WO2009151150A1 - Ｄｎａを定量又は検出する方法 - Google Patents

Ｄｎａを定量又は検出する方法 Download PDF

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WO2009151150A1
WO2009151150A1 PCT/JP2009/061068 JP2009061068W WO2009151150A1 WO 2009151150 A1 WO2009151150 A1 WO 2009151150A1 JP 2009061068 W JP2009061068 W JP 2009061068W WO 2009151150 A1 WO2009151150 A1 WO 2009151150A1
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dna
solution
seq
buffer
antibody
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PCT/JP2009/061068
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冨ヶ原祥隆
佐藤日出夫
樽井弘和
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住友化学株式会社
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for quantifying or detecting DNA having a target DNA region.
  • a DNA synthesis chain reaction (Polymerase Chain Reaction; hereinafter, )
  • a fluorescently labeled oligonucleotide to the target DNA region of the sample.
  • detection for example, J. Cataract. Refract.
  • An object of the present invention is to provide a method for easily quantifying or detecting DNA having a target DNA region.
  • a method for quantifying or detecting DNA having a target DNA region contained in a specimen comprising:
  • a single-stranded methylated DNA is prepared from the DNA treated in the second step, and a detection oligonucleotide is bound to the single-stranded methylated DNA to obtain a test DNA complex.
  • DNA, synthetic oligonucleotide, or purified in advance which is obtained by first digesting the DNA having the target DNA region obtained in the first step with a restriction enzyme that does not use the target DNA region as a recognition cleavage site
  • the detection oligonucleotide comprises a nucleotide sequence capable of complementarily binding to a repetitive sequence in the human genome, a nucleotide sequence of a duplicate gene or a pseudogene or a part thereof.
  • the concentration of sodium salt in the solution used in the DNA extraction operation for preparing DNA from the specimen in the first step is 10 OmM or more and 100 OmM or less, according to any one of Inventions 1 to 12. Method.
  • a method for selecting a specimen derived from a cancer patient, and a method for quantifying or detecting DNA quantified or detected using a specimen derived from a subject by the method according to any one of Inventions 1 to 14, and the same method If there is a significant difference between the quantification results or detection results of DNA quantified or detected using a sample from a healthy person, the subject-derived sample is evaluated as a cancer patient-derived sample.
  • a method comprising the step of identifying a specimen derived from a cancer patient based on the result of.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of Example 1 using 0.5 ⁇ g L of piotin-labeled methylcytosine antibody and 5′-end FITC-labeled oligonucleotide F1.
  • solution A (10 ng / 10 iL TE buffer solution)
  • solution B (1 ng / 10 ⁇ buffer solution)
  • solution C (0.1 ng / 10 ⁇ L TE buffer solution)
  • solution D (0
  • the value obtained by measuring the DNA amount by absorbance (45 nm) is shown.
  • FIG. 2 shows the results obtained in Example 2 using 0.5 ⁇ g / mL of a piotine-labeled methylcytosine antibody and 5′-end FITC-labeled oligonucleotide F1.
  • solution MA (10 ng each / 20 ⁇ buffer solution), solution MB (1 ng each / 20 TE buffer solution), solution MC (0.1 ng each / 20 ⁇ TE buffer solution), solution MD (0 ng Each / 20 ⁇ L TE buffer solution (negative control solution)) shows the value obtained by measuring the amount of DNA by absorbance (45 nm).
  • FIG. 1 10 ng each / 20 ⁇ buffer solution
  • solution MB (1 ng each / 20 TE buffer solution
  • solution MC 0.1 ng each / 20 ⁇ TE buffer solution
  • solution MD (0 ng Each / 20 ⁇ L TE buffer solution (negative control solution)
  • Example 3 shows the results obtained in Example 3 using 0.5 ⁇ g / ml L of a cytosine-labeled methylcytosine antibody and 5′-end FITC-labeled oligonucleotide F2.
  • Solution MA (10 ng each / 20 ⁇ buffer solution)
  • Solution MB (1 ng each / 20 jL TE buffer solution
  • Solution MC 0.1 ng each / 20 ⁇ buffer solution
  • Solution MD For each of (0 ng each / 20 ⁇ TE buffer solution (negative control solution)), the amount of DNA measured by absorbance (45 nm) is shown.
  • Example 4 shows the results obtained in Example 4 using the biotin-labeled methylcytosine antibody 0.5 ⁇ g / mL and the 5′-end FITC-labeled oligonucleotides F1 and F2. From right to right, solution MA (10 ng each / 20 ⁇ L TE buffer solution), solution MB (1 ng each / 20 ⁇ TE buffer solution), solution MC (0.1 ng each / 20 ul TE puff) 1) and MD (0 ng each / 20 ⁇ L TE buffer solution (negative control solution)), the amount of DNA measured by absorbance (450 nm) is shown.
  • FIG. 5 is a view showing the results obtained in Example 5 using 0.5 ⁇ g / mL of the piotine-labeled methylcytosine antibody and the 5′-end FITC-labeled oligonucleotide F3. From right to right, solution A (10 ng / 10 ill TE buffer solution), solution B (1 ng / 10 1 1 buffer solution), solution C (0.1 ng / 10 ⁇ TE buffer solution), solution D (0 ng / 10 For each ⁇ L TE buffer solution (negative control solution)), the amount of DNA measured by absorbance (450 nm) is shown.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of Example 6 using 0.5 ⁇ g / ml L of a cytosine labeled antibody and 5′-end FITC-labeled oligonucleotide F3. From right to right, Solution MA (10 ng each / 20 ⁇ buffer solution), Solution MB (1 ng each / 20 ⁇ TE buffer solution), Solution MC (0 ng each / 20 ⁇ TE buffer solution (negative control solution) ), The amount of DNA measured by absorbance (450 nm) is shown.
  • FIG. 7 is a view showing the results obtained in Example 7 using 0.5 ⁇ g / ml L of a cytosine-labeled methylcytosine antibody and 5′-end FITC-labeled oligonucleotides F3 and F4. From right to right, Solution MA (10 ng each / 20 ⁇ buffer solution), Solution MB (1 ng each / 20 ⁇ TE buffer solution), Solution MC (0 ng each / 20 ⁇ TE buffer solution (negative control solution) ), The amount of DNA measured by absorbance (4 5 Onm) is shown.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of Example 8 using 0.5 g / mL of a piotine-labeled methylcytosine antibody and a 5′-terminal FITC-labeled oligonucleotide F5. From right to right, solution A (100 ng / 5 ⁇ TE buffer solution), solution B (10 ng / 5 jL TE buffer solution), solution C (l ng / 5 ⁇ TE buffer solution), solution D (0 ng / For each of the 5 L TE buffer solutions (negative control solution), the amount of DNA measured by absorbance (45 Onm) is shown.
  • FIG. 9 shows the biotin-labeled methylcytosine antibody 0.5 / ig / mL in Example 9.
  • Figure 5 shows the results of using the terminal FITC-labeled oligonucleotide F6. From right to right, solution A (100 ng / 5 ⁇ 1 ⁇ buffer solution), solution ⁇ (10 ng / 5 ⁇ buffer solution), solution C (l ng / 5 ⁇ TE buffer solution), solution D (0 ng / 5 For each of the TE buffer solutions (negative control solution)), the DNA amount is measured by absorbance (450 nm).
  • FIG. 10 shows the results obtained in Example 10 using a biotin-labeled methylcytosine antibody of 0.5 ⁇ g / mL and a 5, terminal FITC-labeled oligonucleotide F3.
  • solution A (10 ng / 10 ⁇ buffer solution), solution ⁇ (1 ng / 10 ⁇ L buffer solution), solution C (0.1 ng / 10 ⁇ L TE buffer solution), solution D ( For each of 0 ng / 10 / L TE buffer solution (negative control solution)), the value obtained by measuring the DNA amount by absorbance (450 nm) is shown.
  • FIG. 11 shows the results obtained in Example 11 using the biotin-labeled methylcytosine antibody 0.5 ⁇ g / mL and the terminal FITC-labeled oligonucleotide F3.
  • Solution MA (10 ng each / 20 ⁇ buffer solution), Solution MB (1 ng each / 20 ⁇ L buffer solution), Solution MC (0 ng each / 20 ⁇ L TE buffer solution (negative control) (Liquid))
  • FIG. 12 shows the results of Example 12 using the biotin-labeled methylcytosine antibody 0.5 g / mL and the 5-terminal FITC-labeled oligonucleotide F4. From right to right, solution MA (10 ng each / 20 ⁇ TE buffer solution), solution MB (1 ng each / 20 ⁇ TE buffer solution), solution MC (0 ng each / 20 ⁇ TE buffer solution (negative control solution)) For each of these, the amount of DNA measured by absorbance (45 Onm) is shown.
  • FIG. 13 shows the results of Example 13 using piotin-labeled methylcytosine antibody 0.5 ⁇ g / L and 5 terminal FITC-labeled oligonucleotides F3 and F4. From right to right, solution MA (10 ng each / 20 ⁇ TE buffer solution), solution MB (1 ng each / 20 ⁇ TE buffer solution), solution MC (0 ng each / 20 ⁇ TE buffer solution) (negative) For each of the control solutions Shown is the value measured at (4 5 O nin).
  • FIG. 14 shows the results obtained in Example 14 using 0.5 ⁇ g / mL of the thiotin-labeled methylcytosine antibody and 5, and the terminal FITC-labeled oligonucleotide F5.
  • solution A 100 ng / 5 ⁇ buffer solution
  • solution ⁇ 10 ng / 5 ⁇ buffer solution
  • solution C (1 ng / 5 ⁇ L TE buffer solution)
  • solution D 0.
  • the amount of DNA measured by absorbance (4500 mn) is shown.
  • FIG. 15 shows the results obtained in Example 15 using 0.5 ⁇ g / L of the piotin-labeled methylcytosine antibody and the 5, terminal FITC-labeled oligonucleotide F6. From right to right, solution A (100 ng / 5 ⁇ TE buffer solution), solution B (10 ng / 5 L TE buffer solution), solution C (l ng / 5 ⁇ TE buffer solution), solution D (0 ng For each / 5 ⁇ L TE buffer solution (negative control solution), the amount of DNA measured by absorbance (4500 mn) is shown.
  • FIG. 16 is a diagram showing the results of performing DNA detection using biotin-labeled methylcytosine antibody and 5′-end FITC-labeled oligonucleotide F6 after treatment 1 in Example 16; From right to right, solution A (10 ng / 10 rat serum solution), solution ⁇ (1 ng / 10 rat serum solution), solution C (0.1 ng / 10 rat serum solution), solution D (rat serum (negative control) For each of the liquids)), the absorbance (450 nm) is shown.
  • FIG. 17 is a diagram showing the results of performing DNA detection using biotin-labeled methylcytosine antibody and 5′-end FITC-labeled oligonucleotide F6 after treatment 2 in Example 16; From right to right, solution A (10 ng / 10 rat serum solution), solution ⁇ (1 ng / 10 rat serum solution), solution C (0.1 ng / 10 rat serum solution), solution D (rat serum (negative control) For each of the liquids)), the absorbance (450 nm) is shown.
  • FIG. 18 is a diagram showing the results of detection of DNA using the piotin-labeled methylcytosine antibody 5 ′ end FITC-labeled oligonucleotide F6 in Example 17; From right to right, solution A (4 ng / 40 human serum solution), solution ⁇ (2 ng / 40 human serum solution) ), Solution C (1 ng / 40 human serum solution), and solution D (human serum (negative control solution)), the absorbance (450 nm) values are shown.
  • FIG. 19 is a diagram comparing the results of detection using biotin-labeled methylcytosine antibody and 5-terminal FITC-labeled oligonucleotide F6 in Example 18 with the results of quantification by real-time PCR.
  • the detection results are plotted on the vertical axis and the quantification results by real-time PCR are plotted on the horizontal axis.
  • the straight line in the graph shows the regression line (thick line) and the standard error range (thin line).
  • Figure 20 shows the results of detection of DNA using a biotin-labeled methylcytosine antibody 5 and terminal FITC-labeled oligonucleotide F6 in a human serum sample of 57 years of age or younger in Example 18 The plots were divided into healthy subjects and averages and standard deviations for each.
  • the “specimen” in the method of the present invention includes: (a) mammal-derived blood, body fluid, urine, body secretion, cell lysate or tissue lysate; (b) mammal-derived blood, body fluid, urine, body secretion DNA extracted from one selected from the group consisting of lysate, cell lysate and tissue lysate, ( c ) extracted from one selected from the group consisting of mammal-derived tissue, cells, tissue lysate and cell lysate (NA) extracted from bacteria, fungi or virus, (f) DNA prepared from RNA extracted from bacteria, fungus or virus , Etc.
  • tissue has a broad meaning including blood, lymph nodes, and the like.
  • “Mammals” are animals classified into the animal kingdom Chordidae vertebrate submammary (Mammalia), specifically humans, monkeys, marmoset, guinea pigs, rats, mice, tusks, and hidges. , Inu, cats and the like.
  • Body fluid is a fluid that exists between cells that constitute an individual, and specifically includes plasma and interstitial fluid. In many cases, it functions to maintain the homeostasis of an individual. More specifically , Lymph fluid, tissue fluid (interstitial fluid, intercellular fluid, interstitial fluid), body cavity fluid, serosal fluid, pleural effusion, ascites, pericardial fluid, cerebrospinal fluid (spinal fluid), synovial fluid (synovial fluid), eye chamber Water (aqueous humor), cerebrospinal fluid, and the like.
  • Body secretion refers to secretions from exocrine glands, specifically saliva, gastric juice, bile, knee fluid, intestinal juice, sweat, tears, nasal discharge, semen, sputum, amniotic fluid, milk, etc. Can be mentioned.
  • specimen is human blood, body fluid, or body secretions
  • samples collected for clinical examinations in human periodic health examinations can be used.
  • a lysate containing an intracellular solution obtained by disrupting cells cultured on a cell culture plate or the like for example, a cell line, a primary cultured cell, or a blood cell, etc.
  • Examples of the method for destroying cells include a method using ultrasonic waves, a method using a surfactant, and a method using an alkaline solution.
  • a commercially available kit or the like may be used.
  • deoxysholate 0.1% SDS, 0.004% sodium azide
  • 0.1% SDS 0.1% sodium azide
  • tissue lysate a lysate containing intracellular fluid obtained by disrupting cells in tissues collected from animals such as mammals is fisted.
  • the tissue is cut into small pieces using a force razor or the like. If frozen tissue is used, it should be smaller.
  • ice-cold RIPA buffer at a ratio of 3 mL / lg of tissue and homogenize at 4 ° C.
  • a protease inhibitor, a phosphatase inhibitor, etc. may be added to the RIPA buffer, for example, 1/10 volume of 10 mg / mL PMSF of RIPA buffer may be added.
  • a soaker or a pressurized cell disrupter is used for homogenization work, keep the homogenizing solution at 4 ° C at all times to reduce heat generation.
  • the sample may be artificially synthesized DNA.
  • the “target DNA region” (hereinafter sometimes referred to as the target region) in the method of the present invention is a DNA region to be detected or quantified by the method of the present invention, among the DNA contained in the sample.
  • the target DNA region is indicated by the nucleotide sequence on the DNA when the sample is DNA.
  • the target DNA region is indicated by the base sequence on the DNA prepared from RNA by reverse transcriptase, and the complementary base of the predetermined base sequence to be detected on RNA. Is an array.
  • the target region when cytosine is methylated for detection or quantification, the target region preferably contains cytosine or a region rich in CpG described later.
  • the first step is to prepare DNA from the sample to be detected in the target DNA region. This is a process.
  • the DNA prepared in the first step includes, for example, a DNA sample previously digested with a restriction enzyme that does not use the target DNA region of the DNA as a recognition cleavage site, a DNA sample purified in advance, blood Free DNA in the medium, DNA NA derived from the microbial genome, and DNA produced by reverse transcriptase from the RNA in the sample.
  • Examples of DNA prepared in the first step include DNA synthesized and artificially synthesized based on the genetic information of the specimen.
  • plasma or serum is prepared from blood according to a conventional method, and the prepared plasma or serum is used as a specimen, and free DNA contained therein (cancer cells such as gastric cancer cells).
  • cancer cells such as gastric cancer cells.
  • Analysis of DNA derived from cancer cells such as gastric cancer cells by avoiding DNA derived from blood cells, and cancer cells such as gastric cancer cells, tissues containing them, etc. Sensitivity for detection can be improved.
  • DNA prepared in the first step includes reverse transcription from DNA derived from bacteria such as Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria, microorganisms such as fungi, viruses and pathogenic protozoa, and RNA derived from these microorganisms. Mention may be made of DNA obtained with enzymes.
  • Mycoplasma ge talium Mycoplasma pneumoniae ⁇ Borrelia burgdorferi B31, Rickettsia pro azeKii Treponema Chlamydia trachomatis, Helicobacter pylori J "99 , Helicobacter pylori 26695, Haemophilus influenzae Rd, Mycobacterium tuberculosis H37Rv, Pseudomonas aeruginosa ⁇ Legionella pneumophila ⁇ Serratia marcescens, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella enterica ⁇ Campylobacter jejuni subsp.
  • herpesvirus 5 Epstein-Barr virus, Human Immunodeficiency Virus, Human Papilloma Virus, Enterovirus ⁇ Norovirus Influenza Virus, Toxoplasma gondii Cryptosporidium parvum and Entamoeba histolytica genomic DNA or RNA can be used for detection of infection-causing bacteria in samples or food poisoning-causing bacteria in foods.
  • genomic DNA for example, when the specimen is a mammal-derived sample, a commercially available DNA extraction kit (Genfind v2 Kit (Beckman Coulter), FastPure DNA Kit (Takara Bio Inc.)) ) Etc. can be used.
  • genomic DNA can be prepared by a general yeast genome preparation method, as described in Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory Press).
  • a prokaryote such as Otsuki fungus
  • a general method for preparing a microbial genome as described in Molecular Cloning A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press) can be used.
  • DNA may be prepared after separating microorganisms from the food, or genomic DNA other than microorganisms contained in food and a microorganism-derived genome may be obtained simultaneously.
  • RNA extraction kit (IS0GEN (311-02501) (manufactured by NIPPON GENE) ) Or RNA extraction using FastRNA Pro Green Kit (Funakoshi), FastRNA Pro Blue Kit (Bunakoshi), FastRNA Pro Red Kit (Funakoshi), etc.) You may obtain DNA by In addition, when the specimen is a mammal-derived specimen, viral DNA may be extracted after extracting viral particles, or a commercially available kit (QuickGene RNA tissue kit SII, Fuji The virus RNA may be extracted using a film or the like, and the virus-derived DNA may be obtained by reverse transcriptase.
  • RNA may be extracted from virus-infected tissues and virus-derived DNA may be obtained using reverse transcriptase. Alternatively, virus-derived DNA may be obtained from virus-infected tissues. .
  • virus-derived DNA may be obtained from virus-infected tissues.
  • a commercially available kit Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit, manufactured by Roche Diagno Stake Co.
  • methylated DNA any of the four types of bases that make up a gene (genomic DNA) is methylated. For example, in mammals, a base sequence represented by 5, 1 CG-3 ′ (C represents cytosine, G represents guanine.
  • C pG the base sequence
  • cytosine methylation site is at position 5.
  • Cytosine in C p GJ is also methylated in the DNA strand that is instantly born by the action. This cytosine methylation is complementary to C p G containing methylated cytosine in the DNA strand derived from the parent cell.
  • CpG pair means a double-stranded DNA consisting of a base sequence represented by CpG and a complementary CpG bound thereto.
  • Single-stranded methylated DNA is single-stranded DNA in which the 5-position of cytosine in the base sequence indicated by 5 and 1 CG-3 in the base sequence of single-stranded DNA is methylated. .
  • target DNA region examples include Lysyl oxidase, HRAS-like suppressor, bA305P22.2.1, Gamma filamin, HA Dl, Homologue of RIKEN
  • methylated DNA of the “target DNA region” may be individually detected or quantified. For example, in one detection system, The detection of methyl-depleted DNA in the “target DNA region” improves the quantitative accuracy and detection sensitivity accordingly.
  • the useful protein gene is a Lysyl oxidase gene
  • the base sequence containing one or more CpGs present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) As an example, the base sequence of genomic DNA containing exon 1 of the human lysyl oxidase gene and its promoter region located upstream of the gene can be mentioned. More specifically, SEQ ID NO: 1 The base sequence shown (corresponds to the base sequence shown by base numbers 16001 to 18661 of the base sequence described in Genbank Accession No. AF270645).
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 the ATG codon encoding the methionine at the amino terminal of the Lysyl oxidase protein derived from human is represented by nucleotide numbers 2031 to 203'3.
  • the nucleotide sequence of the exon 1 is Base numbers 1957 to 2661 are shown.
  • the useful protein gene is an HRAS-like suppressor gene
  • C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region)
  • the nucleotide sequence included above includes the genomic DNA sequence containing exon 1 of the HRAS-like suppressor gene derived from human, its 5 promoter region located upstream, and more specifically, Is the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (base number 172001- of the base sequence described in Genbank Accession No. AC068162; corresponding to the base sequence represented by L73953).
  • nucleotide sequence of exon 1 of the human-derived HRAS-like suppressor gene is represented by nucleotide numbers 1743 to 1953. More specifically, for example, when the useful protein gene is a bA305P22.2.1 gene, CpG present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) is identified.
  • the base sequence containing at least one gene includes a human-derived bA305P22.2.1 gene exon 1 and its 5 promoter region located upstream.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 (the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 13001 to 13889 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AL121673) ).
  • the ATG codon that codes for the amino acid at the amino terminal of bA305P22.2.1 protein derived from human is shown in base numbers 849 to 851, and the base of exon 1 above is shown.
  • the sequence is shown in base numbers 663-889. More specifically, for example, when the useful protein gene is a Gamma filamin gene, one C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) is used.
  • nucleotide sequence examples include the nucleotide sequence of genomic DNA containing exon 1 of the human-derived Gamma filamin gene and its 5, promoter region located upstream, more specifically, the sequence And the nucleotide sequence represented by No. 4 (corresponding to the complementary sequence of the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 63528 to 64390 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AC074373).
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 the ATG codon encoding the methionine at the amino terminal of human-derived Gamma filamin protein is represented by base numbers 572 to 574, and the base sequence of the above exon 1 is It is shown in base numbers 463-863.
  • C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) is 3 or more.
  • the nucleotide sequence to be included include the base sequence of genomic DNA containing etason 1 of the HAND1 gene derived from human and its 5, promoter region located upstream. More specifically, 5 (corresponding to a complementary sequence of the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 24303 to 26500 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AC026688).
  • the ATG codon that encodes the amino-terminal methione of human-derived HA D1 protein is represented by base numbers 1656 to 1658, and the base sequence of exon 1 is base The numbers 00-2198 are shown.
  • the useful protein gene is the Homologue of RIKEN 2210016F16 gene
  • one C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) is used.
  • the nucleotide sequence included above include the nucleotide sequence of genomic DNA containing exon 1 of the human-derived Homologue of RIKEN 2210016F16 gene, 5, and a promoter region located upstream. Is a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 (Genbank Accession
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 the nucleotide sequence of exon 1 of the human-derived Homologue of RIKEN 2210016F16 protein is represented by nucleotide numbers 1392 to 1945.
  • sequences include the genomic DNA base sequence containing exon 1 of human-derived FLJ32130 gene, its 5, promoter region located upstream, and more specifically, represented by SEQ ID NO: 7. (Corresponding to a complementary base sequence of the base sequence represented by base numbers 1 to 2379 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC002310).
  • SEQ ID NO: 7 corresponds to a complementary base sequence of the base sequence represented by base numbers 1 to 2379 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC002310).
  • the ATG codon that codes for the methionine at the amino acid terminal of the FLJ32130 protein derived from human is shown in base numbers 2136 to 2138, and the base sequence considered as exon 1 is Base numbers 2136 to 2379.
  • the useful protein gene is a PPARG angiopoietin-related protein gene
  • CpG present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) is identified.
  • the nucleotide sequence including two or more include the DNA sequence of genomic DNA containing exon 1 of the human-derived PPARG angiopoietin-related protein gene and part 5, the promoter region located upstream. More specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 can be mentioned.
  • the ATG codon encoding the amino acid methionine at the amino terminal of the human-derived PPARG angiopoietin-related protein protein is represented by base numbers 717 to 719.
  • the base sequence of the side part is shown in base numbers 1957 to 2661. More specifically, for example, when the useful protein gene is a Thrombomodulin gene, one C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) is used.
  • the base sequence of genomic DNA containing exon 1 of the Thrombomodulin gene and the promoter region located 5 ′ upstream thereof can be mentioned. More specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 (Genbank Accession No. Corresponding to the base sequence represented by the base numbers 1 to 6096 of the base sequence described in AF495471. In the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9, the ATG codon encoding the amino acid at the amino terminal of the human Thrombomodulin protein is represented by nucleotide numbers 2590 to 2592. The nucleotide sequence of exon 1 is Base numbers 2048-6096.
  • the useful protein gene is p53-responsive gene 2 gene
  • CpG present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) is selected.
  • the base sequence containing one or more include the base sequence of genomic DNA containing exon 1 of human-derived p53-responsive gene 2 gene and a promoter region located 5 'upstream thereof.
  • a base sequence represented by SEQ ID NO: 10 (corresponding to a complementary sequence of the base sequence represented by base numbers 113501 to 116000 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC009471) can be mentioned.
  • the base sequence of exon 1 of the human-derived p53-responsive gene 2 gene is represented by base numbers 1558 to 1808. More specifically, for example, when the useful protein gene is Fibrillin2 gene, it contains one or more CpG present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region). Examples of the base sequence include the base sequence of genomic DNA containing exon 1 of human-derived Fibrillin2 gene and its promoter region located upstream of it, and more specifically, SEQ ID NO: 1 1 (Corresponding to a complementary sequence of the base sequence represented by base numbers 118801 to 121000 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC113387).
  • nucleotide sequence U of exon 1 of Fibrillin gene derived from human is represented by nucleotide numbers 1091 to 1345. More specifically, for example, when the useful protein gene is a Neurofilaments gene, one or more CpGs present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) are included. As a base sequence to include, derived from human
  • the base sequence of the genomic DNA containing exon 1 of the Neurofilaments gene and the promoter region located 5 'upstream thereof can be mentioned. More specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 (Genbank Accession No. AF106564 corresponds to a complementary sequence of the base sequence represented by base numbers 28001 to 30000 of the base sequence described in No. AF106564. In the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12, the nucleotide sequence of exon 1 of the human-derived Neurofilaments gene is represented by nucleotide numbers 614 to 1694. Specifically, for example, useful protein genes are disintegrin and
  • the human base lj containing one or more C p G present in the base sequence of the promoter region, non-translation region or translation region (coding region) is human.
  • the nucleotide sequence of genomic DNA containing exon 1 of the disintegrin and metalloproteinase domain 23 gene, 5 and its upstream promoter region can be given. More specifically, SEQ ID NO: 13 (Corresponding to the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 21001 to 23300 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AC009225).
  • the salt represented by SEQ ID NO: 1 3 Basically, the base sequence of exon 1 of human-derived disintegrin and metalloproteinase domain 23 gene is shown in base numbers 1194 to 1630. Specifically, for example, when the useful protein gene is a G protein-coupled receptor 7 gene, C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • a base sequence containing one or more of the above there can be mentioned a base sequence of genomic DNA containing exon 1 of a G protein-coupled receptor 7 gene derived from human, and a promoter region located upstream thereof, More specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 (corresponding to the base sequence represented by base numbers 75001 to 78000 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC009800) can be mentioned.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14 the nucleotide sequence of exon 1 of the G protein-coupled receptor 7 gene derived from human is represented by nucleotide numbers 1666 to 2652.
  • a useful protein gene is G-protein coupled.
  • the base sequence containing one or more of the above is a genomic DNA containing the human G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor gene exon 1 and a promoter region located 5 'upstream thereof. More specifically, the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 (complementary to the base sequence shown in base numbers 57001 to 60000 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC008971) Corresponds to an array. ⁇ ⁇ 1 (SEQ ID NO: 15) The human G-protein coupled somatostatin and
  • angiotensin-like peptide rec mark The base sequence of exon 1 of the tor gene in base numbers 776 to 2632.
  • a useful protein gene is Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2
  • a human-derived Solute carrier family D neurotransmitter transporter noradrenalin is a base sequence containing one or more CpGs present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translation region (coding region).
  • the base sequence of genomic DNA containing exon 1 of member 2 and its child, 5 and its upstream promoter region can be mentioned.
  • the second step is a process in which the DNA prepared in the first step is treated with DNA methylase.
  • DNA methylase is an enzyme that methylates a base in DNA, and various DNA methylases have been isolated from mammalian cells, bacteria, and the like. DNA methylenzymes are classified into multiple types, such as adenine methylase and cytosine methylase, depending on the type of substrate base. Cytosine methylase is an enzyme that recognizes a specific sequence in the DNA base sequence and methylates cytosine in the vicinity of that sequence. Cytosine methylases differ depending on the base sequence to be recognized.
  • restriction modification system is a method that prevents the digestion by a restriction enzyme that recognizes a specific sequence (restriction endonuclease) by periodically methylating the entire genome that functions in bacteria. It is a system that protects the microbial genome from infection with pacteriophage. Enzymes that function in the methylation of the genome methylate cytosine or adenine, and many of them are known to methylate the nitrogen at position 6 (N 6) or the carbon at position 5 (C 5). It has been.
  • cytosine methylases that methylate C5 of Sssl (M. Sssl) methylase, Alul methylase, Hhal methylase, Hpall methylase, Mspl methylase, Haelll methylase, and the like are known.
  • the enzymes that methylate the C5 position of cytosine have different base sequences for recognition, and the only cytosine methylhime enzyme that recognizes CpG is Sssl.
  • the methylation reaction of DNA in the human genome is based on epidienetism (a mechanism that produces gene expression diversity independent of gene sequence), which involves the methylation of C p G cytosine at position 5 (C 5).
  • epidienetism a mechanism that produces gene expression diversity independent of gene sequence
  • C 5 C 5
  • DNA methyltransferase DNA methyltransferase is known.
  • Dnmtl methyltransferase is known as a DNA methyltransferase.
  • the C 5 position of cytosine in the CpG sequence is methylated, so when artificially methylating the genome, Sssl is used to increase the methylation in human cells. It is possible to methylate the same cytosine of the same sequence (C p G) at the same position.
  • Optimal 10X buffer (NEBuffer2 (NEB)) 5 S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB) 0.5 ⁇ 1, cytosine methylase Sssl (NEB) Add 0.5 ⁇ each, then add sterile ultrapure water to the mixture to bring the volume to 50 L, and incubate at 37 ° C for 30 minutes.
  • the methylation in the second step is performed to bind the target DNA region to the support by binding to the methylated DNA antibody. Therefore, the target DNA region of the extracted DNA sample is methylated. It is not always necessary to carry out the second step if it has been deceived.
  • the second step when the methylated base constituting the methylated DNA modified by the DNA methylase is different from the methylated base possessed by the detection oligonucleotide described later, the methyl base on the detection oligonucleotide is identified. It can be used as a function.
  • the detection oligonucleotide is 6-methyladenine and cytosine can be modified to 5-methylcytosine in the second step
  • the detection oligonucleotide can be identified.
  • a 6-methyladeyun antibody can be used, and a methylcytosine antibody can be used for fixation to a support.
  • a methylcytosine antibody can be used for fixation to the support.
  • the detection oligonucleotide has methyladenine, and detection of the detection oligonucleotide with the methyladenine antibody does not detect methylcytosine of the DNA having the target DNA region, but detects methyladenine of the detection oligonucleotide. Only this can be detected.
  • single-stranded methylated DNA is prepared from the DNA treated with the DNA methylating enzyme obtained in the second step, and the detection oligonucleotide is detected on the single-stranded methylated DNA having the target DNA region.
  • a test DNA complex is obtained by binding.
  • the “detection oligonucleotide” means that the nucleotide base constituting the oligonucleotide is complementary to DN A having an identification function for detecting or quantifying the detection oligonucleotide and the target DNA region. It is an oligonucleotide having a detection adhesion sequence which is a base sequence for binding by sex.
  • the “detection oligonucleotide” in the present invention may be composed of a repetitive sequence in the human genome described later, a base sequence of a duplicate gene or a pseudogene, or a base sequence that can be complementarily bound to a part thereof. Specific examples include base sequences having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 38 and 40 or their complementary sequences.
  • the adhesion sequence for detection is included in the base sequence necessary to form a conjugate (double stranded) with single-stranded DNA containing the target DNA region, that is, part of the base sequence of the target DNA region.
  • a base sequence containing a sequence that can bind by complementary base pairing or a base sequence containing a base sequence complementary to a part of the base sequence of the DNA region 5 or more from the 5 ′ end of the target DNA region Or a base sequence containing a complementary base sequence in a part of the base sequence further 3 'end side than the 3' end of the target DNA region, and the methylated DNA antibody and the target Does not inhibit the binding to methylated DNA in the DNA region Desired
  • Does not inhibit the binding of methylated DNA antibody to DNA methylated in the target DNA region means that the space occupied by methylated DNA antibody to bind to methylated single-stranded DNA In the figure, it means that a complementary binding between the oligonucleotide and the single-stranded DNA does not occur. That is, not only methylated bases (cytosine) but also methyliated bases (cytosine) are present in order to bind methyli-DNA antibodies to methylated bases (cytosine). It is thought to occupy space. Therefore, the detection adhesion sequence may be an occupied space required when a methylated DNA antibody binds to methylated DNA and does not have a complementary binding to the single-stranded DNA.
  • the detection adhesion sequence to be bound to the single-stranded DNA is not necessarily one type, and two or more types may be used as long as they do not inhibit the binding of the methylated DNA antibody. If a plurality of the present oligonucleotides are used, quantitative accuracy and detection sensitivity can be improved.
  • acquire single-stranded methylated DNA having a target DNA region and bind a detection oligonucleotide to the single-stranded methylated DNA to obtain a test DNA complex means methyl
  • a DNA having a target DNA region hereinafter also referred to as single-stranded methylated DNA
  • a detection oligonucleotide are complementarily bound to each other.
  • the single-stranded methylated DNA methylated by DNA methylase in the second step was prepared in a solution of lng / AtL with Tris-HC1 buffer (10 mM), and the single-stranded DNA was prepared.
  • oligonucleotides capable of binding to methylated DNA in a 0.02 ⁇ 1 solution with Tris-H buffer (10 raM).
  • Tris-H buffer (10 raM) Each oligonucleotide solution and buffer solution (330 mM Tris-Acetate H 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5raM Dithiothreitol) l O / ⁇ L, 100 mM MgCl 2 solution 10 zL, 1 mg / mL BSA solution 10 xL, and then add sterilized ultrapure water to the mixture Make the volume 100 L.
  • “Complementary binding” means that double-stranded DNA is formed by base pairing by hydrogen bonding between bases. For example, each of the double-stranded DNAs constituting a single-stranded DNA forms a double strand by purine and pyrimidine base pairing. It means that double stranded DNA is formed by the continuous base bonding by hydrogen bonding of thymine and adene and guanine and cytosine. Binding by complementarity is sometimes called “complementary binding”. “Complementary binding” means “complementary binding”, “complementary base pairing”, “binding by complementarity” or “combining by complementarity (captive (by base pairing) )) ”.
  • base sequences that can be complementarily bound may be expressed as “complementary to each other” [complementary].
  • inosine contained in the oligonucleotide produced artificially binds to cytosine, Adeyun, or thymine by a hydrogen bond.
  • a part of the base sequence constituting the detection adhesion sequence of the detection oligonucleotide is the single-stranded methyl DNA. The case where base pairing is not included is also included.
  • the bases constituting the adhesion sequence for detection are base-paired with single-stranded methylated DNA, and the test oligonucleotide and This includes the case where an oligonucleotide having a homology of at least 75% or more, preferably 80% or more, and a detection adhesion sequence can be combined.
  • adding a counter oligonucleotide is included in the third step of the method of the present invention. Can do.
  • a counter oligonucleotide is obtained by dividing a polynucleotide having the same base sequence as the target DNA region into “short” oligonucleotides. in this case “Short” refers to a length of 10 to 100 bases, more preferably 20 to 50 bases. Note that the counter single oligonucleotide is not designed on the base sequence to which the detection oligonucleotide and single-stranded methylated DNA bind. Add counter oligonucleotide in excess of the DNA region of interest. If the target DNA region is a positive strand, the target DN A region (positive strand) is made into a single strand and then bound to the immobilized methylated DN A antibody described below.
  • the Kanuta oligonucleotide is added in an amount of at least 10 times, preferably 100 times or more compared to the target DNA region.
  • the target DNA region in the DNA sample prepared in the first step is a single-stranded DNA
  • a special step is required to prepare a single-stranded methylated DNA in the third step.
  • Single-strand methyl baboon DNA can be obtained as a DNA sample without any effort. Specifically, as a DNA trial, it was obtained from a single-stranded DNA synthesized from RNA by reverse transcriptase treatment, and a virus whose genome is single-stranded DNA extracted from viruses. Single-stranded DNA can be raised.
  • the DNA region of interest in the DNA sample prepared in the first step is double-stranded DNA
  • it may be heated at 95 ° C for several minutes and rapidly cooled to 4 ° C or less.
  • the “adhesion sequence for detection” in the detection oligonucleotide is an oligonucleotide having a base sequence complementary to the base sequence of the target DNA region, and the target DNA region to which the detection adhesive sequence can be paired Is a sequence having a homology of 75% or more, preferably 90% or more.
  • the detection adhesive arrangement is It does not matter as long as it does not inhibit the binding between the immobilized methylated DNA antibody described and the test DNA complex.
  • the “adhesion sequence for detection” has a base sequence that binds to the target DNA region or the vicinity of the target DNA region, and is set so that a detection complex can be formed in the fourth step described later. Just do it.
  • the detection adhesive sequence may be one in the same repetitive sequence described later (in the target DNA region), or two or more may be designed. When two or more are designed, the plurality of detection adhesion sequences and the specific adhesion sequence described below may be those that do not inhibit the binding of single-stranded methylolated DNA to each other.
  • the fourth step is a step of obtaining a detection complex by binding an immobilized methylated DNA antibody to the test DNA complex obtained in the third step.
  • “Immobilized methylated DNA antibody” is an antibody in which a methylated DNA antibody that binds with a methylated base in DNA as an antigen is immobilized on a “support”.
  • the antibody is preferably an antibody having the property of recognizing and binding to cytosine methylated at the 5-position in single-stranded DNA, more preferably a methylcytosine antibody. Further, even a commercially available methylated DNA antibody may be used as long as it is capable of specifically recognizing and binding specifically to methylated DNA described in the present specification.
  • the “support” may be any material and shape as long as it is a support to which the methylated DNA antibody can bind.
  • the shape only needs to be suitable for the purpose of use, and examples include a tube shape, a test plate shape, a filter shape, a disk shape, and a bead shape.
  • a material used as a normal support for immunoassay for example, a synthetic resin such as polystyrene, polypropylene, polyacrylamide, polymethyl methacrylate, polysulfone, polyacrylonitrile, nylon, or the synthetic The resin may have a reactive functional group such as a sulfone group or an amino group introduced therein.
  • glass, polysaccharides or derivatives thereof (cellulose, nitrocellulose, etc.), silica gel, porous ceramics, metal oxides, etc. may be used.
  • the “support” may be a fine particle, and the detection oligonucleotide is the same as the support. Fine particles may be bound. Examples of the fine particles include latex beads and gold colloids (gold nanoparticles).
  • the microparticle that is the support and the microparticle that is bound to the detection oligonucleotide are not present on the methylated DNA having the target DNA region.
  • fine particles can be aggregated. That is, the immobilized methylated DNA antibody, the detection oligonucleotide, and the methylated single-stranded DNA bind to form a detection complex, whereby the support microparticles and the microparticles bound to the detection oligonucleotide Means that it becomes an aggregate.
  • the microparticles are latex beads, aggregates can be detected by changes in turbidity. If the fine particles are gold colloid (gold nanoparticles), the aggregate can be detected by a color change (from pink to purple).
  • fine particles are attached to the plurality of methylated DNA on DNA having the target DNA region.
  • Aggregation of microparticles can be detected by binding of the methylated DNA antibody immobilized thereon.
  • the support is a latex bead
  • the aggregate of fine particles can be detected by a change in turbidity.
  • the support is a gold colloid (gold nanoparticle)
  • the aggregate of fine particles can be detected by a color change (from pink to purple). In this case, even if the detection oligonucleotide is not added, the same detection result as that obtained when the detection oligonucleotide is added can be obtained.
  • the amount detected in the aggregate of fine particles is a value that correlates with the total amount of DNA methylated by the second step.
  • the DNA obtained in the first step is DNA contained in cells in the tissue
  • the DNA obtained in the second step is different in each tissue because the degree of DNA methylation contained in the cells in the tissue varies.
  • the degree of methylation includes both the degree of methylation in cells in the tissue and the degree of methylation / reich in the second step. That is, when the DNA methylase treatment is not performed in the second step, the amount detected in the aggregate of fine particles is the amount of cells in the tissue. This value correlates with the degree of methylation at.
  • a “methylated DNA antibody” is an antibody that binds to a methylated base in DNA as an antigen. Specific examples include a methylcytosine antibody, and an antibody having a property of recognizing and binding to cytosine methylated at the 5-position in single-stranded DNA. A commercially available methyl baboon DNA antibody can also be used as long as it is an antibody that can specifically recognize and specifically bind to the methylated DNA described in the present specification.
  • a methylated DNA antibody can be prepared by a conventional method using a methylated base, methylated DNA or the like as an antigen.
  • a methylcytosine antibody specific binding of 5-methylcytidine, 5-methyrecytosine, or an antibody prepared using DNA containing 5-methylcytosine as an antigen to methylcytosine in DNA is required. Select as an indicator. It should be noted that the nature of such immobilized methylated DNA antibody (one antibody binds to one methylated base (cytosine)). Considering that, there are many target DNA regions. By selecting a region in which the methylated base (cytosine), ie, C p G, is present, improvement in quantitative accuracy and detection sensitivity can be expected.
  • Examples of antibodies obtained by bringing an animal into contact with an antigen include an antibody of an IgG fraction (polyclonal antibody) obtained by immunizing an animal with an antigen, and an antibody that produces a single clone (monoclonal antibody).
  • polyclonal antibody obtained by immunizing an animal with an antigen
  • monoclonal antibody an antibody that produces a single clone
  • Examples of a method for producing a monoclonal antibody include a cell fusion method.
  • a hybridoma is produced by cell fusion of spleen cells (B cells) derived from immunized mice and bone marrow moon cells, and an antibody produced by the hybridoma is selected and methylcytosine is selected. Create an antibody (monoclonal antibody).
  • B cells spleen cells
  • methylcytosine is selected.
  • monoclonal antibodies there is no need to purify the antigen.
  • 5-methylcytidine, 5-methylcytosine, or DNA containing 5-methylcytosine The mixture can be administered as an antigen to animals used for immunization.
  • 5-methylcytidine, 5-methylcytosine, or DNA containing 5-methylcytosine is directly administered to a mouse producing an antibody.
  • immunization may be performed by binding an antigen to a support.
  • an adjuvant solution for example, liquid paraffin and A racel A mixed with a mixture of dead Mycobacterium tuberculosis as an adjunct
  • immunizing by incorporating it into a ribosome, It can improve the sex.
  • booster immunization can be performed intraperitoneally or intravenously in mice.
  • the amount of antigen when the amount of antigen is small, it can be immunized by injecting a solution in which the antigen is suspended directly into the mouse spleen. A few days after the final immunization, the spleen is removed and the adipose tissue is peeled off to produce a spleen cell suspension. This splenocyte is fused with, for example, an HGPRT-deficient myeloma cell to produce a hybridoma. Any cell fusion agent can be used as long as it can efficiently fuse spleen cells (B cells) and myeloma cells.
  • cell fusion may be performed by a method using a high voltage pulse. After cell fusion, incubate in HAT medium, select hybridoma husks fused with spleen cells and myeloma cells, and wait for cells to grow until screening becomes possible.
  • An antigen-antibody reaction system can be used for the antibody detection method and antibody titer measurement method for selecting the hybridoma producing the target antibody.
  • Specific examples of antibody measurement methods for soluble antigens include radioactive isotope element immunoassay (RIA) and enzyme immunoassay (ELISA).
  • methylated in the method of the present invention means DNA in which C p G present in DNA is methylated at least at one site, and C present in DNA. It is not limited to DNA in which all of pG is methylated.
  • the “detection complex” in the fourth step means a complex in which the test DNA complex obtained in the third step is bound to the immobilized methylated DNA antibody. Since the methylated DNA antibody is used as one that can be immobilized on the support, the methylated DNA antibody is finally detected as single-stranded DNA containing DNA methylated in the target DNA region. It should be able to be immobilized on a support in the state that a test DNA complex with oligonucleotide is formed.
  • the methylated DNA antibody may be immobilized on the support at the stage before binding of the test DN A complex to the methylated DN A antibody, and
  • the methylated DNA antibody may be immobilized on the support at the stage after binding of the test DN A complex and the methylated DN A antibody.
  • a support in which a biotinylated methylated DNA antibody obtained by biotinylating a methylated DNA antibody is coated with streptavidin is used.
  • streptavidin for example, streptavidin
  • a molecule having an active functional group such as an amino group, a thiol group, or an aldehyde group is covalently bonded to a methylated DNA antibody, and then the surface thereof is activated with a silane coupling agent or the like.
  • a method of covalently bonding to a saccharide derivative, silica gel, the above synthetic resin or the like, or a heat-resistant plastic support for example, a spacer such as a methylated DNA antibody having a molecule having the active functional group and five triglycerides connected in series, a crosslinker, etc. are used. Can be covalently linked.
  • the methyli ⁇ DNA antibody may be directly immobilized on the support, or the antibody against the methylated DNA antibody (secondary antibody) is immobilized on the support, and the methylated antibody is bound to the secondary antibody. You may fix to a support body by doing.
  • the fourth step “Detected by binding immobilized DNA antibody to test DNA complex. “Acquiring the complex” means that the single-stranded methylated DNA contained in the test DNA complex obtained in the third step is bound to the immobilized methylated DNA antibody and immobilized on the support. Means. For example, when “methylated DNA antibody is immobilized on a support at the stage before binding of the test DNA complex and methylated DNA antibody”, specifically, for example, it is immobilized on the support.
  • a biotin-labeled pyotinylated methylated DNA antibody is used, and the sample-derived DNA sample is a genomic DNA sample contained in a sample derived from a biological sample.
  • the sample-derived DNA sample is a genomic DNA sample contained in a sample derived from a biological sample.
  • sample-derived DNA sample is a genomic DNA-derived DNA sample contained in the biological sample-derived sample.
  • NEB NEBuffer2
  • S-adenosyl methionine 3.2 mM, NEB.
  • Methylated single-stranded DNA obtained by separating strand DNA, detection oligonucleotide, and annealing buffer (eg 33 mM Tris-Acetate pH 7.9, 66 mM KOAc, lOraM Mg0Ac 2 N 0.5 mM Dithothreitol) Then, for example, heat at 95 ° C for several minutes. Thereafter, in order to form a conjugate of the single-stranded DNA containing the target DNA region and the detection oligonucleotide, the detection oligonucleotide is rapidly cooled to a temperature about 10 to 20 ° C lower than the Tm value of the detection oligonucleotide.
  • annealing buffer eg 33 mM Tris-Acetate pH 7.9, 66 mM KOAc, lOraM Mg0Ac 2 N 0.5 mM Dithothreitol
  • the conjugate formed at this stage is composed of a methyl ⁇ single-stranded DNA containing DNA methylated in the target DNA region and a detection oligonucleotide.
  • a conjugate of a detection oligonucleotide and a single-stranded DNA that does not contain DNA methylated in the target DNA region is included.
  • the annealing buffer used in (b) is not limited to the annealing buffer, as long as it is suitable for binding the detection oligonucleotide and methylated single-stranded DNA containing the target DNA region. is not.
  • Use of divalent ions, preferably magnesium ions; dissolved in concentrations of L-60 OmM will increase binding stability.
  • the washing procedure in (a) and (c) was suspended in a solution that was not bound to the immobilized DNA antibody that was suspended in the solution and the methylated DNA antibody. This is important because methylated single-stranded DNA other than the target DNA region that did not form a conjugate with the non-methylated single-stranded DNA and the detection oligonucleotide is removed from the reaction solution.
  • the washing buffer is not limited to the washing buffer, as long as it is suitable for removing the above-mentioned free methylated DNA antibody, methyli single-stranded DNA floating in the solution, and the like.
  • DELF IA buffer Perkin Elmer, Tris-HC1 pH 7.8 with Tween 80
  • TE buffer etc.
  • the resulting conjugate is biotin.
  • a methylated DNA antibody is bound to form a complex, but the order is not limited. That is, methyl ⁇ single-stranded DN A containing the target DN A region and After binding the biotinylated methyl baboon DNA antibody, a detection oligonucleotide may be bound to the resulting conjugate to form a complex.
  • a biotinylated methylated DNA antibody immobilized on a streptavidin-coated support a genomic DNA-derived DNA sample, 5 L of NEBuffer2 (NEB), S-adenosyl methionine (3.2 raM, NEB Company Ltd.) 0.5 mu 1, cytosine methylation enzyme Sssl a (NEB Inc.), respectively 0.5 L Karoe, then the liquid amount added with sterilized ultrapure water to the mixture as a 50 ⁇ ⁇ , 30 minutes at 37 ° C for After incubation, the methylated DNA strand obtained by separating from double-stranded DNA is added, so that the conjugate of the pyotinylated methylated DNA antibody immobilized on the support and the methylated single-stranded DNA (The conjugate formed at this stage is a conjugate of a methylated single-stranded DNA containing methylated DNA in the target DNA region and a methylated antibody, and the target DNA region
  • methylated methylated single-stranded DNA and methylation Contains a conjugate of the body.). Thereafter, a detection oligonucleotide is added thereto to form a complex with a conjugate having a methylated single-stranded DNA containing a DNA that has been methylated into the target DNA region of the conjugate. (At this stage, the conjugate of methylated single-stranded DNA containing methylated DNA in a region other than the target DNA region and the methylated antibody does not form a complex.) . It is also possible to perform the operations (a) to (c) using a chromatostrip. In that case, the specific implementation is as follows.
  • biotinylated methylated DNA antibody is developed by chromatography strip partially coated with streptavidin.
  • the piotinylated methyl DNA antibody is immobilized on the portion coated with streptavidin.
  • a conjugate of the methylated single-stranded DNA obtained in (b) and the detection oligonucleotide is a methylation sequence containing DNA methylated in the target DNA region.
  • a conjugate of a single-stranded DNA and a detection oligonucleotide In addition to a conjugate of a single-stranded DNA and a detection oligonucleotide, a conjugate of a single-stranded DNA that does not contain DNA methylated in the target DNA region and a detection oligonucleotide). Develop with the aforementioned chromatostrip.
  • DNA samples derived from genomic DNA NEBuffer2 (NEB) 5 ⁇ L, S-adenosyl Add methionine (3.2 mM, NEB) 0.5 1 and cytosine methylase Sssl (NEB) 0.5 ⁇ respectively, then add sterilized ultrapure water to the mixture to a volume of 50 / L, 37 ° After incubation for 30 minutes at C, a complex consisting of methylated single-stranded DNA obtained by degrading double-stranded DNA, detection oligonucleotide, and biotinylated methylated DNA antibody is coated with streptavidin (Formation of complex / immobilization on support) (At this stage, it does not contain DNA that has been methylated in the target DNA region.
  • streptavidin Formation of complex / immobilization on support
  • the conjugate of does not form a complex.
  • the order of operations for complex formation is not limited to the order of these operations.
  • a complex consisting of a single-stranded DNA containing DNA methylated in the target DNA region, a detection oligonucleotide, and a biotinylated methylated DNA antibody is formed and then developed on a chromatostrip.
  • the complex may be immobilized on the portion coated with streptavidin. In these operations, unnecessary components can be removed by developing the solution with a chromatostrip, and the washing operation can be omitted.
  • a washing operation (development of chromatostrip with 0.05% Tween20-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3raM Na2HP0 7H20 154 mM NaCl pH7.4)) may be performed.
  • the detection oligonucleotide contained in the detection complex obtained in the fourth step is quantified or detected by its discriminating function, so that the DN having the target DNA region in the single-stranded DNA is detected. This is a step of quantifying or detecting A.
  • detection means to determine whether or not the degree of methylination of DNA that has been methylated up to the second step is greater than or equal to a certain level by the identification function of the detection oligonucleotide. In other words, it usually means that a significant value can be obtained by the identification function described later.
  • “Quantitative” means quantification of the amount detected by the discrimination function obtained in the fifth step. That is, it is possible to obtain a value that correlates with the total amount of DNA having the target DNA region obtained in the first step and methyl-rich DNA methylated by DNA methylase treatment in the second step. means. For example, as the identification function described later, Alternatively, the value obtained by quantifying the amount of this oligonucleotide is a value that correlates with the amount of DNA in the target DNA region in the sample. For example, if the sample is 1 mL of serum, Correlation with the total amount of DNA having the target DNA region obtained in the first step and methylated DNA methylated by DNA methylase treatment in the second step Means to get the value.
  • the “identification function” in the fifth step is a function capable of detecting or quantifying the detection oligonucleotide.
  • the identification function may be anything as long as it is a detection oligonucleotide.
  • the identification function based on the label of the detection oligonucleotide and the identification function imparted to the detection oligonucleotide by a detection molecule that binds to the detection oligonucleotide are listed. be able to.
  • the detection oligonucleotide is labeled with its 5 or 3 terminal, europium label, gold colloid label, latex bead label, radioisotope label, fluorescent substance (FITC, etc.) label, horseradish Peroxidase (HR) P) Labeling, Al force phosphatase labeling, etc. Characteristics of the detection oligonucleotide such as fluorescence and color development can be mentioned.
  • Enhancement Solution PerkinElmer
  • a fluorescence detector To detect europium, add Enhancement Solution (PerkinElmer), leave it at room temperature for about 45 minutes, and measure fluorescence (excitation 340mn / fluorescence 612nm) with a fluorescence detector.
  • Enhancement Solution PerkinElmer
  • specific examples of the detection molecule include a methylated DNA antibody and an osmium complex (J. Am. Chem. Soc., 2007; 129 : 5612-5620) and the like.
  • Methylated oligonucleotide means an oligonucleotide in which at least one of the nucleotide bases constituting the oligonucleotide is methylated.
  • 5-methylcytosine, 6-methyladenine, etc. Means an oligonucleotide containing.
  • the detection oligonucleotide when the detection oligonucleotide is FITC-labeled, the detection molecule may be a FITC antibody.
  • the detection molecule is a methylated DNA antibody, an identification function can be imparted to the antibody as long as it can be quantified or detected by binding to the antibody.
  • fixed Methylated DNA antibodies that cross substrate with DNA antibodies cannot be used. For example, if the immobilized methylated DNA antibody uses a methylcytosine antibody, a methylated DNA antibody that can bind to methylcytosine cannot be used.
  • the labeling is fluorescent, such as single mouth Pium label, gold colloid label, latex bead label, radioisotope label, fluorescent substance (FITC, etc.) label, horseradish Peroxidase (HRP) label, alkaline phosphatase label, piotin label, etc.
  • FITC fluorescent substance
  • HRP horseradish Peroxidase
  • ⁇ Functions such as coloring.
  • a discrimination function may be directly coupled to the antibody as the detection molecule, or a secondary antibody or a tertiary antibody having the discrimination function is detected. And a method of binding to an antibody.
  • fluorescently labeled antibodies include horseradish peroxidase (HRP) labeled antibodies, alkaline phosphatase labeled antibodies, biotin labeled antibodies, and europium labeled antibodies are commercially available. It can be used as a secondary antibody or a tertiary antibody. Further, it may be an antibody bound with a substrate detectable by an enzyme cycle method. Examples of quantification or detection means for these functions include measurement with a radiation detector, a spectrophotometer, etc., or visual inspection.
  • HRP horseradish peroxidase
  • alkaline phosphatase labeled antibodies alkaline phosphatase labeled antibodies
  • biotin labeled antibodies include europium labeled antibodies.
  • europium labeled antibodies are commercially available. It can be used as a secondary antibody or a tertiary antibody. Further, it may be an antibody bound with a substrate detectable by an enzyme cycle method. Examples of quantification or detection means for these functions include measurement with a
  • the detection oligonucleotide when the detection oligonucleotide is detected or quantified by its discriminating function, or when a secondary antibody to which europium is added as a function that can be specifically detected or quantified is used, the secondary antibody is added to the detection complex. After binding, add Enhancement Solution (PerkinElmer) and mix and let stand at room temperature for about 45 minutes. Thereafter, fluorescence (excitation 340 nm / fluorescence 612 mu) may be measured with a fluorescence detector.
  • Enhancement Solution PerkinElmer
  • a methylated DNA antibody (a methylated DNA antibody having a substrate specificity different from that of the immobilized methylated DNA antibody) is bound to the methylated DNA on the detection oligonucleotide
  • a secondary antibody against the methyl-rich DNA antibody for example, Eu-N1-labeled mouse IgG antibody: PerkinElmer
  • PerkinElmer a secondary antibody against the methyl-rich DNA antibody
  • 'Enhance Solution PerkinElmer
  • the fluorescence (excitation 340 nm / fluorescence 612 nm) is measured with a fluorescence detector to detect or quantify.
  • a fluorescence detector to detect or quantify.
  • a methylated DNA antibody that binds to methylated DNA on the detection oligonucleotide is labeled with FITC
  • an antibody with FITC bound thereto can be used as a secondary antibody.
  • the fluorescence of FITC can be measured and detected or quantified by a known method, and the anti-FITC antibody can also be detected or quantified as a secondary antibody.
  • FITC when FITC is directly bound to the detection oligonucleotide, FITC can be used as a discriminating function, FITC antibody labeled with horseradish Peroxidase (HRP), FITC antibody labeled with alkaline phosphatase, biotin labeled.
  • HRP horseradish Peroxidase
  • a labeling function can be imparted by FITC antibody, FITC antibody labeled with europium, or the like.
  • HRP horseradish peroxidase
  • a labeled antibody for example, HRP-labeled FI TC antibody (Jackson ImmunoRe search Laboratories) is added and allowed to stand at room temperature for about 1 to 2 hours to promote binding of the FI TC antibody to the detection complex.
  • FI TC antibody solution After washing off the FI TC antibody solution, add an appropriate substrate (for example, Substrate Reagent Pack # DY999: R & D SYSTEMS) and mix.After leaving at room temperature for about 5 to 60 minutes, stop solution ( 2N H2S04 aqueous solution) is added to stop the horseradish peroxidase (HRP) reaction, and the absorbance at 450 nm is measured within 30 minutes after the reaction stops.
  • substrate for example, Substrate Reagent Pack # DY999: R & D SYSTEMS
  • stop solution 2N H2S04 aqueous solution
  • HRP horseradish peroxidase
  • biotinylated oligonucleotides can be used for detection or quantification.
  • detecting or quantifying the biotinylated detection oligonucleotide for example, adding and mixing HRP-labeled streptavidin to the immobilized detection complex, the biotinylated detection oligonucleotide and the HRP weave streptavidin and After the formation and separation of the above-mentioned conjugate, the biotinylated methylated DNA antibody can be detected or quantified by measuring the activity of HRP by a known method.
  • the discrimination function a substrate or the like used in a highly sensitive detection method such as an enzyme cycle method may be used.
  • an antibody to which an enzyme used in the enzyme cycle method is bound may be bound to the detection complex as a detection molecule.
  • the identification function imparted to the detection molecule in the method of the present invention is not limited to the method described above.
  • the “detection molecule” only needs to have the property of detecting or quantifying the detection oligonucleotide.
  • the detection molecule may be one that recognizes the detection sequence of the detection oligonucleotide, and may be previously bound to the detection oligonucleotide.
  • the detection molecule has the property of specifically binding to the detection oligonucleotide, and has the ability to have a “discriminating function” that is a function / characteristic used for quantification or detection, or imparts a discriminating function. Anything that can be done.
  • the detection molecule when the detection sequence is methyl oligonucleotide, the detection molecule only needs to be capable of detecting the methylated oligonucleotide by binding to the methylated oligonucleotide, and is specific to the methylated oligonucleotide. Any device may be used as long as it has an identification function in combination.
  • a methylated DNA antibody having substrate cross-reactivity with an immobilized methylated DNA antibody cannot be used.
  • the immobilized methylated DNA antibody uses a methylcytosine antibody
  • the methylcytosine antibody is detected. It cannot be used as a molecule).
  • the detection molecule may be a methyl DNA antibody.
  • methylated DNA antibodies that cross-link with immobilized methylated DNA antibodies cannot be used.
  • the immobilized DNA methyl antibody uses a methylcytosine antibody
  • the methylcytosine antibody cannot be used as a detection molecule.
  • the detection sequence is the detection molecule itself, it is not necessary to add a new detection molecule in order to detect the detection oligonucleotide.
  • the detection oligonucleotide is detected. Nucleotide detection is possible.
  • immunological measurement methods are widely used. Of these immunological measurement methods, the so-called immunochromatography method using chromatography is simple in operation and requires a short time for the assay. Therefore, there are currently many clinical tests in hospitals, laboratory tests in laboratories, etc. Widely used in scenes.
  • the method of the present invention conceptually enables a method in which the above-described immunochromatography method and the hybrid necking method are mixed.
  • the order of complex formation and complex acquisition is not particularly limited, and various methods are possible. Specifically, for example, it may be carried out as follows.
  • Method 1 A detection oligonucleotide having a discrimination function is added to a sample immediately after the completion of the second step, and a methylated single-stranded DNA containing a target DNA region is bound to a detection oligonucleotide having a discrimination function.
  • the conjugate formed at this stage is not only the conjugate of single-stranded DNA containing DNA methylated in the target DNA region and the detection oligonucleotide, but also in the target DNA region.
  • Method 2 A methylated single-stranded DNA with methylated cytosine is added to the sample immediately after the completion of the second step and a methylated DNA antibody is added.
  • a single-stranded DNA containing a region and a single-stranded DNA other than the target) and a pyotinylated methylated DNA antibody are formed (the conjugate formed at this stage is the target DNA region)
  • the conjugate formed at this stage is the target DNA region
  • methylated single-stranded DNA and methyl other than the target DNA region A conjugate with a conjugated antibody.
  • the conjugate moves through the development part by capillarity and is captured by the part previously coated with streptavidin (this stage)
  • the conjugate is a methylated one other than the target DNA region. Contains a conjugate of strand DNA and methylated antibody).
  • a detection oligonucleotide having a discriminating function when dropped (introduced) into the introduction part, it moves through the development part and binds only to the methylated single-stranded DNA containing the target DNA region in the conjugate, A complex is formed in which a single-stranded DNA containing DNA methylated in the target DNA region, a detection oligonucleotide having a discriminating function, and a piotinylated methyl DNA antibody are bound.
  • the DNA having the target DNA region can be detected or quantified.
  • Method 3 When the pyotinylated methylated DNA antibody is dropped (introduced) onto the chromatographic strip introduction part, the methylated DNA antibody moves through the development part by capillarity and is previously coated with streptavidin. To be captured. Next, when the sample immediately after the completion of the second step is dropped (introduced) into the introduction part, the development part is moved, and the single-stranded DNA having methylated cytosine is transferred to the already captured methyliDNA antibody. (The conjugate formed at this stage is not only the conjugate of single-stranded DNA containing methylated DNA in the target DNA region and the methylated antibody, but also the target DN.
  • the development part is A single-stranded DNA that binds only to methylated single-stranded DNA containing the target DNA region of the conjugate and contains DNA methylated in the target DNA region; and A detection oligonucleotide having an identification function; And Ochin methylated DNA antibody to form a detectable complex bound.
  • Method 4 When dripped (introduced) piotinylated methyl DNA antibody to the introduction part of the chromatostrip, the methylated DNA antibody moves to the development part by capillary action, and the part previously coated with streptavidin To be captured. A detection oligonucleotide having an identification function is added to a sample immediately after the completion of the second step, and a conjugate of a methylated single-stranded DNA containing a target DNA region and a detection oligonucleotide having an identification function. A test DNA complex is formed.
  • the obtained conjugate is dropped (introduced) into the introduction part, the development part is moved, and the methyl-hib DNA antibody already captured contains DNA methylated in the target DNA region of the conjugate. Only single-stranded DNA binds, and a single-stranded DNA containing DNA methylated in the target DNA region, a detection oligonucleotide having a discriminating function, and a piotinylated methylated DNA antibody A bound detection complex is formed. By detecting or quantifying the detection oligonucleotide contained in the obtained complex based on its discrimination function, the DNA having the target DNA region can be detected or quantified.
  • Multiple detection sites exist in the target DNA region, and each target DNA region is detected or quantified sequentially. It is also possible to have multiple target DNAs that simultaneously detect repetitive sequences, duplicate genes or multiple different genes in the genome so that they can form a complex with multiple target DNA regions. Even if a detection oligonucleotide that can bind complementarily to the region is used, the detection sensitivity can be dramatically increased. Furthermore, even if a large number of detection oligonucleotides are designed in one target region and used on the support side or the detection side, the detection sensitivity can be dramatically increased.
  • the above-mentioned methods 1 to The method is not limited to method 4 and may be a method using an immunoantibody method.
  • the ELISA method uses the same principle as the chromatographic strip method, the process of forming a complex and binding it to the support is performed in the order described in Methods 1 to 4. It is possible to implement.
  • Such a DNA methylase, detection oligonucleotide, or methylated DNA antibody that can be used in the method of the present invention is useful as a reagent for a detection kit.
  • the method of the present invention comprises a detection kit containing these DNA methylating enzymes, specific oligonucleotides, methylated DNA antibodies, etc. as reagents, and these oligonucleotides, methyl-rich DNA antibodies, etc. on the support.
  • a detection chip fixed to the detection chip and the scope of the rights of the method of the present invention is that of the detection kit detection chip as described above using the substantial principle of the method. Use in such a form is also included.
  • Known food poisoning bacteria such as Clostridium botulinum, Yersinia enterocooitica, Yersinia pseudotuberculosis, and Clostridium perfringens are known, but no technology for simultaneously detecting several types of food poisoning bacteria is known.
  • a base sequence found in the genome is selected with a specific oligonucleotide, such as a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) region, as a base sequence IJ to be detected, one gene in one genome is selected. Detection with higher sensitivity than detection is possible.
  • CRISPR clustered regularly interspaced short palindromic repeats
  • the method of the present invention can be used for the identification of industrially useful microorganisms and the simple investigation of microorganism groups such as soil, rivers and lake sediments by detecting the genomes of microorganisms in the environment.
  • the microorganisms in the environment for example, Methanococcus jannaschii ⁇ Methanobacterium thermoautotrophi cum deltaH N Aquifex aeolicus, Pyrococcus horikoshii 0T3, Archaeoglobus fulgidus, Thermotoga maritime MSB8, Aeropyrum pernix Kl, Haloferax mediterranei can be confirmed.
  • the target DNA region in the method of the present invention is a base sequence derived from a microorganism, a genomic DNA or DNA fragment extracted from a sample, or a base obtained by converting RNA extracted from a sample into DNA by reverse transcriptase Means an array. Therefore, a region specific to the microorganism may be selected as the base sequence capable of complementary binding to the detection oligonucleotide.
  • the target DNA region in the present invention is a base sequence of a microorganism
  • the microorganism DNA is extracted from the sample or from the sample.
  • the base sequence of DNA such as DNA, by reverse transcriptase
  • the base sequence unique to the microorganism in the vicinity of the target DNA region may be used as the base sequence that specifically binds to the specific oligonucleotide.
  • the target DNA region for detecting the genome in a microorganism and the region where the detection oligonucleotide binds complementarily include the base number of yeast chromosome VII shown in Genbank Accession No. NC_001139 etc.
  • mice Micobacterium tuberculosis;. TRNA on chromosome 13—Tyr base ⁇ self- ! neoformans) and chitin synthase activator (Chs3) have base sequences unique to the genus Aspergillus fumigatus and Neosartorya, so DNA derived from these microorganisms is contained in DNA extracted from human sputum and lung biopsy samples. Can be used to test for infectious diseases caused by microorganisms.
  • actA Listeria monocytogenes
  • pyrG N: 002163, Campylobacter jejuni subsp. Jejuni
  • these genes can be used for microbiological assays in food poisoning.
  • thrA has lj stored in Salmonella enterica, Yersinia enterocolitica, and Escherichia coli, and can detect multiple microorganisms with one gene. Search for base sequences unique to microorganisms from among the base sequences published on the database.
  • the base sequence peculiar to microorganisms can be searched. For example, if the base sequence is in a public database such as Pub Med, it can be obtained by a normal procedure, and the obtained base sequence is subjected to a B 1 ast search by a normal procedure. Thus, it is possible to examine whether the nucleotide sequence is unique.
  • the unique base sequence means that the base sequence to be detected does not have a base sequence having homology with a base sequence derived from an organism other than the genomic base sequence of the microorganism to be detected.
  • the specimen when the specimen is a human biopsy sample, it is important to design a specific oligonucleotide that does not bind complementary to the human gene.
  • the specimen when the specimen is a food, it is important to design a specific oligonucleotide that does not bind complementary to a base sequence derived from an organism other than the detection target contained in the food.
  • any region that correlates with the amount of free DNA can be used, and for the purpose of quantifying or detecting free DNA, the same sequence in the genome should be used several times.
  • the so-called repetitive sequences that are seen repeatedly are desirable, and if they are simple repetitive sequences (called tandem repeats or tandem repeats) or scattered repetitive sequences, it is more suitable.
  • Simple repetitive sequences are characterized by the presence of the same sequence next to each other in the same direction, such as satellite DNA, minisatellite, microsatellite, centromere, telomere, centromere, and a series of nucleotide sequences such as liposome population genes. It has been known. Interspersed repetitive sequences are characterized by the fact that the same sequences are interspersed without being adjacent to each other, and are considered to be DNA derived from retrotransposons. Scattered repeat sequences are classified into SI NE (Short Interspersed Repetitive Element) and LI NE (Long Interspersed Elements) according to the length of the base sequence. The A 1 u and LI NE_1 sequences are known as typical repetitive sequences, respectively.
  • a duplicate gene refers to a case where a plurality of highly homologous genes exist on one genome, and in many cases, is a base sequence that exists in tandem in the vicinity of one gene. Pseudogenes are often one of the duplicate genes.
  • repetitive sequences include, for example, (A) n, (T) n, (GA) n, (CA) n, (TAA) n, (GGA) n, (CAGC) n, (CATA) n, (GAAA) n, (TATG) n, (TTTG) n, (TTTA) n, (TTTC) n, (TAAA) n, (TTCA) n, (TATAA) n, (TCTCC) n, (TTTCC) n, (TTTAA) n, (TTTTC) n, (TTTTA) n, (TTTTG) n, (CMAA) n, (CACCC) n,
  • Sequences such as (TATATG) n, (CATATA) n, (TCTCTG) n, (AGGGGG) n, (CCCCCA) n, (TGGGGG) n (where n means the number of repeats) are known, and transcription factors
  • the derived sequences include MER1-Charlie, Zaphod as MT group, and MER2-Tigger, Tc-1, Mariner as Tc-1 group.
  • Tiggerl, Tigger2a, Tigger5, Charlie4a, Charlie7, etc. are known. These sequences are generally short and simple base sequences, and it is difficult to set a specific adhesion sequence and a detection adhesion sequence described later.
  • a specific adhesion sequence and a detection adhesion described later are used. Since it can be used in the method of the present invention as long as it has a settable array and an array that can be set, the present invention is not necessarily required. It is not excluded as a target of the light method. Satellite DNA, minisatellite, microsatellite, etc. are repetitive sequences classified as simple repetitive sequences.
  • ALR6 is a sequence that exists in a centromere, U2 and U6 as snRNAs, and generally there are multiple copies in the genome such as tRNA and rRA.
  • genes that have multiple copies in the genome due to gene duplication.
  • retroviruses LTRs (Lomg terminal repeat) at the end; ⁇ Zones, endogenous sequences such as MaLRs (Mammalian apparent LTR-Retrotransposons) It is known that multiple LTRs exist in one genome.
  • LTR1, LTR1B, LTR5, LTR7, LTR8, LTR16A1, LTR16A1, LTR16C, LTR26, LTR26E, MER48, and MLT2CB are known as retrovirus-derived LTRs.
  • retrotransposon-derived LTRs are classified into ERV, ERVK, and ERVL classes. Specifically, LTR8A, LTR28, MER21B, MER83, MER31B, MER49, MER66B, HERVH, ERVL, LTR16A1, LTR33A, LTR50, Subfamilies such as LTR52, MLT2A1, MLT2E, MER11C, MER11C can be fisted.
  • Ma LR s refers to a DNA factor having a sequence containing an LTR at both ends of the sequence as in a typical retrotransposon, but the internal sequence sandwiched between the LTRs is not derived from a retrovirus.
  • Interspersed repeat sequences are characterized by interspersed non-adjacent sequences and are thought to be derived from retrotransposons.
  • SINE Short Interspersed Repetitive Element
  • LINE Long Interspersed Elements
  • Most of the SINEs are sequences belonging to the A 1 u family.
  • 7 SLRN It has an arrangement on the 3rd or 5th side of A or an arrangement on the 5th or 5th side, and an AT-rich region sandwiched between regions called left- and right-monomers.
  • the subfamily of A 1 u family includes Alu, Aiserb, AluJo, AluSc, AluS g , AluSp, AluSq, AluSx, AluY, and FAM (Fossil Alu Monomer) and FLAM with FAM sequence.
  • MIR and T her / MIR 3 are known as SINEs other than A 1 u family, and MIR and MIR3 are known as subfamilies respectively.
  • Bl, B2, B4, PB1, PB1D, etc. are known as subfamily members of the A 1 u family of other species.
  • LINEs sublines from LINE1 to Line23 have been reported, but LINE-1, LINE2, and LINE3 are widely known to exist in the genome.
  • L1M1, L plate, L1M3, LlM3d, L1M4, LlM4c, L1MA2, L1MA7, L1MA8, L1MA9, L1MB1, L1MB1, L1MB3, L1MB4, L1MB5, L1MB7, L1MB7, L1MC7 , L1MC3, L1MC4, LlMC4a, L1MC5, LlMDa, LIME, LlMEc, LlMEd, LlMEg, L1ME1, L1ME2, L1ME3, L1ME3A, L1ME3B, LlME4a, L1PB3, L1P4, L1PA2, L1PA4 L1PA13, L1PA14, L1PA16, L1PB1, L1PB3, L1PB4, L1PREC2, and HAL1 subfamilies are known.
  • L2 and L2c subfamilies are known.
  • the following specific adhesion sequence and detection adhesion sequence are set for the common sequence for Alu family or Alu subfamily, and the common sequence for LINE-1 family or LINE-1 subfamily.
  • Specific examples of the target DNA region include a partial sequence of LINE-1 (SEQ ID NO: 3 7), a partial sequence of Alu (base sequence shown in SEQ ID NO: 39), or a base sequence showing homology thereof.
  • Etc For example, if you look at repetitive sequences in a certain region, it is difficult to search with a general sequence search database such as PubMed. http: //www.girinst. ors / repbase /), RepeatMasker (
  • the specific adhesion sequence and the detection adhesion sequence of the method of the present invention can be set, the detection sensitivity can be increased.
  • measuring these repetitive sequences for example, can be treated as a single saloma of the amount of free DNA in the blood, if you pay attention to species-specific repetitive sequences, organisms It can be used for species identification.
  • a repetitive sequence if a repetitive sequence is measured, a plurality of base sequences existing in one genome are measured simultaneously. For example, the base sequence having the sequence identity of 80% or more with the base sequence represented by SEQ ID NO: 37 has about 2 80 copies in the human genome, and 80% or more of the base sequence represented by SEQ ID NO: 39.
  • the base sequence having homology is about 8 20 copies in the human genome. Therefore, if a detection adhesion sequence and a specific adhesion sequence can be set in each base sequence, compared to the case where a detection adhesion sequence and a specific adhesion sequence are set for a single sequence in one genome, 1
  • the detection sensitivity of the genome can be increased by 2 80 to 8 20 times theoretically.
  • a “duplicate gene” is a gene or gene fragment generated by doubling a specific gene or gene fragment in the genome due to gene duplication.
  • Gene duplication is a phenomenon in which a certain region of DNA containing a gene overlaps.
  • causes of gene duplication include abnormal genetic recombination, retrotransposon transfer, and duplication of the entire chromosome. For example, it means that one gene is copied and inserted into the genome DNA, and inserted into a different chromosomal location, or inserted in the vicinity of the original gene.
  • a place where copied genes are lined up in the vicinity of the original gene is called a tandem repeat, and a group of genes created by gene duplication is called a gene family (or gene family).
  • a “pseudogene” has a nucleotide sequence that is characteristic of the DNA sequence that makes you imagine that it was encoding a gene product (especially a protein). It refers to the missing gene. It is thought to have arisen as a result of mutations in the sequence with the original function. For example, mutations cause stop codons that shorten the peptide chain of the protein, making it unable to function as a protein. You may lose. Pseudogenes often remain the original normal genes, but some become pseudogenes alone.
  • Pseudogenes can be classified into three types according to gene sequence characteristics.
  • DNA made from mRNA by retrotransposon reverse transcriptase is inserted into the genome (a process-type pseudogene)
  • the original gene sequence is duplicated in the genome and some of the copies are suddenly abrupt.
  • Loss of function due to mutation, etc. resulting in a pseudogene (overlapping pseudogene or non-process type pseudogene), and loss of function of a gene in the genome (no duplicate gene, leaving it alone) May become a pseudogene.
  • pseudogenes are also known to be transcribed or have gene function (whether they should be called pseudogenes is not known).
  • “pseudogene” is not the presence or absence of gene function or whether or not it is transcribed, but the above “process type pseudogene” and “duplicate pseudogene (non-process type pseudogene)” Means.
  • the DNA having the target DNA region is a repetitive sequence in the genome, since the repetitive sequence is a group of base sequences having homology, the DNA having the target DNA region is adhered to the DNA for detection. Complementary base pairing of sequences may occur when all of the base sequence does not base pair with DNA having the target DNA region.
  • a base sequence having a homology of 80% or more is about 2880 copies in the genome
  • a SINE (A 1 u) sequence is For number 39, about 8 20 copies of a base sequence having 80% homology or more are found in the genome.
  • the base sequences having homology found in these genomes include those that differ from SEQ ID NO: 37 and SEQ ID NO: 39 by one to several bases.
  • the concentration of sodium salt in the solution (for example, buffer solution) used in the first step of the method of the present invention in the DNA extraction operation for obtaining DNA from the sample is at least Examples include 50 mM or more, preferably 100 mM or more. More specifically, it is 50 mM or more and 100 mM or less, preferably 100 mM or more and 100 mM or less, more preferably 100 mM or more and 20 O mM or less. Further, if the salt containing sodium ions, N a C l, but may be a N a C 0 3, N a 2 What salts containing S_ ⁇ 4, etc., preferably, be mentioned N a C 1 Can do.
  • the present invention is a method for selecting a specimen derived from a cancer patient, and the quantification result or detection result of DNA quantified or detected using the specimen derived from the subject by the method according to any one of the inventions 1 to 13 If the difference between the quantification result or the detection result of the DNA quantified or detected using a specimen derived from a healthy person by the same method is significant, the subject-derived specimen is evaluated as a specimen derived from a cancer patient, and Including a step of identifying a specimen derived from a cancer patient based on the result of the evaluation.
  • Preferred embodiments of the invention include an invention in which the specimen is a mammal-derived serum, and further, a DNA having a target DNA region and a free DNA having a target DNA region in a mammal-derived serum. Can be mentioned. If these inventions are used, it will be possible to easily identify cancer patients by blood tests.
  • cancer patient means a subject who has developed cancer
  • examples of cancer include lung cancer (non-small cell lung cancer, small cell lung cancer), esophageal cancer, stomach cancer, duodenal cancer, colon cancer, rectal cancer, Liver cancer (hepatocellular carcinoma, cholangiocarcinoma), gallbladder cancer, bile duct cancer, knee cancer, colon cancer, anal cancer, breast cancer, cervical cancer, uterine cancer, ovarian cancer, vulvar cancer, vaginal cancer, prostate cancer, kidney cancer, Ureteral cancer, bladder cancer, prostate cancer, penile cancer, testicular cancer, maxillary cancer, tongue cancer, (upper, middle, lower) pharyngeal cancer, laryngeal cancer, acute myeloid leukemia, chronic myelogenous leukemia, acute lymph Leukemia, chronic lymphocytic leukemia, malignant lymphoma B double, myelodysplastic syndrome, thyroid cancer, brain tumor, osteosarcoma, skin cancer (basal cell carcinoma
  • methylcytosine antibody A commercially available methylcytosine antibody (Aviva Systems Biology) was labeled with a biotinylated kit (Biotin Labeling Kit-H2, manufactured by Dojindo Laboratories) according to the method described in the catalog. did.
  • the obtained piotin-labeled methylcytosine antibody was refrigerated and stored as a 0.25 ⁇ g / ZL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP0 7H20, 154 mM NaCl pH 7.4) solution.
  • oligonucleotide primers (? 1 and 1 ⁇ 1) designed for PCR shown in SEQ ID NO: 1 7 and SEQ ID NO: 1 8 below. PCR using the reaction conditions and DNA fragment (X, SEQ ID NO: 19, Genbank) used as the test sample
  • PR1 5 '-CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3' (SEQ ID NO: 18) ⁇ DNA fragment>
  • the PCR reaction solution was 10 ng of genomic DNA to be ⁇ -shaped, 3 ⁇ l of each of the above primer solutions 3 1, 5 ⁇ l of each 2 mM dNTP, and 10 X buffer solution ( ⁇
  • the reaction was incubated at 95 ° C for 10 minutes, then at 95 ° C for 30 seconds 61. PCR was performed under the conditions of 40 cycles of incubation at C for 30 seconds and 72 ° C for 45 seconds for one cycle.
  • DNA fragment X was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PR0MEGA).
  • DNA fragment X For DNA fragment X, the following solutions were prepared in duplicate, respectively.
  • Solution D TE buffer solution (negative control solution) 10 ⁇ L of each of the obtained solutions, 0.5 1 of Sssl methylase (manufactured by NEB), 10 ⁇ l of NEBuffer2 (manufactured by NEB) and 5 ⁇ 1 of 3.2 S-adenosyl methionine (manufactured by NEB) 5 ⁇ 1 was mixed, and sterilized ultrapure water was added thereto to prepare a liquid volume of 50 1. The reaction solution was incubated at 37 ° C. for 30 minutes (this corresponds to the first step of the method of the present invention).
  • a 5 ′ terminal FI TC-labeled oligonucleotide F 1 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 1 capable of binding by complementarity to the oligonucleotide X ′ consisting of the target DNA region shown in SEQ ID NO: 20 was synthesized, and 0.02 A ⁇ Tris-HCl buffer (10 ⁇ ) solution was prepared.
  • the DNA fragment reaction solution 10 prepared above was added to the streptavidin-coated 8-tool strip on which the biotin-labeled methylcytosine antibody was immobilized, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour. After removing the solution by pipetting, add 200 ⁇ L of wash buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na2HP0 7H20, -154 mM NaCl pH 7.4)] The buffer was removed by pipetting. This operation was repeated twice more (this corresponds to the third step of the method of the present invention).
  • a commercially available methylcytosine antibody (manufactured by Aviva Systems Biology Co., Ltd.) using a commercially available pyotinylated kit (Biotin Labeling Kit-NH2, manufactured by Dojindo Laboratories) and in accordance with the method described in the catalog. Labeled.
  • the obtained piotin-labeled methylcytosine antibody was refrigerated and stored as a 0.25 Aig / iL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 3raM Na2HP07H20, 154 mM NaCl pH 7.4) solution.
  • oligonucleotide primers ( ⁇ 1 and? 1) designed for the PCR shown in SEQ ID NO: 1 7 and SEQ ID NO: 1 '8 below.
  • DNA fragment (X, SEQ ID NO: 19, Genbank) used as a test sample by performing PCR using 1) and the reverse conditions
  • DNA fragment X was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PR0MEGA).
  • DNA fragment X For DNA fragment X, the following solutions were prepared.
  • Solution D TE buffer solution (negative control solution)
  • human blood genomic DNA purchased from Clontech was designed for PCR shown in SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 23 below.
  • DNA fragment (Y, SEQ ID NO: 24, Genbank) used as a test sample by performing PCR using oligonucleotide primers (PF 2 and PR 2) and reaction conditions A region corresponding to base numbers 76606-76726 shown in Accession No. AC009800 etc. was amplified.
  • the PCR reaction solution was 10 ng of genomic DNA in the form of a cage, 3 At 1 each of 5 liters of the above primer solution, 5 ⁇ 1 of each 2 mM dNTP, 10 X buffer (lOOmM Tris-HCl Mix pH 8.3, 500 mM KC1, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) 5 1 and metathermal DNA polymerase (AmpliTaq Gold) 5 ⁇ / ⁇ 1 with 0.25 zl, and add sterilized ultrapure water.
  • the liquid volume was 50 ⁇ 1. Incubate the reaction solution at 95 ° C for 10 minutes, then heat at 95 ° C for 30 seconds, then at 60 ° C for 30 seconds, and further at 72 ° C for 45 seconds for 1 cycle. PCR was performed under the conditions used.
  • DNA fragment Y was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PR0MEGA).
  • DNA fragment ⁇ For DNA fragment ⁇ , the following solutions were prepared.
  • Solution A DNA Fragment, Ment Y 10ng / 10 ⁇ ⁇ ⁇ Buffer solution
  • Solution D ⁇ ⁇ Buffer solution (Negative control solution) DNA fragment X solution A and DNA fragment Y solution A prepared above, DNA fragment X solution B and DNA fragment Y solution B, DNA fragment X solution C and DNA fragment Y solution C, Solution D of DNA fragment X and solution D of DNA fragment Y were mixed, and the following DNA fragment mixed solutions MA to MD were prepared in duplicate.
  • a 5 ′ terminal FITC-labeled oligonucleotide F 1 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 21 capable of binding by complementarity to the oligonucleotide X ′ consisting of the target DNA region shown in SEQ ID NO: 20 was synthesized, and 0.02 IM A Tris-HC1 buffer (10 mM) solution was prepared. ⁇ Oligonucleotide consisting of the desired DNA domain>
  • reaction solution 40 prepared above, the above-mentioned 5, terminal FI TC-labeled oligonucleotide solution 10, and buffer solution (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol ) With l O z L, 1 00 mM MgCl 2 solution 1
  • washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (lmM KH 2 P0 4 , 3 mM Na2HP0 7H20, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, The buffer was removed by pipetting. This operation was repeated twice more (this corresponds to the third step of the method of the present invention).
  • the reaction was stopped by allowing it to stand at room temperature for about 30 minutes and adding a stop solution (2 ⁇ H 2 SO 4 aqueous solution) to each well at a rate of 50 °. Absorbance at 45 O nm was measured within 30 minutes after stopping the reaction. (This corresponds to the fourth step of the method of the present invention) The results are shown in FIG. In Solution MA, Solution MB, and Solution MC, the absorbance increased compared to Solution MD. Its intensity increased depending on the concentration of the DNA fragment.
  • Biotin Labeling Kit-NH2 Biotin Labeling Kit-NH2
  • a commercially available methylcytosine antibody manufactured by Aviva Systems Biology
  • the resulting Biochin labeled methylcytosine antibody 0. 25 ⁇ ⁇ / ⁇ ⁇ 0. 1% BSA -containing phosphate buffer (ImM K P0 4, 3mM Na2HP0 7H20, 154mM NaCl pH7. 4) stored refrigerated as a solution.
  • oligonucleotide primers (PF 1 and PR 1) designed for PCR shown in SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 below and the reaction conditions were used.
  • DNA fragments used as test samples (X, SEQ ID NO: 19, Genbank)
  • PR 1 5 '-CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3, (SEQ ID NO: 18) DNA fragment>
  • the PCR reaction solution was 10 ng of genomic DNA in the form of ⁇ , 3 1 of each of the above primer solutions of ⁇ ⁇ ⁇ , 5 ⁇ 1 of each 2 mM dNTP, 10 X buffer (lOOraM Tris-HCl Mix pH 8.3, 500 mM KC1, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) 51 with thermostable DNA polymerase (AmpliTaq Gold) 5 ⁇ / ⁇ 1 0.25 1 and add sterilized ultrapure water to this.
  • the liquid volume was 50 ⁇ 1.
  • reaction solution was incubated at 95 ° C for 10 minutes, then heated at 95 ° C for 30 seconds, then at 61 ° C for 30 seconds, and further at 72 ° C for 45 seconds for one cycle.
  • PCR was performed under cycling conditions. After PCR, amplification was confirmed by 2% agarose gel electrophoresis, and DNA fragment X was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PR0MEGA).
  • DNA fragment X For DNA fragment X, the following solutions were prepared.
  • Solution D ⁇ ⁇ Buffer solution (negative control solution)
  • oligonucleotide primers designed for PCR For human blood genomic DNA purchased from Clontech, for the PCR shown in SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 23 below DNA fragments (Y, SEQ ID NO: 24, shown in Genbank Accession No. AC009800 etc.) used as test samples by performing PCR using the designed oligonucleotide primers (PF 2 and PR 2) and reaction conditions Region corresponding to base numbers 76606 to 76726) was amplified.
  • Oligonucleotide primers designed for PCR >
  • PCR reaction solution 10 ng of genomic DNA in a bowl, 3 ⁇ 1 each of the above primer solutions, 2 mM each (1 ?? 5 1 and 10 X buffer (lOOmM Tris- HCl pH 8.3, 500 mM KC1, 15roM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) 5 1 and heat resistance D NA polymerase (AmpliTaq Gold) 511/1 was mixed with 0.25 ⁇ 1, and sterilized ultrapure water was added thereto to make the volume 5 0 1.
  • the reaction solution was incubated at 95 ° C for 10 minutes, then at 95 ° C for 30 seconds, then at 60 ° C for 30 seconds, and further at 72 ° C for 45 seconds. PCR was performed under the condition of 50 cycles of incubation for 1 cycle.
  • DNA fragment Y was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PR0MEGA).
  • DNA fragment ⁇ For DNA fragment ⁇ , the following solutions were prepared.
  • Solution D TE buffer solution (negative control solution) Solution A of DNA fragment X and solution A of DNA fragment Y prepared above, Solution B of DNA fragment X and solution B of DNA fragment Y DNA fragment X solution C and DNA fragment Y solution C, DNA fragment X solution D and DNA fragment Y solution D are mixed, and the DNA fragment mixture solutions MA to MD shown below are mixed. Prepared in duplicate.
  • Solution MD ⁇ ⁇ Buffer solution (negative control solution) Each solution obtained was 20 ⁇ L, Sssl methylase (NEB) 0.5 ⁇ 1, and 10 xNEBuffer2 (NEB) 5 ⁇ 1 and 3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB) 0.5 ⁇ 1 were mixed, and sterilized ultrapure water was added to make the volume to 50 ⁇ 1 Prepared. The reaction solution was incubated for 30 minutes at 37 ° C. (this corresponds to the first step of the method of the present invention).
  • the reaction solution 40 prepared above 10 L of the 5′-terminal FI TC-labeled oligonucleotide solution, and buffer solution (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 s 5raM Dithiothreitol) 10 / L, 100 mM MgCl 2 solution 10 and 1 mg / mL BSA solution 10 L were added, and sterilized ultrapure water was added to the mixture to bring the volume to 100 L and mixed.
  • the PCR tube was then heated at 95 ° C for 10 minutes, quickly cooled to 70 ° C, and kept at that temperature for 10 minutes. Next, the mixture was cooled to 50 ° C and incubated for 10 minutes, and further incubated at 37 ° C for 10 minutes. And corresponds to the second step of the method of the present invention).
  • the above-prepared DNA fragment reaction solution 100 was added to the streptavidin-coated 8-well strip on which the above-mentioned pyotin-labeled methylcytosine antibody was immobilized, and left at room temperature for 1 hour. Thereafter, the solution was removed by pipetting, 20 0 mu L wash puffer of [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4, 3mM Na2HP07H20, 154mM NaCl pH7.4)] was added, pin the buffer For petting. More removed. This operation was repeated twice more (this corresponds to the third step of the method of the present invention).
  • HRP-labeled FI TC antibody solution Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., 0.005 / ig / 100 / zL 0.1% BSA -containing phosphate buffer (ImM K P0 4, 3mM Na2HP0 7H20, 151 ⁇ 2M NaCl ⁇ 7 ⁇ 4) solution] Each Ueru After the addition at a rate of 100 ° C., the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • Biotin Labeling Kit-NH2 Biotin Labeling Kit-NH2
  • a commercially available methylcytosine antibody (Aviva Systems Biology) was labeled according to the method described in the catalog. did.
  • the obtained biotin-labeled methylcytosine antibody was refrigerated and stored as a 0.25 ug / uL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP0 7H20, 154 mM NaCl pH 7.4) solution.
  • BSA-containing phosphotin-labeled methylcytosine antibody obtained by synthesis Prepare an acid buffer (lmM KH 2 P0 4 , 3 mM Na2HP0 7H20, 154 mM NaCl pH 7.4) solution, and apply it to a 100 ⁇ L each streptavidin-coated 8-layer strip (manufactured by Perkin Elmer). The mixture was added and allowed to stand at room temperature for about 1 hour to be immobilized on the well.
  • washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na2HP0 7H20, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was decanted. It was removed with a tissue. This operation was repeated two more times (this corresponds to the preparation of the immobilized methylated DNA antibody used in the method of the present invention).
  • oligonucleotide primers designed for PCR shown in SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 below (1 and ⁇ 1 1) and the reaction conditions DNA fragment used as a test sample by performing PCR (X, SEQ ID NO: 19, region corresponding to base number 25 6 87390-256 87 775 shown in Genbank Accession No. NT— 0 29 419, etc.) was amplified.
  • PCR ⁇ Oligonucleotide Primer designed for PCR>
  • PR 1 5'-CTGGCCAAACTGGAGATCGC-3, (SEQ ID NO: 18) ⁇ DNA fragment>
  • the PCR reaction solution was 10 ng of the genomic DNA to be used in a bowl, 3 ⁇ l each of the above primer solutions of 5 / _ ⁇ , each 2 mM dNTP, and 10 X buffer (lOOraM Tris-HCl H 8.3, 500 mM KC1, 15 mM MgCl (0.01% Gelatin) 5 1 and thermostable DNA polymerase (AmpliTaq Gold) 5U / 1 are mixed with 0.25 ⁇ 1 and sterilized ultrapure water is added to the solution. The amount was 50 ⁇ 1.
  • the reaction solution is kept at 95 ° C for 10 minutes, and then at 95 ° C for 30 seconds! PCR was performed under the conditions of 40 cycles of incubation at 61 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 45 seconds for 1 cycle.
  • DNA fragment X was purified using Wizard SV Gel / PCR Kit (PR0MEGA).
  • DNA fragment X For DNA fragment X, the following solutions were prepared.
  • Solution D ⁇ ⁇ Buffer solution (negative control solution)
  • human blood genomic DNA purchased from Clontech was designed for the PCR shown in SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 23 below.
  • DNA fragments used as test samples (Y, SEQ ID NO: 24, shown in Genbank Accession No. AC009800, etc.) by performing PCR using oligonucleotide primers (PF 2 and PR2) and reaction conditions The region corresponding to base number 76606-76726) was amplified.
  • PR 2 5,-GCGCCGGGTCCGGGCCC -3, (SEQ ID NO: 23) DNA fragment> Y: 5 '-
  • the PCR reaction solution was 10 ng of genomic DNA to form a cage, 3 1 of each of the above primer solutions of 3 1, 5 ⁇ l of each 2 mM dNTP, 10 X buffer (lOOmM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KC1, 15mM MgCl (0.01% Gelatin) 5/1 and metathermic DNA polymerase (AmpliTaq Gold) 5U // _ tl mixed with 0.25 1 and sterilized ultrapure water was added to make the volume 50 ⁇ 1.
  • the reaction solution is incubated at 95 ° C for 10 minutes, then at 95 ° C for 30 seconds, then at 60 ° C for 30 seconds, and then at 2 ° C for 45 seconds for one cycle. PCR was performed under conditions where incubation was performed for 50 cycles.
  • Solution D ⁇ ⁇ Buffer solution (negative control solution) Solution of DNA fragment X prepared above ⁇ and solution A of DNA fragment Y, solution B of DNA fragment X and solution B of DNA fragment Y, DNA fragment X solution C and DNA fragment Y solution C are mixed with DNA fragment X solution D and DNA fragment Y solution D, respectively, and DNA fragment mixed solutions MA to MD shown below are duplicated in duplicate. Prepared.
  • Solution MC 0. lng / 20 ⁇ L ⁇ ⁇ Buffer solution Solution
  • MD TE buffer solution (negative control solution) 10 ⁇ L of each of the obtained solutions, 0.5 ⁇ 1 of Sssl methylase (NEB), and 10 x NEBuffer2 (NEB) 5 ⁇ 1 and 3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB) 0.5 M 1 were mixed, and sterilized ultrapure water was added to prepare a liquid volume of 5 0 1 did .
  • the reaction solution was incubated at 37 ° C. for 30 minutes (this corresponds to the first step of the method of the present invention).
  • 5′-terminal FITC-labeled oligonucleotide F1 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 21 capable of binding by complementarity to the oligonucleotide X ′ consisting of the target DNA region shown in SEQ ID NO: 20 is synthesized, and Synthesizes a terminal FITC-labeled oligonucleotide F2 consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 26 that can be complemented to the oligonucleotide FY 'consisting of the target DNA region represented by SEQ ID NO: 25.
  • a Tris-HC1 buffer (10 mM) solution with a concentration of 0.02 / M was prepared.
  • a commercially available methylcytosine antibody (manufactured by Aviva Systems Biology) was labeled using a commercially available pyotinylated kit (Biot in Labeling Kit_NH2, manufactured by Dojindo Laboratories) according to the method described in the catalog. .
  • the obtained biotin-labeled methylcytosine antibody was refrigerated and stored as a 0.25 ⁇ g / L 0.1% BSA-containing phosphate buffer solution (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP0 7H20, 154 mM NaCl pH 7.4).
  • washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3raM Na2HP0 7H20, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was decanted. It was removed with a tissue. This operation was repeated two more times (this corresponds to the preparation of the immobilized methyl imibo DNA antibody used in the method of the present invention).
  • Baker's yeast strain X 2 1 8 0-1 A is YPD medium% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, H 5.6-6.0), and turbidity is 0D 60 . Incubate until 0.6-1.0, 10,000xg And lxlO 7 yeast cells were prepared by centrifugation for 10 minutes. Yeast genomes were obtained from the prepared yeast cells using a general yeast genome preparation method as described in Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory).
  • the prepared yeast cells are suspended in buffer A (1M sorbitol, 0.1M EDTA, pH 7.4), and 0.1% 2-mercaptoethanol (final concentration 14 mM) and 100 U zymolase (10 mg / ml) are added. Incubate with stirring at 30 ° C for 1 hour until the solution was clear. Protoplasts were collected by centrifugation at 550 xg for 10 minutes, suspended in buffer B (50 ⁇ Tris-HCl, pH 7.4, 20 mM EDTA), and sodium dodecyl sulfate was added to 1% (w / v). Thereafter, it was incubated at 65 ° C for 30 minutes.
  • buffer A 1M sorbitol, 0.1M EDTA, pH 7.4
  • 2-mercaptoethanol final concentration 14 mM
  • 100 U zymolase 10 mg / ml
  • PCR was carried out using the oligonucleotide primers (PF 3 and PR 3) designed for PCR shown in SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 below and the reaction conditions.
  • PF 3 and PR 3 oligonucleotide primers designed for PCR shown in SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 below and the reaction conditions.
  • S a DNA fragment (S, a region corresponding to nucleotide numbers 271743 to 272083 of yeast chromosome VII shown in SEQ ID NO: 29, Genbank Accession No. NC_001139, etc.) used as a test sample was amplified.
  • PCR reaction solution 10 ng of genomic DNA in the form of ⁇ , 3 ⁇ 1 each of 5 ⁇ of the above primer solution, 5/1 each 2 mM dNTP, 10 X buffer (lOOmM Tris- HCl pH 8.3, 500 mM KC1, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) 5 1 and thermostable DNA polymerase (AmpliTaq Gold) 5U / V1 mixed with 0.2 5 ⁇ 1 and sterilized ultrapure water To make the liquid volume 50 1 was used. The reaction solution is incubated at 95 ° C for 10 minutes, then at 95 ° C for 20 seconds, then at 58 ° C for 30 seconds, and at 72 ° C for 30 seconds for one cycle. PCR was performed under the condition of performing 40 cycles.
  • a 5 ′ terminal FI TC-labeled oligonucleotide F3 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 31 capable of binding by complementarity to the oligonucleotide S, consisting of the target DNA region shown in SEQ ID NO: 30 was synthesized, and 0.02 ⁇ Tris-HC1 buffer (10) was prepared.
  • reaction solution 40 prepared above, the 5′-terminal FI TC-labeled oligonucleotide solution 10 and the buffer (330raM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol). l O / ⁇ L, 100 mM MgCl 2 solution 1
  • the DNA fragment reaction solution 100 prepared above was added to the streptavidin-coated 8-well strip on which the biotin-labeled methylcytosine antibody was immobilized, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour. Then, the solution was removed by pipetting, and after adding 200 uL of washing puffer [0.05% Tween20-containing phosphate puffer (IraM KH 2 P0 4 , 3 mM Na2HP0 7H20, 154 mM NaCl pH7.4)] The buffer was removed by pipetting. This operation was repeated twice more (this corresponds to the third step of the method of the present invention).
  • HRP-labeled FITC antibody solution [Jackson Iramuno Research Laboratories, 0. 0.1% BSA-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3raM Na2HP0 7H20, 154 mM NaCl pH7.4) solution] was added to each well at a rate of 100 ⁇ u L and allowed to stand at room temperature for 1 hour. did. After standing, each well was added with 200 ⁇ L of washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na2HP0 7H20, 154 mM NaCl pH 7.4)], and the buffer was added. Removed by decantation. This operation was repeated two more times. Substrate (R & D, # DY999) was added and mixed at a ratio of 100 ⁇ L to each well, and the reaction was started.
  • Biotin Labeling Kit-NH2 Biotin Labeling Kit-NH2
  • a commercially available methylcytosine antibody (Aviva Systems Biology) was labeled according to the method described in the catalog. did.
  • the resulting Biochin labeled methylcytosine antibody 0. 25 / g / L 0. 1 % BSA -containing phosphate buffer (ImM K3 ⁇ 4 P0 4, 3mM Na2HP0 7H20, 154mM NaCl pH7. 4) stored refrigerated as a solution.
  • Baker's yeast strain X 2 1 8 0-1 A in YPD medium (1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6. 0) with a turbidity of 0D 6 . .
  • the cells were cultured until 0. 6-1. 0 and centrifuged at 10, OOOxg for 10 minutes to prepare lx10 7 yeast cells.
  • Yeast genomes were obtained from the prepared yeast cells using a general yeast genome preparation method as described in Methods in 'Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory).
  • the prepared yeast cells are suspended in buffer A (1M sorbitol, 0,1M EDTA, pH 7.4), 0.1% 2-mercaptoethanol (final concentration 14 mM) and 100 U zymolase (10 mg / ml) was added and incubated with stirring at 30 ° C. for 1 hour until the solution was clear. Centrifuge at 550xg for 10 minutes to collect the protoplasts, suspend in buffer B (50 mM Tris-HC1, pH 7.4, 20 mM EDTA), and then add sodium dodecyl sulfate to 1% (w / v). After the addition, it was incubated at 65 ° C for 30 minutes.
  • buffer A 1M sorbitol, 0,1M EDTA, pH 7.4
  • 2-mercaptoethanol final concentration 14 mM
  • 100 U zymolase 10 mg / ml
  • PCR was carried out using oligonucleotide primers (PF 3 and PR 3) designed for PCR shown in SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 below and reaction conditions.
  • a DNA fragment (S, a region corresponding to nucleotide number 271743-272083 of yeast chromosome VII shown in SEQ ID NO: 29, Genbank Accession No. NC_001139, etc.) used as a test sample was amplified.
  • PCR reaction solution 10 ng of the genomic DNA to be ⁇ type, 3 1 of each primer solution of 5 ⁇ , each 2 mM 11 ⁇ 5 1 and 10 X buffer (lOOmM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KC1, 15raM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) 5 ⁇ 1 and thermostable DNA polymerase (AmpliTaq Gold) 511 / ⁇ 1 0.25 ⁇ 1 was mixed, and sterilized ultrapure water was added thereto to make the volume 50 ⁇ 1.
  • Solution A DNA Frata ', Mento S 10ng / 10 ⁇ ⁇ ⁇ Buffer solution
  • PR4 5'-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3, (SEQ ID NO: 33)
  • the PCR reaction solution includes 10 ng of genomic DNA to form a cage, 3 ⁇ 1 each of 5 ⁇ of the above primer solution, 2 mM each (11 ⁇ -?? 5 1, 10 X buffer (lOOmM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KC1, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) 5 1 and metathermal DNA polymerase (AmpliTaq Gold) 51] / 1 mixed with 0.25 ⁇ 1 and sterilized Ultrapure water was added to make the volume 50 ⁇ l 1.
  • the reaction solution was incubated at 95 ° C for 10 minutes, then at 95 ° C for 20 seconds and then at 58 ° C for 30 seconds. PCR was carried out under the condition of 40 cycles of incubation at 72 ° C for 30 seconds with 1 cycle of 30 seconds.
  • DNA fragment T was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PR0MEGA).
  • DNA fragment ⁇ For DNA fragment ⁇ , the following solutions were prepared.
  • Solution C TE buffer solution (negative control solution) Solution A of DNA fragment S and solution A of DNA fragment T prepared above, solution B of DNA fragment S and solution B of DNA fragment T, DNA fragment S Solution C and DNA fragment T solution C were mixed, and the following DNA fragment mixed solutions MA to MC were prepared in duplicate.
  • Solution MC ⁇ ⁇ Buffer solution (negative control solution) 20 ⁇ L of each solution, 0.5 1 of Sssl methylase (NEB), 10 x NEBuffer2 (NEB) 5 and 3.2 mM S-adenosyl methionine (manufactured by NEB) 0.5 ⁇ 1 were mixed, and sterilized ultrapure water was added to prepare a solution volume of 50 1. It was. The reaction solution was incubated at 37 ° C. for 30 minutes (this corresponds to the first step of the method of the present invention).
  • a 5 ′ terminal FI TC-labeled oligonucleotide F3 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 31 capable of binding by complementarity to the oligonucleotide S ′ consisting of the target DNA region shown in SEQ ID NO: 30 was synthesized, and 0.02 ⁇ A Tris_HCl buffer solution (10) was prepared. Oligonucleotide consisting of the desired DNA region
  • reaction solution 40 prepared above, the 5′-end FITC-labeled oligonucleotide solution 10 / zL, and buffer solution (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol ) and 10 L, 100 mM M g Cl 2 solution 1 0 Shito, was added 1 mg / mL BSA solution 10 L, a further liquid volume added with sterilized ultrapure water to the mixture and 100 u L, mix did.
  • the PCR tube was then heated at 95 ° C for 10 minutes, quickly cooled to 70 ° C, and kept at that temperature for 10 minutes.
  • the mixture was cooled to 50 ° C and incubated for 10 minutes, and further incubated at 37 ° C for 10 minutes. And corresponds to the second step of the method of the present invention).
  • 100 L of the DNA fragment reaction solution prepared above was added and left at room temperature for 1 hour.
  • washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na2HP0 7H20, 154 mM NaCl pH7.4)] was added, The buffer was removed by pipetting. This operation was repeated twice more (this corresponds to the third step of the method of the present invention).
  • HRP-labeled FITC antibody solution Jackson ImmunoRe search Laboratories, 0.005 ⁇ / 100 ⁇ 0.1% BSA-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3raM Na2HP0 7H20, 154 mM NaCl pH 7.4) solution ] was added to each well at a rate of 100; uL, and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After standing, each tool was added with 200 L of washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na2HP0 7H20, 154 mM NaCl pH 7.4)] was removed by decantation. This operation was repeated two more times. Substrate (R & D, # DY999) was added and mixed in each well at a rate of 10 ° L to start the reaction.
  • methylcytosine antibody (Aviva Systems Biology) Biotin Labeling Kit-NH2 (manufactured by Dojindo Laboratories) was used to label the thiotin according to the method described in the catalog.
  • the obtained biotin-labeled methylcytosine antibody was refrigerated and stored as a 0.25 g / ⁇ L 0.1% BSA-containing phosphate buffer (lraM KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP0 7H20, 154 mM NaCl pH 7.4) solution.
  • Biochin labeled methylcytosine antibody obtained by ⁇ .
  • 1% BSA-containing phosphate buffer ImM KH 2 P0 4, 3raM Na2HP0 7H20, 154mM NaCl pH7. 4
  • washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na2HP0 7H20, 154raM NaCl pH 7.4)] was added, The buffer was removed by decantation. This operation was repeated two more times (this corresponds to the preparation of the immobilized methylated DNA antibody used in the method of the present invention).
  • Baker's yeast strain X 2 1 8 0— 1 A in YPD medium (1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6. 0) with a turbidity of 0D 6 . .
  • the cells were cultured until 0. 6-1. 0 and centrifuged at 10, OOOxg for 10 minutes to prepare lx lO 7 yeast cells.
  • Yeast genomes were obtained from the prepared yeast cells using a general yeast genome preparation method as described in Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory).
  • the prepared yeast cells are suspended in buffer A (1M sorbitol, 0.1M EDTA, pH 7.4), 0.1% 2-mercaptoethanol (final concentration 14 mM) and 100 U zymolase (10 mg / ml). ) was added and incubated at 30 ° C for 1 hour with stirring until the solution was clear. Centrifuge at 550xg for 10 minutes to collect the protoplasts, suspend in Buffer B (50 mM Tris-HC1, pH 7.4, 20 mM EDTA), and then add sodium dodecyl sulfate to 1% (w / v). And then incubated at 65 ° C for 30 minutes.
  • buffer A 1M sorbitol, 0.1M EDTA, pH 7.4
  • 2-mercaptoethanol final concentration 14 mM
  • 100 U zymolase 10 mg / ml
  • PCR was carried out using oligonucleotide primers (PF 3 and PR 3) designed for PCR shown in SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 below and reaction conditions.
  • a DNA fragment (S, a region corresponding to the base number 271743-272083 of yeast chromosome VII shown in SEQ ID NO: 29, Genbank Accession No. NC-001139, etc.) used as a test sample was amplified.
  • PCR reaction solution 10 ng of genomic DNA in the form of ⁇ , 3 ⁇ l of each of the above primer solutions, 51 of each 2 mM dNTP, 10X buffer solution (lOOraM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KC1, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) 5 1 and thermostable DNA polymerase (AmpliTaq Gold) 5 U / l 0.25 1 are mixed with this, and sterilized ultrapure water Was added to make the volume 50 ⁇ 1.
  • the reaction solution is kept at 95 ° C for 10 minutes, and then kept at 95 ° C for 20 seconds, then at 58 ° C for 30 seconds, and further at 72 ° C for 30 seconds for one cycle for 40 cycles. PCR was performed under conditions.
  • DNA fragment S was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PROMEGA).
  • oligonucleotide primers (PF4 and PF4) designed for PCR shown in SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 33 below.
  • the DN ⁇ fragment used as the test sample (T, SEQ ID NO: 34, base number 384569- of yeast chromosome VII shown in Genbank Accession No. NC—001139, etc.) The region corresponding to 384685) was amplified.
  • the reaction solution of PCR was 10 ng of genomic DNA in the form of ⁇ , 5 ⁇ ⁇ each of the above primer solutions 31, each 2 mM dNTP 51, and 10 X buffer (lOOmM Tris- HCl pH 8.3, 500 mM KC1, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) 5 ⁇ 1 and thermostable DNA polymerase (AmpliTaq Gold) 5 ⁇ / ⁇ 1 are mixed with O. 25 zl, and this is sterilized with ultrapure water. In addition, a solution whose volume was 50 1 was used.
  • reaction solution was incubated at 95 ° C for 10 minutes, then at 95 ° C for 20 seconds, then at 58 ° C for 30 seconds, and further at 72 ° C for 30 seconds.
  • PCR was performed under the condition of 40 cycles of incubation with an interval of 1 cycle.
  • DNA fragment T was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PR0MEGA).
  • Solution C ⁇ Buffer solution (negative control solution) Solution of DNA fragment S prepared above ⁇ and solution A of DNA fragment T, solution B of DNA fragment S and solution B of DNA fragment T, A solution C of DNA fragment S and a solution C of DNA fragment T were mixed, and the following DNA fragment mixed solutions MA to MC shown below were prepared in duplicate.
  • Solution MC ⁇ ⁇ Buffer solution (negative control solution) 20 L of each solution, Sssl methylase (NEB) 0.5 ⁇ 1, and 10 xNEBuffer2 (NEB) 5 1 and 3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB) 0.5 ⁇ 1 were mixed, and sterilized ultrapure water was added thereto to prepare a liquid volume of 50 ⁇ 1. The reaction solution was incubated for 30 minutes at 37 ° C. (this corresponds to the first step of the method of the present invention).
  • a 5′-terminal FI TC-labeled oligonucleotide F3 consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 31 capable of binding by complementarity to the oligonucleotide S, consisting of the target DNA region shown in SEQ ID NO: 30;
  • 5 ′ terminal FI TC-labeled oligonucleotide F4 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 36 capable of binding by complementarity to oligonucleotide T, consisting of the target DNA region shown in SEQ ID NO: 35, was synthesized.
  • a Tris-HCl buffer (10 mM) solution having a concentration of 0.02% was prepared. > Oligonucleotide consisting of the desired DNA region>
  • reaction solution 40 prepared above, the 5′-end FITC-labeled oligonucleotide solution 10 and the buffer solution (330m Tris-Acetate pH 7.9, 660raM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5mM Dithiothreitol).
  • buffer solution 330m Tris-Acetate pH 7.9, 660raM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5mM Dithiothreitol.
  • l O ⁇ L, 100 L of 100 mM MgCl 2 solution, 1 mg / mL BSA solution, 1 ⁇ , and add sterilized ultrapure water to the mixture to bring the volume to 100 / z L. Mix did.
  • the PCR tube was then heated at 95 ° C for 10 minutes, quickly cooled to 70 ° C, and kept at that temperature for 10 minutes. Then 50.
  • HRP-labeled FITC antibody solution Jackson ImmunoRe search Laboratories, 0.005 ⁇ g / 100 ⁇ 0.1% BSA-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na2HP0 7H20, 154 mM NaCl pH 7.4) The solution was added to each tool at a ratio of 100 and then allowed to stand at room temperature for 1 hour. After standing, add 20 L of wash buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na2HP0 7H20, 154 mM NaCl pH 7.4)] to each tool, and then decant the buffer. It was removed by station. This operation was repeated two more times. Substrate (R & D, # DY999) was added and mixed at a ratio of 100 ⁇ L to each well to start the reaction.
  • biotin labeling did.
  • the obtained biotin-labeled methylcytosine antibody was added at 0.25 ° / ⁇ 0.1 ° /.
  • BSA-containing phosphate buffer ImM K P0 3raM Na2HP0 7H20, 154 mM NaCl pH 7.4 was stored refrigerated.
  • Solution D TE buffer solution (negative control solution) 5 L of each solution prepared above, 10 U of restriction enzyme X spl and 10 X buffer solution (200 mM Tris- HCl H 8.5, lOOmM MgCl 2 , lOmM Dithiothreitol, lOOOmM KC1) 2 were mixed, and sterilized ultrapure water was added thereto to adjust the volume to 20 ⁇ 1. The reaction was incubated at 37 ° C for 1 hour.
  • Oligonucleotide Z (region corresponding to base numbers 115 to 386 shown in Genbank Accession No. M80340 etc.) consisting of the target DNA region shown in SEQ ID NO: 37 designed in the LINE1 region known as a human transposon 5 'terminal FITC-labeled oligonucleotide F5 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 38, which can be bound by complementarity, was synthesized, and a 0.02 ⁇ Tris-HC1 buffer (10 mM) solution was prepared. ⁇ Oligonucleotide consisting of the desired DNA region>
  • reaction solution 40 prepared above and the 5′-end FITC-labeled oligonucleotide solution 10 and buffer solution (330 mM Tris-Acetate H 7.9, 660raM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM) Dithiothreitol), 10 / L, 10 mM MgCl 2 solution, 10 L, 1 mg / mL BSA solution, 10 L, and then add sterilized ultrapure water to the mixture to bring the volume to 1 0 0 z L and mixed. Thereafter, the PCR tube was heated at 95 ° C for 10 minutes, rapidly cooled to 70 ° C, and kept at that temperature for 10 minutes.
  • buffer solution 330 mM Tris-Acetate H 7.9, 660raM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM
  • Dithiothreitol 330 mM Tris-Acetate H 7.9, 660raM K0
  • the DNA fragment reaction solution 100 prepared above was added to the streptavidin-coated 8-well strip on which the above-mentioned pyotin-labeled methylcytosine antibody was immobilized, and left at room temperature for 1 hour. Then, remove the solution by pipetting, add 200 ⁇ L of wash buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na2HP0 7 154 154 mM NaCl pH7.4)] The buffer was removed by pipetting. This operation was repeated twice more (this corresponds to the third step of the method of the present invention). '
  • ITC antibody solution [Jackson ImmunoRe search Laboratories, 0.005 ⁇ g / 100 ⁇ L 0.1% BSA-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 3mM Na2HP0 7H20, 154raM NaCl pH7.4 solution)] After addition at a rate of 100 / ⁇ L, the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour. After standing, each well was added with 200 ⁇ L of washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na2HP0 7H20, 154 mM NaCl pH7.4)] The buffer was removed by decantation. This operation was repeated two more times. Substrate (R & D, # DY999) was added and mixed at a ratio of 100 L to each well to start the reaction.
  • methylcytosine antibody A commercially available methylcytosine antibody (Aviva Systems Biology) is labeled with a biotin labeling kit (Biotin Labeling Kit-NH2, manufactured by Dojindo Laboratories) according to the method described in the catalog. did.
  • Biochin labeled methylcytosine antibody 0. 25 ⁇ ⁇ / ⁇ ⁇ 0. 1% BSA -containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4, 3mM Na2HP0 7H20, 154mM NaCl pH7. 4) stored refrigerated as a solution.
  • Solution A Human blood-derived DNA, NOM DNA 100 ng / 5 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Buffer solution
  • Solution D ⁇ ⁇ Buffer solution (negative control solution) 5 L of each of the solutions prepared above, 4 U of restriction enzyme M s ⁇ I, and 10 s optimal for M s ⁇ I Buffer solution (lOOmM Tris-HCl pH 7.5, lOOraM MgCl 2 , lOmM Dithiothreitol, 500 mM NaCl) 2 ⁇ 1 was mixed with sterilized ultrapure water to make the volume 20 ⁇ l. Was prepared. The reaction was incubated at 37 ° C for 1 hour.
  • Oligonucleotide W (Genbank Accession No. AF 4581 corresponding to nucleotide numbers 178-262 shown in Genbank Accession No. AF 4581 10 etc.) composed of the target DNA region shown in SEQ ID NO: 39 designed in the A 1 u region known as human transposon 5 'terminal FI TC-labeled oligonucleotide F 6 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 40 that can be bound by complementarity with the region) was synthesized, and a 0.02 ⁇ 2 Tris_HCl buffer (10 mM) solution was prepared.
  • the reaction solution 40 prepared above 10 L of the 5′-terminal FI TC-labeled oligonucleotide solution, and buffer solution (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol)
  • buffer solution 330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol
  • Add lO ⁇ L 100 mM MgCl 2 solution 10 and 1 mg / mL BSA solution 10 / L, and add sterilized ultrapure water to the mixture to make the volume 100 L. did.
  • the PCR tube was then heated at 95 ° C for 10 minutes, quickly cooled to 70 ° C, and kept at that temperature for 10 minutes.
  • the mixture was cooled to 50 ° C and incubated for 10 minutes, and further incubated at 37 ° C for 10 minutes. And corresponds to the second step of the method of the present invention).
  • the DNA fragment reaction solution 100 ⁇ iL prepared above was added and allowed to stand at room temperature for 1 hour. Then, the solution was removed by pipetting, and after adding 200 IX L washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na2HP0 7H20, 154 mM NaCl pH 7.4)], The puffer was removed by pipetting. This operation was repeated twice more (this corresponds to the third step of the method of the present invention).
  • HRP-labeled FITC antibody solution Jackson ImmunoResearch Laboratories, 0.005 Mg / 100 / i L 0.1% BSA-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na2HP0 7H20, 154 mM NaCl pH 7.4) [Solution] was added to each flask at a rate of 100 L and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After standing, each well was added with 200 L of washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 3raM Na2HP0 7H20, 154 mM NaCl pH7.4)], and the buffer was added. Removed by decantation. This operation was repeated two more times. Substrate (R & D, # DY999) was added and mixed at a ratio of 100 to each volume, and the reaction was started.
  • BSA-containing phosphate buffer ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na2HP
  • Example 1 Using a commercially available methylcytosine antibody (Aviva Systems Biology) and a biotin labeling kit (Biotin Labeling Kit-NH2, manufactured by Dojindo Laboratories) according to the method described in the catalog, Labeled. The resulting Piochin labeled methylcytosine antibody 0. 25 ⁇ ⁇ / ⁇ ⁇ 0. 1% BSA -containing phosphate buffer (ImM K3 ⁇ 4 P0 4, 3mM Na2HP0 7H20, 154mM NaCl P H7. 4) stored refrigerated as a solution.
  • BSA -containing phosphate buffer ImM K3 ⁇ 4 P0 4, 3mM Na2HP0 7H20, 154mM NaCl P H7. 4
  • Baker's yeast strain X 2 1 8 0— 1 A in YPD medium (1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6. 0) with a turbidity of 0D 6 . .
  • the cells were cultured until 0.6-1.0 and centrifuged at 10,000 ⁇ g for 10 minutes to prepare lx10 7 yeast cells. From the prepared yeast cells, the yeast genome was obtained by using a general yeast genome preparation method as described in Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory).
  • the prepared yeast cells are suspended in buffer A (1M sorbitol, 0.1M EDTA, pH 7.4), 0.1% 2-mercaptoethanol (final concentration 14 mM) and 100 U zymolase (10 mg / ml). ) was added and incubated at 30 ° C for 1 hour with stirring until the solution was clear. Centrifuge at 550xg for 10 minutes to collect the protoplasts, suspend in buffer B (50 mM Tris-HC1, pH 7.4, 20 mM EDTA), and then add sodium dodecyl sulfate to 1% (w / v). After the addition, it was incubated at 65 ° C for 30 minutes. Subsequently, 2/5 volume ratio of 5M CH 3 C00K was added and mixed.
  • buffer A 1M sorbitol, 0.1M EDTA, pH 7.4
  • 2-mercaptoethanol final concentration 14 mM
  • 100 U zymolase 10 mg / ml
  • oligonucleotide primers (PF 3 and PR 3) designed for the PCR shown in SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 below and reaction conditions were used.
  • a DNA fragment (S, a region corresponding to nucleotide numbers 271743- 272083 of yeast chromosome VII shown in SEQ ID NO: 29, Genbank Accession No. NC_001139, etc.) used as a test sample was amplified.
  • reaction solution of PCR 10 ng of the genomic DNA to be used as a cage and 5 ⁇ of the above-mentioned Immediate solution 3 il each, 5 ⁇ 1 each 2 mM dNTP, 10 X buffer (lOOmM Tris-HC1 pH 8.3, 500 mM KC1, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) 5 1, heat resistant DNA Polymerase (AmpliTaq Gold) 511 / ⁇ 1 was mixed with 0.25 ⁇ 1 and sterilized ultrapure water was added to make the volume 50 ⁇ 1.
  • the reaction solution is incubated at 95 ° C for 10 minutes, then at 95 ° C for 20 seconds, then at 58 ° C for 30 seconds, and further at 72 ° C for 30 seconds for one cycle. PCR was performed under the condition of 40 cycles.
  • DNA fragment S was purified using Wizard SV Gel / PCR Kit (PR0MEGA).
  • PR0MEGA Wizard SV Gel / PCR Kit
  • Solution D ⁇ Buffer solution (negative control solution) 20 L of each of the obtained solutions, 0.5 1 of Sssl methylase (NEB), 5 of 10 x EBuffer2 (NEB), 3.2 mM S-adenosyl methionine (manufactured by NEB) was mixed with 0.51, and sterilized ultrapure water was added thereto to adjust the volume to 50 ⁇ 1. The reaction solution was incubated at 37 ° C. for 30 minutes (this corresponds to the first step of the method of the present invention).
  • a 5 ′ terminal FI TC-labeled oligonucleotide F 3 consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 31 that can bind to the oligonucleotide S, consisting of the target DNA region shown in SEQ ID NO: 30 by complementarity is synthesized.
  • 02 Tris-HC1 buffer (10 raM) was prepared.
  • SEQ ID NO: 30 is capable of binding by complementarity to the negative strand of the oligonucleotide S ′ comprising the target DNA region represented by SEQ ID NO: 30 4 1, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, and a counter oligonucleotide comprising the base sequences shown by SEQ ID NO: 50 Cleats Cl, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, and C10 were synthesized, and TE buffer solutions having respective concentrations of 0.01 were prepared.
  • reaction solution 40 prepared above, the above-mentioned 5, terminal FI TC-labeled oligonucleotide solution 10 ⁇ L, the above-mentioned force oligonucleotide nucleotide solution 10 and buffer solution (330 mM) Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc or 5 mM Dithiothreitol), l O ⁇ L, 100 mM MgCl 2 solution 10 and 1 mg / mL BSA solution 10 were added, and the mixture was further sterilized.
  • Ultrapure water was added to bring the volume to 100 ⁇ L and mixed. Thereafter, the PCR tube was heated at 95 ° C. for 10 minutes, quickly cooled to 70 ° C., and kept at that temperature for 10 minutes. Next, the mixture was cooled to 50 ° C, incubated for 10 minutes, further incubated at 37 ° C for 10 minutes, and then returned to room temperature to form a 5'-end FITC-labeled oligonucleotide and a DNA fragment. (This corresponds to the second step of the method of the present invention).
  • the DNA fragment reaction solution 100 ZL prepared above was added and left at room temperature for 1 hour. Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 200 ⁇ L of washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na2HP0 7H20, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, The buffer was removed by pipetting. This operation was repeated twice more (this corresponds to the third step of the method of the present invention).
  • HRP-labeled FI TC antibody solution Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., 0. OOS / zg / lOO iL 0.1% BSA -containing phosphate buffer (ImM K3 ⁇ 4P0 4, 3mM Na2HP0 7H20 , 154mM NaCl pH7.4) solution] Each Ueru After addition at a rate of 100 / L, the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • each tool was added with a 20 IL wash buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (lmM KH 2 P0 4 , 3 mM Na2HP0 7H20, 154 mM NaCl pH 7.4)], and then the buffer was decanted. Removed. This operation was repeated two more times. Substrate (R & D, # DY999) was added and mixed in each well at a rate of 100 to start the reaction.
  • Tween20-containing phosphate buffer lmM KH 2 P0 4 , 3 mM Na2HP0 7H20, 154 mM NaCl pH 7.4
  • the reaction was stopped by allowing the solution to stand at room temperature for about 30 minutes and adding a stop solution ( 2 H 2 SO 4 aqueous solution) to each tool at a rate of 50 ⁇ L. Absorbance of 45 Onm was measured within 30 minutes after stopping the reaction. (This corresponds to the fourth step of the method of the present invention) The results are shown in FIG. Solution A, Solution B, and Solution C showed increased absorbance compared to Solution D. Its intensity increased depending on the concentration of the DNA fragment.
  • methylcytosine antibody A commercially available methylcytosine antibody (Aviva Systems Biology) is labeled with a biotinylated kit (Biotin Labeling Kit-NH2, manufactured by Dojindo Laboratories) according to the method described in the catalog. did.
  • the obtained biotin-labeled methylcytosine antibody was refrigerated and stored as a 0.25 ⁇ g / ⁇ L 0.1% BSA-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP0 7H20, 154 mM NaCl pH 7.4) solution.
  • Baker's yeast strain X 2 1 8 0-1 A in YPD medium (1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6. 0) with a turbidity of 0D 6 . .
  • the cells were cultured until 0.6-1 .0 and centrifuged at 10,000 ⁇ g for 10 minutes to prepare lx10 7 yeast cells. From the prepared yeast cells, a general method as described in Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory) The yeast genome was obtained using various yeast genome preparation methods.
  • the prepared yeast cells are suspended in buffer A (1M sorbitol, 0.1M EDTA, pH 7.4) and 0.1 ° /. 2-mercaptoethanol (final concentration 14 mM) and 100 U zymolase (10 rag / ml) were added and incubated for 1 hour at 30 ° C. with stirring until the solution became clear. Centrifuge at 550xg for 10 minutes to collect the protoplasts, suspend in buffer B (50 mM Tris_HCl, pH 7.4, 20 mM EDTA), and then add 1% sodium dodecyl sulfate.
  • buffer A 1M sorbitol, 0.1M EDTA, pH 7.4
  • 2-mercaptoethanol final concentration 14 mM
  • 100 U zymolase 10 rag / ml
  • the reaction solution of PCR is 10 ng of genomic DNA, and 3 ⁇ ⁇ each of the above primer solution of 5 ⁇ , each 2 mM (1 ⁇ 5 1 and 10 X buffer (lOOraM Tris-HCl H 8.3, 500 mM KC1, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) 5 1 and metathermic DNA polymerase (AmpliTaq Gold) 5 U / il. 25 ⁇ 1 was mixed, and sterilized ultrapure water was added to make the volume to 50 ⁇ 1. The reaction solution was incubated at 95 ° C. for 10 minutes. PCR was carried out under the conditions that the temperature was maintained for 40 cycles at 95 ° C for 20 seconds, then at 58 ° C for 30 seconds, and further at 72 ° C for 30 seconds.
  • DNA fragment S was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PR0MEGA).
  • PR0MEGA Wizard SV Gel / PCR Kit
  • TE buffer solution negative control solution
  • oligonucleotides designed for the PCRs shown in SEQ ID NO: 3 2 and SEQ ID NO: 3 3 below from the obtained yeast genomic DNA By performing PCR using primers (PF 4 and PR 4) and reaction conditions, DNA fragments (T, SEQ ID NO: 34, shown in Genbank Accession No. NC_001139, etc.) used as a sample sample The region corresponding to base number 384569 384685 of yeast chromosome VII) was amplified.
  • PCR reaction solution 10 ng of genomic DNA to form a bowl, 3 1 of each 5 ⁇ of the above primer solution, 2 mM each (1 ?? 5 1, 10 X buffer (lOOraM Tris- Mix HCl pH 8,3, 500 mM KC1, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) with 5 ⁇ 1 and metathermal DNA polymerase (AmpliTaq Gold) 51 ⁇ / ⁇ 1 with 0.25 ⁇ ⁇ and sterilize it. Pure water was added to make the volume 50 1. The reaction solution was kept at 95 ° C for 10 minutes, then at 95 ° C for 20 seconds, and then at 58 ° C for 30 seconds. PCR was performed under the conditions of 40 cycles of incubation at 72 ° C for 30 seconds.
  • DNA fragment T was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PR0MEGA).
  • Solution C ⁇ ⁇ Buffer solution (negative control solution) Solution of DNA fragment S prepared above Solution A of DNA fragment T Solution A Solution B of DNA fragment S Solution solution B of DNA fragment T DNA flag Mento S solution C and DNA fragment T solution C were mixed, and the following DNA fragment mixed solutions MA to MC were prepared in duplicate.
  • Solution MC ⁇ ⁇ Buffer solution (negative control solution) 20 ⁇ L of each solution, 0.5 z 1 of Sssl methylase (NEB), 10 x NEBuffer2 (NEB) 5) and 3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB) 0.5 ⁇ 1 were mixed, and sterilized ultrapure water was added thereto to make the volume 50 1.
  • the reaction solution was incubated at 37 ° C for 30 minutes (this corresponds to the first step of the method of the present invention).
  • oligonucleotide consisting of the target DNA region represented by SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, capable of binding by complementary to the negative strand of S,
  • the counter oligonucleotides Cl, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, and C10 consisting of the base sequences shown in SEQ ID NO: 49 and SEQ ID NO: 50 were synthesized, and each concentration was A 0 buffer solution was prepared which was 0 ⁇ 0 1.
  • reaction solution 40 prepared above, 10 L of the 5′-terminal FI TC-labeled oligonucleotide solution, 10 iL of the force counter oligonucleotide solution, and buffer solution (330 mM Tris -Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOraM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol) l O ⁇ L, 100 mM MgCl 2 dissolved overnight, 1 mg / mL BSA solution 10 added, and further the mixture Sterilized ultrapure water was added to make up a volume of 100 L and mixed.
  • buffer solution 330 mM Tris -Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOraM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol
  • the PCR tube was then heated at 95 ° C for 10 minutes, quickly cooled to 70 ° C, and kept at that temperature for 10 minutes. Then cool to 50 ° C and incubate for 10 minutes. After incubating for 10 minutes at C, the temperature was returned to room temperature to promote the formation of a conjugate between the 5′-end FITC-labeled oligonucleotide and the DNA fragment (the second step of the method of the present invention).
  • the DNA fragment reaction solution prepared above was added to the streptavidin-coated 8-well strip on which the biotin-labeled methylcytosine antibody was immobilized, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour. Thereafter, the solution was removed by pipetting, and after adding 200 L of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na2HP0 7H20, 154 mM NaCl pH 7.4)] The buffer was removed by pipetting. This operation was repeated twice more (this corresponds to the third step of the method of the present invention).
  • HRP-labeled FITC antibody solution Jackson ImmunoResearch Laboratories, ⁇ . ⁇ ⁇ g / 100 ⁇ 0.1% BSA-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na2HP0 7H20, 154 mM NaCl pH7.4) solution ] was added to each tool at a rate of 100 / L and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After standing, add 20 ml of wash buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 nM Na2HP0 7H20, 154 mM NaCl pH 7.4)] to each tool, and then decant the buffer. It was removed with a tissue. This operation was repeated two more times. Substrate (R & D, # DY999) was added to each well at a rate of 100 ⁇ uL and mixed to start the reaction.
  • Baker's yeast strain X 2 1 8 0-1 A in YPD medium (1% Yeast extract, 2% Peptone 2% Glucose, pH 5.6-6. 0) with a turbidity of 0D 6 . .
  • the cells were cultured until 0.6-1 .0 and centrifuged at 10,000 ⁇ g for 10 minutes to prepare I ⁇ 10 7 yeast cells.
  • Yeast genomes were obtained from the prepared yeast cells using a general yeast genome preparation method as described in Methods in Yeast Genes (Cold Spring Harbor Laboratory).
  • the prepared yeast cells are suspended in buffer A (1M sorbitol, 0,1M EDTA, pH 7.4), 0.1% 2-mercaptoethanol (final concentration 14 mM) and 100 U zymolase (10 mg / ml) was added and incubated with stirring at 30 ° C. for 1 hour until the solution was clear. Centrifuge at 550xg for 10 minutes to collect the protoplasts, suspend in buffer B (50 mM Tris-HC1, pH 7.4, 20 mM EDTA), and then add sodium dodecyl sulfate to 1% (w / v). After the addition, it was incubated at 65 ° C for 30 minutes.
  • buffer A 1M sorbitol, 0,1M EDTA, pH 7.4
  • 2-mercaptoethanol final concentration 14 mM
  • 100 U zymolase 10 mg / ml
  • the obtained yeast genomic DNA was subjected to PCR using oligonucleotide primers (PF 3 and PR 3) designed for PCR shown in SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 and reaction conditions below.
  • a DNA fragment (S, region corresponding to nucleotide number 271743-272083 of yeast chromosome VII shown in SEQ ID NO: 29, Genbank Accession No. NCJ301139, etc.) used as a test sample was amplified.
  • PCR reaction solution 10 ng of genomic DNA to form a cage, 3 ⁇ l each of the above 5 / iM primer solution, 5 ⁇ 1 each 2 mM dNTP, 10 X buffer (lOOmM Tris- HCl pH 8.3, 500 mM KC1, 15 mM MgCl (0.01% Gelatin) 5 ⁇ 1 and metathermic DNA polymerase (AmpliTaq Gold) 511 / ⁇ are mixed with 25 ⁇ 1 and sterilized with ultrapure water Was added to adjust the liquid volume to 50 1. The reaction solution was kept at 95 ° C for 10 minutes, then kept at 95 ° C for 20 seconds, then at 58 ° C for 30 seconds, and further at 12 ° C for 30 seconds for one cycle. PCR was performed under conditions for cycling.
  • Solution C DNA fragmentation S ⁇ ⁇ Buffer solution (negative control solution) Designed for PCR shown in SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 33 below from the obtained yeast genomic DNA DNA fragments (T, SEQ ID NO: 34, yeast shown in Genbank Accession No. NC_001139, etc.) used as test samples by performing PCR using the prepared oligonucleotide primers (PF 4 and PR 4) and reaction conditions Oligonucleotide primer designed for PCR (a region corresponding to nucleotide number 384569-384685 of chromosome VII)>
  • PCR reaction solution 10 ng of genomic DNA to be a cocoon type, 3 1 each of 5 ⁇ of the above primer solution, each 2 mM (11 ⁇ -?? 5 1, 10 X buffer (lOOmM Tris -HCl pH 8.3, 500 ⁇ KC1, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) 5 ⁇ 1 and metathermic DNA polymerase (AmpliTaq Gold) 5 ⁇ / ⁇ 1 mixed with 0.25 ⁇ 1 and sterilized Pure water was added to make the volume 50 1.
  • the reaction solution was kept at 95 ° C for 10 minutes, then at 95 ° C for 20 seconds, and then at 58 ° C for 30 seconds.
  • PCR was performed under the condition of 40 cycles of heat insulation at 72 ° C with one cycle of 30 seconds.
  • DNA fragment T was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PR0MEGA).
  • DNA fragment ⁇ For DNA fragment ⁇ , the following solutions were prepared.
  • Solution C TE buffer solution (negative control solution) DNA fragment S solution A and DNA fragment T solution A prepared above, DNA fragment S solution B and DNA fragment T solution B, DNA Fragment S solution C and DNA fragment T solution C were mixed, and the following DNA fragment mixed solutions MA to MC were prepared in duplicate.
  • Solution M 10 ng / 20 uL TE buffer solution
  • the solution MC and T E buffer first solution (negative controls opening Lumpur solution) obtained respective solutions 20 mu L, and 0. 5 mu 1 to SSSL methylase (NEB Inc.), 1 0 NEBuffer2 (NEB Inc. ) 5 ⁇ and 3.2 raM S-adenosyl methionine (NEB) 0.5 ⁇ 1 are mixed, and sterilized ultrapure water is added to prepare a solution volume of 50 ⁇ 1 It was. The reaction solution was incubated at 37 ° C. for 30 minutes (this corresponds to the first step of the method of the present invention).
  • F 4 5,-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3 '(SEQ ID NO: 36)
  • it is capable of binding by complementarity to the negative strand of the oligonucleotide T' consisting of the target DNA region represented by SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 51, counter oligonucleotides C11, C12, C13, and C14 consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, and SEQ ID NO: 54 were synthesized, and each concentration was 0.01 ⁇ TE A buffer solution was prepared.
  • reaction solution 40 prepared above, the 5′-end FI TC-labeled oligonucleotide solution 10 L, the force counter oligonucleotide solution 10 / zL, and a buffer (330 mM Tris -Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol) l O ⁇ u L, 100 mM MgCl 2 solution 10 and 1 mg / niL BSA solution 10 ⁇ L, and then add to the mixture Sterile ultrapure water was added to bring the volume to 100 L and mixed.
  • a buffer 330 mM Tris -Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol
  • the PCR tube was then heated at 95 ° C for 10 minutes, quickly cooled to 70 ° C, and kept at that temperature for 10 minutes. Next, cool to 50 ° C and incubate for 10 minutes, then incubate at 37 ° C for 10 minutes, and then return to room temperature to form a conjugate of 5, terminal FI TC-labeled oligonucleotide and DNA fragment. (This corresponds to the second step of the method of the present invention).
  • HRP-labeled FITC antibody solution [Jackson ImmunoResearch Laboratories, 0. OOS.ug/lOO ⁇ L 0.1% BSA-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na2HP0 7H20, 154 mM NaCl pH 7.4) solution] was added to each well at a rate of 100 ⁇ L and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After standing, each well was added with 200 L of wash buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (lmM KH 2 P0 4 , 3 mM Na2HP0 7H20, 154 mM NaCl pH7.4)], and then the buffer was removed by decantation. . This operation was repeated two more times. Substrate (R & D, # DY999) was added to each well at a rate of 100 'and mixed to start the reaction.
  • a commercially available methylcytosine antibody (manufactured by Aviva Systems Biology Co., Ltd.) was prepared using a commercially available pyotinylated kit (Biotin Labeling Kit-NH2, manufactured by Dojindo Laboratories) according to the method described in the catalog. Labeled.
  • the obtained biotin-labeled methylcytosine antibody was refrigerated and stored as a phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP0 7H20, 154raM NaCl pH 7.4) solution containing 0.1% BSA.
  • Tween20-containing phosphate buffer (ImM K3 ⁇ 4 P0 4, 3mM Na2HP0 7H20, 154mM NaCl pH7. 4)] was added thereto, and removing the buffer by decantation. This operation was repeated two more times (this corresponds to the preparation of the immobilized methylated DNA antibody used in the method of the present invention).
  • Baker's yeast strain X 2 1 8 0— 1 A in YPD medium (1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5. 6-6. 0) with turbidity of OD 6 0 0 0. 6- 1. cultured to 0, 10, and centrifuged 10 min at 000 x g, to prepare a yeast cell lx lO 7. From the prepared yeast cells, a general method as described in Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory) The yeast genome was obtained using a simple yeast genome preparation method.
  • the prepared yeast cells are suspended in buffer A (1M sorbitol, 0.1M EDTA, pH 7.4) and 0.1 ° /. 2-Mercaptoethanol (final concentration 14 mM) and 100 U zymolase (10 rag / ml) were added and incubated for 1 hour at 30 ° C. with stirring until the solution became clear. Centrifuge at 550xg for 10 minutes to recover the protoplasts, suspend in Notfer B (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 20 mM EDTA), and then add 1% sodium dodecyl sulfate.
  • buffer A 1M sorbitol, 0.1M EDTA, pH 7.4
  • 2-Mercaptoethanol final concentration 14 mM
  • 100 U zymolase 10 rag / ml
  • PCR was performed using oligonucleotide primers (PF 3 and PR 3) designed for the PCR shown in SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 below and reaction conditions.
  • a DNA fragment (S, a region corresponding to nucleotide numbers 271743 to 272083 of yeast chromosome VII shown in SEQ ID NO: 29, Genbank Accession No. NC_001139, etc.) used as a test sample was amplified.
  • PCR reaction solution 10 ng of genomic DNA in the form of ⁇ , 3 ⁇ each of the above primer solution, and each 2 mM ⁇ 1] ⁇ ? 5 1 and 10X buffer (lOOmM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KC1, 15 mM MgCl in 0.01% Gelatin) 5 ⁇ 1, and thermostable DNA polymerase (AmpliTaq Gold) 511/1 in 0.25 1
  • the mixture was mixed and sterilized ultrapure water was added to make the volume 50 1.
  • Incubate the reaction solution at 95 ° C for 10 minutes, then heat at 95 ° C for 20 seconds, then at 58 ° C for 30 seconds, and then at 72 ° C for 30 seconds for one cycle. PCR was performed under the conditions used.
  • DNA fragment S was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PR0MEGA).
  • PR0MEGA Wizard SV Gel / PCR Kit
  • Solution A DNA flutter, non 10ng / 10 ⁇ Buffer solution
  • Solution C ⁇ buffer solution (negative control solution)
  • oligonucleotide primers PF 4 and PR
  • the DNA fragment T, SEQ ID NO: 34, Genbank Accession No. NC-001139, etc.
  • the PCR reaction solution was 10 ng of the genomic DNA to form a cage, 3 1 of each of the above primer solutions of 5 zM, 51 of each 2 mM dNTP, and 10 X buffer (lOOmM Tris- HCl pH 8.3, 500raM KC1, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) 5 ⁇ 1 and metathermic DNA polymerase (AmpliTaq Gold) 5U / V1 0.25 ⁇ 1 are mixed and sterilized. Pure water was added to adjust the liquid volume to 50 1. The reaction solution was incubated at 95 ° C for 10 minutes, then at 95 ° C for 20 seconds, then at 58 ° C for 30 seconds, and further at 70 ° C for 30 seconds. PCR was performed under the condition of 4 ° cycle incubation.
  • DNA fragment T was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PR0MEGA).
  • Solution A DNA Fragment, Men 10ng / 10 ixL TE buffer solution
  • Solution B DNA fragment; ⁇ -ment T lng / 10 ⁇ ⁇ ⁇ Buffer solution
  • Solution C ⁇ ⁇ Buffer solution (negative control solution) Solution of DNA fragment S prepared above ⁇ and DNA fragment T solution A into DNA fragment S solution B and DNA fragment T solution B into DNA flag Solution C of DNA S and solution C of DNA fragment T are mixed together, and the DNA fragment mixed solution MA ⁇ ! ICs were prepared in duplicate, respectively.
  • Solution M 10 ng / 20 ⁇ TE buffer solution
  • Solution MC ⁇ ⁇ Buffer solution (negative control solution) 20 L of each solution, 0.5 1 of Sssl methylase (NEB) and 10 xNEBuffer2 (NEB) 5 ⁇ 1 and 3.2 mM S-adenosyl methionine (manufactured by NEB) were mixed with 0.5 ⁇ 1 and sterilized ultrapure water was added to prepare a liquid volume of 501. The reaction solution was incubated at 37 ° C. for 30 minutes (this corresponds to the first step of the method of the present invention).
  • a terminal FITC-labeled oligonucleotide F3 consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 31 capable of binding by complementarity to an oligonucleotide S ′ comprising a target DNA region represented by SEQ ID NO: 30, and 5 ′ terminal FI TC-labeled oligonucleotide F4 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 36 capable of binding by complementarity to the oligonucleotide T ′ consisting of the target DNA region shown in SEQ ID NO: 35 was synthesized, respectively.
  • a Tris-HC1 buffer (10 mM) solution having a concentration of 0.02 M was prepared.
  • F 4 5'-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3 '(SEQ ID NO: 36) Also, a sequence that can bind by complementarity to the negative strand of the oligonucleotide S' consisting of the target DNA region shown in ⁇ S column number 30 SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, and SEQ ID NO: 50.
  • Counter oligonucleotides Cl, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, and CIO were synthesized, and oligonucleotide T consisting of the target DNA region represented by SEQ ID NO: 35
  • Counter oligonucleotides C1 1, C1 2, C1 3 consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, and SEQ ID NO: 54. Synthesize C14 and each concentration is 0.01
  • the TE server Ffa solution was prepared that.
  • Counter oligonucleotide> CI: 5,-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3 '(SEQ ID NO: 41)
  • the PCR tube was then heated at 95 ° C for 10 minutes, quickly cooled to 70 ° C, and kept at that temperature for 10 minutes. Next, it was cooled to 50 ° C, incubated for 10 minutes, further incubated at 37 ° C for 10 minutes, and then returned to room temperature to promote the formation of a conjugate between the 5, terminal FI TC-labeled oligonucleotide and the DNA fragment. (This corresponds to the second step of the method of the present invention).
  • HRP labeled FITC antibody solution Jackson ImmunoResearch Laboratories, 0.005 ⁇ g / 100 ⁇ L 0.1% BSA-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na2HP0 7H20, 154 mM NaCl pH 7.4) solution ] was added to each well at a rate of 100 ⁇ L and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After leaving each well, 200 ⁇ L of washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na2HP0 7H20, 15 machine NaCl pH7.4)] was added, and then the buffer was added. Was removed by decantation. This operation was repeated two more times. Substrate (R & D, # DY999) was added and mixed at a ratio of 100 to each tool, and the reaction was completed.
  • BSA-containing phosphate buffer ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na2HP0
  • methylcytosine antibody A commercially available methylcytosine antibody (Aviva Systems Biology) is listed in the catalog using a commercially available pyotinylated kit (Biotin Labeling Kit-H2, manufactured by Dojindo Laboratories). According to the method described, it was labeled with piotin. Obtained biotin-labeled methylcytosine antibody
  • wash buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (ImM K P0 4, 3mM Na2HP07H20 , 154mM NaCl pH7.4)] was ⁇ P a, the buffer Dekante Removed by Chillon. This operation was repeated two more times (this corresponds to the preparation of the immobilized methylated DNA antibody used in the method of the present invention).
  • Solution A Human blood genomic DNA 100ng / 5; uL TE buffer solution
  • Solution B Human blood derived nom DNA lOng / 5 / L TE buffer solution
  • Solution D ⁇ ⁇ Buffer solution (negative control solution) 5 L of each of the solutions prepared above, 10 U of restriction enzyme X spl, and 10 X buffer solution (200 raM Tris-HCl optimal for X spl) pH 8.5, lOOmM MgCl 2 , lOmM Dithiothreitol, lOOOmM KC1) 2 ⁇ 1 were mixed, and sterilized ultrapure water was added thereto to make a volume of 201. The reaction was incubated at 37 ° C for 1 hour.
  • SEQ ID NO: 3 can be bound by complementation with the negative strand of the target oligonucleotide W consisting of the DNA region indicated by S column number 39 5 5, SEQ ID NO: 5 6, SEQ ID NO: 5 7, SEQ ID NO: 5 8, and counter oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 9 C 15, C16, C17, C18, and so on C 19 was synthesized, and a buffer solution with each concentration of 0.01 ⁇ was prepared.
  • reaction solution 40 prepared above, the above-mentioned 5, terminal FI TC-labeled oligonucleotide solution 10 ⁇ L, the above-mentioned force oligonucleotide solution 10, and a buffer solution (330 mM Tris -Acetate H 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol), 10 L, 100 mM MgCl 2 solution, 10 / ⁇ L, and 1 mg / mL BSA solution, 10 ⁇ ! Sterile ultrapure water was added to the mixture to make a volume of 100 ⁇ L and mixed.
  • a buffer solution 330 mM Tris -Acetate H 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol
  • 10 L 100 mM MgCl 2 solution, 10 / ⁇ L, and 1 mg /
  • the PCR tube was then heated at 95 ° C for 10 minutes, quickly cooled to 70 ° C, and kept at that temperature for 10 minutes. Next, it was cooled to 50 ° C, incubated for 10 minutes, further incubated at 37 for 10 minutes, and then returned to room temperature to promote the formation of a 5'-end FITC-labeled oligonucleotide and DNA fragment conjugate. (This corresponds to the second step of the method of the present invention).
  • HRP-labeled FI TC antibody solution [Jackson Immunoesearch Laboratories, 0.005 ⁇ ⁇ / 100 ⁇ 0.1% BSA-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na2HP0 7H20 , 154 mM NaCl pH7.4) solution] was added to each well at a rate of 100 ⁇ L, and then allowed to stand at room temperature for 1 hour. After standing, after addition of wash buffer to each Uweru 2 0 0 L [0. 05% Tween20 -containing phosphate buffer (dark K3 ⁇ 4P0 4, 3mM Na2HP0 7H20, 154mM NaCl pH7. 4)], decantation the buffer Removed. This operation was repeated two more times. Substrate (R & D, # DY999) was added and mixed at a ratio of 100 L to each well to start the reaction.
  • methylcytosine antibody A commercially available methylcytosine antibody (Aviva Systems Biology) is labeled with a biotin labeling kit (Biotin Labeling Kit-NH2, manufactured by Dojindo Laboratories) according to the method described in the catalog. did.
  • Biotin Labeling Kit-NH2 Biotin Labeling Kit-NH2, manufactured by Dojindo Laboratories
  • the obtained biotin-labeled methylcytosine antibody was refrigerated and stored as a 0.25 g // L 0.1% BSA-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP0 7H20, 154 mM NaCl pH 7.4) solution.
  • Solution C Human blood-derived DNA, NOM DNA lng / 5 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Buffer solution
  • Solution D ⁇ ⁇ Buffer solution (negative control solution) 5 ⁇ L of each of the solutions prepared above, 4 U of restriction enzyme M s ⁇ I, and 10 X buffer solution optimal for M s ⁇ I ( lOOmM Tris-HCl pH 7.5, lOOraM MgCl 2 , lOraM Dithiothreitol, 500 mM NaCl) 2 ⁇ was mixed, and sterilized ultrapure water was added to prepare a solution volume of 20 ⁇ 1 . The reaction was incubated at 37 ° C for 1 hour.
  • Each reaction solution obtained was mixed with 20 t L, Sssl methylase (manufactured by NEB) 0.5 ⁇ 1, 10 NEBuffer2 (manufactured by NEB) 5 ⁇ , 3.2 mM S-adenosyl Methionine (manufactured by NEB) was mixed with 0.5 ⁇ 1, and sterilized ultrapure water was added thereto to prepare a liquid volume of 5 ° ⁇ 1.
  • the reaction solution was incubated at 37 ° C. for 30 minutes (this corresponds to the first step of the method of the present invention).
  • Oligonucleotide W (Genbank Accession No. AF 4 5 8 1 1 0 etc.) composed of the target DNA region shown in SEQ ID NO: 39 designed in the A 1 u region known as human transposon 5'-end FITC-labeled oligonucleotide F 6 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 40, which can be bound by complementarity with a complementary sequence, and 0.02 ⁇ Tris-HCL buffer ( 10 raM) solution was prepared.
  • reaction solution 40 prepared above, 10 ⁇ L of the 5′-end FI TC-labeled oligonucleotide solution, 1 O / iL of the force counter oligonucleotide solution, and buffer solution (330 mM) Tris-Acetate H 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol) 10 / z L, 100 mM MgCl 2 solution 10 ⁇ L, and 1 mg / mL BSA solution 10 are added. Pure water was added to make the volume 100 ⁇ L and mixed.
  • the PCR tube is then heated at 95 ° C for 10 minutes and quickly cooled to 70 ° C. And kept at that temperature for 10 minutes. Next, it was cooled to 50 ° C, incubated for 10 minutes, further incubated at 37 ° C for 10 minutes, and then returned to room temperature to promote the formation of a conjugate between the 5, terminal FI TC-labeled oligonucleotide and the DNA fragment. (This corresponds to the second step of the method of the present invention).
  • HRP-labeled FITC antibody solution [Jackson ImmunoResearch Laboratories, 0. OOS ⁇ g / lOO ⁇ L 0.1% BSA-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 Na 2 HP0 7H 20 , 154 mM NaCl pH7. 4) Solution] was added to each well at a rate of 100 ⁇ L, and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After standing, each well was added with 200 L of washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0. 3fflM Na 2 HP0 7H 20 , 154 mM NaCl pH 7.4)], and then the buffer was added. Was removed by decantation. This operation was repeated two more times. Substrate (R & D, # DY999) was added to each well at a rate of 100 / L and mixed to start the reaction.
  • Serum samples include human blood genomic DNA (Human Genomic DNA, # 636401,
  • Clontech's TE buffer solution and serum collected from rats were prepared in quadruplicate as follows.
  • Serum Sanph. Le D Human blood-derived nom DNA 0 ng / 10 yL TE cuff, buffer-solution + rat serum 10 yL (neutral “Tiff” controller / resolution)
  • Process 1 or process 2 shown was performed in duplicate.
  • the liquid volume was adjusted to 40 yL and mixed.
  • the PCR tube was then kept at 95 ° C for 10 minutes, kept at 4 ° C for 10 minutes, and then returned to room temperature. The supernatant was collected after centrifugation at 9100 ⁇ g for 10 minutes.
  • Serum sample 20 buffer solution ( 3 30 raM Tris-Acetate (pH 7.9), 100 mM Mg (0Ac) 2 , 5 mM DTT, 660 mM KOAc) 4 and sterile ultrapure water to the mixture
  • the liquid volume was adjusted to 40 yL and mixed.
  • the PCR tube was then kept at 95 ° C for 10 minutes, kept at 4 ° C for 10 minutes, and then returned to room temperature. The supernatant was collected after centrifugation at 9100 ⁇ g for 10 minutes.
  • the target DNA region consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 39 (W, equivalent to base numbers 178-262 shown in Genbank Accession No. AF458110) 5 ′ terminal FITC-labeled oligonucleotide F1 consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 40 that binds to the positive strand of the target DNA region W by complementarity as a specific oligonucleotide used to obtain A 0.02 M Tris-HCl buffer (10 mM) solution was prepared.
  • F1 5 'GGATGGTCTCGATCTCCTGAC -3' 50 yL of the reaction solution obtained above, 10 pL of 5'-terminal FITC-labeled oligonucleotide solution, and buffer solution (330 mM Tris-Acetate H 7.9 660 mM K0Ac 100 mM Mg0Ac 2 5 mM
  • Dithiothreitol 10 yL 100 mM MgC12 solution 10 and 1 mg / mL BSA solution 10 yL were added, and sterilized ultrapure water was added to the mixture to make the volume 100 lL and mixed. Then, in order to form a double strand between the target DMA region and the 5-terminal FITC-labeled oligonucleotide, the PCR tube is kept at 95 ° C for 10 minutes, rapidly cooled to 70 ° C, Insulated for 10 minutes. Next, the mixture was cooled to 50 ° C. and kept for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature.
  • methylcytosine antibody manufactured by Aviva Systems Biology
  • pyotinylated kit Biotin Labeling Kit-NH2, manufactured by Dojindo Laboratories
  • the obtained thiotin-labeled methylcytosine antibody was used as a 0.25 g / yL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM K P0 4 , 3 mM Na 2 HP0 7H 20 , 154 mM NaCl pH 7.4) solution. Stored refrigerated.
  • the above-mentioned piotin-labeled methylcytosine antibody solution is diluted 5-fold (0.05 ug / pL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 ⁇ ⁇ 2 ⁇ 04, 3 mM Na 2 HP0 7H 20 , 154 mM NaCl pH 7.4) Solution) Add 1 nL and let stand at room temperature for 1 hour.
  • Target DNA region, 5 'end FITC-labeled oligonucleotide and piotin-labeled methyl cytosine A detection complex consisting of an antibody was formed.
  • the reaction solution obtained above is streptavidin-coated 8 roll strip
  • a mixture of human blood genomic DNA (Human Genomic DNA, # 636401, Clontech) TE buffer solution and human serum purchased from Kojinbaio (individual Human Serum) is as follows. Prepared in series.
  • Serum Sanph. B Genomic DNA derived from human blood 2 ng / 10 yL TE Ha ', buffer-solution + human serum 40 yL
  • Serum Sanal C Genomic DNA derived from human blood 1 ng / 10 ⁇ TE Cuff, buffer-solution + human serum 40 pL
  • Serum Sanph. D Human blood-derived nom DNA 0 ng / 10 pL TE /, ', buffer solution + human serum 40 y L (netty control solution)
  • serum samples A to D prepared above the treatment shown below was performed in duplicate
  • Serum sample in PCR tube and buffer 500 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 raM MgCl 2 , 10 niM DTT, 1000 mM NaCl was mixed with 20 yL, and further sterilized ultrapure water was added to the mixture to make a liquid volume of 100 yL and mixed. Thereafter, the PCR tube was kept at 95 ° C. for 10 minutes, cooled to 4 ° C., and returned to room temperature. Subsequently, after centrifugation at 9100 ⁇ g for 10 minutes, 20 pL of the supernatant was recovered.
  • a sequence that can bind by complementarity with the target DNA region designed in the Alu region known as a human transposon (W, SEQ ID NO: 39, the region corresponding to base numbers 178-262 shown in Genbank Accession No. AF458110)
  • W human transposon
  • a 5′-terminal FITC-labeled oligonucleotide F 1 having a base sequence represented by No. 40 was synthesized, and a 0.02 ⁇ Tris-HC1 buffer (10 mM) solution was prepared.
  • F6 5′-GGATGGTCTCGATCTCCTGAC -3, (SEQ ID NO: 40) 50 yL of the reaction solution obtained above, 5 y, terminal FITC-labeled oligonucleotide solution 10 yL, and buffer solution (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, 100 mM Mg0Ac., 5 mM Dithiothreitol) (10 yL), 100 mM MgCl 2 solution (10 yL), and 1 mg / mL BSA solution (10) were added, and sterilized ultrapure water was added to the mixture to bring the volume to 100 and mixed.
  • buffer solution 330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, 100 mM Mg0Ac., 5 mM Dithiothreitol
  • 10 yL 100 mM MgCl 2 solution (10 yL)
  • the PCR tube is kept at 95 ° C. for 10 minutes, rapidly cooled to 70 ° C., The temperature was kept for 10 minutes. Next, the mixture was cooled to 50 ° C. and kept for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature.
  • a commercially available methylcytosine antibody (Aviva Systems Biology) was biotin labeled using a commercially available biotinylated kit (Biotin Labeling Kit-NH2, manufactured by Dojindo Laboratories) according to the method described in the protocol. .
  • the obtained thiotin-labeled methylcytosine antibody was used as a 0.25 yg / yL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP0 70, 154 mM NaCl pH 7.4) solution. Stored refrigerated.
  • the biotin-labeled methylcytosine antibody solution is diluted 5-fold into 100 yL of the reaction solution obtained by the heat treatment (0.05 pg / pL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP0 7H 20 , 154 mM NaCl pH 7.4) solution) 1) and leave at room temperature for 1 hour to obtain the desired DNA region, 5'-end FITC-labeled oligonucleotide and biotin-labeled methyl A detection complex consisting of cytosine antibody was formed.
  • the reaction solution obtained above is streptavidin-coated 8-well strip
  • HRP-labeled FITC antibody solution [Jackson ImmunoResearch Laboratories, 0.005 ⁇ / 100 nL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP0 7H 20 , 154 mM NaCl pH 7.4) solution] was added to each well at a rate of 100 yL and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After standing, the solution is removed by pipetting, and each well is washed buffer [0.05% Tvreen20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP (V 7H 20 , 154 mM NaCl pH7.4) Washed 3 times with 200 nL.
  • a DNA complex sample ⁇ extracted by the method of the present invention was used to form a detection complex consisting of the target DNA region, 5'-end FITC-labeled oligonucleotide and biotin-labeled methylcytosine antibody.
  • -It was clarified that human genomic DNA in human serum can be detected and quantified by selecting by immobilizing via streptavidin binding and detecting FITC in the complex by its function.
  • Human serum purchased from ProMedDx (Individual Human Serum)
  • Serum samples 40 y L a PCR tube, buffer (500 mM Tris-HCl (pH 7. 5), 100 mM MgCl 2, 10 mM DTT, 1000 mM NaCl) and a 20 IIL, further the mixture sterilized ultrapure Water was added to bring the liquid volume to 100 yL and mixed. Thereafter, the PCR tube was kept at 95 ° C for 10 minutes, cooled to 4 ° C, and returned to room temperature. Subsequently, the supernatant 20 was collected after centrifugation at 9100 ⁇ g for 10 minutes.
  • a sequence that can bind by complementarity with the target DNA region designed in the Alu region known as a human transposon (W, SEQ ID NO: 39, the region corresponding to base numbers 178-262 shown in Genbank Accession No. AF458110)
  • W human transposon
  • a 5′-end FITC-labeled oligonucleotide F6 consisting of the base sequence shown by No. 40 was synthesized, and a 0.02 ⁇ Tris-HC1 buffer (10 mM) solution was prepared.
  • a commercially available methylcytosine antibody (Aviva Systems Biology) was biotin labeled using a commercially available biotinylated kit (Biotin Labeling Kit-NH2, manufactured by Dojindo Laboratories) according to the method described in the protocol. .
  • the obtained biotin-labeled methylcytosine antibody was used as a 0.25 yg / pL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP0 70, 154 mM NaCl pH 7.4) solution. Stored refrigerated.
  • the biotin-labeled methylcytosine antibody solution is diluted 5-fold into 100 yL of the reaction solution obtained by the above heat treatment (0.05 ⁇ g / pL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP0 7H 20 , 154 mM NaCl pH 7.4) Solution) 1) and leave at room temperature for 1 hour to label the target DNA region, 5'-end FITC-labeled oligonucleotide and biotin A detection complex consisting of a methyl cytosine antibody was formed.
  • the reaction solution obtained above is streptavidin-coated 8 tools strip
  • HRP-labeled FITC antibody solution [Jackson ImmunoRe search Laboratories, 0.005 yg / 100 uL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP0 7H 20 , 154 mM NaCl pH 7.4) solution] was added to each well at a rate of 100 yL and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After standing, remove the solution by pipetting and wash each tool with the washing buffer.
  • Substrate (R & D Co., # DY999) was then added. Mixed at a ratio of 100 U L each Uweru, the reaction was started.
  • the reaction was stopped by adding a stop solution (2N H 2 S (_K solution) at a ratio of 50 to each tool at a room temperature for 25 minutes and measuring the absorbance at 450 nm within 30 minutes after stopping the reaction. The average value of duplicates was calculated for the measured values.
  • a stop solution (2N H 2 S (_K solution) at a ratio of 50 to each tool at a room temperature for 25 minutes and measuring the absorbance at 450 nm within 30 minutes after stopping the reaction.
  • the average value of duplicates was calculated for the measured values.
  • DNA in the solution obtained by the above enzyme treatment was quantified by real-time PCR.
  • An Mspl-treated human genomic DNA solution was prepared as follows as a standard sample for concentration measurement. Prepare a 5 ng / uL TE buffer solution of human blood genomic DNA (Human Genomic D thigh, # 636401, Clontech), and limit this solution to 20. Mix 2 U of the enzyme Mspl and 10 x buffer solution (100 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM MgCl 2 , 10 mM Dithiothreitol, 500 mM NaCl) 5 optimal for Mspl. Pure water was added to bring the liquid volume to 50 for each treatment. The reaction solution was incubated at 37 ° C for 1 hour. The resulting reaction solution, the dilution that by the TE buffer one, 10 [lambda] 10 4, 10 - 3, was prepared 10- 2, 10 ⁇ ⁇ 1, the 10 ng / 5 solution.
  • Target DNA region (W, SEQ ID NO: 39, the region corresponding to base numbers 178-262 shown in Genbank Accession No. AF458110) designed in the Alu region known as human transposon. Therefore, a forward primer (F) consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 62 and a reverse primer (R) consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 63 were designed. .
  • R 5,-GGATGGTCTCGATCTCCTGAC-3, (SEQ ID NO: 6 3)
  • a 5 ⁇ L Mspl-treated human genomic DNA solution prepared as above, or a standard sample for concentration measurement prepared as described above, and the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 62 and SEQ ID NO: 63 are used.
  • the present invention it is possible to provide a method for easily quantifying or detecting DNA having a target DNA region. Further, it is possible to provide a method for selecting a specimen derived from a cancer patient using a specimen derived from a subject (preferably serum) based on a comparison between a result obtained from the specimen and a result obtained from a healthy subject. It becomes possible. Sequence listing free text

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Abstract

本発明は、検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する方法等に関する。

Description

明細書
DNAを定量又は検出する方法 技術分野
本発明は、 目的とする DNA領域を有する DNAを定量又は検出する方法等に関す る。 背景技術
検体中に含まれる目的とする D N A領域を有する D N Aを定量又は検出する方法と しては、 例えば、 検体から DNAを抽出した後、 DNAポリメラーゼによる DNA合 成の連鎖反応 （Polymerase Chain Reaction；以下、 PCRと記すこともある。 ） に よって目的とする DN A領域を有する DN Aを増幅させて検出する方法や、 検体中の DN Aが有する目的の DN A領域に蛍光標識したォリゴヌクレオチドをハイプリダイ ズさせて検出する方法等が知られている （例えば、 J. Cataract. Refract.
Surg.，2007 ;33 (4) :635 - 641、 Environ. Mol. Mutagen.， 1991 ;18 (4) :259 - 262参照） 。 発明の開示
本発明は、 目的とする DNA領域を有する DN Aを簡便に定量又は検出する方法を 提供することを目的とする。
即ち、 本発明は、
[発明 1 ]
検体中に含まれる目的とする DNA領域を有する DN Aを定量又は検出する方法で あって、
(1) 目的とする DNA領域を検出しょうとする DNAを検体から調製する第一工程 、
( 2 ) 第一工程で調製された DNAを DNAメチル化酵素で処理する第二工程、
(3) 第二工程で処理された DNAから、 一本鎖メチル化 DN Aを調製し、 該一本鎖 メチル化 DNAに検出オリゴヌクレオチドを結合させて被検 DN A複合体を取得する 第三工程、
(4) 第三工程で取得した被検 DNA複合体に固定化メチル化 DN A抗体を結合させ て検出複合体を取得する第四工程、 及び
(5) 第四工程で得られた検出複合体に含まれる検出オリゴヌクレオチドをその識別 機能により定量又は検出することにより、 前記一本鎖 DNA中の目的とする DNA領 域を有する DNAを定量又は検出する第五工程、
を有することを特徴とする方法 （以下、 本発明方法と記すことがある。 ） 。
[発明 2]
第三工程で被検 DN A複合体を取得する際にカウンターオリゴヌクレオチドを添カロ する発明 1に記載の方法。
[発明 3]
固定化メチル化 DNA抗体がメチルシトシン抗体である発明 1又は 2に記載の方法 [発明 4]
DNAメチル化酵素がシトシンメチル化酵素又は S s s Iメチラーゼである発明 1〜 3のいずれか一に記載の方法。
[発明 5]
検体中に含まれる目的とする DN A領域を有する DNAが、 RN Aから逆転写酵素 により生成された DNAにおける目的とする DNA領域を有する DNAである発明 1 〜 4のいずれか一に記載の方法。
[発明 6 ]
検体が、 下記のいずれかの生物由来検体である発明 1〜 5のいずれか一に記載の方 法。
(a) 哺乳動物由来の血液、 体液、 糞尿、 体分泌物、 細胞溶解液又は組織溶解液、 (b) 哺乳動物由来の血液、 体液、 糞尿、 体分泌物、 細胞溶解液及ぴ組織溶解液から なる群より選ばれる一から抽出された DNA、
(c) 哺乳動物由来の組織、 細胞、 組織溶解液及び細胞溶解液からなる群より選ばれ る一から抽出された RNAを鍚型として作製された DNA、 (e) 細菌、 真菌又はウィルスから抽出された DNA、 又は
( f ) 細菌、 真菌又はウィルスから抽出された RNAを鎳型として作製された DNA [発明 7]
第一工程で取得した前記目的とする DN A領域を有する DN Aが、 目的とする DN A領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなる DNA、 合成オリ ゴヌクレオチド、 又は予め精製されてなる DN Aである発明 1〜 6のいずれか一に記 載の方法。
[発明 8]
検出オリゴヌクレオチドの識別機能が、 下記のいずれかの識別機能である発明 1〜 7のいずれか一に記載の方法。
(a) F I TCの蛍光検出、 又は
(b) F I TC抗体による検出
[発明 9]
検出オリゴヌクレオチドが、 ヒトゲノム中の反復配列、 重複遺伝子又は偽遺伝子の 塩基配列若しくはその一部と相補的に結合し得る塩基配列からなる発明 1〜 8のいず れか一に記載の方法。
[癸明 10]
ヒトゲノム中の反復配列が LINE又は SINEである発明 9に記載の方法。
[発明 1 1 ]
検出オリゴヌクレオチドが、 以下に示されるいずれかの塩基配列と相補的に結合し 得る塩基配列からなる発明 1〜 10のいずれか一に記載の方法。
( 1 ) 配列番号 37で示される塩基配列又はそれと 80 %以上の配列同一性を有する 塩基配列、
(2) 配列番号 37で示される塩基配列の相補配列又はそれと 80%以上の配列同一 性を有する塩基配列、
(3) 配列番号 39で示される塩基配列又はそれと 80%以上の配列同一性を有する 塩基配列、 又は
(4) 配列番号 39で示される塩基配列の相補配列又はそれと 80%以上の配列同一 性を有する塩基配列
[発明 1 2]
検出オリゴヌクレオチドが、 以下に示されるいずれかの塩基配列からなる発明 1〜 10のいずれか一に記載の方法。
( 1 ) 配列番号 38で示される塩基配列又はそれと 80 %以上の配列同一性を有する 塩基配列、
( 2 ) 配列番号 38で示される塩基配列の相補配列又はそれと 80 %以上の配列同一 性を有する塩基配列、
(3) 配列番号 40で示される塩基配列又はそれと 80%以上の配列同一性を有する 塩基配列、 又は
(4) 配列番号 40で示される塩基配列の相補配列又はそれと 80%以上の配列同一 性を有する塩基配列
[発明 13]
第一工程において検体から DN Aを調製するための DN A抽出操作において用いら れる溶液中のナトリゥム塩の濃度が、 10 OmM以上 100 OmM以下である発明 1 〜 12のいずれか一項に記載の方法。
[発明 14]
第一工程において検体から D N Aを調製するための D N A抽出操作において用いら れる溶液中のナトリゥム塩の濃度が、 10 OmM以上 20 OmM以下である発明 1〜 12のいずれか一項に記載の方法。
[発明 15]
癌患者由来の検体を選抜する方法であり、 発明 1〜 14のいずれか一項に記載の方 法により被験者由来の検体を用いて定量又は検出された D N Aの定量結果または検出 結果と、 同方法により健常者由来の検体を用いて定量又は検出された DN Aの定量結 果または検出結果との差異が有意であれば、 被験者由来の検体を癌患者由来の検体と して評価し、 当該評価の結果に基づき癌患者由来の検体を特定する工程を含む方法。
[発明 16 ]
検体が、 哺乳動物由来の血清である発明 15に記載の方法。 [発明 17]
目的とする DN A領域を有する DN Aが、 哺乳動物由来の血清中の目的とする DN A領域を有する遊離 DNAである発明 1 5〜1 6のいずれか一項に記載の方法。
；等を提供するものである。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1において、 ピオチン標識メチルシトシン抗体 0.5 μ g L及び 5 ' 末端 F I TC標識オリゴヌクレオチド F 1を用いて実施した結果を示した図であ る。 右から順に、 溶液 A (10 ng/10 iL TEバッファー溶液）、 溶液 B (1 ng/10 μΐ ΤΕパッファ一溶液）、 溶液 C (0.1 ng/10 μ L TE ッファ一溶液）、 溶液 D (0 ng/10 μ L TEバッファー溶液 (ネガテイブコント口ール液) )のそれぞれについて、 DNA量 を吸光度 （4 5 0nm) にて測定した値を示している。
図 2は、 実施例 2において、 ピオチン標識メチルシトシン抗体 0.5 μ g/mL及び 5' 末端 F I TC標識オリゴヌクレオチド F 1を用いて実施した結果を示した図であ る。 右から順に、 溶液 MA(10 ng each/20 μΐ ΤΕバッファー溶液）、 溶液 MB (1 ng each/20 TEバッファー溶液）、 溶液 MC (0.1 ng each/20 μΐ TEバッファー溶液） 、 溶液 MD (0 ng each/20 μ L TEバッファー溶液 (ネガテイブコント口ール液) )の それぞれについて、 DNA量を吸光度 （4 5 0nm) にて測定した値を示している。 図 3は、 実施例 3において、 ピオチン標識メチルシトシン抗体 0.5 μ g /m L及び 5 ' 末端 F I TC標識オリゴヌクレオチド F 2を用いて実施した結果を示した図であ る。 右から順に、 溶液 MA(10 ng each/20 μΐ ΤΕバッファー溶液）、 溶液 MB (1 ng each/20 j L TEバッファ一溶液）、 溶液 MC (0.1 ng each/20 μΐ ΤΕバッファー溶液） 、 溶液 MD (0 ng each/20 μΐ TEバッファー溶液 (ネガティブコント口ール液) )の それぞれについて、 DNA量を吸光度 （4 5 0nm) にて測定した値を示している。 図 4は、 実施例 4において、 ビォチン標識メチルシトシン抗体 0.5 ^ g/mL及び 5 ' 末端 F I TC標識オリゴヌクレオチド F 1及び F 2を用いて実施した結果を示し た図である。 右から順に、 溶液 MA(10 ng each/20 ^ L TEバッファー溶液）、 溶液 M B (1 ng each/20 μΐ TEバッファー溶液）、 溶液 MC (0.1 ng each/20 ul TEパッフ ァ一溶液）、溶液 MD (0 ng each/20 μ L TE ッファ一溶液 （ネガティブコントロー ル液） ）のそれぞれについて、 DNA量を吸光度 （4 50nm) にて測定した値を示し ている。
図 5は、 実施例 5において、 ピオチン標識メチルシトシン抗体 0.5 Ai g/mL及び 5 ' 末端 F I TC標識オリゴヌクレオチド F 3を用いて実施した結果を示した図であ る。 右から順に、 溶液 A (10 ng/10 ill TEバッファー溶液）、 溶液 B (1 ng/10 1 ΤΕバッファー溶液）、 溶液 C (0.1 ng/10 μΐ TEバッファー溶液）、 溶液 D (0 ng/10 μ L TEバッファー溶液 （ネガティブコントロール液） ）のそれぞれについて、 DNA量 を吸光度 （450nm) にて測定した値を示している。
図 6は、 実施例 6において、 ピオチン標識メチルシトシン抗体 0.5 μ g /m L及び 5' 末端 F I TC標識オリゴヌクレオチド F 3を用いて実施した結果を示した図であ る。 右から順に、 溶液 MA(10 ng each/20 μΐ ΤΕバッファ一溶液）、 溶液 MB (1 ng each/20 μΐ TEバッファー溶液）、 溶液 MC (0 ng each/20 μΐ TEバッファー溶液 （ ネガティブコントロール液） ）のそれぞれについて、 DNA量を吸光度 （450nm) にて測定した値を示している。
図 7は、 実施例 7において、 ピオチン標識メチルシトシン抗体 0.5 ^ g /m L及び 5' 末端 F I TC標識オリゴヌクレオチド F 3及び F 4を用いて実施した結果を示し た図である。 右から順に、 溶液 MA(10 ng each/20 μΐ ΤΕバッファー溶液）、 溶液 M B (1 ng each/20 μΐ TEバッファー溶液）、 溶液 MC(0 ng each/20 μΐ TEバッファ 一溶液 （ネガティブコントロール液） ）のそれぞれについて、 DNA量を吸光度 （4 5 Onm) にて測定した値を示している。
図 8は、 実施例 8において、 ピオチン標識メチルシトシン抗体 0.5 g/mL及び 5 ' 末端 F I TC標識オリゴヌクレオチド F 5を用いて実施した結果を示した図であ る。 右から順に、 溶液 A (100 ng/5 μΐ TEバッファー溶液）、 溶液 B (10 ng/5 j L TEバッファー溶液）、 溶液 C(l ng/5 μΐ TEバッファー溶液）、 溶液 D (0 ng/5 L TE バッファー溶液 （ネガティブコントロール液） ）のそれぞれについて、 DNA量を吸 光度 （45 Onm) にて測定した値を示している。
図 9は、 実施例 9において、 ビォチン標識メチルシトシン抗体 0.5 /i g/mL及び 5， 末端 F I TC標識オリゴヌクレオチド F 6を用いて実施した結果を示した図であ る。 右から順に、 溶液 A (100 ng/5 β1 ΤΕバッファー溶液）、 溶液 Β (10 ng/5 μΐ ΤΕバッファー溶液）、 溶液 C(l ng/5 μΐ TEバッファー溶液）、 溶液 D (0 ng/5 TE バッファー溶液 （ネガティブコントロール液） ）のそれぞれについて、 DNA量を吸 光度 （450nm) にて測定した値を示している。
図 1 0は、 実施例 10において、 ビォチン標識メチルシトシン抗体 0.5 μ g/mL 及び 5， 末端 F I TC標識オリゴヌクレオチド F 3を用いて実施した結果を示した図 である。 右から順に、 溶液 A (10 ng/10 μΐ ΤΕバッファー溶液）、 溶液 Β (1 ng/10 μ L ΤΕパッファ一溶液）、溶液 C (0.1 ng/10 μ L TEパッファ一溶液）、溶液 D (0 ng/10 / L TEバッファー溶液 （ネガティブコントロール液） ）のそれぞれについて、 DNA量を吸光度 （450nm) にて測定した値を示している。
図 1 1は、 実施例 1 1において、 ビォチン標識メチルシトシン抗体 0.5 μ g/mL 及ぴ 5， 末端 F I TC標識オリゴヌクレオチド F 3を用いて実施した結果を示した図 である。 右から順に、 溶液 MA(10 ng each/20 μΐ ΤΕバッファー溶液）、 溶液 MB (1 ng each/20 μ L ΤΕバッファ一溶液）、 溶液 MC (0 ng each/20 μ L TEバッファー 溶液 （ネガティブコントロール液） ）のそれぞれについて、 DNA量を吸光度 （45 Onm) にて ¾1定した値を示している。
図 1 2は、 実施例 1 2において、 ビォチン標識メチルシトシン抗体 0.5 g/mL 及ぴ 5， 末端 F I TC標識オリゴヌクレオチド F4を用いて実施した結果を示した図 である。 右から順に、 溶液 MA(10 ng each/20 μΐ TEバッファー溶液）、 溶液 MB (1 ng each/20 μΐ TEバッファー溶液）、 溶液 MC (0 ng each/20 μΐ TEバッファー 溶液 （ネガティブコントロール液） )のそれぞれについて、 DNA量を吸光度 （45 Onm) にて測定した値を示している。
図 1 3は、 実施例 1 3において、 ピオチン標識メチルシトシン抗体 0.5 μ g/ L 及ぴ 5， 末端 F I TC標識オリゴヌクレオチド F 3及び F4を用いて実施した結果を 示した図である。 右から順に、 溶液 MA(10 ng each/20 μΐ TEバッファー溶液）、 溶 液 MB (1 ng each/20 μΐ TEバッファー溶液）、 溶液 MC (0 ng each/20 μΐ TEバッ ファー?容液 （ネガティブコントロール液） ）のそれぞれについて、 DNA量を吸光度 ( 4 5 O nin) にて測定した値を示している。
図 1 4は、 実施例 1 4において、 ピオチン標識メチルシトシン抗体 0. 5 μ g /m L 及ぴ 5， 末端 F I T C標識オリゴヌクレオチド F 5を用いて実施した結果を示した図 である。 右から順に、 溶液 A (100 ng/5 ΐ ΤΕバッファー溶液）、 溶液 Β (10 ng/5 ΐ ΤΕバッファ一溶液）、 溶液 C (1 ng/5 μ L TEパッファ一溶液）、 溶液 D (0 ng/5 μ L TEバッファー溶液 （ネガティブコントロール液） ）のそれぞれについて、 D N A量 を吸光度 （4 5 0 mn) にて測定した値を示している。
図 1 5は、 実施例 1 5において、 ピオチン標識メチルシトシン抗体 0. 5 μ g / L 及び 5， 末端 F I T C標識オリゴヌクレオチド F 6を用いて実施した結果を示した図 である。 右から順に、 溶液 A (100 ng/5 μ ΐ TEバッファー溶液）、 溶液 B (10 ng/5 L TEバッファー溶液）、 溶液 C (l ng/5 μ ΐ TEバッファー溶液）、 溶液 D (0 ng/5 μ L TEバッファー溶液 （ネガティブコントロール液） ）のそれぞれについて、 D N A量 を吸光度 （4 5 0 mn) にて測定した値を示している。
図 1 6は、 実施例 1 6において、 処理 1をおこない、 ビォチン標識メチルシトシン 抗体および 5 ' 末端 FITC標識オリゴヌクレオチド F6を用いて DNAの検出を実施した結果 を示した図である。 右から順に、 溶液 A (10 ng/10 ラット血清溶液）、 溶液 Β (1 ng/10 ラット血清溶液）、 溶液 C (0. 1 ng/10 ラット血清溶液）、 溶液 D (ラット 血清 （ネガティブコントロール液)） のそれぞれについて、 吸光度 （450 nm) を測定 した値を示している。
図 1 7は、 実施例 1 6において、 処理 2をおこない、 ビォチン標識メチルシトシン 抗体および 5 ' 末端 FITC標識オリゴヌクレオチド F6を用いて DNAの検出を実施した結果 を示した図である。 右から順に、 溶液 A (10 ng/10 ラット血清溶液）、 溶液 Β (1 ng/10 ラット血清溶液）、 溶液 C (0. 1 ng/10 ラット血清溶液）、 溶液 D (ラット 血清 （ネガティブコントロール液)） のそれぞれについて、 吸光度 （450 nm) を測定 した値を示している。
図 1 8は、 実施例 1 7において、 ピオチン標識メチルシトシン抗体おょぴ 5' 末端 FITC標識オリゴヌクレオチド F6を用いて DNAの検出を実施した結果を示した図である 。 右から順に、 溶液 A (4 ng/40 ヒト血清溶液）、 溶液 Β (2 ng/40 ヒト血清溶液 )、 溶液 C (1 ng/40 ヒト血清溶液)、 溶液 D (ヒト血清 （ネガティブコントロール 液)） のそれぞれについて、 吸光度 （450 nm) を測定した値を示している。
図 1 9は、 実施例 1 8において、 ビォチン標識メチルシトシン抗体および 5， 末端 FITC標識オリゴヌクレオチド F6を用いて検出した結果と、 リアルタイム PCRにより定 量した結果を比較した図である。 図中、 検出結果を縦軸に、 リアルタイム PCRによる 定量結果を横軸にとり、 プロットした。 またグラフ中の直線は回帰直線 （太線） およ ぴ標準誤差範囲 （細線） を示してある。
図 2 0は、 実施例 1 8において、 57歳以下のヒト血清サンプルについて、 ビォチ ン標識メチルシトシン抗体おょぴ 5， 末端 FITC標識オリゴヌクレオチド F6を用いて DNA を検出した結果を、 がん患者と健常者に分けてプロッ トしたものであり、 それぞれに ついて平均値および標準偏差を示している。 発明を実施するための形態
本発明方法における 「検体」 としては、 （a ) 哺乳動物由来の血液、 体液、 糞尿、 体分泌物、 細胞溶解液又は組織溶解液、 （b ) 哺乳動物由来の血液、 体液、 糞尿、 体 分泌物、 細胞溶解液及び組織溶解液からなる群より選ばれる一から抽出された D NA 、 ( c ) 哺乳動物由来の組織、 細胞、 組織溶解液及び細胞溶解液からなる群より選ば れる一から抽出された R NAを鎵型として作製された D NA、 ( e ) 細菌、 真菌又は ウィルスから抽出された D NA、 ( f ) 細菌、 真菌又はウィルスから抽出された R N Aを铸型として作製された D N A、 等が挙げられる。 前記組織とは、 血液、 リンパ節 等を含む広義の意味である。
「哺乳動物」 とは、 動物界脊索動物門脊椎動物亜門 哺乳綱 （Mammalia) に分類 される動物であり、 具体的には、 ヒト、 サル、 マーモセット、 モルモット、 ラット、 マウス、 ゥシ、 ヒッジ、 ィヌ、 ネコ等が挙げられる。
「体液」 とは、 個体を構成する細胞間に存在する液体であって、 具体的には血漿と 間質液が挙げられ、 多くの場合、 個体の恒常性の維持機能を果たす。 より具体的には 、 リンパ液、 組織液 （組織間液、 細胞間液、 間質液） 、 体腔液、 漿膜腔液、 胸水、 腹 水、 心嚢液、 脳脊髄液 （髄液） 、 関節液 （滑液） 、 眼房水 （房水） 、 脳脊髄液、 等が 挙げられる。 「体分泌物」 とは、 外分泌腺からの分泌液であって、 具体的には、 唾液、 胃液、 胆汁、 膝液、 腸液、 汗、 涙、 鼻水、 精液、 隍液、 羊水、 乳汁、 等が挙げられ る。
検体がヒ トの血液、 体液又は体分泌物等である場合には、 ヒ トの定期健康診断にお ける臨床検査用に採取された試料を利用することができる。
「細胞溶解液」 としては、 細胞培養用のプレート等で培養された細胞、 例えば、 細 胞株ゃ初代培養細胞、 または血球細胞等を破砕することにより得られる細胞内液を含 む溶解液が挙げられる。 細胞を破碎する方法としては、 超音波による方法、 界面活性 剤を用いる方法、 アルカリ溶液を用いる方法等が挙げられる。 細胞を溶解するために は、 市販のキット等を利用してもよい。
例えば、 lOcniプレートでコンフルェントになるまで細胞を培養した後、 培養液を捨 てて、 0. 6mLの RIPAバッファー （lx TBS, 1% nonidet P- 40, 0. 5% sodium
deoxysholate, 0. 1% SDS, 0. 004% sodium azide) を該プレートに加える。 4。Cで 15分 間プレートをゆっくり揺り動かしてから、 該プレート上の接着細胞を、 スクレーパー 等を用いて剥がし、 該プレート上の液をマイクロチューブに移す。 該液の 1 /10容量 の 10mg/mL PMSFを添加してから、 該チューブを氷上で 30-60分間放置した後、 4°Cで 10 分間、 10， OOOxgで遠心し、 上清を細胞溶解液として取得する。
「組織溶解液」 としては、 哺乳動物等の動物から採取した組織中の細胞を破壌する ことにより取得される、 細胞内液を含む溶解液が拳げられる。
具体的には、 動物から取得された組織の重量を測定した後、 力ミソリ等を用いて該 組織を小片に裁断する。 凍結組織を使用する場合は、 更に小さい小片にする必要があ る。 裁断後、 氷冷 RIPAバッファーを組織 lgあたり 3mLの比率で添加し、 4 °Cでホモジ ナイズする。 ここで、 RIPAバッファーには、 プロテア一ゼインヒビター、 フォスファ ターゼインヒビタ一等を添加してもよく、 例えば、 RIPAバッファーの 1/10容量の 10mg/mL PMSFを添加しても良い。 ホモジナイズには、 ソ-ケ一ターや加圧型細胞破砕 装置を用いる。 ホモジナイズの作業では、 ホモジナイズ液を常に 4 °Cに維持し、 発熱 を抑えるようにする。 ホモジナイズ液を、 マイクロチューブに移して、 4°Cで 10分間 、 10，000Xgで遠心し、 上清を組織溶解液として取得する。 本発明方法における 「検体」 としては、 例えば食品、 河川、 土壌、 もしくは一般市 販製品から採取された試料や表面付着物などを挙げることもでき、 真菌、 細菌、 ウイ ルス等の微生物やこれらの核酸が含まれ得る。 検体として使用される DN Aとしては、 前記生体試料や前記微生物から抽出して得 られたゲノム DNA、 ゲノム DNA由来の DNA断片、 若しくは RNA等を挙げるこ とができる。 ゲノム DN Aを哺乳動物由来の試料から得るには、 例えば市販の DN A 抽出用キット等を用いることができる。 また、 RNAから DNAを得るためには、 市 販の cDNA作製キット等の逆転写酵素を用いることができる。 また、 検体としては 、 人工的に合成された DNAであっても良い。 本発明方法における 「目的とする DNA領域」 （以下、 目的領域と記すこともある 。 ） とは、 検体中に含まれる DN Aのうち、 本発明方法により検出又は定量したい D N A領域である。 目的とする DN A領域は、 検体が DN Aである場合には、 DNA上 の塩基配列で示される。 検体が RNAである場合には、. 目的とする DNA領域は、 R N Aから逆転写酵素により作製された D N A上の塩基配列で示され、 R N A上の検出 対象となる所定の塩基配列の相補的塩基配列である。 本発明方法において、 シトシン をメチル化して検出又は定量する場合には、 目的領域はシトシン或いは後述の CpG に富む領域を含むことが望ましい。 第一工程は、 目的とする DNA領域を検出しようとする DNAを検体中から調製す る工程である。
第一工程で調製される D NAとしては、 例えば、 該 D NAが有する目的とする D N A領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理された D NA試料、 予め精製 された D N A試料、 血液中の遊離 D NA、 微生物ゲノム由来の D NA、 及ぴ検体中の R NAから逆転写酵素により作製された D NA等が挙げられる。 第一工程で調製され る D NAとしては、 例えば検体の遺伝子情報に基づいて設計され人工的に合成された D N Aをあげることもできる。
血液を検体として用いる場合には、 血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調 製し、 調製された血漿又は血清を検体として、 その中に含まれる遊離 D N A (胃癌細 胞等の癌細胞由来の D NAが含まれる） を分析すると、 血球由来の D NAを避けて胃 癌細胞等の癌細胞由来の D N Aを解析することができ、 胃癌細胞等の癌細胞、 それを 含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
第一工程で調製される D NAとしては、 グラム陽性菌、 グラム陰性菌等の細菌、 真 菌、 ウィルス、 病原性原虫等の微生物等由来の D N Aや、 該微生物等由来の R N Aか ら逆転写酵素により取得した D NAを挙げることができる。 例えば、 Mycoplasma ge talium、 Mycoplasma pneumoniae^ Borrelia burgdorferi B31、 Rickettsia · pro azeKii Treponema
Figure imgf000013_0001
Chlamydia trachomatis 、 Helicobacter pylori J"99、 Helicobacter pylori 26695、 Haemophilus influenzae Rd、 Mycobacterium tuberculosis H37Rv、 Pseudomonas aeruginosa^ Legionella pneumophila^ Serratia marcescens、 Escherichia coli、 Listeria monocytogenes、 Salmonella enterica^ Campylobacter jejuni subsp. Jejuni N Staphylococcus aureus Vibrio parahaemolyticusN Bacillusu cereus、 Clostridium botulinum、 し丄 ostridium perfringensN Yersinia enterocoliticaN Yersinia
pseudotuberuculosis Trichophyton ruburum Trichophyton mentagrophytes^ Candida albicans^ Cryptococcus neoformans^ Aspergillus fumigatus、
Pneumocystis carinii^ Coccidioides iramitis、 Cytomegalovirus、 human
herpesvirus 5、 Epstein-Barr virus、 Human Immunodeficiency Virus、 Human Papilloma Virus、 Enterovirus^ Norovirus Influenza Virus、 Toxoplasma gondii Cryptosporidium parvum、 Entamoeba histolyticaのゲノム DNA或レヽは RNA力 ら 逆転写酵素により作製された DNAは、 検体中の感染症原因菌、 或いは食品中の食中 毒原因菌等の検出に利用できる。 ゲノム DNAを調製するには、 例えば、 検体が哺乳動物由来の試料である場合は、 市販の DNA抽出用キット （Genfind v2 Kit (ベックマン · コールター社製） 、 FastPure DNA Kit (タカラバイオ株式会社製） ) 等を用いることができる。
検体が真菌等の微生物である場合、 Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory Press)に記載されているような、 一般的な酵母ゲノムの調製法等 でゲノム DNAを調製することができ、 検体が大月 菌のような原核生物である場合、 Molecular Cloning一 A Laboratory Manual- (Cold Spring Harbor Laboratory Press ) に記載されているような一般的な微生物ゲノム調製法等を用いることができる。 また、 検体が食品試料である場合、 食品から微生物等を分離してから DNAを調製 してもよく、 食品に含まれる微生物以外のゲノム DNAと微生物由来のゲノムを同時 に取得してもよい。 また、 検体が哺乳動物由来の糸且織であり、 目的とする DNA領域 がウィルス由来の DNAである場合は、 組織中から市販の RNA抽出用キット （ IS0GEN (311-02501) (NIPPON GENE社製） 、 或いは、 FastRNA Pro Green Kit (フナ コシ社製）、 FastRNA Pro Blue Kit (ブナコシ社製）、 FastRNA Pro Red Kit (フナコ シ社製）、 等） 等を用いて RNAを抽出し、 逆転写酵素によって DNAを取得しても よい。 また、 検体が哺乳動物由来の検体である場合、 ウィルス粒子を抽出してからゥ ィルスの DNAを抽出してもよく、 或いはウィルス粒子を抽出してから市販のキット (QuickGene RNA tissue kit S I I、 富士フィルム社製） 等を用いてウィルス RN Aを抽出し、 逆転写酵素によりウィルス由来の DNAを取得しても良い。 ウィルスが 感染した組織から RN Aを抽出し逆転写酵素によりウィルス由来の DN Aを取得して も良いし、 ウィルスが感染した組織から DNAを取得して、 ウィルス由来の DNAを 取得しても良い。 尚、 RNAから逆転写酵素により DNAを取得する場合には、 市販 のキット （トランスクリプターハイフィデリティ cDNA合成キット、 ロシュディアグノ ステイク社製） 等を用いてもよい。 「メチル化 DNA」 においては、 遺伝子 （ゲノム DNA) を構成する 4種類の塩基 のいずれかがメチル化されている。 例えば、 哺乳動物では、 5， 一 CG— 3' で示さ れる塩基配列 （Cはシトシンを表し、 Gはグァニンを表す。 以下、 該塩基配列を 「C pG」 と記すこともある。 ） 中のシトシンのみがメチル化されるという現象が知られ ている。 シトシンのメチル化部位は 5位である。 細胞分裂に先立つ DN A複製に際し て新生二本鎖 DN Aにおいては、 親細胞由来の鎵型鎖中の 「CpG」 中のシトシンの みがメチル化された状態であるが、 メチル基転移酵素の働きにより即座に新生された DNA鎖中の 「C p GJ 中のシトシンもメチル化される。 このシトシンメチル化は、 親細胞由来の DNA鎖中のメチル化されたシトシンを含む C p Gと相補的に結合する 新生 DNA鎖の C p Gのシトシンをメチル化する。 従って、 親細胞の DNAのメチル 化の状態は、 DNA複製後の、 新しい 2組の DNAにそのまま引き継がれることにな る。 「CpG対」 とは、 CpGで示される塩基配列と、 これに相補する CpGが結合 してなる二本鎖 DN Aを意味するものである。
「一本鎖メチル化 DNA」 とは、 一本鎖 DN Aの塩基配列中の 5， 一 CG— 3， で 示される塩基配列中のシトシンの 5位がメチル化された一本鎖 DNAである。
「目的とする DNA領域」 としては、 例えば、 Lysyl oxidase, HRAS - like suppressor, bA305P22.2.1、 Gamma filamin、 HA Dl, Homologue of RIKEN
2210016F16、 FLJ32130、 PPARG angiopoietin- related protein. Thrombomodulin, p53 -: responsive gene 2、 fibrillin2、 Neurofilament 3、 disintegrin and
metal loproteinase domain 23、 G protein-coupled receptor 7、 G— protein coupled somatostatin and angiotensin— like peptide receptor^ Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2等の有用タンノ ク質遺ィ s子の プロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） 等を挙げることが でき、 これらの塩基配列中に存在する C p Gを一以上含む D N A領域を好ましくあげ ることができる。 本発明方法において、 「目的とする DNA領域」 のメチル化された DNAを個々に検出又は定量してもよいが、 例えば、 1つの検出系において、 より多 くの 「目的とする D NA領域」 のメチルイヒされた D NAを検出すれば、 それだけ定量 精度及ぴ検出感度が向上する。 具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が Lysyl oxidase遺伝子である場合には 、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列 中に存在する C p Gを一つ以上含む塩基配列としては、 ヒト由来の Lysyl oxidase遺 伝子のェクソン 1と、 その 5， 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列を挙げることができ、 より具体的には、 配列番号 1で示される塩基 配列 （Genbank Accession No. AF270645に記載される塩基配列の塩基番号 16001〜 18661で示される塩基配列に相当する。 ） が挙げられる。 配列番号 1で示される塩基 配列においては、 ヒト由来の Lysyl oxidaseタンパク質のァミノ末端のメチォニンを コードする ATGコドンが、 塩基番号 2031〜203'3に示されており、 上記ェクソン 1の塩 基配列は、 塩基番号 1957〜2661に示されている。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が HRAS- like suppressor遺伝子であ る場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 (コーディング領域) の塩基配列中に存在する C p Gを一^ ^以上含む塩基配列としては、 ヒト由来の HRAS - like suppressor遺伝子のェクソン 1と、 その 5， 上流に位置するプロモーター領域 とが含まれるゲノム D NAの塩基配列を挙げることができ、 より具体的には、 配列番 号 2で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AC068162に記載される塩基配列の 塩基番号 172001〜； L73953で示される塩基配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 2で示される塩基配列においては、 ヒト由来の HRAS-like suppressor遺伝子のェクソ ン 1の塩基配列は、 塩基番号 1743〜1953に示されている。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 bA305P22. 2. 1遺伝子である場合 には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基 配列中に存在する C p Gを一つ以上含む塩基配列としては、 ヒト由来の bA305P22. 2. 1 遺伝子のェクソン 1と、 その 5， 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノ ム D NAの塩基配列を挙げることができ、 より具体的には、 配列番号 3で示される塩 基配列 （Genbank Accession No. AL121673に記載される塩基配列の塩基番号 13001〜 13889で示される塩基配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 3で示される塩基 配列においては、 ヒト由来の bA305P22. 2. 1タンパク質のァミノ末端のメチォェンをコ 一ドする ATGコドンが、 塩基番号 849〜851に示されており、 上記ェクソン 1の塩基配 列は、 塩基番号 663〜889に示されている。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Gamma filamin遺伝子である場 合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩 基配列中に存在する C p Gを一つ以上含む塩基配列としては、 ヒト由来の Gamma filamin遺伝子のェクソン 1と、 その 5， 上流に位置するプロモーター領域とが含ま れるゲノム D NAの塩基配列を挙げることができ、 より具体的には、 配列番号 4で示 される塩基配列 （Genbank Accession No. AC074373に記載される塩基配列の塩基番号 63528〜64390で示される塩基配列の相補的配列に相当する。 ） があげられる。 配列番 号 4で示される塩基配列においては、 ヒト由来の Gamma filaminタンパク質のァミノ 末端のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 572〜574に示されており、 上 記ェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 463〜863に示されている。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 HA D1遺伝子である場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列中 に存在する C p Gを一^ 3以上含む塩基配列としては、 ヒト由来の HAND1遺伝子のエタ ソン 1と、 その 5， 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノム D NAの塩 基配列を挙げることができ、 より具体的には、 配列番号 5で示される塩基配列 （ Genbank Accession No. AC026688に記載される塩基配列の塩基番号 24303〜26500で示 される塩基配列の相補的配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 5で示される塩 基配列においては、 ヒト由来の HA D1タンパク質のァミノ末端のメチォェンをコード する ATGコドンが、 塩基番号 1656〜1658に示されており、 上記ェクソン 1の塩基配列 は、 塩基番号 00〜2198に示されている。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Homologue of RIKEN 2210016F16遺伝子である場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 (コーディング領域） の塩基配列中に存在する C p Gを一つ以上含む塩基配列として は、 ヒト由来の Homologue of RIKEN 2210016F16遺伝子のェクソン 1と、 その 5， 上 流に位置するプロモータ一領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列を挙げることが でき、 より具体的には、 配列番号 6で示される塩基配列 （Genbank Accession
No. AL354733に記載される塩基配列の塩基番号 157056〜159000で示される塩基配列の ,相補的塩基配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 6で示される塩基配列におい ては、 ヒ ト由来の Homologue of RIKEN 2210016F16タンパク質のェクソン 1の塩基配 列は、 塩基番号 1392〜： 1945に示されている。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 FLJ32130遺伝子である場合には 、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列 中に存在する C p Gを一つ以上含む塩基配列としては、 ヒト由来の FLJ32130遺伝子の ェクソン 1と、 その 5， 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノム D NA の塩基配列を挙げることができ、 より具体的には、 配列番号 7で示される塩基配列 （ Genbank Accession No. AC002310に記載される塩基配列の塩基番号 1〜2379で示される 塩基配列の相補的塩基配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 7で示される塩基 配列においては、 ヒト由来の FLJ32130タンパク質のアミノ酸末端のメチォニンをコー ドする ATGコドンが、 塩基番号 2136〜2138に示されており、 上記ェクソン 1と考えら れる塩基配列は、 塩基番号 2136〜2379に示されている。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 PPARG angiopoietin- related protein遺伝子である場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （ コーディング領域） の塩基配列中に存在する C p Gを一つ以上含む塩基配列としては 、 ヒト由来の PPARG angiopoietin-related protein遺伝子のェクソン 1と、 その 5， 上流に位置するプロモータ一領域とが含まれるゲノム D NAの塩基配列を挙げること ができ、 より具体的には、 配列番号 8で示される塩基配列があげられる。 配列番号 8 で示される塩基配列においては、 ヒト由来の PPARG angiopoietin-related proteinタ ンパク質のァミノ末端のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 717〜719に 示されており、 上記ェクソン 1の 5 ' 側部分の塩基配列は、 塩基番号 1957〜2661に示 されている。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Thrombomodul in遺伝子である場 合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩 基配列中に存在する C p Gを一つ以上含む塩基配列としては、 ヒト由来の
Thrombomodulin遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモーター領域と が含まれるゲノム D NAの塩基配列を挙げることができ、 より具体的には、 配列番号 9で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AF495471に記載される塩基配列の塩 基番号 1〜6096で示される塩基配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 9で示さ れる塩基配列においては、 ヒト由来の Thrombomodulinタンパク質のァミノ末端のメチ ォ-ンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 2590〜2592に示されており、 上記ェクソ ン 1の塩基配列は、 塩基番号 2048〜6096に示されている。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 p53- responsive gene 2遺伝子 である場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領 域） の塩基配列中に存在する C p Gを一つ以上含む塩基配列としては、 ヒト由来の p53- responsive gene 2遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモータ 一領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列を挙げることができ、 より具体的には、 配列番号 1 0で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AC009471に記載される塩 基配列の塩基番号 113501〜116000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。 ） が あげられる。 配列番号 1 0で示される塩基配列においては、 ヒト由来の p53- responsive gene 2遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1558〜1808に示され ている。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Fibrillin2遺伝子である場合に は、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配 列中に存在する C p Gを一つ以上含む塩基配列としては、 ヒト由来の Fibrillin2遺伝 子のェクソン 1と、 その 5， 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列を挙げることができ、 より具体的には、 配列番号 1 1で示される塩基 配列 （Genbank Accession No. AC113387に記載される塩基配列の塩基番号 118801〜 121000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 1 1 で示される塩基配列においては、 ヒト由来の Fibrillin遺伝子のェクソン 1の塩基配 歹 Uは、 塩基番号 1091〜1345に示されている。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Neurofilaments遺伝子である場 合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩 基配列中に存在する C p Gを一つ以上含む塩基配列としては、 ヒ ト由来の
Neurofilaments遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモーター領域と が含まれるゲノム D NAの塩基配列を挙げることができ、 より具体的には、 配列番号 1 2で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AF106564に記載される塩基配列の 塩基番号 28001〜30000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。 ） があげられる 。 配列番号 1 2で示される塩基配列においては、 ヒ ト由来の Neurofilaments遺伝子の ェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 614〜1694に示されている。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 disintegrin and
metalloproteinase domain 23遺伝子である場合には、 そのプロモーター領域、.非翻 訳領域又は翻訳領域 (コーディング領域) の塩基配列中に存在する C p Gを一つ以上 含む塩基酉己歹 ljとしては、 ヒト由来の disintegrin and metalloproteinase domain 23 遺伝子のェクソン 1と、 その 5， 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノ ム D NAの塩基配列を挙げることができ、 より具体的には、 配列番号 1 3で示される 塩基配列 （Genbank Accession No. AC009225に記載される塩基配列の塩基番号 21001〜 23300で示される塩基配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 1 3で示される塩 基酉己歹におレヽては、 ヒト由来の disintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝 子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1194〜； 1630に示されている。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 G protein-coupled receptor 7 遺伝子である場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディ ング領域） の塩基配列中に存在する C p Gを一つ以上含む塩基配列としては、 ヒト由 来の G protein - coupled receptor 7遺伝子のェクソン 1と、 その 5， 上流に位置する プロモーター領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列を挙げることができ、 より具 体的には、 配列番号 1 4で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AC009800に記 載される塩基配列の塩基番号 75001〜78000で示される塩基配列に相当する。 ） があげ られる。 配列番号 1 4で示される塩基配列においては、 ヒト由来の G protein- coupled receptor 7遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1666〜2652に示され ている。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 G- protein coupled
somatostatin and angiotensin— like peptide receptor遺 12子 C5ある ¾r合に ίま、 その プロモーター領、域、 のプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領 域） の塩基配列中に存在する C p Gを一つ以上含む塩基配列としては、 ヒ ト由来の G- protein coupled somatostatin and angiotensin- like peptide receptor遺 ¼ナのェ クソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノム D N Aの 塩基配列を挙げることができ、 より具体的には、 配列番号 1 5で示される塩基配列 （ Genbank Accession No. AC008971に記載される塩基配列の塩基番号 57001〜60000で示 される塩基配列の相補的配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 1 5で示される 酉己歹 (Jにおレ、ては、 ヒト由来の G— protein coupled somatostatin and
angiotensin- like peptide rec印 tor遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 776 〜2632に示されている。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝ナ ζ？ある場合には、 その プロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 (コーディング領域) の塩基配列中に存 在する C p Gを一つ以上含む塩基配列としては、 ヒト由来の Solute carrier family D neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺 is子のェクソン 1と、 そ の 5， 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノム D NAの塩基配列を挙げ ることができ、 より具体的には、 配列番号 1 6で示される塩基配列 (Genbank Accession No. AC026802に記載される塩基配列の塩基番号 78801〜81000で示される塩 基配列の相補的配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 1 6で示される塩基配列 ίこお ヽ" 1 |¾、 ヒ ト由来の; solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1479〜1804に示 されている。 第二工程は、 第一工程で調製された D NAを D NAメチル化酵素で処理する工程で
¾>る。
「D NAメチル化酵素」 とは、 D N A中の塩基をメチル化する酵素であり、 哺乳動 物細胞、 細菌等から、 多種の D N Aメチル化酵素が単離されている。 D N Aメチルイ匕 酵素は、 基質の塩基の種類から、 アデニンメチル化酵素、 シトシンメチル化酵素等、 複数種類に分類される。 シトシンメチル化酵素は、 D N A塩基配列中の特定の配列を 認識し、 その配列の近くのシトシンをメチル化する酵素であり、 認識する塩基配列に より異なったシトシンメチル化酵素が知られている。
D N Aメチル化酵素の触媒する D N Aのメチル化反応は、 制限修飾系と呼ばれる原 始的な免疫系から多数見出されている。 制限修飾系とは、 細菌で機能するゲノム全体 を定期的にメチル化することにより、 特定の配列を認識する制限酵素 （制限エンドヌ クレアーゼ) によって消化されないようにした上で、 外来 D NA (特にバタテリオフ ァージ） を制限酵素によって消化する機能で、 パクテリオファージ感染から微生物ゲ ノムを防御するシステムである。 ゲノムのメチル化に機能している酵素は、 シトシン 又はアデニンをメチルイヒし、 多くはプリン残基の 6位の窒素 （N 6 ) 、 或いは 5位の 炭素 （C 5 ) をメチル化することが知られている。 このような酵素のうち、 シトシン の C 5をメチル化するシトシンメチル化酵素としては、 Sssl (M. Sssl)メチラーゼ、 Alulメチラ一ゼ、 Hhalメチラーゼ、 Hpallメチラーゼ、 Msplメ'チラーゼ、 Haelllメチ ラーゼ等が知られている。 また、 これらシトシンの C 5位をメチルイ匕する酵素は、 認、 識する塩基配列が異なっており、 CpGを認識するシトシンメチルイヒ酵素は、 Ssslの みである。
ヒ トゲノム中の D NAのメチル化反応としては、 ェピジエネテイクス （遺伝子配列 によらない遺伝子発現の多様性を生みだす仕組み） として、 C p Gのシトシンの 5位 ( C 5 ) のメチル化が知られており、 このようなシトシンメチル化酵素として、 D N Aメチルトランスフェラ一ゼが知られている。 D N Aメチルトランスフェラーゼとし ては、 Dnmtlメチルトランスフヱラーゼが知られている。
ヒ ト細胞中では C p G配列のシトシンの C 5位がメチル化されているため、 人為的 にゲノムをメチル化する場合には、 Ssslを用いることで、 ヒ ト細胞内でのメチル化と 同じ配列 （C p G) の、 同じシトシンの、 同じ位置をメチルイ匕することが可能となる シトシンメチルイ匕酵素により D NAをメチルイ匕するためには、 具体的には例えば、 D NA試料に、 最適な 10 X緩衝液 （NEBuffer2 (NEB社製）） を 5 レ S-adenosyl methionine (3. 2 mM, NEB社製）を 0. 5 μ 1、 シトシンメチル化酵素 Sssl (NEB社製） を 夫々 0· 5 μ ί加え、 次いで該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 50 Lとし、 37°Cで 30 分間インキュベーションする。 第二工程におけるメチル化は、 目的とする D NA領域 を、 メチル化 D N A抗体に結合させることにより、 支持体へ結合するために実施する ため、 抽出した D NA試料の目的とする D N A領域がメチルイ匕されていれば、 必ずし も第二工程を実施する必要は無い。 第二工程において、 D N Aメチル化酵素によつて修飾されたメチル化 D N Aを構成 するメチル化塩基が、 後述の検出オリゴヌクレオチドの有するメチル化塩基と異なる 場合、 該検出オリゴヌクレオチド上のメチルイヒ塩基は識別機能として利用することが できる。 例えば、 検出オリゴヌクレオチドが 6 -メチルアデニンであり、 第二工程で シトシンが 5 -メチルシトシンに修飾できれば、 検出ォリゴヌクレオチドの識別機能 として、 6 -メチルアデユン抗体を利用し、 支持体への固定はメチルシトシン抗体を 用いることができる。 具体的には、 第二工程で S s s Iメチラ一ゼで修飾した場合、 支持体への固定はメチルシトシン抗体を用いることができる。 即ち、 検出オリゴヌク レオチドがメチルアデニン有しており、 メチルアデニン抗体で検出オリゴヌクレオチ ドを検出することは、 目的とする DNA領域を有する DNAのメチルシトシンを検出 することなく、 検出オリゴヌクレオチドのメチルアデニンのみを検出することが可能 となる。 第三工程は、 第二工程で取得した DNAメチル化酵素で処理された DNAから、 一 本鎖メチル化 DN Aを調製し、 目的とする DNA領域を有する一本鎖メチル化 DNA に検出オリゴヌクレオチドを結合させて被検 DN A複合体を取得する工程である。 本発明方法における 「検出オリゴヌクレオチド」 とは、 オリゴヌクレオチドを構成 するヌクレオチドの塩基が、 該検出オリゴヌクレオチドを検出又は定量するための識 別機能と、 目的とする DN A領域を有する DN Aと相補性によって結合するための塩 基配列である検出用接着配列とを有しているオリゴヌクレオチドである。
また、 本発明における 「検出オリゴヌクレオチド」 は、 後述するヒトゲノム中の反 復配列、 重複遺伝子又は偽遺伝子の塩基配列若しくはその一部と相補的に結合し得る 塩基配列からなってもよい。 具体的に例えば、 配列番号 38、 40で示される塩基配 列又はそれらの相補配列を有する塩基配列等を挙げることができる。 検出用接着配列は、 目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNAとの結合体 （二本鎖 ) を形成するために必要な塩基配列、 即ち、 目的とする DNA領域の塩基配列の一部 に相補的な塩基対合により結合できる配列を含む塩基配列、 又は、 目的とする DNA 領域の 5 ' 末端より更に 5， 末端側 D N A領域の塩基配列の一部に相補的な塩基配列 を含む塩基配列、 又は、 目的とする DN A領域の 3' 末端より更に 3' 末端側の塩基 配列の一部に相捕的な塩基配列を含む塩基配列であり、 尚且つ、 メチル化 DN A抗体 と目的とする DNA領域においてメチル化された DN Aとの結合を阻害しないことが 望ましレ
「メチル化 D N A抗体と目的とする DN A領域においてメチル化された DNAとの 結合を阻害せず」 とは、 メチル化 DN A抗体がメチルイヒされた一本鎖 DN Aへの結合 に要する占有空間内で、 本ォリゴヌクレオチドと前記一本鎖 D N Aの相捕的な結合が おこらないことを意味する。 即ち、 メチルイ匕 DN A抗体がメチル化された塩基 （シト シン） に結合するには、 直接結合するメチル化された塩基 （シトシン） のみならず、 メチルイ匕された塩基 （シトシン） の存在する周辺空間も占有すると考えられる。 故に 、 検出用接着配列は、 メチル化 DN A抗体がメチルイヒされた DN Aに結合する際に要 する占有空間で、 前記一本鎖 DNAと相補的な結合をしないものであれば良い。 前記 一本鎖 DNAに結合させる検出用接着配列は、 1種類である必要は無く、 メチル化 D N A抗体の結合を阻害しなければ、 2種類以上用いても良い。 複数の本オリゴヌタレ ォチドを使用すれば、 定量精度及び検出感度を向上させることができる。 第三工程における 「目的とする DNA領域を有する一本鎖メチル化 DNAを取得し 、 該一本鎖メチル化 DNAに検出オリゴヌクレオチドを結合させて被検 DNA複合体 を取得する」 とは、 メチル化された目的とする DNA領域を有する DNA (以下、 一 本鎖メチル化 D N Aと記すこともある） と検出ォリゴヌクレオチドとが相補的に結合 してなる被検 DNA複合体を形成させることを意味する。 具体的には、 前記第二工程 で DN Aメチル化酵素によりメチル化された一本鎖メチル化 DNAを Tris - HC1パッ ファー （10 mM) で lng/AtLの溶液に調製し、 該一本鎖メチル化 D N Aと相捕的に結合 しうる検出オリゴヌクレオチドを Tris - H バッファー （10 raM) で 0.02^^1の溶液に 調製し、 夫々のオリゴヌクレオチド溶液と緩衝液 (330mM Tris- Acetate H 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5raM Dithiothreitol) l O /^ Lと、 100 mM MgCl2溶 液 10 zLと、 1 mg/mL BSA溶液 10 xLを混合し、 更に該混合物に滅菌超純水を加え て液量を 100 Lとする。 その後、 95°Cで 10分間加熱し、 その後 70°Cまで速 やかに冷却して 10分間保温した後、 50 °Cまで冷却して 10分間保温し、 更に 37 °Cで 10分間保温してから、 室温に戻すことで、 一本鎖メチル化 DN Aと検出オリゴ ヌクレオチドとの被検 D N A複合体の形成を促せばょレ
「相補的に結合」 とは、 塩基同士の水素結合による塩基対合により二本鎖 D N Aを 形成することを意味する。 例えば、 D NAを構成する二本鎖の各々一本鎖 D NAを構 成する塩基が、 プリンとピリミジンの塩基対合により二本鎖を形成することであり、 より具体的には、 複数の連続した、 チミンとアデェン、 グァニンとシトシンの水素結 合による塩基結合により、 二本鎖 D NAを形成することを意味する。 相補性によって 結合することを 「相補的な結合」 と呼ぶこともある。 「相補的に結合」 は、 「相補的 に結合し得る」 、 「相補的に塩基対合し得る」 、 「相補性により結合」 又は 「相補性 によって結合 （相捕的な （塩基対合による） 結合） する」 と表現することもある。 ま た、 相補的に結合し得る塩基配列を互いに 「相補性を有する」 [相補性である]と表現 することもある。 尚、 人工的に作製されるオリゴヌクレオチドに含まれるイノシンが 、 シトシン、 アデユン、 又はチミンと水素結合により結合することも意味する。 本発明方法において、 一本鎖メチル化 D N Aと検出オリゴヌクレオチドが 「相補性 により結合」 する場合、 検出オリゴヌクレオチドの検出用接着配列を構成する塩基配 列の一部が一本鎖メチルイ匕 D N Aと塩基対合しない場合も含まれる。 例えば、 検出用 接着配列を構成する塩基のうち、 少なくとも 7 5 %、 好ましくは 8 0 %以上の塩基が 一本鎖メチル化 D N Aと塩基対合しており、 尚且つ、 被検オリゴヌクレオチドと、 少 なくと 7 5 %以上、 好ましくは 8 0 %以上の相同性を有するォリゴヌクレオチドと検 出用接着配列が結合できる場合も含まれる。 本発明方法の第三工程において、 一本鎖メチル化 D N Aと検出ォリゴヌクレオチド との被検 D N A複合体を形成させる際の好ましい態様としては、 カウンターオリゴヌ クレオチドを添カロすること等を挙げることができる。 カウンターオリゴヌクレオチドとは、 目的とする D N A領域と同じ塩基配列からな るポリヌクレオチドを 「短い」 オリゴヌクレオチドに分割したものである。 この場合 、 「短い」 とは、 10〜100塩基、 より好ましくは、 20〜50塩基の長さをいう 。 尚、 カウンタ一オリゴヌクレオチドは、 検出ォリゴヌクレオチドと一本鎖メチル化 DN Aとが結合する塩基配列上には設計しない。 カウンターオリゴヌクレオチドは、 目的とする D N A領域に比し過剰に添加する。 目的とする D N A領域が正鎖である場 合、 目的とする DN A領域 （正鎖） を一本鎖にした後、 後述する固定化メチル化 DN A抗体と結合させる際に、 目的とする DN A領域の相補鎖 （負鎖） と目的とする DN A領域 （正鎖） が相補性により再結合することを妨げるために添加する。 メチル化さ れた目的とする DN A領域にメチル化 DN A抗体を結合させて、 目的とする DN A量 又はそれに相関関係のある指標値を測定する際に、 メチル化された目的領域が一本鎖 である方がメチル化 DN A抗体に結合しやすいからである。 尚、 カンウタ一オリゴヌ クレオチドは、 目的とする DNA領域に比べて、 少なくとも 10倍、 好ましくは 10 0倍以上の量で添加されることが望ましい。 第一工程で調製された D N A試料中の目的とする DN A領域が一本鎖 D N Aである 場合には、 第三工程のうち 「一本鎖メチル化 DN Aを調製」 するためには、 特別な作 業をしなくとも一本鎖メチルイヒ DNAを DNA試料として取得することができる。 具 体的には、 DNA試科として、 RN Aから逆転写酵素処理により合成された一本鎖 D NA、 ウィルスから抽出された DNAのうち、 一本鎖 DNAをゲノムとするウィルス から取得された一本鎖 DN Aを上げることができる。 また、 第一工程で調製された D NA試料中の目的とする DNA領域が二本鎖 DNAである場合には、 第三工程のうち 「一本鎖メチル化 DN Aを調製」 するためには、 二本鎖 DNAを一本鎖にするための 操作を行えばよい。 この場合、 具体的には 95 °Cで数分間加熱し、 4°C以下に急冷す ればよい。 検出オリゴヌクレオチドにおける 「検出用接着配列」 とは、 目的とする DNA領域 の有する塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであって、 検出用 接着配列が対合し得る目的とする D N A領域の塩基配列と 75 %以上、 好ましくは 9 0%以上の相同性を有する配列であることを意味する。 また、 検出用接着配列は、 後 述する固定化メチル化 D N A抗体と被検 D N A複合体との結合を阻害しないものであ れば良い。 また、 「検出用接着配列」 は、 目的とする D N A領域又は目的とする D N A領域の近傍に結合する塩基配列を有し、 後述する第四工程で検出複合体を形成でき るように設定されていれば良い。 尚、 検出用接着配列は後述する同一反復配列中 （目 的とする D N A領域中） に一つであってもよく、 二つ以上設計されていても良い。 二 つ以上設計する場合、 複数の検出用接着配列と後述する特定接着配列は、 互いに一本 鎖メチノレ化 D N Aとの結合を阻害しないものであれば良い。 第四工程は、 第三工程で取得した被検 D N A複合体に固定化メチル化 D N A抗体を 結合させて検出複合体を取得する工程である。
「固定化メチル化 D N A抗体」 とは、 D NA中のメチル化された塩基を抗原として 結合するメチル化 D N A抗体を 「支持体」 に固定ィヒしたものである。 抗体として、 好 ましくは一本鎖 D N A中の 5位がメチル化されたシトシンを認識して結合する性質を 有している抗体であればよく、 より好ましくは、 メチルシトシン抗体でも良レヽ。 また 、 市販されているメチル化 D NA抗体であっても、 本明細書記載のメチル化状態の D N Aを特異的に認識して、 特異的に結合できる抗体であればよい。
「支持体」 としては、 メチル化 D N A抗体が結合可能な支持体であれば、 材質及ぴ 形状は何でも良い。 例えば、 形状は、 使用目的に適っていればよく、 チューブ状、 テ ストプレート状、 フィルター状、 ディスク状、 ビーズ状等が挙げられる。 また、 材質 としては、 通常の免疫測定法用支持体として用いられるもの、 例えば、 ポリスチレン 、 ポリプロピレン、 ポリアクリルアミ ド、 ポリメタクリル酸メチル、 ポリスルホン、 ポリアクリロニトリル、 ナイロン等の合成樹脂、 又は、 前記合成樹脂にスルホン基、 アミノ基等の反応性官能基を導入したものでも良い。 また、 ガラス、 多糖類若しくは その誘導体 （セルロース、 ニトロセルロース等） 、 シリカゲル、 多孔性セラミックス 、 金属酸化物等でも良い。
「支持体」 は微粒子でも良く、 更に、 検出オリゴヌクレオチドには、 支持体と同じ 微粒子が結合されていても構わない。 微粒子としては、 ラテックスビーズ、 金コロイ ド (金ナノ粒子) 等が挙げられる。
支持体と検出オリゴヌクレオチドに、 同一種類の微粒子が結合されていれば、 支持 体である微粒子と検出オリゴヌクレオチドに結合されている微粒子は、 目的とする D NA領域を有するメチル化された D N A上に同時結合して、 微粒子同士が凝集するこ とが可能になる。 即ち、 固定化メチル化 D N A抗体と、 検出オリゴヌクレオチドと、 メチルイヒされた一本鎖 D NAが結合して検出複合体を形成することにより、 支持体で ある微粒子と検出オリゴヌクレオチドに結合された微粒子が凝集体となることを意味 する。 'この場合、 微粒子がラテックスビーズであれば、 凝集体は濁度の変化によって 検出することが可能となる。 また、 微粒子が金コロイド （金ナノ粒子） であれば、 凝 集体は、 色調変化 （ピンクから紫色） によって検出することが可能となる。
—つの目的とする D N A領域を有する D N A上に同時に複数の支持体に固定化され たメチル化 D N A抗体が結合する場合には、 目的とする D N A領域を有する D N A上 の複数のメチル化 D N Aに微粒子上に固定化されたメチル化 D N A抗体が結合するこ とにより微粒子の凝集を検出できる。 例えば、 支持体がラテックスビーズである場合 、 微粒子の凝集体は濁度の変化によって検出することが可能となる。 また、 支持体が 金コロイド （金ナノ粒子） である場合、 微粒子の凝集体は、 色調変化 （ピンクから紫 色） によって検出することが可能となる。 尚、 この場合、 検出オリゴヌクレオチドを 付加せずに実施しても検出オリゴヌクレオチドを添加した場合と同様の検出結果を得 ることができる。 微粒子の凝集体で検出される量は、 第二工程までにメチル化されている D N Aの総 和に相関する値となる。 第一工程で取得する D N Aが組織中の細胞に含まれる D N A である場合、 組織中の細胞に含まれる D NAのメチル化の程度は組織毎に異なってい る為、 第二工程で得られる D N Aのメチルイ匕の程度は、 組織中の細胞でのメチル化の 程度と、 第二工程でメチ /レイヒされるの程度の双方を含む。 即ち、 第二工程で D N Aメ チル化酵素処理を実施しない場合に微粒子の凝集体で検出される量は、 組織中の細胞 でのメチル化の程度に相関する値となる。
「メチル化 D NA抗体」 とは、 D N A中のメチルイ匕された塩基を抗原として結合す る抗体である。 具体的には、 メチルシトシン抗体をあげることができ、 一本鎖 D NA 中の 5位がメチル化されたシトシンを認識して結合する性質を有している抗体を挙げ ることができる。 本明細書記載のメチル化状態の D N Aを特異的に認識して、 特異的 に結合できる抗体であれば、 市販されているメチルイヒ D N A抗体を利用することもで きる。 メチル化 D N A抗体は、 メチル化された塩基、 メチル化 D N A等を抗原として 、 通常の方法により作製できる。 具体的にメチルシトシン抗体を作成するためには、 5—メチルシチジン、 5—メチノレシトシン、 或いは、 5ーメチルシトシンを含む D N A等を抗原として作製された抗体から D N A中のメチルシトシンへの特異的な結合を 指標として選抜する。 尚、 このような固定化メチル化 D N A抗体の性質 （1つのメチ ル化された塩基 （シトシン） に 1つの抗体が結合すること ) カゝら考えると、 目的とす る D N A領域としては、 数多くのメチル化された塩基 （シトシン） 、 即ち C p G、 が 存在する領域を選抜することにより、 定量精度及び検出感度の向上が期待できる。 動物に抗原を接触させて得られる抗体としては、 動物に抗原を免疫して得られる I g G画分の抗体 （ポリクローナル抗体） 、 単一のクローンを生産する抗体 （モノクロ ーナル抗体） がある。 本発明においてはメチル化 D N A、 或いはメチルシトシンを特 異的に認識できる抗体であることが望ましいため、 モノクローナル抗体を利用するこ とが望ましい。 モノクロ一ナル抗体を作製する方法としては、 細胞融合法による方法をあげること ができる。 例えば、 細胞融合法は免疫したマウス由来の脾細胞 （B細胞） と骨髄月重細 胞とを細胞融合させることでハイプリ ドーマを作製し、 ハイブリ ドーマの生産する抗 体を選抜して、 メチルシトシン抗体 （モノクローナル抗体） を作製する。 細胞融合法 でモノクローナル抗体を作製する場合は、 抗原を精製する必要がなく、 例えば、 5— メチルシチジン、 5—メチルシトシン、 又は、 5—メチルシトシンを含む D N A等の 混合物を抗原として、 免疫に用いる動物に投与できる。 投与方法としては、 5—メチ ルシチジン、 5—メチルシトシン、 又は、 5—メチルシトシンを含む D N A等を、 直 接、 抗体を産生させるマウスへ投与する。 抗体が産生されにくい場合は、 抗原を支持 体へ結合させて免疫しても良い。 また、 アジュバント溶液 （例えば、 流動パラフィン と A r a c e l Aを混合し、 アジュパントとして結核菌の死菌を混合したもの） と 抗原をよく混合することや、 リボソームに組み入れて免疫することで、 抗原の免疫性 を上げることができる。 或いは、 抗原を含む溶液とアジュバント溶液を等量添加し、 十分に乳液状にしてから、 マウスの皮下或いは腹腔内に注射する方法や、 ミヨウバン 水とよく混合してから百日咳死菌をアジュバントとして添加する方法がある。 尚、 最 初の免疫をしてから適当な期間の後、 マウスの腹腔内或いは静脈内に追加免疫するこ ともできる。 また、 抗原の量が少ない場合には、 抗原が浮遊する溶液を、 直接マウス 脾臓に注入して免疫しても良レヽ。 最終免疫から数日後に脾臓を摘出し脂肪組織を剥離 して力 ら、 脾細胞浮遊液を作製する。 この脾細胞と、 例えば H G P R T欠損骨髄腫細 胞とを細胞融合してハイプリ ドーマを作製する。 細胞融合剤としては脾細胞 （B細胞 ) と骨髄腫細胞を効率的に融合できる方法ならば何でもよく、 例えば、 センダイウイ ルス (H V J ) 、 ポリエチレングリコール ( P E G) を用いる方法などが挙げられる 。 また、 高電圧パルスを用いる方法で細胞融合をしても良い。 細胞融合操作の後、 H A T培地で培養し、 脾細胞と骨髄腫細胞が融合したハイブリ ドーマのク口ーンを選択 し、 スクリーニングが可能になるまで細胞が成育するのを待つ。 目的とする抗体を生 産するハイプリ ドーマを選択するための抗体の検出法や抗体力価の測定法には、 抗原 抗体反応系を利用できる。 具体的には、 可溶性抗原に対する抗体測定法で、 放射性同 位元素免疫定量法 （R I A) 、 酵素免疫定量法 （E L I S A) などが挙げられる。
' —本鎖 D NA中に存在する C p Gが少なくとも一箇所以上メチル化されていれば抗 メチル化抗体と結合することができる。 従って、 本発明の方法における 「メチル化さ れた」 とは、 D N A中に存在する C p Gが少なくとも一箇所以上メチルイ匕されている D NAを意味しており、 D NA中に存在する C p Gの全てがメチルイヒされている D N Aに限った意味ではない。 第四工程における 「検出複合体」 とは、 第三工程で取得された被検 DNA複合体と 固定化メチル化 D N A抗体とが結合した複合体を意味する。 メチル化 D N A抗体は支 持体に固定ィ匕され得るものとして使用されるため、 メチル化 DNA抗体が、 最終的に 、 目的とする DNA領域においてメチル化された DNAを含む一本鎖 DNAと検出ォ リゴヌクレオチドとの被検 DNA複合体を形成した状態で支持体に固定ィ匕できればよ
(1) 被検 DN A複合体とメチル化 DN A抗体との結合前の段階で、 メチル化 DNA 抗体が支持体へ固定化されていても良く、 また、
(2) 被検 DN A複合体とメチル化 DN A抗体との結合後の段階で、 メチル化 DNA 抗体が支持体へ固定化されていても良い。 メチル化 DNA抗体を支持体へ固定させるためには、 具体的には、 メチル化 DNA 抗体をビォチン化して得られたビォチン化メチル化 D N A抗体をストレプトアビジン で被覆した支持体 （例えば、 ストレプトァビジンで被覆した P C Rチューブ、 ストレ プトァビジンで被覆した磁気ビーズ、 ストレプトァビジンで一部を被覆したクロマト ストリップ等） に固定する方法を挙げることができる。
また、 メチル化 DNA抗体に、 アミノ基、 チォ一ル基、 アルデヒド基等の活性官能 基を有する分子を共有結合させた後、 これをシランカツプリング剤等で表面を活性化 させたガラス、 多糖類誘導体、 シリカゲル、 又は前記合成樹脂等或いは耐熱性プラス チック製の支持体に共有結合させる方法もある。 尚、 前記の共有結合は、 例えば、 メ チル化 DN A抗体に前記の活性官能基を有する分子を、 トリグリセライドを 5個直列 に連結して成るようなスぺーサ一、 クロスリンカ一等を用いて共有結合させればよい 。 また、 メチルイ匕 DNA抗体を直接支持体に固定ィヒしてもよく、 また、 メチル化 DN A抗体に対する抗体 （二次抗体） を支持体に固定化し、 二次抗体にメチル化抗体を結 合させることで支持体に固定しても良い。 第四工程である 「被検 DN A複合体に固定ィ匕メチル化 DNA抗体を結合させて検出 複合体を取得する」 とは、 第三工程で得られた被検 DN A複合体に含まれる一本鎖メ チル化 DNAを固定化メチル化 D N A抗体と結合させて支持体に固定化することを意 味する。 例えば、 「被検 DN A複合体とメチル化 DN A抗体との結合前の段階で、 メ チル化 DN A抗体が支持体へ固定化」 する場合、 具体的には例えば、 支持体に固定化 可能なメチル化 DNA抗体として、 「ビォチン標識されたピオチン化メチル化 DNA 抗体」 を使用し、 検体由来の DNA試料が、 生物由来検体由来検体中に含まれるゲノ ム由来の DNA試料である場合には、 以下のように実施すれば良い。
(a) ピオチン化メチル化 DNA抗体を適当量 （例えば、 4^^/1^溶液を100 丄/ゥェ ル） アビジン被覆プレートに添加し、 その後、 室温で、 例えば、 約 2時間静置するこ とにより、 ピオチン化メチル化 D N A抗体とストレプト了ビジンとの固定化を促す。 その後、 残溶液の除去及び洗浄を行う。 洗浄バッファー （例えば、 0.05% Tween20含 有リン酸バッファー （lmM K P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7.4) ) を、 例 えば 300 L /ゥエルの割合で添加し、 溶液を取り除く。 この洗浄操作を数回繰り 返し、 支持体に固定ィヒされたビォチン化メチルシトシン抗体をゥエル上に残す。
(b) 検体由来の DNA試料が、 生物由来検体由来検体中に含まれるゲノム由来の D NA試料に、 NEBuffer2 (NEB社製）を 5 L、 S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社 製）を 0.5μ 1、 シトシンメチル化酵素 Sssl (NEB社製） を夫々0.5 カ卩え、 次いで該 混合物に滅菌超純水を加えて液量を 50 しとし、 37DCで 30分間インキュベーション後 、 二本鎖 DNAを分離させて得られたメチル化一本鎖 DNAと、 検出オリゴヌクレオ チドと、 ァニーリングバッファー （例えば、 33mM Tris- Acetate pH 7.9、 66mM KOAc 、 lOraM Mg0Ac2 N 0.5mM Dithothreitol) とを混合して、 95 °Cで例えば数分間加熱す る。 その後、 目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNAと検出オリゴヌクレオチドと の結合体を形成させるために、 検出オリゴヌクレオチドの Tm値の約 10〜20°C低 い温度まで速やかに冷却し、 その温度で例えば数分間保温し、 その後、 室温に戻す （ この段階で形成された結合体は、 目的とする DNA領域においてメチル化された DN Aを含むメチルイ匕一本鎖 DN Aと検出オリゴヌクレオチドとの結合体の他、 目的とす る DN A領域においてメチル化された DN Aを含まない一本鎖 DNAと検出オリゴヌ クレオチドとの結合体を含んでいる。 ） 。 (c) 形成されたメチル化一本鎖 DNAと検出オリゴヌクレオチドとの結合体を、 ビ ォチン化メチル化 DNA抗体が固定化されたアビジン被覆プレートに添加し、 その後 、 室温で約 3時間静置し、 ビォチン化メチル化 DN A抗体と、 前記メチル化一本鎖 D NAのうち目的とする DNA領域においてメチルイヒされた DNAを含むメチル化一本 鎖 DNAと、 検出オリゴヌクレオチドとの複合体の形成を促す （複合体の形成） （こ の段階で、 目的とする DNA領域を含む DNA試料がメチルイ匕されていなければ、 一 本鎖 DNAと検出オリゴヌクレオチドとの結合体は、 メチル化 DN A抗体との複合体 を形成しない。 ） 。 その後、 残溶液の除去及ぴ洗浄を行う。 洗浄バッファー （例えば 、 0.05% Tween20含有リン酸バッファ一 （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 7H20 154mM NaCl pH7.4) ) を、 例えば 300 ; L/ゥエルの割合で添加し、 溶液を取り除く。 この洗浄 操作を数回繰り返すことにより、 複合体をゥエル上に残す （複合体の分離） 。
(b) において使用するアニーリングバッファ一としては、 検出オリゴヌクレオチド と、 目的とする DNA領域を含むメチル化一本鎖 DN Aとを結合させるのに適してい れば良く、 前記アニーリングバッファーに限られるわけではない。 二価イオン、 好ま しくはマグネシウムイオンが; L〜 60 OmMの濃度で溶解しているものを使用すれば 結合の安定性が増加する。
(a) 及ぴ （c) における洗浄操作は、 溶液中に浮遊している固定ィ匕されていないメ チル化 D NA抗体と、 メチル化 D N A抗体に結合しなかつた溶液中に浮遊しているメ チル化されていない一本鎖 DNAと、 検出オリゴヌクレオチドとの結合体を形成しな かった目的とする D N A領域以外のメチル化一本鎖 D N A等を反応溶液から取り除く ため重要である。 尚、 洗浄バッファ一は、 上記の遊離のメチル化 DN A抗体、 溶液中 に浮遊しているメチルイ匕一本鎖 DN A等の除去に適していれば良く、 前記洗浄バッフ ァ一に限らず、 DELF I Aバッファー （Perkin Elmer社製、 Tris- HC1 pH 7.8 with Tween 80) 、 TEバッファ一等でも良い。
上記 （a) 〜 （c) では、 前記の目的とする DN A領域をメチル化して得られたメ チル化一本鎖 DNAと、 検出オリゴヌクレオチドとの結合の後、 生じる結合体にビォ チン化メチル化 DN A抗体を結合させ、 複合体を形成しているが、 この順番に限られ るわけではない。 即ち、 前記の目的とする DN A領域を含むメチルイ匕一本鎖 DN Aと ビォチン化メチルイヒ DNA抗体とを結合させた後、 生じる結合体に検出オリゴヌクレ ォチドを結合させ、 複合体を形成しても良い。 例えば、 ストレプトアビジンで被覆し た支持体に固定化されたビォチン化メチル化 D N A抗体に、 ゲノム由来の DN A試料 を、 NEBuffer2 (NEB社製）を 5 L、 S-adenosyl methionine (3.2 raM, NEB社製）を 0.5 μ 1、 シトシンメチル化酵素 Sssl (NEB社製) を夫々 0.5 Lカロえ、 次いで該混合物に 滅菌超純水を加えて液量を 50 μίとし、 37°Cで 30分間インキュベーション後、 二本鎖 D N Aから分離して得られたメチルイヒー本鎖 D N Aを添加することにより、 支持体に 固定化されたピオチン化メチル化 D N A抗体と該メチル化一本鎖 DNAとの結合体を 形成させる （この段階で形成された結合体は、 目的とする DN A領域においてメチル 化された DNAを含むメチル化一本鎖 DNAとメチル化抗体との結合体の他、 目的と する DN A領域以外のメチル化されたメチル化一本鎖 D NAとメチル化抗体との結合 体を含んでいる。 ) 。 その後、 これに検出オリゴヌクレオチドを添加して、 前記結合 体のうち目的とする D N A領域にぉレ、てメチル化された D N Aを含むメチル化一本鎖 DNAを有する結合体との複合体を形成させ、 分離しても良い （この段階で、 目的と する D N A領域以外の領域におけるメチル化された D N Aを含むメチル化一本鎖 D N Aとメチル化抗体との結合体は複合体を形成しない。 ) 。 上記 （a) 〜 （c) の操作を、 クロマトストリップを用いて行うことも可能である 。 その場合には、 具体的には以下のように実施する。 例えば、 まず、 ビォチン化メチ ル化 DNA抗体の適当量を、 ストレプトアビジンで一部を被覆したクロマトストリッ プにより展開する。 該操作により、 ピオチン化メチルイ匕 DN A抗体が、 ストレブ.トァ ビジンで被覆された部分に固定ィ匕されることになる。 次いで、 （b) で得られた前記 メチル化一本鎖 D N Aと検出オリゴヌクレオチドとの結合体 (この段階で形成された 結合体は、 目的とする D N A領域においてメチルイヒされた DNAを含むメチル化一本 鎖 DN Aと検出オリゴヌクレオチドとの結合体の他、 目的とする DN A領域において メチル化された DNAを含まない一本鎖 DNAと検出オリゴヌクレオチドとの結合体 を含んでいる。 ） を、 前記のクロマトストリップにより展開する。 これら操作により 、 ゲノム DNA由来の DNA試料を、 NEBuffer2 (NEB社製）を 5μ L、 S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製）を 0.5 1、 シトシンメチル化酵素 Sssl (NEB社製） を 夫々0.5μί加え、 次いで該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 50/ Lとし、 37°Cで 30 分間インキュベーション後、 二本鎖 DN Aを分解して得られたメチル化一本鎖 DN A と、 検出オリゴヌクレオチドと、 ビォチン化メチル化 DNA抗体とからなる複合体が 、 ストレプトアビジンで被覆した部分に固定ィヒされる （複合体の形成 ·支持体への固 定） （この段階で、 目的とする DNA領域においてメチルイ匕された DNAを含まない —本鎖 DN Aと検出オリゴヌクレオチドとの結合体は、 複合体を形成しない。 ） 。 複 合体形成のための操作の順番については、 これら操作の順に限られるわけではない。 例えば、 目的とする D N A領域においてメチル化された D N Aを含む一本鎖 D N Aと 、 検出オリゴヌクレオチドと、 ビォチン化メチル化 D N A抗体とからなる複合体を形 成させた後、 これをクロマトストリップで展開し、 ストレプトアビジンで被覆した部 分に、 該複合体を固定化しても良い。 これら操作では、 溶液をクロマトストリップに より展開することで不要な成分を除去することができ、 洗浄操作を省略することが可 能となる。 各操作間に、 洗浄操作 （洗浄バッファー （例えば、 0.05% Tween20含有リ ン酸バッファー （ImM KH2P04、 3raM Na2HP0 7H20 154mM NaCl pH7.4) によるクロマ トストリップの展開） を実施してもよい。 第五工程は、 第四工程で得られた検出複合体に含まれる検出オリゴヌクレオチドを その識別機能により定量又は検出することにより、 前記一本鎖 DNA中の目的とする DN A領域を有する DN Aを定量又は検出する工程である。
ここでいう 「検出」 とは、 検出オリゴヌクレオチドの識別機能により、 第二工程ま でにメチル化されている DNAのメチノレイ匕の程度が一定程度以上か否かを判別するこ とを意味する。 即ち、 通常は、 後述の識別機能により有意な値が得られることを意味 する。
また、 「定量」 とは、 第五工程で求めた識別機能により検出される量の数値化を意 味する。 即ち、 第一工程で取得された目的とする DNA領域を有する DNAと第二ェ 程で DN Aメチル化酵素処理によりメチル化されたメチルイヒ DN Aの総和量に相関す る値が得られる事を意味する。 例えば、 後述する識別機能としてメチルイ匕 DN A抗体 又は本オリゴヌクレオチドの量を定量した値は、 検体中での目的とする D NA領域の D N Aの量と相関する値であり、 例えば、 検体が l mLの血清であった場合、 血清 l mL 中に含まれる目的領域の D N Aの、 第一工程で取得された目的とする D NA領域を有 する D N Aと第二工程で D N Aメチル化酵素処理によりメチル化されたメチル化 D N Aの総和量に相関する値を取得することを意味する。 第五工程における 「識別機能」 とは、 検出オリゴヌクレオチドを検出又は定量でき る機能である。 該識別機能は検出オリゴヌクレオチドの有する機能であれば何でも良 く、 例えば、 検出オリゴヌクレオチドの標識に基づく識別機能や、 検出オリゴヌクレ ォチドに結合する検出分子によって検出オリゴヌクレオチドに付与される識別機能を 挙げることができる。 具体的には、 検出オリゴヌクレオチドに、 その 5， 末端若しく は 3， 末端にユーロピウム標識、 金コロイド標識、 ラテックスビーズ標識、 放射性同 位体標識、 蛍光物質 （F I T C等） 標識、 horseradish Peroxidase (HR P ) 標識、 アル力リホスファターゼ標識等がなされた検出オリゴヌクレオチドの蛍光 ·発色等の 特性を挙げることができる。
ユーロピウムの検出のためには、 Enhancement Solution (PerkinElmer社製） を添 加 ·混令し、 約 4 5分間室温で静置した後、 蛍光検出器で蛍光 （励起 340mn/蛍光 612nm) を測定すればょレ、。 また、 検出ォリゴヌクレオチドがメチル化ォリゴヌタレ ォチドである場合には、 検出分子としては、 具体的には、 メチル化 D NA抗体や、 ォ スミゥム錯体 (J. Am. Chem. Soc.， 2007 ; 129 : 5612— 5620) 等が挙げられる。 メチル 化オリゴヌクレオチドとは、 オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドの塩基の少 なくとの一つががメチル化されているオリゴヌクレオチドを意味し、 より具体的には 5 -メチルシトシン、 6 -メチルアデニン等を含むオリゴヌクレオチドを意味する。 更 に、 検出オリゴヌクレオチドが F I T C標識されている場合には、 検出分子として F I T C抗体を挙げることができる。 検出分子がメチル化 D NA抗体である場合には、 抗体に結合させて定量又は検出で きる機能であれば、 識別機能を抗体に付与することができる。 但し、 固定ィ匕メチルイ匕 D N A抗体と基質交差性を有するメチル化 D N A抗体は用いることができない。 例え ば、 固定化メチル化 D N A抗体がメチルシトシン抗体を使用している場合、 メチルシ トシンに結合し得るメチル化 D N A抗体を利用することはできない。 具体的には、 ュ 一口ピウム標識、 金コロイド標識、 ラテックスビーズ標識、 放射性同位体標識、 蛍光 物質 （F I T C等） 標識、 horseradish Peroxidase (H R P ) 標識、 アルカリホスフ ァターゼ標識、 ピオチン標識等、 標識が蛍光 ·発色等の機能である。 尚、 これら検出 分子としての抗体に識別機能を付与する方法としては、 検出分子である抗体に直接識 別機能を結合させても良いし、 識別機能を有した二次抗体又は三次抗体を検出分子で ある抗体に結合させる方法が挙げられる。 具体的には、 蛍光物質で標識された抗体、 horseradish Peroxidase (H R P ) 標識された抗体、 アルカリホスファターゼ標識さ れた抗体、 ビォチン標識された抗体、 ユーロピウム標識された抗体は、 市販されてい るので、 二次抗体又は三次抗体として利用する事ができる。 また、 酵素サイクル法で 検出可能な基質を結合した抗体であっても良い。 これら機能の定量又は検出手段とし ては、 例えば、 放射線検出器、 分光光度計等による測定、 又は目視等が挙げられる。 例えば、 検出オリゴヌクレオチドを、 その識別機能により検出又は定量する場合とし て、 具体的に検出又は定量可能な機能としてユーロピウムが付加された二次抗体を使 用する場合、 検出複合体に二次抗体を結合させた後、 Enhancement Solution ( PerkinElmer社製） を添加 ·混合し、 約 4 5分間室温で静置する。 その後、 蛍光検出 器で蛍光 （励起 340nm/蛍光 612mu) を測定すればよい。
検出オリゴヌクレオチド上のメチル化 D N Aにメチル化 D N A抗体 （固定化メチル 化 D NA抗体と異なる基質特異性を有するメチルイヒ D NA抗体） を結合させて、 その 機能により検出又は定量する場合には、 具体的には例えば、 抗体自身の特性を機能と して用いる際には、 以下のように操作を行えば良い。 複合体にメチル化 D N A抗体を 結合させた後、 メチルイヒ D N A抗体に対する二次抗体 （例えば、 Eu - N1標識マウス IgG 抗体： PerkinElmer社製） を添加し、 室温で約 1時間静置し、 二次抗体の複合体への 結合を促す。 その後、 Enhancement Solution (PerkinElmer社製） を添加 '混合し、 例えば約 4 5分間室温で静置する。 その後、 蛍光検出器で蛍光 （励起 340nm/蛍光 612nm) を測定することにより、 検出又は定量する。 検出オリゴヌクレオチド上のメチル化 DN Aに結合するメチル化 DN A抗体を F I TCで標識する場合には、 二次抗体として F I TCを結合させた抗体を用いることも できる。 この場合、 公知の方法により、 F I TCの蛍光を測定し、 検出又は定量する こともでき、 抗 F I TC抗体を二次抗体として検出又は定量することもできる。 更に 、 検出ォリゴヌクレオチドに F I T Cを直接結合させた場合は、 F I T Cを識別機能 として利用することもできるし、 horseradish Peroxidase (HRP) 標識された F I T C抗体、 アルカリホスファターゼ標識された F I T C抗体、 ビォチン標識された F I TC抗体、 ユーロピウム標識された F I TC抗体等により標識機能を付与すること もできる。 具体的には、 検出オリゴヌクレオチドとして、 F I TC標識したオリゴヌ クレオチドを検出オリゴヌクレオチドとして使用する場合は、 該検出オリゴヌクレオ チドを含む支持体に固定化された検出複合体に、 horseradish Peroxidase (HRP) 標識された抗体 （例えば、 HRP標識 F I TC抗体 （Jackson ImmunoRe search Laboratories社製） を添加し、 室温で約 1時間〜 2時間静置し、 F I TC抗体の検出 複合体への結合を促す。 その後、 F I TC抗体溶液を洗浄除去してから、 適切な基質 (例えば、 Substrate Reagent Pack #DY999： R&D SYSTEMS社製） を添加 ·混合する。 約 5〜60分間室温で静置した後、 ストップ溶液 （2N H2S04水溶液）を添加して horseradish Peroxidase (HRP) の反応を停止させ、 反応停止後 30分以内に 45 0 nmの吸光度を測定すればょ 、。
メチル化 D N A抗体の固定化にビォチンを利用しない場合、 ビォチン化検出オリゴ ヌクレオチドを検出又は定量に用いることができる。 ビォチン化された検出オリゴヌ クレオチドを検出又は定量する場合には、 例えば、 HR P標識ストレプトアビジンを 固定化された検出複合体に添加 ·混合し、 ビォチン化検出オリゴヌクレオチドと HR P標織ストレプトアビジンとの結合体を形成 ·分離した後、 公知の方法によ HRP の活性を測定することによりピオチン化メチル化 DN A抗体を検出又は定量できる。 識別機能としては、 酵素サイクル法等の高感度検出法で用いられる基質等を利用す るものであってもよい。 具体的には、 酵素サイクル法で用いられる酵素を結合した抗 体を検出分子として、 検出複合体に結合させれば良い。 尚、 本発明方法において検出 分子に付与される識別機能としては、 上記の記載の方法に限定されるものではない。 「検出分子」 とは、 検出オリゴヌクレオチドを検出又は定量する性質を有していれ ばよい。 また、 検出分子は、 検出オリゴヌクレオチドの検出配列を認識するものであ つても良く、 予め検出オリゴヌクレオチドに結合されていても構わない。 即ち、 検出 分子は、 検出オリゴヌクレオチドに特異的に結合する性質を有し、 且つ、 定量又は検 出のために利用される機能 ·特性である 「識別機能」 を有する力、 或いは識別機能を 付与され得るものであれば良い。 具体的には、 検出分子は、 検出配列がメチルイヒオリ ゴヌクレオチドの場合、 該メチル化ォリゴヌクレオチドに結合して該メチル化ォリゴ ヌクレオチドを検出できるものであれば良く、 該メチル化オリゴヌクレオチドに特異 的に結合して識別機能を示すものであれば良い。 （但し、 固定化メチル化 D NA抗体 と基質交差性を有するメチル化 D N A抗体は用いることができない。 例えば、 固定化 メチル化 D N A抗体がメチルシトシン抗体を使用している場合、 メチルシトシン抗体 を検出分子として利用することはできない） 。 他に例えば、 検出分子はメチルイ匕 D N A抗体であってもよい。 但し、 固定化メチル化 D N A抗体と基質交差性を有するメチ ル化 D NA抗体は用いることができない。 例えば、 固定ィ匕メチルイヒ D N A抗体がメチ ルシトシン抗体を使用している場合、 メチルシトシン抗体を検出分子として利用する ことはできない。 また、 検出配列が検出分子そのものである場合、 検出オリゴヌタレ ォチドを検出するために、 新たな検出分子を添加しなくとも良く、 検出オリゴヌクレ ォチドに組み込まれた検出分子を検出することにより、 該検出オリゴヌクレオチドの 検出が可能になる。 血液、 尿等の生体試料中に含まれる微量物質の検出又は定量する方法として、 免疫 学的測定方法が汎用されている。 該免疫学的測定方法のうち、 クロマトグラフィーを 用いた所謂ィムノクロマト法は操作が簡単であり、 検定に要する時間も短いため、 現 在、 例えば、 病院における臨床検査、 研究室における検定試験等の多くの場面で広く 利用されている。 また、 近年、 標識された D NA (遺伝子） をクロマトストリップ上 で展開し、 目的 D N A (遺伝子） を捕獲できるプローブを用いてハイブリダィゼーシ ヨンすることにより、 目的 D N A (遺伝子） を検出する、 所謂ハイブリッドクロマト 法が利用されるようになってきた。 この方法も操作が簡便であり、 検定に要する時間 も短いため、 現在、 病院における臨床検查、 研究室における検定試験等の場面で広く 利用され始められている。 本発明方法は、 上記のィムノクロマト法とハイブリッドク 口マト法とを混合した方法を概念的に可能としている。 本発明方法では、 複合体形成 及び複合体取得に関して、 その順序は特に限定されないため、 種々の方法が可能であ る。 具体的には例えば、 以下のように実施すれば良い。 方法 1 ：第二工程終了直後の試料に、 識別機能を有する検出オリゴヌクレオチドを添 加し、 目的とする D N A領域を含むメチル化された一本鎖 D N Aと識別機能を有する 検出オリゴヌクレオチドとの結合体を形成させ （この段階で形成された結合体は、 目 的とする D N A領域においてメチル化された D N Aを含む一本鎖 D N Aと検出オリゴ ヌクレオチドとの結合体の他、 目的とする D N A領域においてメチル化された D N A を含まない一本鎖 D NAと検出オリゴヌクレオチドとの結合体を含んでいる。 ） 、 次 いで、 ピオチン化メチル化抗体を添加し、 目的とする D N A領域においてメチル化さ れた D NAを含む一本鎖 D NAと、 識別機能を有する検出オリゴヌクレオチドと、 ビ ォチン化メチル化 D NA抗体とが結合した複合体を形成させる。 得られた試料を、 ク ロマトストリップの導入部に滴下 （導入） すると、 前記複合体が、 展開部を毛細管現 象により移動し、 予めストレプトアビジンで被覆しておいた部分に捕獲される。 その 後、 得られた複合体に含まれる検出オリゴヌクレオチドを、 その識別機能に基づき検 出又は定量することにより、 目的とする D N A領域有する D N Aを検出又は定量でき る。 方法 2 ：第二工程終了直後の試料に、 ピオチン化メチル化 D N A抗体を添加し、 メチ ル化されたシトシンを有するメチル化された一本鎖 D NA (この中には、 目的とする D NA領域を含む一本鎖 D NAと目的以外の一本鎖 D N Aが存在する） とピオチン化 メチル化 D N A抗体との結合体を形成させる （この段階で形成された結合体は、 目的 とする D N A領域においてメチル化された D N Aを含む一本鎖 D N Aとメチル化抗体 との結合体の他、 目的とする D N A領域以外のメチル化された一本鎖 D N Aとメチル 化抗体との結合体を含んでいる。 ) 。 得られた試料を、 クロマトストリップの導入部 に滴下 （導入） すると、 前記結合体が、 展開部を毛細管現象により移動し、 予めスト レプトアビジンで被覆しておいた部分に捕獲される （この段階でも結合体は、 目的と する D N A領域にぉレ、てメチル化された D N Aを含む一本鎖 D N Aとメチル化抗体と の結合体の他、 目的とする DNA領域以外のメチル化された一本鎖 DNAとメチル化 抗体との結合体を含んでいる。 ） 。 その後、 識別機能を有する検出オリゴヌクレオチ ドを導入部に滴下 （導入） すると、 展開部を移動し、 結合体のうち目的とする DNA 領域を含むメチル化された一本鎖 D N Aにのみ結合し、 目的とする DN A領域におレヽ てメチル化された DNAを含む一本鎖 DNAと、 識別機能を有する検出オリゴヌクレ ォチドと、 ピオチン化メチルイ匕 DNA抗体とが結合した複合体を形成する。 得られた 複合体に含まれる検出オリゴヌクレオチドを、 その識別機能に基づき検出又は定量す ることにより、 目的とする DNA镇域有する DN Aを検出又は定量できる。 方法 3 ： ピオチン化メチル化 DN A抗体をクロマトストリップの導入部に滴下 （導入 ) すると、 前記メチル化 DNA抗体が、 展開部を毛細管現象により移動し、 予めスト レプトアビジンで被覆しておいた部分に捕獲される。 次いで、 第二工程終了直後の試 料を導入部に滴下 （導入） すると、 展開部を移動し、 既に捕獲されているメチルイ匕 D NA抗体に、 メチル化されたシトシンを有する一本鎖 DNAが結合体として捕獲され る （この段階で形成された結合体は、 目的とする DNA領域においてメチル化された DN Aを含む一本鎖 DNAとメチル化抗体との結合体の他、 目的とする DN A領域以 外のメチル化された一本鎖 D N Aとメチル化抗体との結合体を含んでいる。 ) その 後、 識別機能を有する検出オリゴヌクレオチドを導入部に滴下 （導入） すると、 展開 部を移動し、 結合体のうち目的とする DN A領域を含むメチル化された一本鎖 D N A にのみ結合し、 目的とする DN A領域においてメチル化された DN Aを含む一本鎖 D NAと、 識別機能を有する検出オリゴヌクレオチドと、 ピオチン化メチル化 DNA抗 体とが結合した検出複合体を形成する。 得られた複合体に含まれる検出オリゴヌクレ ォチドを、 その識別機能に基づき検出又は定量することにより、 目的とする DN A領 域有する DN Aを検出又は定量できる。 方法 4 ： ピオチン化メチルイ匕 D N A抗体をクロマトストリップの導入部に滴下 （導入 ) すると、 前記メチル化 D NA抗体が、 展開部を毛細管現象により移動し、 予めスト レプトアビジンで被覆しておいた部分に捕獲される。 第二工程終了直後の試料に、 識 別機能を有する検出オリゴヌクレオチドを添加し、 目的とする D N A領域を含むメチ ル化された一本鎖 D N Aと識別機能を有する検出オリゴヌクレオチドとの結合体であ る被検 D NA複合体を形成させる。 次いで、 得られた結合体を導入部に滴下 （導入） すると、 展開部を移動し、 既に捕獲されているメチルイヒ D N A抗体に、 結合体のうち 目的とする D N A領域においてメチル化された D N Aを含む一本鎖 D N Aのみが結合 し、 目的とする D NA領域においてメチル化された D NAを含む一本鎖 D NAと、 識 別機能を有する検出ォリゴヌクレオチドと、 ピオチン化メチル化 D N A抗体とが結合 した検出複合体を形成する。 得られた複合体に含まれる検出オリゴヌクレオチドを、 その識別機能に基づき検出又は定量することにより、 目的とする D N A領域有する D N Aを検出又は定量できる。
目的とする D NA領域に複数の検出部位 （それぞれ異なる目的とする D NA領域と 相補的に結合し得る検出オリゴヌクレオチドを用いる） を存在させ、 各目的とする D N A領域を順次検出又は定量することも可能であり、 また、 複数の目的とする D N A 領域と複合体を形成できるように、 ゲノム中の反復配列や重複遺伝子或いは複数の異 なる遺伝子を同時に検出するような、 複数の目的とする D N A領域と相補的に結合し 得る検出オリゴヌクレオチドを用いても、 検出感度を飛躍的に上げることができる。 更に、 1つの目的領域の中でも、 数多くの検出オリゴヌクレオチドを設計し、 それら を支持体側又は検出側で用いても、 検出感度を飛躍的に上げることができる。 検出オリゴヌクレオチド、 ピオチン化メチル化抗体、 目的とする D NA領域におい てメチル化された一本鎖 D N Aの複合体を形成し支持体へ結合させる過程を実施する 方法としては、 前記の方法 1〜方法 4に限定されるものではなく、 免疫抗体法を用い る方法であってもよい。 例えば、 ELISA法では、 クロマトストリップ法と同様の原理 を用いるため、 複合体を形成し支持体へ結合させる過程を方法 1〜 4に記載の順番で 実施することが可能である。 このような本発明方法で使用し得る D N Aメチル化酵素、 検出ォリゴヌクレオチド 、 又は、 メチル化 D NA抗体は、 検出用キットの試薬として有用である。 本発明方法 は、 これら D N Aメチル化酵素、 特定オリゴヌクレオチド、 又は、 メチル化 D NA抗 体等を試薬として含有する検出用キットや、 これら本オリゴヌクレオチド、 又は、 メ チルイヒ D N A抗体等が支持体上に固定ィヒされてなる検出用チップも提供しており、 本 発明方法の権利範囲は、 該方法の実質的な原理を利用してなる前記のような検出用キ ットゃ検出用チップのような形態での使用も含む。 通常、 生検サンプルや食品中に含まれる病原' I·生微生物の有無を検査する場合、 各々 微生物抗原に対して免疫法による検査により、 該病原性微生物の有無を調べたり、 該 病原性微生物を特定したりする。 しかし、 この免疫法に用いる抗体の作製は容易では なく、 更に複数の病原性微生物を検出するためには、 各々の病原性微生物の抗原に対 する抗体を作製する必要がある。 本発明方法を用いることにより、 これら煩雑な抗体 作製を行うことなく病原性微生物に対する簡易な検査が可能となる。 また、 本努明方 法では、 異なる病原性微生物の塩基配列を同時に検查できることから、 一つの検体中 に含まれる数種類の病原'「生微生物を、 同時に検出できるようになる。 具体的には、 Listeria monocytogenes salmonella enterica^ し ampylobacter jejuni subsp. Jejuni ^ Staphylococcus aureus ^ Vibrio parahaemoly t i cus Bacillusu cereus、
Clostridium botulinum、 Yersinia enteroco丄 itica、 Yersinia pseudotuberculosis 、 Clostridium perfringens等の食中毒菌が知られているが、 これらのうち数種類の 食中毒菌を同時に検出する技術は知られていない。 し力 し、 本発明方法を用いること で数種類の食中毒菌の塩基配列を同時に検出することが可能となる。 また、 検出対象 の塩基配歹 IJとして、 CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)領域のように、 ゲノム中に複数見出される塩基配列を特定オリゴヌクレオチ ドにより選択する場合、 一ゲノム中の一遺伝子を検出するよりも高感度での検出が可 能となる。 このような技術は、 感染症の診断や食中毒菌の迅速検出にも有用である。 また、 本発明方法は環境中の微生物のゲノムを検出することにより、 産業上の有用な 菌の同定や土壌、 河川、 湖沼の底質等の微生物群の簡易調査にも用いることができる 。 環境中の微生物のうち、 例えば、 Methanococcus jannaschii^ Methanobacterium thermoautotrophi cum deltaHN Aquifex aeolicus、 Pyrococcus horikoshii 0T3、 Archaeoglobus fulgidus、 Thermotoga maritime MSB8、 Aeropyrum pernix Kl、 Haloferax mediterraneiの生息を確認することが可能となる。 また、 Geobacter sulfurreducensのように工業上利用でき得る細菌や Streptococcus thermophilusのよ うな醱酵に用いられる微生物の検出、 同定も可能となる。 本発明方法における目的とする D NA領域が、 微生物由来の塩基配列である場合、 検体中から抽出したゲノム D N Aまたは D N A断片、 或いは、 検体.中から抽出した R N Aを逆転写酵素により D N Aとした塩基配列を意味する。 従って、 検出オリゴヌク レオチドとの相補的な結合が可能な塩基配列としては、 該微生物に特異的な領域を選 択すればよい。 例えば、 本発明における目的とする D N A領域が微生物の塩基配列で ある場合、 目的とする D NA領域を検体中から選択的に抽出するためには、 微生物ゲ ノム D NA、 或いは、 検体中から抽出した R NAを逆転写酵素により D NA等の塩基 配列のうち、 目的とする D N A領域近傍にある微生物特有の塩基配列を特定オリゴヌ クレオチドと特異的に結合する塩基配列とすればよい。 例えば、 微生物中のゲノムを検出するための目的とする D NA領域と検出オリゴヌ クレオチドが相補的に結合する領域としては、 具体的には Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体 VIIの塩基番号 271743 - 272083に相当する領域 （配 列番号 2 9 ) 、 Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体 VIIの塩基 番号 384569- 384685 (配列番号 3 4 ) のように遺伝子をコードしなレ、塩基配列でもよ レ、。 また、 種々の病原性微生物に共通する特徴的な遺伝子の病原性微生物で保存され た塩基配列を検出対象とすることは、 複数の病原性微生物を同時に検出する方法を提 供し得るものであるため有用である。 具体的には、 mce- family遺伝子 （
Micobacterium tuberculosis; . 13番染色体上の tRNA— Tyr塩基 Θ己歹!】 (Cryptococcus neoformans) 、 chitin synthase activator (Chs3)は、 Aspergillus fumigatus及び Neosartorya属に特有の塩基配列を有することから、 ヒ トの痰、 肺の生検サンプル中 から抽出した D N A中にこれら微生物由来の D N Aが含まれるか否かを検定すること で微生物による感染症の検定に用いることができる。 また、 actA (Listeria monocytogenes) 、 pyrG (Nし： 002163、 Campylobacter jejuni subsp. jejuni) などは 食中毒菌に特有共通した遺伝子であることから、 これらの遺伝子は食中毒における微 生物検定に用いることができる。 また、 thrAは、 Salmonella enterica、 Yersinia enterocolitica, Escherichia coliで保存された酉己歹 ljを有しており、 一つの遺伝子で 複数の微生物を検出することも可能である。 データベース上で公開されている塩基配列のうち、 微生物特有の塩基配列を検索し
、 微生物特有の塩基配列を探索することができる。 例えば、 P u b M e d等の公開デ ータベース上にある塩基配列であれば、 通常の手続きにより取得することが可能であ り、 取得した塩基配列は、 通常の手続きによる B 1 a s t検索をかけることにより、 特有の塩基配列であるか否かを検討することができる。 尚、 特有の塩基配列とは、 検 出対象の塩基配列が検出対象となる微生物のゲノム塩基配列以外の生物由来の塩基配 列と相同性を示す塩基配列を有さないことを意味する。
特に、 検体がヒ ト生検サンプルである場合、 ヒ ト遺伝子と相補的な結合をしない特 定オリゴヌクレオチドを設計することは重要である。 また、 同様に、 検体が食品であ る場合、 食品に含まれる検出対象以外の生物由来の塩基配列と相補的な結合をしない 特定ォリゴヌクレオチドを設計することは重要である。 血液中の遊離 D N Aを検出するためには、 遊離 D N Aの量と相関する領域であれば 何でもよく、 遊離 D NAの定量又は検出を目的とする場合、 ゲノム中の同じ配列が、 特に数回以上、 反復して見られる、 いわゆる反復配列が望ましく、 単純反復配列 （縦 列反復配列、 或いは、 タンデムリピートと呼ばれる） や、 散在反復配列であれば、 更 にょい。 単純反復配列は、 同じ配列が同じ向きに隣り合って存在することを特徴とし、 サテ ライト DNA、 ミニサテライト、 マイクロサテライト、 セントロメァ、 テロメァ、 動 原体、 リポソーム集団遺伝子のような一連の塩基配列などが知られている。 散在反復配列は、 同じ配列が隣り合わず散在することを特徴とし、 レトロ トランス ポゾンに由来する DN Aと考えられている。 散在反復配列は、 塩基配列の長さにより 、 S I NE (Short Interspersed Repetitive Element：短鎖散在反復配列） と L I NE (Long Interspersed Elements：長鎖散在反復配列） に分類され、 ヒトの塩基配 列としては、 各々、 A 1 u配列や L I NE_ 1配列が代表的な反復配列として知られ ている。 また、 RNAやタンパク質から逆転移した不活性なプロセッシング済みの偽 遺伝子、 遺伝子重複により増幅した遺伝子配列も知られている。 重複遺伝子とは、 一つのゲノム上に複数の高い相同性を有する遺伝子が存在する場 合を指し、 多くの場合は、 一遺伝子の近傍にタンデムに並んで存在する塩基配列であ る。 尚、 偽遺伝子も重複遺伝子の一つである事が多い。 反復配列の具体的な例としては、 例えば、 比較的短い塩基配列からなる繰り返しと しては、 （A)n、 （T)n、 （GA)n、 （CA)n、 （TAA)n、 （GGA)n、 （CAGC)n、 （CATA)n、 (GAAA)n 、 （TATG)n、 （TTTG)n、 （TTTA)n、 （TTTC)n、 (TAAA)n, (TTCA)n、 （TATAA)n、 （TCTCC)n、 (TTTCC)n、 （TTTAA)n、 （TTTTC)n、 （TTTTA)n、 （TTTTG)n、 （CMAA)n、 （CACCC)n、
(TATATG)n、 (CATATA)n, (TCTCTG)n、 （AGGGGG)n、 （CCCCCA)n、 (TGGGGG)n (nは繰返し 数を意味する） 等の配列が知られており、 転写因子に由来する配列としては、 MTグ ループとして、 MER1 -Charlie, Zaphodが該当し、 Tc - 1グループとして、 MER2 - Tigger 、 Tc- 1、 Marinerが該当する。 その他、 具体的には、 Tiggerl、 Tigger2a、 Tigger5、 Charlie4a、 Charlie7等が知られている。 これらの配列は、 一般的に短く且つ単純な 塩基配列であり、 後述の特定接着配列及び検出用接着配列を設定することは難しいが 、 本発明方法における、 後述の特定接着配列及ぴ検出用接着配列の設定対象と設定可 能な配列を有していれば、 本発明方法にも利用可能であることから、 必ずしも、 本発 明方法の対象として排除するものではない。 また、 サテライト D NA、 ミニサテライ ト、 マイクロサテライトなどは、 単純反復配列に分類される反復配列である。
また、 遺伝子中に多コピー存在する配列としては、 セントロメァに存在する配列と して ALR6、 snRNAとして U2や U6、 その他、 tRNAや rR Aのように一般的にゲノム中に多 コピー存在することが知られている遺伝子の他、 遺伝子重複によりゲノム中に複数コ ピー存在する遺伝子等を挙げることができる。 更に、 レトロウイルス、 末端に LTR (Lomg terminal repeat) を有するレトロトラ ンス; ^ゾン、 MaLRs (Mammalian apparent LTR-Retrotransposons) のよつな、 ゥづノレ ス由来と考えられる内在配列や、 レトロウイルス由来の LTRについても、 一ゲノム中 に複数存在することが知られている。
例えば、 レトロトウィルス由来の LTRとしては、 具体的には、 LTR1、 LTR1B、 LTR5、 LTR7、 LTR8、 LTR16A1、 LTR16A1、 LTR16C、 LTR26、 LTR26E, MER48、 MLT2CB等のサブフ アミリーが知られている。 また、 レトロトランスポゾン由来の LTRは、 ERV、 ERVK、 ERVLの各クラスに分類され、 具体的には、 LTR8A、 LTR28、 MER21B, MER83、 MER31B、 MER49、 MER66B、 HERVH、 ERVL, LTR16A1、 LTR33A、 LTR50、 LTR52、 MLT2A1、 MLT2E 、 MER11C、 MER11C等のサブファミリーを拳げることができる。 更に、 M a L R sは、 典 型的なレトロトランスポゾンと同様にその配列の両端に LTRを含むが、 LTRにはさまれ た内部配列がレトロウイルス由来ではない配列の D NA因子を指す。 例えば、 MLT1A1 、 MLT1A2、 MLT1B、 MLT1C、 MLT1D 、 MLT1F、 MLT1G 、 MLT1H、 MLT1J 、 MLT1K 、 MLT1I 、 MLT2CB 、 MSTA、 MSTA- int、 MSTB 、 THE1A、 THE1B、 THE1B- internal, THE1等のサブ フアミリーを挙げることができる。 散在反復配列は、 同じ配列が隣り合わず散在することを特徴としており、 レトロト ランスポゾンに由来すると考えられている。 また、 散在反復配列は、 その長さにより 、 S I N E (Short Interspersed Repetitive Element：短鎖散在反復配列） と L I N E (Long Interspersed Elements：長鎖散在反復配列） に分類される。 S I N Eの うち、 大部分は A 1 uファミリーに属する配列である。 特 1¾としては、 7 S L R N Aの 3， 側の配列或いは 5， 側の配列を有し、 尚且つ Left- monomerと Right- monomer と呼ばれる領域にはさまれた A T— R i c h領域を有している。 A 1 uファミリーの サブファミリ一としては、 Alu、 Alujb、 AluJo、 AluSc、 AluSg、 AluSp、 AluSq、 AluSx 、 AluYを、 更には、 F AM (Fossil Alu Monomer) と、 F AMの配列を有する F L A M (Free Left Alu Monomer) t F R AM (Free Right Alu Monomer) を挙げること ができる。 A 1 uフアミリー以外の S I N Eとしては、 M I R、 及び T h e r /M I R 3が知られており、 夫々、 サブファミリ一として、 MIR、 MIR3が知られている。 そ のほか、 他の生物種の A 1 uファミリーのサブファミリ一としては、 Bl、 B2、 B4、 PB1、 PB1D等が知られている。 L I N Eとしては、 LINE1から Line23のサブファミリー が報告されているが、 LINE - 1、 LINE2, LINE3が広くゲノム中に存在することが知られ ている。 尚、 LINE- 1については、 例えば、 L1M1、 L皿、 L1M3、 LlM3d、 L1M4、 LlM4c、 L1MA2、 L1MA7、 L1MA8、 L1MA9、 L1MB1、 L1MB1、 L1MB3、 L1MB4、 L1MB5、 L1MB6、 L1MB7 、 LlMCa、 LlMCb、 L1MC2、 L1MC3、 L1MC4、 LlMC4a、 L1MC5、 LlMDa、 LIME, LlMEc、 LlMEd、 LlMEg、 L1ME1、 L1ME2、 L1ME3、 L1ME3A、 L1ME3B、 LlME4a、 L1PB3、 L1P4、 L1PA2、 L1PA3、 L1PA4、 L1PA5、 L1PA6、 L1PA7、 L1PA10、 L1PA12、 L1PA13、 L1PA14、 L1PA16、 L1PB1、 L1PB3、 L1PB4、 L1PREC2、 HAL1のサブファミリーが知られており、 LINE - 2としては、 L2、 L2cのサブファミリーが知られている。 なお例えば、 Aluフアミ リ一又は Aluのサブフアミリ一に共通の配列、 LINE- 1フアミリ一或いは LINE- 1のサブ ファミリ一に共通の配列に対して、 後述の特定接着配列及び検出用接着配列を設定で きれば、 一ゲノム中に複数の検出対象を設定することができるため、 ゲノムの検出を より高感度にすることができる。 目的とする D N A領域としては、 具体的に例えば L I N E— 1の部分配列 （配列番 号 3 7 ) や A l uの部分配列 （配列番号 3 9に示す塩基配列） 又はそれらの相同性を 示す塩基配列等を挙げることができる。 例えばある領域中の反復配列を調べたレ、場合、 PubMed等の一般的な配列検索のデー タベースで検索することは難しく、 通常は、 Repbase ( http : //www. girinst. ors/repbase/) 、 RepeatMasker (
http：〃 www. repeatmasker. org/) 等のデータベースを用いればよい。 本発明方法の特 定接着配列及び検出用接着配列を設定できれば、 検出感度を上げることができる。 更 に、 これらの反復配列を測定することは、 例えば、 血液中の遊離 D N A量のサロゲ一 トマ一力一として扱うことが可能であり、 生物種特異的な反復配列に注目する場合は 、 生物種の特定等に利用することができる。 本発明方法において、 反復配列を測定すれば、 一ゲノム中に複数存在する塩基配列 を同時に測定することになる。 例えば配列番号 3 7で示される塩基配列と 8 0 %以上 の配列同一性を有する塩基配列は、 ヒトゲノム中に約 2 8 0コピーあり、 配列番号 3 9で示される塩基配列と 8 0 %以上の相同性を有する塩基配列は、 ヒトゲノム中に約 8 2 0コピーある。 従って、 夫々の塩基配列中に検出用接着配列と特定接着配列を設 定できれば、 1ゲノムの中に一種類しかない配列に対して検出用接着配列と特定接着 配列を設定する場合に比べると、 1ゲノムの検出感度を、 理論上で 2 8 0〜8 2 0倍 上げることが可能となる。
「重複遺伝子」 とは、 遺伝子重複により、 ゲノム中の特定の遺伝子或いは遺伝子断 片が倍加することにより生じた遺伝子或いは遺伝子断片である。 遺伝子重複とは、 遺 伝子を含む DNAのある領域が重複する現象のことである。 遺伝子重複が起こる原因と しては、 遺伝的組換えの異常、 レトロトランスポゾンの転移、 染色体全体の重複など がある。 例えば、 1つの遺伝子がコピーされてゲノム D N Aに揷入されることを意味 し、 異なる染色体位置へ挿入される場合と、 元の遺伝子の近傍に揷入される場合があ る。 元の遺伝子の近傍への揷入により、 コピーされた遺伝子が並んでいる場所をタン デムリピートと呼び、 遺伝子重複によって作り出された遺伝子のグループを遺伝子族 (或いは遺伝子ファミリー）と呼ぶ。
「偽遺伝子」 とは、 D NAの配列のうち、 遺伝子産物 （特にタンパク質） をコード していたことを想像させるような特徴のある塩基配列を有しているが、 現在は機能を 失っている遺伝子をいう。 元の機能を有する配列に突然変異が生じた結果生まれたと 考えられている。 例えば、 突然変異によりストップコドンが生じてタンパク質のぺプ チド鎖が短くなってしまいタンパク質として機能を果たせなくなる場合や、 一塩基置 換等の突然変異により正常な転写に必要な調節配列が機能を失う場合などがある。 偽 遺伝子は元の正常な遺伝子が別に残っている場合が多いが、 単独で偽遺伝子になるも のもある。
偽遺伝子は、 遺伝子配列の特徴により 3タイプに分類できる。 m R N Aからレトロ トランスポゾンの逆転写酵素によって作られた D N Aがゲノムに揷入される場合 (プ 口セス型偽遺伝子） 、 ゲノム内で元の遺伝子配列が重複し、 そのコピーのうち一部が 突然変異等により機能を喪失して偽遺伝子になる場合 （重複偽遺伝子または非プロセ ス型偽遺伝子） 、 及び、 ゲノム内の遺伝子が、 （重複遺伝子がなく単独の遺伝子のま ま） 機能を失うことにより偽遺伝子になる場合がある。
尚、 現在、 偽遺伝子として知られる遺伝子の中には、 転写されている例や、 遺伝子 機能を有する例 （偽遺伝子と呼ぶべきかどうかは定まっていない） も知られるように なっていることから、 本発明方法における、 「偽遺伝子」 とは、 遺伝子機能の有無、 転写されるか否かではなく、 前記の 「プロセス型偽遺伝子」 と 「重複偽遺伝子 （非プ 口セス型偽遺伝子） 」 を意味するものとする。 目的とする D N A領域を有する D N Aがゲノム中の反復配列である場合には、 反復 配列が相同性を有する一群の塩基配列であることから、 目的とする D N A領域を有す る D N Aと検出用接着配列の相補的な塩基対合は、 塩基配列のすべてが目的とする D N A領域を有する D N Aと塩基対合しない場合が発生する可能性がある。 具体的には 、 L I N E配列として、 配列番号 3 7に対しては、 8 0 %以上の相同性を有する塩基 配列はゲノム中に約 2 8 0コピーあり、 S I N E (A 1 u ) 配列として、 配列番号 3 9に対しては、 8 0 %以上の相同性を有する塩基配列は、 ゲノム中に約 8 2 0コピー が見出される。 し力、し、 これらのゲノム中に見出される相同性を有する塩基配列は、 配列番号 3 7及び配列番号 3 9に対して、 一塩基から数塩基異なるものが含まれてい る。 本発明方法の第一工程において、 高濃度のナトリゥム塩が存在する系により検体か ら D N Aを抽出することが好ましい。 具体的には、 本発明方法の第一工程において検 体中から D N Aを取得するための D N A抽出操作にぉレ、て用いられる溶液 （例えば、 緩衝液） 中のナトリウム塩の濃度としては、 少なくとも 5 0 mM以上、 好ましくは 1 0 0 mM以上を挙げることができる。 より具体的には、 5 0 mM以上 1 0 0 0 mM以 下、 好ましくは 1 0 0 mM以上 1 0 0 0 mM以下、 より好ましくは 1 0 0 mM以上 2 0 O mM以下が挙げられる。 また、 ナトリウムイオンを含む塩であれば、 N a C l、 N a C 0 3、 N a 2 S〇4等を含むどのような塩でも構わないが、 好ましくは、 N a C 1を挙げることができる。 本発明は、 癌患者由来の検体を選抜する方法であり、 発明 1〜 1 3のいずれか一項 に記載の方法により被験者由来の検体を用いて定量又は検出された D N Aの定量結果 または検出結果と、 同方法により健常者由来の検体を用いて定量又は検出された D N Aの定量結果または検出結果との差異が有意であれば、 被験者由来の検体を癌患者由 来の検体として評価し、 当該評価の結果に基づき癌患者由来の検体を特定する工程を 含む方法を含む。 当該発明の好ましい態様としては、 検体が哺乳動物由来の血清であ る発明、 また更に、 目的とする D NA領域を有する D NAが哺乳動物由来の血清中の 目的とする D N A領域を有する遊離 D N Aである発明を挙げることができる。 これら 発明を利用すれば、 血液検査により、 癌患者を簡便に特定することが可能となろう。 ここで、 「癌患者」 とは、 癌を発症した被験者を意味しており癌としては、 肺癌 （ 非小細胞肺癌、 小細胞肺癌） 、 食道癌、 胃癌、 十二指腸癌、 大腸癌、 直腸癌、 肝癌 ( 肝細胞癌、 胆管細胞癌） 、 胆嚢癌、 胆管癌、 膝癌、 結腸癌、 肛門癌、 乳癌、 子宮頸癌 、 子宮癌、 卵巣癌、 外陰癌、 膣癌、 前立腺癌、 腎臓癌、 尿管癌、 膀胱癌、 前立腺癌、 陰茎癌、 精巣 （睾丸） 癌、 上顎癌、 舌癌、 （上、 中、 下） 咽頭癌、 喉頭癌、 急性骨髄 性白血病、 慢性骨髄性白血病、 急性リンパ性白血病 、 慢性リンパ性白血病、 悪性リ ンパ B重、 骨髄異形成症候群、 甲状腺癌、 脳腫瘍、 骨肉腫、 皮膚癌 （基底細胞癌、 有棘 細胞癌） 等の、 ヒトおよび哺乳類の臓器で発症する固形癌と、 ヒトおよび哺乳類の血 液で発症する非固形癌のいずれの癌も含むことを意味する。 実施例
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、 本発明はこれらに限定されるもの ではない。 ，
実施例 1
市販のメチルシトシン抗体 （Aviva Systems Biology社製） を、 市販ビォチン化キ ット （Biotin Labeling Kit- H2、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載さ れた方法に準じて、 ピオチン標識した。 得られたピオチン標識メチルシトシン抗体を 0. 25 μ g/ Z L 0. 1% BSA含有リン酸バッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) 溶液として冷蔵保存した。
合成して得られたビォチン標識メチルシトシン抗体の 0. 5 μ g/mLO. 1% BSA含有リン 酸バッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) 溶液を調製し、 これを各 1 0 0 の割合でストレプトアビジン被覆済み 8ウェルストリップ （
Perkin Elmer社製） に添加し、 約 1時間室温で放置してゥエルに固定化した。 その後 、 溶液をピペッティングにより取り除き、 2 0 0 i Lの洗浄バッファー [0. 05% Tween20含有リン酸バッファー （ImM K P0い 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) ]を添加した後、 該パッファーをデカンテーシヨンにより取り除いた。 この操作を更 に 2回繰り返した （以上、 本発明方法で使用する固定化メチルイヒ D N A抗体の調製に 相当する） 。
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノム D N Aについて、 以下の配列番 号 1 7及ぴ配列番号 1 8で示される P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプ ライマー （？ 1及ぴ？1^ 1 ) 及び反応条件を用いて P C Rを行うことにより、 供試 サンプルとして用いられる D NAフラグメント （X、 配列番号 1 9、 Genbank
Accession No. NT— 029419等に示される塩基番号 25687390- 25687775に相当する領域） を増幅した。 く P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
PF1： 5， - CTCAGCACCCAGGCGGCC -3' (配列番号 1 7)
PR1： 5' - CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3' (配列番号 18) く DNAフラグメント〉
X： 5' -
Figure imgf000054_0001
GGCCAG -3' (配列番号 1 9)
PCRの反応液としては、 铸型とするゲノム DNAを 10n gと、 5μΜの上記プラ イマ一溶液各 3 1 と、 each 2 mM dNTPを 5 μ1と、 10 X緩衝液（ΙΟΟπιΜ
Tris-HCl pH 8.3、 500mM KC1、 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 1 と、 而熱性 D N Aポリメラーゼ （AmpliTaq Gold) 5U// 1を 0. 25 μ 1とを混合し、 これに滅菌 超純水を加えて液量を 50 μ 1 としたものを用いた。 該反応液を、 95°Cにて 10分 間保温した後、 95°Cにて 30秒間次いで 61。Cにて 30秒間更に 72°Cにて 45秒 間を 1サイクルとする保温を 40サイクル行う条件で P C Rを行つた。
PCRを行った後、 2%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、 Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） により、 DNAフラグメント Xを精製した。
DNAフラグメント Xについて、 以下の溶液を夫々 2連で調製した。
溶液 A： DNAフラ ' X 10ng/10 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 Β ： DNAフラ 、 ト X lng/10 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 C ： DNAフラ i 0. lng/10 μΐ Τ Εバッファ 溶液
溶液 D ： T Eバッファ一溶液 （ネガテイブコント口ール液） 得られた夫々の溶液を 10μ Lと、 Sssl methylase (NEB社製）を 0. 5 1と、 1 0 NEBuffer2 (NEB社製）を 5 μ1と、 3.2 S-adenosyl methionine (NEB社製）を 0. 5 μ 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 5 0 1としたものを調製した 。 該反応液を、 37°Cにて 30分間インキュベーションした（以上、 本発明方法の第一 工程に相当する）。
配列番号 20で示される目的とする DNA領域からなるオリゴヌクレオチド X' に 相補性により結合可能な配列番号 2 1で示される塩基配列からなる 5 ' 末端 F I TC 標識オリゴヌクレオチド F 1を合成し、 0.02 μ Μの Tris-HClバッファー (10 ηιΜ) 溶液を調製した。
<目的とする DNA領域からなるオリゴヌクレオチド>
X' ： 5，
Figure imgf000055_0001
GGCCAG -3' (配列番号 20)
< 5， 末端 F I T C標識オリゴヌクレオチド>
F 1 : 5， - CTGGCCAAACTGGAGAT -3' (配列番号 2 1) 得られた夫々の反応液について、 以下の処理を施した。
PCRチューブに、 前記で調製した反応液 40 ^uLと、 前記の 5， 末端 F I TC標 識オリゴヌクレオチド溶液 1 0 しと、 緩衝液 （330raM Tris-Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAcい 5mM Dithiothreitol) を 1 0 /i Lと、 1 00 mM MgCl2溶液 1 0 JLILと、 1 mg/mL BSA溶液 1 0 を添加し、 更に該混合物に滅菌超純水を加えて液 量を 1 0 0 /i Lとし、 混合した。 その後、 本 P C Rチューブを 9 5 °Cで 1 0分間加熱 し、 7 0°Cまで速やかに冷却し、 その温度で 1 0分間保温した。 次いで、 5 0°Cまで 冷却し 1 0分間保温し、 更に 3 7°Cで 1 0分間保温した後、 室温に戻し、 5 ' 末端 F I TC標識オリゴヌクレオチドと DN Aフラグメントとの結合体の形成を促した（以 上、 本発明方法の第二工程に相当する）。
前記のビォチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトァビジン被覆済 み 8ゥヱルストリップに、 前記で調製した DN Aフラグメントの反応液 1 0 を 加え、 室温で 1時間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 2 0 0 μ L·の洗净バッファー [0.05% Tween20含有リン酸パッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 -154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 該バッファーをピペッティングに より取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した （以上、 本発明方法の第三工程に相 当する） 。
その後、 ^！！^？標識 I TC抗体溶液 [Jackson ImmunoResearch Laboratories社製 、
Figure imgf000056_0001
0.1% BSA含有リン酸バッファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 7H20 、 154mM NaCl pH7.4) 溶液]を各ゥエルに 1 0 0 μ Lの割合で添加後、 1時間室温で放 置した。 放置後、 各ゥヱルを 20 0 Lの洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸 バッファー （ImM K P04、 3raM Na2HP0 7H20, 154raM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 該 バッファーをデカンテーションにより取り除いた。 この操作を更に 2回操り返した。 基質 （R&D社製、 #DY999) を、 各ゥエルに 1 0 0 Lの割合で添加 '混合し、 反応を 開始した。 約 1 5分間室温で放置し、 ストツプ溶液 （2N S04水溶液）を各ゥヱルに 5 0 の割合で添加し、 反応を停止した。 反応停止後 3 0分以内に 4 5 0 rnnの吸光 度を測定した。 （以上、 本発明方法の第四工程に相当する） その結果を図 1に示した 。 溶液 A、 溶液 B、 及び溶液 Cでは、 溶液 Dに比べて吸光度の増加がみられた。 また その強度は DN Aフラグメントの濃度に依存して増加した。 本実験において、 メチル シトシン抗体と、 メチル化された DNAフラグメントと、 固定ィヒした 5 ' 末端ビォチ ン標識ォリゴヌクレオチドとの複合体を形成 ·選択し、 複合体中の F I T Cを、 その 機能により定量.検出することにより、 D N Aフラグメントの検出 ·定量が可能であ ることが明らかとなった。 実施例 2
市販のメチルシトシン抗体 （Aviva Systems Biology社製） を、 市販ピオチン化キ ット （Biotin Labeling Kit-NH2、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記载さ れた方法に準じて、 ピオチン標識した。 得られたピオチン標識メチルシトシン抗体を 0.25Aig/ iL 0.1% BSA含有リン酸バッファー （ImM KH2P0い 3raM Na2HP07H20、 154mM NaCl pH7.4) 溶液として冷蔵保存した。
合成して得られたピオチン標識メチルシトシン抗体の 0.5 g/mLO.1% BSA含有リン 酸バッファー （lmM KH2P04、 3mM Na2HP07H20、 154mM NaCl pH7.4) 溶液を調製し、 これを各 100 zLの割合でストレプトアビジン被覆済み 8ウエノレストリップ （
Perkin Elmer社製） に添加し、 約 1時間室温で放置してゥエルに固定化した。 その後 、 溶液をピペッティングにより取り除き、 200 μ Lの洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファー （lmM KH2P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7.4) 〕を添カ卩した後、 該バッファーをデカンテーシヨンにより取り除いた。 この操作を更 に 2回繰り返した （以上、 本発明方法で使用する固定化メチル化 DN A抗体の調製に 相当する） 。
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノム D N Aについて、'以下の配列番 号 1 7及ぴ配列番号 1 '8で示される PC Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプ ライマ一 （卩 1及び？1 1) 及び反 条件を用いて PCRを行うことにより、 供試 サンプルとして用いられる DNAフラグメント （X、 配列番号 19、 Genbank
Accession No. NT_029419等に示される塩基番号 25687390- 25687775に相当する領域） を増幅した。 く PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー >
PF 1 ： 5， - CTCAGCACCCAGGCGGCC _3， （配列番号 1 7)
PR 1 : 5， - CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3' (配列番号 18) く DNAフラグメント > X： 5， 一
Figure imgf000058_0001
GGCCAG -3' (配列番号 1 9)
PCRの反応液としては、 錄型とするゲノム DNAを 10n gと、 の上記プラ ィマー溶液各 3 1 と、 each 2 mM dNTPを 5 μ1と、 10 X緩衝液（lOOmM
Tris-HCl pH 8.3、 500raM KC1、 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 1 と、 耐熱性 D NAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold) 51]/μ1を 0. 25 μ 1 とを混合し、 これに滅菌 超純水を加えて液量を 50 μ 1 としたものを用いた。 該反応液を、 95°Cにて 10分 間保温した後、 95°Cにて 30秒間次いで 61°Cにて 30秒間更に 72°Cにて 45秒 間を 1サイクルとする保温を 40サイクル行う条件で P C Rを行った。
PCRを行った後、 2%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、 Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） により、 DNAフラグメント Xを精製した。
DNAフラグメント Xについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 A： DNAフラ ト X 10ng/10 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 Β ： DNAフラク"メント X lng/10 μΐ Τ Εバッファ一溶液 '
溶液 C ： DNAフラタ'メント X 0. lng/10 TEバッファー溶液
溶液 D： T Eバッファ一溶液 （ネガティブコント口ール液） またクロンテック社より購入されたヒ ト血液由来ゲノム DNAについて、 以下の配 列番号 22及び配列番号 23で示される PCRのために設計されたォリゴヌクレオチ ドプライマ一 （PF 2及ぴ PR 2) 及ぴ反応条件を用いて PCRを行うことにより、 供試サンプルとして用いられる DNAフラグメント （Y、 配列番号 24、 Genbank Accession No. AC009800等に示される塩基番号 76606- 76726に相当する領域） を増幅 した。
< P CRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 >
P F 2 : 5' - TGAGCTCCGTAGGGCGTCC -3' (配列番号 22)
PR 2 ： 5' - GCGCCGGGTCCGGGCCC -3' (配列番号 23) ぐ DNAフラグメント >
Y： 5' -
GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCA GGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA - 3' (配列番号 24)
PCRの反応液としては、 铸型とするゲノム DNAを 10n gと、 5 Μの上記プラ イマ一溶液各 3 At 1と、 each 2 mM dNTPを 5 μ1と、 10 X緩衝液（lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KC1、 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 1と、 而熱性 D NAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold) 5υ/μ1を 0. 25 z lとを混合し、 これに滅菌 超純水を加えて液量を 50 μ 1としたものを用いた。 該反応液を、 95°Cにて 10分 間保温した後、 95 °Cにて 30秒間次いで 60 °Cにて 30秒間更に 72 °Cにて 45秒 間を 1サイクルとする保温を 50サイクル行う条件で PCRを行つた。
PCRを行った後、 2%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、 Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） により、 DNAフラグメント Yを精製した。
DNAフラグメント Υについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 A： DNAフラ 、メント Y 10ng/10 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 Β ： DNAフラタ'、メント Y lng/10 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 C ： DNAフラタ'、メント Υ 0. lng/10 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 D： Τ Εバッファ一溶液 （ネガティブコント口ール液) 前記に調製した DNAフラグメント Xの溶液 Aと DNAフラグメント Yの溶液 Aを 、 DNAフラグメント Xの溶液 Bと DNAフラグメント Yの溶液 Bを、 DNAフラグ メント Xの溶液 Cと DNAフラグメント Yの溶液 Cを、 DNAフラグメント Xの溶液 Dと DNAフラグメント Yの溶液 Dを、 夫々混合し、 以下に示す DN Aフラグメント 混合溶液 MA〜MDを夫々 2連で調製した。
溶液 M A： 10ng/20 ^ L T Eバッファ一溶液
溶液 M B ： lng/20 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 M C ： 0. lng/20 ΐ ΤΕバッファ一溶液
溶液 MD ·· Τ Εバッファ一溶液 （ネガテイブコント口ール液） 得られた夫々の溶液を 20 Lと、 Sssl raethylase (NEB社製）を 0. 5 μ 1 と、 1 0 NEBuffer2 (NEB社製）を 5 μΐと、 3· 2 mM S— adenosyl methionine (NEB社製）を 0 . 5 u I とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 μ 1 としたものを調製し た。 該反応液を、 37°Cにて 30分間インキュベーションした（以上、 本発明方法の第 一工程に相当する）。
配列番号 20で示される目的とする DN A領域からなるオリゴヌクレオチド X' に 相補性により結合可能な配列番号 21で示される塩基配列からなる 5 ' 末端 F I T C 標識オリゴヌクレオチド F 1を合成し、 0.02 I Mの Tris- HC1バッファー (10 mM) 溶液を調製した。 く目的とする DN A領域からなるオリゴヌクレオチド〉
X， ： 5,
Figure imgf000060_0001
GGCCAG -3' (配列番号 20) く 5， 末端 F I TC標識オリゴヌクレオチド〉
F 1 ： 5' - CTGGCCAAACTGGAGAT -3' (配列番号 2 1) 得られた夫々の反応液について、 以下の処理を施した。
P CRチューブに、 前記で調製した反応液 40 しと、 前記の 5， 末端 F I TC標 識オリゴヌクレオチド溶液 1 0 と、 緩衝液 (330mM Tris- Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithiothreitol) を l O z Lと、 1 0 0 mM MgCl2溶液 1
0 / Lと、 1 mg/mL BSA溶液 1 0 /_iLを添加し、 更に該混合物に滅菌超純水を加えて液 量を 1 00 Lとし、 混合した。 その後、 本 P C Rチューブを 9 5 °Cで 1 0分間加熱 し、 7 0°Cまで速やかに冷却し、 その温度で 1 0分間保温した。 次いで、 5 0でまで 冷却し 1 0分間保温し、 更に 3 7 °Cで 1 0分間保温した後、 室温に戻し、 5 ' 末端 F
1 T C標識ォリゴヌクレオチドと D N Aフラグメントとの結合体の形成を促した (以 上、 本発明方法の第二工程に相当する）。 前記のピオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトァビジン被覆済 み 8ウェルストリップに、 前記で調製した DNAフラグメントの反応液 1 00 juLを 加え、 室温で 1時間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 2 0 0 μ L·の洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファー （lmM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 該バッファーをピペッティングに より取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した （以上、 本発明方法の第三工程に相 当する） 。
その後、 HRP標識 F I TC抗体溶液 [Jackson ImmunoResearch Laboratories社製 、 0.005 g/100 iL 0.1% BSA含有リン酸バッファー (ImM K P04、 3raM Na2HP0 7H20 、 154mM NaCl pH7.4) 溶液]を各ゥヱルに 1 0 0 Lの割合で添加後、 1時間室温で放 置した。 放置後、 各ゥエルを 2 00 μ Lの洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸 バッファー (ImM KH2P0,い 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 該 バッファーをデカンテーションにより取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した。 基質 （R&D社製、 #DY999) を、 各ゥエルに 1 0 0 z Lの割合で添加 '混合し、 反応を 開台した。
約 3 0分間室温で放置し、 ストツプ溶液 （2Ν H2 S04水溶液）を各ゥエルに 5 0 しの 割合で添加し、 反応を停止した。 反応停止後 3 0分以内に 4 5 O nmの吸光度を測定し た。 （以上、 本発明方法の第四工程に相当する） その結果を図 2に示した。 溶液 MA、 溶液 MB、 及び溶液 MCでは、 溶液 MDに比 ベて吸光度の増加がみられた。 またその強度は D N Aフラグメントの濃度に依存して 増加した。
本実験において、 メチルシトシン抗体と、 メチルイヒされた D N Aフラグメントと、 固定ィ匕した 5 ' 末端ビォチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成'選択し、 複 合体中の F I T Cを、 その機能により定量 ·検出することにより、 D N Aフラグメン トの検出 ·定量が可能であることが明らかとなった。 実施例 3
市販のメチルシトシン抗体 (Aviva Systems Biology社製) を、 巿販ビォチン化キ ット （Biotin Labeling Kit - NH2、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載さ れた方法に準じて、 ビォチン標識した。 得られたビォチン標識メチルシトシン抗体を 0. 25 μ §/ μ Ι 0. 1% BSA含有リン酸バッファー （ImM K P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) 溶液として冷蔵保存した。
合成して得られたビォチン標識メチルシトシン抗体の 0. 5 I g/mL0. 1% BSA含有リン 酸バッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) 溶液を調製し、 これを各 1 0 0 μ Lの割合でストレプトァビジン被覆済み 8ウェルストリップ （ Perkin Elmer社製） に添加し、 約 1時間室温で放置してゥエルに固定ィ匕した。 その後 、 溶液をピペッティングにより取り除き、 2 0 0 Lの洗浄バッファー [0. 05%
Tween20含有リン酸バッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) ]を添加した後、 該バッファーをデカンテーシヨンにより取り除いた。 この操作を更 に 2回繰り返した （以上、 本発明方法で使用する固定化メチル化 D N A抗体の調製に 相当する） 。
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノム DNAについて、 以下の配列番 号 17及ぴ配列番号 18で示される PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプ ライマー （PF 1及び PR 1) 及び反応条件を用いて PCRを行うことにより、 供試 サンプルとして用いられる DNAフラグメント （X、 配列番号 1 9、 Genbank
Accession No. NT一 029419等に示される塩基番号 25687390- 25687775に相当する領域） を増幅した。
<PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー >
PF 1 ： 5' - CTCAGCACCCAGGCGGCC -3， （配列番号 1 7)
PR 1 ： 5' - CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3， （配列番号 18) ぐ DNAフラグメント >
X： 5' -
Figure imgf000063_0001
GGCCAG -3' (配列番号 1 9)
PCRの反応液としては、 铸型とするゲノム DNAを 10n gと、 δ^Μの上記プラ イマ一溶液各 3 1と、 each 2 mM dNTPを 5 μ1と、 10 X緩衝液（lOOraM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KC1、 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 1と、 耐熱性 D NAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold) 5υ/μ1を 0. 25 1とを混合し、 これに滅菌 超純水を加えて液量を 50 μ 1としたものを用いた。 該反応液を、 95°Cにて 10分 間保温した後、 95 °Cにて 30秒間次いで 6 1 °Cにて 30秒間更に 72 °Cにて 45秒 間を 1サイクルとする保温を 40サイクル行う条件で P C Rを行った。 PCRを行った後、 2%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、 Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） により、 DN Aフラグメント Xを精製した。
DNAフラグメント Xについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 A： DNAフラタ'、メント X 10ng/10 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 Β ： DNAフラ^ lng/10 μΐ' Τ Εバッファ一溶液
溶液 C ： DNAフラタ'、メント X 0. lng/10 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 D ： Τ Εバッファ一溶液 （ネガテイブコント口ール液） また、 クロンテック社より購入されたヒ ト血液由来ゲノム DNAについて、 以下の 配列番号 22及ぴ配列番号 23で示される PC Rのために設計されたオリゴヌクレオ チドプライマ一 （PF 2及び PR 2) 及ぴ反応条件を用いて PCRを行うことにより 、 供試サンプルとして用いられる DNAフラグメント （Y、 配列番号 24、 Genbank Accession No. AC009800等に示される塩基番号 76606- 76726に相当する領域） を増幅 した。 く PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 >
PF 2 : 5， - TGAGCTCCGTAGGGCGTCC—3， （配列番号 22)
PR 2 : 5， - GCGCCGGGTCCGGGCCC -3， （配列番号 23) く DNAフラグメント >
Y： 5' -
GGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA - 3， （配列番号 24)
-
PCRの反応液としては、 铸型とするゲノム DNAを 10n gと、 の上記プラ イマ一溶液各 3 μ 1 と、 each 2 mM (1 丁？を5 1と、 10 X緩衝液（lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KC1、 15roM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 1 と、 耐熱性 D NAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold) 511/ 1を 0. 2 5 μ 1 とを混合し、 これに滅菌 超純水を加えて液量を 5 0 1 としたものを用いた。 該反応液を、 9 5°Cにて 1 0分 間保温した後、 9 5 °Cにて 3 0秒間次いで 6 0 °Cにて 3 0秒間更に 7 2 °Cにて 4 5秒 間を 1サイクルとする保温を 5 0サイクル行う条件で PCRを行つた。
P CRを行った後、 2%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、 Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） により、 D N Aフラグメント Yを精製した。
DNAフラグメント Υについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 Α： DNAフラク" ト Y 10ng/10 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 Β ： DNAフラ ト Y lng/10 Τ Εバッファ一溶液
溶液 C ： DNAフラ ト Υ 0. lng/10 j L T Eバッファ一溶液
溶液 D ： T Eバッファ一溶液 （ネガティブコント口ール液） 前記に調製した DN Aフラグメント Xの溶液 Aと DN Aフラグメント Yの溶液 Aを 、 DN Aフラグメント Xの溶液 Bと DNAフラグメント Yの溶液 Bを、 DNAフラグ メント Xの溶液 Cと DNAフラグメント Yの溶液 Cを、 DNAフラグメント Xの溶液 Dと DNAフラグメント Yの溶液 Dを、 夫々混合し、 以下に示す DN Aフラグメント 混合溶液 MA〜MDを夫々 2連で調製した。
溶液 M A： 1 Ong/20 UL ΤΕバッファ一溶液
溶液 MB ： lng/20 L TEバッファー溶液
溶液 M C ： 0. lng/20 μΐ ΤΕバッファ一溶液
溶液 MD ： Τ Εバッファ一溶液 （ネガテイブコント口ール液） 得られた夫々の溶液を 2 0 ^ Lと、 Sssl methylase (NEB社製）を 0. 5 ^ 1 と、 1 0 xNEBuffer2 (NEB社製）を 5 μ 1と、 3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製）を 0 . 5 μ 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 5 0 μ 1 としたものを調製し た。 該反応液を、 37°Cにて 3 0分間インキュベーションした（以上、 本発明方法の第 一工程に相当する）。 配列番号 25で示される目的とする DNA領域からなるオリゴヌクレオチド Y' に 相補性により結合可能な配列番号 26で示される塩基配列からなる 5' 末端 F I TC 標識オリゴヌクレオチド F 2を合成し、 0.02 μΜの Tris-HCLパッファー （10 mM) 溶液を調製した。 く目的とする DNA領域からなるオリゴヌクレオチド>
Figure imgf000066_0001
GGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3' (配列番号 25) く 5 ' 末端]? I T C標識ォリゴヌクレオチド>
F 2 ： 5' - GACAACGCCTCGTTCTCGG -3， （配列番号 26) 得られた夫々の反応液について、 以下の処理を施した。
PCRチューブに、 前記で調製した反応液 40 しと、 前記の 5' 末端 F I TC標 識オリゴヌクレオチド溶液 10 Lと、 緩衝液 （330mM Tris-Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2 s 5raM Dithiothreitol) を 10/ Lと、 100 mM MgCl2溶液 1 0 と、 1 mg/mL BSA溶液 10 Lを添加し、 更に該混合物に滅菌超純水を加えて液 量を 100 Lとし、 混合した。 その後、 本 PC Rチューブを 95 °Cで 10分間加熱 し、 70°Cまで速やかに冷却し、 その温度で 10分間保温した。 次いで、 50°Cまで 冷却し 10分間保温し、 更に 37 °Cで 10分間保温した後、 室温に戻し、 5' 末端 F I T C標識ォリゴヌクレオチドと D N Aフラグメントとの結合体の形成を促した（以 上、 本発明方法の第二工程に相当する）。
前記のピオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトァビジン被覆済 み 8ウェルストリップに、 前記で調製した DNAフラグメントの反応液 100 を 加え、 室温で 1時間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 20 0 μ Lの洗浄パッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na2HP07H20、 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 該バッファーをピペッティングに. より取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した （以上、 本発明方法の第三工程に相 当する） 。
その後、 HRP標識 F I TC抗体溶液 [Jackson ImmunoResearch Laboratories社製 、 0.005/ig/100/zL 0.1% BSA含有リン酸バッファー （ImM K P04、 3mM Na2HP0 7H20 、 15½M NaCl ρΗ7·4) 溶液]を各ゥエルに 1 00 しの割合で添カ卩後、 1時間室温で放 置した。 放置後、 各ゥエルを 200 μ Lの洗浄バッファー [0.05% TVeen20含有リン酸 バッファー （ImM K P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154IBM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 該 バッファーをデカンテーションにより取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した。 基質 （R&D社製、 #DY999) を、 各ゥ ルに 1 00 Lの割合で添加 ·混合し、 反応を 開女台した。
約 30分間室温で放置し、 ストツプ溶液 （2N H2 S04水溶液）を各ゥエルに 50 しの 割合で添加し、 反応を停止した。 反応停止後 30分以内に 45 Onmの吸光度を測定し た。 （以上、 本発明方法の第四工程に相当する） その結果を図 3に示した。 溶液 MA、 及ぴ溶液 MBでは、 溶液 MDに比べて吸光度 の増加がみられた。 またその強度は DN Aフラグメントの濃度に依存して増加した。 本実験において、 メチルシトシン抗体と、 メチル化された DN Aフラグメントと、 固定化した 5， 末端ピオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成 '選^し、 複 合体中の F I TCを、 その機能により定量'検出することにより、 DNAフラグメン トの検出 .定量が可能であることが明らかとなった。 実施例 4
市販のメチルシトシン抗体 （Aviva Systems Biology社製） を、 市販ビォチン化キ ット （Biotin Labeling Kit-NH2、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載さ れた方法に準じて、 ビォチン標識した。 得られたビォチン標識メチルシトシン抗体を 0.25ug/uL 0.1% BSA含有リン酸バッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7.4) 溶液として冷蔵保存した。
合成して得られたピオチン標識メチルシトシン抗体の 0.5 μ g/raLO.1% BSA含有リン 酸バッファー （lmM KH2P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7.4) 溶液を調製し、 これを各 100 μ Lの割合でストレプトァビジン被覆済み 8ゥ工ルストリップ （ Perkin Elmer社製） に添加し、 約 1時間室温で放置してゥエルに固定化した。 その後 、 溶液をピペッティングにより取り除き、 200 μ Lの洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 該バッファーをデカンテーシヨンにより取り除いた。 この操作を更 に 2回繰り返した （以上、 本発明方法で使用する固定化メチル化 DN A抗体の調製に 相当する） 。
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノム DN Aについて、 以下の配列番 号 17及び配列番号 18で示される PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプ ライマー （ 1及び卩1 1) 及ぴ反応条件を用いて PCRを行うことにより、 供試 サンプルとして用いられる DNAフラグメント （X、 配列番号 19、 Genbank Accession No. NT— 029419等に示される塩基番号 25687390- 25687775に相当する領域） を増幅した。 ぐ PCRのために設計されたォリゴヌクレオチドプライマ一〉
PF 1 : 5， - CTCAGCACCCAGGCGGCC -3， （配列番号 17)
PR 1 ： 5' - CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3， （配列番号 18) く DNAフラグメント〉
X： 5' 一
Figure imgf000068_0001
GGCCAG -3' (配列番号 1 9) PCRの反応液としては、 錚型とするゲノム DNAを 10n gと、 5/_ίΜの上記プラ イマ一溶液各 3 μ 1と、 each 2 mM dNTPを と、 10 X緩衝液（lOOraM Tris-HCl H 8.3、 500mM KC1、 15mM MgClい 0.01% Gelatin)を 5 1と、 耐熱性 D NAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold) 5U/ 1を 0. 25 ^ 1とを混合し、 これに滅菌 超純水を加えて液量を 50 μ 1としたものを用いた。 該反応液を、 95°Cにて 10分 間保温した後、 95 °Cにて 30秒間次！/、で 61 °Cにて 30秒間更に 72 °Cにて 45秒 間を 1サイクルとする保温を 40サイクル行う条件で PCRを行つた。
PCRを行った後、 2%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、 Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） により、 D N Aフラグメント Xを精製した。
DNAフラグメント Xについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 A： DNAフラ メント X 10ng/10 ul T Eバッファ一溶液
溶液 B ： DNAフラ ト X lng/10 μ L Τ Εバッファ一溶液
溶液 C ： DNAフラク"メレ 0. lng/10 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 D： Τ Εバッファ一溶液 （ネガティブコント口ール液） また、 クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノム DNAについて、 以下の 配列番号 22及ぴ配列番号 23で示される PC Rのために設計されたオリゴヌクレオ チドプライマ一 （PF 2及ぴ PR2) 及ぴ反応条件を用いて PCRを行うことにより 、 供試サンプルとして用いられる DNAフラグメント （Y、 配列番号 24、 Genbank Accession No. AC009800等に示される塩基番号 76606-76726に相当する領域） を増幅 し 。 く PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 >
PF2 : 5， - TGAGCTCCGTAGGGCGTCC -3' (配列番号 22)
PR 2 : 5， - GCGCCGGGTCCGGGCCC -3， （配列番号 23) ぐ DNAフラグメント > Y ： 5' -
GGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3' (配列番号 24)
PCRの反応液としては、 铸型とするゲノム DNAを 10n gと、 5 Μの上記プラ イマ一溶液各 3 1 と、 each 2 mM dNTPを5 μlと、 1 0 X緩衝液（lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KC1、 15mM MgClい 0.01% Gelatin)を 5 / 1 と、 而ォ熱性 D NAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold) 5U//_tlを 0. 2 5 1 とを混合し、 これに滅菌 超純水を加えて液量を 50 μ 1 としたものを用いた。 該反応液を、 9 5°Cにて 1 0分 間保温した後、 95°Cにて 30秒間次いで 60°Cにて 30秒間更に Ί 2°Cにて 4 5秒 間を 1サイクルとする保温を 50サイクル行う条件で P C Rを行った。
PCRを行った後、 2%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、 Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） により、 DNAフラグメント Yを精製した。 DN Αフラグメント Υについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 A： DNAフラ Γメント Y 10ng/10^L T Eバッファ一溶液
溶液 B ： DNAフラ メント Y lng/10 til T Eバッファ一溶液
溶液 C ： DNAフラ メント Y 0. lng/10 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 D ： Τ Εバッファ一溶液 （ネガテイブコント口ール液） 前記に調製した DNAフラグメント Xの溶液 Αと DNAフラグメント Yの溶液 Aを 、 DNAフラグメント Xの溶液 Bと DNAフラグメント Yの溶液 Bを、 DNAフラグ メント Xの溶液 Cと DNAフラグメント Yの溶液 Cを、 DNAフラグメント Xの溶液 Dと DNAフラグメント Yの溶液 Dを、 夫々混合し、 以下に示す DNAフラグメント 混合溶液 MA〜MDを夫々 2連で調製した。
溶液 M A： 1 Ong/20 μΐ ΤΕバッファ一溶液
溶液 Μ Β ： lng/20 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 M C ： 0. lng/20 μ L Τ Εバッファ一溶液 溶液 MD： T Eバッファ一溶液 （ネガテイブコント口ール液) 得られた夫々の溶液を 10 μ Lと、 Sssl methylase (NEB社製）を 0 . 5 μ 1と、 1 0 xNEBuffer2 (NEB社製）を 5 μ 1と、 3. 2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製）を 0 . 5 M 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 5 0 1としたものを調製した 。 該反応液を、 37°Cにて 3 0分間インキュベーションした（以上、 本発明方法の第一 工程に相当する）。
配列番号 2 0で示される目的とする D N A領域からなるオリゴヌクレオチド X ' に 相補性により結合可能な配列番号 2 1で示される塩基配列からなる 5 ' 末端 F I T C 標識オリゴヌクレオチド F 1を合成し、 また、 配列番号 2 5で示される目的とする D N A領域からなるオリゴヌクレオチ FY ' に相補~生により結合可能な配列番号 2 6で 示される塩基配列からなる 5， 末端 F I T C標識オリゴヌクレオチド F 2を合成し、 夫々の濃度が 0. 02 // Mである Tris - HC1バッファー （10 mM) 溶液を調製した。 く目的とする D NA領域からなるオリゴヌクレオチド>
X' ： 5, -
Figure imgf000071_0001
GGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3 ' (配列番号 2 5 )
< 5 ' 末端 F I T C標識オリゴヌクレオチド〉
F 1 : 5， 一 CTGGCCAAACTGGAGAT -3' (配列番号 2 1 ) F 2 : 5' - GACAACGCCTCGTTCTCGG -3 (配列番号 26) 得られた夫々の反応液について、 以下の処理を施した。
PCRチューブに、 前記で調製した反応液 4 0 しと、 前記の 5， 末端 F I TC標 識オリゴヌクレオチド溶液 1 0 iiLと、 緩衝液 (330mM Tris - Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithiothreitol) を l O ^ Lと、 1 0 0 mM MgCl2溶液 1 と、 1 rag/mL BSA溶液 1 0 丄を添加し、 更に該混合物に滅菌超純水を加えて液 量を 1 0 0 Lとし、 混合した。 その後、 本 P C Rチューブを 9 5 °Cで 1 0分間加熱 し、 7 0°Cまで速やかに冷却し、 その温度で 1 0分間保温した。 次いで、 5 0°Cまで 冷却し 1 0分間保温し、 更に 3 7 °Cで 1 0分間保温した後、 室温に戻し、 5， 末端 F I TC標識オリゴヌクレオチドと D N Aフラグメントとの結合体の形成を促した（以 上、 本発明方法の第二工程に相当する）。
前記のビォチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済 み 8ウェルストリップに、 前記で調製した DNAフラグメントの反応液 1 0 0 μしを 加え、 室温で 1時間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 2 0 0 μ L·の洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸パッファー （ImM KH2 P04、 3raM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 該バッファーをピぺッティングに より取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した （以上、 本発明方法の第三工程に相 当する） 。
その後、 HRP標識 F I TC抗体'溶液 [Jackson ImmunoResearch Laboratories社製 、 0. OOS/zg/lOO^L 0.1% BSA含有リン酸バッファー （ImM K P04、 3mM Na2HP0 7H20 、 154raM NaCl PH7.4) 溶液]を各ゥエルに 1 0 0 の割合で添加後、 1時間室温で放 置した。 放置後、 各ゥエルを 2 0 0 At Lの洗浄バッファー [0.05% TVeen20含有リン酸 バッファー （ImM K P04、 3mM Na2HP0 7H20、 1.5½M NaCl pH7.4) ]を添加した後、 該 バッファーをデカンテーシヨンにより取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した。 基質 （R&D社製、 #DY999) を、 各ゥ ルに 1 0 0 iLの割合で添加'混合し、 反応を 開女台した。
約 3 0分間室温で放置し、 ストップ溶液 （2N ¾S04水溶液）を各ゥヱルに 5 C Lの 割合で添加し、 反応を停止した。 反応停止後 3 0分以内に 4 5 Onmの吸光度を測定し た。 （以上、 本発明方法の第四工程に相当する） その結果を図 4に示した。 溶液 MA、 溶液 MB、 及び溶液 MCでは、 溶液 MDに比 ベて吸光度の増加がみられた。 またその強度は DNAフラグメントの濃度に依存して 增カ 13した。
本実験において、 メチルシトシン抗体と、 メチノレ化された DNAフラグメン卜と、 固定ィヒした 5 ' 末端ピオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成 ·選択し、 複 合体中の F I TCを、 その機能により定量 '検出することにより、 DNAフラグメン トの検出 ·定量が可能であることが明らかとなった。 実施例 5
市販のメチルシトシン抗体 （Aviva Systems Biology社製） を、 市販ピオチン化キ ット （Biot in Labeling Kit_NH2、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載さ れた方法に準じて、 ピオチン標識した。 得られたビォチン標識メチルシトシン抗体を 0.25 μ g/ L 0.1% BSA含有リン酸バッファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7.4) 溶液として冷蔵保存した。
合成して得られたピオチン標識メチルシトシン抗体の 0.5 μ g/mL0.1% BSA含有リン 酸バッファー （lmM KH2P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7.4) 溶液を調製し、 これを各 1 0 0 の割合でストレブトァビジン被覆済み 8ゥェルストリップ （
Perkin Elmer社製） に添加し、 約 1時間室温で放置してゥヱルに固定ィ匕した。 その後 、 溶液をピペッティングにより取り除き、 200 μ Lの洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファー （ImM KH2P04、 3raM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 該バッファーをデカンテーシヨンにより取り除いた。 この操作を更 に 2回繰り返した （以上、 本発明方法で使用する固定化メチルイヒ DN A抗体の調製に 相当する） 。
パン酵母酵母株 X 2 1 8 0 - 1 Aを YPD培地 ％ Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, H 5.6-6.0) で、 濁度が 0D60。 0.6-1.0 になるまで培養し、 10， 000xg で 10分間遠心して、 lxlO7の酵母細胞を調製した。 調製した酵母細胞から、 Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、 一般 的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、 バッファー A (1M ソルビトール、 0.1M EDTA、 pH 7.4) に 懸濁し、 0.1% 2 -メルカプトエタノール （終濃度 1 4mM) 及ぴ 100U zymolase (10 mg/ml) を添加して、 溶液が透明になるまで 30° C で 1時間、 撹拌しながらインキュ ペートした。 550xgで 10分間遠心してプロトプラストを回収後、 バッファー B (50 ΙΏΜ Tris-HCl、 pH 7.4、 20 mM EDTA) に懸濁してから、 ドデシル硫酸ナトリウムを 1 % (w/v) になるように加えた後、 65°Cで 30分間インキュベートした。 続いて、 体積 比 2/5量の 5M CH3 C00Kを添加して混和してから 30分間氷冷後、 15, OOC cgで 30分間遠心 して上清を回収した。 回収した上清に体積比 1/10量の 3M CH3C00Naと等量のイソプロ パノールを加えてよく混和し、 15，000xg 4 °Cで 30分間遠心して得られた沈澱を 70 %エタノ一ノレでリンスして回収した。 沈澱を乾燥させてから、 1 ml の TEバッファー (10 mM Tris- HC1、 pH 8.0、 1 raM EDTA) に溶解し、 40 g/mlになるように RN a s e A (Sigma社製） を加えて 37 °Cで 1時間インキュベートし、 続いて、 混合液に - proteinase K (Sigma社製） を 500 g/m 1及びドデシル硫酸ナトリウムを 1 % (w/v) になるように加えた後、 これを 5 5°Cで約 1 6時間振とうした。 振とう終 了後、 該混合物をフエノール [1M Tris_HCl (pH 8.0) にて飽和] 'クロ口ホルム抽出 処理した。 水層を回収し、 これに Na C lを 0. 5 Nとなるよう加えた後、 これをェ タノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。 回収された沈澱を 70 %エタノールで リンスすることにより、 ゲノム DNAを得た。
得られた酵母ゲノム DNAから、 以下の配列番号 2 7及ぴ配列番号 28で示される PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 (P F 3及ぴ PR 3) 及ぴ 反応条件を用いて PCRを行うことにより、 供試サンプルとして用いられる DNAフ ラグメント （S、 配列番号 29、 Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母 染色体 VIIの塩基番号 271743- 272083に相当する領域） を増幅した。 く P CRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 > PF3 ： 5' - AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号 2 7)
PR 3 : 5， - AGACATGTGCTCACGTACGGT -3， （配列番号 28) く DNAフラグメント〉
S： 5' -
Figure imgf000075_0001
TTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (配列番号 2 9)
PCRの反応液としては、 錄型とするゲノム DNAを 10n gと、 5μΜの上記プラ イマ一溶液各 3 μ 1 と、 each 2 mM dNTPを 5 / 1と、 1 0 X緩衝液（lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KC1、 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 1 と、 耐熱性 D NAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold) 5U/V1を 0. 2 5 μ 1 とを混合し、 これに滅菌 超純水を加えて液量を 50 1 としたものを用いた。 該反応液を、 9 5°Cにて 1 0分 間保温した後、 95°Cにて 20秒間次いで 58°Cにて 30秒聞更に 72°Cにて 30秒 間を 1サイクルとする保温を 40サイクル行う条件で PC Rを行った。
PCRを行った後、 2%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、 Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） により、 DNAフラグメント Sを精製した。
DNAフラグメント Sについて、 以下の溶液を夫々 2連で調製した。
溶液 A DNAフラ メント S 10ng/20^L TEバッファー溶液
溶液 B DNAフラク"メント S lng/20 μ L TEバッファー溶液
溶液。 DNAフラタ'、メント S 0. lng/20 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 D Τ Εバッファ一溶液 （ネガテイブコント口ール液) 得られた夫々の溶液を 20 β Lと、 Sssl methylase (NEB社製）を 0. 5 μ 1 と、 1 0 xNEBuffer2 (NEB社製）を 5 1と、 3.2 mM S - adenosyl methionine (NEB社製）を 0 . 5 ^ 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 1としたものを調製し た。 該反応液を、 37°Cにて 30分間インキュベーションした（以上、 本発明方法の第 一工程に相当する）。
配列番号 30で示される目的とする DNA領域からなるオリゴヌクレオチド S， に 相補性により結合可能な配列番号 31で示される塩基配列からなる 5' 末端 F I TC 標識オリゴヌクレオチド F 3を合成し、 0.02 Μの Tris- HC1バッファー (10 ） を調製した。 く目的とする DNA領域からなるオリゴヌクレオチド >
S ' ： 5' -
Figure imgf000076_0001
TTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (配列番号 30) く 5， 末端 F I T C標識ォリゴヌクレオチド〉
F 3 ： 5' - CTGGCCAAACTGGAGAT -3' (配列番号 31) 得られた夫々の反応液について、 以下の処理を施した。
PCRチューブに、 前記で調製した反応液 40 しと、 前記の 5' 末端 F I TC標 識オリゴヌクレオチド溶液 10 と、 緩衝液 （330raM Tris- Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithiothreitol) を l O /^ Lと、 100 mM MgCl2溶液 1
0 Lと、 1 mg/mL BSA溶液 10 しを添カ[3し、 更に該混合物に滅菌超純水を加えて液 量を 100〃 Lとし、 混合した。 その後、 本 PC Rチューブを 95 °Cで 10分間加熱 し、 70°Cまで速やかに冷却し、 その温度で 10分間保温した。 次いで、 50でまで 冷却し 10分間保温し、 更に 37°Cで 10分間保温した後、 室温に戻し、 5' 末端 F
1 T C標識ォリゴヌクレオチドと D N Aフラグメントとの結合体の形成を促した（以 上、 本発明方法の第二工程に相当する）。
前記のビォチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトァビジン被覆済 み 8ウェルストリップに、 前記で調製した D N Aフラグメントの反応液 1 0 0 を 加え、 室温で 1時間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 2 0 0 u Lの洗浄パッファー [0. 05% Tween20含有リン酸パッファー （IraM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) ]を添加した後、 該バッファーをピペッティングに より取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した （以上、 本発明方法の第三工程に相 当する） 。
その後、 H R P標識 F I T C抗体溶液 [Jackson IramunoResearch Laboratories社製 、 0.
Figure imgf000077_0001
0. 1% BSA含有リン酸バッファー （ImM KH2 P04、 3raM Na2HP0 7H20 、 154mM NaCl pH7. 4) 溶液]を各ゥエルに 1 0 0 ^u Lの割合で添加後、 1時間室温で放 置した。 放置後、 各ゥエルを 2 0 0 μ Lの洗浄バッファー [0. 05% Tween20含有リン酸 バッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) ]を添加した後、 該 バッファーをデカンテーションにより取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した。 基質 （R&D社製、 #DY999) を、 各ゥエルに 1 0 0 μ Lの割合で添加 ·混合し、 反応を 開台した。
約 3 0分間室温で放置し、 ストツプ溶液 （2Ν H2 S04水溶液）を各ゥエルに 5 0 j しの 割合で添加し、 反応を停止した。 反応停止後 3 0分以内に 4' 5 O nmの吸光度を測定し た。 （以上、 本発明方法の第四工程に相当する） その結果を図 5に示した。 溶液 A、 溶液 B、 及ぴ溶液 Cでは、 溶液 Dに比べて吸光 度の増加がみられた。 またその強度は D N Aフラグメントの濃度に依存して増加した 本実験において、 メチルシトシン抗体と、 メチルイ匕された D N Aフラグメントと、 固定ィ匕した 5 ' 末端ピオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成 '選択し、 複 合体中の F I T Cを、 その機能により定量'検出することにより、 D N Aフラグメン トの検出 ·定量が可能であることが明らかとなった。 実施例 6
市販のメチルシトシン抗体 （Aviva Systems Biology社製） を、 市販ビォチン化キ ット （Biotin Labeling Kit - NH2、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載さ れた方法に準じて、 ビォチン標識した。 得られたビォチン標識メチルシトシン抗体を 0. 25 / g/ L 0. 1% BSA含有リン酸バッファー （ImM K¾ P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) 溶液として冷蔵保存した。
合成して得られたビォチン標識メチルシトシン抗体の 0. 5 g/mLO. 1% BSA含有リン 酸バッファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154raM NaCl pH7. 4) 溶液を調製し、 これを各 1 0 0 μ Lの割合でストレプトァビジン被覆済み 8ゥェルストリップ （ Perkin Elmer社製） に添加し、 約 1時間室温で放置してゥエルに固定ィヒした。 その後 、 溶液をピペッティングにより取り除き、 2 0 0 Lの洗浄バッファー [0. 05% Tween20含有リン酸バッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154raM NaCl pH7. 4) ]を添加した後、 該バッファーをデカンテーシヨンにより取り除いた。 この操作を更 に 2回繰り返した （以上、 本発明方法で使用する固定化メチル化 D N A抗体の調製に 相当する） 。
パン酵母株 X 2 1 8 0 - 1 Aを Y P D培地 （1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5. 6-6. 0) で、 濁度が 0D6。。 0. 6-1. 0 になるまで培養し、 10, OOOxgで 10 分間遠心して、 l x lO7の酵母細胞を調製した。 調製した酵母細胞から、 Methods in ' Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、 一般的 な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、 バッファー A (1M ソルビトール、 0, 1M EDTA、 pH 7. 4) に 懸濁し、 0. 1% 2-メルカプトエタノール （終濃度 1 4 mM) 及び 100U zymolase (10 mg/ml) を添加して、 溶液が透明になるまで 30° C で 1時間、 撹拌しながらインキュ ペートした。 550xgで 10分間遠心してプロトプラストを回収後、 バッファー B (50 mM Tris- HC1、 pH 7. 4、 20 mM EDTA) に懸濁してから、 ドデシル硫酸ナトリウムを 1 % (w/ v ) になるように加えた後、 65°Cで 30分間インキュベートした。 続いて、 体積 比 2/5量の 5M CH3 C00Kを添加して混和してから 30分間氷冷後、 15， OOOxgで 30分間遠心 して上清を回収した。 回収した上清に体積比 1/10量の 3M CH。C00Naと等量のイソプロ パノールを加えてよく混和し、 15,000xg 4 °Cで 30分間遠心して得られた沈澱を 70 %エタノールでリンスして回収した。 沈澱を乾燥させてから、 1ml の TEバッファー (10 mM Tris-HCl、 pH 8.0、 1 mM EDTA) に溶解し、 40 g/mlになるように RN a s e A (Sigma社製） を加えて 37 °Cで 1時間インキュベートし、 続いて、 混合液に proteinase K (Sigma社製） を 500 μ g /m 1及びドデシル硫酸ナトリウムを 1 % (w/v) になるように加えた後、 これを 55°Cで約 16時間振とうした。 振とう終 了後、 該混合物をフエノール [ 1M Tris-HCl (pH 8.0) にて飽和] 'クロ口ホルム抽出 処理した。 水層を回収し、 これに Na C lを 0. 5 Nとなるよう加えた後、 これをェ タノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。 回収された沈澱を 70 %ェタノールで リンスすることにより、 ゲノム DNAを得た。
得られた酵母ゲノム DNAから、 以下の配列番号 27及び配列番号 28で示される PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 (P F 3及び PR 3) 及ぴ 反応条件を用いて PCRを行うことにより、 供試サンプルとして用いられる DNAフ ラグメント （S、 配列番号 29、 Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母 染色体 VIIの塩基番号 271743-272083に相当する領域） を増幅した。
< P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー >
PF 3 : 5， - AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号 27)
PR 3 ： 5' - AGACATGTGCTCACGTACGGT -3' (配列番号 28) く DNAフラグメント >
S ： 5' -
Figure imgf000079_0001
TTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (配列番号 29 ) PCRの反応液としては、 鎳型とするゲノム DNAを 10n gと、 5μΜの上記プラ イマ一溶液各 3 1と、 each 2 mM 11^丁？を5 1と、 10 X緩衝液（lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KC1、 15raM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 μ 1と、 耐熱性 D NAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold) 511/μ1を 0. 25 μ 1とを混合し、 これに滅菌 超純水を加えて液量を 50 μ 1としたものを用いた。 該反応液を、 95°Cにて 10分 間保温した後、 95 °Cにて 20秒間次いで 58 °Cにて 30秒間更に 72 °Cにて 30秒 間を 1サイクルとする保温を 40サイクル行う条件で P C Rを行つた。
PCRを行った後、 2%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、 Wizard SV Gel /PCR Kit (PR0MEGA社） により、 DNAフラグメント Sを精製した。
DNAフラグメント Sについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 A： DNAフラタ'、メント S 10ng/10 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 Β ： DNAフラタ'、 ト S lng/10 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 C： Τ Εバッファ一溶液 （ネガティブコント口ール液） また、 得られた酵母ゲノム DN Αから、 以下の配列番号 32及び配列番号 33で示 される PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー （PF 4及び PR 4 ) 及ぴ反応条件を用いて PCRを行うことにより、 供試サンプルとして用いられる D NAフラグメント （T、 配列番号 34、 Genbank Accession No. NC_001139等に示さ れる酵母染色体 VIIの塩基番号 384569 - 384685に相当する領域） を増幅した。 く; PC Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー >
PF4 ： 5' - GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3， （配列番号 32)
PR4 ： 5' - AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3， （配列番号 33)
<DNAフラグメント >
T： 5' - TTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3' (配列番号 34)
PCRの反応液としては、 錄型とするゲノム DNAを 10n gと、 5μΜの上記プラ イマ一溶液各 3 μ 1と、 each 2 mM (11^丁？を5 1と、 10 X緩衝液（lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KC1、 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 1と、 而ォ熱性 D NAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold) 51]/ 1を0. 25 μ 1とを混合し、 これに滅菌 超純水を加えて液量を 50 μ 1としたものを用いた。 該反応液を、 95°Cにて 10分 間保温した後、 95 °Cにて 20秒間次いで 58 °Cにて 30秒間更に 72 °Cにて 30秒 間を 1サイクルとする保温を 40サイクル行う条件で： P C Rを行つた。
PCRを行った後、 2%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、 Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） により、 DNAフラグメント Tを精製した。
DNAフラグメント Τについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 Α： DNAフラタ、' ト T 10ng/10 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 Β ： DNAフラ Γメント T lng/lO^L TEバッファー溶液
溶液 C： TEバッファー溶液 （ネガティブコントロール液） 前記に調製した DNAフラグメント Sの溶液 Aと DNAフラグメント Tの溶液 Aを 、 DNAフラグメント Sの溶液 Bと DNAフラグメント Tの溶液 Bを、 DNAフラグ メント Sの溶液 Cと DNAフラグメント Tの溶液 Cを、 夫々混合し、 以下に示す DN Aフラグメント混合溶液 MA〜MCを夫々 2連で調製した。
溶液 M A： 10ng/20 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 Μ Β ： lng/20 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 M C ： Τ Εバッファ一溶液 （ネガティブコント口ール液） 得られた夫々の溶液を 20 μ Lと、 Sssl methylase (NEB社製）を 0. 5 1と、 1 0 xNEBuffer2 (NEB社製）を 5 と、 3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製）を 0 . 5 μ 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 1としたものを調製し た。 該反応液を、 37°Cにて 30分間インキュベーションした（以上、 本発明方法の第 —工程に相当する）。
配列番号 30で示される目的とする DNA領域からなるオリゴヌクレオチド S' に 相補性により結合可能な配列番号 31で示される塩基配列からなる 5 ' 末端 F I TC 標識オリゴヌクレオチド F 3を合成し、 0.02 μ Μの Tris_HClバッファ一 (10 ） 溶液を調製した。 く目的と る DNA領域からなるオリゴヌクレオチド
Figure imgf000082_0001
TTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT - 3' (配列番号 30) く 5 ' 末端 F I T C標識オリゴヌクレオチド〉
F 3 : 5' - AGACATGTGCTCACGTACGGT -3， （配列番号 31) 得られた夫々の反応液について、 以下の処理を施した。
PCRチューブに、 前記で調製した反応液 40 しと、 前記の 5' 末端 F I TC標 識オリゴヌクレオチド溶液 10 /zLと、 緩衝液 (330mM Tris- Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithiothreitol) を 10 Lと、 100 mM MgCl2溶液 1 0 しと、 1 mg/mL BSA溶液 10 Lを添加し、 更に該混合物に滅菌超純水を加えて液 量を 100 u Lとし、 混合した。 その後、 本 PC Rチューブを 95 °Cで 10分間加熱 し、 70°Cまで速やかに冷却し、 その温度で 10分間保温した。 次いで、 50°Cまで 冷却し 10分間保温し、 更に 37 °Cで 10分間保温した後、 室温に戻し、 5， 末端 F I T C標識ォリゴヌクレオチドと D N Aフラグメントとの結合体の形成を促した（以 上、 本発明方法の第二工程に相当する）。 前記のピオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトァビジン被覆済 み 8ウェルストリツプに、 前記で調製した D N Aフラグメントの反応液 1 0 0〃 Lを 加え、 室温で 1時間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 2 0 0 μ Lの洗浄パッファー [0. 05% Tween20含有リン酸バッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) ]を添加した後、 該バッファーをピペッティングに より取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した （以上、 本発明方法の第三工程に相 当する） 。
その後、 H R P標識 F I T C抗体溶液 [Jackson ImmunoRe search Laboratories社製 、 0. 005 §/100 μ Ι 0. 1% BSA含有リン酸バッファー （ImM KH2P04、 3raM Na2HP0 7H20 、 154mM NaCl pH7. 4) 溶液]を各ゥエルに 1 0 0； u Lの割合で添加後、 1時間室温で放 置した。 放置後、 各ゥヱルを 2 0 0 Lの洗浄バッファー [0. 05% Tween20含有リン酸 バッファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) ]を添カ卩した後、 該 バッファーをデカンテーションにより取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した。 基質 （R&D社製、 #DY999) を、 各ゥエルに 1 0◦ Lの割合で添加 ·混合し、 反応を 開始した。
約 6 0分間室温で放置し、 ストツプ溶液 (2N H2 S04水溶液）を各ゥヱルに 5 0 μ Lの 割合で添加し、 反応を停止した。 反応停止後 3 0分以内に 4 5 O nmの吸光度を測定し た。 （以上、 本発明方法の第四工程に相当する） その結果を図 6に示した。 溶液 MA、 及ぴ溶液 MBでは、 溶液 MCに比べて吸光度 の増加がみられた。 またその強度は D NAフラグメントの濃度に依存して増加した。 本実験において、 メチルシトシン抗体と、 メチルイ匕された D N Aフラグメントと、 固定ィヒした 5 ' 末端ビォチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成 ·選択し、 複 合体中の F I T Cを、 その機能により定量.検出することにより、 D N Aフラグメン トの検出 ·定量が可能であることが明らかとなった。 実施例 7
市販のメチルシトシン抗体 （Aviva Systems Biology社製） を、 市販ピオチン化キ ット （Biotin Labeling Kit-NH2、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載さ れた方法に準じて、 ピオチン標識した。 得られたビォチン標識メチルシトシン抗体を 0. 25 g/ μ L 0. 1% BSA含有リン酸バッファー （lraM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) 溶液として冷蔵保存した。
备成して得られたビォチン標識メチルシトシン抗体の 0. 5 μ §/α10. 1% BSA含有リン 酸バッファー （ImM KH2P04、 3raM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) 溶液を調製し、 これを各 1 0 0 Lの割合でストレプトァビジン被覆済み 8ウェルストリツプ （ Perkin Elmer社製） に添カ卩し、 約 1時間室温で放置してゥエルに固定化した。 その後 、 溶液をピペッティングにより取り除き、 2 0 0 μ Lの洗浄パッファー [0. 05% Tween20含有リン酸バッファー (ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154raM NaCl pH7. 4) ]を添加した後、 該バッファーをデカンテーシヨンにより取り除いた。 この操作を更 に 2回繰り返した （以上、 本発明方法で使用する固定化メチル化 D N A抗体の調製に 相当する） 。
パン酵母株 X 2 1 8 0— 1 Aを Y P D培地 （1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5. 6-6. 0) で、 濁度が 0D6。。 0. 6-1. 0 になるまで培養し、 10， OOOxg で 10 分間遠心して、 l x lO7の酵母細胞を調製した。 調製した酵母細胞から、 Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、 一般的 な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、 バッファー A (1M ソルビトール、 0. 1M EDTA、 pH 7. 4) に 懸濁し、 0. 1% 2 -メルカプトエタノール （終濃度 1 4 mM) 及ぴ 100U zymolase (10 mg/ml) を添加して、 溶液が透明になるまで 30° Cで 1時間、 撹拌しながらインキュ ペートした。 550xgで 10分間遠心してプロトプラストを回収後、 バッファ一 B (50 mM Tris- HC1、 pH 7. 4、 20 mM EDTA) に懸濁してから、 ドデシル硫酸ナトリウムを 1 % (w/ v ) になるように加えた後、 65°Cで 30分間インキュベートした。 続いて、 体積 比 2/5量の 5M CH3 C00Kを添加して混和してから 30分間氷冷後、 15， OOOxgで 30分間遠心 して上清を回収した。 回収した上清に体積比 1/10量の 3M CH3 C00Naと等量のイソプロ パノールを加えてよく混和し、 15， OOOxg 4 °Cで 30分間遠心して得られた沈澱を 7 0 %エタノールでリンスして回収した。 沈澱を乾燥させてから、 l ml の TEバッファー (10 mM Tris-HCL pH 8.0、 1 raM EDTA) に溶解し、 40μ g/mlになるように RN a s e A (Sigma社製） を加えて 37 °Cで 1時間インキュベートし、 続いて、 混合液に proteinase K (Sigma社製） を 500 μ g /m 1及びドデシル硫酸ナトリウムを 1 %
(w/v) になるように加えた後、 これを 55°Cで約 16時間振とうした。 振とう終 了後、 該混合物をフヱノール [1M Tris- HC1 (pH 8.0) にて飽和] 'クロ口ホルム抽出 処理した。 水層を回収し、 これに NaC lを 0. 5 Nとなるよう加えた後、 これをェ タノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。 回収された沈澱を 70%エタノールで リンスすることにより、 ゲノム DN Aを得た。
得られた酵母ゲノム D N Aから、 以下の配列番号 27及ぴ配列番号 28で示される PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 (PF 3及び PR 3) 及び 反応条件を用いて PCRを行うことにより、 供試サンプルとして用いられる DNAフ ラグメント （S、 配列番号 29、 Genbank Accession No. NC— 001139等に示される酵母 染色体 VIIの塩基番号 271743-272083に相当する領域） を増幅した。 <PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 >
P F 3 ： 5' - AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3， （配列番号 27)
PR 3 : 5， - AGACATGTGCTCACGTACGGT -3， （配列番号 28) く DNAフラグメント >
S ： 5' -
Figure imgf000085_0001
TTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (配列番号 29)
PCRの反応液としては、 铸型とするゲノム DNAを 10n gと、 の上記プラ イマ一溶液各 3 μ 1と、 each 2 mM dNTPを 5 1と、 10X緩衝液（lOOraM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KC1、 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 1 と、 耐熱性 D NAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold) 5U/ lを 0. 25 1 とを混合し、 これに滅菌 超純水を加えて液量を 50 μ 1 としたものを用いた。 該反応液を、 95°Cにて 10分 間保温した後、 95 °Cにて 20秒間次いで 58 °Cにて 30秒間更に 72 °Cにて 30秒 を 1サイクルとする保温を 40サイクル行う条件で P C Rを行った。
P C Rを行った後、 2 %ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、 Wizard SV Gel/PCR Ki t (PROMEGA社） により、 DNAフラグメント Sを精製した。
DN Aフラグメント Sについて、 以下の'溶液を調製した。
溶液 A： DNAフラ メント S 10ng/10 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 Β ： DNAフラ メント S lng/10 μ L Τ Εバッファ一溶液
溶液 C ： Τ Εバッファ一溶液 （ネガテイブコント口ール液） また得られた酵母ゲノム DNAから、 以下の配列番号 32及び配列番号 33で示さ れる PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー （PF4及び PR4) 及び反応条件を用いて PCRを行うことにより、 供試サンプルとして用いられる DN Αフラグメント （T、 配列番号 34、 Genbank Accession No. NC— 001139等に示され る酵母染色体 VIIの塩基番号 384569- 384685に相当する領域） を増幅した。 < P CRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 >
P F 4 ： 5' - GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号 32)
PR 4 ： 5' - AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3， （配列番号 33) く DNAフラグメント〉
T ： 5' -
TTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT - 3' (配列番号 34) P CRの反応液としては、 鎳型とするゲノム DNAを 10n gと、 5 Μの上記プラ イマ一溶液各 3 1と、 each 2 mM dNTPを 5 1と、 1 0 X緩衝液（lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KC1、 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 μ 1と、 耐熱性 D NAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold) 5υ/μ1を O. 25 z lとを混合し、 これに滅菌 超純水を加えて液量を 50 1としたものを用いた。 該反応液を、 9 5°Cにて 1 0分 間保温した後、 9 5 °Cにて 2 0秒間次 、で 5 8 °Cにて 3 0秒間更に 7 2 °Cにて 3 0秒 間を 1サイクルとする保温を 4 0サイクル行う条件で P C Rを行つた。
P CRを行った後、 2%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、 Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） により、 DNAフラグメント Tを精製した。
DNAフラグメント Tについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 A： DNAフラク、、 ト T 10ng/10 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 Β ： DNAフラ メン卜 T lng/10 β1 Τ Εバッファ一溶液
溶液 C： Τ Εバッファ一溶液 （ネガティブコント口ール液） 前記に調製した DNAフラグメント Sの溶液 Αと DNAフラグメント Tの溶液 Aを 、 DNAフラグメント Sの溶液 Bと DNAフラグメント Tの溶液 Bを、 DNAフラグ メント Sの溶液 Cと DNAフラグメント Tの溶液 Cを、 夫々混合し、 以下に示す DN Aフラグメント混合溶液 MA〜MCを夫々 2連で調製した。
、- 溶液 M A： 10ng/20 T Eバッファ一溶液
溶液 M B ： lng/20 μΐ ΤΕバッファ一溶液
溶液 M C： Τ Εバッファ一溶液 （ネガティブコント口ール液） 得られた夫々の溶液を 20 Lと、 Sssl methylase (NEB社製）を 0. 5 μ 1と、 1 0 xNEBuffer2 (NEB社製）を 5 1と、 3.2 mM S - adenosyl methionine (NEB社製）を 0 . 5 μ 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 μ 1としたものを調製し た。 該反応液を、 37°Cにて 3 0分間インキュベーションした（以上、 本発明方法の第 一工程に相当する）。 配列番号 30で示される目的とする D N A領域からなるオリゴヌクレオチド S， に 相補性により結合可能な配列番号 31で示される塩基配列からなる 5' 末端 F I TC 標識オリゴヌクレオチド F 3を合成し、 また、 配列番号 35で示される目的とする D NA領域からなるオリゴヌクレオチド T， に相補性により結合可能な配列番号 36で 示される塩基配列からなる 5' 末端 F I TC標識オリゴヌクレオチド F 4を合成し、 夫々の濃度が 0.02 Μである Tris-HClバッファー （10 mM) 溶液を調製した。 く目的とする DNA領域からなるオリゴヌクレオチド >
S， ： 5， -
Figure imgf000088_0001
TTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (配列番号 30)
T' ： 5' - GGACCTGTI
TTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3， （配列番号 35)
く 5 ' 末端 F I T C標識オリゴヌクレオチド>
F 3 ： 5' - AGACATGTGCTCACGTACGGT -3， （配列番号 31)
F 4 : 5' - AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3' (配列番号 36) 得られた夫々の反応液について、 以下の処理を施した。
PCRチューブに、 前記で調製した反応液 40 しと、 前記の 5' 末端 F I TC標 識オリゴヌクレオチド溶液 10 と、 緩衝液 (330m Tris - Acetate pH 7.9、 660raM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithiothreitol) を l O^ Lと、 100 mM MgCl2溶液 1 0 Lと、 1 mg/mL BSA溶液 1 Ο μίを添加し、 更に該混合物に滅菌超純水を加えて液 量を 100/z Lとし、 混合した。 その後、 本 PC Rチューブを 95 °Cで 10分間加熱 し、 70°Cまで速やかに冷却し、 その温度で 10分間保温した。 次いで、 50。じまで 冷却し 1 0分間保温し、 更に 3 7 °Cで 1 0分間保温した後、 室温に戻し、 5 ' 末端 F I T C標識ォリゴヌクレオチドと D N Aフラグメントとの結合体の形成を促した (以 上、 本発明方法の第二工程に相当する）。
前記のピオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトァビジン被覆済 み 8ウェルストリップに、 前記で調製した D N Aフラグメントの反応液 1 0 0 i Lを 加え、 室温で 1時間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 2 0 0 μ Lの洗浄パッファー [0. 05% Tween20含有リン酸バッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 1.54raM NaCl pH7. 4) ]を添加した後、 該バッファ一をピペッティングに より取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した （以上、 本発明方法の第三工程に相 当する） 。
その後、 H R P標識 F I T C抗体溶液 [Jackson ImmunoRe search Laboratories社製 、 0. 005 μ g/100 μ ΐ 0. 1% BSA含有リン酸バッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20 、 154mM NaCl pH7. 4) 溶液]を各ゥヱルに 1 0 0 の割合で添加後、 1時間室温で放 置した。 放置後、 各ゥヱルを 2 0 0 Lの洗浄バッファー [0. 05% Tween20含有リン酸 バッファー (ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) ]を添加した後、 該 バッファーをデカンテーションにより取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した。 基質 （R&D社製、 #DY999) を、 各ゥエルに 1 0 0 μ Lの割合で添加 ·混合し、 反応を 開始した。
約 6 0分間室温で放置し、 ストツプ溶液 （2Ν H2 S04水溶液）を各ゥエルに 5 0 Lの 割合で添加し、 反応を停止した。 反応停止後 3 0分以内に 4 5 0 nmの吸光度を測定し た。 （以上、 本発明方法の第四工程に相当する） その結果を図 7に示した。 溶液 MA、 及ぴ溶液 M Bでは、 溶液 M Cに比べて吸光度 の増加がみられた。 またその強度は D N Aフラグメントの濃度に依存して増加した。 本実験において、 メチルシトシン抗体と、 メチル化された D N Aフラグメントと、 固定ィ匕した 5， 末端ピオチン標識ォリゴヌクレオチドとの複合体を形成 ·選択し、 複 合体中の F I T Cを、 その機能により定量'検出することにより、 D N Aフラグメン トの検出 ·定量が可能であることが明らかとなった。 実施例 8
市販のメチルシトシン抗体 （Aviva Systems Biology社製） を、 市販ピオチン化キ ット （Biotin Labeling Kit - NH2、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載さ れた方法に準じて、 ビォチン標識した。 得られたビォチン標識メチルシトシン抗体を 0.25 Ε/μΙ 0.1°/。 BSA含有リン酸バッファー （ImM K P0い 3raM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7.4) 溶液として冷蔵保存した。
合成して得られたビォチン標識メチルシトシン抗体の 0.5 μ g/mLO.1% BSA含有リン 酸バッファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7.4) 溶液を調製し、 これを各 1 00 Lの割合でストレプトァビジン被覆済み 8ウェルストリップ （
Perkin Elmer社製） に添カ卩し、 約 1時間室温で放置してゥエルに固定ィ匕した。 その後 、 溶液をピペッティングにより取り除き、 200 Lの洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファー （ImM KH2P04、 3raM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 該バッファーをデカンテーシヨンにより取り除いた。 この操作を更 に 2回繰り返した （以上、 本発明方法で使用する固定ィヒメチル化 DN A抗体の調製に 相当する） 。
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノム DN Aについて、 以下の溶液を 夫々 2連で調製した。
溶液 A ： ヒト血液由来ゲノム DNA 100ng/5 μΐ 丁 Εバッファ一溶液
溶液 Β ： ヒト血液由来ゲ、ノム DNA 10ng/5 μΐ ΤΕバッファ一溶液
溶液 C ： ヒト血液由来ゲノム DNA lng/5 /nL TEバッファ一溶液
溶液 D： T Eバッファ一溶液 （ネガテイブコント口ール液） 上記の調製した夫々の溶液を 5 Lと、 制限酵素 X s p lを 1 0Uと、 X s p lに 最適な 1 0 X緩衝液 （200mM Tris-HCl H 8.5、 lOOmM MgCl2、 lOmM Dithiothreitol 、 lOOOmM KC1) 2 とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 20 μ 1とした ものを調製した。 該反応液を、 37°Cにて 1時間インキュベーションした。
得られた夫々の反応液を 20 μ Lと、 Sssl methylase (NEB社製）を 0. 5 1と、 1 0 xNEBuffer2 (NEB社製）を 5 μ 1と、 3· 2 πιΜ S - adenosyl methionine (NEB社製）を 0. 5 μ 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 5 0 μ 1としたものを調製 した。 該反応液を、 37°Cにて 3 0分間インキュベーションした（以上、 本発明方法の 第一工程に相当する）。
ヒトトランスポゾンとして知られる LINE1領域に設計された配列番号 3 7で示され る目的とする DN A領域からなるオリゴヌクレオチド Z (Genbank Accession No. M80340等に示される塩基番号 115- 386に相当する領域） と相補性により結合可能な配 列番号 3 8で示される塩基配列からなる 5 ' 末端 F I T C標識オリゴヌクレオチド F 5を合成し、 0.02 μΜの Tris- HC1バッファー （10 mM) 溶液を調製した。 く目的とする DNA領域からなるオリゴヌクレオチド〉
Z ： 5' -
Figure imgf000091_0001
CCTGGCTCGGAGGGTCCTACGCCCACGGAATCTCGCTGATTGC -3' (配列番号 3 7) く 5， 末端 F I T C標識ォリゴヌクレオチド〉
F 5 : 5， - CTGGCCAAACTGGAGAT -3' (配列番号 3 8) 得られた夫々の反応液について、 以下の処理を施した。
P CRチューブに、 前記で調製した反応液 4 0 と、 前記の 5 ' 末端 F I TC標 識オリゴヌクレオチド溶液 1 0 しと、 緩衝液 （330mM Tris - Acetate H 7.9、 660raM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithiothreitol) を 1 0 /z Lと、 1 0 0 mM MgCl2溶液 1 0 Lと、 1 mg/mL BSA溶液 1 0 Lを添加し、 更に該混合物に滅菌超純水を加えて液 量を 1 0 0 z Lとし、 混合した。 その後、 本 P C Rチューブを 9 5 °Cで 1 0分間加熱 し、 70°Cまで速やかに冷却し、 その温度で 1 0分間保温した。 次いで、 5 0°Cまで 冷却し 1 0分間保温し、 更に 3 7°Cで 1 0分間保温した後、 室温に戻し、 5 ' 末端 F I T C標識ォリゴヌクレオチドと D N Aフラグメントとの結合体の形成を促した（以 上、 本発明方法の第二工程に相当する）。
前記のピオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトァビジン被覆済 み 8ウェルストリップに、 前記で調製した D N Aフラグメントの反応液 1 0 0 を 加え、 室温で 1時間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 2 0 0 μ Lの洗浄バッファー [0. 05% Tween20含有リン酸バッファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 7鼠 154mM NaCl pH7. 4) ]を添加した後、 該バッファーをピペッティングに より取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した （以上、 本発明方法の第三工程に相 当する） 。 '
その後、 ！！ 標識？ I T C抗体溶液 [Jackson ImmunoRe search Laboratories社製 、 0. 005 μ g/100 μ L 0. 1% BSA含有リン酸バッファー （ImM KH2P04 3mM Na2HP0 7H20 、 154raM NaCl pH7. 4) 溶液]を各ゥエルに 1 0 0 /^ Lの割合で添加後、 1時間室温で放 置した。 放置後、 各ゥエルを 2 0 0 μ Lの洗浄バッファー [0. 05% Tween20含有リン酸 バッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) ]を添カ卩した後、 該 バッファーをデカンテ一シヨンにより取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した。 基質 （R&D社製、 #DY999) を、 各ゥエルに 1 0 0 Lの割合で添加 ·混合し、 反応を 開始した。
約 1 0分間室温で放置し、 ストップ溶液 (2N ¾ S04水溶液）を各ゥヱルに 5 0 /i Lの 割合で添加し、 反応を停止した。 反応停止後 3 0分以内に 4 5 O nmの吸光度を測定し た。 （以上、 本発明方法の第四工程に相当する） その結果を図 8に示した。 溶液 A、 溶液 B、 及び溶液 Cでは、 溶液 Dに比べて吸光 度の増: ¾口がみられた。 またその強度はゲノム D N Aの濃度に依存して増加した。 本実験において、 メチルシトシン抗体と、 メチル化された D N Aフラグメントと、 固定化した 5， 末端ビォチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成.選択し、 複 合体中の F I T Cを、 その機能により定量'検出することにより、 D NAフラグメン トの検出 ·定量が可能であることが明らかとなり、 ゲノム D NAの検出 ·定量が可能 であることが明らかとなった。 実施例 9
市販のメチルシトシン抗体 （Aviva Systems Biology社製） を、 市販ピオチン化キ ット （Biotin Labeling Kit- NH2、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載さ れた方法に準じて、 ピオチン標識した。 得られたビォチン標識メチルシトシン抗体を 0. 25 μ §/ μ ί 0. 1% BSA含有リン酸バッファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) 溶液として冷蔵保存した。
合成して得られたビォチン標識メチルシトシン抗体の 0. 5 μ g/mLO. 1% BSA含有リン 酸バッファー （ImM KH2 P04、 3raM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) 溶液を調製し、 これを各 1 0 0 Lの割合でストレプトァビジン被覆済み 8ウェルストリップ （
Perkin Elmer社製） に添加し、 約 1時間室温で放置してゥヱルに固定化した。 その後 、 溶液をピペッティングにより取り除き、 2 0 0 Lの洗浄バッファー [0. 05% Tween20含有リン酸バッファー （ImM K P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) ]を添加した後、 該バッファーをデカンテーシヨンにより取り除いた。 この操作を更 に 2回繰り返した （以上、 本発明方法で使用する固定ィヒメチルイ匕 D N A抗体の調製に 相当する） 。
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノム D N Aについて、 以下の溶液を 夫々 2連で調製した。
溶液 A ： ヒト血液由来ゲ、ノム DNA 100ng/5 μ ΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 Β ：ヒト血液由来 ノム DNA 10ng/5 i L T Eバッファー溶液
溶液 C ： ヒト血液由来ゲノム DNA lng/5 μ ΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 D： Τ Εバッファ一溶液 （ネガテイブコント口ール液） 上記の調製した夫々の溶液を 5 Lと、 制限酵素 M s ρ Iを 4 Uと、 M s ρ Iに最 適な 1 0 X緩衝液 （lOOmM Tris-HCl pH 7. 5、 lOOraM MgCl2、 lOmM Dithiothreitol, 500mM NaCl) 2 μ 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 2 0 μ 1としたも のを調製した。 該反応液を、 37°Cにて 1時間インキュベーションした。
得られた夫々の反応液を 2 0 μ Lと、 Sssl methyl ase (NEB社製）を 0 . 5 μ 1と、 1 0 xNEBuffer2 (NEB社製）を 5 と、 3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製）を 0. 5 μ 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 1としたものを調製 した。 該反応液を、 37°Cにて 30分間インキュベーションした（以上、 本発明方法の 第一工程に相当する）。
ヒトトランスポゾンとして知られる A 1 u領域に設計された配列番号 39で示され る目的とする D N A領域からなるオリゴヌクレオチド W (Genbank Accession No. A F 4581 10等に示される塩基番号 178-262に相当する領域） と相補性により結合 可能な配列番号 40で示される塩基配列からなる 5 ' 末端 F I TC標識オリゴヌタレ ォチド F 6を合成し、 0.02 μΜの Tris_HClバッファー （10 mM) 溶液を調製した。
<目的とする DNA領域からなるオリゴヌクレオチド>
W： 5' -
CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGT AGACCATCC-3' (配列番号 39)
< 5， 末端 F I T C標識ォリゴヌクレオチド >
F 6 : 5' - GGATGGTCTCGATCTCCTGAC -3， （配列番号 40) 得られた夫々の反応液について、 以下の処理を施した。
PCRチューブに、 前記で調製した反応液 40 しと、 前記の 5' 末端 F I TC標 識オリゴヌクレオチド溶液 10 Lと、 緩衝液 （330mM Tris-Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithiothreitol) を l O^ Lと、 100 mM MgCl2溶液 1 0 と、 1 mg/mL BSA溶液 10 / Lを添カ卩し、 更に該混合物に滅菌超純水を加えて液 量を 100 Lとし、 混合した。 その後、 本 PC Rチューブを 95 °Cで 10分間加熱 し、 70°Cまで速やかに冷却し、 その温度で 10分間保温した。 次いで、 50°Cまで 冷却し 10分間保温し、 更に 37 °Cで 10分間保温した後、 室温に戻し、 5' 末端 F I T C標識ォリゴヌクレオチドと D N Aフラグメントとの結合体の形成を促した（以 上、 本発明方法の第二工程に相当する）。 前記のビォチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトァビジン被覆済 み 8ウェルストリップに、 前記で調製した D NAフラグメントの反応液 1 0 0 ^i Lを 加え、 室温で 1時間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 2 0 0 IX Lの洗浄バッファー [0. 05% Tween20含有リン酸バッファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) ]を添加した後、 該パッファーをピペッティングに より取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した （以上、 本発明方法の第三工程に相 当する） 。
その後、 H R P標識 F I T C抗体溶液 [Jackson ImmunoResearch Laboratories社製 、 0. 005 M g/100 /i L 0. 1% BSA含有リン酸バッファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 7H20 、 154mM NaCl pH7. 4) 溶液]を各ゥュルに 1 0 0 Lの割合で添加後、 1時間室温で放 置した。 放置後、 各ゥエルを 2 0 0 Lの洗浄バッファー [0. 05% Tween20含有リン酸 バッファー （ImM KH2P0い 3raM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) ]を添カ卩した後、 該 バッファーをデカンテーシヨンにより取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した。 基質 （R&D社製、 #DY999) を、 各ゥ mルに 1 0 0 の割合で添加 ·混合し、 反応を 開女台した。
≠ 8分間室温で放置し、 ストツプ溶液 （2Ν H2 S04水溶液）を各ゥヱルに 5 0 / Lの割 合で添加し、 反応を停止した。 反応停止後 3 0分以内に 4 5 O nmの吸光度を測定した 。 （以上、 本発明方法の第四工程に相当する） その結果を図 9に示した。 溶液 A、 溶液 B、 及び溶液 Cでは、 溶液 Dに比べて吸光 度の増加がみられた。 またその強度はゲノム D N Aの濃度に依存して增加した。 本実験において、 メチルシトシン抗体と、 メチルイ匕された D N Aフラグメントと、 固定化した 5， 末端ビォチン標識ォリゴヌクレオチドとの複合体を形成 '選択し、 複 合体中の F I T Cを、 その機能により定量'検出することにより、 D NAフラグメン トの検出 ·定量が可能であることが明らかとなり、 ゲノム D NAの検出 ·定量が可能 であることが明らかとなつた。 実施例 1 0 市販のメチルシトシン抗体 （Aviva Systems Biology社製） を、 巿販ビォチン化キ ット （Biotin Labeling Kit- NH2、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載さ れた方法に準じて、 ビォチン標識した。 得られたピオチン標識メチルシトシン抗体を 0. 25 β Ε/ μ Ι 0. 1% BSA含有リン酸バッファー （ImM K¾ P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl PH7. 4) 溶液として冷蔵保存した。
合成して得られたピオチン標識メチルシトシン抗体の 0. 5 μ g/mLO. 1% BSA含有リン 酸バッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) 溶液を調製し、 これを各 1 0 0 ^ Lの割合でストレプトァビジン被覆済み 8ゥェルストリップ （ Perkin Elmer社製） に添加し、 約 1時間室温で放置してゥエルに固定化した。 その後 、 溶液をピペッティングにより取り除き、 2 0 0 Lの洗浄バッファー [0. 05%
Tween20含有リン酸バッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154raM NaCl pH7. 4) ]を添加した後、 該バッファーをデカンテーシヨンにより取り除いた。 この操作を更 に 2回繰り返した （以上、 本発明方法で使用する固定化メチル化 D N A抗体の調製に 相当する） 。
パン酵母酵母株 X 2 1 8 0— 1 Aを Y P D培地 （1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5. 6-6. 0) で、 濁度が 0D6。。 0. 6-1. 0 になるまで培養し、 10, 000xg で 10分間遠心して、 l x lO7の酵母細胞を調製した。 調製した酵母細胞から、 Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory) ίこ記载されてレヽるような、 ——般 的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、 バッファー A (1M ソルビトール、 0. 1M EDTA、 pH 7. 4) に 懸濁し、 0. 1% 2-メルカプトエタノール （終濃度 1 4 mM) 及ぴ 100U zymolase (10 mg/ml) を添加して、 溶液が透明になるまで 30° C で 1時間、 撹拌しながらインキュ ペートした。 550xgで 10分間遠心してプロトプラストを回収後、 バッファー B (50 mM Tris- HC1、 pH 7. 4、 20 mM EDTA) に懸濁してから、 ドデシル硫酸ナトリウムを 1 % (w/ v ) になるように加えた後、 65°Cで 30分間インキュベートした。 続いて、 体積 比 2/5量の 5M CH3 C00Kを添加して混和してから 30分間氷冷後、 15， 000xgで 30分間遠心 して上清を回収した。 回収した上清に体積比 1/10量の 3M CH3 C00Naと等量のイソプロ パノールを加えてよく混和し、 15，000xg 4 °Cで 30分間遠心して得られた沈澱を 7 0 o/0エタノールでリンスして回収した。 沈澱を乾燥させてから、 1 ml の TEバッファー (10 mM Tris - HC1、 pH 8.0、 1 mM EDTA) に溶解し、 40 g/mlになるように RN a s e A (Sigma社製） を加えて 3 7。Cで 1時間インキュベートし、 続いて、 混合液に proteinase K (Sigma社製） を 5 00 μ g/m 1及びドデシル硫酸ナトリウムを 1 % (w/v) になるように加えた後、 これを 5 5°Cで約 1 6時間振とうした。 振とう終 了後、 該混合物をフエノール [1M Tris_HCl (pH 8. θ) にて飽和] 'クロ口ホルム抽出 処理した。 水層を回収し、 これに N a C lを 0. 5 Nとなるよう加えた後、 これをェ タノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。 回収された沈澱を 7 0%エタノールで リンスすることにより、 ゲノム DN Aを得た。
得られた酵母ゲノム DNAから、 以下の配列番号 2 7及び配列番号 2 8で示される P CRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー （P F 3及ぴ PR 3) 及ぴ 反応条件を用いて P CRを行うことにより、 供試サンプルとして用いられる DNAフ ラグメント （S、 配列番号 2 9、 Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母 染色体 VIIの塩基番号 271743- 272083に相当する領域） を増幅した。 く P C Rのために設計されたォリゴヌクレオチドプライマ一 >
PF3 : 5' - AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号 2 7)
PR 3 : 5， - AGACATGTGCTCACGTACGGT -3， （配列番号 2 8) く DNAフラグメント〉
S： 5' -
Figure imgf000097_0001
TTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (配列番号 2 9)
P CRの反応液としては、 铸型とするゲノム DNAを 10n gと、 5μΜの上記プラ イマ一溶液各 3 i lと、 each 2 mM dNTPを 5 μ1と、 1 0 X緩衝液（lOOmM Tris - HC1 pH 8.3、 500mM KC1、 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 1と、 耐熱性 D NAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold) 511/^1を0. 25 ^ 1とを混合し、 これに滅菌 超純水を加えて液量を 50 μ 1としたものを用いた。 該反応液を、 95°Cにて 1 0分 間保温した後、 9 5 °Cにて 20秒間次いで 58 °Cにて 30秒間更に 72 °Cにて 30秒 間を 1サイクルとする保温を 40サイクル行う条件で P C Rを行った。
PCRを行った後、 2%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、 Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） により、 D N Aフラグメント Sを精製した。 DNAフラグメント Sについて、 以下の溶液を夫々 2連で調製した。
溶液 A ： DNAフラタ、'メント S 10ng/20 Τ Εバッファ一溶液
溶液 Β ： DNAフラ メント S lng/20 /iL T Eバッファ一溶液
溶液 C ： DNAフラク、、 ト S 0. lng/20 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 D ： ΤΕバッファー溶液 （ネガティブコントロール液） 得られた夫々の溶液を 20 Lと、 Sssl methylase (NEB社製）を 0. 5 1と、 1 0 x EBuffer2 (NEB社製）を 5 と、 3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製）を 0 . 5 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 μ 1としたものを調製し た。 該反応液を、 37°Cにて 30分間インキュベーションした（以上、 本発明方法の第 —工程に相当する）。
配列番号 30で示される目的とする DNA領域からなるオリゴヌクレオチド S， に 相補性により結合可能な配列番号 3 1で示される塩基配列からなる 5 ' 末端 F I TC 標識オリゴヌクレオチド F 3を合成し、 0,02 の Tris- HC1バッファー (10 raM) を調製した。 く目的とする DNA領域からなるオリゴヌクレオチド >
S， ： 5, - TTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (配列番号 30) く 5 ' 末端 F I T C標識ォリゴヌクレオチド>
F 3 ： 5' - CTGGCCAAACTGGAGAT -3' (配列番号 3 1) また、 配列番号 30で示される目的とする DNA領域からなるオリゴヌクレオチド S' の負鎖に対して相補性により結合可能な、 配列番号 4 1、 配列番号 42、 配列番 号 43、 配列番号 44、 配列番号 45、 配列番号 46、 配列番号 47、 配列番号 48 、 配列番号 49、 及び配列番号 50で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌ クレオチド Cl、 C2、 C3、 C4、 C5、 C6、 C7、 C8、 C 9、 及び C 1 0を合成し、 夫々の濃度が 0. 0 1 である TEバッファー溶液を調製した。 くカウンターオリゴヌクレオチド>
C1 ： 5， ― AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3， （配列番号 41)
C2 ： 5， - GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA -3， (配列番号 42)
C3 ： 5， - CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC - 3， (配列番号 43)
C4 ： 5， - ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT - 3, (配列番号 44)
C5 ： 5， - GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT -3， (配列番号 45)
C6 ： 5， - TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC -3, (配列番号 46)
C7 ： 5， - ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT - 3， (配列番号 47)
C8 ： 5， - TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG -3' (配列番号 48)
C9 ： 5， - ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG -3, (配列番号 49)
C1 0 ： 5' - CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC -3' (配列番号 50) 得られた夫々の反応液について、 以下の処理を施した, PCRチューブに、 前記で調製した反応液 40 と、 前記の 5， 末端 F I TC標 識ォリゴヌクレオチド溶液 1 0 μ Lと、 前記の力ゥンターォリゴヌクレオチド溶液 1 0 しと、 緩衝液 (330mM Tris - Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAcい 5mM Dithiothreitol) を l O ^ Lと、 1 00 mM MgCl2溶液 1 0 と、 1 mg/mL BSA溶液 1 0 しを添加し、 更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 1 00 μ Lとし、 混合 した。 その後、 本 PCRチューブを 9 5°Cで 1 0分間加熱し、 70°Cまで速やかに冷 却し、 その温度で 1 0分間保温した。 次いで、 50°Cまで冷却し 1 0分間保温し、 更 に 3 7 °Cで 1 0分間保温した後、 室温に戻し、 5 ' 末端 F I T C標識ォリゴヌクレオ チドと DN Aフラグメントとの結合体の形成を促した（以上、 本発明方法の第二工程 に相当する）。
前記のピオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトァビジン被覆済 み 8ウェルストリップに、 前記で調製した DN Aフラグメントの反応液 1 0 0 ZLを 加え、 室温で 1時間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 2 0 0 μ L·の洗浄パッファー [0.05% Tween20含有リン酸パッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 該バッファーをピペッティングに より取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した （以上、 本発明方法の第三工程に相 当する） 。
その後、 HRP標識 F I TC抗体溶液 [Jackson ImmunoResearch Laboratories社製 、 0. OOS/zg/lOO iL 0.1% BSA含有リン酸バッファー （ImM K¾P04、 3mM Na2HP0 7H20 、 154mM NaCl pH7.4) 溶液]を各ゥエルに 1 00 / Lの割合で添加後、 1時間室温で放 置した。 放置後、 各ゥヱルを 20 0 I Lの洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸 ノ ッファー （lmM KH2P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 該 バッファーをデカンテーシヨンにより取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した。 基質 （R&D社製、 #DY999) を、 各ゥエルに 1 00 の割合で添加 ·混合し、 反応を 開始した。
約 30分間室温で放置し、 ストツプ溶液 （2Ν H2 S04水溶液）を各ゥヱルに 50 μ Lの 割合で添加し、 反応を停止した。 反応停止後 30分以内に 4 5 Onmの吸光度を測定し た。 （以上、 本発明方法の第四工程に相当する） その結果を図 1 0に示した。 溶液 A、 溶液 B、 及び溶液 Cでは、 溶液 Dに比べて吸 光度の增加がみられた。 またその強度は D N Aフラグメントの濃度に依存して増加し た。
本実験において、 メチルシトシン抗体と、 メチルイヒされた D N Aフラグメントと、 固定ィヒした 5， 末端ピオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成 ·選択し、 複 合体中の F I T Cを、 その機能により定量'検出することにより、 D NAフラグメン トの検出 ·定量が可能であることが明らかとなった。 実施例 1 1
市販のメチルシトシン抗体 （Aviva Systems Biology社製） を、 市販ビォチン化キ ット （Biotin Labeling Kit - NH2、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載さ れた方法に準じて、 ピオチン標識した。 得られたビォチン標識メチルシトシン抗体を 0. 25 μ g/ μ L 0. 1% BSA含有リン酸バッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) 溶液として冷蔵保存した。
合成して得られたビォチン標識メチルシトシン抗体の 0. 5 u g/mLO. 1% BSA含有リン 酸バッファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154πιΜ NaCl pH7. 4) 溶液を調製し、 これを各 1 0 0 /i Lの割合でストレプトァビジン被覆済み 8ゥェルストリップ （ Perkin Elmer社製） に添加し、 約 1時間室温で放置してゥエルに固定ィヒした。 その後 、 溶液をピペッティングにより取り除き、 2 0◦ μ Lの洗浄バッファー [0. 05%
TVeen20含有リン酸バッファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154raM NaCl pH7. 4) ]を添力 Πした後、 該バッファーをデカンテーシヨンにより取り除いた。 この操作を更 に 2回繰り返した （以上、 本発明方法で使用する固定ィヒメチルイヒ D N A抗体の調製に 相当する） 。
パン酵母株 X 2 1 8 0 - 1 Aを Y P D培地 （1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5. 6-6. 0) で、 濁度が 0D6。。 0. 6-1. 0 になるまで培養し、 10， 000xgで 10 分間遠心して、 l x lO7の酵母細胞を調製した。 調製した酵母細胞から、 Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、 一般的 な酵母ゲノムの調製法を用レヽて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、 バッファー A (1M ソルビトール、 0.1M EDTA、 pH 7.4) に 懸濁し、 0.1°/。 2-メルカプトエタノール （終濃度 14mM) 及び 100U zymolase (10 rag/ml) を添加して、 溶液が透明になるまで 30° Cで 1時間、 撹拌しながらインキュ ペートした。 550xgで 10分間遠心してプロトプラストを回収後、 バッファー B (50 mM Tris_HCl、 pH 7.4、 20 mM EDTA) に懸濁してから、 ドデシル硫酸ナトリウムを 1 %
( /v) になるように加えた後、 65°Cで 30分間インキュベートした。 続いて、 体積 比 2/5量の 5M CH3 C00Kを添加して混和してから 30分間氷冷後、 15， OOOxgで 30分間遠心 して上清を回収した。 回収した上清に体積比 1八 0量の 3M CH3C00Naと等量のイソプロ パノールを加えてよく混和し、 15， OOOxg 4 °Cで 30分間遠心して得られた沈澱を 70 %エタノールでリンスして回収した。 沈澱を乾燥させてから、 1 ml の TEバッファー (10 mM Tris - HC1、 pH 8.0、 1 mM EDTA) に溶解し、 g/mlになるように RN a s e A (Sigma社製） を加えて 37 °Cで 1時間インキュベートし、 続いて、 混合液に proteinase K (Sigma社製） を 500 μ g/m 1及びドデシル硫酸ナトリウムを 1 % (w/v) になるように加えた後、 これを 55。Cで約 16時間振とうした。 振とう終 了後、 該混合物をフエノール [1M Tris- HC1 (pH 8.0) にて飽和] 'クロ口ホルム抽出 処理した。 水層を回収し、 これに NaC lを 0. 5 Nとなるよう加えた後、 これをェ タノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。 回収された沈澱を 70%エタノールで リンスすることにより、 ゲノム DN Aを得た。
得られた酵母ゲノム DNAから、 以下の酉己列番号 27及び配列番号 28で示される PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 (PF 3及び PR 3) 及び 反応条件を用いて PCRを行うことにより、 供試サンプルとして用いられる DNAフ ラグメント （S、 配列番号 29、 Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母 染色体 VIIの塩基番号 271743- 272083に相当する領域） を増幅した。 く P CRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 > ' PF 3 : 5， - AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号 27)
PR 3 : 5' - AGACATGTGCTCACGTACGGT -3' (配列番号 28 ) く DNAフラグメント >
S ： 5' -
Figure imgf000103_0001
TTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (配列番号 2 9) P CRの反応液としては、 铸型とするゲノム DNAを 10n gと、 5μΜの上記プラ イマ一溶液各 3 μ ΐ と、 each 2 mM (1^^丁 を5 1と、 1 0 X緩衝液（lOOraM Tris-HCl H 8.3、 500mM KC1、 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 1 と、 而ォ熱性 D NAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold) 5U/ i lを 0. 2 5 μ 1 とを混合し、 これに滅菌 超純水を加えて液量を 5 0 μ 1 としたものを用いた。 該反応液を、 9 5°Cにて 1 0分 間保温した後、 9 5 °Cにて 2 0秒間次いで 5 8 °Cにて 3 0秒間更に 7 2 °Cにて 3 0秒 間を 1サイクルとする保温を 4 0サイクル行う条件で P CRを行った。
P CRを行った後、 2%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、 Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） により、 D N Aフラグメント Sを精製した。 DNAフラグメント Sについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 A ： DNAフラク"メント S 10ng/10 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 Β ： DNAフラ メント S lng/lO^L TEバッファー溶液
溶液 C ： T Eバッファ一溶液 （ネガティブコント口ール液） また、 得られた酵母ゲノム DNAから、 以下の配列番号 3 2及び配列番号 3 3で示 される P CRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー （P F 4及ぴ PR 4 ) 及び反応条件を用いて P C Rを行うことにより、 供試サンプノレとして用いられる D NAフラグメント （T、 配列番号 34、 Genbank Accession No. NC_001139等に示さ れる酵母染色体 VIIの塩基番号 384569 384685に相当する領域） を増幅した。 く P CRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 >
P F 4 ： 5' - GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号 32)
PR4 ： 5， - AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3' (配列番号 33)
<DNAフラグメント >
T ： 5' - GGACCTGTC TTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3 ' (配列番号 34)
PCRの反応液としては、 铸型とするゲノム DNAを 10n gと、 5μΜの上記プラ イマ一溶液各 3 1と、 each 2 mM (1 丁？を5 1と、 10 X緩衝液（lOOraM Tris-HCl pH 8,3、 500mM KC1、 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 μ 1と、 而熱性 D NAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold) 51Ι/μ1を 0. 25 μ ΐとを混合し、 これに滅菌 超純水を加えて液量を 50 1としたものを用いた。 該反応液を、 95°Cにて 10分 間保温した後、 95 °Cにて 20秒間次いで 58 °Cにて 30秒間更に 72 °Cにて 30秒 間を 1サイクルとする保温を 40サイクル行う条件で P C Rを行つた。
PCRを行った後、 2%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、 Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） により、 DNAフラグメント Tを精製した。
DNAフラグメント Tについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 A： DNAフラ ト T 10ng/10 Τ Εバッファ一溶液
溶液 Β ： DMフラク" ト T lng/10 1 Τ Εバッファ一溶液
溶液 C ： Τ Εバッファ一溶液 （ネガテイブコント口ール液) 前記に調製した DNAフラグメント Sの溶液 Αと DNAフラグメント Tの溶液 Aを DNAフラグメント Sの溶液 Bと DNAフラグメント Tの溶液 Bを、 DNAフラグ メント Sの溶液 Cと DN Aフラグメント Tの溶液 Cを、 夫々混合し、 以下に示す DN Aフラグメント混合溶液 MA〜MCを夫々 2連で調製した。
溶液 M A： 10ng/20 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 Μ Β ： lng/20 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 M C： Τ Εバッファ一溶液 （ネガテイブコント口ール液） 得られた夫々の溶液を 20 μ Lと、 Sssl methylase (NEB社製）を 0. 5 z 1と、 1 0 xNEBuffer2 (NEB社製）を 5 1と、 3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製）を 0 . 5 μ 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 1としたものを調製し た。 該反応液を、 37°Cにて 30分間インキュベーションした（以上、 本発明方法の第 一工程に相当する）。
配列番号 30で示される目的とする DNA領域からなるオリゴヌクレオチド S' に 相補性により結合可能な配列番号 31で示される塩基配列からなる 5 ' 末端 F I TC 標識オリゴヌクレオチド F 3を合成し、 0.02 μΜの Tris- H バッファー （10 ） 溶液を調製した。 く目的とする DNA領域からなるオリゴヌクレオチド >
S ' ： 5' -
Figure imgf000105_0001
TTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (配列番号 30)
【0002】
< 5， 末端 F I T C標識オリゴヌクレオチド>
F 3 ： 5' - AGACATGTGCTCACGTACGGT -3' (配列番号 31) また、 配列番号 30で示される目的とする DNA領域からなるオリゴヌクレオチド S， の負鎖に対して相補性により結合可能な、 配列番号 4 1、 配列番号 42、 配列番 号 43、 配列番号 44、 配列番号 45、 配列番号 46、 配列番号 4 7、 配列番号 48 、 配列番号 49、 及び配列番号 50で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌ クレオチド Cl、 C2、 C3、 C4、 C5、 C6、 C7、 C8、 C 9、 及び C 1 0を合成し、 夫々の濃度が 0· 0 1 である ΤΕバッファー溶液を調製した。
<カウンターオリゴヌクレオチド>
C1 ： 5， - AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号 4 1)
C2 ： 5， - GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA -3， (配列番号 4 2)
C3 ： 5， - CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC -3' (配列番号 4 3)
C4 ： 5， - ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT - 3, (配列番号 4 4)
C5 ： 5， - GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT -3, (配列番号 4 5)
C6 ： 5， - TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC -35 (配列番号 4 6)
C7 ： 5， - ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT -3' (配列番号 47)
C8 ： 5， - TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG -3' (配列番号 4 8)
C9 ： 5' - ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG —3, (配列番号 4 9)
C10 : 5， - CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC -3， （配列番号 50) 得られた夫々の反応液について、 以下の処理を施した。
PCRチューブに、 前記で調製した反応液 40 しと、 前記の 5' 末端 F I TC標 識ォリゴヌクレオチド溶液 1 0 Lと、 前記の力ゥンターオリゴヌクレオチド溶液 1 0 iLと、 緩衝液 （330mM Tris- Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOraM MgOAc2、 5mM Dithiothreitol) を l O ^ Lと、 1 00 mM MgCl2溶 ί夜 1 0 しと、 1 mg/mL BSA溶液 1 0 を添加し、 更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 1 00 Lとし、 混合 した。 その後、 本 PCRチューブを 9 5°Cで 1 0分間加熱し、 70°Cまで速やかに冷 却し、 その温度で 1 0分間保温した。 次いで、 5 0°Cまで冷却し 1 0分間保温し、 更 に 3 7。Cで 1 0分間保温した後、 室温に戻し、 5 ' 末端 F I TC標識オリゴヌクレオ チドと DNAフラグメントとの結合体の形成を促した（以上、 本発明方法の第二工程 に相当する）。
前記のビォチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトァビジン被覆済 み 8ウェルストリップに、 前記で調製した D N Aフラグメントの反応液 1 0 0 しを 加え、 室温で 1時間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 2 0 0 Lの洗浄バッファー [0. 05% Tween20含有リン酸パッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) ]を添加した後、 該バッファーをピペッティングに より取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した （以上、 本発明方法の第三工程に相 当する） 。
その後、 H R P標識 F I T C抗体溶液 [Jackson ImmunoResearch Laboratories社製 , Ο. ΟΟδ μ g/100 μ ΐ 0. 1% BSA含有リン酸バッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20 、 154mM NaCl pH7. 4) 溶液]を各ゥヱルに 1 0 0 / Lの割合で添加後、 1時間室温で放 置した。 放置後、 各ゥヱルを 2 0 0 M Lの洗浄バッファー [0. 05% Tween20含有リン酸 バッファー (ImM KH2 P04、 3nM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) ]を添加した後、 該 バッファーをデカンテーシヨンにより取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した。 基質 （R&D社製、 #DY999) を、 各ゥエルに 1 0 0 ^u Lの割合で添加 ·混合し、 反応を開 台した。
約 6 0分間室温で放置し、 ストップ溶液 （2Ν H2 S04水溶液）を各ゥエルに 5 0 μ Lの割 合で添加し、 反応を停止した。 反応停止後 3 0分以内に 4 5 O nmの吸光度を測定した 。 （以上、 本発明方法の第四工程に相当する） その結果を図 1 1に示した。 溶液 MA、 及び溶液 M Bでは、 溶液 M Cに比べて吸光 度の増加がみられた。 またその強度は D N Aフラグメントの濃度に依存して増加した 本実験において、 メチルシトシン抗体と、 メチルイ匕された D N Aフラグメントと、 固定化した 5 ' 末端ピオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成 ·選択し、 複 合体中の F I T Cを、 その機能により定量 '検出することにより、 D N Aフラグメン トの検出 ·定量が可能であることが明らかとなった。 実施例 1 2
市販のメチルシトシン抗体 （Aviva Systems Biology社製） を、 市販ピオチン化キ ット （Biotin Label ing Kit-NH2、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載さ れた方法に準じて、 ピオチン標識した。 得られたビォチン標識メチルシトシン抗体を 0. 25 μ g/ ^ L 0. 1% BSA含有リン酸バッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) 溶液として冷蔵保存した。
合成して得られたピオチン標識メチルシ 1、シン抗体の 0. 5 μ g/mLO. 1% BSA含有リン 酸バッファー （ImM KH2 P04、 3niM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) 溶液を調製し、 これを各 1 0 0 μ Lの割合でストレプトアビジン被覆済み 8ゥェルストリップ （ Perkin Elmer社製） に添加し、 約 1時間室温で放置してゥヱルに固定ィ匕した。 その後 、 溶液をピペッティングにより取り除き、 2 0 0 ^ Lの洗浄バッファー [0. 05% TVeen20含有リン酸バッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) ]を添カ卩した後、 該バッファーをデカンテーシヨンにより取り除いた。 この操作を更 に 2回繰り返した （以上、 本発明方法で使用する固定化メチルイヒ D N A抗体の調製に 相当する） 。
パン酵母酵母株 X 2 1 8 0 - 1 Aを Y P D培地 （1% Yeast extract, 2% Peptoneヽ 2% Glucose, pH 5. 6-6. 0) で、 濁度が 0D6。。 0. 6-1. 0 になるまで培養し、 10， 000xg で 10分間遠心して、 I x lO7の酵母細胞を調製した。 調製した酵母細胞から、 Methods in Yeast Geneti cs (Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、 一般 的な酵母ゲノムの調製法を用レ、て酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、 バッファー A (1M ソルビトール、 0, 1M EDTA、 pH 7. 4) に 懸濁し、 0. 1% 2-メルカプトエタノール （終濃度 1 4 mM) 及び 100U zymolase (10 mg/ml) を添加して、 溶液が透明になるまで 30° C で 1時間、 撹拌しながらインキュ ペートした。 550xgで 10分間遠心してプロトプラストを回収後、 バッファー B (50 mM Tris- HC1、 pH 7. 4、 20 mM EDTA) に懸濁してから、 ドデシル硫酸ナトリウムを 1 % ( w/ v ) になるように加えた後、 65°Cで 30分間インキュベートした。 続いて、 体積 比 2/5量の 5M C C00Kを添加して混和してから 30分間氷冷後、 15， 000xgで 30分間遠心 して上清を回収した。 回収した上清に体積比 1/10量の 3M CH3 C00Naと等量のイソプロ パノールを加えてよく混和し、 15，000xg 4 °Cで 30分間遠心して得られた沈澱を 70 o/0エタノールでリンスして回収した。 沈澱を乾燥させてから、 1ml の TEバッファー (10 raM Tris- HC1、 pH 8.0、 1 mM EDTA) に溶解し、 40μ g/mlになるように RN a s e A (Sigma社製） を加えて 37 °Cで 1時間インキュベートし、 続いて、 混合液に proteinase K (Sigma社製） を 500 g/m 1及ぴドデシル硫酸ナトリウムを 1 % (w/v) になるように加えた後、 これを 55°Cで約 16時間振とうした。 振とう終 了後、 該混合物をフヱノール [1M Tris-HCl (pH 8.0) にて飽和] ·クロ口ホルム抽出 処理した。 水層を回収し、 これに Na C lを 0. 5 Nとなるよう加えた後、 これをェ タノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。 回収された沈澱を 70 %エタノールで リンスすることにより、 ゲノム DN Aを得た。
得られた酵母ゲノム DNAから、 以下の配列番号 27及び配列番号 28で示される PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー （PF 3及び PR 3) 及び 反応条件を用いて PCRを行うことにより、 供試サンプルとして用いられる DNAフ ラグメント （S、 配列番号 29、 Genbank Accession No. NCJ301139等に示される酵母 染色体 VIIの塩基番号 271743-272083に相当する領域） を増幅した。 く PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 >
PF 3 : 5， - AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号 27)
PR 3 : 5， - AGACATGTGCTCACGTACGGT -3' (配列番号 28) く DNAフラグメント〉
S ： 5' -
Figure imgf000109_0001
TTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (配列番号 29) PCRの反応液としては、 鎳型とするゲノム DNAを 10n gと、 5/iMの上記プラ イマ一溶液各 3 μ 1 と、 each 2 mM dNTPを 5 μ1と、 10 X緩衝液（lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KC1、 15mM MgClい 0.01% Gelatin)を 5 μ 1と、 而ォ熱性 D NAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold) 511/μΙを Ο. 25 μ 1 とを混合し、 これに滅菌 超純水を加えて液量を 50 1 としたものを用いた。 該反応液を、 95°Cにて 1 0分 間保温した後、 95°Cにて 20秒間次いで 58°Cにて 30秒間更に 12°Cにて 30秒 間を 1サイクルとする保温を 40サイクル行う条件で P C Rを行つた。
PCRを行った後、 2%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、 Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） により、 DNAフラグメント Sを精製した。
DNAフラグメント Sについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 A： DNAフラタ、、メント S 10ng/10 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 Β ： DNAフラ 、メント S lng/10 μ L Τ Εバッファ一溶液
溶液 C ： DNAフラタ"メント S Τ Εバッファ一溶液 （ネガティブコント口ール液） また、 得られた酵母ゲノム DNAから、 以下の配列番号 32及び配列番号 33で示 される PC Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー （PF 4及び PR 4 ) 及び反応条件を用いて PCRを行うことにより、 供試サンプルとして用いられる D NAフラグメント （T、 配列番号 34、 Genbank Accession No. NC_001139等に示さ れる酵母染色体 VIIの塩基番号 384569- 384685に相当する領域） を増幅した。 く PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー >
P F 4 ： 5' - GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3， （配列番号 32)
PR 4 : 5， - AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3' (配列番号 33)
<DNAフラグメント >
T： 5' - TTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3' (配列番号 34)
PCRの反応液としては、 铸型とするゲノム DNAを 10n gと、 5μΜの上記プラ イマ一溶液各 3 1と、 each 2 mM (11^丁？を5 1と、 10 X緩衝液（lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500πιΜ KC1、 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 μ 1と、 而ォ熱性 D NAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold) 5υ/μ1を 0. 25 μ 1とを混合し、 これに滅菌 超純水を加えて液量を 50 1としたものを用いた。 該反応液を、 95°Cにて 10分 間保温した後、 95 °Cにて 20秒間次いで 58 °Cにて 30秒間更に 72 °Cにて 30秒 間を 1サイクルとする保温を 40サイクル行う条件で P CRを行った。
PCRを行った後、 2%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、 Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） により、 D N Aフラグメント Tを精製した。
DNAフラグメント Τについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 A： DNAフラタ、'メント T 10ng/10 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 Β ： DNAフラ メント T lng/lO/zL TEバッファー溶液
溶液 C： T Eバッファ一溶液 (ネガティブコント口ール液） 前記に調製した DNAフラグメント Sの溶液 Aと DNAフラグメント Tの溶液 Aを 、 DNAフラグメント Sの溶液 Bと DNAフラグメント Tの溶液 Bを、 DNAフラグ メント Sの溶液 Cと DNAフラグメント Tの溶液 Cを、 夫々混合し、 以下に示す DN Aフラグメント混合溶液 MA〜MCを夫々 2連で調製した。
溶液 M A： 10ng/20 uL T Eバッファ一溶液
溶液 M B ： lng/20 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 M C： Τ Εバッファ一溶液 （ネガティブコント口ール液） 得られた夫々の溶液を 20 μ Lと、 Sssl methylase (NEB社製）を 0. 5 μ 1と、 1 0 NEBuffer2 (NEB社製）を 5 μΐと、 3.2 raM S - adenosyl methionine (NEB社製）を 0 . 5 μ 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 μ 1としたものを調製し た。 該反応液を、 37°Cにて 30分間インキュベ シヨンした（以上、 本発明方法の第 一工程に相当する）。
配列番号 35で示される目的とする DN A領域からなるオリゴヌクレオチド T' に 相補性により結合可能な配列番号 36で示される塩基配列からなる 5， 末端 F I TC 標識ォリゴヌクレオチド F 4を合成し、 0.02 μ Μの Tris HC1バッファー (10 mM) 溶液を調製した。 く目的とする DNA領域からなるオリゴヌクレオチド〉
T' ： 5， —
TTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3' (配列番号 35) く 5， 末端 F I T C標識オリゴヌクレオチド〉
F 4 : 5， - AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3 ' (配列番号 36) また、 配列番号 35で示される目的とする DN A領域からなるオリゴヌクレオチド T' の負鎖に対して相補性により結合可能な、 配列番号 51、 配列番号 52、 配列番 号 53、 及び配列番号 54で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチ ド C1 1、 C12、 C13、 及び C14を合成し、 夫々の濃度が 0. 01 Μである TE バッファ一溶液を調製した。
<カウンターオリゴヌクレオチド>
CI 1 ： 5' - GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号 51)
C12 ： 5' - AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3' (配列番号 52)
C13 ： 5' - ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3' (配列番号 53)
C14 : 5， - CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC- 3， （配列番号 54) 得られた夫々の反応液について、 以下の処理を施した； PCRチューブに、 前記で調製した反応液 40 と、 前記の 5' 末端 F I TC標 識ォリゴヌクレオチド溶液 1 0 Lと、 前記の力ゥンターオリゴヌクレオチド溶液 1 0 /zLと、 緩衝液 （330mM Tris- Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithiothreitol) を l O ^u Lと、 1 00 mM MgCl2溶液 1 0 と、 1 mg/niL BSA溶液 10 μ Lを添加し、 更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 1 00 Lとし、 混合 した。 その後、 本 PCRチューブを 9 5°Cで 1 0分間加熱し、 70°Cまで速やかに冷 却し、 その温度で 1 0分間保温した。 次いで、 50°Cまで冷却し 1 0分間保温し、 更 に 37°Cで 1 0分間保温した後、 室温に戻し、 5， 末端 F I TC標識オリゴヌクレオ チドと DN Aフラグメントとの結合体の形成を促した（以上、 本発明方法の第二工程 に相当する）。
前記のビォチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトァビジン被覆済 み 8ウェルストリップに、 前記で調製した DN Aフラグメントの反応液 1 00 μしを 加え、 室温で 1時間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 20 0 / Lの洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファー （IraM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 該バッファーをピペッティングに より取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した （以上、 本発明方法の第三工程に相 当する） 。
その後、 HRP標識 F I TC抗体溶液 [Jackson ImmunoResearch Laboratories社製 、 0. OOS.ug/lOO^L 0.1% BSA含有リン酸バッファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 7H20 、 154mM NaCl pH7.4) 溶液]を各ゥエルに 1 00 μ Lの割合で添加後、 1時間室温で放 置した。 放置後、 各ゥエルを 200 Lの洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸 バッファー （lmM KH2P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 該 バッファーをデカンテーションにより取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した。 基質 （R&D社製、 #DY999) を、 各ゥエルに 1 00 の割合で添加'混合し、 反応を 開始した。
約 6 0分間室温で放置し、 ストップ溶液 （2N H2S04水溶液）を各ゥエルに 50 しの 割合で添加し、 反応を停止した。 反応停止後 30分以内に 45 Onmの吸光度を測定し た。 （以上、 本発明方法の第四工程に相当する） その結果を図 1 2に示した。 溶液 MA、 及び溶液 MBでは、 溶液 MCに比べて吸光 度の増加がみられた。 またその強度は D N Aフラグメントの濃度に依存して増加した 本実験において、 メチルシトシン抗体と、 メチル化された D N Aフラグメントと、 固定ィヒした 5 ' 末端ビォチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成'選択し、 複 合体中の F I T Cを、 その機能により定量'検出することにより、 D NAフラグメン トの検出 ·定量が可能であることが明らかとなった。 実施例 1 3
市販のメチルシトシン抗体 (Aviva Systems Biology社-製) を、 市販ピオチン化キ ット （Biotin Labeling Kit- NH2、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載さ れた方法に準じて、 ピオチン標識した。 得られたビォチン標識メチルシトシン抗体を 0. 0. 1% BSA含有リン酸バッファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154raM NaCl pH7. 4) 溶液として冷蔵保存した。
合成して得られたピオチン標識メチルシトシン抗体の 0. 5 / g/raLO. 1% BSA含有リン 酸バッファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) 溶液を調製し、 これを各 1 0 0 Lの割合でストレプトァビジン被覆済み 8ゥェルストリップ （ Perkin Elmerネ ±¾) に添加し、 約 1時間室温で放置してゥヱルに固定化した。 その後 、 溶液をピペッティングにより取り除き、 2 0 0 μ Lの洗浄バッファー [0. 05%
Tween20含有リン酸バッファー （ImM K¾ P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) ]を添加した後、 該バッファーをデカンテーシヨンにより取り除いた。 この操作を更 に 2回繰り返した （以上、 本発明方法で使用する固定化メチル化 D N A抗体の調製に 相当する） 。
パン酵母株 X 2 1 8 0— 1 Aを Y P D培地 （1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5. 6-6. 0) で、 濁度が OD6 0 0 0. 6-1. 0 になるまで培養し、 10, 000xg で 10 分間遠心して、 l x lO7の酵母細胞を調製した。 調製した酵母細胞から、 Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、 一般的 な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、 バッファー A (1M ソルビトール、 0.1M EDTA、 pH 7.4) に 懸濁し、 0.1°/。 2 -メルカプトエタノール （終濃度 14mM) 及び 100U zymolase (10 rag/ml) を添加して、 溶液が透明になるまで 30° Cで 1時間、 撹拌しながらインキュ ペートした。 550xgで 10分間遠心してプロトプラストを回収後、 ノ ッファー B (50 mM Tris-HCl、 pH 7.4、 20 mM EDTA) に懸濁してから、 ドデシル硫酸ナトリウムを 1 %
( /v) になるように加えた後、 65°Cで 30分間インキュベートした。 続いて、 体積 比 2/5量の 5M CH3 C00Kを添加して混和してから 30分間氷冷後、 15， OOOxgで 30分間遠心 して上清を回収した。 回収した上清に体積比 1/10量の 3M CH3C00Naと等量のイソプロ ノ ノールを加えてよく混和し、 15， OOOxg 4 °Cで 30分間遠心して得られた沈澱を 70 %エタノールでリンスして回収した。 沈澱を乾燥させてから、 1ml の TEバッファー (10 mM Tris- HC1、 pH 8.0、 1 mM EDTA) に溶解し、 40^ g/mlになるように RN a s e A (Sigma社製） を加えて 37 °Cで 1時間インキュベートし、 続いて、 混合液に proteinase K (Sigma社製） を 500 μ g/m 1及ぴドデシル硫酸ナトリウムを 1 % (w/v) になるように加えた後、 これを 55 で約16時間振とうした。 振とう終 了後、 該混合物をフエノール [1M Tris- HC1 (pH 8.0) にて飽和] 'クロ口ホルム抽出 処理した。 水層を回収し、 これに Na C lを 0. 5 Nとなるよう加えた後、 これをェ タノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。 回収された沈澱を 70%エタノールで リンスすることにより、 ゲノム DN Aを得た。
得られた酵母ゲノム DNAから、 以下の配列番号 27及び配列番号 28で示される P CRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー （PF 3及び PR 3) 及び 反応条件を用いて PCRを行うことにより、 供試サンプルとして用いられる DNAフ ラグメント （S、 配列番号 29、 Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母 染色体 VIIの塩基番号 271743- 272083に相当する領域） を増幅した。 く PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 >
P F 3 : 5， - AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号 27)
PR 3 : 5， - AGACATGTGCTCACGTACGGT -3， （配列番号 28) く DNAフラグメント >
S ： 5' -
Figure imgf000116_0001
TTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (配列番号 29) PCRの反応液としては、 錶型とするゲノム DNAを 10n gと、 の上記プラ イマ一溶液各 3 μ ΐと、 each 2 mM <1]^丁？を5 1と、 10X緩衝液（lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KC1、 15mM MgClい 0.01% Gelatin)を 5 μ 1と、 耐熱性 D N Aポリメラーゼ （AmpliTaq Gold) 511/ 1を0. 25 1とを混合し、 これに滅菌 超純水を加えて液量を 50 1としたものを用いた。 該反応液を、 95°Cにて 10分 間保温した後、 95 °Cにて 20秒間次いで 58 °Cにて 30秒間更に 72 °Cにて 30秒 聞を 1サイクルとする保温を 40サイクル行う条件で PCRを行つた。
PCRを行った後、 2%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、 Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） により、 DNAフラグメント Sを精製した。 DNAフラグメント Sについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 A： DNAフラタ、、ノン 10ng/10 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 Β ： DNAフラ ト S lng/10 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 C： ΤΕバッファー溶液 （ネガティブコントロール液) また、 得られた酵母ゲノム DNAから、 以下の配列番号 32及ぴ配列番号 33で示 される PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー （PF 4及び PR 4 ) 及び反応条件を用いて PCRを行うことにより、 供試サンプルとして用いられる D NAフラグメント （T、 配列番号 34、 Genbank Accession No. NC— 001139等に示さ れる酵母染色体 VIIの塩基番号 384569- 384685に相当する領域） を増幅した。
<P CRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 >
P F 4 ： 5' 一 GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号 3 2)
PR 4 ： 5， - AGTACAGATCTGGCGTTCTCG - 3， （配列番号 3 3) く DNAフラグメント〉
T： 5' - GGACC1
TTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT — 3， （配列番号 34)
P CRの反応液としては、 铸型とするゲノム DNAを 10n gと、 5 zMの上記プラ イマ一溶液各 3 1と、 each 2 mM dNTPを 5 1と、 1 0 X緩衝液（lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500raM KC1、 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 μ 1と、 而ォ熱性 D NAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold) 5U/V1を 0. 2 5 μ 1とを混合し、 これに滅菌 超純水を加えて液量を 5 0 1としたものを用いた。 該反応液を、 9 5°Cにて 1 0分 間保温した後、 9 5°Cにて 20秒間次いで 5 8°Cにて 3 0秒間更に 7 2°Cにて 3 0秒 間を 1サイクルとする保温を 4◦サイクル行う条件で P C Rを行つた。
P CRを行った後、 2%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、 Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） により、 DNAフラグメント Tを精製した。
DNAフラグメント Tについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 A： DNAフラ 、メン 10ng/10 ixL T Eバッファ一溶液
溶液 B ： DNAフラ; Γメント T lng/10 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 C： Τ Εバッファ一溶液 （ネガティブコント口ール液) 前記に調製した DNAフラグメント Sの溶液 Αと DNAフラグメント Tの溶液 Aを DNAフラグメント Sの溶液 Bと DNAフラグメント Tの溶液 Bを、 DNAフラグ メント Sの溶液 Cと D N Aフラグメント Tの溶液 Cを、 夫々混合し、 以下に示す DN Aフラグメント混合溶液 M A〜！I Cを夫々 2連で調製した。
溶液 M A： 10ng/20 ΐ T Eバッファ一溶液
溶液 M B： lng/20 μΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 M C： Τ Εバッファ一溶液 （ネガテイブコント口ール液） 得られた夫々の溶液を 20 Lと、 Sssl methylase (NEB社製）を 0. 5 1と、 1 0 xNEBuffer2 (NEB社製）を 5 μ1と、 3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製）を 0 . 5 ^ 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 1としたものを調製し た。 該反応液を、 37°Cにて 30分間インキュベーションした（以上、 本発明方法の第 —工程に相当する）。
配列番号 30で示される目的とする D N A領域からなるオリゴヌクレオチド S ' に 相補性により結合可能な配列番号 31で示される塩基配列からなる 5， 末端 F I TC 標識オリゴヌクレオチド F 3を合成し、 また、 配列番号 35で示される目的とする D NA領域からなるオリゴヌクレオチド T' に相補性により結合可能な配列番号 36で 示される塩基配列からなる 5' 末端 F I TC標識オリゴヌクレオチド F 4を合成し、 夫々の濃度が 0.02 Mである Tris- HC1バッファー （10 mM) 溶液を調製した。 く目的とする DNA領域からなるオリゴヌクレオチド〉
S' ： 5' -
Figure imgf000118_0001
TTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (配列番号 30)
T' ： 5， 一
TTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT - 3， （配列番号 35) < 5， 末端 F I TC標識オリゴヌクレオチド >
F 3 ： 5' - AGACATGTGCTCACGTACGGT -3' (配列番号 3 1)
F 4 ： 5' - AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3' (配列番号 36) また、 酉 S列番号 30で示される目的とする D N A領域からなるオリゴヌクレオチド S' の負鎖に対して相補性により結合可能な、 配列番号 4 1、 配列番号 42、 配列番 号 43、 配列番号 44、 配列番号 45、 配列番号 46、 配列番号 4 7、 配列番号 48 、 配列番号 49、 及ぴ配列番号 50で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌ クレオチド Cl、 C2、 C3、 C4、 C5、 C6、 C7、 C8、 C 9、 及び CI Oを合成し、 また、 配列番号 3 5で示される目的とする DNA領域からなるオリゴヌクレオチド T ， の負鎖に対して相補性により結合可能な、 配列番号 5 1、 配列番号 5 2、 配列番号 53、 及び配列番号 54で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチド C1 1、 C1 2、 C1 3、 及ぴ C14を合成し、 夫々の濃度が 0. 0 1 である TEバ ッファー溶液を調製した。
<目的とする DNA領域からなるオリゴヌクレオチド〉
S， ： 5, -
Figure imgf000119_0001
TTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT - 3' (配列番号 30)
T， ： 5， 一
GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCC TTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3' (配列番号 3 5)
【0003】
くカウンターオリゴヌクレオチド > CI ： 5， - AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG - 3' (配列番号 41)
C2 ： 5' - GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA - 3， (配列番号 42)
C3 ： 5， 一 CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC - 3， (配列番号 43)
C4 ： 5， - ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT - 3， (配列番号 44)
C5 ： 5' - GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT - 3， (配列番号 45)
C6 ： 5， 一 TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC - 3， (配列番号 46)
C7 ： 5， ― ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT - 3， (配列番号 47)
C8 ： 5, 一 TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG -3， (配列番号 48)
C9 ： 5， 一 ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG - 3， (配列番号 49)
CI 0 ： 5， - CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC - 3' (配列番号 50)
CI 1 ： 5， - GGACCTGTGTTTGACGGGTAT - 3' (配列番号 51)
CI 2 ： 5， - AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3' (配列番号 52)
CI 3 ： 5， - ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT - 3' (配列番号 53)
CI 4 ： 5， - CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC-3 ' (配列番号 54)
【0004】
得られた夫々の反応液について、 以下の処理を施した。
PCRチューブに、 前記で調製した反応液 40 ^しと、 前記の 5， 末端 F I T C標 識ォリゴヌクレオチド溶液 10 /z Lと、 前記の力ゥンターォリゴヌクレオチド溶液 1 O^Lと、 緩衝液 （330mM Tris- Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithiothreitol) を l O ^u Lと、 100 mM MgCl2溶液 10 /x Lと、 1 mg/mL BSA溶液 10 を添加し、 更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 100 Lとし、 混合 した。 その後、 本 PCRチューブを 95°Cで 10分間加熱し、 70°Cまで速やかに冷 却し、 その温度で 10分間保温した。 次いで、 50°Cまで冷却し 10分間保温し、 更 に 37°Cで 10分間保温した後、 室温に戻し、 5， 末端 F I TC標識オリゴヌクレオ チドと DNAフラグメントとの結合体の形成を促した（以上、 本発明方法の第二工程 に相当する）。
前記のピオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトァビジン被覆済 み 8ウェルストリップに、 前記で調製した DN Aフラグメントの反応液 100 /iLを 加え、 室温で 1時間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 2 0 0 ^ Lの洗浄パッファー [0. 05% Tween20含有リン酸バッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154raM NaCl pH7. 4) ]を添加した後、 該バッファーをピペッティングに より取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した （以上、 本発明方法の第三工程に相 当する） 。
その後、 H R P標識 F I T C抗体溶液 [Jackson ImmunoResearch Laboratories社製 、 0. 005 μ g/100 μ L 0. 1% BSA含有リン酸バッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20 、 154mM NaCl pH7. 4) 溶液]を各ゥエルに 1 0 0 μ Lの割合で添加後、 1時間室温で放 置した。 放置後、 各ゥエルを 2 0 0 μ Lの洗浄バッファー [0. 05% Tween20含有リン酸 バッファー (ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 15械 NaCl pH7. 4) ]を添加した後、 該 バッファーをデカンテーシヨンにより取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した。 基質 （R&D社製、 #DY999) を、 各ゥ-ルに 1 0 0 の割合で添加 ·混合し、 反応を 開女合した。
約 6 0分間室温で放置し、 ストツプ溶液 （2N H2 S04水溶液）を各ゥヱルに 5 0 μ Lの 割合で添加し、 反応を停止した。 反応停止後 3 0分以内に 4 5 0 nmの吸光度を測定し た。 （以上、 本発明方法の第四工程に相当する） その結果を図 1 3に示した。 溶液 MA、 及び溶液 MBでは、 溶液 MCに比べて吸光 度の増加がみられた。 またその強度は D N Aフラグメントの濃度に依存して増加した 。
本実験において、 メチルシトシン抗体と、 メチル化された D NAフラグメントと、 固定化した 5， 末端ピオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成 '選択し、 複 合体中の F I T Cを、 その機能により定量'検出することにより、 D N Aフラグメン トの検出 ·定量が可能であることが明らかとなった。 実施例 1 4
市販のメチルシトシン抗体 （Aviva Systems Biology社製） を、 市販ピオチン化キ ット （Biotin Labeling Kit- H2、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記载さ れた方法に準じて、 ピオチン標識した。 得られたビォチン標識メチルシトシン抗体を
0.25 g/ ,u L 0. l°/o BSA含有リン酸バッファー （ImM KH2P0い 3mM Na2HP07H20、 154mM NaCl pH7.4) 溶液として冷蔵保存した。
合成して得られたビォチン標識メチルシトシン抗体の 0.5 μ g/mLO.1% BSA含有リン 酸バッファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7.4) 溶液を調製し、 これを各 100 μ Lの割合でストレプトァビジン被覆済み 8ゥヱルストリップ （ Perkin Elmer社製） に添加し、 約 1時間室温で放置してゥヱルに固定ィ匕した。 その後 、 溶液をピペッティングにより取り除き、 200 Lの洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファー （ImM K P04、 3mM Na2HP07H20, 154mM NaCl pH7.4) ]を添力 Pした後、 該バッファーをデカンテーシヨンにより取り除いた。 この操作を更 に 2回繰り返した （以上、 本発明方法で使用する固定化メチル化 DNA抗体の調製に 相当する） 。
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノム DNAについて、 以下の溶液を 夫々 2連で調製した。
溶液 A： ヒト血液由来ゲノム DNA 100ng/5;uL TEバッファー溶液
溶液 B ： ヒト血液由来 ノム DNA lOng/5/ L TEバッファー溶液
溶液 C ：ヒト血液由来 ノム DNA lng/5 μ L Τ Εバッファ一溶液
溶液 D： Τ Εバッファ一溶液 (ネガテイブコント口ール液） 上記の調製した夫々の溶液を 5 Lと、 制限酵素 X s p lを 10Uと、 X s p lに 最適な 10 X緩衝液 （200raM Tris-HCl pH 8.5、 lOOmM MgCl2、 lOmM Dithiothreitol 、 lOOOmM KC1) 2 μ 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 20 1とした ものを調製した。 該反応液を、 37°Cにて 1時間インキュベーションした。
得られた夫々の反応液を 20 μ Lと、 Sssl methylase (NEB社製）を 0. 5 1と、 10 NEBuffer2 (NEB社製）を 5 1と、 3.2 mM S - adenosyl methionine (NEB社製）を 0. 5 μ 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 μ 1としたものを調製 した。 該反応液を、 37°Cにて 30分間インキュベーションした（以上、 本努明方法の 第一工程に相当する）。 22 ヒトトランスポゾンとして知られる LINE1領域に設計された配列番号 3 7で示され る目的とする DNA領域からなるオリゴヌクレオチド Z (Genbank Accession No. M80340等に示される塩基番号 115-386に相当する領域） と相補性により結合可能な配 列番号 3 8で示される塩基配列からなる 5 ' 末端 F I TC標識オリゴヌクレオチド F 5を合成し、 0.02 μΜの Tris- H バッファー （10 ） 溶液を調製した。 く目的とする DNA領域からなるォ'リゴヌクレオチド〉
Z ： 5' -
Figure imgf000123_0001
CCTGGCTCGGAGGGTCCTACGCCCACGGAATCTCGCTGATTGC -3' (配列番号 3 7) く 5， 末端 F I T C標識ォリゴヌクレオチド>
F 5 ： 5' - ATAGTCTCGTGGTGCGCCGT -3' (配列番号 3 8) また、 酉 S列番号 3 9で示される目的とする DN A領域からなるオリゴヌクレオチド Wの負鎖と相補性により結合可能な配列番号 5 5、 配列番号 5 6、 配列番号 5 7、 配 列番号 5 8、 及び配列番号 5 9で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌタレ ォチド C 1 5、 C1 6、 C1 7、 C1 8、 及ぴ C 1 9を合成し、 夫々の濃度が 0.01 μ Μである Τ Εバッファ一溶液を調製した。 く目的とする DN Α領域からなるオリゴヌクレオチド〉
Z： 5' 一
Figure imgf000123_0002
CCTGGCTCGGAGGGTCCTACGCCCACGGAATCTCGCTGATTGC-3' (配列番号 3 7) くカウンターオリゴヌクレオチド>
C 1 5 ： 5， - CAGTGTGTGTGCGCACCGTGCGCGAGCCGA -3' (配列番号 5 5)
C 1 6 ： 5， - GGCGAGGCATTGCCTCACCTGGGAAGCGCA-3， (配列番号 56)
C 1 7 ： 5， - GGTGACGGTCGCACCTGGAAAATCGGGTCA -3' (配列番号 5 7)
C 1 8 ： 5， - ACCCGAATATTGCGCTTTTCAGACCGGCTT-3 ' (配列番号 58)
C 1 9 ： 5， - TCGGAGGGTCCTACGCCCACGGAATCTCGC -3' (配列番号 5 9) 得られた夫々の反応液について、 以下の処理を施した。
PCRチューブに、 前記で調製した反応液 40 と、 前記の 5， 末端 F I TC標 識ォリゴヌクレオチド溶液 1 0 μ Lと、 前記の力ゥンターオリゴヌクレオチド溶液 1 0 しと、 緩衝液 （330mM Tris - Acetate H 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithiothreitol) を 1 0 Lと、 1 00 mM MgCl2溶液 1 0 /^Lと、 1 mg/mL BSA溶液 1 0 μ!を添加し、 更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 1 00 μ Lとし、 混合 した。 その後、 本 PCRチューブを 9 5°Cで 1 0分間加熱し、 70°Cまで速やかに冷 却し、 その温度で 1 0分間保温した。 次いで、 50°Cまで冷却し 1 0分間保温し、 更 に 37でで 1 0分間保温した後、 室温に戻し、 5 ' 末端 F I T C標識ォリゴヌクレオ チドと DN Aフラグメントとの結合体の形成を促した（以上、 本発明方法の第二工程 に相当する）。
前記のビォチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトァビジン被覆済 み 8ウェルストリップに、 前記で調製した DN Aフラグメントの反応液 1 00 Lを 加え、 室温で 1時間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 20 0 μ Lの洗浄パッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 該バッファーをピペッティングに より取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した （以上、 本発明方法の第三工程に相 当する） 。
その後、 HRP標識 F I TC抗体溶液 [Jackson Immuno esearch Laboratories社製 、 0.005μ§/100μί 0.1% BSA含有リン酸バッファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 7H20 、 154mM NaCl pH7. 4) 溶液]を各ゥエルに 1 0 0 μ Lの割合で添加後、 1時間室温で放 釁した。 放置後、 各ゥヱルを 2 0 0 Lの洗浄バッファー [0. 05% Tween20含有リン酸 バッファー (滅 K¾P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) ]を添加した後、 該 バッファーをデカンテーシヨンにより取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した。 基質 （R&D社製、 #DY999) を、 各ゥエルに 1 0 0 Lの割合で添加 ·混合し、 反応を 開始した。
約 9分間室温で放置し、 ストツプ溶液 （2N H2 S04水溶液）を各ゥエルに 5 0 ^ Lの割 合で添加し、 反応を停止した。 反応停止後 3 0分以内に 4 5 O nmの吸光度を測定した 。 （以上、 本発明方法の第四工程に相当する） その結果を図 1 4に示した。 溶液 A、 溶液 B、 及ぴ溶液 Cでは、 溶液 Dに比べて吸 光度の増加がみられた。 またその強度はゲノム D N Aの濃度に依存して増加した。 本実験において、 メチルシトシン抗体と、 メチル化された D NAフラグメントと、 固定ィヒした 5 ' 末端ビォチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成 ·選択し、 複 合体中の F I T Cを、 その機能により定量'検出することにより、 D NAフラグメン トの検出 ·定量が可能であることが明らかとなり、 ゲノム D NAの検出 ·定量が可能 であることが明らかとなった。 実施例 1 5
市販のメチルシトシン抗体 （Aviva Systems Biology社製） を、 市販ピオチン化キ ット （Biotin Labeling Kit- NH2、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載さ れた方法に準じて、 ピオチン標識した。 得られたビォチン標識メチルシトシン抗体を 0. 25 g/ / L 0. 1% BSA含有リン酸バッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) 溶液として冷蔵保存した。
合成して得られたピオチン標識メチルシトシン抗体の 0. 5 g/mL0. 1% BSA含有リン 酸バッファー （1 KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl PH7. 4) 溶液を調製し、 これを各 1 0 0 μ Lの割合でストレプトァビジン被覆済み 8ウエノレス トリップ （ Perkin Elmer¾^) に添加し、 約 1時間室温で放置してゥエルに固定化した。 その後 、 溶液をピペッティングにより取り除き、 2 0 0 ^ Lの洗浄バッファー [0. 05% Tween20含有リン酸バッファー （IraM KH2 P04、 3mM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7. 4) ]を添加した後、 該パッファーをデカンテーシヨンにより取り除いた。 この操作を更 に 2回繰り返した （以上、 本発明方法で使用する固定化メチル化 D N A抗体の調製に 相当する） 。
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノム D N Aについて、 以下の溶液を 夫々 2連で調製した。
溶液 A ： ヒト血液由来ゲノム DNA 100ng/5 μ ΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 Β ： ヒト血液由来ゲ、ノム DNA 10ng/5 μ ΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 C ： ヒト血液由来ゲ、ノム DNA lng/5 μ ΐ Τ Εバッファ一溶液
溶液 D ： Τ Εバッファー溶液 （ネガティブコントロール液） 上記の調製した夫々の溶液を 5 μ Lと、 制限酵素 M s ρ Iを 4 Uと、 M s ρ Iに最 適な 1 0 X緩衝液 （lOOmM Tris-HCl pH 7. 5、 lOOraM MgCl2、 lOraM Dithiothreitol、 500mM NaCl) 2 μ ΐとを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 2 0 μ 1としたも のを調製した。 該反応液を、 37°Cにて 1時間インキュベーションした。
得られた夫々の反応液を 2 0 t Lと、 Sssl methylase (NEB社製）を 0 . 5 ί 1と、 1 0 NEBuffer2 (NEB社製）を 5 μ ΐと、 3. 2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製）を 0 . 5 μ 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 5◦ μ 1としたものを調製 した。 該反応液を、 37°Cにて 3 0分間インキュベーションした（以上、 本発明方法の 第一工程に相当する）。
ヒ ト トランスポゾンとして知られる A 1 u領域に設計された配列番号 3 9で示され る目的とする D N A領域からなるオリゴヌクレオチド W (Genbank Accession No. A F 4 5 8 1 1 0等に示される塩基番号 178 - 262に相当する領域） と相補性により結合 可能な配列番号 4 0で示される塩基配列からなる 5 ' 末端 F I T C標識オリゴヌタレ ォチド F 6を合成し、 0. 02 μ Μの Tris - HCLバッファー （10 raM) 溶液を調製した。 く目的とする D N A領域からなるオリゴヌクレオチド > W： 5, -
AGACCATCC-3 , (配列番号 39 ) く 5， 末端 F I T C標識ォリゴヌクレオチド>
F 6 ： 5' - GGATGGTCTCGATCTCCTGAC -3' (配列番号 40) また、 配列番号 39で示される目的とする DNA領域からなるオリゴヌクレオチド Wの負鎖と相補性により結合可能な配列番号 60及び配列番号 61で示される塩基配 列からなるカウンターオリゴヌクレオチド C 20及び C 21を合成し、 夫々の濃度が 0.01 Μである ΤΕバッファー溶液を調製した。 く目的とする DN Α領域からなるオリゴヌクレオチド〉
W： 5， -
CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGT AGACCATCC-3 ' (配列番号 39 )
<カウンタ一才リゴヌクレ才チド>
C 20 : 5， - CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCA -3' (配列番号 60)
C21 ： 5， - TTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAG -3' (配列番号 61) 得られた夫々の反応液について、 以下の処理を施した。
PCRチューブに、 前記で調製した反応液 40 しと、 前記の 5' 末端 F I TC標 識ォリゴヌクレオチド溶液 10 μ Lと、 前記の力ゥンターオリゴヌクレオチド溶液 1 O/iLと、 緩衝液 （330mM Tris - Acetate H 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithiothreitol) を 10 /z Lと、 100 mM MgCl2溶液 10 μ Lと、 1 mg/mL BSA溶液 10 を添加し、 更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 100 μ Lとし、 混合 した。 その後、 本 PCRチューブを 95°Cで 10分間加熱し、 70°Cまで速やかに冷 却し、 その温度で 10分間保温した。 次いで、 50°Cまで冷却し 10分間保温し、 更 に 37°Cで 10分間保温した後、 室温に戻し、 5， 末端 F I TC標識オリゴヌクレオ チドと DNAフラグメントとの結合体の形成を促した（以上、 本発明方法の第二工程 に相当する）。
前記のビォチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトァビジン被覆済 み 8ゥヱルストリップに、 前記で調製した DNAフラグメントの反応液 100 μΐを 加え、 室温で 1時間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 20 0 μ Lの洗浄パッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファー （ImM KH2 P04、 3mM Na2HP07H20、 154raM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 該バッファーをピペッティングに より取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した （以上、 本発明方法の第三工程に相 当する） 。
その後、 HRP標識 F I TC抗体溶液 [Jackson ImmunoResearch Laboratories社製 、 0. OOS^g/lOO ^L 0.1% BSA含有リン酸バッファー （ImM KH2P04、 3 Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7.4) 溶液]を各ゥエルに 100 μ Lの割合で添加後、 1時間室温で放置 した。 放置後、 各ゥエルを 200 Lの洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バ ッファー (ImM KH2P0.い 3fflM Na2HP0 7H20、 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 該バ ッファーをデカンテーションにより取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した。 基質 （R&D社製、 #DY999) を、 各ゥエルに 100 / Lの割合で添加 ·混合し、 反応を 開台した。
約 8分間室温で放置し、 ストツプ溶液 (2N H S04水溶液）を各ゥエルに 50 μ Lの割 合で添加し、 反応を停止した。 反応停止後 3◦分以内に 45 Onmの吸光度を測定した 。 （以上、 本発明方法の第四工程に相当する） その結果を図 15に示した。 溶液 A、 溶液 及び溶液 Cでは、 溶液 Dに比べて吸 光度の増加がみられた。 またその強度はゲノム DN Aの濃度に依存して増加した。 本実験において、 メチルシトシン抗体と、 メチル化された DN Aフラグメントと、 固定ィヒした 5' 末端ビォチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成'選択し、 複 合体中の F I TCを、 その機能により定量'検出することにより、 DNAフラグメン トの検出 ·定量が可能であることが明らかとなり、 ゲノム D NAの検出 ·定量が可能 であることが明らかとなった。 実施例 1 6
血清サンプルとして、 ヒト血液由来ゲノム DNA (Human Genomic DNA、 #636401、
Clontech社）の TEバッファ一溶液とラット （Wistar Hannover) より採取した血清の混 合液を以下のとおり夫々 4連で調製した。
血清サンフ。ル A:ヒト血液由来 ノム DNA 10 ng/10 pL TE/ ッファ -溶液 +ラット血清 10 μί 血清サンフ。ル B: U、血液由来ゲノム DNA 1 ng/10 pL TE/ ツファ -溶液 +ラット血清 10 pL 血清サン ル C:ヒト血液由来 ノム DNA 0. 1 ng/10 yL TEハ"ッファ 溶液 +ラット血清 10
血清サンフ。ル D:ヒト血液由来 ノム DNA 0 ng/10 yL TEハ、、ッファ -溶液 +ラット血清 10 yL (ネ力"ティフ" コント口 /レ液） 上記に調製した血清サンプル A〜Dについて、 以下に示す処理 1または処理 2を夫々 2連 でおこなった。
処理 1：
血清サンプル 20 y Lと、 緩衝液 （500 mM Tris- HC1 (pH 7. 5) , 100 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1000 mM NaCl)を 4 yLと、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 40 yL とし、 混合した。 その後、 本 PCRチューブを 95 °Cで 10分間保温し、 4 °Cで 10分間保温 した後、 室温に戻した。 9100xgで 10分間遠心してから上清を回収した。
処理 2：
血清サンプル 20 と、 緩衝液 （330 raM Tris- Acetate (pH 7. 9) , 100 mM Mg (0Ac) 2， 5 mM DTT, 660 mM KOAc) を 4 と、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 40 yLとし、 混合した。 その後、 本 PCRチューブを 95 °Cで 10分間保温し、 4 °Cで 10分 間保温した後、 室温に戻した。 9100xgで 10分間遠心してから上清を回収した。 上記の処理 1または処理 2により調製した夫々の溶液を 20 と、 制限酵素 Msplを 2U と、 Msplに最適な 10 X緩衝液 （100 mM Tris- HC1 pH 7, 5、 100 mM MgCl2、 10 raM Dithiothreitol, 500 mM NaCl) 5 yLとを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 としたものを調製した。 当該反応液を、 37°Cにて 1時間インキュベーションし 上記の酵素処理により得られた溶液 30 yLと、 Sssl methylase (NEB社製） を 0. 5 yL と、 10 x NEBuffer2 (NEB社製） を 5 と、 3. 2 mM S - adenosyl methionine (NEB社製） を 0. 5 とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 としたものを調製した 。 該反応液を、 37°Cにて 30分間インキュベーションした。
ヒトトランスポゾンとして知られる Alu領域に設計され 、 配列番号 3 9で示され る塩基配列からなる目的とする DNA領域 （W、 配列番号 3 9 Genbank Accession No. AF458110に示される塩基番号 178-262に相当する領域） を取得するために用いる特定 ォリゴヌクレオチドとして、 目的とする DNA領域 Wの正鎖と相補性により結合する配列 番号 4 0で示される塩基配列からなる 5' 末端 FITC標識ォリゴヌクレオチド F1を合成 し、 0. 02 Mの Tris-HClバッファー （10 mM) 溶液を調製した。 く目的とする DNA領域 >
W 5' - CGGG0
AGACCATCC - 3' (配列番号 3 9 ) く 5， 末端 FITC標識ォリゴヌクレオチド〉
F1 5' GGATGGTCTCGATCTCCTGAC -3' (配列番号 4 0 ) 上記で得た反応液 50 yLと、 5' 末端 FITC標識オリゴヌクレオチド溶液 10 pLと、 緩 衝液 (330 mM Tris - Acetate H 7. 9 660 mM K0Ac 100 mM Mg0Ac2 5 mM
Dithiothreitol) を 10 yLと、 100 mM MgC12溶液 10 と、 1 mg/mL BSA溶液 10 yLを添 加し、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 100 yLとし、 混合した。 その後 、 目的とする DMA領域と 5， 末端 FITC標識オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させる ために、 本 PCRチューブを 95 °Cで 10分間保温し、 70 °Cまで速やかに冷却し、 その温 度で 10分間保温した。 次いで、 50 °Cまで冷却し 10分間保温し、 さらに 37 °Cで 10分間 保温した後、 室温に戻した。
市販のメチルシトシン抗体 （Aviva Systems Biology社製） を、 市販ピオチン化キ ット （Biotin Labeling Kit- NH2、 同仁化学研究所製） を用いて、 プロトコルに記載 された方法に従い、 ピオチン標識した。 得られたピオチン標識メチルシトシン抗体を 0. 25 g/yL 0. 1% BSA含有リン酸バッファー （1 mM K P04、 3 mM Na2HP0 7H20、 154 mM NaCl pH 7. 4) 溶液として冷蔵保存した。
前記の熱処理により得られた反応液 100 に、 上記のピオチン標識メチルシトシン 抗体溶液を 5倍希釈して （0. 05 ug/pL 0. 1% BSA含有リン酸バッファー （1 πΜ Η2Ρ04 、 3 mM Na2HP0 7H20、 154 mM NaCl pH 7. 4) 溶液） 1 nLを添加し、 1時間室温で放置 し、 目的とする DNA領域と 5' 末端 FITC標識ォリゴヌクレオチドとピオチン標識メチル シトシン抗体からなる検出複合体を形成させた。
上記に得られた反応液をストレプトアビジン被覆済み 8ゥ-ルストリップ
(StreptaWell, #11645692001、 Roche社） に移し、 約 60分間、 室温で放置し、 8ゥエル ストリップに目的とする DNA領域と 5， 末端 FITC標識ォリゴヌクレオチドとビォチン標 識メチルシトシン抗体からなる検出複合体をピオチン -ストレプトァビジン結合を介 して固定化した。 その後、 溶液をデカンテーシヨンにて取り除き、 各ゥヱルを洗浄バ ッファー [0. 05%Tween20含有リン酸バッファー （1 mM KH2P04、 3 mM Na2HP04' 7H20、 154 mM NaCl pH 7. 4) ] 200 yLで 3回洗浄した。
その後、 HRP標識 FITC抗体溶液 [Jackson IramunoResearch Laboratories社製、
0. 005 pg/100 L 0. 1% BSA含有リン酸バッファー （1 mM KH2P04、 3 mM Na2HP0 7H20、 154 mM NaCl pH 7. 4) 溶液] を各ゥエルに 100 の割合で添カ卩後、 1時間室温で放置 した。 放置後、 各ゥヱルを 200 の洗浄バッファー [0. 05% Tween20含有リン酸バッ ファー （1 mM K¾P04、 3 mM Na2HP0 7H20、 154 mM NaCl pH 7. 4) ] を添加した後、 該 バッファーをデカンテーシヨンにより取り除いた。 この操作を更に 2回繰り返した。 基質 （R&D社製、 #DY999) を、 各ゥヱルに 100 yLの割合で添加 '混合し、 反応を開 女台した。
約 30分間室温で放置し、 ストップ溶液 （2N ¾S04水溶液）を各ゥエルに 50 の割合 で添加し、 反応を停止した。 反応停止後 30分以内に 450 nmの吸光度を測定し、 得られ た測定値について 2連の平均値を算出した。 その結果を図 1 6および図 1 7に示した。 処理 1では、 ヒ ト血液由来ゲノム DNAの溶 液 A (10 ng) , 溶液 B (1 ng)、 および溶液 C (0. 1 ng) において、 溶液 D (0 ng： コン トロール溶液） に比べて吸光度が濃度依存的に増加した （図 1 6 )。 いっぽう処理 2で は、 ヒ ト血液由来ゲノム DNAの溶液 A (10 ng) において、 溶液 D (0 ng： コントロール 溶液） に比べて吸光度が増加したが、 溶液 B (1 ng) および溶液 C (0. 1 ng) において 、 吸光度の増加は見られなかった （図 1 7 )。
本実験において、 固定化したビォチン標識メチルシトシン抗体と、 メチルイ匕された DNAフラグメントと、 5， 末端 FITC標識ォリゴヌクレオチドとの複合体を形成 ·選択し 、 複合体中の FITCを、 その機能により定量 ·検出することにより、 血清中ヒ トゲノム DNAを感度よく検出 '定量することが可能であることが示された。 また処理 2に比べて 処理 1では血清中ヒトゲノム DNAが感度よく検出された。 実施例 1 7
血清サンプルとして、 ヒ ト血液由来ゲノム DNA (Human Genomic DNA、 #636401、 Clontech社）の TEバッファ一溶液とコージンバイォ社より購入したヒ ト血清 （個体別 Human Serum)の混合液を以下のとおり夫々 2連で調製した。
血清サンフ。ル A：ヒト血液由来ケ、'ノム DNA 4 ng/10 TEハ"ツファ-溶液 +ヒト血清 40 uL
血清サンフ。ル B:ヒト血液由来ゲノム DNA 2 ng/10 yL TEハ'、ッファ -溶液 +ヒト血清 40 yL
血清サンアル C:ヒト血液由来ゲノム DNA 1 ng/10 μί TEハ、、ッファ-溶液 +ヒト血清 40 pL
血清サンフ。ル D :ヒト血液由来 ノム DNA 0 ng/10 pL TE/、'、ッファ 溶液 +ヒト血清 40 yL (ネ ティ コ ントロ-ル液） 上記に調製した血清サンプル A〜Dについて、 以下に示す処理を夫々 2連でおこなった
PCRチューブに血清サンプル 50 と、 緩衝液 （500 mM Tris-HCl (pH 7. 5) , 100 raM MgCl2， 10 niM DTT, 1000 mM NaCl)を 20 yLと、 さらに当該混合物に滅菌超純水を 加えて液量を 100 yLとし、 混合した。 その後、 本 PCRチューブを 95 °Cで 10分間保温し 、 4 °Cに冷却した後、 室温に戻した。 続いて 9100xgで 10分間遠心してから上清 20 pL を回収した。
上記の処理により調製した溶液を 20 nLと、 制限酵素 Msplを 2Uと、 Msplに最適な 10 X緩衝液 （100 mM Tris-HCl pH 7. 5、 100 mM MgCl2、 10 mM Dithiothreitol、 500 mM NaCl) 5 yLとを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 Lとしたものを調製し た。 当該反応液を、 37°Cにて 1時間インキュベーションした。
上記の酵素処理により得られた溶液 30 pLと、 Sssl methylase (NEB社製） を 0. 5 pL と、 10 xNEBuffer2 (NEB社製） を 5 しと、 3. 2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製） を 0. 5 とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 としたものを調製した 該反応液を、 37°Cにて 30分間インキュベーションした。
ヒトトランスポゾンとして知られる Alu領域に設計された目的とする DNA領域 （W、 配列番号 3 9、 Genbank Accession No. AF458110に示される塩基番号 178- 262に相当 する領域） と相補性により結合可能な配列番号 4 0で示される塩基配列からなる 5' 末端 FITC標識ォリゴヌクレオチド F 1を合成し、 0. 02 μΜの Tris- HC1バッファー (10 mM) 溶液を調製した。 く目的とする DNA領域〉
W： 5' - CGGGC
AGACCATCC -3' (配列番号 3 9 )
< 5， 末端 FITC標識ォリゴヌクレオチド >
F6： 5' - GGATGGTCTCGATCTCCTGAC -3， （配列番号 4 0 ) 上記で得た反応液 50 yLと、 5， 末端 FITC標識オリゴヌクレオチド溶液 10 yLと、 緩 衝液 （330 mM Tris- Acetate pH 7. 9、 660 mM KOAc, 100 mM Mg0Ac。、 5 mM Dithiothreitol) を 10 yLと、 100 mM MgCl2溶液 10 yLと、 1 mg/mL BSA溶液 10 を添 加し、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 100 とし、 混合した。 その後 、 目的とする DNA領域と 5， 末端 FITC標識ォリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させる ために、 本 PCRチューブを 95 °Cで 10分間保温し、 70 °Cまで速やかに冷却し、 その温 度で 10分間保温した。 次いで、 50 °Cまで冷却し 10分間保温し、 さらに 37 °Cで 10分間 保温した後、 室温に戻した。
市販のメチルシトシン抗体 （Aviva Systems Biology社製） を、 市販ビォチン化キ ット （Biotin Labeling Kit- NH2、 同仁化学研究所製） を用いて、 プロトコルに記載 された方法に準じて、 ビォチン標識した。 得られたピオチン標識メチルシトシン抗体 を 0. 25 yg/yL 0. 1% BSA含有リン酸バッファー （1 mM KH2P04、 3 mM Na2HP0 7 0、 154 mM NaCl pH 7. 4) 溶液として冷蔵保存した。
前記の熱処理により得られた反応液 100 yLに、 上記のビォチン標識メチルシトシン 抗体溶液を 5倍希釈して （0. 05 pg/pL 0. 1% BSA含有リン酸バッファー （1 mM KH2P04 、 3 mM Na2HP0 7H20、 154 mM NaCl pH 7. 4) 溶液） 1 を添加し、 1時間室温で放置 し、 目的とする DNA領域と 5 ' 末端 FITC標識ォリゴヌクレオチドとビォチン標識メチル シトシン抗体からなる検出複合体を形成させた。
上記に得られた反応液をストレプトアビジン被覆済み 8ウェルストリップ
(StreptaWel #11645692001、 Roche社） に移し、 1時間、 室温で放置し、 8ウェルス トリップに目的とする DNA領域と 5' 末端 FITC標識ォリゴヌクレオチドとビォチン標識 メチルシトシン抗体からなる検出複合体をピオチン -ストレプトァビジン結合を介し て固定ィ匕した。 その後、 溶液をピペッティングにて取り除き、 各ゥエルを洗浄バッフ ァー [0. 05%Tween20含有リン酸バッファー （1 mM K¾P04、 3 mM Na2HP04' 7H20、 154 mM NaCl pH 7. 4) ] 200 yiLで 3回洗浄した。
その後、 HRP標識 FITC抗体溶液 [Jackson ImmunoResearch Laboratories社製、 0. 005 μ§/100 nL 0. 1% BSA含有リン酸バッファー （1 mM KH2P04、 3 mM Na2HP0 7H20、 154 mM NaCl pH 7. 4) 溶液] を各ゥエルに 100 yLの割合で添加後、 1時間室温で放置 した。 放置後、 溶液をピペッティングにて取り除き、 各ゥエルを洗浄バッファー [0. 05%Tvreen20含有リン酸バッファー （1 mM KH2P04、 3 mM Na2HP(V 7H20、 154 mM NaCl pH 7. 4) ]200 nLで 3回洗浄した。
基質 （R&D社製、 #DY999) を、 各ゥエルに 100 uLの割合で添加 '混合し、 反応を開 ヌ'口し 7こ。
20分間室温で放置し、 ストップ溶液 （2N S04水溶液）を各ゥュルに 50 の割合で 添加し、 反応を停止した。 反応停止後 30分以内に 450 nmの吸光度を測定した。 その結果を図 1 8に示した。 ヒト血液由来ゲノム DNAの溶液 A (4 ng)、 溶液 B (2 ng)、 および溶液 C (1 ng) において、 溶液！） （0 ng： コントロール溶液） に比べて吸 光度が濃度依存的に增加した。
本実験において、 今回発明した手法により抽出された DNAサンプ^^を用いて、 目的 とする DNA領域と 5' 末端 FITC標識ォリゴヌクレオチドとビォチン標識メチルシトシン 抗体からなる検出複合体を形成し、 ピオチン -ストレプトアビジン結合を介して固定 化することにより選択し、 複合体中の FITCを、 その機能により検出することにより、 ヒト血清中ヒトゲノム DNAの検出 ·定量が可能であることが明らかとなった。 実施例 1 8
血清サンプルとして、 以下に示すヒト血清を用いた。
コージンパイォ社より購入したヒト血清 （個体別 Human Serum)
Lot No.：
N51438 (健常者）
N51439 (健常者）
N51441 (健常者）
ProMedDx社より購入したヒト血清 （個体別 Human Serum)
Lot No.：
11171268 (健常者、 56歳、 男性）
11171292 (健常者、 62歳、 男性）
11171297 (健常者、 67歳、 男性）
11202510 (健常者、 67歳、 女性） 11202522 (健常者、 64歳、 女性) 11202527 (健常者、 52歳、 女性) 11202615 (健常者、 75歳、 女性) 11202618 (健常者、 78歳、 女性) 10958886 (健常者、 56歳、 男性) 10958979 (健 ヽ 39歳、 男性) 10958980 (健常者、 45歳、 男性) 10960268 (健常者、 37歳、 男性) 10960272 (健常者、 50歳、 男性) 10960276 (健常者、 30歳、 男性) 10960285 (健常者、 39歳、 男性) 11003457 (健常者、 38歳、 男性) 11003479 (健常者、 51歳、 男性) 11003480 (健常者、 48歳、 男性) 11324997 (健常者、 59歳、 男性) 11325001 (健常者、 61歳、 男性) 10325022 (健常者、 61歳、 男性) 10870623 (乳がん患者、 33歳、 女性) 10929521 (乳がん患者、 、 女性) 10989644 (乳がん患者、 45歳、 女性) 11209430 (乳がん患者、 80歳、 女性) 10929514 (乳がん患者、 57歳、 女性) 10843055 (乳がん患者、 59歳、 女性) 10984680 (乳がん患者、 64歳、 女性) 10840414 (肺がん患者、 54歳、 女性) 10929506 (肺がん患者、 55歳、 男性) 11091955 (肺がん患者、 76歳、 女性) 11103346 (肺がん患者、 66歳、 女性) 11142322 (肺がん患者、 62歳、 女性）
11152564 (肺がん患者、 67歳、 男性）
11152571 (肺がん患者、 67歳、 男性）
11153198 (肺がん患者、 69歳、 女性）
11209435 (肺がん患者、 61歳、 男性）
11230621 (肺がん患者、 71歳、 女性）
11153192 (肺がん患者、 59歳、 男性）
10715942 (肺がん患者、 64歳、 男性）
10840422 (肺がん患者、 78歳、 女' 14)
10935547 (前立腺がん患者、 83歳、 男性）
11000243 (前立腺がん患者、 78歳、 男性）
11071226 (前立腺がん患者、 84歳、 男性） 上記の血清サンプルについて、 以下に示す処理を 2連でおこなった。
処理 1：
PCRチューブに血清サンプル 40 y Lと、 緩衝液 （500 mM Tris-HCl (pH 7. 5) , 100 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1000 mM NaCl)を 20 iiLと、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加え て液量を 100 yLとし、 混合した。 その後、 本 PCRチューブを 95 °Cで 10分間保温し、 4 °Cに冷却した後、 室温に戻した。 続いて 9100xgで 10分間遠心してから上清 20 を回 収した。 上記の処理により調製した溶液を 20 と、 制限酵素 Msplを 2ひと、 Msplに最適な 10 X緩衝液 (100 mM Tris-HCl pH 7. 5、 100 mM MgCl2、 10 mM Dithiothreitol、 500 mM NaCl) 5 yLとを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 u Lとしたものを調製し た。 当該反応液を、 37°Cにて 1時間インキュベーションした。
上記の酵素処理により得られた溶液 30 nLと、 Sssl methylase (NEB社製） を 0. 5 pL と、 10 xNEBuffer2 (NEB社製） を 5 yLと、 3. 2 mM S - adenosyl methionine (WEB社製） を 0. 5 とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 tiLとしたものを調製した 。 該反応液を、 37°Cにて 30分間インキュベーションした。
ヒトトランスポゾンとして知られる Alu領域に設計された目的とする DNA領域 （W、 配列番号 3 9、 Genbank Accession No. AF458110に示される塩基番号 178- 262に相当 する領域） と相補性により結合可能な配列番号 4 0で示される塩基配列からなる 5' 末端 FITC標識オリゴヌクレオチド F 6を合成し、 0. 02 μΜの Tris - HC1バッファー (10 mM) 溶液を調製した。 く目的とする DNA領域〉
W： 5， -
CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCC AGACCATCC -3' (配列番号 3 9 ) く 5' 末端 FITC標識ォリゴヌクレオチド>
F6： 5' - GGATGGTCTCGATCTCCTGAC -3' (配列番号 4 0 ) 上記で得た反応液 50 と、 5， 末端 FITC標識オリゴヌクレオチド溶液 10 yLと、 緩 衝液 （330 raM Tris- Acetate H 7. 9、 660 mM K0Ac、 100 mM MgOAc2、 5 mM
Dithiothreitol) を 10 yLと、 100 raM MgC12溶液 10 yLと、 1 mg/mL BSA溶液 10 yLを添 加し、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 100 ULとし、 混合した。 その後 、 目的とする DNA領域と 5， 末端 FITC標識ォリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させる ために、 95 °Cで 10分間保温し、 70 °Cまで速やかに冷却し、 その温度で 10分間保温し た。 次いで、 50 °Cまで冷却し 10分間保温し、 さらに 37 °Cで 10分間保温した後、 室温 に民した。
市販のメチルシトシン抗体 （Aviva Systems Biology社製） を、 市販ビォチン化キ ット （Biotin Labeling Kit- NH2、 同仁化学研究所製） を用いて、 プロトコルに記載 された方法に従つて、 ビォチン標識した。 得られたビォチン標識メチルシトシン抗体 を 0. 25 yg/pL 0. 1% BSA含有リン酸バッファー （1 mM KH2P04、 3 mM Na2HP0 7 0、 154 mM NaCl pH 7. 4) 溶液として冷蔵保存した。 前記の熱処理により得られた反応液 100 yLに、 上記のビォチン標識メチルシトシン 抗体溶液を 5倍希釈して （0. 05 yg/pL 0. 1% BSA含有リン酸バッファー （1 mM KH2P04 、 3 mM Na2HP0 7H20、 154 mM NaCl pH 7. 4) 溶液） 1 を添カ卩し、 1時間室温で放置 し、 目的とする DNA領域と 5' 末端 FITC標識オリゴヌクレオチドとビォチン標識メチル シトシン抗体からなる検出複合体を形成させた。
上記に得られた反応液をストレプトアビジン被覆済み 8ゥヱルストリップ
(StreptaWell, #11645692001 s Roche社） に移し、 1時間、 室温で放置し、 8ウェルス トリップに目的とする DNA領域と 5' 末端 FITC標識オリゴヌクレオチドとビォチン標識 メチルシトシン抗体からなる検出複合体をピオチン -ストレプトァビジン結合を介し て固定化した。 その後、 溶液をピペッティングにて取り除き、 各ゥエルを洗浄パッフ ァー [0· 05%Tween20含有リン酸バッファー （1 mM KH2P04、 3 mM Na2HP04' 7H20、 154 mM NaCl pH 7. 4) ]200 で 3回洗浄した。
その後、 HRP標識 FITC抗体溶液 [Jackson ImmunoRe search Laboratories社製、 0. 005 yg/100 uL 0. 1% BSA含有リン酸バッファー （1 mM KH2P04、 3 mM Na2HP0 7H20、 154 mM NaCl pH 7. 4) 溶液] を各ゥエルに 100 yLの割合で添加後、 1時間室温で放置 した。 放置後、 溶液をピペッティングにて取り除き、 各ゥヱルを洗浄バッファー
[0. 05%Tween20含有リン酸バッファー （1 mM KH2P04、 3 mM Na2HP04' 7 0、 154 mM NaCl pH 7. 4) ] 200 yLで 3回洗浄した。
基質 （R&D社製、 #DY999) を、 各ゥヱルに 100 ULの割合で添加 .混合し、 反応を開 始した。
25分間室温で放置し、 ストップ溶液 （2N H2S( _K溶液）を各ゥヱルに 50 の割合で 添加し、 反応を停止した。 反応停止後 30分以内に 450 nmの吸光度を測定し、 得られた 測定値について 2連の平均値を算出した。
一方、 上記の酵素処理 （Mspl処理） により得られた溶液中の DNAをリアルタイム PCR により定量した。
濃度測定用スタンダードサンプノレとして Mspl処理ヒトゲノム DNA溶液を以下のとお り調製した。 ヒ ト血液由来ゲノム DNA (Human Genomic D腿、 #636401、 Clontech社）の TEバッファー溶液の 5 ng/uL TEバッファー溶液を調製し、 この溶液を 20 と、 制限 酵素 Msplを 2 Uと、 Msplに最適な 10 x緩衝液 （100 mM Tri s-HCl pH 7. 5、 100 mM MgCl2、 10 mM Dithiothreitol, 500 mM NaCl) 5 とを混合し、 これに滅菌超純水 を加えて液量を 50 としたものを夫々の処理について調製した。 当該反応液を、 37 °Cにて 1時間インキュベーションした。 得られた反応液について、 TEバッファ一によ る希釈により、 10Λ 10—4、 10 -3、 10— 2、 10~\ 1、 10 ng/5 溶液を調製した。
ヒトトランスポゾンとして知られる Alu領域に設計された目的とする DNA領域 (W, 配列番号 3 9、 Genbank Accession No. AF458110に示される塩基番号 178- 262に相当 する領域） を增幅してリアルタイム PCRで定量するために配列番号 6 2で示される塩 基配列からなるフォワードプライマー （F) および配列番号 6 3で示される塩基配列 からなるリバースプライマー (R) を設計した。 。 く目的とする DNA領域 >
W： 5' - CGGGCGC
AGACCATCC -3， （配列番吾 3 9 ) くフォヮ一ドプライマ一〉
F： 5， - GGTGGCTCACGCCTGTAATC -3' (配列番号 6 2 ) くリバースプライマー >
R： 5， - GGATGGTCTCGATCTCCTGAC - 3， （配列番号 6 3 )
PCRの反応液としては、 鎳型とする上記に調製した Mspl処理ヒトゲノム DNA溶液 5 pL あるいは上記に調製した濃度測定用スタンダードサンプルと、 配列番号 6 2および配 列番号 6 3で示される塩基配列からなるプライマーの 5 μΜ溶液をそれぞれ 1. 5 と 、 SYBR® Green I (Lonza社） を 0. lx分と、 each 2 mM dNTPを 2. 5 と、 lOxPCR緩衝液 (100 mM Tris-HCl pH 8. 3、 500 mM KC1、 15 mM MgCl2、 0. 01 % Gelatin) を 2. 5 yLと 、 而熱性 DNAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold, 5 U/ L , ABI社）を 0. 125 とを混合し 、 これに滅菌超純水を加えて液量を 25 としたものを用いた。 リアルタイム PCRは、 Mx3005P (Stratagene社）を用いて実施した。 当該反応液を、 95 °Cにて 10分間保温し た後、 95 °Cにて 30秒間、 61 °Cにて 30秒間、 72 °Cにて 45秒間を 1サイクルとして 40 サイクル繰り返すことにより、 目的とする DNA領域を増幅した。 当該リアルタイム PCR の結果により、 血清サンプル中の DNAを定量した。 その結果を図 1 9および図 2 0に示した。 本手法による測定値と、 リアルタイム PCRにより定量した値を比較したところ、 相関があることが示された （相関係数： R = 0. 62) (図 1 9 )。 また、 57歳以下のヒト血清サンプルについて定量した結果を、 がん 患者と健常者で比較したところ、 健常者と比較してがん患者では血清中 DNA濃度が上 昇していることが示された（図 2 0 )。
本実験において、 メチルシトシン抗体と、 メチル化された DNAフラグメントと、 5， 末端ビォチン標識ォリゴヌクレオチドとの複合体を形成 ·選択し、 複合体中のメチル シトシン抗体を、 その機能により検出することにより、 ヒ ト血清中遊離 DNAを感度よ く検出 ·定量することが可能であることが示された。 また、 57歳以下のがん患者と健 常者で血清中 DNA濃度が異なり、 さらに本手法により簡便にその差を検出できること が示された。 ， 産業上の利用可能性
本発明により、 目的とする D N A領域を有する D N Aを簡便に定量又は検出する方 法を提供することが可能となる。 また、 被験者由来の検体 （好ましくは血清） を用い て、 当該検体での結果と健常者由来の検体での結果との比較に基づき癌患者由来の検 体を選抜する方法等を提供することが可能となる。 配列表フリーテキスト
配列番号 1 7〜 6 3
設計されたォリゴヌクレオチド

Claims

請求の範囲
1. 検体中に含まれる目的とする DNA領域を有する DNAを定量又は検出する方法 であって、
(1) 目的とする DNA領域を検出しょうとする DNAを検体から調製する第一工程
( 2 ) 第一工程で調製された DNAを DNAメチル化酵素で処理する第二工程、
(3) 第二工程で処理された DN Aから、 一本鎖メチル化 DN Aを調製し、 該一本鎖 メチル化 DN Aに検出オリゴヌクレオチドを結合させて被検 DN A複合体を取得する 第三工程、
( 4 ) 第三工程で取得した被検 D N A複合体に固定ィヒメチル化 D N A抗体を結合させ て検出複合体を取得する第四工程、 及び
(5) 第四工程で得られた検出複合体に含まれる検出オリゴヌクレオチドをその識別 機能により定量又は検出することにより、 前記一本鎖 D N A中の目的とする D N A領 域を有する DN Aを定量又は検出する第五工程、
を有することを特徴とする方法。
2. 第三工程で被検 DN A複合体を取得する際にカウンターオリゴヌクレオチドを添 加する請求項 1に記載の方法。
3. 固定化メチル化 DN A抗体がメチルシトシン抗体である請求項 1又は 2に記載の 方法。
4. DNAメチル化酵素がシトシンメチル化酵素又は S s s Iメチラーゼである請 求項 1〜 3のいずれか一項に記載の方法。
5. 検体中に含まれる目的とする DN A領域を有する DN Aが、 RN Aから逆転写酵 素により生成された DN Aにおける目的とする DN A領域を有する DN Aである請求 項 1〜 4のいずれか一項に記載の方法,
6. 検体が、 下記のいずれかの生物由来検体である請求項 1〜 5のいずれかー¾に記 載の方法。
(a) 哺乳動物由来の血液、 体液、 糞尿、 体分泌物、 細胞溶解液又は組織溶解液、
(b) 哺乳動物由来の血液、 体液、 糞尿、 体分泌物、 細胞溶解液及び組織溶解液から なる群より選ばれる一から抽出された DNA、
(c) 哺乳動物由来の組織、 細胞、 組織溶解液及び細胞溶解液からなる群より選ばれ る一から抽出された RNAを鎳型として作製された DNA、
(e) 細菌、 真菌又はウィルスから抽出された DNA、 又は '
(f ) 細菌、 真菌又はウィルスから抽出された RNAを铸型として作製された DNA
7. 第一工程で取得した前記目的とする DN A領域を有する DN Aが、 目的とする D NA領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなる DNA、 合成ォ リゴヌクレオチド、 又は予め精製されてなる DN Aである請求項 1〜6のいずれか一 項に記載の方法。
8. 検出オリゴヌクレオチドの識別機能が、 下記のいずれかの識別機能である請求項 1〜 7のいずれか一項に記載の方法。
(a) F I TCの蛍光検出、 又は
(b) F I TC抗体による検出
9. 検出オリゴヌクレオチドが、 ヒトゲノム中の反復配列、 重複遺伝子又は偽遺伝子 の塩基配列若しくはその一部と相補的に結合し得る塩基配列からなる請求項 1〜 8の いずれか一項に記載の方法。
10. ヒトゲノム中の反復配列が LINE又は SINEである請求項 9に記載の方法,
11. 検出オリゴヌクレオチドが、 以下に示されるいずれかの塩基配列と相補的に結 合し得る塩基配列からなる請求項 1〜 10のいずれか一項に記載の方法。
(1) 配列番号 37で示される塩基配列又はそれと 80%以上の配列同一性を有する 塩基配列、
(2) 配列番号 37で示される塩基配列の相補配列又はそれと 80%以上の配列同一 性を有する塩基配列、
(3) 配列番号 39で示される塩基配列又はそれと 80%以上の配列同一性を有する 塩基配列、 又は
( 4 ) 配列番号 39で示される塩基配列の相補配列又はそれと 80 %以上の配列同一 性を有する塩基配列
12. 検出オリゴヌクレオチドが、 以下に示されるいずれかの塩基配列からなる請求 項 1〜 10のいずれか一項に記載の方法。
( 1 ) 配列番号 38で示される塩基配列又はそれと 80 %以上の配列同一性を有する 塩基配列
(2) 配列番号 38で示される塩基配列の相補配列又はそれと 80%以上の配列同一 性を有する塩基配列
( 3 ) 配列番号 40で示される塩基配列又はそれと 80 %以上の配列同一性を有する 塩基配列
(4) 配列番号 40で示される塩基配列の相補配列又はそれと 80%以上の配列同一 性を有する塩基配列
13. 第一工程において検体から DNAを調製するための DNA抽出操作において用 いられる溶液中のナトリゥム塩の濃度が、 10 OmM以上 100 OmM以下である請 求項 1〜 12のいずれか一項に記載の方法。
14. 第一工程において検体から DNAを調製するための DNA抽出操作において用 いられる溶液中のナトリゥム塩の濃度が、 10 OmM以上 20 OmM以下である請求 項 1〜 12のいずれか一項に記載の方法。
15. 癌患者由来の検体を選抜する方法であり、 請求項 1〜 14のいずれか一項に記 載の方法により被験者由来の検体を用いて定量又は検出された DN Aの定量結果また は検出結果と、 同方法により健常者由来の検体を用いて定量又は検出された DN Aの 定量結果または検出結果との差異が有意であれば、 被験者由来の検体を癌患者由来の 検体として評価し、 当該評価の結果に基づき癌患者由来の検体を特定する工程を含む 方法。
16. 検体が、 哺乳動物由来の血清である請求項 15に記載の方法。
17. 目的とする DNA領域を有する DNAが、 哺乳動物由来の血清中の目的とする D N A領域を有する遊離 DN Aである請求項 1.5〜 16のいずれか一項に記載の方法
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