CN113512548A

CN113512548A - 一种基于CRISPR-Cas12a系统的新型冠状病毒检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN113512548A
Application number: CN202110808700.3A
Authority: CN
Inventors: 唐佳; 罗良平; 石海弘; 周峰; 洪燕
Original assignee: Jiangmen Maternity And Child Health Care Hospital
Current assignee: Jiangmen Maternity And Child Health Care Hospital
Priority date: 2021-07-16
Filing date: 2021-07-16
Publication date: 2021-10-19

Abstract

本发明涉及一种用于检测新型冠状病毒的CRISPR‑Cas系统，所述CRISPR‑Cas系统包括ORF1ab基因crRNA和N基因crRNA；所述ORF1ab基因crRNA由SEQIDNo.1‑SEQIDNo.2所述序列转录得到；所述N基因crRNA由SEQIDNo.3‑SEQIDNo.4所述序列转录得到。同时本发明还公开了基于该CRISPR‑Cas12a系统的新型冠状病毒检测试剂盒，该试剂盒通过重组酶聚合酶扩增技术提高检测灵敏度，使其对浓度低至4pg/μl的参考品可以准确检测，同时本发明还具有检测操作简单方便，结果可通过荧光值直观判读等优点，适于临床进行新型冠状病毒快速检测的大规模应用。

Description

一种基于CRISPR-Cas12a系统的新型冠状病毒检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，特别是涉及一种基于CRISPR-Cas12a系统的新型冠状病毒检测试剂盒及其应用。

背景技术

冠状病毒(Coronavirus)是自然界中广泛存在的一类线性单股正链RNA病毒，于1937年最先从鸡身上分离出来，病毒颗粒的平均直径约为100nm，呈球形或椭圆形，具有包膜且包膜上存在棘突，在电子显微镜下可见如日冕般的外围冠状而被命名为“冠状病毒”。其病毒基因组5’端具有甲基化的帽状结构，3’端具有多聚A尾，全长约为27-32kb，是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒。冠状病毒仅感染脊椎动物，少数可感染人体，引发重症急性呼吸道综合征的SARS-CoV和中东呼吸综合征的MERS-CoV是广为人知的两种。调查显示：与流感类似的多种病原体相比，冠状病毒的感染期更长，可达15天；致死率和基本传染数(R0)更高，分别为0.147％和4.18，冠状病毒的危害性大。

早期、快速、准确地对无症状的潜伏期感染者进行临床诊断及鉴别，是防控传染性疾病的关键环节：既能为潜伏期病人争取治疗时间，阻断疾病进一步恶化；又能尽早发现传染源，切断传播途径，阻止疾病进一步蔓延。SARS-CoV-2 肺炎的诊断目前主要依赖核酸检测和CT扫描，然而目前的核酸检测耗时较长，所用试剂盒造价较高，检验依赖PCR仪等大型机器且存在一定的假阴性结果； CT结果无法精确鉴别SARS-CoV-2感染性肺炎与非SARS-CoV-2感染引发的肺炎。

重组聚合酶技术(Recombinase Polymerase Amplificatio，RPA)是由TwistDx 生物技术公司发明的一种由重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换Bsu聚合酶参与的体外恒温核酸扩增技术，在23-45℃下连续反应5-20min，即可对微量的靶基因核酸进行大量扩增，扩增效果好且不依赖PCR仪，操作简便，非常适用于病原体的快速诊断与现场检测。2013年在埃及的手足口病病毒(FMDV)爆发中，该技术被成功应用于现场FMDV的快速检测和疫情控制。Euler研发的 RPA检测板可在6-10min内同时检测包括埃博拉病毒、马尔堡病毒、裂谷热病毒、苏丹病毒和天花病毒在内的多种病毒，检测结果特异性强，与人类基因组无交叉反应；灵敏度高，最低可检测为16拷贝的病毒载量。

CRISPR-Cas系统为存在与大多数细菌与所有古生菌中的一种防御机制，以消灭外来的核酸基因组，由CRISPR序列与Cas家族蛋白两部分组成。CRISPR (ClusteredRegularly Interspaced Short Palindromic Repeats)序列是一个特殊的 DNA重复序列家族，包含有高度保守长度约为21-48bp的重复序列(repeats) 和26-72bp的间隔序列(spacer)，重复序列被不同的间隔序列隔开，CRISPR 通过间隔序列对靶基因进行识别。Cas(CRISPR associated)位于CRISPR位点附近，是双链DNA核酸酶家族的总称，目前已鉴定出Cas蛋白45个，能在crRNA 引导下对靶位点进行切割。Cas12a属于该家族中的一种，能在crRNA引导下对靶基因进行特定切割，同时被激活的Cas12a可发挥非选择性剪切酶活性，对所遇到的DNA进行非选择性剪切。利用Cas12a可被crRNA靶向激活的特性，经过特异性地设计，可以用于靶基因的特异性检测。

发明内容

基于此，本发明的目的之一在于针对新型冠状病毒ORF1 ab和N基因，提出一种CRISPR-Cas系统。

为实现上述目的，本发明采用的具体技术方案为：

一种CRISPR-Cas系统，所述CRISPR-Cas系统包括SARS-CoV-2 ORF1 ab 基因crRNA和N基因crRNA；所述SARS-CoV-2 ORF1 ab基因crRNA由SEQ ID No.1-SEQ ID No.2所述序列转录得到；所述SARS-CoV-2 N基因crRNA由SEQ ID No.3-SEQ ID No.4所述序列转录得到。

在其中一些实施例中，上述CRISPR-Cas系统还包括SARS-CoV-2 ORF1 ab dsDNA扩增引物对和SARS-CoV-2 N基因dsDNA扩增引物对；所述SARS-CoV-2 ORF1 ab dsDNA扩增引物对包括如SEQ ID No.5所示的上游引物和SEQ ID No.6 所示的下游引物；所述SARS-CoV-2 N基因dsDNA扩增引物对包括如SEQ ID No.7所示的上游引物和SEQ ID No.8所示的下游引物。

在其中一些实施例中，上述CRISPR-Cas系统还包括报告DNA链；所述报告DNA链序列如SEQ ID No.9所示，且报告DNA链的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团。

在其中一些实施例中，上述报告DNA链的荧光基团选自FAM、TET、CY3、 CY5或ROX，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2或BHQ3。

在其中一些实施例中，上述CRISPR-Cas系统还包括Cas12a；所述Cas12a 选自MbCas12a、Mb3Cas12a、LbCas12a、FnCas12a、AsCas12a、Lb5Cas12a、 HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a和BoCas12a中的任意一种。

本发明的目的之一还在于提出上述CRISPR-Cas系统在新型冠状病毒检测中的应用。

本发明的目的之一还在于提出一种新型冠状病毒检测试剂盒。

实现上述目的的技术方案如下：

一种新型冠状病毒检测试剂盒，包含上述CRISPR-Cas系统。

在其中一些实施例中，上述试剂盒由Cas12a、crRNA、dsDNA、报告DNA 链和Buffer组成；

优选地，在检测体系中，各组分的含量为：Cas12a 40-50nM、crRNA 20-25nM、dsDNA5-15ng、报告DNA链120-130nM、Buffer 4-16μl。

本发明的目的之一还在于提出一种基于CRISPR-Cas12a系统的新型冠状病毒检测试剂盒的检测方法。

实现上述目的的技术方案如下：

一种基于CRISPR-Cas12a系统的新型冠状病毒检测方法，所述方法包括：

(1)样本核酸提取：提取待检测样本RNA，逆转录为cDNA；

(2)RPA扩增：根据SARS-CoV-2 ORF1 ab基因如SEQ ID No.5所示的上游引物、SEQID No.6所示的下游引物和SARS-CoV-2 N基因SEQ ID No.7所示的上游引物、SEQ ID No.8所示的下游引物，针对步骤(1)中所得待测样本cDNA 进行重组聚合酶技术扩增，得到扩增产物dsDNA；

(3)CRISPR反应检测：根据步骤(2)得到的dsDNA，配置CRISPR反应检测体系，进行反应检测程序，读取检测荧光信号；

(4)根据试剂盒检测结果判定标准，判定检测结果。

在其中一些实施例中，上述CRISPR反应检测程序中，收集荧光的时间为 30-60min；进一步优选为40min。

本发明的发明人针对SARS-CoV-2的ORF1ab基因和N基因进行深入研究，并针对其巧妙地设计了一组crRNA以及扩增引物，在此基础上提出一种CRISPR-Cas12a系统和基于该系统的新型冠状病毒检测试剂盒，从而可以准确地对新型冠状病毒进行扩增和特异性识别，并通过采用重组酶聚合酶扩增技术提高检测灵敏度，使其对浓度低至4pg/μl的参考品可以准确检测，同时本发明还具有检测操作简单方便，结果可通过荧光值直观判读等优点，适于临床进行新型冠状病毒快速检测的大规模应用。

附图说明

图1为实施例1中SARS-CoV-2 ORF1ab基因荧光信号检测结果图，其中空白对照：NC；阳性样本；阴性样本：样本1、样本2、样本3。

图2为实施例1中SARS-CoV-2 N基因荧光信号检测结果图，其中空白对照：NC；阳性样本；阴性样本：样本1、样本2、样本3。

图3为实施例2试剂盒灵敏度检测中不同样本浓度SARS-CoV-2 ORF1基因的荧光信号检测图。

图4为实施例2试剂盒灵敏度检测中不同样本浓度SARS-CoV-2 N基因浓度的荧光信号检测图。

图5为实施例3试剂盒特异性检测中不同SARS-CoV-2 ORF1基因crRNA 的荧光信号检测图。

图6为实施例3试剂盒特异性检测中不同SARS-CoV-2 N基因crRNA的荧光信号检测图。

具体实施方式

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和 /或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1 试剂盒的制备和检测

一、试剂盒的制备

(1)crRNA的合成

CRISPR-Cas12a检测方法的核心在于crRNA，crRNA质量直接决定该检测方法的灵敏度和特异度。根据Cas12a识别富含T的特性，针对GeneBank上 SARS-CoV-2 Orf1 ab基因和N基因核酸序列，根据网站 http://bioinfolab.miamioh.edu设计一段在PAM序列后的20-23bp的靶点序列，利用T7启动子(TAATACGACTCACTATAGG)+Cas12a的scaffold序列(AATTTCTACTAAGTGTAGAT)+靶点序列(靶标DNA PAM序列后的20-23bp) 构成crRNA-F，反向互补为crRNA-R。合成crRNA-F/R两条寡核苷酸链，设计序列如下表1。

表1 crRNA-F/R序列表

crRNA-F/R退火后，按照体外转录及纯化方法来获得crRNA。其中，退火反应体系如下表2所示：

表2 退火反应体系

成分	体积
		crRNA-F(100μM)	45μl
crRNA-R(100μM)	45μl
		10xNEBbuffer2.1	10μl
总体积	100μl

将上述组分加入离心管中，混匀并离心，退火反应程序：37℃30min；95℃ 5min；反应结束后，每分钟降温5℃至25℃，即可获得dsDNA。

按照上述寡核苷酸链退火合成双链的方法将crRNA-F/R退火后，测量浓度，准备1μgDNA加入转录体系中，体外T7(HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit，NEB)转录获得crRNA的反应体系如下表3所示：

表3 体外T7转录反应体系

根据测量的DNA浓度，计算退火合成的DNA加入1μg所需的体积，并按上表将上述组分加入离心管中，混匀并离心，转录反应程序：37℃16h，即可获得crRNA。

crRNA磁珠纯化：通过采用AGENCOURT RNACLEAN XP试剂盒 (BECKMAN COULTER)，将上述crRNA加入2μl DNase(去除DNA酶)， 37℃15min；50μl磁珠混匀，室温静置5min，磁力架吸附5min；50μl70％乙醇溶液(采用DEPC水配制)清洗三次；通风干燥10min；40μl DEPC水洗脱产物，即得所述crRNA。

(2)RPA扩增检测体系配置

设计ORF1 ab dsDNA扩增引物对(F/R)和N基因dsDNA扩增引物对(F/R) 如下表4所示。

表4 ORF1 ab和N基因扩增引物序列

名称	序列(5’-3’)	SEQ ID NO.
			Orf1 ab-RPA-F	GGTATGTGGAAAGGTTATGGCTGTAGTTGT	5
Orf1 ab-RPA-R	TTATCATTGTAGATGTCAAAAGCCCTGTAT	6
			N-RPA-F	ACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTC	7
N-RPA-R	GCAGCAGATTTCTTAGTGACAGTTTGGC	8

具体RPA扩增体系如下表5所示：

表5 RPA扩增体系

将上述46μl混合液加到装有冻干酶粉的Twist Amp UFO kit(TwistDx)反应管中，将冻干酶粉轻轻吹打至完全溶解，然后向反应管中加入4μl醋酸镁溶液，混匀后37℃反应10min，RPA扩增反应完成后，即可获取大量DNA扩增产物。 (3)CRISPR-Cas12a检测RPA扩增产物

CRISPR-Cas12a检测体系配置如下表6所示：

表6 CRISPR-Cas12a检测体系

成分	体积
		Cas12a	45nM
crRNA22.5nM	45nM
		报告DNA	125nM
dsDNA	10ng
		10×NEB Buffer 2.1	8μl
ddH<sub>2</sub>O	Up to 80μl

其中，报告DNA序列如下表7所示：

表7 报告DNA序列

名称	序列(5’-3’)	SEQ ID NO.
			报告DNA链	FAM-TTATT-BHQ1	9

根据上述体系配置制备待检体系，选择报告DNA链5’端修饰的FAM荧光基团对应的激发波长为494nm和发射波长518nm，在stepone plus荧光定量pcr 仪(赛默飞)上每1分钟检测一次荧光，检测60分钟后，确认检测结果。

(4)结果判读

检测ORF1 ab和N基因来检测新型冠状病毒的结果判定标准如下：

(a)阴性(即正常人)：荧光值为0；

(b)阳性(即患者)：荧光值大于5000。

二、试剂盒的检测

收集健康人群的咽拭子样本3份(样本1、样本2、样本3)，并设置空白对照：NC，DEPC水；阳性对照：阳性质控品(4pg/μl，新型冠状病毒合成阳性质粒，上海生工合成)，共5份样本经样本前处理(提取待检测样本RNA，逆转录成cDNA)后采用本发明所述试剂盒进行检测。具体检测步骤如下：

(1)样本核酸提取：Trizol(碧云天)提取待检测样本RNA，逆转录成cDNA。

(2)RPA扩增：以靶基因扩增引物，通过RPA方法扩增步骤(1)中的待测样本cDNA，得到扩增产物dsDNA。

(3)CRISPR反应检测：根据步骤(2)得到的dsDNA，配置CRISPR反应检测体系，进行反应检测，读取检测荧光信号。

(4)根据试剂盒检测结果判定标准，判定检测结果。

根据检测结果图1-2可知，阳性对照样本的ORF1 ab和N基因检测荧光曲线荧光值大于50000，正常人、空白对照和阴性对照样本的ORF1 ab和N基因检测荧光曲线均趋于水平，同时与阳性对照样本的检测荧光曲线具有显著差异，可明显区别和判读。

实施例2 试剂盒的灵敏度检测

使用浓度分别为4ng/μl、400pg/μl、40pg/μl、4pg/μl、400ag/μl、40ag/μl、4ag/μl的阳性质控品(新型冠状病毒合成阳性质粒，上海生工合成)，评估实施例1 中试剂盒的检测准确性，根据检测结果图3-4可知，当阳性质控品的浓度大于 4pg/μl时，样本的ORF1 ab和N基因检测荧光曲线荧光值大于50000，可明显判读。因此，本发明试剂盒的灵敏度为4pg/μl。

实施例3 试剂盒中crRNA的特异性检测

参考上述实施例1中crRNA的合成，分别针对SARS-CoV-2 Orf1 ab基因和 N基因核酸序列设计Orf1 ab-crRNA-1～Orf1 ab-crRNA-4和 N-crRNA-1～N-crRNA-2，具体序列如下表3-1所示，使用浓度为4pg/μl的阳性质控品(新型冠状病毒合成阳性质粒)，进行上述crRNA序列的特异性实验研究，结果见附图5-6。

表3-1crRNA序列

通过检测结果可知，图5为不同SARS-CoV-2 ORF1基因crRNA的荧光信号检测图，可看出采用Orf1 ab-crRNA-4的检测特异性最佳；图6为不同 SARS-CoV-2 N基因crRNA的荧光信号检测图，可看出采用N-crRNA-2的检测特异性优于N-crRNA-1。因此，本发明试剂盒中关于crRNA的序列最佳选择为 Orf1 ab-crRNA-4和N-crRNA-2。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

序列表

<110> 江门市妇幼保健院

<120> 一种基于CRISPR-Cas12a系统的新型冠状病毒检测试剂盒及其应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 66

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gaaattaata cgactcacta tagggtaatt tctactaagt gtagatcggt gtaagtgcag 60

cccgtc 66

<210> 2

<211> 66

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<210> 3

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<212> DNA

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<210> 5

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Claims

1.一种CRISPR-Cas系统，其特征在于，所述CRISPR-Cas系统包括SARS-CoV-2 ORF1 ab基因crRNA和N基因crRNA；

所述SARS-CoV-2 ORF1 ab基因crRNA由SEQ ID No.1-SEQ ID No.2所述序列转录得到；

所述SARS-CoV-2 N基因crRNA由SEQ ID No.3-SEQ ID No.4所述序列转录得到。

2.根据权利要求1所述CRISPR-Cas系统，其特征在于，所述CRISPR-Cas系统还包括SARS-CoV-2 ORF1 ab dsDNA扩增引物对和N基因dsDNA扩增引物对；

所述SARS-CoV-2 ORF1 ab dsDNA扩增引物对包括如SEQ ID No.5所示的上游引物和SEQ ID No.6所示的下游引物；

所述SARS-CoV-2 N基因dsDNA扩增引物对包括如SEQ ID No.7所示的上游引物和SEQID No.8所示的下游引物。

3.根据权利要求1所述CRISPR-Cas系统，其特征在于，所述CRISPR-Cas系统还包括报告DNA链；

所述报告DNA链序列如SEQ ID No.9所示，且报告DNA链的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团。

4.根据权利要求3所述CRISPR-Cas系统，其特征在于，所述报告DNA链的荧光基团选自FAM、TET、CY3、CY5或ROX，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2或BHQ3。

5.根据权利要求1所述CRISPR-Cas系统，其特征在于，所述CRISPR-Cas系统还包括Cas12a；

所述Cas12a选自MbCas12a、Mb3Cas12a、LbCas12a、FnCas12a、AsCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a和BoCas12a中的任意一种。

6.权利要求1～5任一项所述CRISPR-Cas系统在新型冠状病毒检测中的应用。

7.一种新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～5任一项所述CRISPR-Cas系统。

8.根据权利要求7所述的新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由Cas12a、crRNA、dsDNA、报告DNA链和Buffer组成；

9.一种基于CRISPR-Cas12a系统的新型冠状病毒检测方法，所述方法包括：

(1)样本核酸提取：提取待检测样本RNA，逆转录为cDNA；

(2)RPA扩增：根据SARS-CoV-2 ORF1 ab基因如SEQ ID No.5所示的上游引物、SEQ IDNo.6所示的下游引物和SARS-CoV-2 N基因SEQ ID No.7所示的上游引物、SEQ ID No.8所示的下游引物，针对步骤(1)中所得待测样本cDNA进行重组聚合酶技术扩增，得到扩增产物dsDNA；

(4)根据试剂盒检测结果判定标准，判定检测结果。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)CRISPR反应检测程序中，收集荧光的时间为30-60min。