 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속하게 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 다음에, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 또한 37℃로 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌렸다(이상, 본 발명 측정 방법의 제1 공정에 상당한다).
상기의 비오틴 표식 메틸사이토신 항체가 고정화된 스트렙트아비딘 피복이 끝난 8 웰 스트립에, 상기에서 조제한 DNA 프래그먼트의 반응액 100μL를 더하고, 실온에서 1시간 방치하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 당해 버퍼를 피펫팅에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 측정 방법의 제2 공정에 상당한다).
그 후, HRP 표식 FITC 항체 용액[Jackson ImmunoResearch Laboratories사제, 0.005μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]을 각 웰에 100μL의 비율로 첨가 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 각 웰을 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 당해 버퍼를 디켄테이션에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
기질(R&D사제, #DY999)을, 각 웰에 100μL의 비율로 첨가·혼합하여, 반응을 개시하였다.
약 30분간 실온에서 방치하고, 스톱 용액(1N H2SO4 수용액)을 각 웰에 50μL의 비율로 첨가하여, 반응을 정지하였다. 반응 정지 후 30분 이내에 450nm의 흡광도를 측정하였다(이상, 본 발명 측정 방법의 제3 공정에 상당한다).
그 결과를 도 44에 나타내었다. 메틸화된 DNA 프래그먼트 MX의 용액 MA, MB 및 MC에서는, 발색 강도의 증가가 확인되고, 그 강도는 농도 의존적이었다. 음성 대조군 용액 MD에서는, 발색 강도의 증가가 확인되지 않았다. 메틸화되어 있지 않은 DNA 프래그먼트 X의 용액 A, B, C 및 D에서는, 발색 강도의 증가가 확인되지 않았다.
이상으로부터, 고정화한 메틸사이토신 항체로, 메틸화된 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 DNA를 선택하는 것이 가능한 것, 또, 메틸화된 DNA를 고감도로 검출·정량할 수 있는 것이 확인되었다.
실시예 22
시판의 메틸사이토신 항체(Aviva Systems Biology사제)를, 시판 비오틴화 키트(Biotin Labeling Kit-NH2, 도진도 화학 연구소제)를 이용해, 카탈로그에 기재된 방법에 준하여, 비오틴 표식하였다. 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체를 용액[항체 약 0.1μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]으로서 냉장 보존하였다.
합성하여 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체의 0.5μg/mL 용액을 조제하고, 이것을 각 100μL의 비율로 스트렙트아비딘 피복이 끝난 8 웰 스트립(Perkin Elmer사제)에 첨가하고, 약 1시간 실온에서 방치하여 웰에 고정화하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 당해 버퍼를 디켄테이션에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 측정 방법에서 사용하는 고정화 메틸화 DNA 항체의 조제에 상당한다).
빵 효모 효모주 X2180-1A를 YPD 배지(1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6.0)에서, 탁도가 OD600 0.6-1.0이 될 때까지 배양하고, 10,000g으로 10분간 원심하여, 1×107의 효모 세포를 조제하였다. 조제한 효모 세포로부터, Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)에 기재되어 있는, 일반적인 효모 게놈의 조제법을 이용하여 효모 게놈을 취득하였다.
조제한 효모 세포를, 버퍼 A(1M 소르비톨, 0.1M EDTA, pH 7.4)에 현탁하고, 2-메르캅토 에탄올(최종 농도 14mM) 및 100U zymolase(10mg/ml)를 첨가하여, 용액이 투명해질 때까지 30℃로 1시간, 교반하면서 인큐베이트하였다. 550g으로 10분간 원심하여 프로토플래스트를 회수 후, 버퍼 B(50mM Tris-HCl, pH 7.4, 20mM EDTA)에 현탁한 다음, 도데실 황산나트륨을 1%(w/v)가 되도록 더한 후, 65℃로 30분간 인큐베이트하였다. 이어서, 체적비 2/5량의 5M CH3COOK를 첨가하여 섞은 다음 30분간 빙랭 후, 15,000g으로 30분간 원심하여 상청액을 회수하였다. 회수한 상청액에 체적비 1/10량의 3M CH3COONa와 등량의 이소프로판올을 더해 잘 섞고, 15,000g 4℃로 30분간 원심하여 얻어진 침전을 70% 에탄올로 린스하여 회수하였다. 침전을 건조시킨 후, 1ml의 TE 버퍼(10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)에 용해하고, 40μg/ml가 되도록 RNa se A(Sigma사제)를 더해 37℃로 1시간 인큐베이트하고, 이어서, 혼합액에 proteinase K(Sigma사제)를 500μg/ml 및 도데실 황산나트륨을 1%(w/v)가 되도록 더한 후, 이것을 55℃로 약 16시간 진탕하였다. 진탕이 끝난 후, 당해 혼합물을 페놀[1M Tris-HCl(pH 8.0)로 포화]·클로로포름 추출 처리하였다. 수층을 회수하고, 이것에 NaCl을 0.5N이 되도록 더한 후, 이것을 에탄올 침전 처리하여 생긴 침전을 회수하였다. 회수된 침전을 70% 에탄올로 린스함으로써, 게놈 DNA를 얻었다.
얻어진 게놈 DNA로부터, 이하의 배열 번호 140 및 배열 번호 141로 표시되는 프라이머(PF3 및 PR3) 및 반응 조건을 이용하여 PCR을 행함으로써, 공시 샘플로서 이용되는 DNA 프래그먼트(S, 배열 번호 142, Genbank Accession No. NC_001139 등으로 표시되는 효모 염색체 VII의 염기 번호 271743-272083에 상당하는 영역)를 증폭하였다.
PF3 : 5’-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3’(배열 번호 140)
PR3 : 5’-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3’(배열 번호 141)
<DNA 프래그먼트>
S : 5’-
AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCC CGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3’(배열 번호 142)
PCR의 반응액으로서는, 주형으로 하는 게놈 DNA를 10ng과, 5μM의 상기 프라이머 용액 각 3μl와, each 2mM dNTP를 5μl와, 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.01% Gelatin)을 5μl와, 내열성 DNA 폴리머라아제(AmpliTaq Gold) 5U/μl를 0.25μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더해 액량을 50μl로 한 것을 이용하였다. 당해 반응액을, 95℃로 10분간 보온한 후, 95℃로 20초간 다음에 58℃로 30초간 또한 72℃로 30초간을 1사이클로 하는 보온을 40사이클 행하는 조건으로 PCR을 행하였다.
PCR을 행한 후, 2% 아가로스 겔 전기 영동에 의해 증폭을 확인하고, Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해, DNA 프래그먼트 S를 정제하였다.
얻어진 DNA 프래그먼트 용액의 일부에 대해, SssI methylase(NEB사제)를 1μl와, 10×NEBuffer2(NEB사제)를 10μl와, S-adenosyl methionine(3.2mM, NEB사제)을 1μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더해 액량을 100μl로 한 것을 조제하였다. 당해 반응액을, 37℃로 15-30분간 인큐베이션하고, 또한 S-adenosyl methionine(3.2mM, NEB사제)을 1μl를 추가하여 37℃로 15-30분간 인큐베이션하였다. 이것을 Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해 정제하였다. 이 조작을 5회 더 반복하여, 메틸화한 DNA 프래그먼트(MS, 배열 번호 143)를 얻었다.
<DNA 프래그먼트> (N은 5-메틸사이토신을 나타낸다)
MS : 5’-
AGGTGAGCTANGTGTGTTTGGGNGTNGTGCACTGGCTCACTTGTANGNGCAGAAATGGCAGCTTGTANGATTGGTGACCNGCCTTTTNGACACTGGACNGCTATGGANGTGGNGGNGGTGTGGNGGNGGCTCAATGACCTGTGGNGCCNGTTTGTGGNGTGNGATAGTNGAGCNGCCTGTCANGTGNGNGGCNGCCCTGCTCNGTTTGANGNGATGCATAGCATGNGACCACCCAGTAATCATACTGCTGANGCTATTGGTCANGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGNGGTGGNGTCCNGTTTCCACACNGTANGTGAGCACATGTCT-3’(배열 번호 143)
얻어진 DNA 프래그먼트 S에 대해, 이하의 용액을 각각 2련으로 조제하였다.
용액 A : 10ng/10μL TE 용액
용액 B : 1ng/10μL TE 용액
용액 C : 0.1ng/10μL TE 용액
용액 D : TE 용액(음성 대조군액)
얻어진 DNA 프래그먼트 MS에 대해, 이하의 용액을 각각 2련으로 조제하였다.
용액 MA : 10ng/10μL TE 용액
용액 MB : 1ng/10μL TE 용액
용액 MC : 0.1ng/10μL TE 용액
용액 MD : TE 용액(음성 대조군액)
또, 배열 번호 144로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 목적으로 하는 DNA 영역 S’에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 169로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F2를 합성하여, 그 농도가 0.02μ M인 10mM의 Tris-HCl 버퍼 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역> (5-메틸사이토신도 C로 표시한다)
S’ : 5’-
AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3’(배열 번호 144)
<5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드>
F2 : 5’FITC-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3’(배열 번호 169)
또, 배열 번호 144로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 목적으로 하는 DNA 영역 S’의 마이너스 가닥에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 146∼배열 번호 155로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 카운터 올리고뉴클레오티드 C16∼C25를 합성하여, 각각의 농도가 0.01μM인 TE 버퍼 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역> (5-메틸사이토신도 C로 표시한다)
S’ : 5’-
AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCC GTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3’(배열 번호 144)
<카운터 올리고뉴클레오티드>
C16 : 5’-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3’(배열 번호 146)
C17 : 5’-GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA-3’(배열 번호 147)
C18 : 5’-CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC-3’(배열 번호 148)
C19 : 5’-ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT-3’(배열 번호 149)
C20 : 5’-GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT-3’(배열 번호 150)
C21 : 5’-TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC-3’(배열 번호 151)
C22 : 5’-ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT-3’(배열 번호 152)
C23 : 5’-TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG-3’(배열 번호 153)
C24 : 5’-ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG-3’(배열 번호 154)
C25 : 5’-CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC-3’(배열 번호 155)
상기의 DNA 프래그먼트 S의 용액 및 메틸화한 DNA 프래그먼트 MS의 용액의 각각에 대해, 이하의 처리를 실시하였다.
PCR 튜브에, 상기에서 조제한 DNA 프래그먼트 용액 10μL와, 상기에서 조제한 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 상기에서 조제한 카운터 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 10μL와, 100mM의 MgCl2 용액 10μL와, 1mg/mL의 BSA 용액 10μL를 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액 량을 100μL로 하여, 혼합하였다. 그 후, 본 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속하게 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 다음에, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 또한 37℃로 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌렸다(이상, 본 발명 측정 방법의 제1 공정에 상당한다).
상기의 비오틴 표식 메틸사이토신 항체가 고정화된 스트렙트아비딘 피복이 끝난 8 웰 스트립에, 상기에서 조제한 DNA 프래그먼트의 반응액 100μL를 더하고, 실온에서 1시간 방치하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 당해 버퍼를 피펫팅에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 측정 방법의 제2 공정에 상당한다).
그 후, HRP 표식 FITC 항체 용액[Jackson ImmunoResearch Laboratories사제, 0.005μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]을 각 웰에 100μL의 비율로 첨가 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 각 웰을 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 당해 버퍼를 디켄테이션에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
기질(R&D사제, #DY999)을, 각 웰에 100μL의 비율로 첨가·혼합하여, 반응을 개시하였다.
약 15분간 실온에서 방치하고, 스톱 용액(1N H2SO4 수용액)을 각 웰에 50μL 의 비율로 첨가하여, 반응을 정지하였다. 반응 정지 후 30분 이내에 450nm의 흡광도를 측정하였다(이상, 본 발명 측정 방법의 제3 공정에 상당한다).
그 결과를 도 45에 나타내었다. 메틸화된 DNA 프래그먼트 MS의 용액 MA, MB 및 MC에서는, 발색 강도의 증가가 확인되고, 그 강도는 농도 의존적이었다. 음성 대조군 용액 MD에서는, 발색 강도의 증가가 확인되지 않았다. 메틸화되어 있지 않은 DNA 프래그먼트 S의 용액 A, B, C 및 D에서는, 발색 강도의 증가가 확인되지 않았다.
이상으로부터, 고정화한 메틸사이토신 항체로, 메틸화된 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 DNA를 선택하는 것이 가능한 것, 또, 메틸화된 DNA를 고감도로 검출·정량할 수 있는 것이 확인되었다.
실시예 23
시판의 메틸사이토신 항체(Aviva Systems Biology사제)를, 시판 비오틴화 키트(Biotin Labeling Kit-NH2, 도진도 화학 연구소제)를 이용해, 카탈로그에 기재된 방법에 준하여, 비오틴 표식하였다. 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체를 용액[항체 약 0.1μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]으로서 냉장 보존하였다.
합성하여 얻어진 비오틴 표식 메틸사이토신 항체의 0.5μg/mL 용액을 조제하고, 이것을 각 100μL의 비율로 스트렙트아비딘 피복이 끝난 8 웰 스트립(Perkin Elmer사제)에 첨가하고, 약 1시간 실온에서 방치하여 웰에 고정화하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 당해 버퍼를 디켄테이션에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 측정 방법에서 사용하는 고정화 메틸화 DNA 항체의 조제에 상당한다).
빵 효모 효모주 X2180-1A를 YPD 배지(1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6.0)에서, 탁도가 OD600 0.6-1.0이 될 때까지 배양하고, 10,000g으로 10분간 원심하여, 1×107의 효모 세포를 조제하였다. 조제한 효모 세포로부터, Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)에 기재되어 있는, 일반적인 효모 게놈의 조제법을 이용하여 효모 게놈을 취득하였다.
조제한 효모 세포를, 버퍼 A(1M 소르비톨, 0.1M EDTA, pH 7.4)에 현탁하고, 2-메르캅토 에탄올(최종 농도 14mM) 및 100U zymolase(10mg/ml)를 첨가하여, 용액이 투명해질 때까지 30℃로 1시간, 교반하면서 인큐베이트하였다. 550g으로 10분간 원심하여 프로토플래스트를 회수 후, 버퍼 B(50mM Tris-HCl, pH 7.4, 20mM EDTA)에 현탁한 다음, 도데실 황산나트륨을 1%(w/v)가 되도록 더한 후, 65℃로 30분간 인큐베이트하였다. 이어서, 체적비 2/5량의 5M CH3COOK를 첨가하여 혼합한 다음 30분간 빙랭 후, 15,000g으로 30분간 원심하여 상청액을 회수하였다. 회수한 상청액에 체적비 1/10량의 3M CH3COONa와 등량의 이소프로판올을 더해 잘 섞고, 15,000g 4℃로 30분간 원심하여 얻어진 침전을 70% 에탄올로 린스하여 회수하였다. 침전을 건조시킨 후, 1ml의 TE 버퍼(10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)에 용해하고, 40μg/ml가 되도록 RNa se A(Sigma사제)를 더해 37℃로 1시간 인큐베이트하고, 이어서, 혼합액에 proteinase K(Sigma사제)를 500μg/ml 및 도데실 황산나트륨을 1%(w/v)가 되도록 더한 후, 이것을 55℃로 약 16시간 진탕하였다. 진탕이 끝난 후, 당해 혼합물을 페놀[1M Tris-HCl(pH 8.0)로 포화]·클로로포름 추출 처리하였다. 수층을 회수하고, 이것에 NaCl을 0.5N이 되도록 더한 후, 이것을 에탄올 침전 처리하여 생긴 침전을 회수하였다. 회수된 침전을 70% 에탄올로 린스함으로써, 게놈 DNA를 얻었다.
얻어진 게놈 DNA로부터, 이하의 배열 번호 157 및 배열 번호 158로 표시되는 PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머(PF4 및 PR4) 및 반응 조건을 이용하여 PCR을 행함으로써, 공시 샘플로서 이용되는 DNA 프래그먼트(T, 배열 번호 159, Genbank Accession No. NC_001139 등으로 표시되는 효모 염색체 VII의 염기 번호 384569-384685에 상당하는 영역)를 증폭하였다.
<PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머>
PF4 : 5’-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3’(배열 번호 157)
PR4 : 5’-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3’(배열 번호 158)
<DNA 프래그먼트>
T : 5’-
GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3’(배열 번호 159)
PCR의 반응액으로서는, 주형으로 하는 게놈 DNA를 10ng과, 5μM으로 조제된 올리고뉴클레오티드 프라이머 용액 각 3μl와, each 2mM dNTP를 5μl와, 10×완충액(100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.01% Gelatin)을 5μl와, 내열성 DNA 폴리머라아제(AmpliTaq Gold, ABI사제) 5U/μl를 0.25μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더해 액량을 50μl로 한 것을 이용하였다. 당해 반응액을, 95℃로 10분간 보온한 후, 95℃로 20초간 다음에 58℃로 30초간 또한 72℃로 30초간을 1사이클로 하는 보온을 40사이클 행하는 조건으로 PCR을 행하였다.
PCR을 행한 후, 1.5% 아가로스 겔 전기 영동에 의해 증폭을 확인하고, Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해, DNA 프래그먼트 T를 정제하였다.
얻어진 DNA 프래그먼트 용액의 일부에 대해, SssI methylase(NEB사제)를 1μl와, 10×NEBuffer2(NEB사제)를 10μl와, S-adenosyl methionine(3.2mM, NEB사제)을 1μl를 혼합하고, 이것에 멸균 초순수를 더해 액량을 100μl로 한 것을 조제하였다. 당해 반응액을, 37℃로 15-30분간 인큐베이션하고, 또한 S-adenosyl methionine(3.2mM, NEB사제)을 1μl를 추가하여 37℃로 15-30분간 인큐베이션하였다. 이것을 Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA사)에 의해 정제하였다. 이 조작을 5회 더 반복하여, 메틸화한 DNA 프래그먼트(MT, 배열 번호 160)를 얻었다.
<DNA 프래그먼트> (N은 5-메틸사이토신을 나타낸다)
MT : 5’-
GGACCTGTGTTTGANGGGTATAACACTAAGTTGNGCAATTTGCTGTATTGNGAAATCNGCCNGGANGATAT CACTCTTGAGNGCATGTGCNGTTTCNGAGAANGCCAGATCTGTACT-3’(배열 번호 160)
얻어진 DNA 프래그먼트 T에 대해, 이하의 용액을 각각 2련으로 조제하였다.
용액 A : 10ng/10μL TE 용액
용액 B : 1ng/10μL TE 용액
용액 C : 0.1ng/10μL TE 용액
용액 D : TE 용액(음성 대조군액)
얻어진 DNA 프래그먼트 MT에 대해, 이하의 용액을 각각 2련으로 조제하였다.
용액 MA : 10ng/10μL TE 용액
용액 MB : 1ng/10μL TE 용액
용액 MC : 0.1ng/10μL TE 용액
용액 MD : TE 용액(음성 대조군액)
또, 배열 번호 161로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 목적으로 하는 DNA 영역 T’에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 170으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 F3을 합성하여, 그 농도가 0.02μM인 10mM의 Tris-HCl 버퍼 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역> (5-메틸사이토신도 C로 표시한다)
T’ : 5’-
GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3’(배열 번호 161)
<5’말단 FITC 표식 올리고뉴클레오티드>
F3 : 5’FITC-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3’(배열 번호 170)
또, 배열 번호 161로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 목적으로 하는 DNA 영역 T’의 마이너스 가닥에 상보성에 의해 결합 가능한 배열 번호 163, 배열 번호 164, 배열 번호 165, 및 배열 번호 166으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 카운터 올리고뉴클레오티드 C26, C27, C28, 및 C29를 합성하여, 각각의 농도가 0.01μM인 TE 버퍼 용액을 조제하였다.
<목적으로 하는 DNA 영역> (메틸사이토신도 C로 표시한다)
T’ : 5’-
GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3’(배열 번호 161)
<카운터 올리고뉴클레오티드>
C26 : 5’-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3’(배열 번호 163)
C27 : 5’-AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT-3’(배열 번호 164)
C28 : 5’-ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT-3’(배열 번호 165)
C29 : 5’-CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC-3’(배열 번호 166)
상기의 DNA 프래그먼트 T의 용액 및 메틸화한 DNA 프래그먼트 MT의 용액의 각각에 대해, 이하의 처리를 실시하였다.
PCR 튜브에, 상기에서 조제한 DNA 프래그먼트 용액 10μL와, 상기에서 조제한 FITC 표식 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 상기에서 조제한 카운터 올리고뉴클레오티드 용액 10μL와, 완충액(330mM Tris-Acetate pH 7.9, 660mM KOAc, 100mM MgOAc2, 5mM Dithiothreitol) 10μL와, 100mM의 MgCl2 용액 10μL와, 1mg/mL의 BSA 용액 10μL를 첨가하고, 또한 당해 혼합물에 멸균 초순수를 더해 액량을 100μL로 하여, 혼합하였다. 그 후, 본 PCR 튜브를 95℃로 10분간 가열하고, 70℃까지 급속하게 냉각하여, 그 온도로 10분간 보온하였다. 다음에, 50℃까지 냉각하여 10분간 보온하고, 또한 37℃로 10분간 보온한 후, 실온으로 되돌렸다(이상, 본 발명 측정 방법의 제1 공정에 상당한다).
상기의 비오틴 표식 메틸사이토신 항체가 고정화된 스트렙트아비딘 피복이 끝난 8 웰 스트립에, 상기에서 조제한 DNA 프래그먼트의 반응액 100μL를 더하고, 실온에서 1시간 방치하였다. 그 후, 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 당해 버퍼를 피펫팅에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다(이상, 본 발명 측정 방법의 제2 공정에 상당한다).
그 후, HRP 표식 FITC 항체 용액[Jackson ImmunoResearch Laboratories사제, 0.005μg/100μL 0.1% BSA 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4) 용액]을 각 웰에 100μL의 비율로 첨가 후, 1시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 각 웰을 200μL의 세정 버퍼[0.05% Tween20 함유 인산 버퍼(1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO·7H2O, 154mM NaCl pH7.4)]를 첨가한 후, 당해 버퍼를 디켄테이션에 의해 제거하였다. 이 조작을 2회 더 반복하였다.
기질(R&D사제, #DY999)을, 각 웰에 100μL의 비율로 첨가·혼합하여, 반응을 개시하였다.
약 1시간 실온에서 방치하고, 스톱 용액(1N H2SO4 수용액)을 각 웰에 50μL의 비율로 첨가하여, 반응을 정지하였다. 반응 정지 후 30분 이내에 450nm의 흡광도를 측정하였다(이상, 본 발명 측정 방법의 제3 공정에 상당한다).
그 결과를 도 46에 나타내었다. 메틸화된 DNA 프래그먼트 MT의 용액 MA, MB 및 MC에서는, 발색 강도의 증가가 확인되고, 그 강도는 농도 의존적이었다. 음성 대조군 용액 MD에서는, 발색 강도의 증가가 확인되지 않았다. 메틸화되어 있지 않은 DNA 프래그먼트 T의 용액 A, B, C 및 D에서는, 발색 강도의 증가가 확인되지 않았다.
이상으로부터, 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA와, 본 올리고뉴클레오티드의 결합체를 형성시킬 때에는, 마그네슘 이온을 함유하는 반응계를 이용하는 것이 바람직한 것이 확인되었다. 또, 이상으로부터, 고정화한 메틸사이토신 항체로, 메틸화된 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 DNA를 선택하는 것이 가능한 것, 또, 메틸화된 DNA를 고감도로 검출·정량할 수 있는 것이 확인되었다.
본 발명에 의해, 생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA가 갖는 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 간편하게 검출 혹은 정량하는 방법 등을 제공하는 것이 가능해진다.
[배열표 프리텍스트]
배열 번호 17
고정을 위해 설계된 비오틴 표식 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 18
고정을 위해 설계된 비오틴 표식 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 19
고정을 위해 설계된 비오틴 표식 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 20
고정을 위해 설계된 비오틴 표식 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 21
고정을 위해 설계된 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 22
고정을 위해 설계된 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 23
고정을 위해 설계된 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 24
고정을 위해 설계된 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 25
설계된 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 26
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 27
고정을 위해 설계된 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 28
설계된 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 29
설계된 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 30
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 31
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 32
고정을 위해 설계된 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 33
설계된 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 34
설계된 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 35
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 36
고정을 위해 설계된 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 37
설계된 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 38
설계된 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 39
설계된 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 40
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 41
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 42
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 43
고정을 위해 설계된 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 44
고정을 위해 설계된 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 45
고정을 위해 설계된 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 46
설계된 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 47
설계된 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 48
설계된 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 49
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 50
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 51
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 52
설계된 FITC 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 53
고정을 위해 설계된 FITC 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 54
고정을 위해 설계된 FITC 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 55
설계된 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 56
설계된 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 57
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 58
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 59
설계된 FITC 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 60
설계된 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 61
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 62
고정을 위해 설계된 FITC 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 63
고정을 위해 설계된 FITC 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 64
고정을 위해 설계된 FITC 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 65
설계된 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 66
설계된 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 67
설계된 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 68
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 69
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 70
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 71
설계된 FITC 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 72
설계된 FITC 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 73
설계된 FITC 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 74
설계된 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 75
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 76
설계된 FITC 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 77
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 78
설계된 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 79
설계된 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 80
설계된 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 81
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 82
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 83
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 84
설계된 FITC 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 85
설계된 FITC 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 86
설계된 FITC 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 87
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 88
설계된 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 89
실험을 위해 설계된 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 90
실험을 위해 설계된 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 91
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 92
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 93
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 94
설계된 FITC 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 95
설계된 FITC 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 96
설계된 FITC 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 97
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 98
설계된 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 99
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 100
설계된 FITC 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 101
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 102
설계된 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 103
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 104
고정을 위해 설계된 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 105
설계된 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 106
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 107
고정을 위해 설계된 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 108
설계된 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 109
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 110
고정을 위해 설계된 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 111
PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머
배열 번호 112
PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머
배열 번호 113
목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 증폭된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 114
목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 115
목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 116
고정을 위해 설계된 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 117
목적으로 하는 DNA 영역 단일 가닥 DNA를 작성하기 위해 설계된 카운터 올리고뉴클레오티드
배열 번호 118
목적으로 하는 DNA 영역 단일 가닥 DNA를 작성하기 위해 설계된 카운터 올리고뉴클레오티드
배열 번호 119
목적으로 하는 DNA 영역 단일 가닥 DNA를 작성하기 위해 설계된 카운터 올리고뉴클레오티드
배열 번호 120
목적으로 하는 DNA 영역 단일 가닥 DNA를 작성하기 위해 설계된 카운터 올리고뉴클레오티드
배열 번호 121
목적으로 하는 DNA 영역 단일 가닥 DNA를 작성하기 위해 설계된 카운터 올리고뉴클레오티드
배열 번호 122
목적으로 하는 DNA 영역 단일 가닥 DNA를 작성하기 위해 설계된 카운터 올리고뉴클레오티드
배열 번호 123
목적으로 하는 DNA 영역 단일 가닥 DNA를 작성하기 위해 설계된 카운터 올리고뉴클레오티드
배열 번호 124
목적으로 하는 DNA 영역 단일 가닥 DNA를 작성하기 위해 설계된 카운터 올리고뉴클레오티드
배열 번호 125
목적으로 하는 DNA 영역 단일 가닥 DNA를 작성하기 위해 설계된 카운터 올리고뉴클레오티드
배열 번호 126
목적으로 하는 DNA 영역 단일 가닥 DNA를 작성하기 위해 설계된 카운터 올리고뉴클레오티드
배열 번호 127
목적으로 하는 DNA 영역 단일 가닥 DNA를 작성하기 위해 설계된 카운터 올리고뉴클레오티드
배열 번호 128
목적으로 하는 DNA 영역 단일 가닥 DNA를 작성하기 위해 설계된 카운터 올리고뉴클레오티드
배열 번호 129
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 130
PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머
배열 번호 131
PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머
배열 번호 132
목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 증폭된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 133
목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 134
목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 135
고정을 위해 설계된 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 136
목적으로 하는 DNA 영역 단일 가닥 DNA를 작성하기 위해 설계된 카운터 올리고뉴클레오티드
배열 번호 137
목적으로 하는 DNA 영역 단일 가닥 DNA를 작성하기 위해 설계된 카운터 올리고뉴클레오티드
배열 번호 138
목적으로 하는 DNA 영역 단일 가닥 DNA를 작성하기 위해 설계된 카운터 올리고뉴클레오티드
배열 번호 139
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 140
PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머
배열 번호 141
PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머
배열 번호 142
목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 증폭된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 143
목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 설계된 메틸화 올리고뉴클레오티드
배열 번호 144
목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 145
고정을 위해 설계된 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 146
목적으로 하는 DNA 영역 단일 가닥 DNA를 작성하기 위해 설계된 카운터 올리고뉴클레오티드
배열 번호 147
목적으로 하는 DNA 영역 단일 가닥 DNA를 작성하기 위해 설계된 카운터 올리고뉴클레오티드
배열 번호 148
목적으로 하는 DNA 영역 단일 가닥 DNA를 작성하기 위해 설계된 카운터 올리고뉴클레오티드
배열 번호 149
목적으로 하는 DNA 영역 단일 가닥 DNA를 작성하기 위해 설계된 카운터 올리고뉴클레오티드
배열 번호 150
목적으로 하는 DNA 영역 단일 가닥 DNA를 작성하기 위해 설계된 카운터 올리고뉴클레오티드
배열 번호 151
목적으로 하는 DNA 영역 단일 가닥 DNA를 작성하기 위해 설계된 카운터 올리고뉴클레오티드
배열 번호 152
목적으로 하는 DNA 영역 단일 가닥 DNA를 작성하기 위해 설계된 카운터 올리고뉴클레오티드
배열 번호 153
목적으로 하는 DNA 영역 단일 가닥 DNA를 작성하기 위해 설계된 카운터 올리고뉴클레오티드
배열 번호 154
목적으로 하는 DNA 영역 단일 가닥 DNA를 작성하기 위해 설계된 카운터 올리 고뉴클레오티드
배열 번호 155
목적으로 하는 DNA 영역 단일 가닥 DNA를 작성하기 위해 설계된 카운터 올리고뉴클레오티드
배열 번호 156
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 157
PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머
배열 번호 158
PCR을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머
배열 번호 159
목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 증폭된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 160
목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 161
목적으로 하는 DNA 영역으로 이루어지는 설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 162
고정을 위해 설계된 비오틴 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 163
목적으로 하는 DNA 영역 단일 가닥 DNA를 작성하기 위해 설계된 카운터 올리 고뉴클레오티드
배열 번호 164
목적으로 하는 DNA 영역 단일 가닥 DNA를 작성하기 위해 설계된 카운터 올리고뉴클레오티드
배열 번호 165
목적으로 하는 DNA 영역 단일 가닥 DNA를 작성하기 위해 설계된 카운터 올리고뉴클레오티드
배열 번호 166
목적으로 하는 DNA 영역 단일 가닥 DNA를 작성하기 위해 설계된 카운터 올리고뉴클레오티드
배열 번호 167
설계된 올리고뉴클레오티드
배열 번호 168
설계된 FITC 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 169
설계된 FITC 표식 올리고뉴클레오티드
배열 번호 170
설계된 FITC 표식 올리고뉴클레오티드
SEQUENCE LISTING
<110> Sumitomo Chemical Co., Ltd.
<120> Method for measuring DNA methylation
<130> S17332WO01
<150> JP2007-078660
<151> 2007-3-26
<160> 170
<210> 1
<211> 2661
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
acagacatgt gccaccatgc ccagctaatt ttttgtttgt ttgtttgttt gtttgtattt 60
ttagtagaga tggggttttg ccatgttggc caggctggtc tcgaactcct gacctcgaat 120
gataatgatc cgccgcttgg cctccaaagt gctaggatta caggtgtgag ccactgcgcc 180
aggcctgggc actttcttta gtagtttgag gagcaacatt tttgacagtg tccttctgct 240
caagattcaa gatcccagat aaaattaaac catctagaga gatggcttga ttggccaaac 300
ctggatctca tgaccacttc ttgaagtggg taagtctcat aaatgctcag tccttccact 360
atgcaactga gtggggtggg tgggaagccc ctcaaaggaa aatccggttg ttcttactag 420
aaagaaaagg aaaatggatg tgaggcagtc aaaatcagca gaggtccacc acaccaccaa 480
aatgtggtga ttaaatatgg agagacagag actaacagag gtatgtgaat attgaagtat 540
gtctggacaa tagcccaatg atgagaccaa taaaatggtt accaaaatct ggttttgagt 600
agtagtgtta aatcagacca tttagtaacc attttttgtt gcaaagtttc tagcactgcc 660
caaaccctga gtggtatatg aataactcgt ccattatgta tctctttcca gtcagcataa 720
tttatccccc acctatattc ttttctgacc actcctactt ccttctcttt accaaaatct 780
aaactctaag gctgtttctt cagcaacttc tttgtttaga ttggaagata aattaaacag 840
catgcgatgt tttactgact ttcagtattt aacagaggtg atttaatttt tttttaaatc 900
caaagtcaaa cttctttata agatgaagga gaaaaatgtc ttataaaatg catatgtgaa 960
gatgccttct gagtgctttc tcatgcagac ttgttctagt ctttaatgaa tcttccttgt 1020
agacactgtg gagatgaaag atggttctcc acttctactc aaagtacaaa tcaggccggc 1080
attttgaaaa agagacaggt ttattcatag ctgcagcgtt agctggcttt gttccctgta 1140
caatttcact tttggttatt aaaatattca ctgtaggaaa taaatttgta acccatttct 1200
catattacct acacacagaa aaacaaaatt tgatatcctg gggtttattt gctgagggcg 1260
cttcccataa aagcgagaga gtgtgcgttg ggaaatgtgt ctggttaact cttttatgga 1320
taaactttag tcacaatcct cccccgcccc cctctcaccc ccagcaccct cccaacctcc 1380
cgacttcccg cctctcaagg gctggtgacc taatagcatt tttcttcgtg catattttgg 1440
cgtcgcccca tggcctggct gccttcgcct gtctgagttt tttgaaattc ctgcatgttc 1500
gccccagatt aagccagtgt gtctcaggat gtgtgttccg ttttgttctt tccccttaac 1560
gctccctgtg caacgtgtct ggggggagga gggcagggac gggagagagg gaggggcaga 1620
ggcgaggagc tgtccgcctt gcacgtttcc aatcgcatta cgtgaacaaa tagctgaggg 1680
gcggccgggc cagaacggct tgtgtaactt tgcaaacgtg ccagaaagtt taaatctctc 1740
ctccttcctt cactccagac actgcccgct ctccgggact gccgcgcggc tccccgttgc 1800
cttccaggac tgagaaaggg gaaagggaag ggtgccacgt ccgagcagcc gccttgactg 1860
gggaagggtc tgaatcccac ccttggcatt gcttggtgga gactgagata cccgtgctcc 1920
gctcgcctcc ttggttgaag atttctcctt ccctcacgtg atttgagccc cgtttttatt 1980
ttctgtgagc cacgtcctcc tcgagcgggg tcaatctggc aaaaggagtg atgcgcttcg 2040
cctggaccgt gctcctgctc gggcctttgc agctctgcgc gctagtgcac tgcgcccctc 2100
ccgccgccgg ccaacagcag cccccgcgcg agccgccggc ggctccgggc gcctggcgcc 2160
agcagatcca atgggagaac aacgggcagg tgttcagctt gctgagcctg ggctcacagt 2220
accagcctca gcgccgccgg gacccgggcg ccgccgtccc tggtgcagcc aacgcctccg 2280
cccagcagcc ccgcactccg atcctgctga tccgcgacaa ccgcaccgcc gcggcgcgaa 2340
cgcggacggc cggctcatct ggagtcaccg ctggccgccc caggcccacc gcccgtcact 2400
ggttccaagc tggctactcg acatctagag cccgcgaacc tggcgcctcg cgcgcggaga 2460
accagacagc gccgggagaa gttcctgcgc tcagtaacct gcggccgccc agccgcgtgg 2520
acggcatggt gggcgacgac ccttacaacc cctacaagta ctctgacgac aacccttatt 2580
acaactacta cgatacttat gaaaggccca gacctggggg caggtaccgg cccggatacg 2640
gcactggcta cttccagtac g 2661
<210> 2
<211> 1953
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
tataaattcc acgcaggcat tgaattgaat ttgttcttaa ccaaatgcgt tttatctata 60
cctggcagga atctagaagt gaaattacaa gatttatttc attttaattc tattatgaag 120
catttaatca caaataccct gaaaatgaaa agataattta tcattttacc ttgactgagc 180
aactctcctc acttcacatt catgaatcca taacgcagag aggagactgg atgattaagt 240
gtttgattag agaaaacaga ttaacctagc aaacataata aatttggctc ataagcagga 300
tggctttata aatgctcaca atacctctcc tgtataaaat catgaaccac ttcctacagt 360
gatgactcca tcgaaatagt tgagaaacat aaagcaaatg catgtttatg gctttctctt 420
tgagacatta aaagggtatt gaaaggcata tctgattcag cttataactc tggatatata 480
ttaaggaaca tgtaagaaaa tattaatgca taaaaaaagc tacaacttct caagtgttct 540
agtttccact ttgtcaataa ttacgttttc aatgtccttc tgtggactgt ttccaaaggt 600
gccaatccag acccaaagtt tcagatcact cagattcacc cttaaccttc ataacacaac 660
ccaatagctt tacgaaaaaa gttgcatatt taggtagttg ttatcccatt atgacaaaat 720
acataaaatt agcgagatat tttttagcct tcaaataagt gggaaaaaat ccttttagct 780
gagattccat ttacatcaga ataaaaatct aagttatgac taggttgaag caacgtcctg 840
tgcagcgctc cataaagttc acttagtctt caagggttcc ttacttagct aggttagtat 900
tcctggcctc tttttttagc agtgagaaaa aggatactct ccctgcccca gctttatttt 960
taaactcaca gccatatcct ggaggtctct gctggctatt tggcgcgtgg gggcggaggg 1020
gggccggggg aggggggcgg ggcggggtct ggaggtctgt gctggctatc tggcgtgtgt 1080
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtggttgg aggtctctgc tggctatctg gcgtgtgtgt 1140
gtgtgtggtg tggtgtgtgt aagcagtgag gttgttttag ggccagtcct tcctccgcca 1200
ctttgctgac tcaaagaccc agaggctttc ttggggtgca ggtaccatga ttccttgggc 1260
cctaagggaa tttttgttag gctagaagag tgggtgtact catgatgggt gtacccgaac 1320
attcctgggc tcaacaaaac cgattatctt tataaccgcg gcgcctagca cagcgcctgg 1380
tgccctaaac gttggctgcg ggaacgtccg agacgcgggt gcggagccgg gggcggaata 1440
actggttgcg cggcgctttg accgtaggcg ctggagcgcg tgcgttgcgt gcgcgcgcgg 1500
aggcggctgc gtcggggcgc gagaaggtgc agttccccgg cgggcgggcg ggcgggcggg 1560
cgaagctggg ctcggggcca agcgaggtct agccggagcg actgtgcccc gcctcctggg 1620
cggagcgggc ggctccccat ggtcagagcc tcgtgccggc tcggcagcgc ccggacgccg 1680
agcccagcgc gtcggccccc cggcgtgcgg gcgtctcaga gccgcggagg ggccgccggg 1740
accgtttcag cgtggcggcg ctggtgctgg cgttggccct ggaggacggc cccgagtgat 1800
ggctggcgcc tgcctcccgg gtgtctcccg ggtacagatg gagtcgtccc gcggccgccg 1860
gcggcaaggt cggcagctgc gaggccaaga gagaccccag gacacacaca gctgcctccc 1920
ggtgcgagaa gaagaccccg gcttgagagt gag 1953
<210> 3
<211> 889
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
cggccccatg gctccgtgtc gtgtccaagg gatgggctgg cacctcttgg accaggctta 60
ccaccagggc ccttctctga agccccagtc tgaccggcct gctgctggga atccccctct 120
gcccccacac taacctctgc tggggctgag ccagggcgcg tcggacagtc agggcgaccc 180
agccagggcg accgttggcc ccgctcctat ggggcagcag ggaccgacgt cagcagggtg 240
gggcgggcac ccgagtggta tgccccgccc tgccccgcct gcccgccctg gtggccgtct 300
gggggcgaca agtcctgaga gaaccagacg gaagcgcgct gggactgaca cgtggacttg 360
ggcggtgctg cccgggtggg tcagcctggg ctgggaggca gccccgggac acagctgtgc 420
ccacgccgtc tgagcacccc aagcccgatg cagccacccc cagacgaggc ccgcagggac 480
atggccgggg acacccagtg gtccaggtgt ggcgggggtg aggggagggg gggtgggagc 540
ggtggagatg gggccgtggg gagggagctg agatactgcc acgtgggacg atgctaggtg 600
gggagggctg agctgggcgg gctcctctgg ctgtggggcc ccctgtgttc cttgtgggag 660
gtggaaggaa gtgagtgccc tgtccttcct ccctgccatg agattccagg accggacctg 720
gcaagtgccc tatcccagcc agtgttcctg gggctcttcc aggcagggct atgttcccca 780
ggccaggggc attgtcctgg acagtcagga ggcatacccc tcgccaggtg gaaccaccct 840
gtgtatgcat gaccctgaca agcaggcgcc aggacagtca ggaggccag 889
<210> 4
<211> 863
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
gttgttgggt gtgaatggag aactgtgggc cctccccgac accttccagc gggacggcaa 60
cgggggccca gggggtgggc gccatcaacc ccgtcccacc gccaggacgg cgcgggggag 120
ggccggcggg ggcggggcgt cctgtaaggc gcggccccca cccgcgggcg gggcggcatt 180
cctgggaggc cggcgctctg acgtggaccc gggggccgcg ggcacggcgg gggggcggcg 240
gtccgggggc ttcttaaacc ccccgccccg gcccagcccg cacttcccga gcaccgctcc 300
gaccctggag ggagagagag ccagagagcg gccgagcgcc taggaggccc gccgagcctc 360
gccgagcccc gccagccccg gcgcgagaga agttggagag gagagcagcg cagcgcagcg 420
agtcccgtgg tcgcgcccca acagcgcccg acagcccccg atagcccaaa ccgcggccct 480
agccccggcc gcacccccag cccgcgccag catgatgaac aacagcggct actcagacgc 540
cggcctcggc ctgggcgatg agacagacga gatgccgtcc acggagaagg acctggcgga 600
ggacgcgccg tggaagaaga tccagcagaa cacattcacg cgctggtgca atgagcacct 660
caagtgcgtg ggcaagcgcc tgaccgacct gcagcgcgac ctcagcgacg ggctccggct 720
catcgcgctg ctcgaggtgc tcagccagaa gcgcatgtac cgcaagttcc atccgcgccc 780
caacttccgc caaatgaagc tggagaacgt gtccgtggcc ctcgagttcc tcgagcgcga 840
gcacatcaag ctcgtgtcca tag 863
<210> 5
<211> 2198
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
aagagaggca cactccctct accacaccga gggagggggc gttgagctga gaaaggttga 60
gagaatgagg gacccaggta ggtggacatc ggccaagaaa ggaaccacag cgggaggtaa 120
gaccgagagt ccccagcttg aagcgtcacc actccgggat tcccagattc caacgcgagc 180
ctggggaaag cccacagtgg agagagtccg gctggcaggg aatggcccta cccccggggt 240
gaaatctcgg agggtcgtgc agccgagtcg cgcctctgcg ctgatgcgtg agagatgccg 300
gacgtcgcgt ttgcctgtgc gagcctcgcg gatgctgtgc agtcttggtc ccctctgcgt 360
gtgtctaacg ccgaatgctg gtgtctcgag gtgtgagctt cggggccggt gtctttaaag 420
aaccaaagat tcttaaggag tgatgatctg ggtagagcgg cccgacgtag ccgcgctccc 480
aggtctcggt gcgagtcctg cggacagacc agaggagacc tgctggccag atgccccggg 540
cccaaggcgg acgccagact gtctctgcgc cagccgggct ggccttcgga atggatcagg 600
cacccgggag gccggagtgg atctcagacc ctcaagccgg gaacaaaccc gtcgatgccc 660
gtgggcctgg agtccgcctc ctccttcccg ccccacccct acccctgcct ccgaaaggct 720
tcttcgctgg tcagtagctg cgtgcccgtc tgcctgaggc tgggtcagaa ttggcgggct 780
ggtaacgacc ccgtgcacaa gcggctccca gtctctccag aaagggccga tgactaaggg 840
gtgggggtgg gggcggaggg ctggaaggtg ttagggaaga acgttagcgg cctatcctgt 900
cttcagcagc gccctctcat cttctagctc tgacgccgag cagagcagtt ggagctcggg 960
actgggaact gctggaattc ctatttagac ttctagacag tctagaaaca agaacctttc 1020
tttccctggg cctcagtttc cttgtctgta aaatcaaaag gcgggctcta ggtgtaggcc 1080
ttcttttcgc ttggtgattc tggattcctt tccttggatc cgtggggagg gggtggcagc 1140
aacagtccag ggcgttggcc gtcctgtgcc tcaagtacgt agtccccgtg cccgccccct 1200
caacaccccc agcagcccgc ccccctaagc ccgcagagca gggagctgag tgggaggggc 1260
agaggcgggg ccggttccca gtccctgctg gcggactaga gtggcgcggg ctgagcgtaa 1320
aacctgggat agccactccc ccttttcctt atccccgccc ccctgccatt ggctcccggg 1380
agaggttgac atcaaagccg cggtcttata taagccagat ccgcagggga gtccgcagaa 1440
gggttaaaca ggtctttggg cttcggcgac ctcgcccgcg gcagaaaccg gtaagaagac 1500
agtgggctgc gcgtctcatt ttcagccttg cccggactct cccaaagccg gcgcccagta 1560
gtggctccag agcccacagg tggcccccgg cagtctctgg ggcgcatgga gcggcgttaa 1620
tagggctggc ggcgcaggcc agtagccgct ccaacatgaa cctcgtgggc agctacgcac 1680
accatcacca ccatcaccac ccgcaccctg cgcaccccat gctccacgaa cccttcctct 1740
tcggtccggc ctcgcgctgt catcaggaaa ggccctactt ccagagctgg ctgctgagcc 1800
cggctgacgc tgccccggac ttccctgcgg gcgggccgcc gcccgcggcc gctgcagccg 1860
ccaccgccta tggtcctgac gccaggcctg ggcagagccc cgggcggctg gaggcgcttg 1920
gcggccgtct tggccggcgg aaaggctcag gacccaagaa ggagcggaga cgcactgaga 1980
gcattaacag cgcattcgcg gagttgcgcg agtgcatccc caacgtgccg gccgacacca 2040
agctctccaa gatcaagact ctgcgcctag ccaccagcta catcgcctac ctgatggacg 2100
tgctggccaa ggatgcacag tctggcgatc ccgaggcctt caaggctgaa ctcaagaagg 2160
cggatggcgg ccgtgagagc aagcggaaaa gggagctg 2198
<210> 6
<211> 1945
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
ctggatgaca gagtgagact ccgtctcaaa aaaaaagctc catttgggag gccgaggagg 60
gtggattacc tgaggtcagg agtttgagac cagcctggcc cacataggga aaccccatct 120
ctactaaaaa tacaaaaatt agtcaggtgt ggtggctgac acctataatc ccagctactt 180
gggaagctga ggcagggaga atcacttgaa ccggggaggt ggaggttgca gtgagctgag 240
atcatgccac tgcactccag cctgggcgac agggtgagat tctgtctcaa acaaacaaat 300
ttaaaagctc cgaatcctcc aaaaatacca agattttcct gtcggtaact agagatgggt 360
actgatgatt atttttaata ggtgattttc aaagatgtga acgttatcca tggagattta 420
agtctccaaa aggaaaaaaa atgcatacct ttatactaaa acttcatcac cagtcaaatt 480
tggatcatca ctaaattggc ttctacacct ctctcctaat ataaggtact tgtgtaagtt 540
tgcagttgtg agacacttat ttcctcattt ttaatgtctt ctcagtaggg ccactgatat 600
agtcactatt tgactgacca gaatggttgg cactggtgat tggctcataa agtgccctcg 660
atttaggggg ctcaattatc aaaggtttaa atcctagccc aaaccattgc tgtgatgggg 720
gttaatcaat gaaccactca gcttcacttg caaaagcggg atcacaatag ccgctttcgt 780
catgacccag cctaggtgag atttagtact taagtacact gccaggcaca caaggttaat 840
ttaacaattt aacacatttg tttcctcatc catttctcca aaccttccaa ctaatcctaa 900
cgttcgttcg gccaaatggg ccaggaattc acttaaacaa aaacaaaaaa caaaacaaac 960
aaaaaaacac tccctggggc ttggggaagg aggcaccgcc gcccatgtcg cagtctgggg 1020
gtggctcagt cctcagcacc cagatctacg gccataatgc tcttcgaggc caaggagccc 1080
ggatgcgggg cgttgccgaa ggcgtcttgc tcaggctgcg ggaaaggaga ggggtgggag 1140
cggggtgggg gcatcgcgac ccagggcaag gcggcgagtc gccgtcttcg agtcccacct 1200
gtccgaagcg gggtgagaaa aggcaaaaca tggcaaagcc atgcacctcc cagggtgggc 1260
aactcacggc cggtgaacgc cggaccctta gcagtttcca gacctttgga accggaagcg 1320
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed biotinated oligonucleotide for fixation
<220>
<223> n stands for m5c
<400> 17
angaangtan ggangc 16
<210> 18
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Designed biotinated oligonucleotide for fixation
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<223> n stands for m5c
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Designed biotinated oligonucleotide for fixation
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gtctgactac aacatccaga 80
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tattag 66
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<220>
<223> n stands for m5c
<400> 102
angaangtan ggangctnga tngttnggtn gcctgtctga ctacaacatc caga 54
<210> 103
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed oligonucleotide
<400> 103
acgaacgtac ggacgctcga tcgttcggtc gcctgtctga ctacaacatc caga 54
<210> 104
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed biotinated oligonucleotide for fixation
<400> 104
tctggatgtt gtagtcagac ag 22
<210> 105
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed oligonucleotide
<220>
<223> n stands for m5c
<400> 105
angaangtan ggangctnga tngttnggtn gccagccgac gaagggctta ttag 54
<210> 106
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed oligonucleotide
<400> 106
acgaacgtac ggacgctcga tcgttcggtc gccagccgac gaagggctta ttag 54
<210> 107
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed biotinated oligonucleotide for fixation
<400> 107
ctaataagcc cttcgtcggc t 21
<210> 108
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed oligonucleotide
<220>
<223> n stands for m5c
<400> 108
angaangtan ggangctnga tngttnggtn gccagccgac gaagggctta ttag 54
<210> 109
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed oligonucleotide
<400> 109
acgaacgtac ggacgctcga tcgttcggtc gccagccgac gaagggctta ttag 54
<210> 110
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed biotinated oligonucleotide for fixation
<400> 110
ctaataagcc cttcgtcggc t 21
<210> 111
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed oligonucleotide primer for PCR
<400> 111
ctcagcaccc aggcggcc 18
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed oligonucleotide primer for PCR
<400> 112
ctggccaaac tggagatcgc 20
<210> 113
<211> 386
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amplified oligonucleotide consist of objective DNA domain ( Genbank Accession No.NT029419 25687390-25687775 Homo sapiens )
<400> 113
ctcagcaccc aggcggccgc gatcatgagg cgcgagcggc gcgcgggctg ttgcagagtc 60
ttgagcgggt ggcacaccgc gatgtagcgg tcggctgtca tgactaccag catgtaggcc 120
gacgcaaaca tgccgaacac ctgcaggtgc ttcaccacgc ggcacagcca gtcggggccg 180
cggaagcggt aggtgatgtc ccagcacatt tgcggcagca cctggaagaa tgccacggcc 240
aggtcggcca ggctgaggtg tcggatgaag aggtgcatgc gggacgtctt gcgcggcgtc 300
cggtgcagag ccagcagtac gctgctgttg cccagcacgg ccaccgcgaa agtcaccgcc 360
agcacggcga tctccagttt ggccag 386
<210> 114
<211> 386
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed oligonucleotide consist of objective DNA domain ( Genbank Accession No.NT029419 25687390-25687775 Homo sapiens ) n=m5c
<400> 114
ctcagcaccc aggnggcngn gatcatgagg ngngagnggn gngngggctg ttgcagagtc 60
ttgagngggt ggcacacngn gatgtagngg tnggctgtca tgactaccag catgtaggcn 120
gangcaaaca tgcngaacac ctgcaggtgc ttcaccangn ggcacagcca gtnggggcng 180
nggaagnggt aggtgatgtc ccagcacatt tgnggcagca cctggaagaa tgccanggcc 240
aggtnggcca ggctgaggtg tnggatgaag aggtgcatgn gggangtctt gngnggngtc 300
nggtgcagag ccagcagtan gctgctgttg cccagcangg ccacngngaa agtcacngcc 360
agcanggnga tctccagttt ggccag 386
<210> 115
<211> 386
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed oligonucleotide consist of objective DNA domain ( Genbank Accession No.NT029419 25687390-25687775 Homo sapiens )
<400> 115
ctcagcaccc aggcggccgc gatcatgagg cgcgagcggc gcgcgggctg ttgcagagtc 60
ttgagcgggt ggcacaccgc gatgtagcgg tcggctgtca tgactaccag catgtaggcc 120
gacgcaaaca tgccgaacac ctgcaggtgc ttcaccacgc ggcacagcca gtcggggccg 180
cggaagcggt aggtgatgtc ccagcacatt tgcggcagca cctggaagaa tgccacggcc 240
aggtcggcca ggctgaggtg tcggatgaag aggtgcatgc gggacgtctt gcgcggcgtc 300
cggtgcagag ccagcagtac gctgctgttg cccagcacgg ccaccgcgaa agtcaccgcc 360
agcacggcga tctccagttt ggccag 386
<210> 116
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed biotinated oligonucleotide for fixation
<400> 116
ctggccaaac tggagatcgc 20
<210> 117
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed counter oligonucleotide for making a objective DNA domain a single strand DNA
<400> 117
gccaccgcga aagtcaccgc cagcacggcg 30
<210> 118
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed counter oligonucleotide for making a objective DNA domain a single strand DNA
<400> 118
gccagcagta cgctgctgtt gcccagcacg 30
<210> 119
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed counter oligonucleotide for making a objective DNA domain a single strand DNA
<400> 119
cgggacgtct tgcgcggcgt ccggtgcaga 30
<210> 120
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed counter oligonucleotide for making a objective DNA domain a single strand DNA
<400> 120
aggctgaggt gtcggatgaa gaggtgcatg 30
<210> 121
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed counter oligonucleotide for making a objective DNA domain a single strand DNA
<400> 121
acctggaaga atgccacggc caggtcggcc 30
<210> 122
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed counter oligonucleotide for making a objective DNA domain a single strand DNA
<400> 122
taggtgatgt cccagcacat ttgcggcagc 30
<210> 123
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed counter oligonucleotide for making a objective DNA domain a single strand DNA
<400> 123
cggcacagcc agtcggggcc gcggaagcgg 30
<210> 124
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed counter oligonucleotide for making a objective DNA domain a single strand DNA
<400> 124
atgccgaaca cctgcaggtg cttcaccacg 30
<210> 125
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed counter oligonucleotide for making a objective DNA domain a single strand DNA
<400> 125
atgactacca gcatgtaggc cgacgcaaac 30
<210> 126
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed counter oligonucleotide for making a objective DNA domain a single strand DNA
<400> 126
tggcacaccg cgatgtagcg gtcggctgtc 30
<210> 127
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed counter oligonucleotide for making a objective DNA domain a single strand DNA
<400> 127
cgcgcgggct gttgcagagt cttgagcggg 30
<210> 128
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed counter oligonucleotide for making a objective DNA domain a single strand DNA
<400> 128
caggcggccg cgatcatgag gcgcgagcgg 30
<210> 129
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed oligonucleotide
<400> 129
atctccagtt tggccag 17
<210> 130
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed oligonucleotide primer for PCR
<400> 130
tgagctccgt agggcgtcc 19
<210> 131
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed oligonucleotide primer for PCR
<400> 131
gcgccgggtc cgggccc 17
<210> 132
<211> 121
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amplified oligonucleotide consist of objective DNA domain ( Genbank Accession No.AC009800 76606-76726 Homo sapiens )
<400> 132
gcgccgggtc cgggcccgat gcgttggcgg gccagggctc cgagaacgag gcgttgtcca 60
tctcaacgag ggcagaggag ccggcgacct ggcgtccccc aaggacgccc tacggagctc 120
a 121
<210> 133
<211> 121
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed oligonucleotide consist of objective DNA domain ( Genbank Accession No.AC009800 76606-76726 Homo sapiens ) n=m5c
<400> 133
gngcngggtc ngggccngat gngttggngg gccagggctc ngagaangag gngttgtcca 60
tctcaangag ggcagaggag cnggngacct ggngtccccc aaggangccc tanggagctc 120
a 121
<210> 134
<211> 121
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed oligonucleotide consist of objective DNA domain ( Genbank Accession No.AC009800 76606-76726 Homo sapiens )
<400> 134
gcgccgggtc cgggcccgat gcgttggcgg gccagggctc cgagaacgag gcgttgtcca 60
tctcaacgag ggcagaggag ccggcgacct ggcgtccccc aaggacgccc tacggagctc 120
a 121
<210> 135
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed biotinated oligonucleotide for fixation
<400> 135
gacaacgcct cgttctcgg 19
<210> 136
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed counter oligonucleotide for making a objective DNA domain a single strand DNA
<400> 136
gcgtccccca aggacgccct acggagctca 30
<210> 137
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed counter oligonucleotide for making a objective DNA domain a single strand DNA
<400> 137
ctcaacgagg gcagaggagc cggcgacctg 30
<210> 138
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed counter oligonucleotide for making a objective DNA domain a single strand DNA
<400> 138
cgccgggtcc gggcccgatg cgttggcggg 30
<210> 139
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed oligonucleotide
<400> 139
ccgagaacga ggcgttgtct 20
<210> 140
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed oligonucleotide primer for PCR
<400> 140
aggtgagcta cgtgtgtttg g 21
<210> 141
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed oligonucleotide primer for PCR
<400> 141
agacatgtgc tcacgtacgg t 21
<210> 142
<211> 331
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amplified oligonucleotide consist of objective DNA domain ( Genbank Accession No.NC001139 271743-272083?Saccharomyces cereviciae chromosome VII )
<400> 142
aggtgagcta cgtgtgtttg ggcgtcgtgc actggctcac ttgtacgcgc agaaatggca 60
gcttgtacga ttggtgaccc gccttttcga cactggaccg ctatggacgt ggcggcggtg 120
tggcggcggc tcaatgacct gtggcgcccg tttgtggcgt gcgatagtcg agccgcctgt 180
cacgtgcgcg gccgccctgc tccgtttgac gcgatgcata gcatgcgacc acccagtaat 240
catactgctg acgctattgg tcacgtggtt atggcagctg ctgttgactg cggtggcgtc 300
ccgtttccac accgtacgtg agcacatgtc t 331
<210> 143
<211> 331
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed oligonucleotide consist of objective DNA domain ( Genbank Accession No.NC001139 271743-272083?Saccharomyces cereviciae chromosome VII ) n=m5c
<400> 143
aggtgagcta ngtgtgtttg ggngtngtgc actggctcac ttgtangngc agaaatggca 60
gcttgtanga ttggtgaccn gccttttnga cactggacng ctatggangt ggnggnggtg 120
tggnggnggc tcaatgacct gtggngccng tttgtggngt gngatagtng agcngcctgt 180
cangtgngng gcngccctgc tcngtttgan gngatgcata gcatgngacc acccagtaat 240
catactgctg angctattgg tcangtggtt atggcagctg ctgttgactg nggtggngtc 300
cngtttccac acngtangtg agcacatgtc t 331
<210> 144
<211> 331
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed oligonucleotide consist of objective DNA domain ( Genbank Accession No.NC001139 271743-272083?Saccharomyces cereviciae chromosome VII )
<400> 144
aggtgagcta cgtgtgtttg ggcgtcgtgc actggctcac ttgtacgcgc agaaatggca 60
gcttgtacga ttggtgaccc gccttttcga cactggaccg ctatggacgt ggcggcggtg 120
tggcggcggc tcaatgacct gtggcgcccg tttgtggcgt gcgatagtcg agccgcctgt 180
cacgtgcgcg gccgccctgc tccgtttgac gcgatgcata gcatgcgacc acccagtaat 240
catactgctg acgctattgg tcacgtggtt atggcagctg ctgttgactg cggtggcgtc 300
ccgtttccac accgtacgtg agcacatgtc t 331
<210> 145
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed biotinated oligonucleotide for fixation
<400> 145
agacatgtgc tcacgtacgg t 21
<210> 146
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed counter oligonucleotide for making a objective DNA domain a single strand DNA
<400> 146
aggtgagcta cgtgtgtttg g 21
<210> 147
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed counter oligonucleotide for making a objective DNA domain a single strand DNA
<400> 147
gcgtcgtgca ctggctcact tgtacgcgca 30
<210> 148
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed counter oligonucleotide for making a objective DNA domain a single strand DNA
<400> 148
cttgtacgat tggtgacccg ccttttcgac 30
<210> 149
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed counter oligonucleotide for making a objective DNA domain a single strand DNA
<400> 149
actggaccgc tatggacgtg gcggcggtgt 30
<210> 150
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed counter oligonucleotide for making a objective DNA domain a single strand DNA
<400> 150
ggcggcggct caatgacctg tggcgcccgt 30
<210> 151
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed counter oligonucleotide for making a objective DNA domain a single strand DNA
<400> 151
ttgtggcgtg cgatagtcga gccgcctgtc 30
<210> 152
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed counter oligonucleotide for making a objective DNA domain a single strand DNA
<400> 152
acgtgcgcgg ccgccctgct ccgtt 25
<210> 153
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed counter oligonucleotide for making a objective DNA domain a single strand DNA
<400> 153
tgacgcgatg catagcatgc gaccacccag 30
<210> 154
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed counter oligonucleotide for making a objective DNA domain a single strand DNA
<400> 154
actgctgacg ctattggtca cgtggttatg 30
<210> 155
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed counter oligonucleotide for making a objective DNA domain a single strand DNA
<400> 155
ctgctgttga ctgcggtggc gtcccgtttc 30
<210> 156
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed oligonucleotide
<400> 156
accgtacgtg agcacatgtc t 21
<210> 157
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed oligonucleotide primer for PCR
<400> 157
ggacctgtgt ttgacgggta t 21
<210> 158
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed oligonucleotide primer for PCR
<400> 158
agtacagatc tggcgttctc g 21
<210> 159
<211> 116
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amplified oligonucleotide consist of objective DNA domain ( Genbank Accession No.NC001139 384569-384685 Saccharomyces cereviciae chromosome VII )
<400> 159
ggacctgtgt ttgacgggta taacactaag ttgcgcaatt tgctgtattg cgaaatccgc 60
ccggacgata tcactcttga gcgcatgtgc cgtttccgag aacgccagat ctgtact 116
<210> 160
<211> 116
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed oligonucleotide consist of objective DNA domain ( Genbank Accession No.NC001139 384569-384685 Saccharomyces cereviciae chromosome VII ) n=m5c
<400> 160
ggacctgtgt ttgangggta taacactaag ttgngcaatt tgctgtattg ngaaatcngc 60
cnggangata tcactcttga gngcatgtgc ngtttcngag aangccagat ctgtact 116
<210> 161
<211> 116
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed oligonucleotide consist of objective DNA domain ( Genbank Accession No.NC001139 384569-384685 Saccharomyces cereviciae chromosome VII )
<400> 161
ggacctgtgt ttgacgggta taacactaag ttgcgcaatt tgctgtattg cgaaatccgc 60
ccggacgata tcactcttga gcgcatgtgc cgtttccgag aacgccagat ctgtact 116
<210> 162
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed biotinated oligonucleotide for fixation
<400> 162
agtacagatc tggcgttctc g 21
<210> 163
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed counter oligonucleotide for making a objective DNA domain a single strand DNA
<400> 163
ggacctgtgt ttgacgggta t 21
<210> 164
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed counter oligonucleotide for making a objective DNA domain a single strand DNA
<400> 164
aacactaagt tgcgcaattt gctgt 25
<210> 165
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed counter oligonucleotide for making a objective DNA domain a single strand DNA
<400> 165
attgcgaaat ccgcccggac gatat 25
<210> 166
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed counter oligonucleotide for making a objective DNA domain a single strand DNA
<400> 166
cactcttgag cgcatgtgcc gtttc 25
<210> 167
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed oligonucleotide
<400> 167
cgagaacgcc agatctgtac t 21
<210> 168
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed FITC labeled oligonucleotide
<400> 168
ctggccaaac tggagatcgc 20
<210> 169
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed FITC labeled oligonucleotide
<400> 169
agacatgtgc tcacgtacgg t 21
<210> 170
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed FITC labeled oligonucleotide
<400> 170
agtacagatc tggcgttctc g 21
Claims (22)
- 생물 유래 검체(檢體) 중에 포함되는 게놈 DNA가 갖는, 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 검출 혹은 정량하는 방법으로서,(1) 생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA 유래의 DNA 시료에 포함되는 이중 가닥(double-stranded) DNA를 단일 가닥(single-stranded) DNA로 분리하는 제1 공정,(2) (i) 제1 공정에서 분리된 단일 가닥 DNA, (ii) 메틸화 DNA 항체, 및 (iii) 상기의 메틸화 DNA 항체와 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA의 결합을 저해하지 않고 또한 상기의 단일 가닥 DNA와 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 혼합함으로써 메틸화된 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA와, 메틸화 DNA 항체와, 상기의 올리고뉴클레오티드의 복합체를 형성시키는 동시에 혹은 형성시킨 후, 당해 복합체를 분리하는 제2 공정, 및(3) 분리된 복합체에 포함되는 상기의 메틸화 DNA 항체, 또는 상기의 올리고뉴클레오티드를, 당해 메틸화 DNA 항체 또는 당해 올리고뉴클레오티드가 갖는, 검출에 이용할 수 있는 식별 기능에 의거하여 검출 혹은 정량함으로써, 생물 유래 검체 중에 포함되는 목적으로 하는 DNA 영역에서 메틸화된 DNA를 검출 혹은 정량하는 제3 공정을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 1에 있어서,제2 공정에서 혼합되는, 메틸화 DNA 항체와 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA 중에 존재하는 메틸화된 염기의 결합을 저해하지 않는 올리고뉴클레오티드로서, 2종류 이상의 올리고뉴클레오티드가 이용되는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 1에 있어서,제2 공정에서 형성되는 복합체, 또는 제2 공정의 복합체를 형성시키는 과정에서 생기는 제1 공정에서 분리된 단일 가닥 DNA와, 메틸화 DNA 항체와 목적으로 하는 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA 중에 존재하는 메틸화된 염기의 결합을 저해하지 않는 올리고뉴클레오티드의 결합체를 2가 양이온을 함유하는 반응계 중에서 형성시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 3에 있어서,2가 양이온이 마그네슘 이온인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,제2 공정에 있어서의 복합체의 분리 조작으로서, 형성된 복합체에 포함되는 메틸화 DNA 항체를 지지체에 결합시키는 공정을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,제2 공정에 있어서의 복합체의 분리 조작으로서, 형성된 복합체에 포함되는 상기의 올리고뉴클레오티드를 지지체에 결합시키는 공정을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,제1 공정의 종료 직후부터 제3 공정의 개시 직전까지의 사이에, 제1 공정에서 분리된 단일 가닥 DNA를, 적어도 1종류의 단일 가닥 DNA를 소화(消化)할 수 있는 메틸화 감수성 제한 효소에 의해 소화하는 공정을 추가적으로 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,제1 공정의 종료 직후부터 제3 공정의 개시 직전까지의 사이에, (i) 제1 공정에서 분리된 단일 가닥 DNA, 및 적어도 1종류의 메틸화 감수성 제한 효소의 인식 배열을 그 일부로서 갖는 마스킹용 올리고뉴클레오티드를 혼합하는 공정, 및 (ii) 이전 공정에 의해 얻어진 혼합물(중에 존재하는 목적으로 하는 DNA 영역에서 DNA가 메틸화되어 있지 않은 단일 가닥 DNA)을 상기의 메틸화 감수성 제한 효소에 의해 소화하는 공정을 추가적으로 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 7에 있어서,적어도 1종류의 단일 가닥 DNA를 소화할 수 있는 메틸화 감수성 제한 효소 가, 단일 가닥 DNA를 소화할 수 있는 메틸화 감수성 제한 효소인 HhaI인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 8에 있어서,적어도 1종류의 메틸화 감수성 제한 효소가, 메틸화 감수성 제한 효소인 HpaII 또는 HhaI인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,메틸화 DNA 항체가, 메틸사이토신 항체인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,생물 유래 검체가, 포유동물의 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,생물 유래 검체가, 포유동물의 혈액 또는 체액인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,생물 유래 검체가, 세포 용해액 또는 조직 용해액인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA 유래의 DNA 시료가, 당해 게놈 DNA가 갖는 목적으로 하는 DNA 영역을 인식 절단 부위로 하지 않는 제한 효소로 미리 소화 처리되어 이루어지는 DNA 시료인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서,생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA 유래의 DNA 시료가, 적어도 1종류의 메틸화 감수성 제한 효소로 소화 처리되어 이루어지는 DNA 시료인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서,생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA 유래의 DNA 시료가, 특정 마스킹용 올리고뉴클레오티드를 첨가한 후에, 적어도 1종류의 메틸화 감수성 제한 효소로 소화 처리되어 이루어지는 DNA 시료인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 16 또는 청구항 17에 있어서,적어도 1종류의 메틸화 감수성 제한 효소가, 메틸화 감수성 제한 효소인 HpaII 또는 HhaI인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서,생물 유래 검체 중에 포함되는 게놈 DNA 유래의 DNA 시료가, 미리 정제되어 이루어지는 DNA 시료인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서,게놈 DNA가 갖는 목적으로 하는 DNA 영역이, 적어도 1종류의 메틸화 감수성 제한 효소가 인식하는 절단 부위를 갖는 DNA 영역인 것을 특징으로 하는, 방법
- 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 있어서,제1 공정에서 게놈 DNA 유래의 DNA 시료에 포함되는 이중 가닥 DNA를 단일 가닥 DNA로 분리할 때에, 카운터 올리고뉴클레오티드를 첨가하는, 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 있어서,제1 공정에서의, 게놈 DNA 유래의 DNA 시료에 포함되는 이중 가닥 DNA의 단일 가닥 DNA로의 분리가, 2가 양이온 혹은 마그네슘 이온을 함유하는 반응계 중에서 행해지는, 방법.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4775619A (en) * | 1984-10-16 | 1988-10-04 | Chiron Corporation | Polynucleotide determination with selectable cleavage sites |
| US5030557A (en) * | 1987-11-24 | 1991-07-09 | Ml Technology Venture | Means and method for enhancing nucleic acid hybridization |
| US5203993A (en) * | 1991-10-29 | 1993-04-20 | Electrostat Technologies, Inc. | Method and apparatus for removing salt from sea water |
| US5681697A (en) * | 1993-12-08 | 1997-10-28 | Chiron Corporation | Solution phase nucleic acid sandwich assays having reduced background noise and kits therefor |
| US6265556B1 (en) * | 1994-12-02 | 2001-07-24 | The Burnham Institute | Nucleic acid encoding CD40 associated proteins |
| CA2248981C (en) * | 1996-03-15 | 2009-11-24 | The Penn State Research Foundation | Detection of extracellular tumor-associated nucleic acid in blood plasma or serum using nucleic acid amplification assays |
| US6203993B1 (en) * | 1996-08-14 | 2001-03-20 | Exact Science Corp. | Methods for the detection of nucleic acids |
| FR2755149B1 (fr) * | 1996-10-30 | 1999-01-15 | Pasteur Institut | Procede de diagnostic de maladies genetiques par peignage moleculaire et coffret de diagnostic |
| JPH10253632A (ja) * | 1997-03-10 | 1998-09-25 | Nissui Pharm Co Ltd | 分析方法、キット及び装置 |
| US6605432B1 (en) * | 1999-02-05 | 2003-08-12 | Curators Of The University Of Missouri | High-throughput methods for detecting DNA methylation |
| DE10056802B4 (de) * | 2000-11-14 | 2005-06-16 | Epigenomics Ag | Verfahren zur Detektion von Methylierungszuständen zur toxikologischen Diagnostik |
| US6756200B2 (en) * | 2001-01-26 | 2004-06-29 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Aberrantly methylated genes as markers of breast malignancy |
| WO2002101353A2 (en) * | 2001-06-08 | 2002-12-19 | U.S. Genomics, Inc. | Methods and products for analyzing nucleic acids based on methylation status |
| US7081336B2 (en) * | 2001-06-25 | 2006-07-25 | Georgia Tech Research Corporation | Dual resonance energy transfer nucleic acid probes |
| US20030152950A1 (en) * | 2001-06-27 | 2003-08-14 | Garner Harold R. | Identification of chemically modified polymers |
| US6927028B2 (en) * | 2001-08-31 | 2005-08-09 | Chinese University Of Hong Kong | Non-invasive methods for detecting non-host DNA in a host using epigenetic differences between the host and non-host DNA |
| EP2722395B1 (en) * | 2001-10-15 | 2018-12-19 | Bioarray Solutions Ltd | Multiplexed analysis of polymorphic loci by concurrent interrogation and enzyme-mediated detection |
| WO2003064700A2 (en) * | 2002-01-30 | 2003-08-07 | Epigenomics Ag | Identification of cell differentiation states based on methylation patterns |
| EP1534752B1 (en) * | 2002-05-01 | 2011-08-03 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies that specifically bind to chemokine beta-4 |
| US7442506B2 (en) * | 2002-05-08 | 2008-10-28 | Ravgen, Inc. | Methods for detection of genetic disorders |
| EP1604013A4 (en) * | 2003-03-17 | 2009-02-11 | Univ Johns Hopkins | METHYL GENES ABERRANTY IN PANCREATIC CANCER |
| US20060134609A1 (en) * | 2003-04-17 | 2006-06-22 | Linnen Jeffrey M | Compositions and methods for determining the presence of SARS coronavirus in a sample |
| EP1723256B1 (en) * | 2004-02-18 | 2010-04-14 | Centre for Addiction and Mental Health | CpG-AMPLICON AND ARRAY PROTOCOL |
| WO2005080565A1 (ja) * | 2004-02-20 | 2005-09-01 | Japan Science And Technology Agency | Ｄｎａメチル化分析用ｄｎａアレイ及びその製造方法並びにｄｎａメチル化分析方法 |
| US20060292600A1 (en) * | 2004-03-10 | 2006-12-28 | Corixa Corporation | Methods, compositions and kits for the detection and monitoring of lung cancer |
| US20050233340A1 (en) * | 2004-04-20 | 2005-10-20 | Barrett Michael T | Methods and compositions for assessing CpG methylation |
| WO2005111243A2 (en) * | 2004-05-07 | 2005-11-24 | Cepheid | Multiplexed detection of biological agents |
| US20100273151A1 (en) * | 2004-05-28 | 2010-10-28 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Genome-wide analysis of palindrome formation and dna methylation |
| AU2005308918B2 (en) * | 2004-11-29 | 2012-09-27 | Sequenom, Inc. | Means and methods for detecting methylated DNA |
| US9249464B2 (en) * | 2004-11-29 | 2016-02-02 | Sequenom, Inc. | Kits and methods for detecting methylated DNA |
| US20070092883A1 (en) * | 2005-10-26 | 2007-04-26 | De Luwe Hoek Octrooien B.V. | Methylation specific multiplex ligation-dependent probe amplification (MS-MLPA) |
| US20070292866A1 (en) * | 2005-12-08 | 2007-12-20 | Ambergen, Inc. | Diagnosing human diseases by detecting DNA methylation changes |
| US7906288B2 (en) * | 2006-01-04 | 2011-03-15 | The Johns Hopkins University | Compare-MS: method rapid, sensitive and accurate detection of DNA methylation |
| WO2007095493A2 (en) * | 2006-02-10 | 2007-08-23 | Applera Corporation | Systems and methods for methylation prediction |
| WO2007119518A1 (ja) * | 2006-03-28 | 2007-10-25 | The University Of Tokyo | 抗メチル化dna抗体及びその作製方法 |
| US20080003609A1 (en) * | 2006-05-10 | 2008-01-03 | The Cleveland Clinic Foundation | Method of detecting bladder urothelial carcinoma |
| EP1914320A3 (en) * | 2006-10-16 | 2009-02-11 | Epigenomics AG | A method for detection of one or more CpG positions |
| US20080102452A1 (en) * | 2006-10-31 | 2008-05-01 | Roberts Douglas N | Control nucleic acid constructs for use in analysis of methylation status |
| WO2008156536A1 (en) * | 2007-06-20 | 2008-12-24 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Methods for determining cytosine methylation in dna and uses thereof |
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| US7939546B2 (en) * | 2007-10-12 | 2011-05-10 | Supergen, Inc. | Quinoline derivatives for modulating DNA methylation |
| EA201000910A1 (ru) * | 2007-11-30 | 2011-04-29 | Бристоль-Мейерз Сквибб Компани | Конъюгат "моноклональное антитело против в7н4/лекарственное средство" и способы его применения |
| US7608402B2 (en) * | 2008-01-10 | 2009-10-27 | Weiwei Li | DNA methylation specific signal amplification |
| US8242243B2 (en) * | 2008-05-15 | 2012-08-14 | Ribomed Biotechnologies, Inc. | Methods and reagents for detecting CpG methylation with a methyl CpG binding protein (MBP) |
| US8361746B2 (en) * | 2008-07-24 | 2013-01-29 | Brookhaven Science Associates, Llc | Methods for detection of methyl-CpG dinucleotides |
| WO2010098866A1 (en) * | 2009-02-27 | 2010-09-02 | Supergen, Inc. | Cyclopentathiophene/cyclohexathiophene dna methyltransferase inhibitors |
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