JP2012178986A - 試料中のメチル化ｄｎａを検出する方法 - Google Patents
試料中のメチル化ｄｎａを検出する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2012178986A JP2012178986A JP2011042367A JP2011042367A JP2012178986A JP 2012178986 A JP2012178986 A JP 2012178986A JP 2011042367 A JP2011042367 A JP 2011042367A JP 2011042367 A JP2011042367 A JP 2011042367A JP 2012178986 A JP2012178986 A JP 2012178986A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- methylated dna
- sample
- dna
- methylated
- binding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 63
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 213
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 28
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 16
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 18
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 claims description 16
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 16
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 13
- 238000002493 microarray Methods 0.000 claims description 12
- 108010007577 Exodeoxyribonuclease I Proteins 0.000 claims description 11
- 102100029075 Exonuclease 1 Human genes 0.000 claims description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 claims description 7
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 claims description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 7
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 5
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000006890 Methyl-CpG-Binding Protein 2 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010072388 Methyl-CpG-Binding Protein 2 Proteins 0.000 claims description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 3
- 229940119679 deoxyribonucleases Drugs 0.000 claims description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 3
- 241000192041 Micrococcus Species 0.000 claims description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 claims description 2
- 108010092809 exonuclease Bal 31 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010055863 gene b exonuclease Proteins 0.000 claims description 2
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 claims 1
- 101000581507 Homo sapiens Methyl-CpG-binding domain protein 1 Proteins 0.000 claims 1
- 101000615488 Homo sapiens Methyl-CpG-binding domain protein 2 Proteins 0.000 claims 1
- 101000615492 Homo sapiens Methyl-CpG-binding domain protein 4 Proteins 0.000 claims 1
- 102100027383 Methyl-CpG-binding domain protein 1 Human genes 0.000 claims 1
- 102100021299 Methyl-CpG-binding domain protein 2 Human genes 0.000 claims 1
- 102100021290 Methyl-CpG-binding domain protein 4 Human genes 0.000 claims 1
- 108010086093 Mung Bean Nuclease Proteins 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 103
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 39
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 28
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 20
- 102100030012 Deoxyribonuclease-1 Human genes 0.000 description 16
- 239000002585 base Substances 0.000 description 15
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 14
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 13
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 12
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 10
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 7
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 6
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 6
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 6
- 101000668165 Homo sapiens RNA-binding motif, single-stranded-interacting protein 1 Proteins 0.000 description 4
- 102100039692 RNA-binding motif, single-stranded-interacting protein 1 Human genes 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 4
- HWPZZUQOWRWFDB-UHFFFAOYSA-N 1-methylcytosine Chemical compound CN1C=CC(N)=NC1=O HWPZZUQOWRWFDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 description 3
- 102100030943 Glutathione S-transferase P Human genes 0.000 description 3
- 101001010139 Homo sapiens Glutathione S-transferase P Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 101150008380 gstp1 gene Proteins 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 101100365087 Arabidopsis thaliana SCRA gene Proteins 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 2
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101000668170 Homo sapiens RNA-binding motif, single-stranded-interacting protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 102100039690 RNA-binding motif, single-stranded-interacting protein 2 Human genes 0.000 description 2
- 101150105073 SCR1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100134054 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) NTG1 gene Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 2
- LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N bakuchiol Chemical compound CC(C)=CCC[C@@](C)(C=C)\C=C\C1=CC=C(O)C=C1 LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N 0.000 description 2
- 238000001369 bisulfite sequencing Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 2
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- -1 5-methylcytosine (methylated cytosine Chemical class 0.000 description 1
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical group OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000005956 Cosmos caudatus Nutrition 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 101710206036 Deoxyribonuclease-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical class O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000019975 dosage compensation by inactivation of X chromosome Effects 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- NRHMKIHPTBHXPF-TUJRSCDTSA-M sodium cholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 NRHMKIHPTBHXPF-TUJRSCDTSA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】より簡便にメチル化DNA試料を得ることができるチル化DNAの検出方法を提供することを課題とする。
【解決手段】メチル化DNAを含む可能性のある試料と、メチル化DNAと結合できるタンパク質とを接触させて、前記試料中のメチル化DNAと前記タンパク質とを結合させる工程と、前記結合工程で得られた試料と、少なくとも１種類のデオキシリボヌクレアーゼとを接触させて、前記試料中のDNAを分解する工程と、前記分解工程で得られた試料における、前記タンパク質との結合により前記デオキシリボヌクレアーゼで分解されなかったメチル化DNAを検出する工程とを含み、前記デオキシリボヌクレアーゼの少なくとも１種類が、一本鎖DNAを分解できるメチル化感受性制限酵素とは異なるデオキシリボヌクレアーゼである、試料中のメチル化DNAを検出する方法により、上記課題を解決する。
【選択図】図１
【解決手段】メチル化DNAを含む可能性のある試料と、メチル化DNAと結合できるタンパク質とを接触させて、前記試料中のメチル化DNAと前記タンパク質とを結合させる工程と、前記結合工程で得られた試料と、少なくとも１種類のデオキシリボヌクレアーゼとを接触させて、前記試料中のDNAを分解する工程と、前記分解工程で得られた試料における、前記タンパク質との結合により前記デオキシリボヌクレアーゼで分解されなかったメチル化DNAを検出する工程とを含み、前記デオキシリボヌクレアーゼの少なくとも１種類が、一本鎖DNAを分解できるメチル化感受性制限酵素とは異なるデオキシリボヌクレアーゼである、試料中のメチル化DNAを検出する方法により、上記課題を解決する。
【選択図】図１
Description
本発明は、DNAを含む試料からメチル化DNAを検出する方法に関する。
高等真核生物の染色体DNAでは、DNAを構成する塩基のうちC（シトシン）の５位がメチル化されることが知られている。このようなDNAのメチル化は、遺伝子発現の制御機構として機能している。例えば、ある遺伝子のプロモーター領域に存在するCpG配列に富む領域（「CpGアイランド」または「CG島」とも呼ばれる）がメチル化されている場合、その遺伝子の転写は抑制される。この現象は、「遺伝子のサイレンシング」とも呼ばれる。これに対して、CpGアイランドがメチル化されていない場合、転写因子がプロモーターに結合できるので、遺伝子の転写が可能となる。
上述のように、DNAのメチル化は遺伝子発現の制御機構の１つである。すなわち、DNAのメチル化は、初期胚発生、組織特異的な遺伝子の発現、哺乳動物に特徴的な現象である遺伝子刷り込みやX染色体の不活性化、染色体の安定化、DNA複製のタイミングなど、様々な生理的および病理的な現象に重要な役割を果たしている。さらに近年、DNAのメチル化の異常、すなわち、DNAのメチル化による遺伝子のサイレンシングが、癌などの疾患に関与することが明らかになってきている。そのため、種々の遺伝子についてメチル化DNAを検出することの重要性が近年増してきている。
メチル化DNAを検出する方法は、当該技術において種々の方法が知られており、例えばバイサルファイトシーケンス法、メチル化感受性制限酵素を用いる方法、メチル化DNA免疫沈降を用いる方法（MeDIP法）などが挙げられる。バイサルファイトシーケンス法では、バイサルファイトの作用によりDNA中の非メチル化シトシンをウラシルに変換し、塩基配列を決定することにより、DNA中のメチル化されている部位を検出する。メチル化感受性制限酵素を用いる方法では、メチル化感受性制限酵素がメチル化された認識配列を切断できないことを利用し、その切断結果を検討することによりメチル化DNAを検出する。MeDIP法では、メチル化DNAを特異的に認識する抗体またはメチル化DNA結合タンパク質を用いて免疫沈降を行い、得られたメチル化DNAをマイクロアレイ解析などに供することで、メチル化DNAを検出する。なお、この方法はMeDIP-Chip法として知られている。
また、特許文献１には、メチル化感受性制限酵素を用いるメチル化DNAを検出する方法において、抗メチル化DNA抗体を用いて試料中のメチル化DNAを固相に固定し、メチル化感受性制限酵素で消化処理を行う方法が開示されている。
このように、メチル化DNAの検出の重要性が増しており、新たなメチル化DNAを検出する方法の開発が望まれていた。
本発明は、試料中のメチル化DNAを検出するための、新たな方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、驚くべきことに、メチル化DNAに結合できるタンパク質とメチル化DNAを結合させることにより、該メチル化DNAがデオキシリボヌクレアーゼによっても完全には分解されずに残存すること、さらに得られたデオキシリボヌクレアーゼ分解産物が検出工程において影響を及ぼさないことを見出して、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
メチル化DNAを含む可能性のある試料と、メチル化DNAと結合できるタンパク質とを接触させて、前記試料中のメチル化DNAと前記タンパク質とを結合させる工程と、
前記結合工程で得られた試料と、少なくとも１種類のデオキシリボヌクレアーゼとを接触させて、前記試料中のDNAを分解する工程と、
前記分解工程で得られた試料における、前記タンパク質との結合により前記デオキシリボヌクレアーゼで分解されなかったメチル化DNAを検出する工程とを含み、
前記デオキシリボヌクレアーゼの少なくとも１種類が、一本鎖DNAを分解できるメチル化感受性制限酵素とは異なるデオキシリボヌクレアーゼである、試料中のメチル化DNAを検出する方法を提供する。
メチル化DNAを含む可能性のある試料と、メチル化DNAと結合できるタンパク質とを接触させて、前記試料中のメチル化DNAと前記タンパク質とを結合させる工程と、
前記結合工程で得られた試料と、少なくとも１種類のデオキシリボヌクレアーゼとを接触させて、前記試料中のDNAを分解する工程と、
前記分解工程で得られた試料における、前記タンパク質との結合により前記デオキシリボヌクレアーゼで分解されなかったメチル化DNAを検出する工程とを含み、
前記デオキシリボヌクレアーゼの少なくとも１種類が、一本鎖DNAを分解できるメチル化感受性制限酵素とは異なるデオキシリボヌクレアーゼである、試料中のメチル化DNAを検出する方法を提供する。
本発明によれば、試料中のメチル化DNAを検出するための新たな方法を提供することができる。また、本発明によれば、従来のメチル化DNAを検出する方法において、検出精度の向上のために必要とされていた洗浄操作および精製操作を省略こともできる。この場合、より簡便に試料中のメチル化DNAを検出することができる。
本明細書において「CpG部位」とは、DNAの塩基配列中、シトシン（C）とグアニン（G）が5'から3'への方向にこの順序で隣り合っている部位を意味する。なお、CpGの「p」の文字は、シトシンとグアニンとの間のホスホジエステル結合を表わす。
本明細書において「メチル化CpG部位」とは、シトシンの５位がメチル化修飾されたCpG部位を意味する。すなわち、メチル化CpG部位では、５−メチルシトシン（メチル化シトシン）とグアニンが5'から3'への方向にこの順序で隣り合っている。
本明細書において「メチル化DNA」とは、少なくとも１つの５−メチルシトシンを含むDNAを意味する。
本明細書において「メチル化CpG部位」とは、シトシンの５位がメチル化修飾されたCpG部位を意味する。すなわち、メチル化CpG部位では、５−メチルシトシン（メチル化シトシン）とグアニンが5'から3'への方向にこの順序で隣り合っている。
本明細書において「メチル化DNA」とは、少なくとも１つの５−メチルシトシンを含むDNAを意味する。
本発明の試料中のメチル化DNAを検出する方法（以下、「検出方法」ともいう）では、まず、メチル化DNAを含む可能性のある試料と、メチル化DNAと結合できるタンパク質とを接触させる。この接触により、該試料中にメチル化DNAが存在する場合、メチル化DNAと上記のタンパク質とを結合させることができる（以下、この工程を「結合工程」という）。
本発明の検出方法においては、上記のタンパク質と結合したメチル化DNAは、次の工程で用いられるデオキシリボヌクレアーゼで完全には分解されない。すなわち、上記のタンパク質との結合により、メチル化DNA中の５−メチルシトシンおよびその周辺領域はデオキシリボヌクレアーゼによる分解から免れる。
本発明の検出方法においては、上記のタンパク質と結合したメチル化DNAは、次の工程で用いられるデオキシリボヌクレアーゼで完全には分解されない。すなわち、上記のタンパク質との結合により、メチル化DNA中の５−メチルシトシンおよびその周辺領域はデオキシリボヌクレアーゼによる分解から免れる。
本発明の検出方法に供される試料は、メチル化DNAを含む可能性のある試料であれば特に限定されない。そのような試料としては、例えば、生体試料から調製されたDNA含有試料、５−メチルシトシンを少なくとも１つ含む合成ポリヌクレオチドを含有する試料などが挙げられる。生体試料としては、例えば培養細胞株、生体から採取された血液、体液、組織、細胞などが挙げられる。なお、本明細書において「血液」は、全血、ならびにそれから得られる血清および血漿のいずれであってもよい。また、本明細書において「組織」および「細胞」には、生体から採取した組織および細胞の培養物が含まれる。
メチル化DNAを含む可能性のある試料が、生体から採取された血液、体液、組織または細胞から調製された試料である場合、本発明の検出方法の結果は、DNAのメチル化が関連する疾患の診断または判定に利用することができる。
メチル化DNAを含む可能性のある試料が、生体から採取された血液、体液、組織または細胞から調製された試料である場合、本発明の検出方法の結果は、DNAのメチル化が関連する疾患の診断または判定に利用することができる。
本発明の実施形態において、生体試料からのDNA含有試料の調製は当該技術において公知の方法により行うことができる。例えば、細胞または組織を可溶化する界面活性剤（コール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウムなど）を含む可溶化液と生体試料とを混合した後、物理的処理（撹拌、ホモジナイズ、超音波破砕など）を施して生体試料に含まれるDNAを可溶化液中に遊離させて、DNAを抽出することにより試料を調製できる。また、本発明の実施形態においては、抽出したDNAを当該技術において公知の方法により精製してもよい。なお、生体試料からのDNAの抽出および精製は、市販のキットを用いて行うこともできる。
本発明の実施形態においては、試料中のDNAは、100〜1000 bp程度のDNA断片であることが好ましい。試料に含まれるDNAをそのような長さに断片化しておくことにより、メチル化DNAとメチル化DNAに結合できるタンパク質を効率よく結合させることができる。
なお、DNAの断片化は、物理的処理、化学的処理、制限酵素処理などの当該技術において公知の方法により行うことができる。物理的処理としては、例えば超音波破砕が挙げられる。化学的処理としては、例えば水酸化ナトリウムを用いるアルカリ処理が挙げられる。また、制限酵素処理では、制限酵素を目的のDNAの塩基配列に基づいて適宜選択でき、例えばMseIやBamHIなどを用い得る。本発明の実施形態においては、物理的処理により試料中のDNAを断片化することが好ましい。
なお、DNAの断片化は、物理的処理、化学的処理、制限酵素処理などの当該技術において公知の方法により行うことができる。物理的処理としては、例えば超音波破砕が挙げられる。化学的処理としては、例えば水酸化ナトリウムを用いるアルカリ処理が挙げられる。また、制限酵素処理では、制限酵素を目的のDNAの塩基配列に基づいて適宜選択でき、例えばMseIやBamHIなどを用い得る。本発明の実施形態においては、物理的処理により試料中のDNAを断片化することが好ましい。
本発明の実施形態において、試料に含まれる可能性のあるメチル化DNAは一本鎖メチル化DNAであってもよい。すなわち、上記の試料が一本鎖メチル化DNAを含む可能性のある試料であり、後述するメチル化DNAを検出する工程が一本鎖メチル化DNAを検出する工程である場合も、本発明の範囲に含まれる。
本発明の実施形態においては、上記の結合工程の前に、試料に含まれるDNAを一本鎖に変性させる操作を行ってもよい。そのような操作は当該技術において公知であり、例えば、メチル化DNAを含む可能性のある試料を95℃程度に加熱した後、４℃まで速やかに冷却することにより、試料中のDNAを一本鎖にすることができる。
本発明の実施形態においては、上記の結合工程の前に、試料に含まれるDNAを一本鎖に変性させる操作を行ってもよい。そのような操作は当該技術において公知であり、例えば、メチル化DNAを含む可能性のある試料を95℃程度に加熱した後、４℃まで速やかに冷却することにより、試料中のDNAを一本鎖にすることができる。
本発明の実施形態において、メチル化DNAと結合できるタンパク質は、DNA中の５−メチルシトシンまたはメチル化CpG部位を認識して結合できるタンパク質であれば特に限定されない。そのようなタンパク質としては、例えば抗メチル化DNA抗体、メチル化DNA結合タンパク質などが挙げられる。それらの中でも、抗メチル化DNA抗体が好ましい。特に、一本鎖のメチル化DNAを検出する場合は、抗メチル化DNA抗体を用いることが望ましい。
抗メチル化DNA抗体としては、抗メチル化シトシン抗体および抗メチル化CpG抗体が挙げられる。また、本発明の実施形態においては、抗メチル化シチジン抗体も抗メチル化DNA抗体として用いることができる。
本発明の実施形態において、抗メチル化DNA抗体は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれであってもよい。また、抗メチル化DNA抗体を断片化することによって得られる活性フラグメントを用いてもよい。そのような活性フラグメントは、メチル化DNAへの特異的結合活性を失っていないフラグメントであれば特に限定されず、例えばFabフラグメント、F(ab')2フラグメント、sFvフラグメントなどが挙げられる。活性フラグメントは、例えば、精製した抗メチル化DNAモノクローナル抗体をパパイン、ペプシン、トリプシンなどの酵素で切断することにより調製できる。
本発明の実施形態において、抗メチル化DNA抗体は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれであってもよい。また、抗メチル化DNA抗体を断片化することによって得られる活性フラグメントを用いてもよい。そのような活性フラグメントは、メチル化DNAへの特異的結合活性を失っていないフラグメントであれば特に限定されず、例えばFabフラグメント、F(ab')2フラグメント、sFvフラグメントなどが挙げられる。活性フラグメントは、例えば、精製した抗メチル化DNAモノクローナル抗体をパパイン、ペプシン、トリプシンなどの酵素で切断することにより調製できる。
本発明の実施形態においては、市販の抗メチル化DNA抗体を用いてもよい。市販の抗メチル化DNA抗体としては、例えば表１に示される抗体が挙げられる。
本発明の実施形態においては、当該技術において公知の方法により作製した抗メチル化DNA抗体を用いてもよい。抗メチル化DNA抗体は、例えば、次の手順により作製できる。まず、５−メチルシトシンなどのメチル化DNAを免疫原として、所望によりアジュバントとともに適切な哺乳動物（例えばラット、マウスなど）に投与して免疫する。そして、免疫された動物の脾臓細胞などから、免疫原に対する抗体を産生する抗体産生細胞をスクリーニングにより選択する。得られた抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを得て、これをスクリーニングすることにより、メチル化DNAへの特異的結合活性を有する抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。得られたハイブリドーマの培養上清又は該ハイブリドーマをマウスの腹腔内に投与して得られる腹水から、抗メチル化DNA抗体を得ることができる。
抗メチル化DNA抗体を産生するハイブリドーマとしては、例えば、独立行政法人製品評価技術基盤機構（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、郵便番号２９２−０８１８）に、２００９年８月２５日に受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−８０５で寄託されたハイブリドーマＳＣＲ２、ならびに２００９年９月１０日に受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−８１０、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−８１１および受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−８１２でそれぞれ寄託されたハイブリドーマＳＣＲ１、ＳＣＲ３およびＳＣＲ６が挙げられる。
本発明の実施形態においては、上記のハイブリドーマＳＣＲ１、ＳＣＲ２、ＳＣＲ３およびＳＣＲ６から産生される抗メチル化DNA抗体を用いることができる。
本発明の実施形態においては、上記のハイブリドーマＳＣＲ１、ＳＣＲ２、ＳＣＲ３およびＳＣＲ６から産生される抗メチル化DNA抗体を用いることができる。
メチル化DNA結合タンパク質としては、例えばMBD1（methyl cytosine binding domain protein 1）、MBD2（methyl cytosine binding domain protein 2）、MBD4（methyl cytosine binding domain protein 4）、MeCP2（methyl CpG binding protein 2）などが挙げられる。なお、これらのタンパク質自体は当該技術において公知である。
本発明の実施形態においては、メチル化DNA結合タンパク質は、メチル化DNAを特異的に認識して結合できる限り、野生型のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸の欠失、置換または付加を含む変異型であってもよい。なお、そのような変異型の作製方法自体は当該技術において公知である。
本発明の実施形態においては、メチル化DNA結合タンパク質は、メチル化DNAを特異的に認識して結合できる限り、野生型のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸の欠失、置換または付加を含む変異型であってもよい。なお、そのような変異型の作製方法自体は当該技術において公知である。
本発明の実施形態において、メチル化DNAを含む可能性のある試料と、メチル化DNAと結合できるタンパク質との接触は、試料に該タンパク質を添加することにより行うことができる。本発明の実施形態において、メチル化DNAと結合できるタンパク質の添加量は特に限定されず、後の検出工程において十分に検出可能なメチル化DNA量を確保できる添加量であればよい。例えば、試料中の核酸含量が１ng〜10μgである場合、抗メチル化DNA抗体の添加量は１ng〜10μg程度であればよい。
また、接触条件（周囲温度および時間）は、メチル化DNAに結合できるタンパク質の種類により異なるが、通常４〜42℃にて10分〜24時間程度であればよい。
また、接触条件（周囲温度および時間）は、メチル化DNAに結合できるタンパク質の種類により異なるが、通常４〜42℃にて10分〜24時間程度であればよい。
本発明の検出方法では、上記の結合工程で得られた試料と、少なくとも１種類のデオキシリボヌクレアーゼとを接触させて、該試料中のDNAを分解する（以下、この工程を「分解工程」という）。
この工程では、メチル化DNAと結合できるタンパク質と結合しなかったDNA、すなわち非メチル化DNAはデオキシリボヌクレアーゼにより分解されるが、該タンパク質と結合したメチル化DNAは、その結合により５−メチルシトシンおよびその周辺領域は分解されない。
すなわち、本発明の検出方法において、上記の結合工程および分解工程により、非メチル化DNAを除去することができる。
この工程では、メチル化DNAと結合できるタンパク質と結合しなかったDNA、すなわち非メチル化DNAはデオキシリボヌクレアーゼにより分解されるが、該タンパク質と結合したメチル化DNAは、その結合により５−メチルシトシンおよびその周辺領域は分解されない。
すなわち、本発明の検出方法において、上記の結合工程および分解工程により、非メチル化DNAを除去することができる。
本発明の実施形態においては、デオキシリボヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼのいずれであってもよい。なお、本発明の実施形態においては、デオキシリボヌクレアーゼとして制限酵素を用いてもよい。この場合、DNA切断部位は該制限酵素の認識領域に限定される。そのため、分解工程で得られた試料を、そのまま後述の検出工程に用いる場合は、分解物が後の検出工程に影響を及ぼさないよう留意すべきである。例えば、複数種類の制限酵素を用いることにより、非メチル化DNAを十分に分解することができる。
本発明の好ましい実施形態において、デオキシリボヌクレアーゼは、デオキシリボヌクレアーゼI（DNaseI）、エキソヌクレアーゼI、ラムダ・エキソヌクレアーゼ、T7エキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼIII、RecJ型エキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼT、BAL31ヌクレアーゼ、Mung Beanヌクレアーゼ、ミクロコッカス・ヌクレアーゼおよびT7エンドヌクレアーゼからなる群より選択される少なくとも１つである。
本発明の検出方法においては、用いるデオキシリボヌクレアーゼの少なくとも１種類が、一本鎖DNAを分解できるメチル化感受性制限酵素とは異なるデオキシリボヌクレアーゼである。ここで「一本鎖DNAを分解できるメチル化感受性制限酵素」とは、一本鎖DNA中のメチル化されたシトシンを含む認識配列を切断せず、メチル化されていないシトシンを含む認識配列のみを切断することのできる制限酵素を意味する。そのような制限酵素としては、例えばHhaIが挙げられる。
本発明の実施形態において、上記の結合工程で得られた試料と、デオキシリボヌクレアーゼとの接触は、試料にデオキシリボヌクレアーゼを添加することにより行うことができる。本発明の実施形態において、デオキシリボヌクレアーゼの添加量は特に限定されず、後の検出工程において非メチル化DNAを十分に分解できる添加量であればよい。例えば、試料中の核酸含量が１ng〜10μgである場合、DNaseIの添加量は0.1〜120 U程度であればよい。
また、接触条件（周囲温度および時間）は、デオキシリボヌクレアーゼの種類により異なるが、通常４〜42℃にて10分〜24時間程度であればよい。
また、接触条件（周囲温度および時間）は、デオキシリボヌクレアーゼの種類により異なるが、通常４〜42℃にて10分〜24時間程度であればよい。
本発明の検出方法において、上記の分解工程で得られた試料はそのまま次の検出工程に用いることもできる。そのため、非メチル化DNAの除去するための洗浄およびメチル化DNAの精製を省略することもできる。
本発明の実施形態においては、次の検出工程で用いられる検出手段に応じて、上記の分解工程で得られた試料に含まれるメチル化DNAを鋳型とする核酸増幅法を実行してもよい。DNAを増幅する方法自体は、当該技術において公知であるDNA増幅法であれば特に限定されない。例えばIVT（in vitro transcription）増幅法、SPIA（商標）増幅法、GenomiPhi増幅法などが挙げられる。
本発明の検出方法では、上記の分解工程で得られた試料における、メチル化DNAに結合できるタンパク質との結合によりデオキシリボヌクレアーゼで分解されなかったメチル化DNAを検出する（以下、この工程を「検出工程」という）。
本明細書において「メチル化DNAを検出する」とは、メチル化DNA中の目的のCpG部位のメチル化の有無を検出すること、メチル化DNAの塩基配列を決定すること、およびメチル化DNA中のCpG部位のメチル化の頻度を解析することを意味する。ここで「メチル化の頻度」とは、メチル化DNA中の目的の領域に存在する全てのCpG部位または任意のCpG部位のうち、メチル化CpG部位の数またはその割合を意味する。
本明細書において、メチル化DNAの検出は、目的のDNAのメチル化の判定や、メチル化DNAの塩基配列を決定や、メチル化DNAの網羅的な解析など、上述の分解工程でデオキシリボヌクレアーゼにより分解されなかったメチル化DNAを検出できるものであれば、特に制限されない。
本発明の実施形態において、検出工程に用いられる方法は、上述の分解工程でデオキシリボヌクレアーゼにより分解されなかったメチル化DNAを検出できるものであれば特に限定されず、当該技術において公知の方法から適宜選択できる。そのような方法としては、核酸増幅法、塩基配列決定法、マイクロアレイ法などが挙げられる。
例えば、核酸増幅法を検出工程に用い、目的のＤＮＡのメチル化の有無を判定する場合、目的のＤＮＡにあるCpG部位を挟むように設計したプライマーセットを用いてPCR法を行い、増幅産物の有無から、目的のＤＮＡのメチル化の有無を判定することができる。また、定量PCR法により、試料中のメチル化DNA含量を定量することもできる。さらに、塩基配列決定法の一つである高速シーケンス法（次世代シーケンス法）を検出工程に用いれば、メチル化DNAを網羅的に解析することもできる。そのような高速シークエンス法に用いられるシークエンサーとしては、例えばABI3730xl（Life Technologies社）、GS FLX Titanium（Roche社）、などが挙げられる。
また、マイクロアレイ法を検出工程に用いることもできる。この場合、マイクロアレイは特に限定されないが、好ましくはDNAマイクロアレイまたはDNAチップである。また、GeneChip（登録商標）（Affymetrix社）など市販のマイクロアレイを用いてもよく、当該技術に公知の方法によって作製したマイクロアレイを用いてもよい。なお、全ゲノム領域または特定の領域から等間隔に抽出した塩基配列を有するプローブがタイル状に配置されたマイクロアレイであるタイリングアレイを検出工程に用いれば、メチル化DNAを網羅的に解析することができる。
本発明の実施形態において、マイクロアレイ法を検出工程に用いる場合、上記の試料中のDNAは当該技術において公知の標識物質により標識されていることが好ましい。したがって、本発明の検出方法は、試料中のDNAを標識する工程をさらに含んでいてもよい。標識物質としては、蛍光物質、ビオチンなどのハプテン、放射性物質などが挙げられる。蛍光物質としては、Cy3、Cy5、Alexa Fluor（商標）、FITCなどが挙げられる。マイクロアレイ法においては、DNAを標識することによりシグナル測定が容易になる。なお、DNAを標識物質で標識する方法自体は当該技術において公知である。
上記のシグナルは、マイクロアレイの種類に応じて適切なシグナルであり得る。例えば、シグナルは、マイクロアレイの各プローブとハイブリダイズしたDNAが存在する場合に発生する電気的シグナルであってもよいし、上記のように試料中のDNAが標識されている場合は、標識物質から生じる蛍光、発光、放射線などのシグナルであってもよい。
シグナルの検出は、通常のマイクロアレイ測定装置に備えられたスキャナーにより行うことができる。スキャナーとしては、例えば、GeneChip（登録商標）Scanner3000 7G（Affymetrix社）などが挙げられる。
シグナルの検出は、通常のマイクロアレイ測定装置に備えられたスキャナーにより行うことができる。スキャナーとしては、例えば、GeneChip（登録商標）Scanner3000 7G（Affymetrix社）などが挙げられる。
以下に本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
検出対象のメチル化DNAとして、５−メチルシトシンを６つ含むオリゴヌクレオチドである６ＭｅＣＧオリゴヌクレオチドを用いた。６ＭｅＣＧオリゴヌクレオチドの塩基配列を、以下に示す。
＜６ＭｅＣＧオリゴヌクレオチド＞
5'-CGAGGTCGACGGTATTGATm5cGAGTATm5cGATAGTm5cGATATm5cGATATm5cGATATm5cGATATACAACGTCGTGACTGG-3'（配列番号１）
（塩基配列中の「m5c」は、５−メチルシトシンを示す。）
検出対象のメチル化DNAとして、５−メチルシトシンを６つ含むオリゴヌクレオチドである６ＭｅＣＧオリゴヌクレオチドを用いた。６ＭｅＣＧオリゴヌクレオチドの塩基配列を、以下に示す。
＜６ＭｅＣＧオリゴヌクレオチド＞
5'-CGAGGTCGACGGTATTGATm5cGAGTATm5cGATAGTm5cGATATm5cGATATm5cGATATm5cGATATACAACGTCGTGACTGG-3'（配列番号１）
（塩基配列中の「m5c」は、５−メチルシトシンを示す。）
（１）試料の調製
10 pMの６ＭｅＣＧオリゴヌクレオチドの水溶液を、６ＭｅＣＧオリゴヌクレオチド溶液として調製した。６ＭｅＣＧオリゴヌクレオチド溶液を95℃で10分間加熱して変性させた後、氷上に１分間静置した。変性させた６ＭｅＣＧオリゴヌクレオチドの溶液から２μlを取り、これをインプットサンプルとした。残りの溶液を本発明の検出方法に供される試料とした。
10 pMの６ＭｅＣＧオリゴヌクレオチドの水溶液を、６ＭｅＣＧオリゴヌクレオチド溶液として調製した。６ＭｅＣＧオリゴヌクレオチド溶液を95℃で10分間加熱して変性させた後、氷上に１分間静置した。変性させた６ＭｅＣＧオリゴヌクレオチドの溶液から２μlを取り、これをインプットサンプルとした。残りの溶液を本発明の検出方法に供される試料とした。
（２）試料と抗メチル化DNA抗体との接触
上記の試料を二つに分け、一方に抗メチル化DNA抗体（１μg）を添加して検体サンプル（100μl）とし、他方には抗メチル化DNA抗体を添加せず対照サンプル（100μl）とした。各サンプルを25℃で２時間インキュベートした。
なお、本実施例で用いた抗メチル化DNA抗体は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、郵便番号２９２−０８１８）に、２００９年８月２５日に受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−８０５で寄託されたハイブリドーマＳＣＲ２から得られたモノクローナル抗体である。
上記の試料を二つに分け、一方に抗メチル化DNA抗体（１μg）を添加して検体サンプル（100μl）とし、他方には抗メチル化DNA抗体を添加せず対照サンプル（100μl）とした。各サンプルを25℃で２時間インキュベートした。
なお、本実施例で用いた抗メチル化DNA抗体は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、郵便番号２９２−０８１８）に、２００９年８月２５日に受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−８０５で寄託されたハイブリドーマＳＣＲ２から得られたモノクローナル抗体である。
（３）デオキシリボヌクレアーゼによるDNAの分解
上記の検体サンプルおよび対照サンプルに、デオキシリボヌクレアーゼの１種であるDNaseI（２U/μl：NEB社）を１μlずつ添加し、37℃で１時間反応させた。反応後、各サンプルを75℃で10分間加熱することにより、DNaseIを失活させた。
上記の検体サンプルおよび対照サンプルに、デオキシリボヌクレアーゼの１種であるDNaseI（２U/μl：NEB社）を１μlずつ添加し、37℃で１時間反応させた。反応後、各サンプルを75℃で10分間加熱することにより、DNaseIを失活させた。
（４）メチル化DNAの検出
試料中に６ＭｅＣＧオリゴヌクレオチドが残存しているか否かを検討するために、定量PCR法を行った。
（i）PCR反応液の調製
下記の試薬を混合して、12μlの反応液を調製した。
2x FastStart SYBR Green Master Mix（ROCHE社） ６μl
フォワード（Ｆ）プライマー（10μM） １μl
リバース（Ｒ）プライマー（10μM） １μl
サンプル １μl
dH 2 O ３μl
合計 12μl
試料中に６ＭｅＣＧオリゴヌクレオチドが残存しているか否かを検討するために、定量PCR法を行った。
（i）PCR反応液の調製
下記の試薬を混合して、12μlの反応液を調製した。
2x FastStart SYBR Green Master Mix（ROCHE社） ６μl
フォワード（Ｆ）プライマー（10μM） １μl
リバース（Ｒ）プライマー（10μM） １μl
サンプル １μl
dH 2 O ３μl
合計 12μl
（ii）プライマーの配列
６ＭｅＣＧオリゴヌクレオチドを検出するためのプライマーセットとして、配列番号２および配列番号３で示されるプライマーセットを用いた。このプライマーセットの塩基配列を以下に示す。
Ｆ：5'- CGAGGTCGACGGTAT -3' （配列番号２）
Ｒ：5'- CCAGTCACGACGTTGTA -3'（配列番号３）
（iii）定量PCR反応条件
上記の反応液について、Mx3005P（Stratagene社製）を用いて、以下の反応条件で定量PCRを行った。
95℃で10分、
95℃で30秒、55℃で15秒および72℃で30秒を45サイクル、ならびに
95℃で１分、55℃で30秒および95℃で30秒を１サイクル。
６ＭｅＣＧオリゴヌクレオチドを検出するためのプライマーセットとして、配列番号２および配列番号３で示されるプライマーセットを用いた。このプライマーセットの塩基配列を以下に示す。
Ｆ：5'- CGAGGTCGACGGTAT -3' （配列番号２）
Ｒ：5'- CCAGTCACGACGTTGTA -3'（配列番号３）
（iii）定量PCR反応条件
上記の反応液について、Mx3005P（Stratagene社製）を用いて、以下の反応条件で定量PCRを行った。
95℃で10分、
95℃で30秒、55℃で15秒および72℃で30秒を45サイクル、ならびに
95℃で１分、55℃で30秒および95℃で30秒を１サイクル。
得られた反応液を、３%アガロースゲルを用いる電気泳動に付し、増幅産物の有無を確認した。結果を図１に示す。
図１より、抗メチル化DNA抗体を添加しなかったサンプルでは増幅産物のバンドが検出されず、抗体を添加したサンプルではバンドが検出されたことがわかる。このことから、６ＭｅＣＧオリゴヌクレオチドに抗メチル化DNA抗体を結合させることにより、DNaseIによる該オリゴヌクレオチドの分解が阻害され、６ＭｅＣＧオリゴヌクレオチドを検出できることが示された。
図１より、抗メチル化DNA抗体を添加しなかったサンプルでは増幅産物のバンドが検出されず、抗体を添加したサンプルではバンドが検出されたことがわかる。このことから、６ＭｅＣＧオリゴヌクレオチドに抗メチル化DNA抗体を結合させることにより、DNaseIによる該オリゴヌクレオチドの分解が阻害され、６ＭｅＣＧオリゴヌクレオチドを検出できることが示された。
（実施例２）
（１）試料の調製
実施例１と同様にして、６ＭｅＣＧオリゴヌクレオチドの溶液を調製し、該溶液からインプットサンプルおよび本発明の検出方法に供される試料を得た。
（２）抗メチル化DNA抗体との接触
上記の試料から、実施例１と同様にして、検体サンプルおよび対照サンプルを得た。
（３）デオキシリボヌクレアーゼによるDNAの分解
上記の検体サンプルおよび対照サンプルに、デオキシリボヌクレアーゼの１種であるエキソヌクレアーゼI（20 U/μl：NEB社）を４μlずつ添加し、37℃で１時間反応させた。反応後、各サンプルを80℃で20分間加熱することにより、エキソヌクレアーゼIを失活させた。
（４）メチル化DNAの検出
試料中に６ＭｅＣＧオリゴヌクレオチドが残存しているか否かを検討するために、実施例１と同様にして定量PCR法を行った。
得られた反応液を、３%アガロースゲルを用いる電気泳動に付し、増幅産物の有無を確認した。結果を図２に示す。
（１）試料の調製
実施例１と同様にして、６ＭｅＣＧオリゴヌクレオチドの溶液を調製し、該溶液からインプットサンプルおよび本発明の検出方法に供される試料を得た。
（２）抗メチル化DNA抗体との接触
上記の試料から、実施例１と同様にして、検体サンプルおよび対照サンプルを得た。
（３）デオキシリボヌクレアーゼによるDNAの分解
上記の検体サンプルおよび対照サンプルに、デオキシリボヌクレアーゼの１種であるエキソヌクレアーゼI（20 U/μl：NEB社）を４μlずつ添加し、37℃で１時間反応させた。反応後、各サンプルを80℃で20分間加熱することにより、エキソヌクレアーゼIを失活させた。
（４）メチル化DNAの検出
試料中に６ＭｅＣＧオリゴヌクレオチドが残存しているか否かを検討するために、実施例１と同様にして定量PCR法を行った。
得られた反応液を、３%アガロースゲルを用いる電気泳動に付し、増幅産物の有無を確認した。結果を図２に示す。
図２より、抗メチル化DNA抗体を添加しなかったサンプルでは増幅産物のバンドが検出されず、抗体を添加したサンプルではバンドが検出されたことがわかる。このことから、６ＭｅＣＧオリゴヌクレオチドに抗メチル化DNA抗体を結合させることにより、エキソヌクレアーゼIによる該オリゴヌクレオチドの分解が阻害され、６ＭｅＣＧオリゴヌクレオチドを検出できることが示された。
（実施例３）
本実施例では、検出対象のメチル化DNAとして、乳癌細胞株MCF7のゲノムDNAにおいて高頻度にメチル化修飾されることが知られているGSTP1遺伝子のプロモーター領域を選択した。なお、GSTP1遺伝子のプロモーター領域の塩基配列は当該技術において公知である。
また、非メチル化DNA（ネガティブコントロール）として、ヒトの第14染色体に存在し、CpG部位を有さないのでメチル化修飾されない領域（以下「CGF-1領域」という）を選択した。CGF-1領域の塩基配列を以下に示す。
＜CGF-1領域＞
5'-GGAGGAGTCAAGAGAAGTTGGAAGCCAACTGAGAGAGAGGGAAGGCTTGAAGTGGTCAGGACAGTGAACACCTAAGAGACATCCACTGAATTTGCCCACTAGGAAGCCATTAGTGACTTCAATAGGAACATCTTCAGTGCATCATGAAGGCCAAAGATTGCCATGAAAGAGAGGAATGGAAATGGAGTGTGGG -3'（配列番号４）
本実施例では、検出対象のメチル化DNAとして、乳癌細胞株MCF7のゲノムDNAにおいて高頻度にメチル化修飾されることが知られているGSTP1遺伝子のプロモーター領域を選択した。なお、GSTP1遺伝子のプロモーター領域の塩基配列は当該技術において公知である。
また、非メチル化DNA（ネガティブコントロール）として、ヒトの第14染色体に存在し、CpG部位を有さないのでメチル化修飾されない領域（以下「CGF-1領域」という）を選択した。CGF-1領域の塩基配列を以下に示す。
＜CGF-1領域＞
5'-GGAGGAGTCAAGAGAAGTTGGAAGCCAACTGAGAGAGAGGGAAGGCTTGAAGTGGTCAGGACAGTGAACACCTAAGAGACATCCACTGAATTTGCCCACTAGGAAGCCATTAGTGACTTCAATAGGAACATCTTCAGTGCATCATGAAGGCCAAAGATTGCCATGAAAGAGAGGAATGGAAATGGAGTGTGGG -3'（配列番号４）
（１）試料の調製
MCF7細胞から抽出したゲノムDNAの溶液を、バイオラプター（登録商標）（コスモ・バイオ株式会社）を用いる超音波破砕により断片化して、500 bp以下のゲノムDNA断片の溶液を得た。調製したゲノムDNA断片の溶液を95℃で10分間加熱して変性させた後、氷上に１分間静置して一本鎖DNA断片の溶液を得た。
得られた一本鎖DNA断片の溶液を用い、DNA量が２ng／μlとなるように調整した試料から一部を取り、これをインプットサンプルとした。
MCF7細胞から抽出したゲノムDNAの溶液を、バイオラプター（登録商標）（コスモ・バイオ株式会社）を用いる超音波破砕により断片化して、500 bp以下のゲノムDNA断片の溶液を得た。調製したゲノムDNA断片の溶液を95℃で10分間加熱して変性させた後、氷上に１分間静置して一本鎖DNA断片の溶液を得た。
得られた一本鎖DNA断片の溶液を用い、DNA量が２ng／μlとなるように調整した試料から一部を取り、これをインプットサンプルとした。
（２）試料と抗メチル化DNA抗体との接触
上記の試料50μlに、ハイブリドーマＳＣＲ２から得た抗メチル化DNA抗体（１μg）を添加して、検体サンプル（100μl）とした。また、上記の試料50μlに、純水を添加したものを対照サンプル（100μl）とした。各サンプルを25℃で２時間インキュベートした。
上記の試料50μlに、ハイブリドーマＳＣＲ２から得た抗メチル化DNA抗体（１μg）を添加して、検体サンプル（100μl）とした。また、上記の試料50μlに、純水を添加したものを対照サンプル（100μl）とした。各サンプルを25℃で２時間インキュベートした。
（３）デオキシリボヌクレアーゼによるDNAの分解
上記の検体サンプルを二つに分け、一方にDNaseI（２U/μl：NEB社）を0.5μl添加し、他方にDNaseIを１μl添加した。同様に、上記の対照サンプルも二つに分け、一方にDNaseI（２U/μl：NEB社）を0.5μl添加し、他方にDNaseIを１μl添加した。これらのサンプルを37℃で１時間反応させた。反応後、各サンプルを75℃で10分間加熱することにより、DNaseIを失活させた。
上記の検体サンプルを二つに分け、一方にDNaseI（２U/μl：NEB社）を0.5μl添加し、他方にDNaseIを１μl添加した。同様に、上記の対照サンプルも二つに分け、一方にDNaseI（２U/μl：NEB社）を0.5μl添加し、他方にDNaseIを１μl添加した。これらのサンプルを37℃で１時間反応させた。反応後、各サンプルを75℃で10分間加熱することにより、DNaseIを失活させた。
（４）メチル化DNAの検出
試料中にMCF7のゲノム由来のメチル化DNAが残存しているか否かを検討するために、定量PCR法を行った。また、本発明の検出方法によりメチル化DNAを特異的に検出できることを確認するために、試料中の非メチル化DNAが分解されているか否かを定量PCR法により検討した。
（i）PCR反応液の調製
下記の試薬を混合して、12μlの反応液を調製した。
2x FastStart SYBR Green Master Mix（ROCHE社） ６μl
フォワード（Ｆ）プライマー（10μM） １μl
リバース（Ｒ）プライマー（10μM） １μl
サンプル １μl
dH 2 O ３μl
合計 12μl
試料中にMCF7のゲノム由来のメチル化DNAが残存しているか否かを検討するために、定量PCR法を行った。また、本発明の検出方法によりメチル化DNAを特異的に検出できることを確認するために、試料中の非メチル化DNAが分解されているか否かを定量PCR法により検討した。
（i）PCR反応液の調製
下記の試薬を混合して、12μlの反応液を調製した。
2x FastStart SYBR Green Master Mix（ROCHE社） ６μl
フォワード（Ｆ）プライマー（10μM） １μl
リバース（Ｒ）プライマー（10μM） １μl
サンプル １μl
dH 2 O ３μl
合計 12μl
（ii）プライマーの配列
メチル化DNA検出用プライマーセットとして、GSTP1遺伝子のプロモーター領域を増幅するためのプライマーセットを用いた。このプライマーセットの塩基配列を以下に示す。
Ｆ：5'- GAGGCCTTCGCTGGAGTT -3'（配列番号５）
Ｒ：5'- GTACTCACTGGTGGCGAAGA -3'（配列番号６）
メチル化DNA検出用プライマーセットとして、GSTP1遺伝子のプロモーター領域を増幅するためのプライマーセットを用いた。このプライマーセットの塩基配列を以下に示す。
Ｆ：5'- GAGGCCTTCGCTGGAGTT -3'（配列番号５）
Ｒ：5'- GTACTCACTGGTGGCGAAGA -3'（配列番号６）
非メチル化DNA検出用プライマーセットとして、CGF-1領域を増幅するためのプライマーセットを用いた。このプライマーセットの塩基配列を以下に示す。
Ｆ：5'- GGAGGAGTCAAGAGAAGTTGGAAGC -3'（配列番号７）
Ｒ：5'- CCCACACTCCATTTCCATTCCTC -3'（配列番号８）
Ｆ：5'- GGAGGAGTCAAGAGAAGTTGGAAGC -3'（配列番号７）
Ｒ：5'- CCCACACTCCATTTCCATTCCTC -3'（配列番号８）
（iii）定量PCR反応条件
上記の反応液について、Mx3005P（Stratagene社製）を用いて、以下の反応条件で定量PCRを行った。
95℃で10分、
95℃で30秒、66℃で15秒および72℃で30秒を45サイクル、ならびに
95℃で１分、66℃で30秒および95℃で30秒を１サイクル。
上記の反応液について、Mx3005P（Stratagene社製）を用いて、以下の反応条件で定量PCRを行った。
95℃で10分、
95℃で30秒、66℃で15秒および72℃で30秒を45サイクル、ならびに
95℃で１分、66℃で30秒および95℃で30秒を１サイクル。
得られた反応液を、３%アガロースゲルを用いる電気泳動に付し、増幅産物の有無を確認した。結果を図３に示す。
図３より、抗メチル化DNA抗体を添加しなかったサンプルでは、GSTP1プロモーター領域の増幅産物のバンドが検出されず、抗体を添加したサンプルではバンドが検出されたことがわかる。これに対して、CGF-1領域については、抗メチル化DNA抗体の添加の有無に関わらず、増幅産物のバンドが検出されなかったことがわかる。
これらのことから、ゲノムDNAのメチル化される領域に抗メチル化DNA抗体を結合させることにより、DNaseIによるメチル化DNAの分解が阻害され、メチル化DNAを検出できることが示された。他方、抗メチル化DNA抗体との結合によりDNaseIによる分解反応が阻害される現象は、メチル化される領域で特異的に起こることが示唆された。
図３より、抗メチル化DNA抗体を添加しなかったサンプルでは、GSTP1プロモーター領域の増幅産物のバンドが検出されず、抗体を添加したサンプルではバンドが検出されたことがわかる。これに対して、CGF-1領域については、抗メチル化DNA抗体の添加の有無に関わらず、増幅産物のバンドが検出されなかったことがわかる。
これらのことから、ゲノムDNAのメチル化される領域に抗メチル化DNA抗体を結合させることにより、DNaseIによるメチル化DNAの分解が阻害され、メチル化DNAを検出できることが示された。他方、抗メチル化DNA抗体との結合によりDNaseIによる分解反応が阻害される現象は、メチル化される領域で特異的に起こることが示唆された。
（実施例４）
（１）試料の調製
実施例３と同様にして、MCF7由来の一本鎖ゲノムDNAを含む溶液を調製し、該溶液からインプットサンプルおよび本発明の検出方法に供される試料を得た。
（２）抗メチル化DNA抗体との接触
上記の試料から、実施例３と同様にして、検体サンプルおよび対照サンプルを得た。
（３）デオキシリボヌクレアーゼによるDNAの分解
上記の検体サンプルおよび対照サンプルに、エキソヌクレアーゼI（20 U/μl：NEB社）を2.5μlずつ添加し、37℃で１時間反応させた。反応後、各サンプルを80℃で20分間加熱することにより、エキソヌクレアーゼIを失活させた。
（１）試料の調製
実施例３と同様にして、MCF7由来の一本鎖ゲノムDNAを含む溶液を調製し、該溶液からインプットサンプルおよび本発明の検出方法に供される試料を得た。
（２）抗メチル化DNA抗体との接触
上記の試料から、実施例３と同様にして、検体サンプルおよび対照サンプルを得た。
（３）デオキシリボヌクレアーゼによるDNAの分解
上記の検体サンプルおよび対照サンプルに、エキソヌクレアーゼI（20 U/μl：NEB社）を2.5μlずつ添加し、37℃で１時間反応させた。反応後、各サンプルを80℃で20分間加熱することにより、エキソヌクレアーゼIを失活させた。
（４）メチル化DNAの検出
試料中にMCF7のゲノム由来のメチル化DNAが残存しているか否かを検討するために、実施例３と同様にしてPCR反応液を調製し、定量PCRを行った。なお、定量PCRの反応条件は、以下のとおりである。
＜GSTP1のプロモーター領域を増幅するためのプライマーセットを用いる定量PCR＞
95℃で10分、
95℃で30秒、66℃で15秒および72℃で30秒を35サイクル、ならびに
95℃で１分、66℃で30秒および95℃で30秒を１サイクル。
＜CGF-1領域を増幅するためのプライマーセットを用いる定量PCR＞
95℃で10分、
95℃で30秒、66℃で15秒および72℃で30秒を45サイクル、ならびに
95℃で１分、66℃で30秒および95℃で30秒を１サイクル。
試料中にMCF7のゲノム由来のメチル化DNAが残存しているか否かを検討するために、実施例３と同様にしてPCR反応液を調製し、定量PCRを行った。なお、定量PCRの反応条件は、以下のとおりである。
＜GSTP1のプロモーター領域を増幅するためのプライマーセットを用いる定量PCR＞
95℃で10分、
95℃で30秒、66℃で15秒および72℃で30秒を35サイクル、ならびに
95℃で１分、66℃で30秒および95℃で30秒を１サイクル。
＜CGF-1領域を増幅するためのプライマーセットを用いる定量PCR＞
95℃で10分、
95℃で30秒、66℃で15秒および72℃で30秒を45サイクル、ならびに
95℃で１分、66℃で30秒および95℃で30秒を１サイクル。
得られた反応液を、３%アガロースゲルを用いる電気泳動に付し、増幅産物の有無を確認した。結果を図４に示す。
図４より、抗メチル化DNA抗体を添加しなかったサンプルでは、GSTP1プロモーター領域の増幅産物のバンドが検出されず、抗体を添加したサンプルではバンドが検出されたことがわかる。これに対して、CGF-1領域については、抗メチル化DNA抗体の添加の有無に関わらず、増幅産物のバンドが検出されなかったことがわかる。
これらのことから、ゲノムDNAのメチル化される領域に抗メチル化DNA抗体を結合させることにより、エキソヌクレアーゼIによるメチル化DNAの分解が阻害され、メチル化DNAを検出できることが示された。他方、抗メチル化DNA抗体との結合によりエキソヌクレアーゼIによる分解反応が阻害される現象は、メチル化される領域で特異的に起こることが示唆された。
図４より、抗メチル化DNA抗体を添加しなかったサンプルでは、GSTP1プロモーター領域の増幅産物のバンドが検出されず、抗体を添加したサンプルではバンドが検出されたことがわかる。これに対して、CGF-1領域については、抗メチル化DNA抗体の添加の有無に関わらず、増幅産物のバンドが検出されなかったことがわかる。
これらのことから、ゲノムDNAのメチル化される領域に抗メチル化DNA抗体を結合させることにより、エキソヌクレアーゼIによるメチル化DNAの分解が阻害され、メチル化DNAを検出できることが示された。他方、抗メチル化DNA抗体との結合によりエキソヌクレアーゼIによる分解反応が阻害される現象は、メチル化される領域で特異的に起こることが示唆された。
Claims (8)
- メチル化DNAを含む可能性のある試料と、メチル化DNAと結合できるタンパク質とを接触させて、前記試料中のメチル化DNAと前記タンパク質とを結合させる工程と、
前記結合工程で得られた試料と、少なくとも１種類のデオキシリボヌクレアーゼとを接触させて、前記試料中のDNAを分解する工程と、
前記分解工程で得られた試料における、前記タンパク質との結合により前記デオキシリボヌクレアーゼで分解されなかったメチル化DNAを検出する工程と
を含み、
前記デオキシリボヌクレアーゼの少なくとも１種類が、一本鎖DNAを分解できるメチル化感受性制限酵素とは異なるデオキシリボヌクレアーゼである、
試料中のメチル化DNAを検出する方法。 - 前記メチル化DNAと結合できるタンパク質が、抗メチル化DNA抗体またはメチル化DNA結合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
- 前記メチル化DNAと結合できるタンパク質が、抗メチル化DNA抗体である、請求項１または２に記載の方法。
- 前記メチル化DNAと結合できるタンパク質が、MBD1、MBD2、MBD4およびMeCP2からなる群より選択される少なくとも１つのメチル化DNA結合タンパク質である、請求項１または２に記載の方法。
- 前記試料が、培養細胞株または生体から採取された血液、体液、組織もしくは細胞から調製された試料である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記デオキシリボヌクレアーゼが、デオキシリボヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼI、ラムダ・エキソヌクレアーゼ、T7エキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼIII、RecJ型エキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼT、BAL31ヌクレアーゼ、Mung Beanヌクレアーゼ、ミクロコッカス・ヌクレアーゼおよびT7エンドヌクレアーゼからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記試料が、一本鎖メチル化DNAを含む可能性のある試料であり、
前記メチル化DNAを検出する工程が一本鎖メチル化DNAを検出する工程である、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 - 前記メチル化DNAを検出する工程が、核酸増幅法、塩基配列決定法又はマイクロアレイ法を用いてメチル化DNAを検出する工程である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011042367A JP5832760B2 (ja) | 2011-02-28 | 2011-02-28 | 試料中のメチル化ｄｎａを検出する方法 |
| US13/404,865 US20120219949A1 (en) | 2011-02-28 | 2012-02-24 | Method of detecting methylated dna in sample |
| CN201210055737.4A CN102653787B (zh) | 2011-02-28 | 2012-02-28 | 检测样品中的甲基化dna的方法 |
| EP12157307.5A EP2492356B1 (en) | 2011-02-28 | 2012-02-28 | Method of detecting methylated DNA in sample |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011042367A JP5832760B2 (ja) | 2011-02-28 | 2011-02-28 | 試料中のメチル化ｄｎａを検出する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2012178986A true JP2012178986A (ja) | 2012-09-20 |
| JP5832760B2 JP5832760B2 (ja) | 2015-12-16 |
Family
ID=45756923
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2011042367A Active JP5832760B2 (ja) | 2011-02-28 | 2011-02-28 | 試料中のメチル化ｄｎａを検出する方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20120219949A1 (ja) |
| EP (1) | EP2492356B1 (ja) |
| JP (1) | JP5832760B2 (ja) |
| CN (1) | CN102653787B (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013123481A1 (en) | 2012-02-16 | 2013-08-22 | Cornell University | Methods and kit for characterizing the modified base status of a transcriptome |
| CN104152437A (zh) * | 2014-08-12 | 2014-11-19 | 上海派森诺生物科技有限公司 | 一种应用于甲基结合蛋白测序中的甲基化dna富集方法 |
| SG11202112704TA (en) * | 2019-05-21 | 2021-12-30 | Agency Science Tech & Res | Nucleic acid analysis |
| CN112662749B (zh) * | 2020-09-27 | 2023-05-12 | 中山大学 | 一种具有单碱基分辨率的核酸修饰检测方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008263961A (ja) * | 2007-03-26 | 2008-11-06 | Sumitomo Chemical Co Ltd | Ｄｎａメチル化測定方法 |
| JP2008263962A (ja) * | 2007-03-26 | 2008-11-06 | Sumitomo Chemical Co Ltd | Ｄｎａメチル化測定方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1570083A4 (en) * | 2002-12-10 | 2007-04-25 | Medstar Res Inst | IDENTIFICATION OF GENES INVOLVED IN THE ANGIOGENESIS AND DEVELOPMENT OF A DIAGNOSTIC CHIP FOR ANGIOGENESIS TO IDENTIFY PATIENTS WITH ANGIOGENIC IMPACT |
| AU2005308916B2 (en) * | 2004-11-29 | 2011-07-21 | Sequenom, Inc. | Kits and methods for detecting methylated DNA |
| WO2006056480A2 (en) * | 2004-11-29 | 2006-06-01 | Klinikum Der Universität Regensburg | Means and methods for detecting methylated dna |
| US20080124735A1 (en) * | 2006-10-16 | 2008-05-29 | Matthias Schuster | Method for detection of one or more CpG positions |
-
2011
- 2011-02-28 JP JP2011042367A patent/JP5832760B2/ja active Active
-
2012
- 2012-02-24 US US13/404,865 patent/US20120219949A1/en not_active Abandoned
- 2012-02-28 EP EP12157307.5A patent/EP2492356B1/en active Active
- 2012-02-28 CN CN201210055737.4A patent/CN102653787B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008263961A (ja) * | 2007-03-26 | 2008-11-06 | Sumitomo Chemical Co Ltd | Ｄｎａメチル化測定方法 |
| JP2008263962A (ja) * | 2007-03-26 | 2008-11-06 | Sumitomo Chemical Co Ltd | Ｄｎａメチル化測定方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JPN6015012902; Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２００９， Ｖｏｌ．４３， Ｎｏ．３， ｐ．３５５-３５９ * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102653787A (zh) | 2012-09-05 |
| EP2492356B1 (en) | 2013-08-21 |
| CN102653787B (zh) | 2016-12-14 |
| US20120219949A1 (en) | 2012-08-30 |
| EP2492356A1 (en) | 2012-08-29 |
| JP5832760B2 (ja) | 2015-12-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102307230B1 (ko) | 핵산의 다중 검출 | |
| US11130991B2 (en) | Method for highly sensitive DNA methylation analysis | |
| CN108138209B (zh) | 通过原位扩增制备细胞游离核酸分子的方法 | |
| KR20230116944A (ko) | 고온 내성 Cas 단백질의 용도, 표적 핵산 분자의 검출방법 및 시약 키트 | |
| CN110719957B (zh) | 用于核酸靶向富集的方法和试剂盒 | |
| AU2016297510A1 (en) | Methods of amplifying nucleic acid sequences | |
| CN105586408B (zh) | 一种癌症筛检的方法 | |
| CN110129436A (zh) | Dna甲基化的数字序列分析 | |
| US20120129729A1 (en) | Method for Determining the Methylation Pattern of a Polynucleic Acid | |
| EP3828273A1 (en) | Methylation modification-based tumor marker stamp-ep2 | |
| JP5832760B2 (ja) | 試料中のメチル化ｄｎａを検出する方法 | |
| CN112662763A (zh) | 一种检测常见两性癌症的探针组合物 | |
| Kang et al. | AMY2A: a possible tumor-suppressor gene of 1p21. 1 loss in gastric carcinoma | |
| JPWO2019108626A5 (ja) | ||
| US20080206772A1 (en) | Sample treatment solution and reagent kit for preparing sample for detecting dna methylation | |
| JPWO2008149855A1 (ja) | メチル化核酸又は非メチル化核酸を増幅する方法 | |
| JPWO2005118791A1 (ja) | 微量試料を用いる網羅的遺伝子発現プロフィール解析法 | |
| WO2017119510A1 (ja) | 乳がんの診断のための検査方法、遺伝子マーカー、および検査薬 | |
| EP2843047B1 (en) | Nucleic acid detection method | |
| CN112662764A (zh) | 一种检测11种癌症的探针组合物 | |
| JP4359497B2 (ja) | 核酸増幅用プライマー、核酸増幅用プライマーセット及びこれを用いた癌の検査方法 | |
| JP5116939B2 (ja) | 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法 | |
| CN110616255B (zh) | Rna水平鉴别牙髓干细胞与牙龈干细胞的引物组、试剂盒及鉴定方法 | |
| WO2021124455A1 (ja) | 分析方法及びキット | |
| Guanzon et al. | Comparing methylation levels assayed in GC-rich regions with current and emerging methods |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20140129 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150331 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150528 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20151006 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20151028 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5832760 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |