CN109266735A - Crth2作为肺动脉高压免疫治疗药物靶标及其应用 - Google Patents

Crth2作为肺动脉高压免疫治疗药物靶标及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种CRTH2作为肺动脉高压免疫治疗药物靶标及其应用。本发明从临床出发，经在动物水平反复研究，发现在肺动脉高压的发生发展过程中，前列腺素D2受体CRTH2通过介导Th2型炎症反应来促进以平滑肌增殖为主因的肺动脉血管重塑，从而引发或加重肺动脉高压的病症；当CRTH2被敲除或被抑制后可以改善肺动脉高压的病症。同时，CRTH2可作为临床上治疗肺动脉高压的一个新的药物靶标，CRTH2的抑制剂及Th2型细胞因子的中和抗体可参考作为治疗肺动脉高压的潜在药物。

Description

CRTH2作为肺动脉高压免疫治疗药物靶标及其应用
技术领域
本发明创造属于生物技术领域，具体涉及CRTH2作为肺动脉高压免疫治疗药物靶标及其应用。
背景技术
血液通过体循环和肺循环维持着一个生命的各项生理活动，在血液流动过程中血管需要维持一种相对稳定的生理状态，当血管稳态被打破就会产生各种心血管疾病。肺动脉高压(Pulmonary arterial hypertension，PAH)就是一种肺部动脉血管稳态失衡引发的一种严重致死性的心血管疾病，临床上尚没有治愈的手段。在过去的十多年里对PAH发生机制的研究不断深入，但PAH的确切发病机理仍然不为人所知。临床上把通过右心导管术测得的平均肺动脉压力≥25mmHg，同时毛细血管嵌顿压＜15mmHg的症状定义为肺动脉高压(PAH)。血管活性物质失衡、免疫炎症、原位血栓形成及遗传因素等多方面的因素综合作用使肺动脉血管重塑，血管阻力增大，肺动脉压力升高，最终导致右心衰竭。肺动脉高压的关键病理变化是肺部中、微小动脉重塑，即其内皮细胞增殖致内膜增生，血管平滑肌增殖、肥大及迁移致中膜肥厚，外膜纤维化并有胶原大量沉积，最终使管腔狭窄形成特征性的丛样病变。在肺动脉重塑的同时，炎症细胞大量浸润并释放白介素、趋化因子、生长因子等。抗炎治疗肺动脉高压有一定的效果，说明这些免疫炎性细胞与炎性因子确实参与肺动脉高压的发病。
在这些免疫细胞中，多种证据支持T细胞在肺动脉高压的发展中起作用。例如,Treg能够限制血管内皮损伤，抵抗PAH形成。一些研究结果表明,在肺动脉高压患者的外周血中CD8+Tc细胞减少，Treg细胞增加。而另外一些研究则表明在肺动脉高压病人和健康志愿者之间，Treg细胞并无差异。在肺动脉高压的动物模型中,无胸腺的大鼠(无成熟的T细胞)的PAH的发生和发展比正常大鼠更加迅速,这表明在肺动脉高压中T细胞给予保护作用。相反,在其他动物模型中，用中和抗体耗去Th细胞又可以改善PAH的严重程度。因此,T细胞的某些亚型可能在PAH的发展中起到有益作用,而另一些亚型则可以促进肺部血管重塑。人们检测到无论是血清还是肺支气管灌洗液中Th2型细胞因子IL-4、IL-5、IL-13等的水平升高，并且与肺动脉压力及血管重塑呈正相关，而当中和掉IL-4或IL-13的时候，肺动脉高压症状缓解。另有报道指出，当敲除IL-13的受体IL-13Rα1后，肺动脉高压的相关指数是降低的。
炎症的发生包括炎症细胞的趋化性迁移和细胞因子的释放等需要一些炎症介质来介导，而前列腺素就是一类脂质炎性介质。前列腺素在维持心血管稳态中具有重要作用，这可以通过阿司匹林(Aspirin)及非甾体类抗炎药(NSAIDs)(非选择性COX抑制剂)在临床上的治疗效应显现出来。前列腺素(Prostaglandins,PGs)是二十碳不饱和脂肪酸花生四烯酸(AA)经酶促代谢产生的一类脂质介质。花生四烯酸在各种生理和病理刺激下经磷脂酶A2(Phopholipase A2,PLA2)催化经细胞膜膜磷脂释放，在环氧化酶(Cyclooxygenase,COX)的环氧化活性(COX)和过氧化活性(POX)的作用下，依次转变为前列腺素中间代谢产物PGG2和PGH2，然后经下游前列腺素合成酶的作用生成PGI2，PGE2，PGF2，PGD2，Thromboxane A2(TxA2)，它们通过各自受体发挥作用如PGI2受体(IP)、PGE2受体(EP1-EP4)、PGF2受体(FPA和FPB)、PGD2受体(DP1和DP2，也称DP和CRTH2)、TxA2受体(TPα和TPβ)。其中PGD2合成酶(Prostaglandin D2synthase,PGDS)分两种，即脂质运载蛋白型PGDS(lipocalin-typePGDS,L-PGDS)和造血型PGDS(hematopoietic-type PGDS,H-PGDS)。L-PGDS表达于脑部、心内膜、睾丸、眼睛和上皮细胞，常分泌在体液中譬如脑脊液、血浆、眼分泌物等。H-PGDS主要在血液细胞如T细胞、巨噬细胞、肥大细胞等细胞中高表达，同时在心血管系统中比如心肌细胞、心房心内膜细胞、血管平滑肌细胞及内皮细胞表达。PGD2通过其特异受体DP(也称DP1)和CRTH2(也称DP2)在不同炎症条件下发挥不同作用如抗炎作用、促炎作用。DP1在某些炎症细胞如:嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞、树突状细胞,和血管平滑肌细胞、人类血小板、中枢神经系统都有表达。而CRTH2即Th2上的化学同源受体(chemoattractant-receptorhomologous molecule expressed on Th2 cells,CRTH2)主要表达在炎症细胞表面如Th2细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等炎症细胞。但它与DP1不具有同源性，属于孤儿受体。与DP1偶联刺激性G蛋白Gs不同，CRTH2则与Gi型G蛋白偶联,抑制cAMP的产生，而诱导cGMP产生，导致细胞内Ca2+上调，蛋白激酶激活，并激活细胞内转录因子，调节IL-4、IL-5、IL-13等Th2细胞因子的表达，并可介导Th2细胞、嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞等炎症细胞的活化和募集。
这些炎症反应伴随于多种心肺血管疾病过程中，至今还未有炎症细胞通过表面蛋白CRTH2(PGD2的受体)参与肺动脉高压发生发展过程及相关机制的研究报道。
发明内容
本发明创造的目的在于提供CRTH2作为肺动脉高压免疫治疗药物靶标的应用。
本发明的CRTH2基因或其表达产物(CRTH2基因的编码蛋白)在下述任一方面的应用：
i)开发、筛选PAH功能产品方面；
ii)制备治疗或预防PAH的功能产品方面。
其中，所述功能产品包括药品(或药物、药剂等)、抑制剂(或抑制物等)等能够对PAH的发生、发展产生治疗、缓解、抑制、调节等有益作用的产品或潜在物质；所述功能产品可以为单一制剂，也可以为包含有效量制剂成分的组合物，所述组合物中可以包括药剂学上能接受的载体。
其中，所述功能产品包括下调CRTH2基因的表达、转录或其表达产物的功能；本领域技术人员可知的能够下调CRTH2基因的表达、转录或其表达产物的手段包括但不限于以下一种或多种，均可以用于本发明：(i)DNA水平上：降低CRTH2基因拷贝数、转染CRTH2基因低表达载体；(ii)转录水平上：阻碍或抑制CRTH2基因的表达、阻碍或失活调控CRTH2基因表达的启动子、激活负调控CRTH2基因表达的转录因子、采用RNA干扰技术对CRTH2基因表达进行干扰；(iii)转录后水平上：激活促进CRTH2基因mRNA降解的microRNA转录表达、导入抑制CRTH2基因表达的microRNA；(iv)翻译后水平上：导入抑制CRTH2基因编码蛋白的分子、促进负调控CRTH2基因表达的蛋白、抑制CRTH2基因表达的银子及蛋白的表达。
其中，所述功能产品含有以CRTH2为靶标，并对CRTH2基因的表达、转录或其表达产物起到抑制作用的有效成分。
该有效成分可以为核酸抑制物、蛋白抑制剂、抗体、配体、蛋白水解酶、蛋白结合分子中的一种或多种。
其中，所述蛋白抑制剂为CAY10595。
其中，所述抗体为Th2型细胞因子IL-4、IL-13的中和抗体。
其中，所述功能产品用于起到以下一种或多种作用：
i)降低Th2型细胞因子IL-4、IL-13的表达；
ii)提高Th2型细胞因子IL-4、IL-13中和抗体的浓度；
iii)降低磷酸化STAT6的表达；
iv)抑制对平滑肌细胞的增殖；
v)降低肺组织CD4+T细胞的浸润和活化。
其中，CRTH2的DNA序列为SEQ ID NO：1。
其中，所述功能产品选自或含有以下任一种：
i)以SEQ ID NO：1或其转录本为靶序列，且能够抑制CRTH2基因表达产物的表达或基因转录的小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸；
ii)能表达或形成i)中所述小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸的构建物；
iii)含有SEQ ID NO：1或其互补序列，且能够在转入体内后形成抑制CRTH2基因表达产物的表达或基因转录的干扰分子的构建物；
iv)抑制或敲除SEQ ID NO：1基因序列后的免疫相关细胞、其分化细胞或构建物；
v)以根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的SEQ ID NO：1的同源序列或其转录本为靶序列，且能够抑制CRTH2基因表达产物的表达或基因转录的小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸；
vi)能表达或形成v)中所述小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸的构建物；
vii)含有根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的SEQ ID NO：1的同源序列或其互补序列，且能够在转入体内后形成抑制CRTH2基因表达产物的表达或基因转录的干扰分子的构建物；
viii)抑制或敲除根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的SEQ ID NO：1的同源基因序列后的免疫相关细胞、其分化细胞或构建物。
其中，所述构建物可以为细胞(如转染细胞)或表达载体。所述同源序列的同源性优选地大于70％。
其中，所述CRTH2基因或其表达产物应理解为包括：
i)CRTH2基因或其表达产物的原始序列或片段；
ii)CRTH2基因或其表达产物的保守性变体、生物活性片段或衍生物；
iii)根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的CRTH2基因或其表达产物的原始序列或片段；
iv)根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的CRTH2基因或其表达产物的保守性变体、生物活性片段或衍生物。
另外，本发明还提供CRTH2作为药物靶标用于筛选、预防、缓解和/治疗PAH的药物的应用。
另外，本发明还提供CRTH2的抑制剂CAY10595用于制备预防、缓解和/治疗PAH的药物的应用。
另外，本发明还提供CRTH2介导的IL-4、IL-13的中和抗体用于制备预防、缓解和/治疗PAH的药物的应用。
另外，本发明上述实施例中涉及的CAY10595、IL-4中和抗体、IL-13中和抗体较优选自：
CAY10595：CRTH2抑制剂，货号：10012553，Cayman Chemical(Ann Harbor,MI,USA)。
Anti-IL-4：IL-4中和抗体，货号：AB-404-NA，R&D systems(Minneapolis,MN,USA)。
Anti-IL-13：IL-13中和抗体，货号：AB-413-NA，R&D systems(Minneapolis,MN,USA)。
本发明主要采用激光共聚焦显微技术、Real-time PCR技术、流式细胞术、免疫印迹技术等先进的分子生物学技术手段，从临床(肺动脉高压病人组和健康对照组)和基础(小鼠肺动脉高压模型组及正常对照组)两方面着手对CRTH2在肺动脉高压中的作用进行了研究。在临床研究中，本发明主要采取了病人的血液样本对炎症细胞和相关细胞基因进行了检测分析。在基础研究中，以野生型和CRTH2受体敲除小鼠为对象，利用肺动脉高压模型结合骨髓移植及适应性细胞转移的转化医学手段研究CRTH2在肺动脉高压中的作用及相关分子机制。首先，通过流式细胞术和细胞因子检测发现在肺动脉高压病人和小鼠模型中，Th2反应增强；再次，通过RT-PCR和流式细胞术检测发现在肺动脉高压病人外周血和肺动脉高压模型小鼠肺部的CD4+T细胞中，CRTH2的表达上调。鉴于此，本发明利用WT小鼠和CRTH2敲除小鼠诱导肺动脉高压模型，在低氧结合SU5416(血管内皮生长因子受体的抑制剂)和低氧结合OVA两种方法诱导的肺动脉高压模型中，都发现CRTH2的缺失可以减轻肺动脉高压的症状，进一步研究发现CRTH2的缺失主要减轻了Th2相关细胞的招募和活化。通过骨髓移植(WT-CRTH2 KO、CRTH2 KO-CRTH2 KO)和适应性T细胞转移(WT-CRTH2 KO、CRTH2 KO-CRTH2KO)的方法，本发明进一步确认CRTH2主要通过介导Th2活化分泌IL-4和IL-13激活STAT6信号参与肺动脉血管重塑(主要影响肺动脉平滑肌的增殖)和肺动脉高压的发生。本发明在体外通过Th2细胞与肺动脉平滑肌共培养的方式，发现CRTH2介导的Th2活化通过激活STAT6信号可以促进肺动脉平滑肌的增殖。本发明通过对已建立肺动脉高压模型的治疗发现CRTH2的抑制剂可以有效缓解肺动脉高压的症状。通过以上研究，本发明可以确认CRTH2可以作为防治肺动脉高压的有效药物靶标。
附图说明
图1反应肺动脉高压病人外周循环的Th2型炎症反应增强。
其中，图1A、图1B均为流式检测肺动脉高压病人(PAH组)和健康志愿者(健康组)静脉血液中的CD3+CD4+T细胞的比例。图1C是肺动脉高压病人和健康志愿者外周血CD4+T细胞的Th2细胞因子的转录表达水平。图1D是ELISA检测肺动脉高压病人和健康志愿者外周血中Th2细胞因子的蛋白水平。*P<0.05,**P<0.01vs健康组。
图2反应肺动脉高压模型小鼠肺组织的Th2型炎症反应增强。
其中，图2A、图2B均体现流式检测肺动脉高压小鼠(实验组)和正常小鼠(对照组)肺组织中的CD3+CD4+T细胞的比例。图2C体现动脉高压小鼠(实验组)和正常小鼠(对照组)肺组织CD4+T细胞的Th2细胞因子的转录表达水平。图2D体现ELISA检测动脉高压小鼠(实验组)和正常小鼠(对照组)肺泡灌洗液中Th2细胞因子的蛋白水平。*P<0.05,**P<0.01vs对照组。
图3反应肺动脉高压条件下CRTH2在CD4+T细胞中表达上调，PGs合成增加。
其中，图3A为PAH病人和健康者血液CD4+T细胞的前列腺素受体(IP、DP1、CRTH2、EP1-EP4、FP和TP)的mRNA表达水平。图3B、图3C为流式细胞术确认PAH病人和健康者血液CD4+T细胞的CRTH2表达水平。*P<0.05,**P<0.01vs健康志愿者组。图3D为PAH小鼠和对照组小鼠肺组织中CD4+T细胞的PGD2合酶(H-PGDS和L-PGDS)和受体(DP1、CRTH2)的mRNA表达水平。图3E为质谱检测小鼠分别在诱导肺动脉高压和正常条件下，其肺组织中5种前列腺素(PGI2、PGE2、PGF2α、PGD2和TxA2)的表达水平。*P<0.05,**P<0.01vs对照组。
图4反应CRTH2缺失可降低PAH小鼠(HySU)的肺动脉压力和血管重塑。
其中，图4A为低氧结合皮下注射SU5416的方法(HySU)诱导小鼠肺动脉高压模型方案。图4B、图4C为小鼠模型建立后测定的右心室收缩压力(RVSP，mmHg)和右心肥厚程度(RV/LV+S)。图4D为伊红美蓝染色(H&E)检测肺血管的重塑情况。图4E为Image-Pro Plus软件统计分析肺血管的重塑程度。图4F、图4G为通过SMA(血管平滑肌的标志)和PCNA(细胞增殖的标记)及DAPI(细胞核的标记)共同染色检测肺血管中膜的增厚情况及统计结果。*P<0.05,**P<0.01vs对照组。
图5体现CRTH2缺失抑制肺血管周围的Th2炎症反应(HySU诱导模型)。
其中，图5A、图5B为通过SMA(血管平滑肌的标志)和CD4(Th2细胞增殖的标记)及DAPI(细胞核的标记)共同染色检测野生型(WT)小鼠和CRTH2缺失(CRTH2-/-)小鼠建立肺高压模型前后肺血管Th2细胞的浸润情况(A)及统计结果(B)。图5C、图5D、图5E为流式细胞术检测野生型(WT)小鼠和CRTH2缺失(CRTH2-/-)小鼠建立肺高压模型前后肺组织Th2细胞的比例和数量。图5F、图5G为ELISA检测血清和肺泡灌洗液的Th2细胞因子水平。*P<0.05,**P<0.01vs对照组。
图6体现CRTH2缺失可降低PAH小鼠(HyOA)的肺动脉压力和血管重塑。
其中，图6A为低氧结合皮下OVA处理(先腹腔注射后吸入)的方法(HyOA)诱导小鼠肺动脉高压模型方案。图6B、图6C为小鼠模型建立后测定的右心室收缩压力(RVSP，mmHg)和右心肥厚程度(RV/LV+S)。图6D为伊红美蓝染色(H&E)检测肺血管的重塑情况。图6E为Image-Pro Plus软件统计分析肺血管的重塑程度。图6F、图6G为通过SMA(血管平滑肌的标志)和PCNA(细胞增殖的标记)及DAPI(细胞核的标记)共同染色检测肺血管中膜的增厚情况及统计结果。*P<0.05,**P<0.01vs对照组。
图7体现CRTH2缺失抑制肺血管周围的Th2炎症反应(HyOA诱导模型)。
其中，图7A、图7B为通过SMA(血管平滑肌的标志)和CD4(Th2细胞增殖的标记)及DAPI(细胞核的标记)共同染色检测野生型(WT)小鼠和CRTH2缺失(CRTH2-/-)小鼠建立肺高压模型前后肺血管Th2细胞的浸润情况(A)及统计结果(B)。图7C、图7D、图7E为流式细胞术检测野生型(WT)小鼠和CRTH2缺失(CRTH2-/-)小鼠建立肺高压模型前后肺组织Th2细胞的比例和数量。图7F、图7G为ELISA检测血清和肺泡灌洗液的Th2细胞因子水平。*P<0.05,**P<0.01vs对照组。
图8体现骨髓移植确认CRTH2对肺动脉高压条件下Th2反应的介导作用。
其中，图8A为骨髓移植小鼠的肺高压诱导方案及中和抗体处理。图8B、图8C为通过EGFP(供体小鼠骨髓细胞的标记)、SMA(血管平滑肌的标志)、CD4(Th2细胞增殖的标记)及DAPI(细胞核的标记)共同染色检测CRTH2对Th2细胞浸润的影响及统计结果。图8D、图8E、图8F为ELISA检测CRTH2对肺泡灌洗液中Th2细胞因子IL-4和IL-13(D-E)及Th1细胞因子IFN-γ(F)水平的影响。*P<0.05,**P<0.01vs对照组。
图9体现骨髓移植证明CRTH2介导的Th2活化对肺动脉高压的影响。
其中，图9A为骨髓移植小鼠的肺高压诱导方案及中和抗体处理。图9B、图9C为小鼠模型建立后测定的右心室收缩压力(RVSP，mmHg)和右心肥厚程度(RV/LV+S)。图9D为伊红美蓝染色(H&E)和免疫荧光(SMA)检测肺血管的重塑情况。图9E为Image-Pro Plus软件统计分析肺血管的重塑程度。*P<0.05,**P<0.01vs对照组。
图10体现T细胞适应性转移证明CRTH2对肺动脉高压和血管重塑的影响。
其中，图10A为WT CD4+T细胞适应性转移小鼠(CD4+T细胞组)和不转移小鼠(对照组)的肺高压诱导方案。图10B、图10C为小鼠模型建立后测定的右心室收缩压力(RVSP，mmHg)和右心肥厚程度(RV/LV+S)。图10D、图10E为伊红美蓝染色(H&E)和免疫荧光(SMA)检测肺血管的重塑情况。图10F为Image-Pro Plus软件统计分析肺血管的重塑程度。*P<0.05,**P<0.01vs对照组。
图11体现T细胞适应性转移证明CRTH2介导Th2细胞因子IL-4和IL-13对肺动脉高压和血管重塑的影响。
其中，图11A为WT CD4+T细胞适应性转移小鼠(CD4+T细胞组)和不转移小鼠(对照组)的肺高压诱导方案及中和抗体处理。图11B、图11C为IL-4和IL-13的中和处理逆转CRTH2+/+T细胞转移引起的Th2因子的增加。图11D、图11E为小鼠模型建立后测定的右心室收缩压力(RVSP，mmHg)和右心肥厚程度(RV/LV+S)。图11F为伊红美蓝染色(H&E)和免疫荧光(SMA)检测肺血管的重塑情况。图11G为Image-Pro Plus软件统计分析肺血管的重塑程度。*P<0.05,**P<0.01vs对照组。
图12体现CRTH2介导的Th2细胞因子IL-4和IL-13通过激活STAT6影响肺动脉高血管重塑。
其中，图12A为Western blot分析野生型(WT)小鼠和CRTH2缺失(CRTH2-/-)小鼠在诱导肺高压(诱导组)和正常条件(对照组)下STAT6的磷酸化水平。图12B为通过p-STAT6、SMA(血管平滑肌的标志)、及DAPI(细胞核的标记)共同染色检测野生型小鼠和CRTH2缺失小鼠在诱导肺高压(诱导组)和正常条件(对照组)下STAT6的磷酸化水平。图12C为通过骨髓移植和IL-4和IL-13中和抗体的处理来验证CRTH2通过介导IL-4和IL-13进而激活STAT6影响肺血管重塑。
图13体现CRTH2的抑制剂对已建立肺动脉高压小鼠的治疗作用。
其中，图13A为正常小鼠的肺高压诱导及CRTH2抑制剂CAY10595的治疗方案。图13B、图13C为小鼠模型建立后CRTH2抑制剂治疗前后测定的右心室收缩压力(RVSP，mmHg)和右心肥厚程度(RV/LV+S)。图13D、图13E为伊红美蓝染色(H&E)和免疫荧光(SMA)检测肺血管的重塑情况。图13F为Image-Pro Plus软件统计分析肺血管的重塑程度。*P<0.05,**P<0.01vs对照组。
具体实施方式
下面通过结合具体实施例对本发明创造进行进一步说明。
本说明书和权利要求书中使用的下列术语，除非另外说明具有下述一般含义，且下述含义被认为在本领域技术人员的知识范围之内：
“保守”指所涉及的氨基酸序列或核酸序列与原始序列具有较高的相似性或同一性，能够维持其原始序列基本的结构、生物学活性或功能，一般可以通过相似的氨基酸残基替换或等位基因(简并密码子)替换等获得。
“变体”指具有一个或多个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或核酸序列，所述改变可包括氨基酸序列或核酸序列中氨基酸或核苷酸的插入、缺失或替换。变体可具有保守性改变，其中替换的氨基酸与原氨基酸具有相似的结构或化学性质，如亮氨酸和异亮氨酸之间的替换，也可具有非保守性改变。
“同源”包括完全同源和部分同源，在描述多肽、蛋白质或氨基酸序列时，指具有相同或相似的结构或功能，或具有相似的氨基酸序列；在描述核酸序列时，指具有相似性或互补的核酸序列，也包括根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的核酸序列；“同源”在本发明具有相对较为广泛的含义，例如，包括具有一定百分比的相同性的序列(氨基酸序列或核酸序列)，或包括序列的变体。
“衍生物”在描述多肽、蛋白质或氨基酸序列时，指由原多肽、蛋白质或氨基酸序列衍生而来的关联多肽、蛋白质或氨基酸序列，其具有与原始多肽、蛋白质或氨基酸序列相似的性质、活性或功能，例如，本发明中多肽、蛋白质或氨基酸序列包括这样的衍生物：(i)成熟多肽与另一种化合物融合，或者(ii)在氨基酸序列中融合或插入附加的氨基酸序列(linker、蛋白质纯化标识序列、酶切位点等)；等；在描述核酸序列时，指由原始序列衍生未来的关联序列，其具有与原始核酸序列相似的性质、活性或功能，可以包括：(i)序列或基因中连续或间隔地插入、缺失、替换一个或多个碱基(优选为等位基因的替换)，且所述一个或多个氨基酸残基的插入、缺失、替换在同一序列或基因中可同时或不同时存在；(ii)序列或基因中一个或多个碱基被修饰；(iii)序列或基因中融合或插入编码附加的氨基酸序列的基因；等。
“抑制剂”包括了拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂、核酸抑制物等。
“下调”指降低CRTH2基因或其表达产物的活性、降低CRTH2基因或其表达产物的稳定性、降低CRTH2基因表达产物的表达、减少CRTH2基因或其表达产物的有效作用时间、抑制CRTH2基因的转录和/或翻译等。
“干扰分子”是指能够下调CRTH2基因或其表达产物的物质的总称，包括所述的小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸等。
根据特定的靶序列来设计干扰分子是本领域技术人员已知且能够实现的。这些干扰分子也可以通过本领域已知的多种手段(例如采用适当的试剂)被输送到体内，从而发挥其下调CRTH2基因或其表达产物的作用。
在通过本文得知了CRTH2基因或其表达产物与PAH之间的相关性后，可以基于该特征来筛选能够作用于、尤其是能够下调CRTH2基因或其表达产物的功能产品，所用的筛选方法也可以通过本领域已知的多种手段得到实现。
下面通过具体实验及分析和讨论详细阐述CRTH2基因或其表达产物与PAH之间的相关性。
实施例1在肺动脉高压(PAH)病人和PAH模型小鼠中Th2反应活化
本实施例涉及的主要实施过程如下：
1)收集临床PAH及健康志愿者的外周血，提取细胞和血清并流式检测、Real-TimePCR检测和ELISA检测；
2)诱导小鼠PAH模型，收集肺泡灌洗液并分离肺部淋巴细胞，分别作ELISA和流式检测。
本实施例涉及的主要实验部分如下：
1、病人外周血细胞和小鼠肺部细胞的流式检测
实验步骤如下：
1)取新鲜抗凝血20ml以2000rpm离心20min弃去血浆；
2)向弃去血浆的血细胞中加入全血及组织匀浆稀释液12ml小心混匀；
3)将混合液(PAH病人外周血或小鼠肺组织消化液)小心叠加于细胞分离液之液面上(混合液：分离液＝2：1)；
4)以2000rpm离心15分钟(半径15cm水平转子)；
5)此时离心管中由上至下细胞分为四层。第一层，为血浆层；第二层，为环状乳白色淋巴细胞层；第三层，为透明分离液层；第四层，为红细胞层。收集第二层细胞放入含20ml细胞洗涤液的试管中，充分混匀后，以2000rpm离心20分钟，弃去上清留沉淀细胞；
6)向细胞沉淀中加入500ul-1ml红细胞裂解液，混匀作用3min,加入10倍的1xPBS中和，2000rpm离心5min；
7)若离心后得到沉淀不变白可重复上述操作；
8)裂解完成，离心弃去上清，向试管中加入1ml 1xPBS混匀；
9)向1.5ml离心管中加入490μlPBS，再加入10μl上步的细胞悬液，计数；
10)取106个细胞加PBS定容至100μl，向细胞悬液内加入抗体(CD3，1:50，eBioscience；CD4,1:50,eBiocience)2μl，4℃孵育30min；
11)向细胞悬液中加入1ml PBS中和，2000rpm,离心5min；
12)弃上清，向管中加入200μl PBS，上机检测，结果见图1A，图2A。
2、Real-Time PCR检测炎症因子表达
实验步骤如下：
1)将上述分离的PAH病人外周血CD4细胞或小鼠肺组织CD4细胞加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解(注：此时可放入-70℃长期保持)；
2)按200μl氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀15s，室温放置10min(注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂)；
3)将样品于4℃条件下12000g离心15min；
4)小心吸取上层水相转移至新的1.5ml离心管(RNase free)中；
5)按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇，充分混匀，于室温放置5-10min；
6)将样品于4℃12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底；
7)按1ml 75％乙醇/ml Trizol加入75％乙醇(DEPC处理后的去离子水配制)，温和振荡离心管，悬浮洗涤沉淀；
8)将样品于4℃8000g离心5min，尽量弃上清；
9)室温晾干或真空干燥5-10min。注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解；
10)可用20-50μl DEPC H2O溶解RNA样品，55-60℃5-10min；
11)Nano Drop测量RNA浓度；
12)逆转录及RT-PCR反应条件：参照Takara公司反转录试剂盒说明书完成。
基因组DNA的除去反应体系如下表所示：
表2.1基因组DNA的除去反应体系
置于42℃反应2min(或室温5min*b)。
*a：20μl反转录反应体系中，Green qPCR法最多可使用1μg的Total RNA；
*b：室温反应时，可以延长至30分钟；
反转录反应体系如下表所示：
表2.2反转录反应体系
置于37℃反应15min，继以85℃反应5s。
定量PC反应体系如下表所示：
表2.3定量PCR反应体系
反应程序：95℃反应5min完成预变性反应；PCR循环扩增40轮，每轮反应于95℃保温25s以使模板变性、于60℃保温25s促进引物与模板配对结合、于72℃反应30s完成延伸反应并记录荧光读值。计算统计结果见图1C，图2C。
3、ELISA检测PAH病人外周血和肺泡灌洗液的细胞因子蛋白水平
将取得的PAH病人外周血或气管插管取得的小鼠肺泡灌洗液，3000g离心取上清,备用，ELISA操作如下：
1)使用前将所有试剂平衡至室温；
2)洗液(Wash Buffer):如果浓缩液中已经形成结晶,平衡至室温,并轻轻地摇晃直到结晶完全溶解。加入去离子水或蒸馏水稀释20ml浓缩洗涤液至500ml；
3)底物溶液(Substrate Solution):显色试剂A和B应该在使用前15min以等体积混合。避光保存。每孔需要200ul生成的混合物；
4)相关细胞因子的标准品(Standard):使用5ml标准稀释液RD5T(CalibratorDiluent RD5T)(适用于细胞培养上清液样本)或标准稀释液RD6F(Calibrator DiluentRD6F)(适用于血清/血浆样本)重新配制标准品。重新配制的产品为300pg/ml贮存液。稀释前允许将标准品至少轻轻搅拌15min；
5)吸取适当的标准稀释液将标准品进行一系列稀释至各个EP管，没有稀释的标准品作为高标准，适当的标准稀释液作为0标准(0pg/ml)；
6)每孔加入100ul Assay Diluent RD1W；
7)每孔依次加入100ul标准品、样本和对照。用橡皮条密封。室温孵化2小时。记录测定标准和样本的分布；
8)吸弃孔内液体,每孔400ul洗涤液,充分洗涤后完全去除液体。在干净的纸上拍干。反复洗涤4次；
9)每孔加入200ul IL-6Conjugate。用新的橡皮膏条密封。室温温浴2小时；
10)重复步骤8；
11)每孔加入200ul Substrate Solution。室温避光孵育20分钟；
12)每孔加入50ul Stop Solution。孔内颜色应该由蓝变黄。如果孔内颜色是绿色,或者颜色变化不均匀,轻轻拍打板子以确保充分混匀；
13)30分钟内使用酶标仪在450nm测定每孔的吸光度,如果波长校正是有效的,设为540nm或570nm。如果波长校正不可用,从450nm波长读数减去540nm或570nm波长读数。
14)建立标准曲线，计算各细胞因子浓度，统计结果，见图1D，图2D。
小结：在本实施例的上述实验过程中，我们收集了未服过药的特发性肺动脉高压病人(PAH组)新鲜血样及相应的健康志愿者(健康组)的血样，经过流式检测发现肺动脉高压病人组的CD3+CD4+T细胞的比例增加(图1A，图1B)。对此，我们进一步提取了肺动脉高压病人和健康者血液炎症细胞的mRNA，通过Real-Time PCR检测了T helper type 2(Th2)型细胞因子IL-4、IL-5、IL-13的表达水平(图1C)，发现这些炎症因子表达均有上调表达；同时我们采集了多例病人的血清(新鲜和冻存的)，并用ELISA试剂盒在蛋白水平进行了检测和验证，结果与mRNA水平基本一致(图1D)。
同理，我们诱导了肺动脉高压模型，检测了其肺组织中CD3+CD4+T细胞及Th2反应情况。流式检测发现肺动脉高压病小鼠的CD3+CD4+T细胞的比例增加，(图2A，2B)。提取肺组织T细胞通过Real-Time PCR检测了T helper type 2(Th2)型细胞因子IL-4、IL-5、IL-13的表达水平，发现这些炎症因子表达均有上调表达(图2C)；然后，ELISA试剂盒检测了肺泡灌洗液中这些细胞因子的水平，与mRNA一致(图2D)。
实施例2CRTH2在PAH病人外周血和PAH小鼠肺组织的CD4+T细胞中表达上调
本实施例涉及的主要实验部分如下：
1、RT-PCR检测前列腺素受体表达
方法同实施例1细胞因子的PCR检测，结果见图3A、图3B。
2、小鼠PAH模型(低氧加SU5416)的建立
8-10周的小鼠置于常压混合气体仓内(仓内O2浓度维持在9％～11％，CO2浓度为5％～6％)，按50mg/kg体重，每周两次通过皮下注射给予SU5416。
3、前列腺素的提取和检测
1)将肺组织均将处理，3000g离心10min；
2)取500μl上清液，在同一管中分别按每毫升上清加入4ng PGE2及PGF2α，PGD2，PGI2，TXA2的内标(PGE2，PGF2α，PGD2，PGI2，TXA2的内标贮存液浓度为100μg/ml，稀释后100倍，使用内标的终浓度为1ng/ul)；
3)然后加入40μl 1M柠檬酸及5μl 10％BHT来避免自由基催化氧化作用；
4)组织上清液液萃取，加入2ml的正己烷/乙酸乙酯(1:1)旋涡震荡混合1min；5)3000g,40℃离心10min后，吸出上层有机相并保存；
6)再将水相用正己烷/乙酸乙酯(1:1)二次萃取；
7)将两次有机相混合，用氮吹仪氮吹干；
8)再用100μl 10％乙腈溶解，用0.2μM spin HPLC柱离心12000g，1min；
9)收集滤液，即可上机检测，最终各内标浓度为20ng/ml。
10)建立标准曲线，统计各前列腺素浓度，见图3C。
小结：我们知道前列腺素是一类炎性介质，鉴于肺动脉高压病人和小鼠模型的Th2炎症反应增强，我们想知道哪种前列腺素及其受体对此病理过程中的炎症反应有影响。我们用磁珠分选出肺动脉高压病人血液中的CD4+T细胞，通过Real-Time PCR检测了所有前列腺素受体[PGI2受体IP、PGE2受体EP1-EP4、PGF2受体FP、PGD2受体(DP1和DP2，也称DP和CRTH2)、TxA2受体TP]的表达情况，发现PGD2受体CRTH2的表达上调(图3A)，进一步通过流式检测确认CRTH2表达上调(图3B，图3C)。
基于临床样品的研究，我们进一步在小鼠肺动脉高压模型中进行相应的探究。通过给小鼠皮下注射SU5416(内皮生长因子受体2即VEGFR2的一种抑制剂)，按照20mg/kg体重的剂量，每周的第一天给药，同时给予低氧(10％O2)处理三周构建肺动脉高压模型。这个模型我们命名为“HySU”，即Hypoxia加上SU5416处理诱导的PAH模型。取PAH小鼠及对照组(Ctrl)小鼠的肺组织提取CD4+T细胞进行Real-Time PCR检测前列腺素受体的表达情况，我们发现PAH小鼠的CRTH2的表达也有上调(图3D)。我们同时将PAH小鼠和对照组小鼠的肺组织匀浆，提取前列腺素，通过质谱检测了各种前列腺素(PGI2、PGE2、PGF2α、PGD2和TxA2)的含量，结果发现在PAH小鼠的肺组织中所有前列腺素水平均增加(图3E)。
实施例3CRTH2的缺失可以改善低氧结合SU5416诱导的PAH及Th2炎症反应
本实施例涉及的主要实验部分如下：
1、小鼠右心收缩压和右心肥厚的测定
小鼠PAH模型的建立同实施例二。采用计算机控制的血流血压仪测试系统(Transonic Systems Inc)测量麻醉状态下小鼠的右心室收缩压。在操作过程中，待血压值稳定开始读数，并记录一段时间内的压力值，然后采用这段时间内的平均值作为该小鼠的平均肺动脉压力。测完以后，取出小鼠心脏，分离小鼠的右心室，然后分别称量右心室(RV)和左心室及室间隔(LV+S)的重量，计算(RV/LV+S)的值即为希尔顿系数指标。结果见图4B，图4C。
2、肺组织切片H&E及免疫荧光染色
2.1H&E染色
1)将肺组织石蜡切片依次置于二甲苯Ⅰ15min→二甲苯Ⅱ15min→二甲苯：无水乙醇＝1:1 2min；
2)然后置于100％乙醇Ⅰ5min→100％乙醇Ⅱ5min→80％乙醇5min→蒸馏水5min；
3)再经苏木精液染色5min→流水稍洗去苏木精液1-3s→1％盐酸乙醇1-3s；
4)稍水洗10-30s→蒸馏水过洗1-2s；
5)再0.5％伊红液染色1-3min→蒸馏水稍洗1-2s→80％乙醇稍洗1-2s→95％乙醇Ⅰ2-3s→95％乙醇Ⅱ3-5s；
6)然后将切片置于无水乙醇5-10min→石炭酸二甲苯5-10min；
7)二甲苯Ⅰ2min→二甲苯Ⅱ2min→二甲苯Ⅲ2min；
8)中性树胶封固；
9)显微镜选取视野拍摄并用Image-J统计分析血管重塑。
2.2免疫荧光染色
1)取出新鲜组织样本，对于冰冻样品，梯度蔗糖脱水(5％2小时，30％过夜)；对于石蜡样品，用4％多聚甲醛固定；
2)作冰冻样品用OCT包埋，超低温速冻；石蜡样品，则经脱水后石蜡包埋；
3)冰冻样品利用冰冻切片机切成厚度为6-8μm的切片；石蜡样品则用石蜡切片机切成3-5μm的切片；
4)冰冻切片完成后，-80℃保存，使用时先室温晾干一小时，丙酮固定10-15min室温晾干；石蜡切片则经二甲苯、梯度乙醇脱水；
5)1-3％BSA封闭30-1.5h；
6)PBST洗涤3次，每次5min；
7)加入1％BSA的PBST稀释一抗(α-SMA，1:500，Sigma；CD4，1:50，eBioscience；PCNA，1:200，Biolegend)，4℃孵育过夜；
8)PBST洗涤3次，每次5min；
9)二抗避光孵育1-2小时，TBST洗涤3次，每次5min；
10)DAPI(1:10000)孵育30s-1min；
11)PBST清洗两次，每次5min，室温避光晾干；
12)加入防淬灭封片剂封片，使用激光共聚焦显微镜拍照(Olympus)并分析。
3、ELISA检测肺泡灌洗液(BALF)Th2因子的水平
方法同实施例1中ELISA检测。
小结：通过上述实验我们初步确定PGD2及其受体CRTH2可能在肺动脉高压炎症反应中起作用。我们利用低氧加皮下注射SU5416(HySU)的方法对野生型(WT)和CRTH2缺失型(CRTH2-/-)小鼠诱导肺动脉高压模型(图4A)。然后用血压血流仪测量小鼠的右心收缩压(RVSP，mmHg)，取下小鼠的心脏，分离小鼠的右心室(RV)和左心室(LV)及室间隔(S)，分别用天平称量各自的重量，进而计算希尔顿系数即RV/LV+S的比值。通过检测我们发现，在正常条件下CRTH2缺失的小鼠与WT并无明显的差别；而在诱导肺动脉高压之后，CRTH2缺失却可以明显改善其血液动力学常数(RVSP、RV/LV+S)(图4B，图4C)。在完成血液动力学指标的测定后，我们也进行了形态学的检测。通过伊红和美蓝染色，用显微镜观察肺动脉(20-70μm)的重塑情况并拍照，然后用Image-pro plus软件分析血管的增厚情况。经统计，我们发现CRTH2缺失显著减轻肺动脉血管的重塑(图4D，图4E)。我们进一步用SMA(平滑肌细胞的marker)免疫荧光染色及SMA和PCNA(细胞增殖的表征性marker)免疫共染的方法来确定平滑肌的变化。通过分析，我们发现中膜的变化主要表现在平滑肌细胞数目的增多即平滑肌的增殖，CRTH2的缺失抑制了对平滑肌细胞的增殖(图4F，图4G)。
我们已经知道任何血管疾病都伴随着炎症的发生，相关研究已经证实炎症在肺动脉高压起着非常重要的作用。而CRTH2作为一个主要在如Th2细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞等炎症细胞上表达的前列腺素受体，无疑对炎症细胞的行为和功能有重要影响。因此，我们通过小鼠肺组织免疫荧光染色，即将SMA分别与CD4+T细胞来对肺动脉血管炎症进行定性并定量。我们的研究发现，CRTH2的缺失可以显著影响CD4+T细胞的浸润(图5A，图5B)。同时用流式细胞术检测了肺组织Th2细胞(CD4+IL-4+)的比例和数量，CRTH2的缺失可以明显降低Th2水平(图5C-图5E)。除了细胞水平，我们也在分子水平进行了探究。我们在收集小鼠样品的时候，采集了静脉血清(Serum)和肺泡灌洗液(BALF)，然后用ELISA试剂盒进行了相关因子的测定，结果表明CRTH2缺失后Th2型细胞因子水平显著下降(图5F，图5G)。
实施例4 CRTH2的敲除可以减轻低氧结合OVA诱导的PAH及Th2炎症反应
本实施例涉及的主要实验部分如下：
1、小鼠PAH模型(低氧加OVA)的建立
8-10周的小鼠置于常压混合气体仓内(仓内O2浓度维持在9％～11％，CO2浓度为5％～6％)，分别在第1天和第7天给予腹腔注射OVA和氢氧化铝免疫佐剂(Alum)的混合体(每只小鼠小鼠的剂量为50μg OVA and 2mg Alum)。此后三周给予汽化的OVA(10mg/ml)刺激30分钟，时间点见图4A。
2、右心收缩压和右心肥厚程度及组织形态学检测
方法同实施例3的检测。
小结：在上述实验过程中，我们进一步利用低氧加OVA处理(HyOA)的方法对野生型(WT)和CRTH2缺失型(CRTH2-/-)小鼠诱导肺动脉高压模型(图6A)对上述模型进行确认。然后用血压血流仪测量小鼠的右心收缩压(RVSP，mmHg)，取下小鼠的心脏，分离小鼠的右心室(RV)和左心室(LV)及室间隔(S)，分别用天平称量各自的重量，进而计算希尔顿系数即RV/LV+S的比值。通过检测我们发现，在正常条件下CRTH2缺失的小鼠与WT并无明显的差别；而在诱导肺动脉高压之后，CRTH2缺失却可以明显改善其血液动力学常数(RVSP、RV/LV+S)(图6B，图6C)。在完成血液动力学指标的测定后，我们也进行了形态学的检测。通过伊红和美蓝染色(H&E)，用显微镜观察肺动脉(20-70μm)的重塑情况并拍照，然后用Image-pro plus软件分析血管的增厚情况。经统计，我们发现CRTH2缺失显著减轻肺动脉血管的重塑(图6D，图6E)。我们进一步用SMA(平滑肌细胞的marker)免疫荧光染色及SMA和PCNA(细胞增殖的表征性marker)免疫共染的方法来确定平滑肌的变化。通过分析，我们发现中膜的变化主要表现在平滑肌细胞数目的增多即平滑肌的增殖，CRTH2的缺失抑制了对平滑肌细胞的增殖(图6F，图6G)。
同HySU模型一样，我们通过小鼠肺组织免疫荧光染色，即将SMA分别与CD4+T细胞)来对肺动脉血管炎症进行定性并定量。我们的研究发现，CRTH2的缺失可以显著影响CD4+T细胞的浸润(图7A，图7B)。同时用流式细胞术检测了肺组织Th2细胞(CD4+IL-4+)的比例和数量，CRTH2的缺失可以明显降低Th2水平(图7C-图7E)。除了细胞水平，我们也在分子水平进行了探究。我们在收集小鼠样品的时候，采集了静脉血清(Serum)和肺泡灌洗液(BALF)，然后用ELISA试剂盒进行了相关因子的测定，结果表明CRTH2缺失后Th2型细胞因子水平显著下降(图7F，图7G)。
实施例5 CRTH2+/+骨髓重构的CRTH2-/-小鼠恢复的PAH症状能被IL-4和IL-13的中和抗体所挽救
本实施例涉及的主要实验部分如下：
1、骨髓移植及小鼠PAH模型建立
1.1受体小鼠辐照
1)将CRTH2 KO小鼠随机分为5组(不同处理)，根据需要每组8只；
2)小鼠分两批以137Cs来源的射线以9Gy的剂量均匀辐照，以去除小鼠原有骨髓而不致死；
1.2供体细胞提取及尾静脉注射
1)将6只WT和3只CRTH2 KO的带EGFP的小鼠安乐处死；
2)实验室取出小鼠的下肢放在50ml离心管中，置于冰上；
3)细胞房超净台里，铺上保鲜膜，剔肉前在75％的酒精中涮一下，之后再在1640中涮一下；
4)剔完后，放在1640中,1640和75％酒精可以放在六孔板中；
5)之后10ml注射器注射器用1640冲出骨髓，关节处下针，下端剪开；
6)一组的收在一个管中,1600g，6min；
7)弃上清，加3ml裂红液，吹匀，静止5min；
8)加入至少10倍1xPBS中和,70um筛子过滤,吹匀，再取出少许稀释约3-5倍，计数，1600g，6min,弃上清；
9)按计数结果，重悬骨髓细胞浓度约为2x107个细胞/ml；
10)每只小鼠尾静脉注射400μl细胞悬液左右，约8x106个；
11)实验过程中要保证无菌，裂红液和PBS都要高压灭菌，手术器械也灭菌；
12)实验后两天换次新霉素水，同时换笼，粮食每次少加点最好也两天换，至少持续两周；
13)经过2个月小鼠状态稳定后，进行PAH模型诱导，方法同实施例4。
2、IL-4和IL-13的中和抗体对小鼠的治疗处理
骨髓重构小鼠在诱导模型过程中，给予IL-4和IL-13的中和抗体处理，对照组给予相应的IgG处理。中和抗体通过腹腔注射给予，Anti-IL-4按0.5mg每只小鼠给予，Anti-IL-13按1mg每只小鼠给予。中和抗体及对照蛋白是在每一次对小鼠进行OVA呼吸式刺激后的24h进行腹腔注射(图8A)。
3、小鼠右心收缩压和右心肥厚及形态学检测
方法同实施例3。
小结：由于我们使用的是全身敲除CRTH2的小鼠，为了更好说明CRTH2是通过炎症因素对肺动脉高压的发生发展起作用，我们进行了骨髓移植(Bone Marrow Transplant,BMT)实验。将用于受体的CRTH2 KO小鼠进行9Gy的137Cs放射源的照射，以去除原有骨髓，然后将同是C57背景的WT小鼠和CRTH2 KO小鼠的骨髓通过尾静脉注射打入辐照后的CRTH2 KO小鼠体内，即分为WT→KO和KO→KO组。经过2个月左右的时间，小鼠状态稳定后，采用HyOA法(或HySU法)诱导肺动脉高压模型。鉴于此前我们已经证实CRTH2可以影响肺动脉高压发生过程中的Th2炎症反应，主要是促进IL-4和IL-13的分泌，于是我们将WT→KO组小鼠又分为四组，即腹腔注射IgG组(Control组)、Anti-IL-4组、Anti-IL-13组及Anti-IL-4和Anti-IL-13组，为了与注射IgG组的WT→KO小鼠保持一致，我们也对KO→KO小鼠腹腔注射了IgG。Anti-IL-4和Anti-IL-13是IL-4和IL-13的中和抗体(R&D)，IgG为对照球蛋白。中和抗体及对照蛋白是在每一次对小鼠进行OVA呼吸式刺激后的24h进行腹腔注射(图8A)。
在小鼠肺动脉高压模型造好后，我们取肺组织做了切片染色，并收集了肺泡灌洗液(BALF)。鉴于此实验的目的，我们首先检测了肺组织中CD4细胞的浸润情况和肺泡灌洗液中IL-4和IL-13的含量。相对于IgG处理的KO→KO组而言，IgG处理的WT→KO组小鼠的CD4浸润增多(图8B，图8C)，IL-4和IL-13的水平明显增加(图8D，图8E)，再一次证明CRTH2对Th2炎症的介导作用。而经IL-4中和抗体处理的WT→KO组小鼠，相对于IgG处理的KO→KO组而言，其IL-4水平降到极低，同时IL-13的水平也降低近40-50％；同理，经IL-13中和抗体处理的WT→KO组小鼠，相对于IgG处理的KO→KO组而言，其IL-13水平降到极低，同时IL-4的水平也降低近30-40％；而经IL-4和IL-13中和抗体同时处理的WT→KO组小鼠，相对于IgG处理的KO→KO组而言，其IL-4和IL-13的水平均降到极低，而IFN-g并无明显变化(图8D，图8E)。
我们同样测试了肺动脉压力及右心肥厚的情况，取肺组织做了H&E染色，发现CRTH2骨髓的移入增加的肺动脉压力和右心肥厚，可以被IL-4和IL-13中和抗体所逆转(图9B，图9C)，血管重塑也被逆转(图9D，图9E)。
实施例6 CRTH2+/+CD4+T细胞适应性转移重现的PAH表型也能被IL-4和IL-13的中和抗体所逆转
本实施例涉及的主要实验部分如下：
1、T细胞适应性转移
1)将小鼠安乐处死，取出脾脏，在超净台中研磨并用70um的细胞筛过滤；
2)将上述细胞悬液稀释并记数；
3)根据需要用磁珠(STEMCELL TECHNOLOGIES)分选出CD4+Tcells；
4)将分选出的细胞(CD4+T Cells)及对照液(Vehicle)通过尾静脉注射(i.v.)打入已诱导肺动脉高压一周的WT和CRTH2 KO小鼠体内；
5)诱导肺动脉高压模型。
2、IL-4和IL-13的中和抗体联合处理PAH小鼠
方法同实施例5。
3、小鼠右心收缩压和右心肥厚及组织形态学检测
方法同实施例3。
小结：在本实施例中，为了更直接证明CRTH2影响的是CD4+T细胞(确切的说是Th2细胞)的招募和活化，我们在小鼠诱导肺动脉高压一周后，将无菌分选的WT型CD4+T细胞通过尾静脉分别注射到WT和CRTH2 KO小鼠体内，对照组用CD4+T细胞的悬浮液(Vehicle)打入WT和CRTH2KO小鼠体内(图10A)。在肺动脉高压诱导结束后，我们检测了血液动力学相关指标，并收集了肺泡灌洗液和血清，并且取肺组织做了切片。经分析，我们发现，对于打入T细胞和Vehicle的WT小鼠在诱导肺动脉高压后，T细胞组小鼠的右心收缩压力和右心肥厚有所增强，但差异不够显著；而对于打入T细胞和Vehicle的CRTH2 KO小鼠在诱导肺动脉高压后，T细胞组小鼠的右心收缩压力和右心肥厚明显加重(图10B，图10C)。然后，我们做了肺组织的H&E染色和SMA的免疫荧光染色，以及PCNA与SMA的共定位染色。显微镜拍照后，经image-pro plus软件统计分析，我们发现对于打入T细胞和Vehicle的WT小鼠在诱导肺动脉高压后，T细胞组小鼠肺动脉血管重塑及平滑肌的增值有所增强，但并无显著性差异；而对于打入T细胞和Vehicle的CRTH2 KO小鼠在诱导肺动脉高压后，T细胞组小鼠肺动脉重塑及平滑肌的增值情况明显增加(图10D-图10F)。
我们为了进一步确认CRTH2介导Th2活化对肺动脉高压产生影响，用IL-4和IL-13中和抗体处理CRTH2+/+T细胞转移的CRTH2-/-小鼠(图11A)，首先我们可以看到通过ELISA检测血清和肺泡灌洗液中IL-4和IL-13的水平，IL-4和IL-13中和抗体可以明显降低IL-4和IL-13的含量(图11B，图11C)。同时IL-4和IL-13的中和可以明显逆转CRTH2+/+T细胞转移造成的肺动脉高压表型的恢复，包括肺动脉压力和右心室肥厚程度的降低(图11D，图11E)，血管重塑也减轻(图11F，图11G)。
实施例7 CRTH2介导的IL-4和IL-13通过激活STAT6信号通路促进肺动脉平滑肌细胞增殖进而影响血管重塑
本实施例涉及的主要实验部分如下：
1、小鼠肺组织p-STAT6的Western Blot检测
取50～100mg小鼠肺组织，加入500ul裂解液及5ul PMSF(碧云天，中国)，4度组织研磨机打碎，冰上静置10分钟；4℃，14000g离心15分钟，取上清弃沉淀；用BCA法测定蛋白浓度，零下30度保存备用。对于肝原代细胞或其他细胞系，每个六孔板的一空加入100ul裂解液及1ul PMSF，用细胞刮仔细挂下细胞，其他步骤同上。利用6×SDS-PAGE使蛋白变性，100℃金属浴10分钟上静置5分钟。-30度保存或利用SDS变性胶在电泳仪中，120V稳压电泳。待蛋白完全分开之后，利用电泳仪和湿转液进行转膜，300mA恒流转膜。转膜完毕之后，5％脱脂蛋白封闭60分钟，TBST洗三次，一抗4度过夜；TBST洗三次，二抗常温孵育2小时，显影液显影。实验中用到的抗体有：p-STAT6(1:500；Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)、STAT6(1:1,000；ABclonal,Woburn,MA,USA)、GAPDH(1:2,000；Cell SignalingTechnology,Danvers,MA,USA)。
2、小鼠肺组织p-STAT6的检测
1)取出新鲜组织样本，对于冰冻样品，梯度蔗糖脱水(5％2小时，30％过夜)；对于石蜡样品，用4％多聚甲醛固定；
2)作冰冻样品用OCT包埋，超低温速冻；石蜡样品，则经脱水后石蜡包埋；
3)冰冻样品利用冰冻切片机切成厚度为6-8μm的切片；石蜡样品则用石蜡切片机切成3-5μm的切片；
4)冰冻切片完成后，-80℃保存，使用时先室温晾干一小时，丙酮固定10-15min室温晾干；石蜡切片则经二甲苯、梯度乙醇脱水；
5)1-3％BSA封闭30-1.5h；
6)PBST洗涤3次，每次5min；
7)加入1％BSA的PBST稀释一抗(α-SMA，1:500，Sigma；p-STAT6 1:500；Santa CruzBiotechnology,Santa Cruz,CA,USA)，4℃孵育过夜；
8)PBST洗涤3次，每次5min；
9)二抗避光孵育1-2小时，TBST洗涤3次，每次5min；
10)DAPI(1:10000)孵育30s-1min；
11)PBST清洗两次，每次5min，室温避光晾干；
12)加入防淬灭封片剂封片，使用激光共聚焦显微镜拍照(Olympus)并分析。
小结：IL-4和IL-13可以通过其受体激活细胞增殖相关信号通路，STAT6信号通路是其下游经典的信号通路。我们想知道CRTH2介导的IL-4和IL-13是否也是通过激活STAT6信号引起血管平滑肌细胞增殖进而影响血管重塑。我们先检测了肺组织的STAT6的磷酸化水平，CRTH2的缺失可以明显降低磷酸化STAT6(p-STAT6)的表达(图12A)。进一步通过免疫荧光染色和IL-4和IL-13的中和抗体处理，我们可以看到CRTH2介导的IL-4和IL-13确实通过激活STAT6促进平滑肌增殖引起血管重塑(图12B，图12C)。
实施例8CRTH2抑制剂CAY10595一定程度上可以治疗肺动脉高压
本实施例涉及的主要实验部分如下：
1、CAY10595处理已建立PAH的小鼠
已建立PAH的小鼠，分为两组，实验组按5mg/kg小鼠体重通过灌胃给予CAY10595(溶于吐温80/乙醇/双蒸水的体积比为5/5/90的溶剂中，对照组给予同样体积的溶剂。具体实施时间点如图13A。
2、小鼠右心收缩压和右心肥厚及组织形态学检测
方法同实施例3。
通过以上实验证明了PGD2/CRTH2介导的Th2活化(包括T细胞对肺血管的浸润和Th2细胞因IL-4、IL-13的释放)通过激活STAT6促进肺动脉血管重塑，进而引起肺动脉高压。综合来看，CRTH2可能作为肺动脉高压治疗的新的药物靶标。从转化医学的角度，我们利用CRTH2的抑制剂CAY10595治疗已建立肺动脉高压的小鼠(图13A)，与对照组相比，CAY10595可以明显改善肺动脉压力和右心肥厚程度(图13B，图13C)，同时血管重塑也得到明显改善(图13D-图13F)。
综合上述各实施例，本发明从临床出发，经在动物水平反复研究，发现在肺动脉高压的发生发展过程中，前列腺素D2受体CRTH2通过介导Th2型炎症反应来促进以平滑肌增殖为主因的肺动脉血管重塑，从而引发或加重肺动脉高压的病症；当CRTH2被敲除或被抑制后可以改善肺动脉高压的病症。本发明研究丰富了对肺动脉高压发病机理的基础研究的内容，为更深入探索肺动脉高压发病的本质原因提供了新的思路。同时，CRTH2可作为临床上治疗肺动脉高压的一个新的药物靶标，CRTH2的抑制剂及Th2型细胞因子的中和抗体可参考作为治疗肺动脉高压的潜在药物。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。
序列表
<110> 天津医科大学
<120> CRTH2作为肺动脉高压免疫治疗药物靶标及其应用
<130> YKDYY1801-1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1149
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggccaacg tcacactgaa gccgctctgt ccactcttgg aggagatggt ccagcttcca 60
aaccacagca actctagcct ccgctacatc gaccacgtgt cggtgctgtt gcacgggctg 120
gcctcgctgc tgggcctggt ggaaaacgga ctcatcctgt ttgtggtggg ctgtcgcatg 180
cgccagacag tggtcaccac ctgggtgctg cacctggcgc tatccgactt gttagccgcc 240
gcctccctgc ctttcttcac ctacttcctg gcagtgggcc actcgtggga gctgggcact 300
accttctgca agctacattc ctcggtcttc ttcctcaaca tgtttgccag cggcttcctg 360
ctcagtgcca ttagcctgga ccgctgcctg caggtggtga ggccagtgtg ggcacagaac 420
caccgcacgg tggcggtcgc gcacagagtc tgcctgatgc tctgggctct ggcggtgctc 480
aacacaatac catatttcgt gttcagagac accatcccgc ggcttgatgg ccgcatcatg 540
tgctactaca acttgctgct ctggaatcca gggcctgacc gcgacaccac gtgcgactac 600
cgccagaagg ccctggcggt cagcaaattc ctgctggcct tcatggtacc tctggccata 660
attgcctcga gccacgtagc cgtgagcctg cgactgcacc accgtggtcg ccagaggaca 720
ggccgctttg tgcgcctggt ggcggccatc gtggttgcct tcgtgctctg ctgggggccc 780
taccacatct tcagtctgct ggaggcgcgt gcccattctg tcaccacgct acggcagctc 840
gcgtcacgtg ggctgccctt tgtcaccagc ctggccttct tcaacagcgt ggtcaaccca 900
ctgctctatg tgttcacatg ccccgacatg ttgtacaaac tgcggcgctc gctacgcgcg 960
gtgcttgaaa gcgtgctggt agaagacagc gaccagagtg gtgggctccg caatcgccgt 1020
cgccgcgcct cctccaccgc caccccagcc tctaccctcc tgctggctga ccgaattccc 1080
caactgcgtc caacccgctt gatcggctgg atgaggcgtg gcagtgcaga ggtcccacag 1140
agggtctga 1149

Claims (8)

1.CRTH2基因或其表达产物(CRTH2基因的编码蛋白)在下述任一方面的应用：
i)开发、筛选PAH功能产品方面；
ii)制备治疗或预防PAH的功能产品方面。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述功能产品为能够对PAH的发生、发展产生治疗、缓解、抑制、调节的有益作用的产品或潜在物质；所述功能产品为单一制剂或包含有效量制剂成分的组合物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述功能产品含有以CRTH2为靶标，并对CRTH2基因的表达、转录或其表达产物起到抑制作用的有效成分。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，该有效成分可以为核酸抑制物、蛋白抑制剂、抗体、配体、蛋白水解酶、蛋白结合分子中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述蛋白抑制剂为CAY10595。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗体为Th2型细胞因子IL-4、IL-13的中和抗体。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述功能产品用于起到以下一种或多种作用：
i)降低Th2型细胞因子IL-4、IL-13的表达；
ii)提高Th2型细胞因子IL-4、IL-13中和抗体的浓度；
iii)降低磷酸化STAT6的表达；
iv)抑制对平滑肌细胞的增殖；
v)减少肺组织CD4+T细胞的浸润和活化。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述功能产品选自或含有以下任一种：
i)以SEQ ID NO：1或其转录本为靶序列，且能够抑制CRTH2基因表达产物的表达或基因转录的小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸；
ii)能表达或形成i)中所述小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸的构建物；
iii)含有SEQ ID NO：1或其互补序列，且能够在转入体内后形成抑制CRTH2基因表达产物的表达或基因转录的干扰分子的构建物；
iv)抑制或敲除SEQ ID NO：1基因序列后的免疫相关细胞、其分化细胞或构建物；
v)以根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的SEQ ID NO：1的同源序列或其转录本为靶序列，且能够抑制CRTH2基因表达产物的表达或基因转录的小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸；
vi)能表达或形成v)中所述小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸的构建物；
vii)含有根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的SEQ ID NO：1的同源序列或其互补序列，且能够在转入体内后形成抑制CRTH2基因表达产物的表达或基因转录的干扰分子的构建物；
viii)抑制或敲除根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的SEQ ID NO：1的同源基因序列后的免疫相关细胞、其分化细胞或构建物。
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