CN104611410A - 一种无创癌症检测方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种无创癌症检测方法，包括以下步骤：从受试者采集外周血并分离血浆；抽提血浆DNA并用亚硫酸氢盐处理；将上述用亚硫酸氢盐处理后的血浆DNA用聚合酶扩增以制备测序文库；对所制备的测序文库进行高通量测序；将高通量测序得到的序列与人类基因组进行对比；统计高通量测序得到的序列中基因组特定区域甲基化水平，并与健康人群确定的基因组单位长度内甲基化水平进行对比，以判断所述受试者是否患有癌症。本发明还公开了适用于上述检测方法的试剂盒。

Description

一种无创癌症检测方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及一种无创癌症检测方法及其试剂盒。更具体地，本发明涉及一种通过高通量测序无创检测血浆DNA特定区域，特别是基因组重复区的甲基化水平用于癌症检测的方法及其试剂盒。

背景技术

随着测序技术进步，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，费用更低、通量更高、速度更快、可完成全基因组测序的高通量测序技术应运而生。高通量测序技术的核心思想是高通量的边合成边测序，即通过捕捉新合成末端的标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche/454FLX、Illumina/Hiseq/Miseq、Applied BiosystemsSOLID和life Technologies/Ion Torrent/Proton等。以Illumina产品为例，HiSeq2000目前每个run可以达到6个人基因组30X覆盖的测序通量，约600G/run数据，上机操作时间也减少到了30分钟。而且随着高通量测序技术的成熟，将其应用于临床检测的研究迅猛发展。实践表明通过测序孕妇血浆DNA可以判断胎儿遗传健康状况，使得无创产前检测领域快速发展，而测序检测者血浆DNA可以进行癌症早期筛查，并具有很强的应用前景。

血浆DNA又称循环DNA，是血液中的细胞外DNA，长约几十到几百核苷酸(主峰约167bp)，可以以DNA-蛋白质复合物的形式存在，也可以是游离的DNA片段。正常情况下，血浆DNA来源于衰老死亡细胞的DNA释放。健康状态下，循环DNA的生成与清除处于动态平衡状态，维持在较恒定的低水平，1mL血浆正常人约含有2000个基因组DNA的量。循环DNA能反映人体内细胞新陈代谢的状况，是健康评判的一个重要指标。外周血循环DNA量和质的改变与多种疾病(包括肿瘤、复合性严重外伤、器官移植、妊娠相关疾病、感染性疾病、器官功能衰竭等)关系密切，作为一种无创性检测指标，有望成为某些疾病早期诊断、病情监测、疗效及预后评估的一种重要的分子标志物。本发明所述的无创是指相对于组织监测，如组织活检和手术等方法，本发明不需要对受试者造成实质性创伤。

研究发现，癌症病人的癌细胞凋亡产物(包括断裂游离的癌细胞DNA)会释放到的血液中，随血液循环系统运送到全身，血浆DNA中携带有癌细胞基因组的全部遗传信息(Schwarzenbach，Hoon et a1.2011)。通过高通量测序挖掘血浆游离DNA中的癌细胞基因组信息，是目前实现无创癌症检测及实时监测的主要途径。而研究结果也揭出癌细胞基因组表现出低于正常的细胞的甲基因化水平(Feinberg and Vogel stein1983；Ushijima2005；Ross，Rand et al.2010)，甲基化水平应可以反映出癌症的发展情况。

但是由于癌症可以在身体的各种器官和组织中存在并发生转移，并没有一种适用于所有癌症的检测标记可以用于癌症的检测。但是本发明人惊奇的发现，血浆DNA中基因组重复区的甲基化水平的低表达和癌症的存在是相关的。因此，本发明利用高通量测序技术，发明了一种测序和分析血浆DNA中基因组重复区低甲基化水平的方法和试剂盒，可实现癌症在外周血中快速、准确、无创、高灵敏检测，可为患者提供各种诊断治疗依据。

发明内容

本发明提供了一种无创癌症检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

从受试者采集外周血并分离血浆；

抽提血浆DNA并用亚硫酸氢盐处理；

将上述用亚硫酸氢盐处理后的血浆DNA用聚合酶扩增以制备测序文库；

对所制备的测序文库进行高通量测序；

将高通量测序得到的序列与人类基因组进行对比；统计高通量测序得到的序列中基因组特定区域甲基化水平，并与健康人群确定的基因组单位长度内甲基化水平进行对比，以判断所述受试者是否患有癌症。

优选地，统计高通量测序得到的序列中基因组重复区甲基化水平，并与根据健康人群确定的基因组单位长度甲基化平均值和标准方差进行对比，统计甲基化水平低于平均值-nX(n倍)标准方差的单位数目以判断所述受试者是否患有癌症，其中n为1-5的整数。

优选地，其中基因组单位长度为0.5-5M，优选1-3M，并且n为3。更优选地，其中所述基因组重复区为基因组CpG重复区。特别优选地，其中以1M基因组长度为单位统计CpG重复区内的甲基化比例，针对每个单位窗口统计 $Z-\mathrm{Score}=\frac{\%{\mathrm{MD}}_{\mathrm{sample}}-\mathrm{mean}\%{\mathrm{MD}}_{\mathrm{reference}}}{{\mathrm{SD}}_{\mathrm{reference}}},$ 其中，％MD_sample为样品的甲基化程度百分比，mean％MD_reference为健康人甲基化程度平均值，SD_reference为健康人甲基化程度标准方差。如果Z Score＜-3的单位数目的比例大于0％，优选大于0.04％，更优选大于0.1％，进一步优选大于1％的受试者判断为癌症阳性。更优选地，所述高通量测序技术选自Roche/454FLX、Illumina/Hiseq/Miseq、AppliedBiosystems SOLID和life Technologies/Ion Torrent/Proton。更优选地，在用亚硫酸氢盐处理抽提血浆DNA之前，还包括用对所抽提的血浆DNA进行末端修复和连接甲基化接头的步骤。更优选地，所述癌症选自胃癌、结直肠癌、平滑肌肉瘤肝癌、肺癌、肠癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、乳腺癌、淋巴癌、胰腺癌、甲状腺癌、食道癌、鼻咽癌、骨癌和肾癌。

本发明另一方面，本发明提供一种无创癌症检测试剂盒，其特征在于，包括，血浆DNA抽取试剂、高通量测序重测序文库构建试剂、亚硫酸氢盐试剂、DNA扩增引物及扩增试剂、甲基化序列比对软件、重复区甲基化水平统计软件。优选地，统计高通量测序得到的序列中基因组特定区域甲基化水平，并与健康人群确定的基因组单位长度内甲基化水平差进行对比，以判断所述受试者是否患有癌症。更优选地，统计基因组重复区甲基化水平，并与根据健康人群确定的基因组单位长度甲基化平均值和标准方差进行对比，统计甲基化水平低于平均值-n倍标准方差的单位数目以判断所述受试者是否患有癌症，其中n为1-5的整数。更优选地，其中基因组单位长度为0.5-5M，优选1-3M，所述基因组重复区为基因组CpG重复区并且n为3。更优选地，其中以1M基因组长度为单位统计CpG重复区内的甲基化比例，针对每个单位窗口统计 $Z-\mathrm{Score}=\frac{\%{\mathrm{MD}}_{\mathrm{sample}}-\mathrm{mean}\%{\mathrm{MD}}_{\mathrm{reference}}}{{\mathrm{SD}}_{\mathrm{reference}}},$ 其中，％MD_sample为样品的甲基化程度百分比，mean％MD_reference为健康人甲基化程度平均值，SD_reference为健康人甲基化程度标准方差。如果Z Score＜-3的单位数目的比例大于0％，优选大于0.04％，更优选大于0.1％，进一步优选大1％的受试者判断为癌症阳性。更优选地，所述试剂盒还包括高通量测序试剂。更优选地，所述所述癌症选自胃癌、结直肠癌、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、肠癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、乳腺癌、淋巴癌、胰腺癌、甲状腺癌、食道癌、鼻因癌、骨癌和肾癌。更优选地，所述高通量测序技术选自Roche/454FLX、Illumina/Hiseq/Miseq、Applied Biosystems SOLID和life Technologies/IonTorrent/Proton。

附图说明

图1示本发明设计思想。本发明的癌症检测方法主要包括外周血采集和血浆分离步骤；抽提血浆DNA并用亚硫酸氢盐处理以制备测序文库的步骤；高通量测序步骤；和数据分析步骤，其中包括将测序得到的序列与人类基因组进行对比并统计重复区甲基化水平以及根据和健康人群的甲基化水平平均值进行对比以判断是否患有癌症。其中在测序文库的制备过程中还包括先将血浆DNA连接甲基化接头，为文库扩增做准备。其中亚硫酸氢盐处理，目的是将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，用于测序区分胞嘧啶是否甲基化。

图2本发明文库构建效果，图为2％琼脂糖胶。文库大小约290bp，其中接头总长约120bp，符合实验预期。M：marker1：WCZ2：WJJ3：LJS4：XGZ5：SB6：SHY7：YQH8：ZYL

图3本发明可有效区分胃癌与健康对照，癌症样品表现出明显的低甲基化水平。图示为以11个健康人为对照，计算每1Mb窗口内CpG区甲基化例平均值MD_mean与标准方差SD，对每份样品每条染色体统计偏离MD_mean±3SD的数据点。图A为4份胃癌血浆样品，由外到内分别为样品WCZ WJJ LJS XGZ，与从健康对照比表现出明显的低甲基化水平。图B为健康对照样品(样品名SB)示例，无数据点偏离，全部对照如此。

发明具体实施方式

1人外周血全血的采集和血浆的分离

血液标本的采集是分析质量控制的重要环节，可采用毛细血管采血法、静脉采血法、动脉采血法、和真空负压静脉采血法。其中最采用的采血方法是静脉采血法，其采血量大，可用于各种临床检测。而真空静脉采血法是近年来采用的一种新的采血方法，此法简便易行。分离血浆可以使用各种常用的方法，例如离心法，血浆分离器，血浆分离杯，血浆分离机等。

2血浆DNA抽提

血浆DNA抽提方式主要有两种，磁珠法与分离柱法。原理基本一致，血浆DNA以DNA与核小体缠绕的方式存在，首先需要在蛋白酶作用下将核小体消化，使DNA游离出来。然后缓冲液作用下结合到磁珠表面或柱膜上，清洗杂质后将DNA洗脱下来。磁珠法相对纯度较高，操作所需设备要求低，便于大规模应用。

3测序文库制备

血浆DNA末端可能出现平末端、3’突出、突出和有无磷酸集团情形的不同组合。利T4DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶、T4PNK组合进行末端修复将其修整成平末端且5’端带有磷酸。亚硫酸氢盐处理DNA可以将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，故连接的高通量测序接头需经甲基化修饰，以避免后续亚硫酸氢盐甲基化的影响。亚硫酸氢盐主要是亚硫酸氢钠，是目前普遍采用的甲基化转化试剂。经亚硫酸氢盐处理后，DNA链中出现尿嘧啶，不同聚合酶对尿嘧啶识别差异较大，需采用对尿嘧啶不敏感的聚合酶，例如pfu Turbo CxHotStart DNA Polymerase(Agilent，美国)。

4高通量测序

高通量测序相对传统测序而言具有高通量、单位数据成本低、准确度高等特点。以Illumina Hiseq2000为例，可产生3×10⁹序列/run，6×10¹¹碱基/run。特别适合基因组水平检测研究，逐渐为实验室研究和临床检测所采用。

5与人类基因组序列进行对比的方法

高通量测序产生的海量数据是传统序列比对软件(例如BLAST)所难适应的，针对高通量测序数据的特点逐渐发展了一批专用的序列比对软件，如SOAP、bowtie、bwa等，适于高通量数据序列短，数量大的特点，具有速度快、准确性高等优势。全基因组甲基化数据中生物甲基化水平较低，实践操作中先将基因组序列中的C转化为T，再利用此类软件进行比对。

6甲基化水平统计方法

衡量甲基化水平即统计特定区域内，例如基因组重复区，的甲基化C占区域内全部C的比例，习惯把甲基化分为CG CHG CHH(H为A/C/T)3类甲基化，动物以CG甲基化为主。统计可以使用各种市售统计软件进行，必要时，可以根据实验需要进行修改。

7癌症

癌症是一大类恶性肿瘤的统称。癌细胞的特点是无限制、无止境地增生，使患者体内的营养物质被大量消耗；癌细胞释放出多种毒素，使人体产生一系列症状；癌细胞还可转移到全身各处生长繁殖，导致人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热以及严重的脏器功能受损等。依据发生脏器的不同，常将其分为胃癌、结直肠癌、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、肠癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、乳腺癌、淋巴癌、胰腺癌、甲状腺癌、食道癌、鼻咽癌、骨癌和肾癌。特别是，胃癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、鼻因癌、肝癌和平滑肌肉瘤。

8统计结果分析判断

本发明将人类基因组划分为多个等单位长度的窗口，统计受试者低于健康人平均值-n倍，优选3倍标准方差的窗口数目，窗口数目比例越多癌症风险越高。当设置恰当的阈值时，可有效区分癌症病人及健康人。本发明的实施例证明，以1Mb基因组长度为窗口，将人类基因组划为多个窗口，统计每个窗口CpG重复区内的甲基化比例， $Z-\mathrm{Score}=\frac{\%{\mathrm{MD}}_{\mathrm{sample}}-\mathrm{mean}\%{\mathrm{MD}}_{\mathrm{reference}}}{{\mathrm{SD}}_{\mathrm{reference}}},$ 其中，％MD_sample为样品的甲基化程度百分比，mean％MD_reference为健康人甲基化程度平均值，SD_reference为健康人甲基化程度标准方差。根据如下的实施例，本发明人发现如果Z Score＜-3的数据点(窗口数目)大于0％，优选大于0.01％，0.02％，0.03％，0.04％，0.05％，0.06％，0.07％，0.08％或0.09％，更优选大于0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，或0.9％，进一步优选大1％，进一步优选大于2％，2.1％，2.2％，2.3％，2.4％，或2.5％，进一步优选大于2.8％，进一步优选大于3.4％，14％，15％，18％，或32％的受试者为癌症阳性。

9.多类癌症评价

为验证该方法在各类癌症的有效性，实验选取12例阳性样品，包括胃癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、肝癌、平滑肌肉瘤，以35例健康人做对照，结果显示健康人群对照的Z Score＜-3的数据点34例为0％，只有1个为0.04％。癌症样品均远远大于0.04％，范围为0.93％-32.03％。结果表现出良好的特异性和准确性，说明该方法具有一般性。

实施例

实施例1外周血采集和血浆分离

1.采集受试者外周血至10mL EDTA抗凝管(或血浆采集专用采血管，美国St reck公司CF管)。受试者采取自愿原则，癌症样品来自北京大学肿瘤医院。

2.取1支10mL EDTA采血管1600g离心10min。

3.取上层血清转移到1.5mL EP管中，注意枪头不要碰到中间层和底层红细胞层。

4.16000g离心10min。

5.取上清转移至新的1.5mL EP管中。

6.可将纯出的血清-80℃冻存。

实施例2测序文库的制备

1.接头设计，其中全部C为5mC

5′P-GATCGGAAGAGCACACGTCT

5′ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT

2.取2mL血浆抽提血浆游离DNA。

3.末端补平

制备如下的反应混合液

表1

在20℃温浴30分钟；

在纯化柱上纯化DNA样品，并在42μl的无菌dH20或洗脱缓冲液中洗脱。

4.在DNA片段的3’末端加多聚腺嘌呤尾

制备如下的反应混合液

表2

在37℃温浴30分钟；

在柱上纯化DNA样品，并在25μl的无菌dH20或洗脱缓冲液中洗脱。

5.为DNA片段连接甲基化接头

制备如下的反应混合液

表3

在20℃温浴15分钟。

在Qiagen柱上纯化回收DNA样品，并在25μl的无菌dH20或洗脱缓冲液中洗脱。

6.亚硫酸氢盐处理。将上步产物采用EZ DNA Methylat ion-Gold^TMKi t(Zymo D5006)按使用说明完成处理，洗脱于15uL洗脱液。

7.通过PCR预扩增富集接头修饰的DNA片段

制备如下的PCR反应混合液

用如下的PCR实验方案进行扩增：

a.98℃30秒；

b.18个如下的循环：

98℃10秒，65℃30秒，72℃30秒；

c.72℃5分钟；

d.保持在4℃。

将PCR产物置于2％的琼脂糖凝胶上进行电泳，结果见图2所示，然后采用Qiagnen kit(cat：28704)切胶回-300bp目标条带，洗脱于20μl的洗脱缓冲液中。

实施例3高通量测序

1.取1uL文库进行Qubit(Life Technologies，美国)定量，由定量结果转算成摩尔浓度。

2.按照Illumina Hi seq2000操作说明，将文库稀释到10nM，NaOH将双链DNA变性为单链，再次稀释后上机。

3.设置文库测序类型。

实施例4与人类基因组进行序列对比

1.将10M序列使用Bi smark0.7.0http：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/bismark/比对到人类基因组(hg19)

2.将比对结果利用samtool s：0.1.19(samtools.sourceforge.net)和picard1.77去除冗余。

实施例5甲基化水平统计

以1Mb基因组长度为窗口，将人类基因组划为多个窗口，统计每个窗口CpG重复区内的甲基化比例， $Z-\mathrm{Score}=\frac{\%{\mathrm{MD}}_{\mathrm{sample}}-\mathrm{mean}\%{\mathrm{MD}}_{\mathrm{reference}}}{{\mathrm{SD}}_{\mathrm{reference}}},$ 其中，％MD_sample为样品的甲基化程度百分比，mean％MD_reference为健康人甲基化程度平均值，SD_reference为健康人甲基化程度标准方差。如果Z Score＜-3的数据点大于0.04％即为阳性。结果见下表4。

表4.

示本发明的方法在各类癌症的有效性。实验选取11例阳性样品，包括胃癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、肝癌、平滑肌肉瘤，以35例健康人做对照，结果显示Z Score＜-3的数据点大于0.04％即为癌症阳性。结果表现出良好的特异性和准确性，说明该方法具有一般性。其中癌症样品来自北京大学肿瘤医院，健康人群样品来自志愿者。

Claims (16)

1.一种无创癌症检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

从受试者采集外周血并分离血浆；

抽提血浆DNA并用亚硫酸氢盐处理；

将上述用亚硫酸氢盐处理后的血浆DNA用聚合酶扩增以制备测序文库；

对所制备的测序文库进行高通量测序；

将高通量测序得到的序列与人类基因组进行对比；

统计高通量测序得到的序列中基因组特定区域甲基化水平，并与健康人群确定的基因组单位长度内甲基化水平进行对比，以判断所述受试者是否患有癌症。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中统计高通量测序得到的序列中基因组重复区甲基化水平，并与健康人群确定的基因组单位长度内甲基化水平平均值和标准方差进行对比，统计甲基化水平低于平均值-nX标准方差的单位数目以判断所述受试者是否患有癌症，其中n为1-5的整数。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中基因组单位长度为0.5-5M，优选1-3M，并且n为3。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述基因组重复区为基因组CpG重复区。

5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，其中以1M基因组长度为单位统计CpG重复区内的甲基化比例，针对每个单位窗口统计 $Z-\mathrm{Score}=\frac{\%{\mathrm{MD}}_{\mathrm{sample}}-\mathrm{mean}\%{\mathrm{MD}}_{\mathrm{reference}}}{{\mathrm{SD}}_{\mathrm{reference}}},$ 其中，％MD_sample为样品的甲基化程度百分比，mean％MD_reference为健康人甲基化程度平均值，SD_reference为健康人甲基化程度标准方差。如果Z Score＜-3的单位数目的比例大于0％，优选大于0.04％，更优选大于0.1％，进一步优选大于1％的受试者判断为癌症阳性。

6.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述高通量测序技术选自Roche/454FLX、Illumina/Hiseq/Miseq、Appl ied Biosys tems SOLID和lifeTechnologies/Ion Torrent/Proton。

7.根据权利要求1-3任一项的方法，其特征在于，在用亚硫酸氢盐处理抽提血浆DNA之前，还包括用对所抽提的血浆DNA进行末端修复和连接甲基化接头的步骤。

8.根据权利要求1-3任一项的方法，其特征在于，所述癌症选自胃癌、结直肠癌、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、肠癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、乳腺癌、淋巴癌、胰腺癌、甲状腺癌、食道癌、鼻因癌、骨癌和肾癌。

9.一种无创癌症检测试剂盒，其特征在于，包括，血浆DNA抽取试剂、高通量测序重测序文库构建试剂、亚硫酸氢盐试剂、DNA扩增引物及扩增试剂、甲基化序列比对软件、重复区甲基化水平统计软件。

10.根据权利要求9所述的无创癌症检测试剂盒，其特征在于，统计高通量测序得到的序列中基因组特定区域甲基化水平，并与健康人群确定的基因组单位长度内甲基化水平进行对比，以判断所述受试者是否患有癌症。

11.根据权利要求9或10所述的无创癌症检测试剂盒，其特征在于，其中统计高通量测序得到序列中基因组重复区甲基化水平，并与根据健康人群确定的基因组单位长度甲基化平均值和标准方差进行对比，统计甲基化水平低于平均值-n倍标准方差的单位数目以判断所述受试者是否患有癌症，其中n为1-5的整数。

12.根据权利要求9或10所述的无创癌症检测试剂盒，其特征在于，其中基因组单位长度为0.5-5M，优选1-3M，所述基因组重复区为基因组CpG重复区并且n为3。

13.根据权利要求9-12任一项所述的无创癌症检测试剂盒，其特征在于，其中以1M基因组长度为单位统计CpG重复区内的甲基化比例，针对每个单位窗口统计 $Z-\mathrm{Score}=\frac{\%{\mathrm{MD}}_{\mathrm{sample}}-\mathrm{mean}\%{\mathrm{MD}}_{\mathrm{reference}}}{{\mathrm{SD}}_{\mathrm{reference}}},$ 其中，％MD_sample为样品的甲基化程度百分比，mean％MD_reference为健康人甲基化程度平均值，SD_reference为健康人甲基化程度标准方差。如果Z Score＜-3的单位数目的比例大于0％，优选大于0.04％，更优选大于0.1％，进一步优选大于1％的受试者判断为癌症阳性。

14.根据权利要求9-12任一项所述的无创癌症检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括高通量测序试剂。

15.根据权利要求9-12任一项所述的无创癌症检测试剂盒，其特征在于，所述所述癌症选自胃癌、结直肠癌、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、肠癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、乳腺癌、淋巴癌、胰腺癌、甲状腺癌、食道癌、鼻咽癌、骨癌和肾癌。

16.根据权利要求9-12任一项所述的无创癌症检测试剂盒，其特征在于，所述高通量测序技术选自Roche/454FLX、Illumina/Hiseq/Miseq、Applied Biosystems SOLID和life Technologies/Ion Torrent/Proton。