CN108753958B - 基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物、检测试剂盒及其应用 - Google Patents
基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物、检测试剂盒及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108753958B CN108753958B CN201811006866.8A CN201811006866A CN108753958B CN 108753958 B CN108753958 B CN 108753958B CN 201811006866 A CN201811006866 A CN 201811006866A CN 108753958 B CN108753958 B CN 108753958B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- detection
- sox10
- sox10 gene
- peripheral blood
- gene methylation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 71
- 101150077014 sox10 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 67
- 230000011987 methylation Effects 0.000 title claims abstract description 65
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 title claims abstract description 65
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 28
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 title claims abstract description 28
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 15
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 8
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims description 7
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 5
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 claims description 5
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 4
- 210000000105 enteric nervous system Anatomy 0.000 claims description 4
- BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 2-(4-octylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(OCCO)C=C1 BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 230000036244 malformation Effects 0.000 claims description 2
- 239000012502 diagnostic product Substances 0.000 claims 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 abstract description 5
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 3
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 210000000933 neural crest Anatomy 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- -1 Tris saturated phenol Chemical class 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 208000032170 Congenital Abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 206010010539 Congenital megacolon Diseases 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 208000004592 Hirschsprung disease Diseases 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- LJSAJMXWXGSVNA-UHFFFAOYSA-N a805044 Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1.OC1=CC=C(O)C=C1 LJSAJMXWXGSVNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 210000003027 ear inner Anatomy 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 210000000609 ganglia Anatomy 0.000 description 1
- 210000005095 gastrointestinal system Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000000276 neural tube Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000008925 shengjing Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/154—Methylation markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物、试剂盒及其应用，属于基因工程领域。本发明提供的基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物，针对性的检测Sox10基因启动子区域甲基化水平，因此将检测引物应用于外周血Sox10基因甲基化水平检测以及制备Sox10基因甲基化的检测试剂盒具有较好的效果；Sox10基因甲基化的检测试剂盒操作简便，利于实施，具有较高的医学应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体而言，涉及基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物、检测试剂盒及其应用。
背景技术
Sox10基因定位于22q13.1，cDNA全长1.4kb，含有5个外显子，其中只有3、4、5号外显子编码蛋白，5’非编码区含有一个或一个以上的非编码外显子。Sox10最先在神经嵴干细胞迁徙早期的背神经管中表达，在小鼠胚胎发育第9.5天(E9.5)，Sox10开始表达，至第16.5天(E16.5)时表达开始下降。然后随着神经嵴干细胞逐渐分化而在其衍生物如周围神经系统、胃肠道系统及黑素细胞中表达。Sox10在人和成年小鼠中广泛地表达于各种组织器官中，如大脑、心脏、肺、肾上腺、结肠、膀胱、胰腺、前列腺、睾丸、内耳等。Sox10是神经嵴发育中的一个关键转录因子，在黑素细胞和肠道神经节的发育中发挥重要作用，可促进胚胎神经细胞和外周神经系统的发育。
目前关于Sox10基因甲基化的研究还不够充分，对该基因的检测还比较少。
发明内容
本发明的第一目的在于提供基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物，该检测引物能较好的检测Sox10基因甲基化。
本发明的第二目的在于提供上述的基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物在Sox10基因甲基化检测中的应用。
本发明的第三目的在于提供上述基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物在制备检测Sox10基因甲基化的检测试剂盒中的应用。
本发明的第四目的在于提供Sox10基因甲基化的检测试剂盒，方便对Sox10基因甲基化的检测。
本发明的第五目的在于提供上述的Sox10基因甲基化的检测试剂盒在Sox10基因甲基化的检测中的应用。
为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：
基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物，检测引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1-2所示。
上述的基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物在Sox10基因甲基化检测中的应用。
上述的基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物在制备检测Sox10基因甲基化的检测试剂盒中的应用。
Sox10基因甲基化的检测试剂盒，检测试剂盒包括上述的基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物。
上述的Sox10基因甲基化的检测试剂盒在Sox10基因甲基化的检测中的应用。
与现有技术相比较，本发明的有益效果包括：本发明提供的基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物，针对性的检测Sox10基因甲基化水平，因此将检测引物应用于检测以及制备Sox10基因甲基化的检测试剂盒具有较好的效果；Sox10基因甲基化的检测试剂盒操作方便，利于实施，具有较高的医学应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例2提供的电泳结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员应当理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物、检测试剂盒及其应用进行具体说明。
基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物，检测引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1-2所示。
检测引物的上游引物：SEQ ID NO.1，Sox10-F:5’-GGAGAGAGAGATGTTAGGTAGGTAG-3’。
检测引物的下游引物：SEQ ID NO.2，Sox10-R:5’-AGTTTAATAAAAATTTTCTCTTTCTCTC-3’。
产物长度388bp。
上述的基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物在Sox10基因甲基化检测中的应用。
上述的基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物在制备检测Sox10基因甲基化的检测试剂盒中的应用。
Sox10基因甲基化的检测试剂盒，检测试剂盒包括上述的基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，检测试剂盒包括基因组DNA提取试剂，亚硫酸氢钠，乙酸钠，无水乙醇，PCR反应试剂。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，基因组DNA提取试剂包括PBS缓冲液、蛋白酶K和STE溶液。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，STE溶液由0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA制得。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，PCR反应试剂包括PCR反应缓冲液、Taq 酶和ddH2O；PCR反应缓冲液包括100 mM Tris-HCl(pH 8.8 at 25℃)，500 mM KCl，15mM MgCl2，0.8%(v/v)Nonidet P40。
上述的Sox10基因甲基化的检测试剂盒在Sox10基因甲基化的检测中的应用。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，包括以下步骤：
提取待检样本的基因组DNA，用亚硫酸氢钠处理基因组DNA，用SEQ ID NO.1-2所示的检测引物进行PCR扩增，得到扩增片段，将扩增片段连接至克隆载体并筛选得到阳性菌；将阳性菌进行测序，并分析待检样本甲基化结果；
PCR扩增的反应条件为98℃预变性4min，94℃变性45s，66℃退火45s，72℃延伸1min；20个循环；94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，72℃修复延伸8min。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物，检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。
检测引物的上游引物：SEQ ID NO.1，Sox10-F:5’- GGAGAGAGAGATGTTAGGTAGGTAG-3’。
检测引物的下游引物：SEQ ID NO.2，Sox10-R:5’-AGTTTAATAAAAATTTTCTCTTTCTCTC-3’。
产物长度388bp。
因此，可以将述的基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物在Sox10基因甲基化检测中应用。
当然，也可以将基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物应用于制备Sox10基因甲基化的检测试剂盒。
实施例2
本实施例提供Sox10基因甲基化的检测试剂盒，该试剂盒包括基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物，检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。
检测引物的上游引物：SEQ ID NO.1，Sox10-F:5’- GGAGAGAGAGATGTTAGGTAGGTAG-3’。
检测引物的下游引物：SEQ ID NO.2，Sox10-R:5’-AGTTTAATAAAAATTTTCTCTTTCTCTC-3’。
产物长度388bp。
检测试剂盒包括基因组DNA提取试剂，亚硫酸氢钠，乙酸钠，无水乙醇，PCR反应试剂中的至少一种。
基因组DNA提取试剂包括PBS缓冲液、蛋白酶K和STE溶液。
STE溶液由0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA制得。
PCR反应试剂包括PCR反应缓冲液、Taq 酶和ddH2O；PCR反应缓冲液包括100 mMTris-HCl(pH 8.8 at 25℃)，500 mM KCl，15mM MgCl2，0.8%(v/v)Nonidet P40。
因此可以将Sox10基因甲基化的检测试剂盒用于外周血Sox10基因。
Sox10基因甲基化的检测试剂盒在Sox10基因甲基化的检测中的应用，包括基因组DNA提取、基因组DNA处理、目的片段扩增和克隆载体构建与测序。
基因组DNA的提取：
1.1取外周血1mL，加入等体积的PBS缓冲液，混匀后12000rpm离心5min，弃上清；
1.2加入667μL的STE，24μL的20%的SDS，37℃水浴1h，加10µL的20mg/mL的蛋白酶K混匀，55℃水浴消化过夜；
1.3消化的样品加入等体积的Tris饱和酚，充分摇匀，12000rpm离心10min，取上清加入等体积的Tris饱和酚，充分摇匀，12000rpm离心10min；
1.4取上清加入等体积的氯仿：异戊醇，漩涡震荡，再12000rpm离心10min，重复一次；
1.5取上清液加入2倍体积的冰醋酸，1/10体积醋酸钠水平摇动，直到可见絮状DNA析出，-20℃处理30min或冰浴15～20min，取出后再次12000rpm离心10min，使DNA沉淀；
1.6用70%的乙醇洗涤2次。晾干，加入TE缓冲液溶解，-20℃保存备用.
基因组DNA的处理：
2.1将约2μgDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50μL，加5.5μL新鲜配制的3M NaOH，42℃水浴30min。
2.2加10mM对苯二酚（氢醌）30μL至上述水浴后混合液中，溶液变成淡黄色，加520μL的3.6M亚硫酸氢钠至上述水浴后溶液中。EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。
2.3加200 μL石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化，50℃避光水浴16h。
2.4将移液器枪头伸入石蜡油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后吸取混合液至一洁净1.5mL的EP管中。
2.5加300μL结合液（6M盐酸胍）到EP管中。混匀后移到UNIQ柱中，室温静置2min。8000rpm 室温离心1min，弃收集管废液。
2.6加入洗液650μL，8000rpm 室温离心1min，弃收集管废液，重复清洗一次。12000rpm 室温离心1min。
2.7把UNIQ柱放入一个新的1.5mL的EP管中，55℃烘箱放置10min，加入预热的双蒸水50μL，55℃烘箱放置20min。12000rpm 室温离心2min，收集洗脱液，使体积终体积为50μL。
2.8加5.5μL新鲜配制的3M NaOH，室温放置15min。
2.9加8μL的3M乙酸钠、4uμL10mg/mL糖原和270μL冰无水乙醇，置于-20度，过夜沉淀。
2.10以12000rpm离心10min，倒去上清液。加500μL的70%乙醇，12000rpm，离心5min，去上清。再加同量乙醇，同样再做一遍。倒掉上清，并常温简短离心后，将附壁乙醇离至EP管底，移液器小心将残余液体吸净，室温干燥5min，或沉淀由不透明变为半透明或透明时，加入20μL-30μLddH2O，溶解沉淀，得到DNA样品。
目的片段扩增：
以步骤2.10中得到的DNA样品为DNA模板进行扩增。
扩增的体系：
DNA模板3μL；
上/下游引物1μL/1μL;
PCR反应缓冲液5μL;
Taq 酶0.8μL；
ddH2O补足至50μL。
反应条件：
98℃预变性4min，94℃变性45s，66℃退火45s，72℃延伸1min；20个循环；94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，72℃修复延伸8min。
扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。
从图1可以看出，引物能较好的扩增出目的条带。
克隆载体构建并测序：
纯化PCR反应产物然后连接到pUC18-T载体；连接反应体系为：
10 ×Ligation Buffer 1μL;
50%PEG 1μL;
pUCm-T Vector 50ng;
PCR产物 0.2pmol;
T4 DNA Ligase 2.5U;
ddH2O补足至10μL，18℃连接过夜。
连接产物转化：
3.1100μL感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮；
3.2加入10μL连接液，轻轻混匀。冰上放置30分钟；
3.3在42℃水浴热激60秒。冰上放置10～15分钟；
3.4加400μL的LB培养基，37℃ 200～250 rpm振荡培养1小时；
3.5室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400μL上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮；
3.6将细菌涂布在预先用20μL 100 mM IPTG和100μL 20 mg/mL X-gal涂布的氨苄青霉素平板上，倒置培养过夜。
选择在IPTG/X-gal平板上生长的白色菌落，用牙签挑至含氨苄青霉素的液体培养基，37℃培养过夜。
目的片段TA克隆的菌落PCR鉴定（3％糖凝胶电泳检测）。
利用M13+/-引物测序。
Sox10基因启动子区域57号位点甲基化水平检测：应用引物对10例正常和20例ENS畸形（包括10例HD，10例IND）患者的外周血Sox10基因启动子区域57号位点甲基化水平检测，并对诊断的敏感性，特异性和准确率进行评估，计算基于ROC曲线的cutoff值，结果发现，应用Sox10基因启动子区域57号位点甲基化水平诊断正常与异常的cutoff界值为90%，诊断IND与非IND的cutoff值为60%。因此，Sox10基因启动子区域57号位点甲基化水平检测可以用于肠神经系统发育畸形的诊断，当甲基化水平为90%以上时为正常，甲基化水平为60-90%诊断为先天性巨结肠，甲基化水平为60%以下诊断为IND。
综上所述，本发明实施例提供的基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物，能方便的进行Sox10基因的检测，方便对表达结果的鉴定和分析。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国医科大学附属盛京医院
<120> 基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物、检测试剂盒及其应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ggagagagag atgttaggta ggtag 25
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
agtttaataa aaattttctc tttctctc 28
Claims (5)
1.一种基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物在制备肠神经系统发育畸形诊断产品中的应用，其特征在于，所述检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肠神经系统发育畸形诊断产品包括基因组DNA提取试剂、亚硫酸氢钠、乙酸钠、无水乙醇、PCR反应试剂中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述基因组DNA提取试剂包括PBS缓冲液、蛋白酶K和STE溶液。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述STE溶液由0.1mol/LNaCl、10mmol/LTris-HCl、1mmol/LEDTA制得。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PCR反应试剂包括PCR反应缓冲液、Taq酶和ddH2O；所述PCR反应缓冲液包括pH 8.8的100 mM Tris-HCl、500 mM KCl、15mM MgCl2、0.8%的Nonidet P40。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811006866.8A CN108753958B (zh) | 2018-08-30 | 2018-08-30 | 基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物、检测试剂盒及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811006866.8A CN108753958B (zh) | 2018-08-30 | 2018-08-30 | 基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物、检测试剂盒及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108753958A CN108753958A (zh) | 2018-11-06 |
| CN108753958B true CN108753958B (zh) | 2021-05-14 |
Family
ID=63966787
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201811006866.8A Expired - Fee Related CN108753958B (zh) | 2018-08-30 | 2018-08-30 | 基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物、检测试剂盒及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108753958B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104611410A (zh) * | 2013-11-04 | 2015-05-13 | 北京贝瑞和康生物技术有限公司 | 一种无创癌症检测方法及其试剂盒 |
| CN108103195A (zh) * | 2018-01-22 | 2018-06-01 | 上海酷乐生物科技有限公司 | 一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针、试剂盒及其应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1664336A2 (en) * | 2003-09-11 | 2006-06-07 | University College Cork-National University of Ireland, Cork | A detection method for autism and related disorders |
| CN105219851B (zh) * | 2015-09-25 | 2018-05-25 | 东南大学 | 一种焦测序定量检测甲基化的方法 |
-
2018
- 2018-08-30 CN CN201811006866.8A patent/CN108753958B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104611410A (zh) * | 2013-11-04 | 2015-05-13 | 北京贝瑞和康生物技术有限公司 | 一种无创癌症检测方法及其试剂盒 |
| CN108103195A (zh) * | 2018-01-22 | 2018-06-01 | 上海酷乐生物科技有限公司 | 一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针、试剂盒及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108753958A (zh) | 2018-11-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Huppi et al. | The 8q24 gene desert: an oasis of non-coding transcriptional activity | |
| Li et al. | MyoD-induced circular RNA CDR1as promotes myogenic differentiation of skeletal muscle satellite cells | |
| Inskip et al. | Identification of polymorphism at the glutathione S-transferase, GSTM3 locus: evidence for linkage with GSTM1* A. | |
| Mazar et al. | Epigenetic regulation of microRNA genes and the role of miR-34b in cell invasion and motility in human melanoma | |
| Zhang et al. | MicroRNA deregulation in right ventricular outflow tract myocardium in nonsyndromic tetralogy of fallot | |
| CN103205503B (zh) | 用于检测clcn1基因突变的方法、试剂盒及特异性引物 | |
| CN114891886B (zh) | 用于诊断膀胱癌的核酸产品、试剂盒及应用 | |
| CN116121365B (zh) | 导致cofs综合征的致病基因、检测及应用 | |
| CN107557461B (zh) | 一种用于肝癌易感基因早筛的核酸质谱的检测方法 | |
| CN113512548A (zh) | 一种基于CRISPR-Cas12a系统的新型冠状病毒检测试剂盒及其应用 | |
| US20100092981A1 (en) | Methods of detecting hypermethylation | |
| Wu et al. | NEXN is a novel susceptibility gene for coronary artery disease in Han Chinese | |
| Qu et al. | A fluorescence strategy for circRNA quantification in tumor cells based on T7 nuclease-assisted cycling enzymatic amplification | |
| WO2011082325A3 (en) | Sequences of e.coli 055:h7 genome | |
| CN114959064A (zh) | 一种抗凝全血法鉴定鸡隐性白羽基因型的分子检测方法及其应用 | |
| CN108753958B (zh) | 基于外周血Sox10基因甲基化的检测引物、检测试剂盒及其应用 | |
| CN107385037B (zh) | 一种miRNA间接实时荧光定量PCR检测方法 | |
| Khoshnevisan et al. | A significant upregulation of miR-886-5p in high grade and invasive bladder tumors | |
| CN110684834B (zh) | 一种检测由6个cd36突变基因所导致gpⅳ缺失的基因分型试剂盒 | |
| CN108384785B (zh) | 环状RNA circ-GPC3及其检测试剂与应用 | |
| TWI385252B (zh) | 一種癌症篩檢的方法 | |
| CN109022466B (zh) | 一种acta2-mitf融合基因及其检测引物和应用 | |
| CN108624589B (zh) | 环状RNA circ-ERBB2及其检测试剂与应用 | |
| Chinnasri et al. | Preferentially different mechanisms of inactivation of 9p21 gene cluster in liver fluke–related cholangiocarcinoma | |
| JP5800307B2 (ja) | ウシ由来試料を鑑定する方法及びキット |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20210514 |