JP2008263961A - Dnaメチル化測定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(1)生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料からメチル化された一本鎖DNAを取得し、該一本鎖DNAと、固定化メチル化DNA抗体とを結合させて一本鎖DNAを選択する第一工程、(2)第一工程で選択された一本鎖DNAを少なくとも1種類の一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素で消化処理する第二工程、及び、(3)下記の各本工程の前工程として、第二工程で得られた未消化物である一本鎖DNAを、前記の固定化メチル化DNA抗体から分離して一本鎖状態であるDNA(正鎖)にする工程(第三(前A)工程)等を有する生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの含量を測定する方法等を提供する。
【選択図】図1
Description
当該測定方法では、まず、生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料から、目的とするDNA領域を含むDNAを抽出する必要がある。当該抽出方法としては、例えば、ゲル濾過、シリカ支持体、有機溶媒等による抽出方法等が知られているが、いずれの抽出方法も操作が煩雑である。
次いで、抽出されたDNAの目的領域におけるメチル化されたDNAの含量を測定する方法としては、例えば、(1)亜硫酸塩等を用いて当該DNAを修飾した後、DNAポリメラーゼによるDNA合成の連鎖反応(Polymerase Chain Reaction;以下、PCRと記すこともある。)に供することにより目的領域を増幅する方法、(2)メチル化感受性制限酵素を用いて当該DNAを消化した後、PCRに供することにより、目的領域を増幅する方法等を挙げることができる。
このように、生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの含量を測定するための一連の操作には、多大な手間が存在していた。
即ち、本発明は、
1.生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの含量を測定する方法であって、
(1)生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料からメチル化された一本鎖DNAを取得し、該一本鎖DNAと、固定化メチル化DNA抗体とを結合させて一本鎖DNAを選択する第一工程、
(2)第一工程で選択された一本鎖DNAを少なくとも1種類の一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素で消化処理する第二工程、及び、
(3)下記の各本工程の前工程として、第二工程で得られた未消化物である一本鎖DNA(前記の一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のCpGを含まない一本鎖DNA)を、前記の固定化メチル化DNA抗体から分離して一本鎖状態であるDNA(正鎖)にする工程(第三(前A)第三(前A)工程)と、
第三(前A)工程で分離された一本鎖状態であるDNA(正鎖)を鋳型として、当該一本鎖状態であるDNA(正鎖)が有する塩基配列の部分塩基配列(正鎖)であって、且つ、前記の目的とするDNA領域の塩基配列(正鎖)の3’末端よりさらに3’末端側に位置する部分塩基配列(正鎖)に対して相補性である塩基配列(負鎖)を有する伸長プライマー(フォーワード用プライマー)を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを1回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるDNA(正鎖)を二本鎖DNAとして伸長形成させる工程(第三(前B)工程)と、
第三(前B)工程で伸長形成された二本鎖DNAを、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)と目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)に一旦分離する工程(第三(前C)工程)を有し、且つ、本工程として
(a)生成した目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)を鋳型として、前記フォワード用プライマーを伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを一回伸長させることにより、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる本工程−Aと、
(b)生成した目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)を鋳型として、前記の目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)が有する塩基配列の部分塩基配列(負鎖)であって、且つ、前記の目的とするDNA領域の塩基配列(正鎖)に対して相補性である塩基配列(負鎖)の3’末端よりさらに3’末端側に位置する部分塩基配列(負鎖)、に対して相補性である塩基配列(正鎖)を有する伸長プライマー(リバース用プライマー)を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを1回伸長させることにより、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる本工程−Bとを有し、
さらにかかる各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する第三工程、を有することを特徴とする方法(以下、本発明測定方法と記すこともある。);
2.請求項1記載の第三工程のメチル化DNA抗体がメチルシトシン抗体である、請求項1記載の、生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの含量を測定する方法;
3.生物由来検体が、哺乳動物の血清又は血漿であることを特徴とする請求項1〜2のいずれかの請求項記載の方法;
4.生物由来検体が、哺乳動物の血液又は体液であることを特徴とする請求項1〜2のいずれかの請求項記載の方法;
5.生物由来検体が、細胞溶解液又は組織溶解液であることを特徴とする請求項1〜2のいずれかの請求項記載の方法;
6.生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料が、当該ゲノムDNAが有する目的とするDNA領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるDNA試料であることを特徴とする請求項1〜5のいずれかの請求項記載の方法;
7.生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料が、少なくとも1種類のメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなるDNA試料であることを特徴とする請求項1〜6のいずれかの請求項記載の方法;
8.生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料が、予め精製されてなるDNA試料であることを特徴とする請求項1〜7のいずれかの請求項記載の方法;
9.少なくとも1種類の1本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素が、生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域の中に認識切断部位を有する制限酵素であることを特徴とする請求項1〜8のいずれかの請求項記載の方法;
10.少なくとも1種類の1本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素が、メチル化感受性制限酵素であるHhaIであることを特徴とする請求項1〜9のいずれかの請求項記載の方法;
11.第二工程において一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素での消化処理を実施せずに第三工程を実施する前項1〜10のいずれか一項に記載の方法;
12. 第一工程が、生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料から、メチル化された一本鎖DNAを分離する第一(A)工程と、
第一(A)工程で分離された一本鎖DNAと固定化メチル化DNA抗体とを結合させる第一(B)工程と、からなり、
第一(A)工程でメチル化された一本鎖DNAを分離する際に、カウンターオリゴヌクレオチドを添加する前項1〜11のいずれか一項に記載の方法;
等を提供するものである。
本発明における「生物由来検体」としては、例えば、細胞溶解液、組織溶解液(ここでの組織とは、血液、リンパ節等を含む広義の意味である。)若しくは、哺乳動物においては、血漿、血清、リンパ液等の体液、体分泌物(尿や乳汁等)等の生体試料及びこれら生体試料から抽出して得られたゲノムDNAをあげることができる。また当該生物由来検体としては、例えば、微生物、ウイルス等由来の試料もあげられ、この場合には、本発明測定方法における「ゲノムDNA」とは、微生物、ウイルスのゲノムDNAを意味するものである。
哺乳動物由来の検体が血液である場合には、定期健康診断や簡便な検査等での本発明測定方法の利用が期待できる。
ゲノムDNAを哺乳動物由来の検体から得るには、例えば、市販のDNA抽出用キット等を用いてDNAを抽出すればよい。
因みに、血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体として、その中に含まれる遊離DNA(胃癌細胞等の癌細胞由来のDNAが含まれる)を分析すると、血球由来のDNAを避けて胃癌細胞等の癌細胞由来のDNAを解析することができ、胃癌細胞等の癌細胞、それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
本発明における「CpG対」とは、CpGで示される塩基配列と、これに相補するCpGが結合してなる二本鎖オリゴヌクレオチドを意味するものである。
メチル化DNA抗体は、メチル化された塩基、メチル化DNA等を抗原として、通常の方法により作成できる。具体的にメチルシトシン抗体を作成するためには、5−メチルシチジン、5−メチルシトシン、あるいは、5−メチルシトシンを含むDNA等を抗原として作製された抗体からDNA中のメチルシトシンへの特異的な結合を指標として選抜することで作製できる。
動物に抗原を免疫して得られる抗体としては、精製した抗原を免疫した後、IgG画分の抗体(ポリクローナル抗体)を利用する方法と、単一のクローンを生産する抗体(モノクローナル抗体)を利用する方法がある。本特許ではメチル化DNA、あるいはメチルシトシンを特異的に認識できる抗体であることが望ましいため、モノクローナル抗体を利用することが望ましい。
モノクローナル抗体を作製する方法としては、細胞融合法による方法をあげることができる。例えば、細胞融合法は免疫したマウス由来の脾細胞(B細胞)と骨髄腫細胞とを細胞融合させることでハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマの生産する抗体を選抜して、メチルシトシン抗体(モノクローナル抗体)を作製できる。細胞融合法でモノクローナル抗体を作製する場合は、抗原を精製する必要がなく、例えば、5−メチルシチジン、5−メチルシトシン、又は、5−メチルシトシンを含むDNA等の混合物を抗原として、免疫に用いる動物に投与できる。投与方法としては、5−メチルシチジン、5−メチルシトシン、又は、5−メチルシトシンを含むDNA等を、直接、抗体を産生させるマウスへ投与する。抗体が産生されにくい場合は、抗原を支持体へ結合させて免疫しても良い。また、アジュバント溶液(例えば、流動パラフィンとAracel Aを混合し、アジュバントとして結核菌の死菌を混合したもの)と抗原をよく混合することや、リポソームに組み入れて免疫することで、抗原の免疫性を上げることができる。あるいは、抗原を含む溶液とアジュバント溶液を等量添加し、十分に乳液状にしてから、マウスの皮下あるいは腹腔内に注射する方法や、ミョウバン水とよく混合してから百日咳死菌をアジュバントとして添加する方法がある。尚、最初の免疫をしてから適当な期間の後、マウスの腹腔内あるいは静脈内に追加免疫することもできる。また、抗原の量が少ない場合には、抗原が浮遊する溶液を、直接マウス脾臓に注入して免疫しても良い。
最終免疫から数日後に脾臓を摘出し脂肪組織を剥離してから、脾細胞浮遊液を作製する。この脾細胞と、例えばHGPRT欠損骨髄腫細胞とを細胞融合してハイブリドーマを作製する。細胞融合剤としては脾細胞(B細胞)と骨髄腫細胞を効率的に融合できる方法ならば何でもよく、例えば、センダイウイルス(HVJ)、ポリエチレングリコール(PEG)を用いる方法などがあげられる。また、高電圧パルスを用いる方法で細胞融合をしても良い。
細胞融合操作の後、HAT培地で培養し、脾細胞と骨髄腫細胞が融合したハイブリドーマのクローンを選択し、スクリーニングが可能になるまで細胞が成育するのを待つ。目的とする抗体を生産するハイブリドーマを選択するための抗体の検出法や抗体力価の測定法には、抗原抗体反応系を利用できる。具体的には、可溶性抗原に対する抗体測定法で、放射性同位元素免疫定量法(RIA)、酵素免疫定量法(ELISA)などがあげられる。
「目的とするDNA領域(に対して相補性である塩基配列)を含む一本鎖DNA」とは、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAとの結合体(二本鎖)を形成するために必要な塩基配列、即ち、目的とするDNA領域の塩基配列の一部に相補的な塩基配列を含む塩基配列であることを意味し、「相補的塩基配列」と表現することもある。また、相補的塩基配列は、「相補的」と表現することもある。
一本鎖DNAを取得するには、二本鎖DNAを一本鎖DNAに分離して取得してもよいし、元来検体中に含まれる一本鎖DNAをそのまま取得してもよい。尚、この二本鎖DNAを一本鎖DNAに分離するには、通常の手法を用いて行うことができる。
このように固定化されるためには、メチル化DNA抗体を通常の遺伝子工学的な操作方法又は市販のキット・装置等に従って、支持体に固定すればよい(固相への結合)。具体的には、メチル化DNA抗体をビオチン化して得られたビオチン化メチル化DNA抗体をストレプトアビジンで被覆した支持体(例えば、ストレプトアビジンで被覆したPCRチューブ、ストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズ等)に固定する方法を挙げることができる。
また、メチル化DNA抗体に、例えば、アミノ基、チオール基、アルデヒド基等の活性官能基を有する分子を共有結合させた後、これをシランカップリング剤等で表面を活性化させたガラス、多糖類誘導体、シリカゲル、あるいは前記合成樹脂等、若しくは耐熱性プラスチック製の支持体に共有結合させる方法もある。尚、共有結合の際には、例えば、トリグリセライドを5個直列に連結して成るようなスペーサー、クロスリンカー等を利用して共有結合させてもよい。
さらに、メチル化DNA抗体を直接支持体に固定化してもよく、また、メチル化DNA抗体に対する抗体(二次抗体)を支持体に固定化し、二次抗体にメチル化抗体を結合させることで支持体に固定してもよい。
尚、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)を選択する際には、固定化メチル化DNA抗体が支持体に固定化されていればよく、(1)当該一本鎖DNA(正鎖)と固定化メチル化DNA抗体との結合前の段階で、固定化メチル化DNA抗体と支持体との結合により固定化されるものであってもよく、また(2)当該一本鎖DNA(正鎖)と固定化メチル化DNA抗体との結合後の段階で、固定化メチル化DNA抗体と支持体との結合により固定化されるものであってもよい。
(a)ビオチン化メチルシトシン抗体の適当量(例えば、0.1μg/50μL)をアビジン被覆PCRチューブに添加して得られた混合物を、室温で約1時間静置することにより、ビオチン化メチルシトシン抗体とストレプトアビジンとの固定化を促す。当該操作後、残溶液の除去及び洗浄を行う。得られたアビジン被覆PCRチューブに洗浄バッファー[例えば、0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO・7H2O、154mM NaCl pH7.4))を100μL/チューブの割合で添加した後、当該アビジン被覆PCRチューブから溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返することにより、支持体に固定化されたビオチン化メチルシトシン抗体をアビジン被覆PCRチューブ内に残す。
(b)生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来の二本鎖DNAをバッファー(例えば、33mM Tris-Acetate pH 7.9、66mM KOAc、10mM MgOAc2、0.5mM Dithothreitol)とを混合して、95℃で数分間加熱する。その後、約0〜4℃の温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温し、一本鎖DNAを形成させる。その後、室温に戻す。
(c)形成された前記一本鎖DNAを、ビオチン化メチルシトシン抗体が固定化されたアビジン被覆PCRチューブに添加し、その後、室温で約1時間静置し、ビオチン化メチルシトシン抗体と、前記一本鎖DNAのうちメチル化された一本鎖DNAとの結合を促す(結合体の形成)(この段階で、少なくともメチル化されてないDNA領域を含む一本鎖DNAは、結合体を形成しない。)。その後、残溶液の除去及び洗浄を行う。洗浄バッファー[例えば、0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO・7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を、100μL/チューブの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返し、結合体をPCRチューブ内に残す(結合体の選択)。
また例えば、(a)及び(c)における洗浄操作は、溶液中に浮遊している固定化されていないメチル化DNA抗体、メチル化DNA抗体に結合しなかった溶液中に浮遊しているメチル化されていない一本鎖DNA、または、後述の制限酵素で消化された溶液中に浮遊しているDNA等を反応溶液から取り除くため重要である。尚、洗浄バッファーは、上記の遊離のメチル化DNA抗体、溶液中に浮遊している一本鎖DNA等の除去に適していれば良く、前記洗浄バッファーに限らず、DELFIAバッファー(PerkinElmer社製、Tris-HCl pH 7.8 with Tween 80)、TEバッファー等でも良い。
本発明測定方法の第二工程における「メチル化感受性制限酵素」とは、例えば、メチル化されたシトシンを含む認識配列を消化せず、メチル化されていないシトシンを含む認識配列のみを消化することのできる制限酵素等を意味する。即ち、メチル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されているDNAの場合には、当該メチル化感受性制限酵素を当該DNAに作用させても、当該DNAは切断されない。これに対して、メチル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されていないDNAの場合には、当該メチル化感受性制限酵素を当該DNAに作用させれば、当該DNAは切断される。このようなメチル化感受性酵素の具体的な例としては、例えば、HpaII、BstUI、NarI、SacII、HhaI等を挙げることができる。尚、前記のメチル化感受性制限酵素は、ヘミメチル状態のCpG対を含む二本鎖DNA(即ち、前記CpG対のうち、一方の鎖のシトシンがメチル化されており、他方の鎖のシトシンがメチル化されていないような二本鎖DNA)を切断しないものであり、すでにGruenbaumらにより明らかにされている(Nucleic Acid Research, 9、 2509-2515)。
また、「一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素」とは、例えば、一本鎖DNA中の、メチル化されたシトシンを含む認識配列を消化せず、メチル化されていないシトシンを含む認識配列のみを消化することのできる制限酵素等を意味する。即ち、メチル化感受性制限酵素の中には、一本鎖DNAを消化するものもある。例えば、HhaI等を挙げることができる。
因みに、第一工程で選択されたメチル化された一本鎖DNAにおいて、目的とするDNA領域は一本鎖状態であり、負鎖としてのオリゴヌクレオチドは、目的とするDNA領域とは結合しないため、当該一本鎖DNAは生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来の一本鎖である。また、当該一本鎖DNAは、前述の通り、目的とするDNA領域の全てのCpGがメチル化されているとは限らない。したがって、前記の一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素がメチル状態である一本鎖DNAを切断しないという特性を利用することにより、前記の生物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおける前記の一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも1つ以上のCpGにおけるシトシンがメチル化されていたか否かを区別することができ、目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの含量をより精度良く求めることができる。つまり、目的とするDNA領域または目的とするDNA領域以外のほんの一部のCpGがメチル化されていたためメチル化抗体と結合体を形成し選択された一本鎖DNAについて、前記の一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素で消化処理することにより消化し、真にメチル化された目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAのみを選択することを可能にしている。即ち、前記の一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素で消化処理することにより、仮に生物由来検体中に含まれるゲノム由来の一本鎖DNAの目的とするDNA領域に含まれる一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位のCpGのシトシンがメチル化されている場合には、一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にはメチル化DNA抗体が結合しているが、ゲノム由来の一本鎖DNAの目的とするDNA領域に含まれる一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位のCpGのシトシンがメチル化されていない場合には、メチル化DNA抗体が結合していないため、一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素によって消化される。
したがって、消化処理を実施した後、後述のように、前記の目的とするDNA領域を増幅可能な一対のプライマーを用いたPCRを実施すると、生物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおける前記制限酵素の認識部位の中に存在している、少なくとも1つ以上のCpGにおけるシトシンがメチル化されていないのであれば、PCRによる増幅産物は得られず、一方、生物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおける前記の一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している全てのCpGにおけるシトシンがメチル化されていたのであれば、PCRによる増幅産物が得られることになる。
殆どのメチル化感受性制限酵素は、アンメチル化状態であっても一本鎖DNAを消化できないが、前述の通り、一部のメチル化感受性制限酵素はアンメチル化状態の一本鎖DNAを消化できる。一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素としては、例えば、HhaIがあり、このような酵素を利用することにより、一本鎖DNAのメチル化の有無を判別することができる。即ち、上記の操作で得られた固定化メチル化抗体と結合した検体中のDNAの一本鎖部分の、HhaIの認識部位に含まれるCpGのシトシンがメチル化されていたならば、HhaIは、このDNAを消化することができず、メチル化されていなければ、HhaIは、このDNAを消化する。従って、上記反応を実施後、目的とするDNA領域を増幅可能な一対のプライマーを用いてPCR反応を実施すると、検体中のDNAがアンメチル化状態であれば増幅産物は得られず、検体中のDNAがメチル化状態であれば増幅産物が得られることになる。
より具体的には例えば、ストレプトアビジンで被覆したPCRチューブを使用する場合には、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、これに生物由来検体の容量と略等量のTEバッファーを添加した後、当該TEバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。またストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズを使用する場合は、磁石によりビーズを固定した後、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、生物由来検体の容量と略等量のTEバッファーを添加した後、当該TEバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。
次いで、このような操作を数回実施することにより、消化物(前記制限酵素の認識部位に少なくとも1つ以上のアンメチル状態のCpGを含む一本鎖DNA)の除去及び洗浄(DNA精製)する。
尚、上記洗浄操作は、必ずしも必要ではない。例えば、前記メチル化感受性制限酵素処理で得られた溶液全てを、第三工程に用いることも可能である。
また、「生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料」が、少なくとも1種類以上のメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなるDNA試料であることを好ましい態様の一つとして挙げることができる。
これらの好ましい態様は、生物由来検体そのものを予め上記のような制限酵素で消化処理しておくことにより、メチル化量を精度良く求めることができるためである。当該方法は、上記のような「DNAの切れ残し」を無くすのに有用である。
生物由来検体に含まれるゲノムDNA由来の試料をメチル化感受性制限酵素により消化する方法としては、生物由来検体がゲノムDNA自体の場合には前記の方法と同様な方法でよく、生物由来検体が組織溶解液、細胞溶解液等の場合には前記の方法と同様な方法に準じて、大過剰のメチル化感受性制限酵素、例えば、25ngのDNA量に対して500倍量(10U)又はそれ以上のメチル化感受性制限酵素を用いて消化処理を実施すればよい。
ゲノムDNAは、基本的には二本鎖DNAとして存在している。したがって、本操作においては、一本鎖を消化できるメチル化感受性制限酵素(例えば、HhaI)だけでなく、二本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素(例えば、HpaII、BstUI、NarI、SacII、HhaI等)を用いることができる。
第三(前A)工程で分離された一本鎖状態であるDNA(正鎖)を鋳型として、当該一本鎖状態であるDNA(正鎖)が有する塩基配列の部分塩基配列(正鎖)であって、且つ、前記の目的とするDNA領域の塩基配列(正鎖)の3’末端よりさらに3’末端側に位置する部分塩基配列(正鎖)に対して相補性である塩基配列(負鎖)を有する伸長プライマー(フォーワード用プライマー)を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを1回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるDNA(正鎖)を二本鎖DNAとして伸長形成させる工程(第三(前B)工程)と、
第三(前B)工程で伸長形成された二本鎖DNAを、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)と目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)に一旦分離する工程(第三(前C)工程)を有し、且つ、本工程として
(a)生成した目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)を鋳型として、前記フォワード用プライマーを伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを一回伸長させることにより、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる本工程−Aと、
(b)生成した目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)を鋳型として、前記の目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)が有する塩基配列の部分塩基配列(負鎖)であって、且つ、前記の目的とするDNA領域の塩基配列(正鎖)に対して相補性である塩基配列(負鎖)の3’末端よりさらに3’末端側に位置する部分塩基配列(負鎖)、に対して相補性である塩基配列(正鎖)を有する伸長プライマー(リバース用プライマー)を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを1回伸長させることにより、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる本工程−Bとを有し、
さらにかかる各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する。
その後、本工程として、
(i) 生成した目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)に、前記のフォワード用プライマーをアニーリングさせるために、例えば、前記のフォワード用プライマーのTm値の約0〜20℃低い温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温する。
(ii)その後、室温に戻す。
(iii)上記(i)でアニーリングさせた前記の一本鎖状態であるDNAを鋳型として、前記のフォワード用プライマーを伸長プライマーとして、当該プライマーを1回伸長させることにより、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる(即ち、第三工程−A)。具体的には例えば、後述の説明や前述の本発明測定方法の第三(前B)工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよい。
(iv)生成した目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)を鋳型として、前記の目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)が有する塩基配列の部分塩基配列(負鎖)であって、且つ、前記の目的とするDNA領域の塩基配列(正鎖)に対して相補性である塩基配列(負鎖)の3'末端よりさらに3'末端側に位置する部分塩基配列(負鎖)、に対して相補性である塩基配列(正鎖)を有する伸長プライマー(リバース用プライマー)を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを1回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるDNAを伸長形成された二本鎖DNAとする(即ち、第三工程−B)。具体的には例えば、上記(iii)の第三工程−Aと同様に、第三(前B)工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよい。
(v)さらにかかる各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すこと(例えば、第三工程−A及び第三工程−B)により、前記の目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する。
目的とするDNA領域(即ち、目的領域)は、GCリッチな塩基配列が多いため、時に、ベタイン、DMSO等を適量加えて反応を実施してもよい。反応条件としては、例えば、前記のような反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて30秒間次いで55〜65℃にて30秒間さらに72℃にて30秒間を1サイクルとする保温を30〜40サイクル行う条件があげられる。かかるPCRを行った後、得られた増幅産物を検出する。例えば、予め標識されたプライマーを使用した場合には、先と同様の洗浄・精製操作を実施した後、蛍光標識体の量の測定によりPCR反応での増幅量を評価することができる。また、標識されていない通常のプライマーを用いたPCRを実施した場合には、金コロイド粒子、蛍光等で標識したプローブ等をアニーリングさせ、目的領域に結合した当該プローブの量を測定することにより検出することができる。また、増幅産物の量をより精度よく求めるには、例えば、リアルタイムPCR法を用いればよい。リアルタイムPCR法とは、PCRをリアルタイムでモニターし、得られたモニター結果をカイネティックス分析する方法であり、例えば、遺伝子量に関して2倍程度のほんの僅かな差異をも検出できる高精度の定量PCR法として知られる方法である。当該リアルタイムPCR法には、例えば、鋳型依存性核酸ポリメラーゼプローブ等のプローブを用いる方法、サイバーグリーン等のインターカレーターを用いる方法等を挙げることができる。リアルタイムPCR法のための装置及びキットは市販されるものを利用してもよい。以上の如く、検出については特に限定されることはなく、これまでに周知のあらゆる方法による検出が可能である。これら方法では、反応容器を移し換えることなく検出までの操作が可能となる。
例えば、疾患由来の生物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおいて100%メチル化されているDNA領域があり、そのDNA領域について、本発明測定方法を実施すれば、メチル化されたDNAの量は多くなり、例えば、疾患由来の生物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおいて100%メチル化されていないDNA領域があり、そのDNA領域について、本発明測定方法を実施すれば、メチル化されたDNAの量はほぼ0に近い値となるであろう。また、例えば、健常者の生物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおいて低メチル化状態(hypomethylation)で、且つ、疾患患者の生物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおいて高メチル化状態(hypermethylation)であるDNA領域があり、そのDNA領域について、本発明測定方法を実施すれば、健常者の場合には、メチル化されたDNAの量は、0に近い値を示し、一方、疾患患者の場合には、健常者の場合における値よりも有意に高い値を示すため、この値の差異に基づき、「疾患の度合い」を判定することができる。ここでの「疾患の度合い」とは、一般に当該分野において使用される意味と同様であって、具体的には、例えば、生物由来検体が細胞である場合には当該細胞の悪性度を意味し、また、例えば、生物由来検体が組織である場合には当該組織における疾患細胞の存在量等を意味している。さらに、生物由来検体が血漿・血清である場合にはその個体が疾患を有する確率を意味している。従って、本発明測定方法は、メチル化異常を調べることにより、各種疾患を診断することを可能にする。
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.1μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO・7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
溶液A:0.01pmoL/100μL TEバッファー溶液
溶液B:0.001pmoL/100μL TEバッファー溶液
溶液C:0.0001pmoL/100μL TEバッファー溶液
溶液D:0pmoL/100μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液)
UBC-M:5'-
AGTGACACCATNGAGAATGTCAGATCNGGATCAGAGNGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGACTACAACATCCAGA -3'(配列番号17)
<アンメチル化オリゴヌクレオチド>
UBC-U:5'-AGTGACACCATCGAGAATGTCAGATCCGGATCAGAGCGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGACTACAACATCCAGA-3'(配列番号18)
PF:5'-AGTGACACCATCGAGAATGTCA-3'(配列番号19)
PR:5'-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3'(配列番号20)
UBC:5'-AGTGACACCATCGAGAATGTCAGATCCGGATCAGAGCGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGACTACAACATCCAGA-3'(配列番号21)
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動に供することによりDNAの増幅を確認した。その結果を図1に示した(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。UBC−Mの溶液A(0.01pmol)、溶液B(0001pmol)、及び、溶液C(0.0001pmol)で、DNAの増幅が確認されその増幅産物(目的とするDNA領域:UBC)が得られた。UBC−Mの溶液D(0pmol)では、DNAの増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。一方、UBC−Uの溶液A(0,01pmol)、溶液B(0.001pmol)、溶液C(0.0001pmol)、及び、溶液D(0pmol)の全ての群において、DNAの増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.1μg/50μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO・7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
Nは5-メチルシトシンを示す。
GPR7-2079-2176/98mer-M(7):
5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGNGCNGGGTGGCNGGCCGCACCTACAGNGCCGNGNGNGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3'(配列番号22)
<HhaIで消化される部分メチル化オリゴヌクレオチド>
Nは5-メチルシトシンを示す。
GPR7-2079-2176/98mer-HM(5):
5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCNGGCCGCACCTACAGNGCCGNGNGNGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3'(配列番号23)
<アンメチル化オリゴヌクレオチド>
GPR7-2079-2176/98mer-UM:
5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCGGCCGCACCTACAGCGCCGCGCGCGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3'(配列番号24)
PF2:5'-GTTGGCCACTGCGGAGTCG-3'(配列番号25)
PR2:5'-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3'(配列番号26)
GPR7-2079-2176:5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCGGCCGCACCTACAGCGCCGCGCGCGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3'(配列番号27)
PCRを行った後、得られた増幅産物を1.5%アガロースゲル電気泳動に供することによりDNAの増幅を確認した。その結果を図2に示した(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。A処理群(無処理群)の場合、HhaIで消化されない部分メチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−M(7)と、HhaIで消化される部分メチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−HM(5)とでは、DNAの増幅が確認されその増幅産物(目的とするDNA領域:GPR7−2079−2176)が得られた。アンメチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−UMでは、DNAの増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。B処理群(HhaI処理群)の場合、HhaIで消化されない部分メチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−M(7)では、DNAの増幅が確認されその増幅産物(目的とするDNA領域:GPR7−2079−2176)が得られたが、HhaIで消化される部分メチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−HM(5)、及び、アンメチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−UMでは、DNAの増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.1μg/50μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO・7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
Nは5-メチルシトシンを示す。
GPR7-2079-2176/98mer-M(7):
5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGNGCNGGGTGGCNGGCCGCACCTACAGNGCCGNGNGNGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3'(配列番号22)
<HhaIで消化される部分メチル化オリゴヌクレオチド>
Nは5-メチルシトシンを示す。
GPR7-2079-2176/98mer-HM(5):
5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCNGGCCGCACCTACAGNGCCGNGNGNGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3'(配列番号23)
<アンメチル化オリゴヌクレオチド>
GPR7-2079-2176/98mer-UM:
5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCGGCCGCACCTACAGCGCCGCGCGCGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3'(配列番号24)
PF2:5'-GTTGGCCACTGCGGAGTCG-3'(配列番号25)
PR2:5'-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3'(配列番号26)
GPR7-2079-2176:5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCGGCCGCACCTACAGCGCCGCGCGCGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3'(配列番号27)
PCRを行った後、得られたPCR産物を1.5%アガロースゲル電気泳動に供することによりDNAの増幅を確認した。その結果を図2に示した(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。A処理群(無処理群)の場合、HhaIで消化されない部分メチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−M(7)と、HhaIで消化される部分メチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−HM(5)とは、DNAの増幅が確認されその増幅産物(目的とするDNA領域:GPR7−2079−2176)が得られた。アンメチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−UMでは、DNAの増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。B処理群(HhaI処理群)の場合、HhaIで消化されない部分メチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−M(7)では、増幅が確認されその増幅産物(目的とするDNA領域:GPR7−2079−2176)が得られたが、HhaIで消化される部分メチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−HM(5)、及び、アンメチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−UMでは、DNAの増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
PF1:5'- CTCAGCACCCAGGCGGCC -3' (配列番号28)
PR1:5'- CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3' (配列番号29)
X:5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3'(配列番号30)
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA社)により、DNAフラグメントXを精製した。
MX:5'- CTCAGCACCCAGGNGGCNGNGATCATGAGGNGNGAGNGGNGNGNGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGNGGGTGGCACACNGNGATGTAGNGGTNGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCNGANGCAAACATGCNGAACACCTGCAGGTGCTTCACCANGNGGCACAGCCAGTNGGGGCNGNGGAAGNGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGNGGCAGCACCTGGAAGAATGCCANGGCCAGGTNGGCCAGGCTGAGGTGTNGGATGAAGAGGTGCATGNGGGANGTCTTGNGNGGNGTCNGGTGCAGAGCCAGCAGTANGCTGCTGTTGCCCAGCANGGCCACNGNGAAAGTCACNGCCAGCANGGNGATCTCCAGTTTGGCCAG -3'(配列番号31)
溶液A:100pg/10μL TE溶液
溶液B:10pg/10μL TE溶液
溶液C:1pg/10μL TE溶液
溶液D:TE溶液(ネガティブコントロール液)
溶液MA:100pg/10μL TE溶液
溶液MB:10pg/10μL TE溶液
溶液MC:1pg/10μL TE溶液
溶液MD:TE溶液(ネガティブコントロール液)
X’:5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3' (配列番号32)
C1:5'- GCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCG -3' (配列番号33)
C2:5'- GCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACG -3' (配列番号34)
C3:5'- CGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGA -3' (配列番号35)
C4:5'- AGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATG -3' (配列番号36)
C5:5'- ACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCC -3' (配列番号37)
C6:5'- TAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGC -3' (配列番号38)
C7:5'- CGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGG -3' (配列番号39)
C8:5'- ATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACG -3' (配列番号40)
C9:5'- ATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAAC -3' (配列番号41)
C10:5'- TGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTC -3' (配列番号42)
C11:5'- CGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGG -3' (配列番号43)
C12:5'- CAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGG -3' (配列番号44)
PF1:5'- CTCAGCACCCAGGCGGCC -3' (配列番号28)
PR1:5'- CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3' (配列番号29)
X’:5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3' (配列番号32)
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
PF2:5'- TGAGCTCCGTAGGGCGTCC -3' (配列番号45)
PR2:5'- GCGCCGGGTCCGGGCCC -3' (配列番号46)
Y:5'- GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3'(配列番号47)
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA社)により、DNAフラグメントYを精製した。
MY:5'- GNGCNGGGTCNGGGCCNGATGNGTTGGNGGGCCAGGGCTCNGAGAANGAGGNGTTGTCCATCTCAANGAGGGCAGAGGAGCNGGNGACCTGGNGTCCCCCAAGGANGCCCTANGGAGCTCA -3'(配列番号48)
溶液A:100pg/10μL TE溶液
溶液B:10pg/10μL TE溶液
溶液C:1pg/10μL TE溶液
溶液D:TE溶液(ネガティブコントロール液)
溶液MA:100pg/10μL TE溶液
溶液MB:10pg/10μL TE溶液
溶液MC:1pg/10μL TE溶液
溶液MD:TE溶液(ネガティブコントロール液)
Y’:5'- GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3'(配列番号49)
C13:5'- GCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3' (配列番号50)
C14:5'- CTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTG -3' (配列番号51)
C15:5'- CGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGG -3' (配列番号52)
PF2:5'- TGAGCTCCGTAGGGCGTCC -3' (配列番号45)
PR2:5'- GCGCCGGGTCCGGGCCC -3' (配列番号46)
Y’:5'- GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3'(配列番号49)
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
調製した酵母細胞を、バッファーA(1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4)に懸濁し、2-メルカプトエタノール(終濃度14mM)及び100U zymolase(10 mg/ml)を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で1時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーB(50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA)に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g 4℃で30分間遠心して得られた沈澱を70%エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、1ml のTEバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA)に溶解し、40μg/mlになるようにRNase A(Sigma社製)を加えて37℃で1時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K(Sigma社製)を500μg/ml及びドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、これを55℃で約16時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl(pH 8.0)にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにNaClを0.5Nとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を70%エタノールでリンスすることにより、ゲノムDNAを得た。
得られたゲノムDNAから、以下の配列番号53及び配列番号54で示されるPCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー(PF3及びPR3)及び反応条件を用いてPCRを行うことにより、供試サンプルとして用いられるDNAフラグメント(S、配列番号55、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号271743-272083に相当する領域)を増幅した。
PF3:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号53)
PR3:5'- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3' (配列番号54)
S:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3'(配列番号55)
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA社)により、DNAフラグメントSを精製した。
MS:5'- AGGTGAGCTANGTGTGTTTGGGNGTNGTGCACTGGCTCACTTGTANGNGCAGAAATGGCAGCTTGTANGATTGGTGACCNGCCTTTTNGACACTGGACNGCTATGGANGTGGNGGNGGTGTGGNGGNGGCTCAATGACCTGTGGNGCCNGTTTGTGGNGTGNGATAGTNGAGCNGCCTGTCANGTGNGNGGCNGCCCTGCTCNGTTTGANGNGATGCATAGCATGNGACCACCCAGTAATCATACTGCTGANGCTATTGGTCANGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGNGGTGGNGTCCNGTTTCCACACNGTANGTGAGCACATGTCT -3'(配列番号56)
溶液A: 10pg/10μL TE溶液
溶液B: 1pg/10μL TE溶液
溶液C: TE溶液(ネガティブコントロール液)
溶液MA: 10pg/10μL TE溶液
溶液MB: 1pg/10μL TE溶液
溶液MC: TE溶液(ネガティブコントロール液)
S’:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3'(配列番号57)
C16:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号58)
C17:5'- GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA -3' (配列番号59)
C18:5'- CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC -3' (配列番号60)
C19:5'- ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT -3' (配列番号61)
C20:5'- GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT -3' (配列番号62)
C21:5'- TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC -3' (配列番号63)
C22:5'- ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT -3' (配列番号64)
C23:5'- TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG -3' (配列番号65)
C24:5'- ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG -3' (配列番号66)
C25:5'- CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC -3' (配列番号67)
PF3:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号53)
PR3:5'- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3' (配列番号54)
S’:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (配列番号57)
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
調製した酵母細胞を、バッファーA(1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4)に懸濁し、2-メルカプトエタノール(終濃度14mM)及び100U zymolase(10 mg/ml)を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で1時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーB(50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA)に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g 4℃で30分間遠心して得られた沈澱を70%エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、1ml のTEバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA)に溶解し、40μg/mlになるようにRNase A(Sigma社製)を加えて37℃で1時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K(Sigma社製)を500μg/ml及びドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、これを55℃で約16時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl(pH 8.0)にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにNaClを0.5Nとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を70%エタノールでリンスすることにより、ゲノムDNAを得た。
得られたゲノムDNAから、以下の配列番号68及び配列番号69で示されるPCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー(PF4及びPR4)及び反応条件を用いてPCRを行うことにより、供試サンプルとして用いられるDNAフラグメント(T、配列番号70、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384569-384685に相当する領域)を増幅した。
PF4:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号68)
PR4:5'- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3' (配列番号69)
T:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3'(配列番号70)
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA社)により、DNAフラグメントTを精製した。
MT:5'- GGACCTGTGTTTGANGGGTATAACACTAAGTTGNGCAATTTGCTGTATTGNGAAATCNGCCNGGANGATATCACTCTTGAGNGCATGTGCNGTTTCNGAGAANGCCAGATCTGTACT -3'(配列番号71)
溶液A: 10pg/10μL TE溶液
溶液B: 1pg/10μL TE溶液
溶液C: TE溶液(ネガティブコントロール液)
溶液MA: 10pg/10μL TE溶液
溶液MB: 1pg/10μL TE溶液
溶液MC: TE溶液(ネガティブコントロール液)
T’:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3'(配列番号72)
C26:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号73)
C27:5'- AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3' (配列番号74)
C28:5'- ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3' (配列番号75)
C29:5'- CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC -3' (配列番号76)
PF4:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号68)
PR4:5'- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3' (配列番号69)
T’:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3' (配列番号72)
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
調製した酵母細胞を、バッファーA(1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4)に懸濁し、2-メルカプトエタノール(終濃度14mM)及び100U zymolase(10 mg/ml)を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で1時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーB(50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA)に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g 4℃で30分間遠心して得られた沈澱を70%エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、1ml のTEバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA)に溶解し、40μg/mlになるようにRNase A(Sigma社製)を加えて37℃で1時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K(Sigma社製)を500μg/ml及びドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、これを55℃で約16時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl(pH 8.0)にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにNaClを0.5Nとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を70%エタノールでリンスすることにより、ゲノムDNAを得た。
溶液A:10ng/5μL TE溶液
溶液B:1ng/5μL TE溶液
溶液C:0.1ng/5μL TE溶液
溶液D:TE溶液(ネガティブコントロール液)
溶液MA:10ng/5μL TE溶液
溶液MB:1ng/5μL TE溶液
溶液MC:0.1ng/5μL TE溶液
溶液MD:TE溶液(ネガティブコントロール液)
S:5'- TAGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCTGGATTGC -3'(配列番号77)
C16:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号58)
C17:5'- GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA -3' (配列番号59)
C18:5'- CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC -3' (配列番号60)
C19:5'- ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT -3' (配列番号61)
C20:5'- GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT -3' (配列番号62)
C21:5'- TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC -3' (配列番号63)
C22:5'- ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT -3' (配列番号64)
C23:5'- TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG -3' (配列番号65)
C24:5'- ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG -3' (配列番号66)
C25:5'- CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC -3' (配列番号67)
PF3:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号53)
PR3:5'- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3' (配列番号54)
S’:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (配列番号57)
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
調製した酵母細胞を、バッファーA(1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4)に懸濁し、2-メルカプトエタノール(終濃度14mM)及び100U zymolase(10 mg/ml)を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で1時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーB(50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA)に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g 4℃で30分間遠心して得られた沈澱を70%エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、1ml のTEバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA)に溶解し、40μg/mlになるようにRNase A(Sigma社製)を加えて37℃で1時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K(Sigma社製)を500μg/ml及びドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、これを55℃で約16時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl(pH 8.0)にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにNaClを0.5Nとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を70%エタノールでリンスすることにより、ゲノムDNAを得た。
溶液A:10ng/5μL TE溶液
溶液B:1ng/5μL TE溶液
溶液C:0.1ng/5μL TE溶液
溶液D:TE溶液(ネガティブコントロール液)
溶液MA:10ng/5μL TE溶液
溶液MB:1ng/5μL TE溶液
溶液MC:0.1ng/5μL TE溶液
溶液MD:TE溶液(ネガティブコントロール液)
T:5'- TAGGAAATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCCTATTATTAGAGGGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACTGCGATCGCACACGAGGAGACACAGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGACAAATGAACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC -3'(配列番号78)
C26:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号73)
C27:5'- AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3' (配列番号74)
C28:5'- ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3' (配列番号75)
C29:5'- CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC -3' (配列番号76)
C30:5'- AATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCC -3' (配列番号79)
C31:5'- GCGATCGCACACGAGGAGACA -3' (配列番号80)
C32:5'- AGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGAC -3' (配列番号81)
C33:5'- AAATGAACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC -3' (配列番号82)
PF4:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号68)
PR4:5'- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3' (配列番号69)
T’:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3' (配列番号72)
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
PF1:5'- CTCAGCACCCAGGCGGCC -3' (配列番号28)
PR1:5'- CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3' (配列番号29)
X:5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3'(配列番号30)
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA社)により、DNAフラグメントXを精製した。
MX:5'- CTCAGCACCCAGGNGGCNGNGATCATGAGGNGNGAGNGGNGNGNGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGNGGGTGGCACACNGNGATGTAGNGGTNGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCNGANGCAAACATGCNGAACACCTGCAGGTGCTTCACCANGNGGCACAGCCAGTNGGGGCNGNGGAAGNGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGNGGCAGCACCTGGAAGAATGCCANGGCCAGGTNGGCCAGGCTGAGGTGTNGGATGAAGAGGTGCATGNGGGANGTCTTGNGNGGNGTCNGGTGCAGAGCCAGCAGTANGCTGCTGTTGCCCAGCANGGCCACNGNGAAAGTCACNGCCAGCANGGNGATCTCCAGTTTGGCCAG -3'(配列番号31)
溶液A:100pg/10μL TE溶液
溶液B:10pg/10μL TE溶液
溶液C:1pg/10μL TE溶液
溶液D:TE溶液(ネガティブコントロール液)
溶液MA:100pg/10μL TE溶液
溶液MB:10pg/10μL TE溶液
溶液MC:1pg/10μL TE溶液
溶液MD:TE溶液(ネガティブコントロール液)
X’:5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3' (配列番号32)
C1:5'- GCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCG -3' (配列番号33)
C2:5'- GCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACG -3' (配列番号34)
C3:5'- CGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGA -3' (配列番号35)
C4:5'- AGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATG -3' (配列番号36)
C5:5'- ACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCC -3' (配列番号37)
C6:5'- TAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGC -3' (配列番号38)
C7:5'- CGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGG -3' (配列番号39)
C8:5'- ATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACG -3' (配列番号40)
C9:5'- ATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAAC -3' (配列番号41)
C10:5'- TGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTC -3' (配列番号42)
C11:5'- CGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGG -3' (配列番号43)
C12:5'- CAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGG -3' (配列番号44)
PF1:5'- CTCAGCACCCAGGCGGCC -3' (配列番号28)
PR1:5'- CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3' (配列番号29)
X’:5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3' (配列番号32)
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
調製した酵母細胞を、バッファーA(1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4)に懸濁し、2-メルカプトエタノール(終濃度14mM)及び100U zymolase(10 mg/ml)を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で1時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーB(50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA)に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g 4℃で30分間遠心して得られた沈澱を70%エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、1ml のTEバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA)に溶解し、40μg/mlになるようにRNase A(Sigma社製)を加えて37℃で1時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K(Sigma社製)を500μg/ml及びドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、これを55℃で約16時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl(pH 8.0)にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにNaClを0.5Nとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を70%エタノールでリンスすることにより、ゲノムDNAを得た。
得られたゲノムDNAから、以下の配列番号53及び配列番号54で示されるPCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー(PF3及びPR3)及び反応条件を用いてPCRを行うことにより、供試サンプルとして用いられるDNAフラグメント(S、配列番号55、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号271743-272083に相当する領域)を増幅した。
PF3:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号53)
PR3:5'- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3' (配列番号54)
S:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3'(配列番号55)
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA社)により、DNAフラグメントSを精製した。
MS:5'- AGGTGAGCTANGTGTGTTTGGGNGTNGTGCACTGGCTCACTTGTANGNGCAGAAATGGCAGCTTGTANGATTGGTGACCNGCCTTTTNGACACTGGACNGCTATGGANGTGGNGGNGGTGTGGNGGNGGCTCAATGACCTGTGGNGCCNGTTTGTGGNGTGNGATAGTNGAGCNGCCTGTCANGTGNGNGGCNGCCCTGCTCNGTTTGANGNGATGCATAGCATGNGACCACCCAGTAATCATACTGCTGANGCTATTGGTCANGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGNGGTGGNGTCCNGTTTCCACACNGTANGTGAGCACATGTCT -3'(配列番号56)
溶液A:100pg/10μL TE溶液
溶液B:10pg/10μL TE溶液
溶液C:1pg/10μL TE溶液
溶液D:TE溶液(ネガティブコントロール液)
溶液MA:100pg/10μL TE溶液
溶液MB:10pg/10μL TE溶液
溶液MC:1pg/10μL TE溶液
溶液MD:TE溶液(ネガティブコントロール液)
S’:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3'(配列番号57)
C16:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号58)
C17:5'- GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA -3' (配列番号59)
C18:5'- CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC -3' (配列番号60)
C19:5'- ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT -3' (配列番号61)
C20:5'- GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT -3' (配列番号62)
C21:5'- TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC -3' (配列番号63)
C22:5'- ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT -3' (配列番号64)
C23:5'- TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG -3' (配列番号65)
C24:5'- ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG -3' (配列番号66)
C25:5'- CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC -3' (配列番号67)
PF3:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号53)
PR3:5'- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3' (配列番号54)
S’:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (配列番号57)
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
調製した酵母細胞を、バッファーA(1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4)に懸濁し、2-メルカプトエタノール(終濃度14mM)及び100U zymolase(10 mg/ml)を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で1時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーB(50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA)に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g 4℃で30分間遠心して得られた沈澱を70%エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、1ml のTEバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA)に溶解し、40μg/mlになるようにRNase A(Sigma社製)を加えて37℃で1時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K(Sigma社製)を500μg/ml及びドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、これを55℃で約16時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl(pH 8.0)にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにNaClを0.5Nとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を70%エタノールでリンスすることにより、ゲノムDNAを得た。
得られたゲノムDNAから、以下の配列番号68及び配列番号69で示されるPCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー(PF4及びPR4)及び反応条件を用いてPCRを行うことにより、供試サンプルとして用いられるDNAフラグメント(T、配列番号70、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384569-384685に相当する領域)を増幅した。
PF4:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号68)
PR4:5'- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3' (配列番号69)
T:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3'(配列番号70)
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA社)により、DNAフラグメントTを精製した。
MT:5'- GGACCTGTGTTTGANGGGTATAACACTAAGTTGNGCAATTTGCTGTATTGNGAAATCNGCCNGGANGATATCACTCTTGAGNGCATGTGCNGTTTCNGAGAANGCCAGATCTGTACT -3'(配列番号71)
溶液A:100pg/10μL TE溶液
溶液B:10pg/10μL TE溶液
溶液C:1pg/10μL TE溶液
溶液D:TE溶液(ネガティブコントロール液)
溶液MA:100pg/10μL TE溶液
溶液MB:10pg/10μL TE溶液
溶液MC:1pg/10μL TE溶液
溶液MD:TE溶液(ネガティブコントロール液)
T’:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3'(配列番号72)
C26:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号73)
C27:5'- AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3' (配列番号74)
C28:5'- ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3' (配列番号75)
C29:5'- CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC -3' (配列番号76)
PF4:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号68)
PR4:5'- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3' (配列番号69)
T’:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3' (配列番号72)
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
溶液A:10ng/5μL TE溶液
溶液B:1ng/5μL TE溶液
溶液C:TE溶液(ネガティブコントロール液)
溶液MA:10ng/5μL TE溶液
溶液MB:1ng/5μL TE溶液
溶液MC:TE溶液(ネガティブコントロール液)
X”:5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3' (配列番号83)
C1:5'- GCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCG -3' (配列番号33)
C2:5'- GCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACG -3' (配列番号34)
C3:5'- CGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGA -3' (配列番号35)
C4:5'- AGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATG -3' (配列番号36)
C5:5'- ACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCC -3' (配列番号37)
C6:5'- TAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGC -3' (配列番号38)
C7:5'- CGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGG -3' (配列番号39)
C8:5'- ATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACG -3' (配列番号40)
C9:5'- ATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAAC -3' (配列番号41)
C10:5'- TGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTC -3' (配列番号42)
C11:5'- CGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGG -3' (配列番号43)
C12:5'- CAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGG -3' (配列番号44)
PF1:5'- CTCAGCACCCAGGCGGCC -3' (配列番号28)
PR1:5'- CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3' (配列番号29)
X’:5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3' (配列番号32)
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
調製した酵母細胞を、バッファーA(1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4)に懸濁し、2-メルカプトエタノール(終濃度14mM)及び100U zymolase(10 mg/ml)を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で1時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーB(50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA)に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g 4℃で30分間遠心して得られた沈澱を70%エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、1ml のTEバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA)に溶解し、40μg/mlになるようにRNase A(Sigma社製)を加えて37℃で1時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K(Sigma社製)を500μg/ml及びドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、これを55℃で約16時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl(pH 8.0)にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにNaClを0.5Nとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を70%エタノールでリンスすることにより、ゲノムDNAを得た。
溶液A:10ng/5μL TE溶液
溶液B:1ng/5μL TE溶液
溶液C:0.1ng/5μL TE溶液
溶液D:TE溶液(ネガティブコントロール液)
溶液MA:10ng/5μL TE溶液
溶液MB:1ng/5μL TE溶液
溶液MC:0.1ng/5μL TE溶液
溶液MD:TE溶液(ネガティブコントロール液)
S:5'- TAGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCTGGATTGC -3'(配列番号77)
C16:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号58)
C17:5'- GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA -3' (配列番号59)
C18:5'- CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC -3' (配列番号60)
C19:5'- ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT -3' (配列番号61)
C20:5'- GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT -3' (配列番号62)
C21:5'- TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC -3' (配列番号63)
C22:5'- ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT -3' (配列番号64)
C23:5'- TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG -3' (配列番号65)
C24:5'- ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG -3' (配列番号66)
C25:5'- CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC -3' (配列番号67)
PF3:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号53)
PR3:5'- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3' (配列番号54)
S’:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (配列番号57)
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
調製した酵母細胞を、バッファーA(1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4)に懸濁し、2-メルカプトエタノール(終濃度14mM)及び100U zymolase(10 mg/ml)を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で1時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーB(50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA)に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g 4℃で30分間遠心して得られた沈澱を70%エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、1ml のTEバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA)に溶解し、40μg/mlになるようにRNase A(Sigma社製)を加えて37℃で1時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K(Sigma社製)を500μg/ml及びドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、これを55℃で約16時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl(pH 8.0)にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにNaClを0.5Nとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を70%エタノールでリンスすることにより、ゲノムDNAを得た。
溶液A:10ng/5μL TE溶液
溶液B:1ng/5μL TE溶液
溶液C:0.1ng/5μL TE溶液
溶液D:TE溶液(ネガティブコントロール液)
溶液MA:10ng/5μL TE溶液
溶液MB:1ng/5μL TE溶液
溶液MC:0.1ng/5μL TE溶液
溶液MD:TE溶液(ネガティブコントロール液)
T:5'- TAGGAAATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCCTATTATTAGAGGGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACTGCGATCGCACACGAGGAGACACAGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGACAAATGAACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC -3'(配列番号78)
C26:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号73)
C27:5'- AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3' (配列番号74)
C28:5'- ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3' (配列番号75)
C29:5'- CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC -3' (配列番号76)
C30:5'- AATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCC -3' (配列番号79)
C31:5'- GCGATCGCACACGAGGAGACA -3' (配列番号80)
C32:5'- AGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGAC -3' (配列番号81)
C33:5'- AAATGAACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC -3' (配列番号82)
PF4:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号68)
PR4:5'- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3' (配列番号69)
T’:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3' (配列番号72)
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号18
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号19
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号20
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号21
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号22
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号23
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号24
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号25
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号26
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号27
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号28
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号29
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号30
実験のために設計されたDNAフラグメント
配列番号31
実験のために設計されたメチル化DNAフラグメント
配列番号32
目的とするDNA領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号33
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号34
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号35
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号36
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号37
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号38
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号39
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号40
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号41
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号42
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号43
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号44
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号45
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号46
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号47
実験のために設計されたDNAフラグメント
配列番号48
実験のために設計されたメチル化DNAフラグメント
配列番号49
目的とするDNA領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号50
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号51
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号52
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号53
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号54
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号55
実験のために設計されたDNAフラグメント
配列番号56
実験のために設計されたメチル化DNAフラグメント
配列番号57
目的とするDNA領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号58
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号59
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号60
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号61
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号62
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号63
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号64
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号65
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号66
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号67
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号68
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号69
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号70
実験のために設計されたDNAフラグメント
配列番号71
実験のために設計されたメチル化DNAフラグメント
配列番号72
目的とするDNA領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号73
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号74 実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号75 実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号76
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号77
実験のために設計されたDNAフラグメント
配列番号78
実験のために設計されたDNAフラグメント
配列番号79
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号80
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号81
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号82
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号83
実験のために設計されたDNAフラグメント
Claims (12)
- 生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの含量を測定する方法であって、
(1)生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料からメチル化された一本鎖DNAを取得し、該一本鎖DNAと、固定化メチル化DNA抗体とを結合させて一本鎖DNAを選択する第一工程、
(2)第一工程で選択された一本鎖DNAを少なくとも1種類の一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素で消化処理する第二工程、及び、
(3)下記の各本工程の前工程として、第二工程で得られた未消化物である一本鎖DNA(前記の一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のCpGを含まない一本鎖DNA)を、前記の固定化メチル化DNA抗体から分離して一本鎖状態であるDNA(正鎖)にする工程(第三(前A)工程)と、
第三(前A)工程で分離された一本鎖状態であるDNA(正鎖)を鋳型として、当該一本鎖状態であるDNA(正鎖)が有する塩基配列の部分塩基配列(正鎖)であって、且つ、前記の目的とするDNA領域の塩基配列(正鎖)の3’末端よりさらに3’末端側に位置する部分塩基配列(正鎖)に対して相補性である塩基配列(負鎖)を有する伸長プライマー(フォーワード用プライマー)を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを1回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるDNA(正鎖)を二本鎖DNAとして伸長形成させる工程(第三(前B)工程)と、
第三(前B)工程で伸長形成された二本鎖DNAを、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)と目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)に一旦分離する工程(第三(前C)工程)を有し、且つ、本工程として
(a)生成した目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)を鋳型として、前記フォワード用プライマーを伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを一回伸長させることにより、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる本工程−Aと、
(b)生成した目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)を鋳型として、前記の目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)が有する塩基配列の部分塩基配列(負鎖)であって、且つ、前記の目的とするDNA領域の塩基配列(正鎖)に対して相補性である塩基配列(負鎖)の3’末端よりさらに3’末端側に位置する部分塩基配列(負鎖)、に対して相補性である塩基配列(正鎖)を有する伸長プライマー(リバース用プライマー)を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを1回伸長させることにより、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる本工程−B工程とを有し、
さらにかかる各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する第三工程、を有することを特徴とする方法。 - 請求項1記載の第三工程のメチル化DNA抗体がメチルシトシン抗体である、請求項1記載の、生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの含量を測定する方法
- 生物由来検体が、哺乳動物の血清又は血漿であることを特徴とする請求項1〜2のいずれかの請求項記載の方法。
- 生物由来検体が、哺乳動物の血液又は体液であることを特徴とする請求項1〜2のいずれかの請求項記載の方法。
- 生物由来検体が、細胞溶解液又は組織溶解液であることを特徴とする請求項1〜2のいずれかの請求項記載の方法。
- 生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料が、当該ゲノムDNAが有する目的とするDNA領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるDNA試料であることを特徴とする請求項1〜5のいずれかの請求項記載の方法。
- 生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料が、少なくとも1種類のメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなるDNA試料であることを特徴とする請求項1〜6のいずれかの請求項記載の方法。
- 生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料が、予め精製されてなるDNA試料であることを特徴とする請求項1〜7のいずれかの請求項記載の方法。
- 少なくとも1種類の1本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素が、生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域の中に認識切断部位を有する制限酵素であることを特徴とする請求項1〜8のいずれかの請求項記載の方法。
- 少なくとも1種類の1本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素が、メチル化感受性制限酵素であるHhaIであることを特徴とする請求項1〜9のいずれかの請求項記載の方法。
- 第二工程において一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素での消化処理を実施せずに第三工程を実施する請求項1〜10のいずれかの請求項記載の方法。
- 第一工程が、
生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料から、メチル化された一本鎖DNAを分離する第一(A)工程と、
第一(A)工程で分離された一本鎖DNAと固定化メチル化DNA抗体とを結合させる第一(B)工程と、からなり、
第一(A)工程でメチル化された一本鎖DNAを分離する際に、カウンターオリゴヌクレオチドを添加する請求項1〜11のいずれかの請求項記載の方法。
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