CN116064765B - 检测loxl1基因突变的物质在制备肝纤维化患者分子分型的产品中的应用 - Google Patents

检测loxl1基因突变的物质在制备肝纤维化患者分子分型的产品中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116064765B
CN116064765B CN202210918879.2A CN202210918879A CN116064765B CN 116064765 B CN116064765 B CN 116064765B CN 202210918879 A CN202210918879 A CN 202210918879A CN 116064765 B CN116064765 B CN 116064765B
Authority
CN
China
Prior art keywords
liver fibrosis
mutation
loxl1gene
treatment
loxl1
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210918879.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116064765A (zh
Inventor
陈巍
尤红
孙亚朦
张文
陈姝延
张宁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Friendship Hospital
Original Assignee
Beijing Friendship Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Friendship Hospital filed Critical Beijing Friendship Hospital
Priority to CN202210918879.2A priority Critical patent/CN116064765B/zh
Publication of CN116064765A publication Critical patent/CN116064765A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116064765B publication Critical patent/CN116064765B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开检测LOXL1基因突变的物质在制备肝纤维化患者分子分型的产品中的应用。本发明公开了检测LOXL1基因突变的物质在制备肝纤维化患者分子分型的产品中的应用，所述LOXL1基因突变为LOXL1基因第一外显子从起始密码子ATG开始的第458位的核苷酸由G突变为A的杂合突变。本发明首次发现LOXL1基因458G>GA杂合突变与肝纤维化患者治疗后的肝纤维化不易逆转显著相关，基于该发现可快速对肝纤维化初治患者进行分子分型，以预判治疗后效果，有利于临床诊治过程中对肝纤维化患者更好地监督管理，适用于大样本肝纤维化患者分子分型的快速诊断筛查。

Description

检测LOXL1基因突变的物质在制备肝纤维化患者分子分型的 产品中的应用
技术领域
本发明涉及生物检测鉴定技术领域。更具体地，涉及检测LOXL1基因突变的物质在制备肝纤维化患者分子分型的产品中的应用。
背景技术
当前预防肝硬化的主要手段为消除病因，然而尽管动物实验和临床研究证据表明去除损伤刺激因素可有效逆转肝纤维化，但仍有部分患者难以逆转(Sun Y,Zhou J,WangL,et al.New classification of liver biopsy assessment for fibrosis in chronichepatitis B patients before and after treatment.Hepatology 2017；65:1438-1450.；Vilar-Gomez E,Martinez-Perez Y,Calzadilla-Bertot L,et al.Weight LossThrough Lifestyle Modification Significantly Reduces Features of NonalcoholicSteatohepatitis.Gastroenterology 2015；149:367-78e5；quiz e14-5.)。细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度沉积是不同病因肝纤维化的共同病理特征，其降解是肝纤维化逆转的关键步骤。然而不同的肝纤维化患者其肝脏ECM构成组分以及交联程度存在差异，因此ECM的理化属性差异可能是影响肝纤维化可逆性的重要因素。赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)家族成员(包括LOX，LOXL1-4)是催化纤维化肝脏ECM交联重构的重要酶分子(Chen W,Yang A,Jia J,et al.Lysyl oxidase(LOX)family members:rationaleand their potential as therapeutic targets for liver fibrosis.Hepatology2020；72(2):729-741.)。课题组研究发现在肝纤维化小鼠模型中，LOXL1表达失调相比其他LOX成员更显著；小鼠实验发现抑制LOXL1基因表达可延缓ECM结构蛋白胶原和弹性蛋白的交联沉积，进而显著减轻四氯化碳(CCl4)或者是高脂饮食(CDAA)诱导的肝纤维化(Yang A,Yan X,Xu H,et al.Selective depletion of hepatic stellate cells-specificLOXL1alleviates liver fibrosis.FASEB J2021；35(10):e21918.；Yang A,Yan X,Fan X,et al.Hepatic stellate cells-specific LOXL1deficiency abrogates hepaticinflammation,fibrosis,and corrects lipid metabolic abnormalities in non-obeseNASH mice.Hepatol Int 2021；15(5):1122-1135.；Zhao W,Yang A,Chen W,etal.Inhibition of lysyl oxidase-like 1(LOXL1)expression arrests liver fibrosisprogression in cirrhosis by reducing elastin crosslinking.Biochim BiophysActa Mol Basis Dis 2018；1864(4Pt A):1129-1137.)。
近年来，肝纤维化发生的遗传易感性越来越受到关注。研究表明多个基因诸如SERPINA1，JAK2，AFP，PNPLA3等突变与肝纤维化发生显著相关。人类LOXL1基因位于15号染色体，共7个外显子，编码574个氨基酸的LOXL1蛋白。目前研究较多的错义突变包括LOXL1422G>T(rs1048661)和LOXL1458G>A(rs3825942)，但是主要集中在眼科相关的疾病。LOXL1422G>T和LOXL1458G>A突变在欧洲(Thorleifsson G,Magnusson KP,Sulem P,etal.Common sequence variants in the LOXL1gene confer susceptibility toexfoliation glaucoma.Science 2007；317(5843):1397–1400.；Aragon-Martin JA,RitchR,Liebmann J,et al.Evaluation of LOXL1 gene polymorphisms in exfoliationsyndrome and exfoliation glaucoma.Mol Vis 2008；14:533-541.)，美国(Aragon-Martin JA,Ritch R,Liebmann J,et al.Evaluation of LOXL1 gene polymorphisms inexfoliation syndrome and exfoliation glaucoma.Mol Vis 2008；14:533-541.)及亚洲(Wu M,Zhu XY,Ye J.Associations of polymorphisms of LOXL1gene with primaryopen-angle glaucoma:a meta-analysis based on 5,293 subjects.Mol Vis 2015；21:165-172.)人群中与原发性开角型青光眼和剥脱综合征性青光眼的高发生率显著相关；另外，LOXL1458G>A突变还和自发性动脉夹层易感显著相关(G,Friedrichs F,Kis B,et al.Association between single nucleotide polymorphisms in the lysyloxidase-like 1 gene and spontaneous cervical artery dissection.CerebrovascDis 2007；24(4):343-348.)。LOXL1突变导致胶原和/或弹性纤维过度交联后丧失弹性引起组织僵硬是这类疾病的共同病因，这也是肝纤维化的病理特征。然而，截止目前，全世界范围内LOXL1基因多态性与肝纤维化的发生及治疗后逆转情况的关联性尚无报道。
目前临床上针对各种病因引起的肝纤维化的治疗方式主要是去病因治疗，尚无肝纤维化特效治疗药物。然而在去病因治疗后，仍有部分肝纤维化患者不逆转甚至出现进展情况。国内外尚未见从分子易感性方面阐述肝纤维化患者甚至是病理评分一致的肝纤维化患者在去病因治疗后肝纤维化不逆转原因。因此，找到肝纤维化不逆转原因并应用于肝纤维化患者分子分型具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供检测LOXL1基因突变的物质在制备肝纤维化患者分子分型的产品中的应用，以预判肝纤维化患者在去病因治疗后的肝纤维化的逆转情况的偏好性，有利于更好地对肝纤维化患者进行临床监督管理。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明首先提供了检测LOXL1基因突变的物质在制备肝纤维化患者分子分型的产品中的应用；
所述LOXL1基因突变为LOXL1基因第一外显子从起始密码子ATG开始的第458位的核苷酸由G突变为A的杂合突变(即SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第458位的核苷酸由G突变为A的杂合突变)。
进一步，所述肝纤维化患者分子分型是预判肝纤维化初治患者治疗后的肝纤维化逆转情况。
在本发明的具体实施方式中，所述预判肝纤维化初治患者治疗后的肝纤维化逆转情况是预判肝纤维化初治患者治疗后的肝纤维化属于易逆型还是难逆型。
进一步，所述检测LOXL1基因突变的物质包括能扩增含有所述LOXL1基因突变的DNA片段的引物对。
在本发明的具体实施方式中，所述引物对可由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的两条单链DNA组成。
进一步，所述检测LOXL1基因突变的物质可由所述引物对组成，还可由所述引物对与进行PCR扩增所需的除引物外的其他试剂组成。
在本发明的具体实施方式中，所述除引物外的其他试剂包括MaxDNA Polymerase(2X)和RNase-free H2O等。
本发明进一步提供了检测LOXL1蛋白突变的物质在制备肝纤维化患者分子分型的产品中的应用；
所述LOXL1蛋白突变为LOXL1蛋白的第153位的氨基酸残基由G突变为D的突变(即SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的第153位的氨基酸残基由G突变为D的突变)。
进一步，所述检测LOXL1蛋白突变的物质可为能特异识别LOXL1蛋白或所述LOXL1蛋白突变的物质。
在本发明中，所述产品可以为试剂盒。
本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述检测LOXL1基因突变的物质或所述LOXL1蛋白突变的物质。
进一步，所述试剂盒的用途为肝纤维化患者分子分型。
进一步，所述肝纤维化患者分子分型是预判肝纤维化初治患者治疗后的肝纤维化逆转情况。
在本发明的具体实施方式中，所述预判肝纤维化初治患者治疗后的肝纤维化逆转情况是预判肝纤维化初治患者治疗后的肝纤维化属于易逆型还是难逆型。
上述试剂盒还可包括记载有如下a1)或a2)的载体：
a1)如待测肝纤维化初治患者基因组中不含有所述LOXL1基因突变或所述LOXL1蛋白突变，所述待测肝纤维化初治患者治疗后的肝纤维化属于易逆型；
a2)如待测肝纤维化初治患者基因组中含有所述LOXL1基因突变或所述LOXL1蛋白突变，所述待测肝纤维化初治患者治疗后的肝纤维化属于难逆型。
进一步，所述试剂盒可由上述检测LOXL1基因突变的物质或上述检测LOXL1蛋白突变的物质组成，还可由上述检测LOXL1基因突变的物质或上述检测LOXL1蛋白突变的物质与上述记载有a1)或a2)的载体组成。
本发明中，所述肝纤维化初治患者是慢乙肝肝纤维化初治患者，慢乙肝肝纤维化初治患者是指慢乙肝患者就医诊断为慢乙肝肝纤维化，但尚未接受过任何抗病毒治疗，准备接受抗病毒治疗时，称为初治患者；所述治疗后指的是抗病毒治疗后。
本发明的有益效果如下：
本发明首次发现LOXL1基因458G>GA杂合突变(无纯合突变)与肝纤维化患者治疗后肝纤维化不易逆转显著相关，基于该发现利用普通PCR技术和Sanger测序检测肝纤维化初治患者(特别是慢乙肝肝纤维化初治患者)的抗凝全血或者非抗凝血凝块基因组DNA中LOXL1基因突变情况，可快速对肝纤维化初治患者进行分子分型(肝纤维化初治患者治疗后的肝纤维化属于易逆型还是难逆型)，有利于临床诊治过程中对肝纤维化患者更好地监督管理，整个实验流程仅需一管全血可在10小时内完成，实验操作简便，经济高效，可同时进行大规模临床血样检测，适用于大样本肝纤维化患者分子分型的快速诊断筛查。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为LOXL1 458G>A突变后促进LOXL1蛋白胞外分泌及胞外胶原沉积试验结果；其中，A为LOXL1458G>A质粒的pRP[Exp]-EGFP/neo-EF1A>hLOXL1458G>A[NM_005576.3]/FLAG的图谱；B为人LOXL1458G>A质粒，LOXL1WT质粒及空质粒转染人肝星状细胞系LX-2后免疫印迹分析FLAG,LOXL1,LOX,αSMA及内参GAPDH蛋白表达的检测结果；C为人LOXL1458G>A，LOXL1WT，及空质粒转染人肝星状细胞系LX-2后qPCR对LOXL1,LOX,αSMA基因表达的检测结果；D为人LOXL1458G>A质粒，LOXL1WT质粒转染人肝星状细胞系LX-2后共聚焦荧光显微镜观察LOXL1蛋白表达定位情况；E为人LOXL1458G>A，LOXL1WT质粒及空质粒转染人肝星状细胞系LX-2后共聚焦荧光显微镜观察EGFP绿色荧光蛋白及I型胶原蛋白表达定位情况；
Con代表转染空质粒，WT代表转染LOXL1WT质粒，c.458G>A代表转染LOXL1458G>A质粒。
图2为基于本发明引物PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳图。
图3为LOXL1基因未发生458G>GA突变时Sanger测序后BioEdit软件可视化图。
图4为LOXL1基因发生458G>GA突变时Sanger测序后BioEdit软件可视化图。
图5为164例患者初治及治疗78周时各生化指标、肝组织弹性值及肝纤维化Ishak评分的比较结果；其中，A为谷丙转氨酶ALT，谷草转氨酶AST，谷氨酰转肽酶GGT及血小板PLT指标；B为肝组织弹性值LSM及LOXL1458G>GA突变患者及非突变患者间的肝组织病理Ishak评分差异结果(趋势卡方检验)。
图6为LOXL1458G>GA突变及非突变慢乙肝肝纤维化患者抗病毒治疗后突变率与非突变率间差异分析结果(卡方检验)。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1与肝纤维化患者逆转情况相关的LOXL1基因突变的发现
依赖于国家重大传染病科技专项临床样本队列中的164位慢乙肝肝纤维化患者(抗病毒前后各行一次肝穿，准确评估肝纤维化)血液样本的LOXL1外显子进行了Sanger测序，分析了LOXL1基因外显子所有突变与抗病毒治疗后肝纤维化临床逆转情况的相关性，发现LOXL1基因第一个外显子从起始密码子ATG开始的第458位的核苷酸由G突变为A的杂合突变(458G>GA，无纯合突变)(SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第458位的核苷酸由G突变为A的杂合突变，整个杂合突变简写为LOXL1458G>GA，当涉及到构建质粒时，突变简写为LOXL1458G >A，未发生458G>GA突变的基因简写为LOXL1WT)与肝纤维化患者抗病毒治疗后肝纤维化不易逆转显著相关(LOXL1458G>GA突变患者与非突变患者逆转率分别为26.3％和52.4％，p＝0.025)。相应的，LOXL1蛋白的第153位氨基酸残基由G突变为D(即SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的第153位的氨基酸残基由G突变为D)的突变。
LOXL1 458G>A突变后促进LOXL1蛋白胞外分泌及胞外胶原沉积试验，具体步骤如下：
1、人LOXL1458G>A质粒，LOXL1WT质粒及不含LOXL1基因的空质粒合成：
委托云舟生物科技(广州)股份有限公司进行人LOXL1458G>A和LOXL1WT(未发生突变)质粒以及不含LOXL1基因的空质粒(简称空质粒)的合成，质粒分别为pRP[Exp]-EGFP/neo-EF1A>hLOXL1458G>A[NM_005576.3]/FLAG，其结构示意图如图1中A所示，LOXL1蛋白的C端融合了FLAG标签蛋白，pRP[Exp]-EGFP/neo-EF1A>hLOXL1WT[NM_005576.3]/FLAG(与pRP[Exp]-EGFP/neo-EF1A>hLOXL1458G>A[NM_005576.3]/FLAG相比将LOXL1458G>A基因替换为LOXL1WT基因)，以及pRP[Exp]-Neo-EF1A>null。
2、人LOXL1458G>A质粒，LOXL1WT质粒及空质粒转染人肝星状细胞系LX-2后免疫印迹分析FLAG,LOXL1,LOX,αSMA及内参GAPDH蛋白表达。
①细胞转染
LX-2细胞用含10％FBS的MEM培养基在六孔板中培养(2ml/孔)，至细胞长满至80％时，使用罗氏公司的X-tremeGENE HP DNATransfection Reagent进行质粒转染，转染步骤如表1所示。
表1质粒转染步骤
②细胞蛋白提取
1)细胞转染48h后，弃去培养基，PBS清洗1次去除多余培养基，每孔加入200μl0.25％-Trypsin-EDTA(Thermo Fisher)，细胞培养箱中置1min，取出加入1ml含10％FBSMEM培养基中和胰酶消化，2000rpm常温离心1min，保留细胞沉淀，PBS重悬细胞沉淀，2000rpm常温离心1min，弃上清，保留细胞沉淀。
2)细胞中加入100μl含10％蛋白酶抑制剂(上海翊圣生物科技有限公司)的RIPA溶液(上海碧云天生物技术有限公司)，移液器反复吹打至细胞完全破碎，冰上静置30min，期间每隔10min震荡5s。13500rpm，4℃离心15min，弃去沉淀，留取上清的蛋白溶液。蛋白浓度通过经典BCA法测定。
③免疫印迹Western Blotting检测
蛋白上样量为30μg，一抗分别为FLAG(MBL，M185-3L，稀释比例1：1000)，LOXL1(Abcam，ab221362，稀释比例1：1000)，LOX(Sigma，L4669，稀释比例1：1000)，αSMA(Abcam，ab5694，稀释比例1：500)，GAPDH(Abcam,ab8245,稀释比例1：10000)，4℃过夜孵育。二抗为羊抗鼠及羊抗兔二抗(中杉金桥，稀释比例1：5000)，常温孵育1h。使用Super ECLDetection Reagent ECL化学发光超敏显色试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)显影。
结果如图1中B所示，结果显示，LOXL1458G>A质粒过表达人肝星状细胞系LX-2后免疫印迹检测LOXL1蛋白及FLAG标签蛋白，发现LOXL1突变不影响LOXL1本身表达(标签蛋白FLAG和LOXL1蛋白自身表达无变化)，但可以促进同家族成员赖氨酸氧化酶LOX及肝星状细胞活化标志蛋白αSMA的表达。
3、人LOXL1458G>A质粒，LOXL1WT质粒及空质粒转染人肝星状细胞系LX-2后qPCR分析LOXL1,LOX,αSMA基因表达
①细胞总RNA提取
细胞总RNA提取使用Trizol(Sigma)法，向细胞中加入1ml Trizol后移液器反复吹打至细胞完全破裂，室温静置10min后加入200μl氯仿，上下颠倒混匀至溶液呈现乳白色，室温静置10min，12000g，4℃离心10min，吸取上清后加入等体积异丙醇混匀，-20℃静置1h(也可以-20℃静置过夜以增加总RNA得率)，12000g，4℃离心10min，弃去上清，留下沉淀，加入1ml 75％DEPC水配置的酒精溶液清洗1遍，12000g，4℃离心10min，弃去上清，留下沉淀，通风橱干燥10min，加入20μl DEPC水溶解，利用Nano2000紫外分光光度计测RNA浓度。
②cDNA合成
cDNA合成使用罗氏的Transcriptor cDNA Synth.Kit 2试剂盒，根据说明书要求，第一步加入1μg RNA，oligo(dT)引物和水，混匀后65℃孵育10min后置于冰上；第二步加入缓冲液，RNase Inhibitor，dNTPs，Transcriptor RT后50℃孵育1h，85℃孵育5min至于冰上，留待qPCR扩增反应。
③qPCR定量检测
qPCR定量检测LOXL1,LOX,αSMA基因表达，其中PCR所用的引物如表2所示，体系如表3所示，条件如表4所示，结果如图1中C所示，LOXL1458G>A质粒过表达人肝星状细胞系LX-2后实时荧光定量PCR检测，发现LOXL1458G>A突变对LOXL1，LOX及αSMA基因表达无影响。
表2 引物
表3 PCR反应体系
组分 体积 终浓度 品牌 货号
SYBR Green Mix(2X) 10μl 1X Applied Biosystems A25742
正向引物 1μl 0.2μM - -
反向引物 1μl 0.2μM - -
模板DNA 5μl 200ng - -
RNase-free H2O 3μl - - -
表4 PCR反应条件
4、人LOXL1458G>A质粒和LOXL1WT质粒转染人肝星状细胞系LX-2后共聚焦荧光显微镜观察LOXL1蛋白表达定位
LOXL1458G>A，LOXL1WT质粒转染人肝星状细胞系LX-2步骤同步骤2，区别在于培养皿为24孔板，细胞接种前，24孔板中放置合适的细胞爬片使LX-2细胞在爬片上生长。转染48h后，弃去培养基，PBS清洗1遍后，每孔加入500μl甲醇溶液(4℃预冷)固定10min，弃去甲醇，PBS清洗3遍(注意操作要柔和，以防细胞脱片)，加入200μl驴血清室温封闭1h，加入LOXL1一抗(Abcam，ab221362，稀释比例1：100)，4℃过夜孵育，PBS清洗3遍，加入Alexa Fluor594donkey anti-rabbit IgG(H+L)二抗(Invitrogen，A21207，稀释比例1：500)常温避光孵育1h后PBS洗3次，DAPI染核(Abcam，ab104139)，中性树胶封片，共聚焦显微镜下成像拍照。
结果如图1中D所示，结果显示：免疫荧光分析LOXL1突变后可促进LOXL1蛋白向胞外转运。
5、人LOXL1458G>A质粒，LOXL1WT质粒及空质粒转染人肝星状细胞系LX-2后共聚焦荧光显微镜观察EGFP绿色荧光蛋白及I型胶原蛋白表达定位
细胞转染操作同步骤2，免疫荧光染色步骤同步骤2，不同点：一抗为I型胶原(Abcam,ab34710，稀释比例：1：100)。
结果如图1中E所示，结果显示：免疫荧光分析LOXL1突变后可促进胞外胶原形成与沉积。
通过以上结果分析可以得出：
LOXL1458G>A突变质粒转染人肝星状细胞系LX-2后，FLAG标签蛋白及LOXL1蛋白表达相对LOXL1WT质粒转染无显著变化，说明LOXL1458G>A突变对LOXL1蛋白表达量无影响，但是αSMA及LOX蛋白表达增加，说明LOXL1458G>A突变可促进肝星状细胞活化；免疫荧光实验证明LOXL1458G>A突变后可促进LOXL1蛋白向胞膜和胞外转移以及促进胞外I型胶原沉积。因此，LOXL1基因第一个外显子从起始密码子ATG开始的458G>GA杂合突变可促进LOXL1胞内蛋白向胞外分泌，进而促进ECM结构蛋白交联沉积。ECM过度沉积是不同病因肝纤维化的共同病理特征，其降解是肝纤维化逆转的关键步骤。然而不同的肝纤维化患者其肝脏ECM交联程度存在差异，其理化属性差异可能是影响肝纤维化可逆性的重要因素。
综上，分析检测肝纤维化患者LOXL1基因的第一个外显子从起始密码子ATG开始的458G>GA突变情况可对肝纤维化初治患者进行精准分子分型：若未发生突变(LOXL1WT)，则肝纤维化初治患者治疗后的肝纤维化属于易逆型；若发生突变(LOXL1458G>GA)，则肝纤维化初治患者治疗后的肝纤维化属于难逆型。
实施例2基于LOXL1基因从起始密码子ATG开始的458G>GA突变的肝纤维化患者分子分型方法
一、引物设计与合成
人LOXL1基因序列下载自NCBI网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000015.10？report＝fasta&from＝73926462&to＝73952136。LOXL1基因位于15号染色体，共7个外显子。设计并合成特异性识别LOXL1基因第一个外显子覆盖458G>GA突变序列的引物，正向引物的序列为5’-CTCAGCGCTCCGAGAGTAG-3’(SEQ ID NO.2)，反向引物的序列为5’-GCTGTACAGACTGTGCGAGTA-3’(SEQ ID NO.3)，产物大小644bp。其中，引物设计使用Primer-BLAST在线工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝BlastHome)。引物合成由北京天一辉远生物科技有限公司完成，纯化方式为AHRP。引物均以DEPC水溶解为100μmol/L的储存液，于-20℃避光保存。正向引物和反向引物的工作浓度为10μmol/L。
二、分子分型方法
1、基因组DNA提取
收集肝纤维化患者抗凝全血或非抗凝血凝块，抗凝全血(5ml)使用天根生化科技(北京)有限公司血液基因组DNA提取试剂盒(0.1-20ml)(DP349)提取基因组DNA，非抗凝血块(1ml)使用天根生化科技(北京)有限公司0.1-1ml血凝块基因组DNA提取试剂盒(0.1-1ml)(DP335)提取基因组DNA。DNA浓度利用紫外可见分光光度计BioSpec-nano(日本岛津)检测。
2、PCR扩增
利用步骤一合成的正向引物和反向引物进行PCR扩增，其中，PCR反应体系及PCR反应条件见表5和表6。所得产物在1％琼脂糖凝胶电泳中可观察到清晰的条带，结果如图2所示，在紫外灯照射下切胶回收，使用天根生化科技(北京)有限公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(增强型)(DP219)进行PCR产物回收和纯化。
3、Sanger测序
纯化后的PCR产物交由北京天一辉远生物科技有限公司进行Sanger测序，测序结果通过BioEdit软件可视化及分析肝纤维化患者LOXL1基因的突变情况(c.458G>GA,p.G153GD)，其中，LOXL1基因未发生突变的结果如图3所示，LOXL1基因发生突变的结果如图4所示。
4、分子分型
根据LOXL1基因的突变情况对肝纤维化初治患者进行分子分型：若未发生突变(LOXL1WT)，则肝纤维化初治患者治疗后的肝纤维化属于易逆型；若发生突变(LOXL1458G>GA)，则肝纤维化初治患者治疗后的肝纤维化属于难逆型。
表5 PCR反应体系
表6 PCR反应条件
温度 时间 循环
预变性 98℃ 2min 1
变性 98℃ 10s 35
退火延伸 60℃ 15s
终末延伸 72℃ 1min 1
孵育 4℃ - -
实施例3基于LOXL1基因458G>GA突变的肝纤维化患者分子分型试剂盒
基于LOXL1基因458G>GA突变的肝纤维化患者分子分型试剂盒包括：
Max DNA Polymerase(2X)
正向引物：5’-CTCAGCGCTCCGAGAGTAG-3’(SEQ ID NO.2)
反向引物：5’-GCTGTACAGACTGTGCGAGTA-3’(SEQ ID NO.3)
阳性对照：LOXL1基因发生458G>GA突变的核苷酸序列
阴性对照：LOXL1基因未发生458G>GA突变的核苷酸序列
记载有如下a1)或a2)的载体：
a1)如待测肝纤维化初治患者基因组中不含有LOXL1基因458G>GA突变，所述待测肝纤维化初治患者治疗后的肝纤维化属于易逆型；
a2)如待测肝纤维化初治患者基因组中含有LOXL1基因458G>GA突变，所述待测肝纤维化初治患者治疗后的肝纤维化属于难逆型。
实施例4逆转与临床的关系
164例慢乙肝肝纤维化初治患者进行抗病毒治疗78周，分别在初治和78周时肝穿进行病理诊断Ishak肝纤维化评分，78周Ishak肝纤维化评分相对初治时下降≥1则判定为逆转，否则为不逆转，结果如表7所示，88例出现了不逆转，76例出现了逆转。
利用164例慢乙肝肝纤维化初治患者留存的血根，根据上述实施例1中“二、分子分型方法”分别进行基因组DNA提取，PCR扩增，Sanger测序，结果如表7所示，发现88例不逆转的患者中LOXL1458G>GA突变例数为28，突变率为31.8％，76例逆转患者中LOXL1458G>GA突变例数为10，突变率为13.2％，二者突变率存在显著差异(卡方检验，p＝0.005)。
整理164例患者初治及治疗78周时血生化谷丙转氨酶ALT，谷草转氨酶AST，谷氨酰转肽酶GGT及血小板PLT指标，以及初治及治疗78周肝组织弹性值LSM，系统比较LOXL1458G>GA突变患者及非突变患者间的差异(t检验)。结果如图5中A和B，结果显示，治疗78周后，LOXL1458G>GA突变患者血清ALT和GGT显著高于非突变者(图5中A)，且肝脏弹性值显著高于非突变者(图5中B)。LOXL1458G>GA突变慢乙肝肝纤维化患者抗病毒治疗后肝纤维化逆转率为26.3％，非突变慢乙肝肝纤维化患者抗病毒治疗后肝纤维化逆转率为52.4％，两者间存在显著差异(卡方检验，结果如图6所示)。以上结果说明，LOXL1458G>GA突变的慢乙肝肝纤维化初治患者抗病毒治疗后不易逆转。
表7 突变与慢乙肝肝纤维化逆转情况的相关性分析。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (4)

1.检测LOXL1基因突变的试剂在制备肝纤维化患者分子分型的产品中的应用；
所述LOXL1基因突变为LOXL1基因第一外显子从起始密码子ATG开始的第458位的核苷酸由G突变为A的杂合突变；
所述肝纤维化患者分子分型是预判肝纤维化初治患者治疗后的肝纤维化逆转情况；
所述预判肝纤维化初治患者治疗后的肝纤维化逆转情况是预判肝纤维化初治患者治疗后的肝纤维化属于易逆型还是难逆型。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测LOXL1基因突变的试剂包括能扩增含有所述LOXL1基因突变的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物对可由SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示的两条单链DNA组成。
4.检测LOXL1蛋白突变的试剂在制备肝纤维化患者分子分型的产品中的应用；
所述LOXL1蛋白突变为LOXL1蛋白的第153位的氨基酸残基由G突变为D的突变；
所述肝纤维化患者分子分型是预判肝纤维化初治患者治疗后的肝纤维化逆转情况；
所述预判肝纤维化初治患者治疗后的肝纤维化逆转情况是预判肝纤维化初治患者治疗后的肝纤维化属于易逆型还是难逆型。
CN202210918879.2A 2022-08-02 2022-08-02 检测loxl1基因突变的物质在制备肝纤维化患者分子分型的产品中的应用 Active CN116064765B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210918879.2A CN116064765B (zh) 2022-08-02 2022-08-02 检测loxl1基因突变的物质在制备肝纤维化患者分子分型的产品中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210918879.2A CN116064765B (zh) 2022-08-02 2022-08-02 检测loxl1基因突变的物质在制备肝纤维化患者分子分型的产品中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116064765A CN116064765A (zh) 2023-05-05
CN116064765B true CN116064765B (zh) 2023-09-05

Family

ID=86179234

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210918879.2A Active CN116064765B (zh) 2022-08-02 2022-08-02 检测loxl1基因突变的物质在制备肝纤维化患者分子分型的产品中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116064765B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101835490A (zh) * 2007-08-02 2010-09-15 阿雷斯托生物科学股份有限公司 Lox和loxl2抑制剂及其应用
CN109477144A (zh) * 2015-09-29 2019-03-15 国家儿童医院研究所 用于检测肝脏纤维化和对疗法的响应性的方法
CN111560419A (zh) * 2020-05-25 2020-08-21 南通大学 基因il-32在监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的应用及药物应用
CN111647656A (zh) * 2020-05-15 2020-09-11 华中科技大学同济医学院附属同济医院 mir-29a基因在检测肝癌及肝纤维化中的应用及所述基因条件敲入小鼠的构建方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1706139A4 (en) * 2004-01-23 2009-06-17 Massachusetts Eye & Ear Infirm LYSYL OXIDASE-LIKE 1 (LOXL1) AND ELASTOGENESIS
SG10201703240RA (en) * 2012-10-30 2017-06-29 Gilead Sciences Inc Therapeutic and diagnostic methods related to lysyl oxidase-like 2 (loxl2)

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101835490A (zh) * 2007-08-02 2010-09-15 阿雷斯托生物科学股份有限公司 Lox和loxl2抑制剂及其应用
CN109477144A (zh) * 2015-09-29 2019-03-15 国家儿童医院研究所 用于检测肝脏纤维化和对疗法的响应性的方法
CN111647656A (zh) * 2020-05-15 2020-09-11 华中科技大学同济医学院附属同济医院 mir-29a基因在检测肝癌及肝纤维化中的应用及所述基因条件敲入小鼠的构建方法
CN111560419A (zh) * 2020-05-25 2020-08-21 南通大学 基因il-32在监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的应用及药物应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
赖氨酰氧化酶家族在肝细胞癌发生发展中的作用;覃小宾等;临床肝胆病杂志;第38卷(第3期);682-687 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN116064765A (zh) 2023-05-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106947838A (zh) 非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光lamp检测引物组、试剂盒及检测方法
CN110452984A (zh) 一种用于宫颈癌甲基化检测的甲基化基因组合、引物和探针组合、试剂盒及其使用方法
CN110541025B (zh) 杜氏肌营养不良基因缺陷的检测方法、引物组合物及试剂盒
CN110343785B (zh) 基于PCR-CRISPR-cas13a检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的试剂盒
CN108192965B (zh) 一种检测线粒体基因组a3243g位点异质性的方法
CN115141884B (zh) 一种新的atp7b突变基因及其诊断试剂
CN110551812A (zh) 一种诊断脊髓性肌萎缩症的CRISPR-Cas系统及其应用
CN116064765B (zh) 检测loxl1基因突变的物质在制备肝纤维化患者分子分型的产品中的应用
CN112941161A (zh) 评价脑梗死的风险的方法
CN108384785B (zh) 环状RNA circ-GPC3及其检测试剂与应用
CN115927356B (zh) Slc45a2致病突变基因、致病突变体及在制备眼皮肤白化病ⅳ型诊断试剂盒中的应用
CN109022466B (zh) 一种acta2-mitf融合基因及其检测引物和应用
KR101236197B1 (ko) 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스의 감별 진단
CN114480411A (zh) 一种Alport综合征患者COL4A5致病突变基因及其检测试剂
CN111733227B (zh) 特发性视神经炎诊断分子标记物circRNA、试剂盒及应用
CN113981072A (zh) 用于hla-a*29基因检测的引物、探针、试剂盒和方法
CN114032303A (zh) 检测基因abcb11新突变的寡核苷酸和方法
CN108676852B (zh) 在外周血游离dna中检测p53基因表观遗传学修饰差异的引物对组及试剂盒
JP5828499B2 (ja) Ｅｙｓ遺伝子の変異を検出するためのプライマーセット、プローブ、マイクロアレイ、及び、これらを備える検出キット、並びに、網膜色素変性症原因遺伝子変異の検査方法
CN110699450A (zh) miRNA生物标志物在肝脏疾病诊断和预后判断中的应用
CN110760578B (zh) 一种检测人cyp2c9和vkorc1基因多态性的试剂盒
CN108342404A (zh) Inpp5e基因突变体及其应用
CN114032297B (zh) 一种与ICP辅助诊断相关的血清/血浆外泌体miRNA标志物及其应用
Said et al. Association between AXIN1 gene polymorphisms (wnt signaling pathway gene) and nephropathy induced by diabetes and hypertension in the Egyptian population
CN113637774B (zh) 一种ddPCR检测包虫病的扩增引物及其构建方法、应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant