CN111560419A - 基因il-32在监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的应用及药物应用 - Google Patents

基因il-32在监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的应用及药物应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基因IL‑32在监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的应用，其特征在于，具体包括以下过程：(1)、实验动物及其分组；(2)、实验小鼠取样；(3)、天狼星红染色检测肝脏胶原变化；(4)、实时定量荧光PCR检测肝脏α‑SMA和Collagen‑α1(I)的表达；(5)、Western Blot检测肝脏α‑SMA的表达；本发明还公开基因IL‑32在制备监测日本血吸虫病肝纤维化发展进程药物方面的应用；本发明另外还公开基因IL‑32在制备治疗日本血吸虫病肝纤维化药物方面的应用。本发明通过小鼠模型实验，验证了IL‑32能够监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程的作用，并为IL‑32在监测血吸虫病肝纤维化发展过程的药物应用提供了理论基础。

Description

基因IL-32在监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的应用 及药物应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基因IL-32在监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的应用、基因IL-32在制备监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的药物中的应用、基因IL-32在制备治疗日本血吸虫病肝纤维化药物方面的应用。
背景技术
日本血吸虫病是严重危害我国人民身体健康的寄生虫病之一。血吸虫感染后，肝脏虫卵肉芽肿的形成和纤维化引起患者出现门脉高压综合征，并发上消化道大出血、肝昏迷，最终可导致死亡。肝纤维化是肝内纤维合成与降解失衡的复杂动态过程，是胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度累积的结果(Safadi and Friedman 2002,Batallerand Brenner 2005)。肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)活化为肌成纤维细胞(myofibroblast,MFB)是肝纤维化发生、发展的中心环节(Bataller and Brenner 2005)。HSCs是肝纤维化中ECM的主要来源细胞，当各种外来因素持续作用于肝脏时可激活HSCs(Gabele,Brenner et al.2003)。在急性肝损伤时，HSCs增殖后表型发生改变，转为移行细胞，合成基质蛋白以利组织修复。其后当刺激解除时，细胞表型回复，且可能通过凋亡机制使细胞数量也恢复正常。在慢性肝损伤时，HSCs通过复杂的机制而持续激活、增殖，并且发生显著的表型转化，变为肌成纤维细胞(myofibroblast,MFB)(Bataller and Brenner2005)。在血吸虫虫卵肉芽肿边缘存在大量HSCs(Bartley,Ramm et al.2006)，活化后在组织中表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，合成大量的ECM，如I型胶原(Collagen I)和III型胶原(Collagen III)等(Friedman 2008)。目前对于血吸虫感染诱导肝纤维化的机制还不十分明了，研究表明病原诱导的宿主免疫应答是刺激HSCs活化的关键环节，而细胞因子则是其中的信号传递者。在血吸虫病虫卵肉芽肿、肝纤维化过程中，宿主免疫应答类型逐渐呈现Th1向Th2极化，虫源蛋白通过各种细胞及细胞因子参与肉芽肿反应、纤维化形成的调节(deJesus,Magalhaes et al.2004,Wynn 2004,Caldas,Campi-Azevedo et al.2008,Anthony,Allen et al.2010)。
白介素-32(interleukin-32,IL-32)是一个促炎症细胞因子，已知IL-32有6种剪接异构体(splicing isoform)，IL-32γ是其中生物活性最强的亚型(Goda,Kanaji etal.2006,Choi,Bae et al.2009)。IL-32可在多种细胞和组织中表达，活化的T细胞和NK细胞是其主要来源，脾脏、肝脏等组织里都有IL-32的表达。在上皮细胞中，肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)、IL-1β和IL-18等能够刺激IL-32的表达(Dinarello and Kim2006)。研究表明重组IL-32(recombinant IL-32,rIL-32)能够在多种细胞(尤其是单核细胞、巨噬细胞和外周血单个核细胞)中激活IL-8、TNF-α、MIP-2(macrophage inflammatoryprotein-2)等炎性细胞因子的表达(Kim,Han et al.2005)。研究揭示，poly I:C可刺激NK细胞活化，活化的NK细胞能负调控日本血吸虫虫卵引起的肝纤维化，这种负调控是通过刺激产生抗纤维化因子IFN-γ和NK细胞对活化肝星状细胞的杀伤实现的(Hou,Yu etal.2012)。活化的NK细胞是IL-32主要来源细胞，且poly I:C、IFN-γ和IL-32的表达关系密切(Kim,Han et al.2005)。此外，重组IL-32可以刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7表达TNF-α(Kim,Han et al.2005)，而TNF-α也与血吸虫病肝肉芽肿和纤维化密切相关(Booth,Mwathaet al.2004)。研究表明，IL-32和IL-17能够相互作用(Moon,Yoon et al.2012)，而IL-17可以通过多种信号途径诱导肝纤维化(Meng,Wang et al.2012)。综上所述，IL-32与诸多调控纤维化的细胞及细胞因子密切相关。但IL-32在日本血吸虫病肝纤维化中的作用目前未见报道。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种基因IL-32在监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的应用、基因IL-32在制备监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的药物中的应用、基因IL-32在制备治疗日本血吸虫病肝纤维化药物方面的应用。
为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种基因IL-32在监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的应用。
进一步的，一种基因IL-32在监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的应用，其特征在于，具体包括以下过程：
(1)、实验动物及其分组
(1-1)选取36只6-8周龄的雌性ICR小鼠；将ICR小鼠随机分成A、B、C三组，每组12只；
(1-2)其中，A组为模拟感染组，即无血吸虫感染的对照组；B组为感染对照组，用日本血吸虫尾蚴经皮肤感染，每周腹腔注射200ul/只PBS缓冲液2次；C组为感染实验组，用日本血吸虫尾蚴经皮肤感染，每周注射含100ng人重组IL-32的200ul/只PBS缓冲液2次；分别于感染后6周、12周取样进行相关检测；
(2)、实验小鼠取样
(2-1)在设计的时间点，每组随机选取6只小鼠进行取样；
(2-2)待取样小鼠腹腔注射10％水合氯醛麻醉，然后将其固定在解剖台上；
(2-3)75％酒精消毒腹部后打开腹腔，充分暴露肝脏；
(2-4)在肝门静脉出插入输液针，灌注生理盐水，同时在下腔静脉处剪一小口作为流出通道。待肝脏颜色由鲜红变为土黄色，且下腔静脉流出液变得较澄清后，将肝脏游离取下置于无菌平皿中；
(2-5)肝脏分成3部分，一部分肝组织用10％甲醛固定后做石蜡切片，一部分肝组织用于提取RNA，一部分肝组织用于提取蛋白；
(3)、天狼星红染色检测肝脏胶原变化：使用天狼星红染色盒试剂盒进行染色
(3-1)10％甲醛固定肝组织，常规脱水后进行石蜡包埋，切片厚度6μm，常规脱蜡至水；
(3-2)weigert铁苏木素染色液染色10-20分钟；
(3-3)酸性分化液分化5-10秒；
(3-4)自来水洗5-10分钟，蒸馏水漂洗一次；
(3-5)天狼星红染色液滴染1小时，流水冲洗，去除切片表面染料；
(3-6)常规脱水透明，中性树胶封固；
(3-7)光学显微镜下观察拍照；
(4)、实时定量荧光PCR检测肝脏α-SMA和Collagen-α1(I)的表达
(4-1)取新鲜小鼠肝组织50-150mg，剪成小块，放入1.5ml Eppendorf管中，立即加入1ml TRIzol，在冰上用塑料棒对组织进行研磨；
(4-2)按照TRIzol的说明书进行操作，最终提取肝组织总RNA用200ul nuclease-free水溶解；
(4-3)用NanoDrop2000测定RNA的浓度；
(4-4)取5ug总RNA，使用M-MLV逆转录酶进行逆转录反应，逆转录引物使用Oligo(dT)18；
(4-5)逆转录产物即为各个样品的cDNA；
(4-6)以得到的cDNA为模板，使用Eco实时定量PCR仪进行RT-qPCR；
引物如下，GAPDH，F：5’-AAGGGCTCATGACCACAGTC-3’；
GAPDH，R：5’-ACACATTGGGGGTAGGAACA-3’；
α-SMA，F：5’-GTCCCAGACATCAGGGAGTAA-3’；
α-SMA，R：5’-TCGGATACTTCAGCGTCAGGA-3’；
Collagen-α1(I)，F：5’-CCTGGCAAAGACGGACTCAAC-3’；
Collagen-α1(I)，R：5’-GCTGAAGTCATAACCGCCACTG-3’；
(4-7)20μl反应体系如下：SYBR Premix Ex Taq 10μl，Forward primer0.4μl，Reverse primer 0.4μl，cDNA模板2μl，ddH2O 7.2μl；
RT-qPCR反应程序：95℃，5min；95℃5s、60℃30s、72℃30s，40个循环；95℃15s、60℃30s、95℃15s，溶解曲线分析；
数据使用ΔΔCt法进行目的基因与管家基因GAPDH的相对定量；
(5)、WesternBlot检测肝脏α-SMA的表达情况图；
(5-1)取新鲜肝组织50-150mg，剪成小块后放入1.5ml Eppendorf管中，加入M-PER蛋白抽提液(Thermo Scientific产品)500-900μl后，用小塑料棒于冰上研磨，冰上裂解10分钟；
(5-2)4℃12000rpm离心10分钟，将上清转移到新的1.5ml Eppendorf管中；
(5-3)加入150-200μl 5×SDS-PAGE上样缓冲液，涡旋震荡后，沸水浴10分钟，制备好的样品进行常规WesternBlot实验检测。
进一步的，所述步骤(1)中制备感染对照组模型，具体包括以下过程：将日本血吸虫阳性钉螺放入去氯水中，室温光照下让血吸虫尾蚴自钉螺释放出后，用接种环蘸取含尾蚴的水滴加到无菌盖玻片上；于显微镜下计数，每片含18-20条尾蚴；将6-8周龄的雌性ICR小鼠固定后腹部去毛，用去氯水润湿去毛部分皮肤；把含尾蚴的盖玻片贴到小鼠腹部皮肤上，经皮肤感染15分钟；感染后的小鼠置于SPF级动物房饲养。
本发明的实施例还提供基因IL-32在制备监测日本血吸虫病肝纤维化发展进程药物方面的应用。
本发明的实施例另外还提供基因IL-32在制备治疗日本血吸虫病肝纤维化药物方面的应用。
进一步的，所述治疗药物的靶标为基因IL-32。
进一步的，所述治疗药物抑制基因IL-32的表达。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
(1)本发明的实施例中通过建立模拟感染组、感染对照组、感染实验组的小鼠模型，并采用观察感染小鼠肝脏外观、天狼星红染色、RT-qPCR检测及WesternBlot检测，通过小鼠模型实验，揭示基因IL-32在促进日本血吸虫病肝纤维化方面的作用验证了IL-32能够监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程的作用，并为IL-32在监测血吸虫病肝纤维化发展过程的药物应用提供了理论基础。
(2)本发明的实施例中还通过转染IL-32启动子报告质粒的细胞中加入SEA和LX-2细胞中加入SEA，验证了IL-32可以作为血吸虫感染的检测指标，并验证了IL-32的表达与血吸虫感染进程密切相关。
(3)本发明的实施例中还通过IL-32刺激形状细胞株纤维化因子的表达，验证，抑制IL-32可以下调肝纤维化因子的表达，提示其可以作为抑制纤维化进展的潜在药物作用靶标。
附图说明
图1为本发明的实施例1中外源重组IL-32促进日本血吸虫感染小鼠肝脏纤维化形成的结果图；其中，图1A为血吸虫感染小鼠后肝脏外观变化图；图1B为天狼星红染色检测肝脏胶原变化图；图1C为RT-qPCR检测肝脏α-SMA和Collagen-α1(I)的表达情况图；图1D为WesternBlot检测肝脏α-SMA的表达情况图；
图2为本发明的实施例2和实施例3中SEA上调IL-32的表达图；其中，图2A为在转染IL-32启动子报告质粒的细胞中加入SEA，启动子活性图；图2B为在LX-2细胞中加入SEA，IL-32的表达图；图2C为在PBMC中加入SEA，IL-32的表达图。
图3为本发明的实施例4和实施例5中IL-32刺激肝形状细胞株纤维化因子的表达图；其中，图3A为转染Si-IL-32的LX-2细胞中，IL-32和Collagen-α1(I)的表达情况图；图3B为MDI处理的LX-2中加入重组IL-32，Collagen-α1(I)和α-SMA的表达情况图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
实验准备：
抗α-SMA、Collagen-α1(I)、IL-32、GAPDH抗体均购自Abcam公司；
HRP-标记羊抗兔、HRP-标记羊抗鼠二抗购自Santa Cruz公司。
实施例1外源重组IL-32促进日本血吸虫感染小鼠肝脏纤维化形成
(1)实验动物及其分组：将ICR小鼠随机分成A、B、C三组，每组12只。A组为模拟感染组，即无血吸虫感染的对照组，共12只。B组为感染对照组，用日本血吸虫尾蚴经皮肤感染，每周腹腔注射200ul/只PBS缓冲液2次。C组为感染实验组，用日本血吸虫尾蚴经皮肤感染，每周注射含100ng人重组IL-32的200ul/只PBS缓冲液2次。分别于感染后6周、12周取样进行相关检测。其中，血吸虫感染小鼠模型的建立，按照以下步骤进行：将日本血吸虫阳性钉螺放入去氯水中，室温光照下让血吸虫尾蚴自钉螺释放出后，用接种环蘸取含尾蚴的水滴加到无菌盖玻片上。于显微镜下计数，每片含18-20条尾蚴。将6-8周龄的雌性ICR小鼠固定后腹部去毛，用去氯水润湿去毛部分皮肤。把含尾蚴的盖玻片贴到小鼠腹部皮肤上，经皮肤感染15分钟。感染后的小鼠置于SPF级动物房饲养。
(2)实验小鼠取样：在设计的时间点，每组随机选取6只小鼠进行取样。待取样小鼠腹腔注射10％水合氯醛麻醉，然后将其固定在解剖台上。75％酒精消毒腹部后打开腹腔，充分暴露肝脏。在肝门静脉出插入输液针，灌注生理盐水，同时在下腔静脉处剪一小口作为流出通道。待肝脏颜色由鲜红变为土黄色，且下腔静脉流出液变得较澄清后，将肝脏游离取下置于无菌平皿中。肝脏分成3部分，一部分肝组织用10％甲醛固定后做石蜡切片，一部分肝组织用于提取RNA，一部分肝组织用于提取蛋白。
日本血吸虫感染小鼠试验结果显示，解剖小鼠直接观察肝脏时可以看到注射IL-32的感染实验组小鼠肝脏中肉芽肿数明显比仅注射PBS的感染对照组多，如图1A所示。
(3)天狼星红染色：使用天狼星红染色盒试剂盒(北京索莱宝产品)进行。步骤如下：10％甲醛固定肝组织，常规脱水后进行石蜡包埋，切片厚度6μm，常规脱蜡至水。weigert铁苏木素染色液染色10-20分钟。酸性分化液分化数秒。自来水洗5-10分钟，蒸馏水漂洗一次。天狼星红染色液滴染1小时，流水稍微冲洗，去除切片表面染料。常规脱水透明，中性树胶封固。光学显微镜(德国Leica)下观察拍照。
天狼星红染色结果统计分析进一步表明，在感染后6周和12周，注射IL-32的感染实验组小鼠肝脏纤维化面积占比都显著高于仅注射PBS的感染对照组(P<0.01)，其中，第6周感染实验组与感染对照组的纤维化面积占比分别为13.52±2.90％和7.01±1.88％，第12周感染实验组与感染对照组的纤维化面积占比分别为22.53±4.64％和10.55±1.99％，如图1B所示。
(4)实时定量荧光PCR(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-qPCR)检测：取新鲜小鼠肝组织50-150mg，剪成小块，放入1.5ml Eppendorf管中，立即加入1ml TRIzol(Invitrogen产品)，在冰上用塑料棒对组织进行研磨。接下来，按照TRIzol的说明书进行操作，最终提取肝组织总RNA用200ul nuclease-free水溶解。用NanoDrop2000(Thermo Scientific产品)测定RNA的浓度。取5ug总RNA，使用M-MLV逆转录酶(Promega产品)进行逆转录反应，逆转录引物使用Oligo(dT)18，具体操作见逆转录酶说明书。逆转录产物即为各个样品的cDNA。以得到的cDNA为模板，使用Eco实时定量PCR仪(Illumina产品)进行RT-qPCR。
引物如下：
GAPDH，F：5’-AAGGGCTCATGACCACAGTC-3’；
GAPDH，R：5’-ACACATTGGGGGTAGGAACA-3’；
α-SMA，F：5’-GTCCCAGACATCAGGGAGTAA-3’；
α-SMA，R：5’-TCGGATACTTCAGCGTCAGGA-3’；
Collagen-α1(I)，F：5’-CCTGGCAAAGACGGACTCAAC-3’；
Collagen-α1(I)，R：5’-GCTGAAGTCATAACCGCCACTG-3’。
20μl反应体系如下：SYBR Premix Ex Taq(宝生物产品)10μl，Forward primer(10μM)0.4μl，Reverse primer(10μM)0.4μl，cDNA模板2μl，ddH2O7.2μl。RT-qPCR反应程序：95℃，5min；95℃5s、60℃30s、72℃30s，40个循环；95℃15s、60℃30Ss、95℃15s，溶解曲线分析。数据使用ΔΔCt法进行目的基因与管家基因GAPDH的相对定量。
RT-qPCR结果显示，与仅注射PBS的感染对照组相比，在感染后的第6周和第12周，注射IL-32的感染实验组小鼠肝脏纤维化分子α-SMA和Collagen-α1(I)的mRNA水平显著升高，如图1C所示。
(5)WesternBlot检测：取新鲜肝组织50-150mg，剪成小块后放入1.5ml Eppendorf管中，加入M-PER蛋白抽提液(含新鲜加入的蛋白酶和磷酸酶抑制剂，均为ThermoScientific产品)500-900μl后，用小塑料棒于冰上研磨，冰上裂解10分钟。4℃12000rpm离心10分钟，将上清转移到新的1.5ml Eppendorf管中。加入150-200μl 5×SDS-PAGE上样缓冲液，涡旋震荡后，沸水浴10分钟，制备好的样品进行常规WesternBlot实验检测。
WesternBlot结果与RT-qPCR结果一致，在日本血吸虫感染小鼠肝脏中，注射IL-32能显著提高肝纤维化分子α-SMA的蛋白表达水平，如图1D所示。通过以上的动物实验结果揭示，在日本血吸虫感染小鼠后，注射IL-32能显著促进肝纤维化，表明在血吸虫感染进程中，IL-32是一个促肝纤维化的分子，提示IL-32可以作为日本血吸虫病肝纤维化的潜在药物作用靶标。
实施例2
(1)细胞培养：人肝星状细胞株LX-2购自中南大学湘雅中心实验室细胞库，人胚肾细胞株HEK293购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。LX-2和HEK293使用含10％胎牛血清(Hyclone公司)，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM完全培养基(Gibco公司)，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中进行培养。
(2)瞬时转染和双荧光素酶报告实验：将生长状态良好的LX-2和HEK293细胞分别以5×104细胞/孔的密度传代到24孔培养板。待细胞长至汇合度为70-80％时，利用FuGENEHD转染试剂(Promega产品)进行质粒瞬时转染，具体操作按照说明书进行。每孔转染500ngIL-32启动子(-756/+25)报告质粒pIL32-Luc和50ng内参质粒pRL-TK(Promega产品)，每个处理做3个重复孔。转染后4小时，更换新鲜培养基，加入10μg/ml日本血吸虫可溶性虫卵抗原(soluble egg antigen,SEA)进行刺激，以加入PBS的孔作为阴性对照组。转染后36小时收取细胞，利用双荧光素酶检测试剂盒(Promega产品)在GloMax 20/20生物发光检测仪(Promega产品)上检测荧光素酶的活性，荧光素酶的活性反映了IL-32启动子的活性。实验结果如图2A所示，在LX2和HEK293细胞中，日本血吸虫SEA能显著刺激IL-32启动子活性上调。该结果表明，日本血吸虫感染可以在转录水平激活IL-32的表达，IL-32的表达与血吸虫感染密切相关，提示IL-32可以作为血吸虫感染的检测指标之一。
实施例3
(1)人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的分离：PBMC分离自健康志愿者的外周血。采用淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司产品)分离新鲜采集的外周血中的PBMC，简述步骤如下。用抗凝管收集血液，摇匀，加入等体积的PBS缓冲液稀释血液。淋巴细胞分离液5ml，放入15ml的离心管。用吸管吸取稀释血液，小心在离分层液面上1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液量叠于分层液上，保持两者界面清晰。稀释血液与分离液体积比例约为2:1。18-20℃，水平离心机2000rpm离心20min，离心后其中的内容物分为四层，上层为血浆(内含血小板)，中间层为分层液，底层为红细胞和粒细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的PBMC层(薄)。用移液器的枪头轻轻插入白膜层，沿试管壁周缘吸取界面层的PBMC，移入另一离心管中。加入5ml不含Ca2+，Mg2+的PBS缓冲液(Gibco产品)洗涤2次，混匀，依次以1500rpm、1000rpm离心10min，吸弃上清。末次离心后，弃上清，用2ml RPMI 1640培养基(Gibco产品)重悬细胞。取20ul细胞悬液加20ul 0.4％台盼兰染液，3-5分钟后取样用血球计数板进行计数。
(2)Western blot检测：将生长状态良好的LX-2和新分离的PBMC分别传代至6孔培养板中，每孔约1×106个细胞，然后加入10μg/ml日本血吸虫SEA进行刺激。在设计的时间点收取细胞，制备成SDS-PAGE样品，常规Western Blot检测。实验结果如图2B和图2C所示，在LX-2细胞和PBMC中，日本血吸虫SEA能上调IL-32的表达，随刺激时间的延长IL-32的表达水平增加。该结果表明，血吸虫感染能够刺激IL-32的表达，IL-32的表达与血吸虫感染进程密切相关，提示IL-32可以作为血吸虫感染的检测指标之一。。
实施例4
将生长状态良好的人肝星状细胞株LX-2传代至6孔培养板中，每孔约5×105个细胞，待细胞长至汇合度为70-80％时，使用FuGENE HD转染试剂(Promega产品)进行质粒瞬时转染，具体操作按照说明书进行。每孔转染IL-32干扰RNA(Si-IL-32)质粒2μg或者对照质粒(Si-con)2μg。转染后36小时收取细胞，制备成SDS-PAGE样品，常规Western Blot检测。实验结果如图3A所示，在LX-2细胞中瞬时转染IL-32干扰RNA质粒，抑制IL-32的表达能够显著下调肝纤维化分子Collagen-α1(I)的蛋白表达水平。该结果表明IL-32与肝纤维化密切相关，抑制IL-32可以下调肝纤维化因子的表达，提示其可以作为抑制纤维化进展的潜在药物作用靶标。
实施例5
将生长状态良好的人肝星状细胞株LX-2传代至6孔培养板中，用成脂分化混合物MDI(Methylisobutylxanthine,Dexamethasone,Insulin,MDI)培养基处理人肝星状细胞株LX-2，使其处于静息状态。接着，在细胞培养基加入100ng/ml的外源重组IL-32γ(R&D产品)进行刺激，用加入等体积PBS的孔作为阴性对照。刺激36小时后收集细胞，制备成SDS-PAGE样品，常规WesternBlot检测。实验结果如图3B所示，在静息状态的LX-2细胞中加入外源IL-32γ刺激能显著上调肝纤维化因子Collagen-α1(I)、α-SMA的表达。该结果表明，在肝纤维化的关键细胞肝星状细胞株中，IL-32与肝纤维化因子的表达密切相关，提示其可以作为抑制纤维化进展的潜在药物作用靶标。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南通大学
<120> 基因IL-32在监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的应用及药物应用
<141> 2020-05-25
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物GAPDH的正链序列(GAPDH-F)
<400> 1
aagggctcat gaccacagtc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物GAPDH的反链序列(GAPDH-R)
<400> 2
acacattggg ggtaggaaca 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> α-SMA的正链序列(α-SMA-F)
<400> 3
gtcccagaca tcagggagta a 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> α-SMA的反链序列(α-SMA-R)
<400> 4
tcggatactt cagcgtcagg a 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Collagen-α1(I)的正链序列(Collagen-α1(I)-F)
<400> 5
cctggcaaag acggactcaa c 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Collagen-α1(I)的反链序列(Collagen-α1(I)-R)
<400> 6
gctgaagtca taaccgccac tg 22

Claims (7)

1.一种基因IL-32在监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的应用。
2.根据权利要求1所述的一种基因IL-32在监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的应用，其特征在于，具体包括以下过程：
(1)、实验动物及其分组
(1-1)选取36只6-8周龄的雌性ICR小鼠；将ICR小鼠随机分成A、B、C三组，每组12只；
(1-2)其中，A组为模拟感染组，即无血吸虫感染的对照组；B组为感染对照组，用日本血吸虫尾蚴经皮肤感染，每周腹腔注射200ul/只PBS缓冲液2次；C组为感染实验组，用日本血吸虫尾蚴经皮肤感染，每周注射含100ng人重组IL-32的200ul/只PBS缓冲液2次；分别于感染后6周、12周取样进行相关检测；
(2)、实验小鼠取样
(2-1)在设计的时间点，每组随机选取6只小鼠进行取样；
(2-2)待取样小鼠腹腔注射10％水合氯醛麻醉，然后将其固定在解剖台上；
(2-3)75％酒精消毒腹部后打开腹腔，充分暴露肝脏；
(2-4)在肝门静脉出插入输液针，灌注生理盐水，同时在下腔静脉处剪一小口作为流出通道。待肝脏颜色由鲜红变为土黄色，且下腔静脉流出液变得较澄清后，将肝脏游离取下置于无菌平皿中；
(2-5)肝脏分成3部分，一部分肝组织用10％甲醛固定后做石蜡切片，一部分肝组织用于提取RNA，一部分肝组织用于提取蛋白；
(3)、天狼星红染色检测肝脏胶原：使用天狼星红染色盒试剂盒进行染色(3-1)10％甲醛固定肝组织，常规脱水后进行石蜡包埋，切片厚度6μm，常规脱蜡至水；
(3-2)weigert铁苏木素染色液染色10-20分钟；
(3-3)酸性分化液分化5-10秒；
(3-4)自来水洗5-10分钟，蒸馏水漂洗一次；
(3-5)天狼星红染色液滴染1小时，流水冲洗，去除切片表面染料；
(3-6)常规脱水透明，中性树胶封固；
(3-7)光学显微镜下观察拍照；
(4)、实时定量荧光PCR检测肝脏α-SMA和Collagen-α1(I)的表达
(4-1)取新鲜小鼠肝组织50-150mg，剪成小块，放入1.5ml Eppendorf管中，立即加入1ml TRIzol，在冰上用塑料棒对组织进行研磨；
(4-2)按照TRIzol的说明书进行操作，最终提取肝组织总RNA用200ul nuclease-free水溶解；
(4-3)用NanoDrop2000测定RNA的浓度；
(4-4)取5ug总RNA，使用M-MLV逆转录酶进行逆转录反应，逆转录引物使用Oligo(dT)18；
(4-5)逆转录产物即为各个样品的cDNA；
(4-6)以得到的cDNA为模板，使用Eco实时定量PCR仪进行RT-qPCR；
引物如下，GAPDH，F：5’-AAGGGCTCATGACCACAGTC-3’；
GAPDH，R：5’-ACACATTGGGGGTAGGAACA-3’；
α-SMA，F：5’-GTCCCAGACATCAGGGAGTAA-3’；
α-SMA，R：5’-TCGGATACTTCAGCGTCAGGA-3’；
Collagen-α1(I)，F：5’-CCTGGCAAAGACGGACTCAAC-3’；
Collagen-α1(I)，R：5’-GCTGAAGTCATAACCGCCACTG-3’；
(4-7)20μl反应体系如下：SYBR Premix Ex Taq 10μl，Forward primer 0.4μl，Reverse primer 0.4μl，cDNA模板2μl，ddH2O 7.2μl；
RT-qPCR反应程序：95℃，5min；95℃ 5s、60℃ 30s、72℃ 30s，40个循环；95℃ 15s、60℃ 30s、95℃ 15s，溶解曲线分析；
数据使用ΔΔCt法进行目的基因与管家基因GAPDH的相对定量；
(5)、WesternBlot检测肝脏α-SMA的表达
(5-1)取新鲜肝组织50-150mg，剪成小块后放入1.5ml Eppendorf管中，加入M-PER蛋白抽提液500-900μl后，用小塑料棒于冰上研磨，冰上裂解10分钟；
(5-2)4℃ 12000rpm离心10分钟，将上清转移到新的1.5ml Eppendorf管中；
(5-3)加入150-200μl 5×SDS-PAGE上样缓冲液，涡旋震荡后，沸水浴10分钟，制备好的样品进行常规WesternBlot实验检测。
3.根据权利要求2所述的一种基因IL-32在监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的应用，其特征在于，所述步骤(1)中制备感染对照组模型，具体包括以下过程：将日本血吸虫阳性钉螺放入去氯水中，室温光照下让血吸虫尾蚴自钉螺释放出后，用接种环蘸取含尾蚴的水滴加到无菌盖玻片上；于显微镜下计数，每片含18-20条尾蚴；将6-8周龄的雌性ICR小鼠固定后腹部去毛，用去氯水润湿去毛部分皮肤；把含尾蚴的盖玻片贴到小鼠腹部皮肤上，经皮肤感染15分钟；感染后的小鼠置于SPF级动物房饲养。
4.基因IL-32在制备监测日本血吸虫病肝纤维化发展进程药物方面的应用。
5.基因IL-32在制备治疗日本血吸虫病肝纤维化药物方面的应用。
6.根据权利要求5所述的基因IL-32在制备治疗日本血吸虫病肝纤维化药物方面的应用，其特征在于，所述治疗药物的靶标为基因IL-32。
7.根据权利要求5所述的基因IL-32在制备治疗日本血吸虫病肝纤维化药物方面的应用，其特征在于，所述治疗药物抑制基因IL-32的表达。
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