CN108384785B - 环状RNA circ-GPC3及其检测试剂与应用 - Google Patents

环状RNA circ-GPC3及其检测试剂与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种环状RNA circ‑GPC3及其检测试剂与应用，属于生物技术领域。本发明的环状RNA circ‑GPC3对应的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，所述环状RNA circ‑GPC3由GPC3母基因的第3个独立外显子反向拼接环化产生；本发明环状RNA circ‑GPC3的检测引物如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；本发明环状RNA circ‑GPC3的检测探针如SEQ ID NO:4所示，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。本发明提供了一种新的环状RNA分子—环状RNA circ‑GPC3，并以该环状RNA circ‑GPC3作为分子标志物诊断肝癌。本发明还设计针对环状RNA circ‑GPC3分子的荧光定量检测引物及taqman探针，该探针和引物能很好的检测生物体内的circ‑GPC3表达情况，可以为肝癌的诊断提供一种基于环状RNA检测的方案。

Description

环状RNA circ-GPC3及其检测试剂与应用
技术领域
本发明涉及一种环状RNA circ-GPC3及其检测试剂与应用，具体涉及一种环状RNAcirc-GPC3、其检测引物和探针以及该环状RNA circ-GPC3在肝癌诊断中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
环状RNA(circRNA)是一类在生物体内存在的闭合的环状RNA分子，具有多种生物学特性，而且是客观大量存在的。环状RNA由基因组DNA转录加工后反向拼接产生的一类新颖的核酸分子。对于环化RNA的具体功能机制尚未明确，但在生物体内环状RNA可以多层次调控基因的表达，比如：环状RNA可以通过海绵作用吸附miRNA，转录后调控基因表达；环状RNA可以和RNA结合蛋白作用调控基因转录；环状RNA可以和基因组DNA结合调控RNA的剪接；另外环状RNA可以直接作为模板翻译蛋白质发挥重要的生物学作用。
Glypican3(GPC3)是一种硫酸乙酰肝素糖蛋白，全长蛋白位于细胞膜上。人的GPC3基因位于X染色体长臂26.2区域，全长基因组DNA跨越450151bp；最长转录RNA变异体包含9个外显子。GPC3的核酸及蛋白在肝、心、脑、脾、胃、小肠、大肠及胰腺等正常成人组织中均不表达或超微量表达，而在胎盘、胚胎肝、胚胎肺和胚胎肾中表达。1997年Hsu等报道GPC3mRNA在肝癌组织中特异性高表达，在非肿瘤性肝脏中不表达或极低表达。GPC3作为一种分泌型的糖基磷脂酰肌醇锚定膜蛋白，在原发性肝癌患者的血清中可以被检测到，而在肝硬化、慢性肝炎以及正常人群的血清中则无法检测到，GPC3的存在并不受到AFP的影响，在AFP阴性或阳性的肝癌患者的血清中均能够检测到GPC3的存在。GPC3基因和肝癌的发生发展有密切关系，研究认为GPC3是肝癌发生过程中的一个早期事件，参与调控肝癌的发展过程；GPC3可以与Wnt通途信号分子形成复合物，通过自分泌和旁分泌的方式来增加经典Wnt途径中的信号分子的表达，促进肝癌细胞的生长。
然而，现有技术暂无关于环状RNA circ-GPC3的研究。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种环状RNA circ-GPC3及其检测试剂与应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种环状RNA circ-GPC3，所述环状RNA circ-GPC3对应的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，所述环状RNA circ-GPC3由GPC3母基因的第3个独立外显子反向拼接环化产生。
本发明的环状RNA circ-GPC3是申请人检索环状RNA数据库circbase及设计反向扩增PCR引物，经过大量研究，在肝癌细胞系Huh7中识别鉴定的一个新型的环状RNA分子。环状RNA circ-GPC3是由GPC3基因的第3个独立完整的外显子首位相接连接而成的环状RNA分子，申请人将其命名为circ-GPC3，成熟circ-GPC3序列的长度为695nt。
第二方面，本发明提供了上述环状RNA circ-GPC3作为分子标志物在制备用于诊断肝癌的试剂盒中的应用。
经过研究，申请人发现，本发明的环状RNA circ-GPC3分子在肝癌细胞高表达，但在正常肝脏细胞中不表达，由此本发明的环状RNA circ-GPC3可作为分子标志物用于诊断肝癌。并且，本发明环状RNA circ-GPC3具有闭合的环状结构，不容易受核酸外切酶攻击，在生物体内非常稳定，是理想的分子诊断标志物。
第三方面，本发明提供了上述环状RNA circ-GPC3的检测试剂在制备用于诊断肝癌的试剂盒中的应用。
第四方面，本发明提供了上述环状RNA circ-GPC3的检测引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。该引物是用于扩增环状RNA circ-GPC3对应的cDNA的反向PCR引物。
第五方面，本发明提供了上述环状RNA circ-GPC3的检测探针，所探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。所述探针是taqman探针，该探针能很好的检测生物体内的circ-GPC3表达情况，可以为肝癌的诊断提供一种基于环状RNA检测的方案。
第六方面，本发明提供了上述引物和/或上述探针在制备用于检测环状RNA circ-GPC3或诊断肝癌的试剂盒中的应用，所述环状RNA circ-GPC3对应的cDNA序列如SEQ IDNO:1所示，所述环状RNA circ-GPC3由GPC3母基因的第3个独立外显子反向拼接环化产生。
第七方面，本发明提供了用于检测环状RNA circ-GPC3或诊断肝癌的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物和/或上述探针，所述环状RNA circ-GPC3对应的cDNA序列如SEQ IDNO:1所示，所述环状RNA circ-GPC3由GPC3母基因的第3个独立外显子反向拼接环化产生。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括RNA提取试剂、逆转录反应体系和RCR反应液。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括去基因组DNA反应体系。
作为本发明所述试剂盒的更优选实施方式，所述RNA提取试剂为Trizol试剂。
本发明检测环状RNA circ-GPC3或诊断肝癌的方法包括以下步骤：(1)提取肝脏细胞中的总RNA；(2)用DNA酶除去提取的RNA中残留的基因组DNA；(3)将RNA逆转录成cDNA；(4)采用反向PCR引物和探针进行荧光定量PCR，检测环状RNA circ-GPC3分子在肝脏细胞中的表达情况。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供了一种新的环状RNA分子—环状RNA circ-GPC3，并以该环状RNA circ-GPC3作为分子标志物诊断肝癌。本发明还设计针对环状RNA circ-GPC3分子的荧光定量检测引物及taqman探针，该探针和引物能很好的检测生物体内的circ-GPC3表达情况，可以为肝癌的诊断提供一种基于环状RNA检测的方案。
附图说明
图1为本发明环状RNA circ-GPC3的分子定位及形成模式图；
图2为本发明环状RNA circ-GPC3的DNA测序验证环化接口峰图；
图3为本发明Taqman探针荧光定量PCR检测环状RNA circ-GPC3在正常肝脏细胞及肝癌细胞中表达的结果图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明环状RNA circ-GPC3的一种实施例，本实施例所述环状RNA circ-GPC3对应的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，所述环状RNA circ-GPC3由GPC3母基因的第3个独立外显子反向拼接环化产生，其成熟circ-GPC3序列的长度为695nt，环状RNA circ-GPC3的分子定位及形成模式图如图1所示。
实施例2
本实施例设计PCR扩增引物并识别鉴定实施例1所述环状RNA circ-GPC3在肝脏细胞中的客观存在。本实施例识别鉴定的方法包括以下步骤：1.Trizol方法提取肝脏细胞中的总RNA；2.用DNA酶除去提取的RNA中残留的基因组DNA：3.将RNA逆转录成cDNA；4.设计反向扩增引物PCR扩增，PCR产物经核酸凝胶电泳后，割胶回收目标条带，然后经过sanger法DNA测序验证环状RNA circ-GPC3的客观存在的接口。本实施例识别鉴定实施例1所述环状RNA circ-GPC3在肝脏细胞中客观存在的具体方法如下：
1.RNA提取(Trizol方法)
(1)细胞取100万个左右，加入1ml trizol；
(2)加入200μL氯仿，剧烈振荡10秒，室温静置10min；
(3)4℃下，12,000g离心10min，溶液分为三层，RNA溶解在水相中，转移水相至另一个新的RNase free EP管；
(4)加入1倍体积异丙醇，涡旋充分混匀；
(5)4℃下，12,000g离心15min，离心后管底出现RNA沉淀，弃去上清；
(6)加入1ml 75％乙醇，用手轻轻颠倒，12,000g离心5min，弃去上清；
(7)室温晾干，加入20μL DEPC水溶解沉淀。
2.基因组DNA去除
去除总RNA中的基因组DNA的残留，采用DNA消化酶，具体反应体系和条件如下：
反应液总体积为10μL，如下组分组成：
Figure BDA0001631159680000051
反应液中于37℃消化40min后，85℃3min灭活DNA消化酶。
3.RNA逆转录成CDNA
将RNA逆转录成cDNA反应体系和条件如下：
Figure BDA0001631159680000052
反应条件为：37℃10min，42℃20min，85℃5min，4℃2min。
4.设计反向扩增PCR引物扩增circ-GPC3接口及侧翼序列DNA测序验证
根据circbase数据库中提供部分参考序列，设计识别反向PCR扩增引物，扩增circ-GPC3的接口及侧翼序列引物序列为F1:5'GAACGTACTGCTTGGTCTCT3'(如SEQ ID NO:2所示)，R1:5'TTCTTGGCATGGCGAACAAC 3'(如SEQ ID NO:3所示)；引物扩增环状circ-GPC3部分序列的大小为116bp；以Huh7肝癌细胞系cDNA为模板，PCR扩增环状circ-GPC3的环化接口两侧的部分序列，经2％浓度核酸琼脂糖电泳分离，PCR产物纯化后经DNA测序验证，结果见图2。结果显示circ-GPC3分子是由GPC3基因的第3个独立完整的外显子首位相接连接而成的环状RNA分子。
实施例3
本实施例选用正常肝脏细胞系LO2以及肝癌细胞系Hep3B、HepG2、Huh7，采用荧光定量PCR检测环状circ-GPC3分子在肝脏细胞中的表达情况。
本实施例根据实施例1所述环状RNA circ-GPC3成熟序列设计荧光定量PCRtaqman探针；探针的序列为：
5'FAM-CCTAGTGGTGGTCAGCTTTCCTG-TAMRA 3'(如SEQ ID NO:4所示)；
配套引物为识别鉴定环状RNA反向PCR引物F1/R1；序列参见实施例2，
F1:5'GAACGTACTGCTTGGTCTCT3'(如SEQ ID NO:2所示)，
R1:5'TTCTTGGCATGGCGAACAAC 3'(如SEQ ID NO:3所示)。扩增环状RNA circ-GPC3环化接口区域序列的大小为116bp。
荧光定量PCR扩增检测环状circ-GPC3分子在各细胞中表达情况的方法为：按照实施例2所述方法提取肝脏细胞中的总RNA，并用DNA酶除去提取的RNA中残留的基因组DNA，将RNA逆转录成cDNA；最后采用荧光定量PCR扩增进行检测，荧光定量PCR扩增检测环状RNAcirc-GPC3分子在各细胞中的表达情况反应体系及反应条件如下：
Figure BDA0001631159680000061
荧光定量PCR反应条件为：95℃5分钟变性；95℃10秒，60℃35秒；40个循环。
Taqman探针荧光定量PCR检测环状RNA circ-GPC3在正常肝细胞及肝癌细胞中的表达结果参见图3，结果显示本发明方法检测环状circ-GPC3分子在肝癌细胞高表达，在正常肝脏细胞LO2中未检测到表达。本发明的荧光定量PCR检测方法能够理想的检测环状circ-GPC3在生物体中的表达情况。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州永诺生物科技有限公司
<120> 环状RNA circ-GPC3及其检测试剂与应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 695
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
aggcctttga aattgttgtt cgccatgcca agaactacac caatgccatg ttcaagaaca 60
actacccaag cctgactcca caagcttttg agtttgtggg tgaatttttc acagatgtgt 120
ctctctacat cttgggttct gacatcaatg tagatgacat ggtcaatgaa ttgtttgaca 180
gcctgtttcc agtcatctat acccagctaa tgaacccagg cctgcctgat tcagccttgg 240
acatcaatga gtgcctccga ggagcaagac gtgacctgaa agtatttggg aatttcccca 300
agcttattat gacccaggtt tccaagtcac tgcaagtcac taggatcttc cttcaggctc 360
tgaatcttgg aattgaagtg atcaacacaa ctgatcacct gaagttcagt aaggactgtg 420
gccgaatgct caccagaatg tggtactgct cttactgcca gggactgatg atggttaaac 480
cctgtggcgg ttactgcaat gtggtcatgc aaggctgtat ggcaggtgtg gtggagattg 540
acaagtactg gagagaatac attctgtccc ttgaagaact tgtgaatggc atgtacagaa 600
tctatgacat ggagaacgta ctgcttggtc tcttttcaac aatccatgat tctatccagt 660
atgtccagaa gaatgcagga aagctgacca ccact 695
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaacgtactg cttggtctct 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttcttggcat ggcgaacaac 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cctagtggtg gtcagctttc ctg 23

Claims (1)

1.环状RNA circ-GPC3的检测引物和/或环状RNA circ-GPC3的检测探针在制备用于诊断肝癌的试剂盒中的应用，其特征在于，所述环状RNA circ-GPC3对应的cDNA序列如SEQ IDNO:1所示，所述环状RNA circ-GPC3由GPC3母基因的第3个独立外显子反向拼接环化产生；
所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；
所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
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